PL204381B1 - Sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, która niesie w genomie gen chimerowy, transformowana tym sposobem genem chimerowym roślina i komórka roślinna, izolat DNA genu chimerowego oraz zawierający gen chimerowy biologicznie funkcjonalny nośnik ekspresji - Google Patents
Sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, która niesie w genomie gen chimerowy, transformowana tym sposobem genem chimerowym roślina i komórka roślinna, izolat DNA genu chimerowego oraz zawierający gen chimerowy biologicznie funkcjonalny nośnik ekspresjiInfo
- Publication number
- PL204381B1 PL204381B1 PL362052A PL36205201A PL204381B1 PL 204381 B1 PL204381 B1 PL 204381B1 PL 362052 A PL362052 A PL 362052A PL 36205201 A PL36205201 A PL 36205201A PL 204381 B1 PL204381 B1 PL 204381B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- coding sequence
- seq
- rip
- maize
- Prior art date
Links
- 230000030833 cell death Effects 0.000 title description 11
- 108090000829 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 122
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 99
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims abstract description 77
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 73
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims abstract description 70
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims abstract description 70
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 54
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 53
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 8
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 3
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022419 RPA-interacting protein Human genes 0.000 claims 4
- 238000002473 ribonucleic acid immunoprecipitation Methods 0.000 claims 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 20
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract description 16
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 abstract description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 70
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 32
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 241000243785 Meloidogyne javanica Species 0.000 description 14
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 14
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 14
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 13
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 12
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 101100296719 Caenorhabditis elegans pde-4 gene Proteins 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000405147 Hermes Species 0.000 description 9
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 9
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 8
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 7
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000482313 Globodera ellingtonae Species 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 6
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 5
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 5
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 241001489135 Globodera pallida Species 0.000 description 4
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 4
- RZUBARUFLYGOGC-MTHOTQAESA-L acid fuchsin Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)C1=C(N)C(C)=CC(C(=C\2C=C(C(=[NH2+])C=C/2)S([O-])(=O)=O)\C=2C=C(C(N)=CC=2)S([O-])(=O)=O)=C1 RZUBARUFLYGOGC-MTHOTQAESA-L 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 4
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010004950 Birth mark Diseases 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 3
- 206010027145 Melanocytic naevus Diseases 0.000 description 3
- 208000007256 Nevus Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 3
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000027832 depurination Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 2
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 2
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 2
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 2
- 101710158575 Cap-specific mRNA (nucleoside-2'-O-)-methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 2
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001442497 Globodera rostochiensis Species 0.000 description 2
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 2
- 241000498254 Heterodera glycines Species 0.000 description 2
- 241000379510 Heterodera schachtii Species 0.000 description 2
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001143352 Meloidogyne Species 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 101000598243 Nicotiana tabacum Probable aquaporin TIP-type RB7-18C Proteins 0.000 description 2
- 101000655028 Nicotiana tabacum Probable aquaporin TIP-type RB7-5A Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000005078 fruit development Effects 0.000 description 2
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 108700028325 pokeweed antiviral Proteins 0.000 description 2
- 230000007198 pollen germination Effects 0.000 description 2
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150012623 AGL15 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000306795 Andigena Species 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 235000021533 Beta vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000228438 Bipolaris maydis Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000007563 Galectins Human genes 0.000 description 1
- 108010046569 Galectins Proteins 0.000 description 1
- 241001442498 Globodera Species 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 241001480224 Heterodera Species 0.000 description 1
- 241001481225 Heterodera avenae Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 208000000291 Nematode infections Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 241001291279 Solanum galapagense Species 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 235000003095 Vaccinium corymbosum Nutrition 0.000 description 1
- 240000000851 Vaccinium corymbosum Species 0.000 description 1
- 235000017537 Vaccinium myrtillus Nutrition 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 235000021014 blueberries Nutrition 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 108010010621 modeccin Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001069 nematicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania rośliny transgenicznej, która niesie w genomie gen chimerowy, transformowanej tym sposobem genem chimerowym rośliny i komórki roślinnej, izolatu DNA genu chimerowego oraz zawierającego gen chimerowy biologicznie funkcjonalnego nośnika ekspresji.
Jeden ze sposobów dostępnych dla hodowców, których celem jest wyprodukowanie nowych odmian hodowlanych stanowi produkcja hybryd pomiędzy istniejącymi odmianami hodowlanymi posiadającymi pożądane cechy. Hybrydy są na ogół lepsze pod względem szeregu cech od każdego z rodziców, zjawisko to znane jest jako bujność mieszań ców. Takie krzyż ówki hybryd mogą być prowadzone za pomocą krzyżowego zapylania ręcznego, procedury zarówno żmudnej jak i czasochłonnej.
W czasie produkcji takich krzyżówek mieszańców kluczowe jest zapobieganie samozapylaniu. Aby to osiągnąć rodzic żeński może mieć usunięte męskie organy rozrodcze np. przy produkcji hybrydowej kukurydzy przez usuwanie kitek. Jednak usuwanie organów męskich na dużą skalę u gatunków z kwiatami hermafrodytycznymi jest niemoż liwe ze wzglę dów ekonomicznych. Ż e ń skie linie rodzicielskie (męsko sterylne) można także generować przez genetyczną męską sterylność, cechę znaną u wielu roś lin, na ogół recesywną i monogeniczną . Problemem tego podejś cia jest trudność uzyskania czystych linii męskosterylnych rodziców do każdej krzyżówki. Najszerzej stosowany system wytwarzania męskiej sterylności do stosowania w produkcji hybryd to cytoplazmatyczna męska sterylność (cytoplasmic małe sterility (cms)). W tym przypadku czynniki cytoplazmatyczne są odpowiedzialne za niefunkcjonalność pyłku. System ten był powszechnie stosowany w roślinach uprawnych, u których określono cms w plazmie germinalnej np. kukurydzy czy słoneczniku. Ma on jednak kilka wad: męsko sterylna cytoplazma może być zasocjowana z innymi niepożądanymi cechami np. cytoplazma-T u kukurydzy oraz jest podatna na Helminthosporium maydis; stosowanie jej wymaga izogenicznych utrzymujących żeńskich płodnych linii do namnażania męskiego rodzica i jest ograniczone do gatunków, u których dostępne jest cytoplazmatyczne źródło sterylności.
Inną zaletą systemu męskiej sterylności byłaby produkcja roślin wolnych od pyłku. Byłoby to pożądane dla szeregu odmian kwiatów ozdobnych i by także miało zastosowanie w ograniczaniu cech genetycznych przez zapobieganie krzyżowaniu na zewnątrz.
Kolejną korzystną cechą systemu sterylności jest, że można by produkować rośliny sterylne żeńskie, tak że rozwój owoców zachodził by bez tworzenia nasion. Bezpestkowe odmiany owoców np. pomidorów byłyby korzystne do obróbki a także były by pożądane przez konsumentów np. bezpestkowy melon. Odmiany bez nasion są dostępne i istnieją ustalone programy ich namnażania, lecz rozwój owoców bez pestek był ograniczony dostępnością odpowiedniej plazmy germinalnej u wielu gatunków.
W przypadkach gdy genetyczne źródło sterylności nie jest dostępne lub z innych względów jest niemożliwe podejście modyfikacji genetycznej mogłoby zapewnić sterylność dostarczając system śmierci komórek, za pomocą którego zachodzi nekroza w specyficznych komórkach w tkankach rozrodczych.
WO 89/10396 ujawnia system śmierci komórek gdzie gen chimerowy wprowadza się do rośliny, który to gen chimerowy zawiera promotor specyficzny dla pylników przyłączony do białka lub polipeptydu RNAzy, które gdy ulega ekspresji powoduje zaburzenie metabolizmu komórki. Tak więc ekspresja genu chimerowego powoduje nekrozę komórek pylników i powoduje męską sterylność u roślin.
Obecny system śmierci komórek, gdzie celem byłby zalążek rośliny mógłby być stosowany do dostarczenia żeńskiej sterylności u roślin gdzie miejscem docelowym może być zalążek rośliny.
WO 93/18170 i WO 92/04453 ujawniają systemy śmierci komórek, które są specyficzne dla kontroli zakażenia przez nicienie. W WO 93/18170 i WO 92/04453 gen zawierający sekwencję kodującą, która to sekwencja kodująca koduje produkt zaburzający atak przez nicienie jest wprowadzany do gatunku rośliny gospodarza. Gen dalej zawiera region promotora, który to region promotora kontroluje ekspresję sekwencji kodującej tak, że ekspresja zachodzi przy ataku przez nicienie i zasadniczo specyficznie w lub przy komórkach miejsca żerowania nicieni. Aby zaburzyć atak nicieni produkt może być albo szkodliwy dla komórek roślinnych, które różnicują się do komórek miejsca żerowania nicieni lub komórek do nich przylegających lub bezpośrednio szkodliwy dla nicienia.
Ekonomicznie ważne pasożytnicze nicienie roślin obejmują nicienie cystowe takie jak nicienie cystowe ziemniaka (Globodera rostochiensis i G. pallida), nicienie cystowe soji (Heterodera glycines), nicienie cystowe buraka (Heterodera schachtii) i nicienie cystowe zbóż (Heterodera avenae), i nicienie węzłów korzeni takie jak Meloidogyne spp. Takie pasożytnicze nicienie roślin są ważnymi patogenami
PL 204 381 B1 wielu roślin uprawnych na całym świecie, na przykład jarzyn, spożywczych roślin strączkowych, pomidorów, arbuzów, winogron, orzeszków ziemnych, tytoniu i bawełny.
Kontrola chemiczna, praktyki hodowlane i stosowanie opornych odmian roślin są głównymi podejściami do kontroli nicieni, które są obecnie dostępne i są one często stosowane w sposób integrowany przeciwko nicieniom pasożytniczym roślin. Istnieje potrzeba poprawy kontroli nicieni ponieważ te obecne podejścia dają niewystarczającą ochronę plonów. Środki nicieniobójcze są wątpliwe ze względu na środowisko i nie zawsze są skuteczne. Kontrola hodowlana na kilka sposobów powoduje ukryte straty hodowców. Szeroki zakres gospodarza nicieni węzłów korzeni ogranicza dostępność zadawalających ekonomicznie roślin uprawnych nie będących gospodarzami. Często nie są dostępne skuteczne oporne odmiany hodowlane i często te, które hodowca może stosować czasem dają gorsze efekty niż wrażliwe odmiany hodowlane przy niskich gęstościach nicieni. Także oporność może zostać utracona przy wysokich temperaturach gleby, które występują w otoczeniu tropikalnym i subtropikalnym.
Można przewidywać inne zastosowania systemu śmierci komórek. Na przykład docelowym miejscem mogą być specyficzne części kwiatu w ten sposób zmieniając morfologię kwiatu. Alternatywnie docelowe miejsce może być korzeniami bocznymi, kolcami lub kłującymi włoskami. Odcięcie liścia lub owocu można uzyskać przez naprowadzanie strefy odcięcia liścia lub owocu. Może będzie możliwe ułatwianie uwalniania nasion z roślin przez naprowadzanie łodyżki nasiona. Przez naprowadzanie innych narządów takich jak włośniki, które to włośniki są typowo gruczołowe, można by zakończyć lub zapobiec produkcji substancji chemicznych przez te narządy. Innym zastosowaniem mogłoby być indukowalne odpadnięcie korzeni, liści, kwiatów lub owoców pod koniec okresu wzrostu.
Białka inaktywujące rybosom (ribosome inactivating proteins - RIP) są grupą toksycznych białek roślinnych, które katalitycznie inaktywują rybosomy eukariotyczne (Stirpe i Barbieri 1986). RIP działają jako N-glikozydazy aby usunąć specyficzną adeninę w konserwowanej pętli dużego rRNA i w ten sposób blokują wiązanie czynnika elongacji 2, blokując komórkową syntezę białka.
Opisano trzy formy RIP. RIP typu 1 takie jak antywirusowe białko szkarłatki (PAP) i inhibitor translacji jęczmienia są każdy złożone z pojedynczego łańcucha polipeptydowego, każdy o przybliżonej wartości Mr 30,000. RIP typu 2 takie jak rycyna, abryna i modekcyna zawierają każde po dwa łańcuchy polipeptydowe. Jeden polipeptyd z aktywnością RIP (łańcuch A) jest połączony wiązaniem dwusiarczkowym do lektyny wiążącej galaktozę (łańcuch B; Stirpe i wsp. 1978). Wartość Mr każdego RIP Typu 2 wynosi około 60000.
RIP kukurydzy, który jest spotykany w endospermie nasion kukurydzy (Zea mays) stanowi RIP Typu 3. Ten RIP jest syntetyzowany jako pojedynczy łańcuch polipeptydowy, który następnie jest cięty proteolitycznie uwalniając dwie aktywne domeny peptydowe. RIP kukurydzy zawiera dwie domeny - domenę α i domenę β , które to domeny są rozdzielone w nieaktywne formy RIP kukurydzy (tzn. pro-RIP kukurydzy) przez centralny przerywnik peptydu i są oflankowane przez N- i C-końcowe peptydy. Domena α jest umieszczona w stronę N-końca pro-RIP, domena β jest umieszczona w stronę C-końca. W czasie kiełkowania nasion pro-RIP kukurydzy jest aktywowany poprzez cięcie proteolityczne N- i Ckońcowych peptydów razem z centralnym przerywnikiem peptydu tak, że dwie domeny tworzą dojrzały (aktywny) RIP kukurydzy (US 5,248,606). Cięcie jest przeprowadzane przez endogenne proteazy.
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania rośliny transgenicznej, która niesie w genomie rośliny gen chimerowy, którego ekspresja powoduje cytotoksyczność w miejscu docelowym, w którym roślinę transformuje się chimerowym genem zawierającym promotor, który jest indukowany w i/lub koło miejsca docelowego funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, która koduje zrekombinowane dojrzałe inaktywujące rybosom białko (RIP) kukurydzy zawierające domenę α i domenę β ułożone przylegle względem siebie, przy czym sekwencja kodująca zawiera sekwencję określoną w ID. SEKW. Nr: 2 lub sekwencję kodującą przynajmniej w 70% identyczną z sekwencją ID. SEKW. Nr: 2.
Wynalazek dotyczy również rośliny transformowanej sposobem według wynalazku genem chimerowym, który to gen chimerowy zawiera promotor indukowany w i/lub koło miejsca docelowego, funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, która koduje dojrzałe zrekombinowane RIP kukurydzy zawierające domeny α i β umieszczone przylegle względem siebie, przy czym sekwencja kodująca zawiera sekwencję określoną w ID. SEKW. Nr. 2 lub sekwencję kodującą wykazującą przynajmniej 70% identyczność z SEKW. Nr. 2.
Przedmiotem wynalazku jest również komórka roślinna transformowana sposobem według wynalazku genem chimerowym, który to gen chimerowy zawiera promotor indukowany w i/lub koło miejsca docelowego, funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, która koduje dojrzałe zrekombinowane RIP kukurydzy zawierające domeny α i β umieszczone przylegle względem siebie, przy czym
PL 204 381 B1 sekwencja kodująca obejmuje sekwencję określoną w ID. SEKW. Nr: 2 lub sekwencję kodującą przynajmniej w 70% identyczną z sekwencją ID. SEKW. Nr: 2.
Wynalazek dostarcza także izolatu DNA genu chimerowego zawierającego promotor, który jest indukowany w i/lub koło miejsca docelowego, funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, która koduje dojrzałe zrekombinowane RIP kukurydzy zawierające domeny α i β umieszczone przylegle względem siebie, przy czym sekwencja kodująca obejmuje sekwencję określoną w ID. SEKW. Nr: 2 lub sekwencję kodującą przynajmniej w 70% identyczną z sekwencją ID. SEKW. Nr: 2.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest również biologicznie funkcjonalny nośnik ekspresji zawierający gen chimerowy obejmujący promotor, który jest indukowany w i/lub koło miejsca docelowego, funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, która koduje dojrzałe zrekombinowane RIP kukurydzy zawierające domeny α i β umieszczone przylegle względem siebie, przy czym sekwencja kodująca obejmuje sekwencję określoną w ID. SEKW. Nr: 2 lub sekwencję kodującą przynajmniej w 70% identyczną z sekwencją ID. SEKW. Nr: 2.
Sekwencja kodująca białka kukurydzy inaktywującego rybosom może alternatywnie obejmować rekombinowany „dojrzały” RIP, określany w niniejszym opisie jako „RIP-P”, zawierający domenę α i domenę β ułoż one przylegające do siebie tzn. usunięte są przedłużenia N- i C-końcowe i centralny peptyd przerywnika. Twórcy wynalazku stwierdzili, że dostarczenie funkcjonalnie aktywnej cząsteczki RIP nie zależy od jakichkolwiek ograniczeń konformacyjnych umieszczonych na nim przez nienaruszoną cząsteczkę pro-RIP lub przez reakcję cięcia. Aktywność funkcjonalna w bezkomórkowych systemach translacji rekombinowanych cząsteczek RIP pozbawionych centralnego przerywnika i peptydów terminalnych była opisana w opisach patentowych USA Nr US-5248606 i US-5646026.
Sekwencja kodująca białka kukurydzy inaktywującego rybosom może korzystnie dalej zawierać zrekombinowany RIP zawierający tylko domenę α lub zrekombinowany RIP zawierający tylko domenę β, sama domena α lub β jest częścią białka kukurydzy inaktywującego rybosom mającą wymaganą funkcjonalność. Domena α białka kukurydzy inaktywującego rybosom jest tą domeną, która jest umieszczona w stronę N-końca białka kukurydzy inaktywującego rybosom, podczas gdy domena β białka kukurydzy inaktywującego rybosom jest tą domeną, która jest umieszczona w stronę C-końca białka kukurydzy inaktywującego rybosom. Jeśli dodatkowe kwasy nukleinowe są włączone w domenie α lub β wówczas część aktywna będzie zazwyczaj nadal tylko domeną α lub β.
Nie wiążąc się z tą teorią przyjmuje się, że domena α zawiera regiony rozpoznawania i wiązania rybosomów podczas gdy domena β zawiera miejsce katalityczne potrzebne do depurynacji/cięcia rybosomu. Przed obecnym wynalazkiem uważano, że domena β jest niezbędna dla dostarczenia aktywnego białka kukurydzy inaktywującego rybosom. Tak więc było zadziwiające stwierdzenie, że włączenie samej domeny α (tzn. bez domeny β może być stosowane do dysrupcji funkcji rybosomów rośliny i powoduje nekrozę komórek roślin.
Sekwencja nukleotydów sekwencji kodującej pro-RIP jest określona w ID.SEKW. NR: 1 lub jest sekwencją kodującą do niej homologiczną; sekwencja nukleotydowa sekwencji kodującej RIP-P jest tą określoną w ID.SEKW. NR: 2 lub sekwencją kodującą do niej homologiczną; sekwencja nukleotydów sekwencji kodującej domeny α jest określona w ID.SEKW. NR: 3 lub jest sekwencją kodującą do niej homologiczną; sekwencja nukleotydów sekwencji kodującej domeny β jest tą określoną w ID.SEKW. NR: 4 lub sekwencją kodującą do niej homologiczną.
W zależności od wymaganej homologii sekwencji nukleotydów, moż na stosować różne warunki ostrości w procedurze hybrydyzacji stosowanej do poszukiwania podobnych sekwencji. Przykładowo, bez ograniczania się do, procedury hybrydyzacji stosujące warunki wysokiej ostrości są jak następuje: hybrydyzacja do DNA związanego z filtrem w 0,5 M NaHPO4, 7% siarczanie dodecylu sodu (SDS), 1 mM EDTA w 65°C, i płukanie w 0,1xSSC/0,1% SDS w 68°C (Ausubel F.M. i wsp., red., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, tom I, Green Publishing Associates, Inc., i John Wiley and Sons, Inc., New York, na str. 2.10.3). Inne warunki wysokiej ostrości, które mogą być stosowane są dobrze znane w dziedzinie. Procedury hybrydyzacji, które mogą być stosowane w warunkach umiarkowanej ostrości są jak następuje: hybrydyzacja do DNA związanego z filtrem w 0,5 M NaHPO4, 7% siarczanie dodecylu sodu (SDS), 1 mM EDTA w 65°C, i płukanie w 0,2xSSC/0,1% SDS w 42°C (Ausubel i wsp., 1989, powyżej). Inne warunki umiarkowanej ostrości, które mogą być stosowane są znane w dziedzinie. Inne roztwory takie jak standardowy solny roztwór cytrynianu sodu (SSC) lub (solny roztwór fosforan sodu EDTA) (SSPE) mogą być stosowane w procedurach hybrydyzacji.
PL 204 381 B1
Odpowiednie sekwencje homologiczne to sekwencje, które są przynajmniej w 70%, korzystnie 80% i jeszcze bardziej korzystnie w 90% lub 95% homologiczne do każ dej sekwencji tu podanej, które to homologiczne sekwencje zachowują wymaganą aktywność enzymatyczną.
Zgodnie z korzystną postacią wykonania sposobu według wynalazku sekwencja kodująca zrekombinowane dojrzałe RIP kukurydzy zawiera sekwencję kodującą, która wykazuje przynajmniej 80% identyczność z sekwencją określoną w ID. SEKW. Nr: 2, korzystniej przynajmniej 85% identyczność z sekwencją okreś loną w ID. SEKW. Nr: 2 a jeszcze korzystniej przynajmniej 90% identyczność z sekwencją okreś loną w ID. SEKW. Nr: 2.
W korzystnym wariancie wykonania sposobu wedł ug wynalazku gen chimerowy dodatkowo zawiera nieulegającą translacji sekwencję 3' terminatora.
W innym korzystnym wariancie wykonania sposobu według wynalazku nieulegającą translacji sekwencja 3' terminatora jest sekwencją z genów rośliny, bakterii lub wirusa. Korzystnie nieulegającą translacji sekwencja 3' terminatora jest wybrana z grupy obejmującej sekwencję terminatora rbcS E9 grochu, sekwencję terminatora nos pochodzącą z genu syntazy nopaliny Agrobacterium tumefaciens i sekwencję terminatora 35S z wirusa mozaiki kalafiora.
Osoba biegła w dziedzinie będzie znała inne odpowiednie sekwencje terminatora.
W kolejnym korzystnym wariancie wykonania sposobu wedł ug wynalazku gen chimerowy zawiera sekwencję wzmacniacza transkrypcji lub translacji i/lub wewnątrzkomórkowe sekwencje naprowadzające i introny, i/lub sekwencje nukleotydów ułatwiające proces transformacji i stabilną ekspresję genu chimerowego. Przykładowe sekwencje wzmacniacza transkrypcji lub translacji, stanowią te opisane w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym Publikacja Nr WO 97/20056. Przykłady sekwencji nukleotydów ułatwiających proces transformacji i stabilną ekspresję genu chimerowego stanowią regiony graniczne T-DNA, miejsca przyczepu do macierzy i sekwencje wycinania/rekombinacji.
W Międzynarodowych Zgłoszeniach Patentowych WO 98/32325 i WO 93/18170 opisano dwuskładnikowe systemy, w których stosuje się dwa lub więcej trans genów takich, że łączone efekty ich produktów ekspresji prowadzą do śmierci komórki. Indywidualne składniki są nieaktywne lub nieszkodliwe oddzielnie, ale wykazują efekt cytotoksyczny gdy są obecne razem. Każdy transgen jest sterowany przez oddzielny promotor, promotory są wybrane tak, że ich profile ekspresji zachodzą na siebie w pożądanym docelowym miejscu ś mierci komórki ale nie w innych tkankach. System dwuskładnikowy może zawierać oddzielnie domenę α i domenę β białka kukurydzy inaktywującego rybosom, każdy jako oddzielny konstrukt transgenu sterowanego przez promotor. Przykłady odpowiednich promotorów są opisane poniżej a dalsze będą znane osobom biegłym w dziedzinie. Taki system dwuskładnikowy może być produkowany przez krzyżowanie dwóch roślin, z których każda zawiera jeden składnik, przez łączenie transgenów przez kolejną lub równoczesną transformację dwoma konstruktami transgenów, lub przez transformację konstruktem zawierającym oba komponenty w pojedynczej kasecie. Dwie domeny mogą pochodzić z innych białek kukurydzy inaktywujących rybosom.
Promotor jest indukowany specyficznie lub zasadniczo specyficznie w i/lub koło miejsca docelowego. Jeśli promotor jest indukowany inaczej niż w miejscu docelowym i/lub komórkach koło miejsca docelowego promotor jest zasadniczo wyrażany w i/lub koło miejsca docelowego.
Zgodnie z pierwszym wykonaniem obecnego wynalazku miejsce docelowe może stanowić miejsce żerowania nicieni. Gdy miejsce docelowe jest miejscem żerowania nicieni wybranym promotorem jest taki, który jest indukowany w i/lub koło miejsca żerowania nicieni. Taki promotor jest korzystnie indukowany przy zakażeniu rośliny przez nicienie. Przykładem odpowiedniego promotora jest promotor KNT1. Izolacja promotora KNT1 jest podana w Patencie NZ Nr 260511 i jest dalej podana poniżej. Inne odpowiednie promotory obejmują promotor TobRB7 i promotory Lemmi. Izolacja promotora TobRB7 jest podana w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym WO 94/17194, i izolacja promotorów Lemmi jest ujawniona w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym Nr WO 92/21757.
Miejsce żerowania nicieni może być na przykład złożone z komórek roślinnych w miejscu zakażenia, które następnie różnicują się aby wytworzyć syncytium (dla nicieni cystowych) lub komórki olbrzymie i/lub towarzyszące komórki hipertroficzne (w przypadku nicieni węzłów korzeni) i/lub jedno lub więcej z komórek syncytium, komórek olbrzymich i towarzyszących komórek hipertroficznych.
Przez naprowadzanie miejsca żerowania nicieni można uzyskać roślinę oporną na nicienie. Przez określenie „roślina oporna na nicienie” rozumie się niniejszym roślinę, która po infekcji przez nicienia pasożytującego na roślinach jest zdolna do zapobiegania, spowolnienia lub w inny sposób wpływania w na wzrost i rozwój nicieni, które atakują roślinę zapobiegając w ten sposób narastaniu ekonomicznie znaczących gęstości nicieni pasożytów roślin w czasie jednego okresu wzrostu rośliny
PL 204 381 B1 uprawnej. Oznacza to, że nicień może na przykład umrzeć lub cykl życiowy nicieni może być spowolniony, co powoduje przedłużenie czasu, który jest niezbędny dla osiągnięcia dojrzałości a więc produkcji jaj, lub dojrzałe samice nicieni mogą być mniejsze a więc mieć mniejszą zdolność do składania jaj, jako że składanie jaj rozpoczyna się po osiągnięciu przez samice nicieni minimalnej krytycznej wielkości.
Obecny wynalazek znajduje zastosowanie między innymi w odniesieniu do następujących gatunków nicieni: Globodera spp., Heterodera spp. i Meloidogyne spp.
Zgodnie z drugim praktycznym wykonaniem wynalazku, zamiast oporności na nicienie sposób jest skierowany na spowodowanie męskiej sterylności u roślin. Na przykład miejscem docelowym może być jedno lub więcej wybrane spośród pyłku rośliny, pylników lub tapetum. Gdy na przykład miejscem docelowym jest tapetum wybrany promotor to taki, który jest indukowany w i/lub koło tapetum. Przykładem odpowiedniego dla tapetum promotora jest promotor TA29 tytoniu, jak ujawniono w Mariani i wsp. (1990). Promotory specyficzne dla pylników są ujawnione w Twell i wsp. (1991).
Zgodnie z trzecim praktycznym wykonaniem wynalazku sposób jest skierowany na uzyskanie żeńskiej sterylności u roślin. Na przykład, docelowym miejscem może być zalążek rośliny. To znaczy, że wybrany promotor jest takim, który jest indukowany w i/lub koło zalążka. Przykładem odpowiedniego promotora jest promotor AGL15 jak ujawniono w Perry i wsp., 1996.
Według czwartego wykonania wynalazku, manipulowana jest morfologia kwiatu rośliny. Na przykład, miejscem docelowym mogą być specyficzne części kwiatu, celem jest, że gdy te specyficzne części kwiatu się nie rozwijają zmienia się morfologia kwiatu. W tym przypadku wybrany promotor jest to taki, który jest indukowany w i/lub koło działki kielicha, słupka, płatka, i/lub pręcika. Przykłady odpowiednich promotorów są to te znajdowane w genach agamous, apetala3, globosa, pistillata i deficiens (Sieburth i Meyerowitz, 1997; Samach i wsp., 1997, i podane tam odnośniki).
Zgodnie z piątym wykonaniem wynalazku, sposób jest stosowany aby pomóc w lub promować odpadanie liści i/lub owoców w roślinach. Na przykład, docelowym miejscem może być strefa odcięcia liścia i/lub owocu. Tak więc wybrany promotor jest takim, który jest indukowany w i/lub koło takiej strefy odcięcia.
Szóstym aspektem wynalazku jest naprowadzanie do włośników, które to włośniki są typowo gruczołowe. Wybrany promotor to taki, który jest indukowany w i/lub koło włośników. Przez spowodowanie nekrozy włośników rośliny można zakończyć lub zapobiec produkcji chemicznych substancji przez włośnik. Siódmym wykonaniem obecnego wynalazku jest naprowadzanie bocznych korzeni, kolców lub włosków parzących.
Zgodnie z ósmym wykonaniem wynalazku sposób jest skierowany na kontrolę zakażeń wirusami. W czasie zakażeń wirusami szereg genów ulega specyficznej lub zasadniczo specyficznej indukcji w komórkach zakaż onych przez wirus. Wybrany promotor jest takim, który jest indukowany w i/lub koło komórek zakażonych przez wirus.
Według dziewiątego wykonania wynalazku sposób jest skierowany na ułatwienie uwalniania nasion z roślin, przez naprowadzanie nasion. W czasie rozwoju nasion istnieje szereg genów, które są indukowane specyficznie lub zasadniczo specyficznie w obrębie pewnych komórek/części nasiona.
Według dziesiątego wykonania wynalazku wybrany jest promotor, który jest indukowany z zewnątrz i który jest indukowany na przykład w korzeniach rośliny. Taki promotor można stosować do przeprowadzenia odpadnięcia korzeni pod koniec sezonu uprawy. Podobne promotory indukowane na przykład w ogonkach liści, szypułach lub szypułkach można by stosować do przeprowadzenia odpadania liści, kwiatów lub owoców pod koniec sezonu hodowlanego.
Techniki transformacji roślin są dobrze znane specjalistom w dziedzinie i obejmują na przykład transformację z udziałem Agrobacterium. Typowo w transformacji z udziałem Agrobacterium wektor binarny niosący obcy interesujący DNA np. gen chimerowy, jest przenoszony z odpowiedniego szczepu Agrobacterium docelowej rośliny przez kokultywację Agrobacterium z eksplantami z docelowej rośliny. Transformowana tkanka rośliny jest następnie regenerowana na podłożach selekcyjnych, które to podłoża selekcyjne zawierają marker selekcyjny i roślinne hormony wzrostowe.
Kolejne odpowiednie sposoby transformacji obejmują bezpośrednie przenoszenie genów do protoplastów stosując na przykład techniki z glikolem polietylenowym lub elektroporację, bombardowanie cząsteczkami, mikroiniekcję i stosowanie włókien węglika krzemu.
Odpowiednie gatunki roślin, które mogą być transformowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem obejmują, ale nie są do nich ograniczone, ryż, pszenicę, kukurydzę, rzepak, ziemniak, tytoń, burak
PL 204 381 B1 cukrowy, soję, pomidor, orzeszki ziemne, bawełnę, winorośl, arbuz, papaję, jarzyny i pokarmowe rośliny strączkowe.
Dla lepszego zrozumienia i łatwiejszej realizacji wynalazku wynalazek przedstawiono na rysunkach na których:
Fig. 1 przedstawia wpływ dojrzałego białka kukurydzy inaktywującego rybosom (RIP-P) na rybosomy tytoniu mierzony za pomocą syntezy białka GUS;
Fig. 2 przedstawia efekt dawki różnych ilości DNA RIP-P kukurydzy (20 μg do 0,02 mg) na rybosomy tytoniu mierzony za pomocą syntezy białka GUS;
Fig. 3 przedstawia wpływ dojrzałych białek RIP-P na rybosomy tytoniu mierzony za pomocą syntezy białka α-amylazy i GUS;
Fig. 4 przedstawia wpływ oddzielnych domen α i β RIP i połączonych domen α i β na rybosomy tytoniu mierzony za pomocą syntezy białka GUS;
Fig. 5 przedstawia schematycznie konstrukty pDVM35S i pATC promotora KNT1 i konstrukty pATC KNT RIP α KNT/RIP β stosowane w transformacji roślin;
Fig. 6 przedstawia wielkość dorosłych nicieni w liniach kontrolnych i transgenicznych RIP kukurydzy przedstawione jako wykres kumulatywnej częstości;
Fig. 7 przedstawia wielkość samic znoszących jaja w tych samych liniach kontrolnych i transgenicznych RIP kukurydzy przedstawione jako wykres kumulatywnej częstości;
Fig. 8 przedstawia porównanie między wielkościami dorosłych i znoszących jaja nicieni węzłów korzeni w liniach kontrolnych i transgenicznych przedstawione jako wykres kumulatywnej częstości;
Fig. 9 przedstawia liczbę galasów i trzy kategorie nicieni dla każdej transgenicznej linii nicieni. Linie A do G są potomstwem z transformantów RIP-P kukurydzy, linie I do Q są potomstwem z dwuskładnikowych transformantów kukurydzy RIPa/RIPe i linie P i Q są nietransformowanymi liniami kontrolnymi;
Fig. 10 przedstawia wektor do transformacji pATC, do którego wstawiono konstrukty RIP z Fig. 5 w celu transformacji roślin;
Fig. 11 przedstawia wektor do klonowania pDE4;
Fig. 12 jest schematycznym wykresem produkcji wariantów białka kukurydzy inaktywującego rybosom za pomocą PCR;
Fig. 13 przedstawia konstrukt stosowany do uzyskania męskiej sterylności;
Fig. 14 przedstawia wytwarzanie łagiewki pyłkowej dla pyłku typu dzikiego (z lewej) ze strzałkami przy łagiewkach i transgenik RIP-P (z prawej) ze zdeformowanym ziarnkiem pyłku pozbawiony łagiewek; i
Fig. 15 przedstawia pyłek typu dzikiego z cv Desiree (z lewej) wykazujący pobieranie FDA przez żywotne ziarnka pyłku i podobną liczbę ziarenek pyłku z linii transgenicznej RIP-P (z prawej) wykazujący tylko jeden z pobieraniem PDA. Ziarna pyłku mają średnicę 50 nm.
PRZYKŁADY
Klonowanie i sekwencjonowanie białka kukurydzy inaktywującego rybosom
Genomowy DNA ekstrahowano z 14-dniowych siewek odmiany kukurydzy Earli King.
Startery zaprojektowano z sekwencji nukleotydów genomowego DNA RIP kukurydzy aby wygenerować warianty sekwencji RIP przez wyeliminowanie N- i C-końcowych regionów i centralnego przerywnika. Startery także zaprojektowano aby usunąć miejsce SacI w sekwencji RIP i w ten sposób ułatwić klonowanie (Fig. 12). Sekwencje RIP amplifikowano za pomocą polimerazy Pfu.
Sekwencję ProRIP (ID.SEKW. NR: 1) uzyskano za pomocą PCR DNA genomowego jak następuje:
Aby usunąć miejsce restrykcyjne SacI w genie przeprowadzono dwie reakcje PCR stosując startery PRORIPBF (ID.SEKW. NR:5) plus RIPSDR (SEQ. ID. NO. 14) i RIPSDF (ID.SEKW. NR: 13) plus PRORIPSR (ID.SEKW. NR:6) odpowiednio. Produkty PCR oczyszczono w żelu i połączono. Przedłużenie sekwencji zachodzących na siebie a następnie amplifikacja PCR z zastosowaniem starterów PRORIPBF (ID.SEKW. NR:5) i PRORIPSR (ID.SEKW. NR:6) dała sekwencję pełnej długości ProRIP (ID.SEKW. NR: 1).
PCR ProRIP ze starterami RIP1BF (ID.SEKW. NR: 7) i RIP2SR (ID.SEKW. NR: 8) dało w efekcie produkt PCR około 800 bp, odpowiadający domenom RIPa, RIPe i centralnej. Ten produkt („RIP-CD”) strawiono endonukleazami restrykcyjnymi XbaI i SalI, oczyszczono z żelu, zligowano do wektora pBluescript, transformowano do komórek E. coli X1-Blue i poddano sekwencjonowaniu. Sekwencja była identyczna do ekwiwalentnego regionu DNA RIP kukurydzy.
PL 204 381 B1
Centralny region przerywnika usunięto jak następuje. DNA RIP-CD amplifikowano w dwóch reakcjach PCR stosując startery RIP1BF (ID.SEKW. NR: 7) plus RIPCDR (ID.SEKW. NR: 12) i RIPCDF (ID.SEKW. NR: 11) plus RIP2SR (ID.SEKW. NR: 8). Produkty PCR oczyszczono w żelu i połączono. Przedłużenie obszarów zachodzących na siebie, po którym nastąpił PCR ze starterami RIP1BF (ID.SEKW. NR: 7) i RIP2SR (ID.SEKW. NR: 8) dał w efekcie w pełni obrobiony RIP (RIP-P). RIP-P strawiono endonukleazami restrykcyjnymi Xbal i SalI, oczyszczono w żelu, wligowano do wektora pBluescript, transformowano do komórek E. coli X1-Blue i poddano sekwencjonowaniu. Sekwencja RIP-P jest tu identyfikowana jako ID.SEKW. NR: 2.
Dalsze reakcje PCR przeprowadzono na RIP-CD stosując albo startery RIP1BF (ID.SEKW. NR: 7) plus RIP1SR (ID.SEKW. NR: 9) albo startery RIP2BF (ID.SEKW. NR: 10) plus RIP2SR (ID.SEKW.
NR: 8) aby zamplifikować odpowiednio domeny RIPa lub RIPe. RIPa lub RIPe strawiono endonukleazami restrykcyjnymi XbaI i SalI, oczyszczono w żelu, wligowano do wektora pBluescript transformowano do komórek E. coli X1-Blue i poddano sekwencjonowaniu. Sekwencje RIPa i RIPe są tu określane odpowiednio jako ID.SEKW. NR: 3 i ID.SEKW. NR:4.
Otrzymywanie konstruktów obejmujących białko kukurydzy inaktywujące rybosom dla oceny w oznaczeniu przejściowym w protoplastach
Konstrukty zawierające promotor konstytutywny wirusa mozaiki kalafiora połączony z sekwencją kodującą pochodzącą z białka kukurydzy inaktywującego rybosom i sekwencję terminatora Nos otrzymano w wektorze pochodzącym z pDE4 (Denecke i wsp., 1990) (patrz Fig. 11) odpowiednie do stosowania w systemie ekspresji przejściowej w protoplastach. Przygotowano następujące konstrukty i przedstawiono schematycznie na Fig. 5:
1. pDE4/Pro RIP
2. pDE4/RIP P („dojrzały” RIP)
3. pDE4/RIP a
4. pDE4/RIP β
Oznaczenia przejściowe konstruktów PAP-S w protoplastach tytoniu
W tym oznaczeniu wykrywano inaktywację rybosomów z udziałem białka inaktywującego rybosomy za pomocą oceny syntezy białka. Protoplasty przygotowano z liści hodowanych in vitro roślin tytoniu i elektroporowano konstruktami RIP. Wydajność translacji rybosomów w protoplastach tytoniu oceniano za pomocą genu reportera GUS w konstrukcie pDE4 pod kontrolą promotora 35S CaMV. Konstrukt GUS pDE4 koelektroporowano z każdym konstruktem PAP-S. Aby uzyskać wartości dla optymalnych poziomów syntezy białka GUS w protoplastach we współzawodnictwie z drugim białkiem stosowano kontrolę GUS-dodatnią, gdzie konstrukt nietoksycznego białka opiekuńczego BiP, pDE800 (Leborgna-Castel i wsp., 1999) koelektroporowano do protoplastów tytoniu razem z konstruktem GUS pDE4. Stosowano też kontrolę GUS-negatywną gdzie pusty wektor pDE4 elektroporowano do protoplastów tytoniu razem z konstruktem nietoksycznego białka opiekuńczego BiP.
(i) Dojrzały RIP-P kukurydzy
Konstrukty RIP-P kukurydzy poddano koelektroporacji z konstruktem GUS do protoplastów tytoniu. Wpływ aktywności RIP na rybosomy oznaczono przez pomiar aktywności GUS po 24 godzinach ekspresji (Fig. 1). Efekt dawki tego konstruktu mierzono przez elektroforezę różnych ilości (0,02 μg do 20 μg) konstruktu RIP-P kukurydzy (Fig. 2).
Wyniki wykazują, że dojrzałe białko RIP-P kukurydzy wydajnie inaktywuje rybosomy tytoniu. W efekcie tylko podstawowe poziomy aktywności GUS są obserwowane w porównaniu z kontrolą GUS dodatnią.
Wydajność inaktywacji rybosomów zależała od ilości DNA elektroporowanego do protoplastów. Wyższe ilości DNA RIP (20 μg) indukowały inaktywację rybosomów szybko i obserwowano tylko podstawowy poziom aktywności GUS. Niższe użyte ilości DNA (0,02 μg) powodowały znacznie większą resztkową aktywność GUS, być może ze względu na dłuższy czas potrzebny by RIP osiągnął krytyczne stężenia białka i całkowicie unieczynnił rybosomy.
(ii) Aktywność RIP-P kukurydzy na różne rybosomy komórki
Przeprowadzono doświadczenie aby zbadać czy RIP-P kukurydzy depurynuje zarówno rybosomy na reticulum endoplazmatycznym (ER) i w cytosolu. Jako przykład białka syntetyzowanego w ER białko a-amylaza posiada N-końcową sekwencję sygnalną i białko jest wydzielane przez ER. Konstrukt a-amylazy poddano koelektroporacji do protoplastów razem z konstruktem RIP-P i dla porównania stosowano także konstrukt GUS. Po ekspresji przez 24 godziny przeprowadzono oznaczenie amylazy (Fig. 3).
PL 204 381 B1
Wyniki nie wykazały znaczącej różnicy między efektem RIP-P na aktywności α-amylazy i GUS. Dojrzały RIP-P kukurydzy inaktywował wszystkie rybosomy niezależnie od ich lokalizacji komórkowej. Wyniki tych oznaczeń z RIP-P kukurydzy wykazują, że enzym jest wysoce skuteczny aby indukować całkowitą inaktywację rybosomów i następnie atenuację komórek lub śmierć komórek.
(iii) Oddzielne domeny RIP kukurydzy
Regiony polipeptydów kukurydzy RIPa i RIPe były także wyrażane albo oddzielnie albo razem w protoplastach tytoniu (Fig. 4).
Ekspresja samego białka RIPa zadziwiająco spowodowała znaczące obniżenie aktywności GUS. Przeciwnie, stwierdzono, że ekspresja samego białka RIPP nie dała efektu. Na podstawie przewidywań strukturalnych, RIPa zawiera motyw rozpoznawania RNA i regiony domeny wiążącej rybosomy, ale nie zawiera istotnego miejsca reszty katalitycznej. Białko RIPa może zapobiegać translacji przez wiązanie rybosomów i zapobieganie translacji białka. To by sugerowało, że RIPa przyjmuje prawidłowo zwiniętą konformację i jest zdolne do specyficznego rozpoznawania molekularnego. RIPe zawiera reszty aktywnego miejsca potrzebne do depurynacji rybosomów i nie oczekiwano by było zdolne do interakcji z rybosomem.
Ekspresja zarówno RIPa i RIPe równocześnie w protoplastach dała dalsze zmniejszenie aktywności GUS w porównaniu z samymi białkami RIPa i RIPe. Sugeruje to, że dwa peptydy są zdolne do interakcji i ułatwiają depurynację rybosomów.
Izolacja promotora, który jest indukowany w i/lub koło miejsca docelowego
Jest tu podany sposób izolacji promotora, który to sposób jest podany jako przykład. Alternatywne sposoby izolacji odpowiedniego promotora dla stosowania w obecnym wynalazku będą łatwo dostępne dla osoby biegłej w dziedzinie, dla niektórych z tych metod podane są odnośniki powyżej. Poniżej przedstawiono sposób izolacji promotora KNT1:
Wzrost i zakażenie roślin tytoniu
Nasiona tytoniu C319 kiełkowano na kompoście Fisons F1 w następujących warunkach: intensywność światła 4500 do 5000 luks; 16 godz. dzień/8 godz. noc; temperatura 20-25°C. Po około 3 tygodniach siewki łagodnie płukano w wodzie wodociągowej aby usunąć glebę i przeniesiono do toreb (Northrup-King), 2 rośliny na torbę, i hodowano jeszcze przez tydzień w Conviron w 25°C z oświetleniem jak powyżej. Korzenie podniesiono z tyłu torby i podtrzymywano papierem z włóknem szklanym Whatman GF/A na ich końcach. Trzydniowe nicienie (M.javanica) następnie dostarczono do końców tych korzeni w próbkach 10 μl (50 nicieni) i na wierzchu umieszczono drugi kawałek papieru GF/A aby w pełni otoczyć koniec korzenia. Po 24 godzinach po infekcji usunięto papier GF/A aby zapewnić synchroniczną infekcję. Po 3 dniach po zakażeniu węzły korzeni wycięto (pozostawiając zdrowy korzeń i tkankę czubka korzenia) i natychmiast zamrożono w ciekłym azocie. Około 0,5-1,0 g zakażonej tkanki korzeni zebrano z 80 zaszczepionych roślin.
Barwienie w celu wizualizacji nicieni w zakażonych korzeniach
Jakość infekcji była oznaczana przez określenie liczby zakażających nicieni na czubek korzenia. Korzenie zebrano 3 dni po zakażaniu roślin i zanurzono przez 90 sekund w laktofenolu zawierającym w 0,1% Cotton Blue w 95°C. Po płukaniu 5 sekund w wodzie korzenie umieszczono w laktofenolu w temperaturze pokojowej (RT) przez 3-4 dni w celu sklarowania. Wybarwione nicienie wizualizowano stosując mikroskopię świetlną.
Izolacja RNA ze zdrowej i zakażonej tkanki korzeni
Tkanka korzenia była mielona na drobny proszek w moździerzu z tłuczkiem schłodzonym ciekłym azotem. Około 100 mg próbki następnie przeniesiono do podobnie schłodzonych probówek do mikrowirówki i dodano 300 μl buforu do ekstrakcji gorącym fenolem (50% fenol, 50% bufor do ekstrakcji, 0,1M chlorek litu, 0,1M Tris-HCl pH 8,0 (RT), 10 mM EDTA, 1% SDS) i inkubowano w 80°C przez 5 minut. Wówczas dodano równą objętość chloroformu i homogenat żwirowano w mikrowirówce przez 15 minut w 4°C. Fazę wodną następnie ekstrahowano 600 μl fenolu/chloroformu i wirowano w mikrowirówce jak powyżej. Fazę wodną ponownie usunięto i RNA strącono równą objętością chlorku litu w 4°C przez noc. Osad żwirowano przez wirowanie w mikrowirówce przez 15 minut w RT i przepłukano 70% etanolem. Osad liofilizowano, ponownie zawieszono w wodzie poddanej działaniu DEPC i oznaczono stosując spektrofotometr. Jakość RNA oceniono przez elektroforezę w żelu denaturującym. (Przystosowane z Shirzadegan i wsp., 1991).
Klonowanie subtrakcyjne cDNA specyficznych dla infekcji
RNA poli(A)+ (mRNA) izolowano z 200 μg całkowitego RNA ze zdrowej i zakażonej tkanki korzeni C319 stosując magnetyczne oligo dT Dynabeads według instrukcji producenta. Syntezę pierwszej nici
PL 204 381 B1 cDNA wykonano na frakcji poli(A)+ związanej z Dynabeads ze zdrowych tkanek by dostarczyć DNA sterujące. Syntezę pierwszej i drugiej nici przeprowadzono in situ na frakcji związanej z Dynabeadpoli(A)+ z zakażonej tkanki by zapewnić docelowy DNA. Wszystkie reakcje cDNA przeprowadzono stosując zestaw do syntezy cDNA według instrukcji producenta (Pharmacia). Trzy oligonukleotydy SUB21 (5'CTCTTGCTTGAATTCGGACTA 3') określane tu jako SEQ. ID. NO. 30, SUB25 (5' TAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA 3') (sekwencje z Duguid i Dinauer, 1990) i określane tu jako SEQ. ID. NO. 31 i LDT15 (5' GACAGAAGCGGATCCd(T)15 3') (O'Reilly, 1991) określane tu jako SEQ. ID. NO. 32 kinazowano kinazą polinukleotydową T4 według Maniatis i wsp. (1982). SUB21 i SUB25 następnie hybrydyzowano aby wytworzyć linker, który następnie zligowano do DNA sterującego za pomocą ligazy DNA T4 według King i Blakesley (1986). Następnie paciorki niosące docelowy wektor DNA płukano starannie TE i eluowano drugą nić cDNA w 95°C w 5xSSC.
RNA związany z DNA sterującym związanym z Dynabead usunięto za pomocą ciepła i eluowany docelowy DNA hybrydyzowano do sterującego DNA w 55°C w 5xSSC przez 5 godzin. Nie hybrydyzujące docelowe DNA oddzielono od związanego z paciorkami sterującego DNA w temperaturze pokojowej (RT) według instrukcji producenta po czym hybrydyzujące DNA docelowe podobnie oddzielono od związanego z paciorkami DNA sterującego w 95°C. Wyeluowane w RT docelowe DNA następnie z powrotem dodano do sterującego DNA i powtórzono hybrydyzację. Proces ten powtarzano aż ilość docelowego hybrydyzującego do sterującego już nie przekraczała ilości, która nie hybrydyzowała. Ustalono stężenia DNA stosując DNA Dipstick (Invitrogen) zgodnie z instrukcją producenta.
Próbki ostatniej frakcji wyeluowanej w RT stosowano w amplifikacji PCR (Eckert i Kunkel, 1990) aby wygenerować dwuniciowy cDNA do klonowania w wektorze plazmidowym. Amplifikację docelowej sekwencji przeprowadzono stosując startery SUB21 i LDT15 według warunków opisanych przez Frohman i wsp., 1988. Produkty PCR następnie wligowano do wektora pBluescript strawionego Smal według King i Blakesley (1986).
Przeszukiwanie biblioteki subtrakcyjnej za pomocą odwrotnej analizy typu Northern
Rekombinanty identyfikowano za pomocą kolonijnego PCR (Gussow i Clackson, 1989). Zamplifikowane wstawki przenoszono techniką Southerna w trzech powtórzeniach na membrany Pall Biodyne według zaleceń producenta. Prehybrydyzacja i hybrydyzacja były obie przeprowadzone w 42°C w 5xSSPE, 0,05% BLOTTO, 50% formamid. Membrany hybrydyzowano oddzielnie do sond cDNA (patrz poniżej) z tkanki zdrowej i zakażonej i do sondy zawierającej zamplifikowany docelowy DNA z ostatecznej subtrakcji. Klony wykazują ce sygnał hybrydyzacji tylko do sondy zakaż onego cDNA lub wykazujące sygnał hybrydyzacji tylko do odjętej sondy były wybrane do dalszej analizy.
Generacja sond cDNA
Próbki 10 μg całkowitego RNA ze zdrowej i zakażonej tkanki poddano działaniu 2,5 jednostek DNazy1 w 37°C przez 15 minut. Następnie DNazę1 denaturowano w 95°C przez 10 minut przed przeprowadzeniem syntezy cDNA stosując protokół producenta (Pharmacia). RNA następnie usunięto w obecności 0,4M wodorotlenku sodu przez 10 minut w RT i cDNA oczyszczono przez wirowaną kolumnę Sephacryl 400HR. Wydajność i stężenie określono stosując DNA Dipsticks (Invitrogen). cDNA wyznakowano stosując ok. 35 ng/sondy stosując standardowy protokół oligoznakowania Pharmacia.
Transfer typu Northern
Aby określić profil ekspresji klonów wybranych z odwróconych Northernów, zostały one zastosowane jako sondy w analizie typu Northern albo całkowitego albo poli(A)+ RNA ze zdrowych i zakażonych korzeni, łodyg, liści i kwiatów. Bloty całkowitego RNA zawierały 25 μg RNA na ścieżkę, podczas gdy bloty poli(A)+ RNA zawierały 0,5-1,0 μg RNA na ścieżkę. RNA poddano elektroforezie w żelach formaldehydowych i przenoszono na membrany Pall Biodyne B jak opisali Fourney i wsp. (1988). Sondy znakowano i hybrydyzowano jak powyżej.
Transfer typu Southern
Aby określić czy wybrane cDNA pochodziły od roślin czy od nicieni przygotowano DNA tytoniu C319 i M.javanica jak opisali Gawel i Jarret (1991). Przygotowano bioty typu Southerna zawierające 10 μg DNA strawionego EcoRI i Hindlll na ścieżkę. Bloty hybryzowano do znakowanych sond oligonukleotydowych jak opisano powyżej.
Hybrydyzacje in situ
Aby określić miejsce ekspresji interesujących cDNA w miejscu żerowania przeprowadzono hybrydzację in situ. Tkankę z zakażonych i zdrowych korzeni zatopiono w wosku, pocięto i hybrydyzowano do sond jak opisał Jackson (1991).
PL 204 381 B1
Izolacja końców 5' mRNA
Końce 5' interesujących RNA określano przez stosowanie 5' RACE jak opisali Frohman i wsp. (1988).
Izolacja regionów promotora
Regiony promotora interesujących genów izolowano za pomocą PCR zligowanego wektora. 100 ng próbki genomowego DNA C310 strawionego endonukleazą restrykcyjną zligowano przez 4 godziny w RT (King i Blakesley, 1986) z 100 ng próbek pBluescript (trawiony endonukleazą restrykcyjną dającą kompatybilne końce). Typowo stosowanymi enzymami były EcoRI, BamHI, Hindlll, Bglll, XhoI, ClaI, SalI, KpnI, Pstl i Sstl. Następnie przeprowadzono PCR na ligacjach stosując starter wektora taki jak starter do -40 i starter komplementarny do końca 5' mRNA. Produkty PCR następnie sklonowano i zsekwencjonowano. Jeśli było to konieczne proces ten powtórzono z nowym starterem komplementarnym do końca 5' fragmentu promotora aby zapewnić izolację sekwencji kontrolnych promotora.
Stosując opisane powyżej procedury zidentyfikowano i wyizolowano gen KNT1 z roślin tytoniu. Wyizolowano fragment promotora KNT1 o długości około 0,8 Kbp od miejsca startu transkrypcji i wstawiono do wektora reporterowego GUS pBI101 (Jefferson i wsp., 1987). Powstały konstrukt, pBIN05101, zastosowano do transformacji roślin tytoniu. Po zakażeniu M.javanica, zaobserwowano silną ekspresję GUS w miejscu żerowania nicieni.
Wykazano, że gen KNT1 ma homologi w innych gatunkach roślin niż tytoń. Obejmują one, ale nie są ograniczone do, Solanum tuberosum, Lycopersicon esculentum i Beta vulgaris. Gen KNT1 jest także indukowany przez gatunki nicieni zarówno węzłów korzeni jak i cystowe.
Kostrukt pBIN05101 został zdeponowany przez Advanced Technologies (Cambridge) Limited, 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 0WA, Anglia w ramach Traktatu Budapeszteńskiego o Mi ę dzynarodowym Uznaniu Deponowania Mikroorganizmów dla celów Procedury Patentowej w National Collections of Industrial, Food i Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Street, Aberdeen, Szkocja 20 marca 1997 pod numerem dostępu NCIMB 40870. Wektor zawiera lewe i prawe granice T-DNA szczepu C58 Agrobacterium tumefaciens. Między granicami są wielokrotne miejsca klonowania i gen oporności na kanamycynę pod kontrolą roślinnego promotora (Nos). Na zewnątrz granic wektor zawiera bakteryjny gen oporności na kanamycynę. Wstawka w wektorze składa się z promotora KNT1 - sekwencji kodującej glukuronidazy -terminatora Nos. Produkcja konstruktów do badania transformacji roślin, które to konstrukty zawierają białko kukurydzy inaktywujące rybosom i promotory, które są indukowane w i/lub koło miejsca żerowania nicieni
Konstrukty zawierające promotor KNT1 reagujący na nicienie połączony z sekwencją kodującą białka inaktywującego rybosomy i terminatorem Nos w wektorze do transformacji roślin pochodzącym od pATC (Fig. 10) użyto do badań z transformacją. Zostały one zaprojektowane do zbadania skuteczności konstruktów RIP w indukcji śmierci komórki w miejscach żerowania ustalonych przez nicienie. Konstrukty były montowane w wektorze pDVM i następnie kasety transgenów wycięto endonukleazą restrykcyjną Notl i wklonowano do binarnego wektora pATC. Konstrukty wprowadzono do Agrobacterium tumefaciens LBA4404 za pomocą elektroporacji. Wyprodukowano następujące konstrukty:
1. pATCKNT1/Pro RIP
2. pATCKNT1/RIP-P
3. pATCKNT1/RIP α
4. pATCKNT1/RIP β
Przygotowano ostateczny konstrukt zawierający zarówno region kodujący RIP α i RIP β pod dwoma promotorami reagującymi na nicienie (Fig. 5). Drugi zastosowany promotor był określony jako KNT2 (patrz ID.SEKW. NR: 18). Ten konstrukt nazwano pATC KNT2/RIP α KNT1/RIP β
Promotor KNT1 jest wyrażany w komórkach miejsca żerowania, czubkach korzeni i w znacznie mniejszym stopniu w innych merystemach. Promotor KNT2 jest wyrażany w ciele korzenia i komórkach miejsca żerowania (ale nie w czubkach korzeni). Tak więc jest zachodząca na siebie ekspresja komórek miejsca żerowania powodując wzmożoną specyficzną cytotoksyczność w stosunku do roślin tam gdzie domeny α i β są wyrażane razem.
Konstrukty do stosowania w innych wykonaniach wynalazku są przygotowane podobnie z odpowiednimi promotorami dla alternatywnego odpowiedniego wykonania.
Produkcja roślin transgenicznych zawierających konstrukty RIP kukurydzy pod kontrolą promotorów indukowalnych przez nicienie
PL 204 381 B1
Wszystkie powyższe konstrukty (patrz Fig. 5) wprowadzono do ziemniaka cv Hermes i tytoniu cv K326 za pomocą metody kokultywacji krążków liści stosując szczep LBA4404 Agrobacterium tumefaciens (Horsch i wsp., 1985).
Wygenerowano transgeniczne rośliny ziemniaka i tytoniu, i przeprowadzono badania oporności na nicienie w szklarni. Skrining na oporność stosując rośliny tytoniu zakażone Meloidogyne javanica
Transgeniczne i kontrolne roślinki tytoniu hodowano w doświadczeniu randomizowanym ze ślepą w kompoście do korzeni drobnym bez nawozów i większe liście obcięto o połowę. Rośliny przykryto polietylenem aby utrzymać wysoką wilgotność w czasie przestawiania. Stopniowo wycinano dziury w polietylenie aby zmniejszyć wilgotno ść przed zakoń czeniem przestawiania. Tydzień po przestawieniu, małe rośliny zakażono 200 wylęgniętymi nicieniami J2 Meloidogyne javanica. Podlewanie płynną pożywką następnie wykonywano tylko gdy ziemia wyschła dostatecznie by powodować więdnięcie liści. Pojemniki na korzenie umieszczono na tacach na podgrzewanych matach aby utrzymywać temperaturę gleby między 25-30°C. Liście podcinano raz na tydzień aby wyrównać wzrost i zapobiec by punkty wzrostu zostały pokryte przez większe liście ze względu na gęstość wysiania.
Rośliny zebrano w celu analizy około 8 tygodni po zakażeniu. Typowo korzenie płukano i badano wzrost korzeni, poziom tworzenia galasów i wielkość galasów.
Badanie oporności stosując rośliny ziemniaka zakażone Globodera pallida odmiana patologiczna 2/3
Badanie pierwotnej oporności roślin transgenicznych prowadzono w próbach randomizowanych ze ślepą na partiach 20 do 25 linii transgenicznych z przynajmniej dziesięcioma powtórzeniami 2 lub więcej linii kontrolnych. Pojemniki na korzenie lub pojemniki stożkowe wypełniono mieszaniną 50:50 gliny i piasku. 12 litrów gliny i piasku zwilżono 1250 ml wody dając zawartość wody 40%. 3 cysty umieszczano na korzeniach każdej roślinki, która była następnie wstawiana do dziury w kompoście i kompost delikatnie zamykano wokół korzenia. Rośliny przestawiano i następnie podlewano tylko raz na tydzień płynną pożywką lub gdy ziemia była dostatecznie sucha. Gdy rośliny osiągnęły wysokość ok. 10 cm podcinano ich wierzchołki by wyrównać wzrost.
Rośliny hodowano dokładnie przez trzy miesiące by pozwolić na dojrzenie cyst. Roślinom następnie pozwolono na wysuszenie przez następny miesiąc. Cysty odzyskano z roślin przez płukanie ziemi i korzeni energicznie w zlewce z 250ml wody. Pozwolono glebie na opadnięcie przez kilka minut i supernatant zlano do dużego lejka sączą cego z krążkiem 32 cm z bibuł y Whatman Nr 1. Supernatant pozostawiono w sączku przez minutę i następnie dotknięto środka powierzchni roztworu kropelką detergentu Hederol aby przesunąć materiał na menisku roztworu na bok filtru. Następnie przedziurawiono podstawę filtru aby usunąć resztę roztworu. Usunięto krążek filtru i policzono liczbę przylegających do niego cyst.
Rośliny traktowano jako wykazujące oznaki oporności o ile były zakażone mniejszą liczbą cyst niż wrażliwe linie kontrolne.
Badanie zakażenia tytoniu i ziemniaka przez nicienie za pomocą barwienia
Rośliny tytoniu z hodowli tkankowej lub siewki wysiewano i hodowano jak opisano powyżej z nastę pują c ą modyfikacją . Ro ś liny zakaż ano 1000 wylę gnię tymi nicieniami Meloidogyne javanica. Rośliny ziemniaka zakażano Globodera pallida jak opisano powyżej.
Jeden miesiąc po zakażeniu z roślin pobrano wycinki. Korzenie odpłukano do czysta od gleby i odbarwiano przez 4 minuty w 1% podchlorynie sodu. Wybielacz usunię to przez pł ukanie wodą i następnie moczenie w dużej objętości wody przez 15 minut z mieszaniem od czasu do czasu. Korzenie następnie umieszczono w 10 do 15 ml rozcieńczenia 1:500 roztworu wyjściowego kwaśnej fuksyny w 5% kwasie octowym. (Roztwór wyjściowy kwaś nej fuksyny przygotowano według 'Introduction to Plant Nematology' V. H. Dropkin, ISBN 0-47185268-6. Rozpuścić 0,35 g kwaśnej fuksyny w 100 ml 1:3 lodowaty kwas octowy: woda destylowana). Próbki w barwniku umieszczono we wrzącej łaźni wodnej przez 4 minuty i przeniesiono do 37°C na cztery godziny. Barwnik zdekantowano i próbki sklarowano przez dodanie zakwaszonego glicerolu i inkubację w 37°C przez noc.
Oczyszczone korzenie z wybarwionymi nicieniami następnie umieszczano w szalkach Petriego (próbka była umieszczana na wewnętrznej stronie wieczka szalki Petriego i podstawa szalki Petriego była stosowana do rozprzestrzenienia i ściśnięcia próbki aby łatwiej ją zobaczyć pod mikroskopem).
Próbki oglądano w powiększeniu 20 do 100x i nicienie określano na kilka sposobów. Nicienie węzłów korzeni dzielono na trzy kategorie a) nicienie robakowate, b) torbiaste nicienie, które nie produkują jaj c) torbiaste nicienie, które produkują jaja. Cechy zasadniczo torbiastych nicieni mierzono stosując siatkę nitek okularu. Nicienie cystowe były także dzielone na trzy kategorie: a) robakowate
PL 204 381 B1 nicienie, b) grube robakowate nicienie i c) globularne nicienie produkujące jaja. Średnice zasadniczo globularnych nicieni były mierzone stosując siatkę nitek okularu.
Efekty na oporność mierzono pod kątem absolutnych liczb nicieni w układzie korzeni, pod kątem proporcji nicieni osiągających dojrzałość i produkujących jaja i pod kątem wielkości nicieni.
Zidentyfikowano szereg linii opornych tytoniu i ziemniaka wyrażających RIP kukurydzy jako pojedynczy składnik efektora jak i składnik systemu dwuskładnikowego. Próby doniczkowe wybranych linii ziemniaka z RIP kukurydzy
Skiełkowane bulwy wybranych linii ziemniaka cv Hermes namnożono i stosowano w standardowych badaniach oporności nicieni cystowych z G. pallida rasa 2/3 na którą dostępna jest tylko częściowa oporność. Ziemniaki obejmowały cztery linie transformowane obrobionym RIP kukurydzy i cztery linie transformowane dwuskładnikowym konstruktem RIPa/RIPe. Próba obejmowała nietransformowane Hermes i Prairie zarówno jako wyjściowe bulwy (kontrola) i materiał, który przeszedł przez tę samą procedurę hodowli tkankowej jak rośliny transgeniczne (kontrola ncc). Dodatkowo próby obejmowały nietransformowane odmiany kontrolne Desiree i Maris Piper (oba wrażliwe na PCN) i Sante (częściowa oporność na PCN rasa 2/3, najlepsza linia dostępna handlowo.
Tabela 1 przedstawia podsumowanie wyników wyrażonych jako procent podatności linii transgenicznych względem nieopornych kontroli.
T a b e l a 1
| Konstrukt | Odmiana hodowlana | Linia | Procent Wrażliwości |
| RIP P | Hermes | 1 | 143 |
| RIP P | Hermes | 10 | 72 |
| RIP P | Hermes | 13 | 45** |
| RIP P | Hermes | 15 | 63 |
| RIPoc/RIPP | Hermes | 9 | 44** |
| RJPa/RIPP | Hermes | 11 | 65 |
| RIPa/RIPP | Hermes | 14 | 103 |
| RIPa/RIPp | Hermes | 15 | 88 |
| NCC Kontrola | Hermes | 90 | |
| Kontrola | Hermes | 139 | |
| NCC Kontrola | Prairie | 115 | |
| Kontrola | Prairie | 93 | |
| Kontrola | Desiree | 94 | |
| Kontrola | Maris Piper | 62 | |
| Kontrola | Sante | 21 |
Stwierdzono duży stopień zmienności w liczbie cyst PCZ zarówno między kontrolami i między poszczególnymi powtórzeniami, co może być przypisane czynnikom środowiskowym. Jednak jedna linia z obrobionym RIP kukurydzy (RIP-P) i jedna dwuskładnikowa linia z RIP kukurydzy wykazywała znaczący we wrażliwości względem linii kontrolnych. Są one oznakowane przez ** w Tabeli 1. W systemie dwuskładnikowym jest zadziwiające, że niektóre rośliny pozostają żywotne mimo ekspresji RIP a lub β w niezachodzących na siebie miejscach.
Analiza nicieni w transgenicznych liniach tytoniu wyrażających RIP kukurydzy
Potomstwo z transgenicznych linii tytoniu transformowanych obrobionym RIP-P kukurydzy lub dwuskładnikowym konstruktem RIP kukurydzy zakażono nicieniami węzłów korzeni. Miesiąc po zakażeniu korzenie z zakażonych roślin traktowano kwaśną fuksyną aby wybarwić nicienie in situ. Galasy i wybarwione nicienie zliczono i przypisano do czterech następujących kategorii: puste galasy, robakowate młodociane, kuliste osobniki dorosłe, osobniki dorosłe składające jaja (Fig. 9).
PL 204 381 B1
Choć nie było znaczącej różnicy w całkowitej liczbie nicieni i galasów na linię między liniami transgenicznymi i kontrolami, trzy linie transgeniczne D, G i K wykazały mniej osobników dorosłych składających jaja.
Aby określić czy linie z RIP kukurydzy zmniejszają wzrost nicieni u roślin mierzono wielkość dojrzałych nicieni jak opisano powyżej.
Dorosłe nicienie nie składające jaj były znacząco mniejsze dla linii D, G i K w porównaniu z tymi na roślinach kontrolnych (Fig. 6). Jednak wielkość nicieni składających jaja wykazywała znacznie mniejsze różnice (Fig. 7), wskazując, że składanie jaj wydaje się zachodzić dopiero gdy nicienie osiągnęły minimalną wielkość (32 do 36 jednostek nitek siatki okularu). Ekspresja RIP wydaje się zwalniać wzrost nicienia, powodując opóźnienie w osiąganiu wielkości składania jaj (Fig. 8).
Przeciwnie, te linie, które nie wykazywały żadnego zmniejszenia w liczbie zakażających nicieni lub w liczbie składających jaja samic nie wykazywały zmniejszenia w wielkości dojrzałych samic obserwowanej w liniach D, G i K.
Te wyniki wskazują więc, że RIP kukurydzy i dwuskładnikowy RIP kukurydzy wpływają na rozwój nicieni węzłów korzeni.
Do wykorzystania w innych aspektach wynalazku stosowany jest odpowiedni promotor z białkiem kukurydzy inaktywującym rybosom lub jego częścią w funkcjonalnym połączeniu zgodnie z procesami opisanymi w tym podanym przykładowo aspekcie.
Męska sterylność indukowana w pyłku przez ekspresję białka inaktywującego rybosom (RIP) Konstrukty
Sekwencję barnazy z Bacillus amyloliquefaciens (Hartley R.W. 1998) i białka inaktywującego rybosom (RIP-P; ID.SEKW. NR: 2) z ziaren kukurydzy (Bass i wsp. 1995) każdy wstawiono do oddzielnego konstruktu za promotorem specyficznym dla tapetum (TA29, Mariani, C., 1989) z Nicotiana tabacum. Konstrukty wyprodukowano (Fig. 13) i transformowano nimi stosując wektor roślinny pBI121 (bez promotora 35S CaMV). Konstrukty transformowano do Solanum tuberosum spp tuberosum cv Desiree aby pozwolić na bezpośrednie porównanie z normalnym fenotypowo Desiree.
Transformacja i regeneracja roślin transgenicznych
Powyższa kaseta była wklonowana do wektora binarnego pBI121 jako fragment Not I. Końcowy konstrukt wprowadzono do kompetentnej Agrobacterium tumefaciens LBA4404 za pomocą elektroporacji jak opisali Shen W. i wsp., 1989.
Następnie krążki liści Solanum tuberosum tuberosum cv Desiree transformowano jak opisano za pomocą standardowego protokołu (Dietze J. i wsp. 1995). Rośliny transgeniczne ukorzeniano w płynnej MS (Murashige, T. i Skroog, F., 1962) uzupełnionej 0,1 mg l-1 NAA przed przeniesieniem do gleby.
Regenerowane rośliny przeszczepiano do doniczek z mieszaniną piasku i gliny 50:50. Rośliny każdej odmiany hodowlanej hodowano w zamkniętej szklarni w 18 ± 2°C przy długości dnia 14 godz. z podlewaniem gdy było to wymagane. Nietransgeniczne linie były ustalone w hodowli tkankowej z łodyg roślin hodowanych w szklarni. Rośliny generowane z tego źródła transplantowano do szklarni równocześnie z liniami transgenicznymi.
Linie transgeniczne i kontrolne badano pod kątem żywotnego pyłku stosując zarówno biooznaczenie z kiełkowaniem łagiewki pyłkowej i ich zdolność do pobierania dioctanu fluoresceiny. Linie wybrane jako wykazujące utratę żywotnych pyłków plus rośliny kontrolne były następnie stosowane w wykonanych ręcznie doświadczeniach z krzyżowaniem aby potwierdzić zdolność lub niezdolność ich pyłku do zapłodnienia krzyżowego znamienia innej rośliny ziemniaka.
Tworzenie łagiewki
Kiełkowanie pyłku było badane stosując protokół według Krishnakumar i Oppenheimer (1999).
Szkiełka pokryto stopionym podłożem do kiełkowania pyłku. Jest to roztwór w pH 6 1 mM CaCl2, 1 mM Ca(NO3)2, 1 nM MgSO4, 0,01% kwas borny, 18% sacharoza i 0,5% agaroza. Usunięto pylnik z rośliny testowej i wypukano z niego pyłek na szkiełko. Pozostawiono go następnie na 18 godz. w komorze z około 100% względnej wilgotności w inkubatorze w 22-25°C w ciemności. Na szkiełku umieszczono szkiełko przykrywkowe i liczono część ziaren z łagiewkami pyłkowymi za pomocą oglądania ziaren pyłku pod iluminacją w jasnym polu. Fig. 14 pokazuje tworzenie łagiewek z pyłku typu dzikiego ale ich nieobecność u nienormalnego pyłku z jednej z linii RIP-P wybranej jako wykazującej męską sterylność.
Barwienie żywotnego pyłku dioctanem fluoresceiny (FDA)
Procedura stosuje roztwór wzorcowy dioctanu fluoresceiny sporządzony z 2mg/ml w acetonie. Przed użyciem był on rozcieńczany 1000 razy w 20% sacharozie w wodzie destylowanej, którą uprzednio
PL 204 381 B1 wysterylizowano za pomocą sączenia. Pylniki usunięto indywidualnie z kwiatu ziemniaka za pomocą pęsety i pukano nimi w szkiełko aby zebrać ziarnka pyłku. Dodano rozcieńczony roztwór FDA i na szkiełko naniesiono szkiełko przykrywkowe. Preparat badano natychmiast pod mikroskopem (Leica DMR) z oświetleniem z góry i odpowiednimi filtrami do badania emisji fluorescencji przez fluoresceinę. Obrazy zapisywano stosując dołączona kamerę (Olympus OM4) i odwrotną błoną (Kodak Elite 100 ASA). Fig. 15 wykazuje przykład pyłku typu dzikiego w oświetleniu jasnego pola. W porównaniu linie transgeniczne wyrażające ID.SEKW. NR:2 lub barnazę dostarczyły pyłek, które był skurczony i nie tworzył łagiewek pyłkowych. To wskazywało na brak żywotności pyłku z linii transgenicznych.
W wyniku obu oznaczeń kiełkowania łagiewek pyłkowych i pobierania FDA wybrano łącznie 8 z 37 linii RIP-P, które były oznaczane jako mające bardzo niską żywotność pyłku. Dane dla każdej z tych linii plus przykład każdego konstruktu linii odrzuconej jako niedostatecznie męskosterylnej podano w Tabeli 2. Włączono także niektóre linie kontrolne.
| Konstrukt | Badane ziarnka pyłku | Wytworzone łagiewki | Badane ziarnka pyłku | pobrany FDA |
| Linie wybrane jako męskosterylne | ||||
| RIP 04 | 10 | 0 | 50 | 0 |
| RIP 11 | 100 | 1 | 100 | 1 |
| RIP 21 | 100 | 1 | 100 | 0 |
| RIP 22 | 100 | 1 | 300 | 1 |
| RIP 33 | 100 | 0 | 100 | 1 |
| RIP 41 | 100 | 1 | 100 | 1 |
| RIP 44 | 100 | 0 | 100 | 0 |
| RIP 48 | 500 | 1 | 500 | 0 |
| Razem | 1110 | 5 | 1350 | 4 |
| Bar 12 | 50 | 0 | 200 | 0 |
| Bar 38 | 100 | 1 | 300 | 1 |
| Razem | 150 | 1 | 500 | 1 |
| Przykłady linii nie wybrane jako odpowiednio męskosterylne | ||||
| RIP 32 | 100 | 3 | 100 | 5 |
| Bar 7 | 10 | 4 | 10 | 8 |
| Razem | 110 | 7 | 110 | 13 |
| Kontrole | ||||
| Maria Huanca | 10 | 4 | 100 | 20 |
| Desiree | na | na | 100 | 90 |
| Razem | 10 | 4 | 200 | 110 |
Wybrano osiem linii wyrażających RIP i dwie wyrażające barnazę jako męskosterylne na podstawie biooznaczeń kiełkowania łagiewki pyłkowej i niskiej częstości pobierania FDA przez ziarna pyłku. Dla porównania przedstawiono dwie linie transgeniczne nie wykazujące wysokiego poziomu nieżywotnego pyłku i nietransformowane kontrolne odmiany hodowlanej ziemniaka (na = nie oznaczane).
Różnice w częstości kiełkowania łagiewek pyłkowych lub pobierania FDA dla linii dodatnich RIP i barnazy były statystycznie różna niż u kontroli (test x2, p < 0,001 w obu przypadkach).
Ręczne zapylanie ziemniaka
Zastosowano tę procedurę, aby sprawdzić, że zarówno dany RIP (ID.SEKW. NR: 2) i linia barnazy oceniane jako męskosterylne na podstawie kiełkowania łagiewki pyłkowej i pobierania FDA nie zapłodniły znamienia kwiatu ziemniaka otrzymującego pyłek. Do tej pracy także wybrano szereg kontrolnych
PL 204 381 B1 odmian hodowlanych. Odmiany hodowlane Revolution i Waycha są formami Solanum tuberosum spp andigena. Były one wybrane jako że cv Waycha produkuje jagody obficie podczas gdy Revolution jest męskosterylna i nie są tworzone jagody o ile nie otrzyma pyłku. Eksperymenty kontrolne ustaliły, że zapylanie ręczne jest często udane z żywotnym źródłem pyłku.
Solanum tuberosum spp tuberosum odmiana hodowlana Desiree był także stosowany w tej pracy. Wytwarza obficie jagody i jest odmianą hodowlaną, u której często produkowane są prawdziwe nasiona ziemniaka. Ze względu na jego normalną zdolność do obfitego wytwarzania jagód reprezentuje odpowiednią odmianę hodowlaną aby określić utratę tej zdolności stosując jeden z genów RIP, który jest przedmiotem tego wynalazku. Skuteczność tego transgenu w zapobieganiu zapłodnieniu była porównana z tą uzyskaną z zastosowaniem barnazy.
Gdy wytwarzał się kwiat był on przygotowywany dla wymuszonego ręcznego krzyżowania. Jeśli miał być odbiorcą pyłku jego płatki a następnie pylniki odcinano tak, że wystawało znamię. Jeśli kwiat miał być dawcą pyłku, odcinano płatki i znamię. W tym przypadku pobierano pojedynczy pylnik pęsetą i pukano nim w powierzchnię czarnego kafelka aby można było wizualnie sprawdzić odkładanie pyłku. Źródłem pyłku pocierano znamię biorców lub dawców pyłku. Wszystkie niewykorzystane kwiaty odcięto z rośliny. Gdy udało się zapłodnić znamię kwiat nie odpadał i zaczynał pęcznieć by wytworzyć jagodę. Jeśli zapłodnienie nie było udane znamię odpadało z rośliny w ciągu tygodnia i nie tworzyła się jagoda. Obecność jagód była godnym zaufania wstępnym wskaźnikiem, że zaszło zapłodnienie. Wstępne doświadczenia ustaliły, że jagody zawierały nasiona, ale nie liczono rutynowo ich ilości.
Wyniki przedstawione w Tabeli 3 potwierdzają, że pyłek linii RIP 33 i linii barnazy 12 wybranych jako męskosterylne z biooznaczeń kiełkowania łagiewek pyłkowych i braku pobierania FDA przez ziarna pyłku istotnie nie zapładniały znamienia ziemniaka.
T a b e l a 3
| Konstrukt | Biorca pyłku | Dawca pyłku | Przeprowadzona liczba krzyżówek | Liczba znamion tworzących jagody |
| Brak | Revolution | Waycha | 11 | 4 |
| Brak | Waycha | Waycha | 11 | 5 |
| Bar 12 | Desiree | Desiree | 10 | 0 |
| RIP 33 | Desiree | Desiree | 5 | 0 |
Tabela 3 przedstawia podsumowanie wykonanych ręcznie krzyżówek do indywidualnych znamion dla różnych odmian hodowlanych jako biorców lub dawców pyłku i liczbę następnie powstałych jagód. Krzyżówki z transgenicznymi Desiree miały potwierdzić wniosek wysokiego poziomu męskiej sterylności dla dwóch linii zidentyfikowanych jako męskosterylne w biooznaczeniach kiełkowania łagiewki pyłkowej i przez brak pobierania FDA przez ziarnka pyłku.
Literatura
Bass H.W., O' Brian, G.R. i Boston, R.S. (1995) Plant Physiol. 107, 661-662
Deneck J., Betterman J. i Deblaere R. (1990) The Plant Cell 51-59
Dietze J., Blass A., Willmitzer L. (1995) Agrobacterium - mediated transformation of potato (Solanum tuberosum). W: Potryka I.S. i Spangenburg G. (red). Gene transfer to plants. Springer Lab. manual str. 24-30.
Duguid J.R. i Dinauer M.C. (1990) Nucleic Acids Research 18(9) 2889-2792
Eckert K.A. i Kunkel T.A. (1990) Nucleic Acids Research 18(13) 3737-3744
Fourney R.M., Miyakoshi J., Day III R.S. i Paterson M.C. (1988) Focus 10(1) 5-7
Frohman M.A., Dush M.K. i Martin G.R. (1988) Proceedings of the Natl. Acad. Sci. USA 85 8998-9002 Gawel N.J. i Jarret R.L. (1991) Plant Molec. Biol. Reporter. 9(3) 262-266 Gussow D. i Clackson T. (1989) Nucleic Acids Research 17 4000-4008 Hartley H.W. (1998) J. Mol. Biol., 202, 913-915
Horsch R.B., Fry J.E., Hoffman N.L., Eicholtz D., Rogers S.G. i Fraey R.T. (1985) Science 227 1229-1231 Jackson D. (1991) Molecular Plant Pathology: A Practical Approach. IRL Press, Oxford.
King P.V. i Blakesley R.W. (1986) Focus 8(1) 1-3
Krishnakumar i Oppenheimer (1999) Development, 126, 3079-3088
PL 204 381 B1
Leborgna-Castel N., Jelitto-Van Droven E.P.W.M., Crofts A.J. i Denecke J. (1999) The Plant Cell 11 459-469
Lemmetyinen, J., Pennanen, T. Lannengpaa M, i Sopanen T. (2001) Molecular Breeding, 7 341-350
Maniatis T., Fritsch E.F. i Sambrook J. (1982) Molecular Cloning; A Laboratory Manual. N.Y. Cold Spring Harbour Laboratory.
Mariana i wsp (1990) Nature 347 737-741
Mariana, C, Leemans, J., De Gref, W. i de Beuckeleer, M. (1989) EPO 344029
Murashiga, R. i Skroog F. (1962) Physiol. Plant, 15, 473
O'Reilly D., Thomas C.J.R. i Coutts R.H.A. (1991) J. Gen. Virology 17 1-7
Perry S.E., Nicholas K.W. i Fernandez D.E. (1996) the Plant Cell 8 1977-1989
Samach A., Kohlmai S.E., Motte P., Datla R. i Haughn G.W. (1997) The Plant Cell 9 559-570
Shen, W. i Forde, E.G., Nucleic Acids Research, 17, 83-85
Shirzadegan M., Christie P. i Seemann J.R. (1991) Nucleic Acids Research 19 (21) 6055
Sieburth L.E. i Meyerowitz E.M. (1997) The Plant Cell 9 355-365
Stirpe i Barbiere (1986) FEES Lett. 195, 1-8
Stirpe i wsp (1978) FEES Lett. 85 65-67
Twell i wsp (1991) Molec. Gen. Genet. 217 240-245
PL 204 381 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Advanced Technologies (Cambridge) Limited <120> System śmierci komórek rośinnych <130> RD-ATC-28 <140> PCT/GBO1/04581 <141> 15 październik 2001 <160> 18 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 909 <212> DNA <213> Zea mays <220>
<221> cechy różne <222> (1)..(48) <223> Domena N-końcowa <220>
<221> cechy różne <222> (865)..(903) <223> Domena C-końcowa <220>
<221> cechy różne <222> (484) . . (558) <223> Domena centralna <220>
<221> mutacja <222> (226)..(231) <223> Sekwencja zastępująca usunięte miejsce SacI <220>
<221> cechy różne <222> (1)..(3) <223> Kodon inicjacyjny dodany za pomocą startera do PCR <220>
<221> cechy różne <222> (904)..(909) <223> Kodony stop dodane za pomocą startera do PCR <220>
<221> cechy różne <222> (1)..(24) <223> Miejsce wiązania startera ProRIPBF <220>
<221> cechy różne <222> (205)..(249) <223> Miejsce wiązania startera RIPSDF <220>
<221> cechy różne
PL 204 381 B1 <222> Dopełnienie ((205).. (249)) <223> Miejsce wiązania startera RIPSDR <220>
<221> cechy różne <222> Dopełnienie((880)..(909)) <223> Miejsce wiązania startera ProRIPSR <220>
<221> cechy różne <222> (49)..(73) <223> Miejsce wiązania startera RIP1BF <220>
<221> cechy różne <222> Dopełnienie((837)..(864)) <223> Miejsce wiązania startera RIP2SR <220>
<221> cechy różne <222> (463)..(579) <223> Miejsce wiązania startera RIPCDF obejmujące domenę centralną <220>
<221> cechy różne <222> Dopełnienie((463)..(579)) <223> Miejsce wiązania startera RIPCDR obejmujące domenę centralną <400> 1 atggccgaga taaccctaga gccgagtgat cttatggcgc aaacaaacaa aagaatagtg 60 ccaaagttca ctgaaatctt ccccgtggag gacgcgaact acccttacag cgccttcatc 120 gcgtcggtcc ggaaagacgt gatcaaacac tgcaccgacc ataaagggat cttccagccc 180 gtgctgccac cggagaagaa ggtcccggag ctatggttct acacagaact gaaaactagg 240 accagctcca tcacgctcgc catacgcatg gacaacctgt acctcgtggg cttcaggacc 300 ccgggcgggg tgtggtggga gttcggcaag gacggcgaca cccacctcct cggcgacaac 360 cccaggtggc tcggcttcgg cggcaggtac caggacctca tcggcaacaa gggtctggag 420 accgtcacca tgggccgcgc cgaaatgacc agggccgtca acgacctggc gaagaagaag 480 aagatggcga cactggagga ggaggaggtg aagatgcaga tgcagatgcc ggaggccgct 540 gatctggcgg cggcggcagc ggctgaccca caggccgaca cgaagagcaa gctggtgaag 600 ctggtggtca tggtgtgcga ggggctgcgg ttcaacaccg tgtcccgcac ggtggacgcg 660 gggttcaaca gccagcacgg ggtgaccttg accgtgacgc aggggaagca ggtgcagaag 720 tgggacagga tctccaaggc ggccttcgag tgggctgacc accccaccgc tgtgatcccc 780 gacatgcaga agcttggcat caaggataag aacgaagcag cgaggatcgt tgcgctcgtt 840 aagaatcaaa ctactgccgc tgccgctact gctgccagtg ctgacaacga cgacgacgag 900 gcctaataa 909 <210> 2 <211> 750 <212> DNA <213> Zea mays <220>
<221> cechy różne <222> (1)..(3) <223> Kodon inicjacyjny dodany za pomocą startera do PCR <220>
<221> mutacja <222> (181)..(186) <223> Sekwencja zastępująca usunięte miejsce SacI <220>
PL 204 381 B1 <221> cechy różne <222> (745)..(750) <223> Kodony stop dodane za pomocą startera do PCR <400> 2 atgaaaagaa tagtgccaaa gttcactgaa atcttccccg tggaggacgc gaactaccct 60 tacagcgcct tcatcgcgtc ggtccggaaa gacgtgatca aacactgcac cgaccataaa 120 gggatcttcc agcccgtgct gccaccggag aagaaggtcc cggagctatg gttctacaca 180 gaactgaaaa ctaggaccag ctccatcacg ctcgccatac gcatggacaa cctgtacctc 240 gtgggcttca ggaccccggg cggggtgtgg tgggagttcg gcaaggacgg cgacacccac 300 ctcctcggcg acaaccccag gtggctcggc ttcggcggca ggtaccagga cctcatcggc 360 aacaagggtc tggagaccgt caccatgggc cgcgccgaaa tgaccagggc cgtcaacgac 420 ctggcgaaga agaagaaggc ggctgaccca caggccgaca cgaagagcaa gctggtgaag 480 ctggtggtca tggtgtgcga ggggctgcgg ttcaacaccg tgtcccgcac ggtggacgcg 540 gggttcaaca gccagcacgg ggtgaccttg accgtgacgc aggggaagca ggtgcagaag 600 tgggacagga tctccaaggc ggccttcgag tgggctgacc accccaccgc tgtgatcccc 660 gacatgcaga agcttggcat caaggataag aacgaagcag cgaggatcgt tgcgctcgtt 720 aagaatcaaa ctactgccgc tgcctaataa 750 <210> 3 <211> 444 <212> DNA <213> Zea mays <220>
<221> cechy różne <222> (1)..(3) <223> Kodon inicjacyjny dodany za pomocą startera do PCR <220>
<221> mutacja <222> (181)..(186) <223> Sekwencja zastępująca usunięte miejsce SacI <220>
<221> cechy różne <222> (439)..(444) <223> Kodony stop dodane za pomocą startera do PCR <400> 3 atgaaaagaa tacagcgcct gggatcttcc gaactgaaaa gtgggcttca ctcctcggcg aacaagggtc ctggcgaaga tagtgccaaa tcatcgcgtc agcccgtgct ctaggaccag ggaccccggg acaaccccag tggagaccgt agaagaagta gttcactgaa atcttccccg tggaggacgc gaactaccct 60 ggtccggaaa gacgtgatca aacactgcac cgaccataaa 120 gccaccggag aagaaggtcc cggagctatg gttctacaca 180 ctccatcacg ctcgccatac gcatggacaa cctgtacctc 240 cggggtgtgg tgggagttcg gcaaggacgg cgacacccac 300 gtggctcggc ttcggcggca ggtaccagga cctcatcggc 360 caccatgggc cgcgccgaaa tgaccagggc cgtcaacgac 420 ataa 444 <210> 4 <211> 354 <212> DNA <213> Zea mays <220>
<221> cechy różne <222> (1) .. (3) <223> Kodon inicjacyjny dodany za pomocą startera do PCR <220>
<221> cechy różne
PL 204 381 B1 <222> (349) . . (354) <223> Kodon stop dodany za pomocą startera do PCR <400> 4 atggcggctg tgcgaggggc cacggggtga aaggcggcct ggcatcaagg gccgctgccg acccacaggc tgcggttcaa ccttgaccgt tcgagtgggc ataagaacga ctactgctgc cgacacgaag caccgtgtcc gacgcagggg tgaccacccc agcagcgagg cagtgctgac agcaagctgg cgcacggtgg aagcaggtgc accgctgtga atcgttgcgc aacgacgacg tgaagctggt acgcggggtt agaagtggga tccccgacat tcgttaagaa acgaggccta ggtcatggtg caacagccag caggatctcc gcagaagctt tcaaactact ataa
120
180
240
300
354 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter ProRIPBF <220>
<221> cechy różne <222> (1)..(19) <223> Wprowadzone miejsca restrykcyjne <400> 5 actcgagtct agaggatcca tggccgagat aaccctagag ccg <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter ProRIPSR <220>
<221> cechy różne <222> (1)..(19) <223> Wprowadzone miejsca restrykcyjne <400> 6 gactagtgtc gacgagctct tattaggcct cgtcgtcgtc gttgtcagc <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter RIP1BF <220>
<221> cechy różne <222> (1) . . (19) <223> Wprowadzone miejsca restrykcyjne <400> 7 gctcgagtct agaggatcca tgaaaagaat agtgccaaag ttcactg
PL 204 381 B1 <210> 8 <211> 53 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter RIP2SR <220>
<221> cechy różne <222> (1)..(19) <223> Wprowadzone miejsca restrykcyjne <400> 8 gactagtgtc gacgagctct tattaggcag cggcagtagt ttgattctta acg <210> 9 <211> 53 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter RIP1SR <220>
<221> cechy różne <222> (1)..(19) <223> Wprowadzone miejsca restrykcyjne <400> 9 aactagtgtc gacgagctct tattacttct tcttcttcgc caggtcgttg acg <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter RIP2BF <220>
<221> cechy różne <222> (1). . (19) <223> Wprowadzone miejsca restrykcyjne <400> 10 actcgagtct agaggatcca tggcggctga cccacaggcc gacacgaaga g <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter RIPCDF <400> 11 gacctggcga agaagaagaa ggcggctgac ccacaggccg ac
PL 204 381 B1 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter RIPCDR <400> 12 gtcggcctgt gggtcagccg ccttcttctt cttcgccagg tc <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter RIPSDF <220>
<221> mutacja <222> (22)..(27) <223> Nukleotydy zmodyfikowane aby usunąć miejsce SacI <400> 13 ccggagctat ggttctacac agaactgaaa actaggacca gctcc <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter RIPSDR <220>
<221> mutacja <222> (19).. (24) <223> Nukleotydy zmodyfikowane aby usunąć miejsce SacI <400> 14 ggagctggtc ctagttttca gttctgtgta gaaccatagc tccgg 45 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter SUB21 <400> 15 ctcttgcttg aattcggact a 21 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna
PL 204 381 B1 <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter SUB25 <400> 16 tagtccgaat tcaagcaaga gcaca <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter LDT15 <400> 17 gacagaagcg gatccttttt tttttttttt <210> 18 <211> 381 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 18 tctagaaagc ttatctaaac aaagttttaa attcatttct taaacgtcca ttacaatgta 60 atataactta gtcgtctcaa ttaaaccatt aatgtgaaat ataaatcaaa aaaagccaaa 120 gggcggtggg acggcgccaa tcatttgtcc tagtccactc aaataaggcc catggtcggc 180 aaaaccaaac acaaaatgtg ttatttttaa ttttttcctc ttttattgtt aaagttgcaa 240 aatgtgttat ttttggtaag accctatgga tatataaaga caggttatgt gaaacttgga 300 aaaccatcaa gttttaagca aaaccctctt aagaacttaa attgagcttc ttttggggca 360 tttttctagt gagaaggatc c 381
Claims (12)
1. Sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, która niesie w genomie rośliny gen chimerowy, którego ekspresja powoduje cytotoksyczność w miejscu docelowym, znamienny tym, że roślinę transformuje się chimerowym genem zawierającym promotor, który jest indukowany w i/lub koło miejsca docelowego funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, która koduje zrekombinowane dojrzałe inaktywujące rybosom białko (RIP) kukurydzy zawierające domenę α i domenę β ułożone przylegle względem siebie, przy czym sekwencja kodująca zawiera sekwencję określoną w ID. SEKW. Nr: 2 lub sekwencję kodującą przynajmniej w 70% identyczną z sekwencją ID. SEKW. Nr: 2.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja kodująca zrekombinowane dojrzałe RIP kukurydzy zawiera sekwencję kodującą, która wykazuje przynajmniej 80% identyczność z sekwencją określoną w ID. SEKW. Nr: 2.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że sekwencja kodująca zrekombinowane dojrzałe RIP kukurydzy zawiera sekwencję kodującą, która wykazuje przynajmniej 85% identyczność z sekwencją okreś loną w ID. SEKW. Nr: 2.
4. Sposób według zastrz. 1-3, znamienny tym, że sekwencja kodująca zrekombinowane dojrzałe RIP kukurydzy zawiera sekwencję kodującą, która wykazuje przynajmniej 90% identyczność z sekwencją określoną w ID. SEKW. Nr: 2.
5. Sposób według zastrz. 1-4, znamienny tym, że gen chimerowy dodatkowo zawiera nieulegającą translacji sekwencję 3' terminatora.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że nieulegającą translacji sekwencja 3' terminatora jest sekwencją z genów rośliny, bakterii lub wirusa.
PL 204 381 B1
7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że nieulegającą translacji sekwencja 3' terminatora jest wybrana z grupy obejmującej sekwencję terminatora rbcS E9 grochu, sekwencję terminatora nos pochodzącą z genu syntazy nopaliny Agrobacterium tumefaciens i sekwencję terminatora 35S z wirusa mozaiki kalafiora.
8. Sposób według zastrz. 1-7, znamienny tym, że gen chimerowy zawiera sekwencję wzmacniacza transkrypcji lub translacji i/lub wewnątrzkomórkowe sekwencje naprowadzające i introny, i/lub sekwencje nukleotydów ułatwiające proces transformacji i stabilną ekspresję genu chimerowego.
9. Roślina transformowana genem chimerowym sposobem jak określono w zastrz. 1-8, który to gen chimerowy zawiera promotor indukowany w i/lub koło miejsca docelowego, funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, która koduje dojrzałe zrekombinowane RIP kukurydzy zawierające domeny a i β umieszczone przylegle względem siebie, przy czym sekwencja kodująca zawiera sekwencję określoną w ID. SEKW. Nr. 2 lub sekwencję kodującą wykazującą przynajmniej 70% identyczność z SEKW. Nr. 2.
10. Komórka roślinna transformowana genem chimerowym sposobem jak określono w zastrz. 1-8, który to gen chimerowy zawiera promotor indukowany w i/lub koło miejsca docelowego, funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, która koduje dojrzałe zrekombinowane RIP kukurydzy zawierające domeny a i β umieszczone przylegle względem siebie, przy czym sekwencja kodująca obejmuje sekwencję określoną w ID. SEKW. Nr: 2 lub sekwencję kodującą przynajmniej w 70% identyczną z sekwencją ID. SEKW. Nr: 2.
11. Izolat DNA genu chimerowego zawierający promotor, który jest indukowany w i/lub koło miejsca docelowego, funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, która koduje dojrzałe zrekombinowane RIP kukurydzy zawierające domeny a i β umieszczone przylegle względem siebie, przy czym sekwencja kodująca obejmuje sekwencję określoną w ID. SEKW. Nr: 2 lub sekwencję kodującą przynajmniej w 70% identyczną z sekwencją ID. SEKW. Nr: 2.
12. Biologicznie funkcjonalny nośnik ekspresji zawierający gen chimerowy obejmujący promotor, który jest indukowany w i/lub koło miejsca docelowego, funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, która koduje dojrzałe zrekombinowane RIP kukurydzy zawierające domeny a i β umieszczone przylegle względem siebie, przy czym sekwencja kodująca obejmuje sekwencję określoną w ID. SEKW. Nr: 2 lub sekwencję kodującą przynajmniej w 70% identyczną z sekwencją ID. SEKW. Nr: 2.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0025225.4A GB0025225D0 (en) | 2000-10-14 | 2000-10-14 | Plant cell death system |
| PCT/GB2001/004581 WO2002033106A2 (en) | 2000-10-14 | 2001-10-15 | Plant cell death system |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL362052A1 PL362052A1 (pl) | 2004-10-18 |
| PL204381B1 true PL204381B1 (pl) | 2010-01-29 |
Family
ID=9901296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL362052A PL204381B1 (pl) | 2000-10-14 | 2001-10-15 | Sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, która niesie w genomie gen chimerowy, transformowana tym sposobem genem chimerowym roślina i komórka roślinna, izolat DNA genu chimerowego oraz zawierający gen chimerowy biologicznie funkcjonalny nośnik ekspresji |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20020116737A1 (pl) |
| EP (1) | EP1328649B1 (pl) |
| AR (1) | AR033582A1 (pl) |
| AT (1) | ATE418617T1 (pl) |
| AU (2) | AU2001294041B2 (pl) |
| BR (1) | BR0114820A (pl) |
| CA (1) | CA2425321C (pl) |
| DE (1) | DE60137138D1 (pl) |
| ES (1) | ES2316481T3 (pl) |
| GB (1) | GB0025225D0 (pl) |
| PL (1) | PL204381B1 (pl) |
| RU (2) | RU2261277C2 (pl) |
| WO (1) | WO2002033106A2 (pl) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0025225D0 (en) | 2000-10-14 | 2000-11-29 | Cambridge Advanced Tech | Plant cell death system |
| US6936288B2 (en) * | 2003-06-10 | 2005-08-30 | Klearsen Corporation | Method and composition for the treatment of shingles and related afflictions |
| GB0421598D0 (en) * | 2004-09-29 | 2004-10-27 | Cambridge Advanced Tech | Modification of plant development and morphology |
| EP2633048B1 (en) * | 2010-10-27 | 2019-07-31 | Devgen NV | Down-regulating gene expression in insect pests |
| EP2635106A4 (en) | 2010-11-05 | 2015-04-15 | Agrigenetics Inc | SOYBEAN MARKERS ASSOCIATED TO SCN RESISTANCE |
| NZ719494A (en) * | 2013-11-04 | 2017-09-29 | Dow Agrosciences Llc | Optimal maize loci |
| EP3744839A1 (en) * | 2019-05-31 | 2020-12-02 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | A genetically encoded protein synthesis inhibitor (gepsi) |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8810120D0 (en) | 1988-04-28 | 1988-06-02 | Plant Genetic Systems Nv | Transgenic nuclear male sterile plants |
| US5248606A (en) | 1990-06-11 | 1993-09-28 | Dowelanco | Dna encoding inactive precursor and active forms of maize ribosome inactivating protein |
| US5635384A (en) | 1990-06-11 | 1997-06-03 | Dowelanco | Ribosome-inactivating proteins, inactive precursor forms thereof, a process for making and a method of using |
| DE69129540T2 (de) | 1990-09-10 | 1998-10-01 | Advanced Technologies (Cambridge) Ltd., Cambridge | Pflanzliche parasitäre nematode bekämpfung |
| CA2110169A1 (en) | 1991-05-30 | 1992-12-10 | Walter Van Der Eycken | Nematode-responsive plant promoters |
| GB9205474D0 (en) | 1992-03-13 | 1992-04-29 | Cambridge Advanced Tech | Root knot nematode resistance |
| US6015940A (en) | 1992-04-07 | 2000-01-18 | Monsanto Company | Virus resistant potato plants |
| US5332808A (en) * | 1992-09-08 | 1994-07-26 | North Carolina State University | DNA encoding a ribosome inactivating protein |
| US6008436A (en) * | 1993-01-21 | 1999-12-28 | North Carolina State University | Nematode-resistant transgenic plants |
| ZA939767B (en) * | 1993-01-21 | 1994-09-14 | Univ North Carolina State | Nematode-resistant transgenic plants |
| WO1997003183A1 (en) | 1995-07-11 | 1997-01-30 | Rutgers, The State University | Pap mutants that exhibit anti-viral and/or anti-fungal activity in plants |
| FR2736930B1 (fr) * | 1995-07-17 | 1997-09-19 | Biocem | Procede de production, par des cellules vegetales, de proteines heminiques, proteines ainsi obtenues et produits contenant ces proteines |
| GB9524350D0 (en) | 1995-11-29 | 1996-01-31 | Lynxvale Ltd | Enhancer-increased gene expression in plants |
| AU744675B2 (en) | 1997-01-24 | 2002-02-28 | Dna Plant Technology Corporation | Two component plant cell lethality methods and compositions |
| GB9706381D0 (en) * | 1997-03-27 | 1997-05-14 | Cambridge Advanced Tech | Improvements relating to the specificity of gene expression |
| AU4008799A (en) | 1998-05-22 | 1999-12-13 | Rutgers, The State University | Transgenic plants producing a pap ii protein |
| GB0025225D0 (en) | 2000-10-14 | 2000-11-29 | Cambridge Advanced Tech | Plant cell death system |
-
2000
- 2000-10-14 GB GBGB0025225.4A patent/GB0025225D0/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-10-12 AR ARP010104811A patent/AR033582A1/es not_active Application Discontinuation
- 2001-10-15 AU AU2001294041A patent/AU2001294041B2/en not_active Ceased
- 2001-10-15 RU RU2003113968/13A patent/RU2261277C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-10-15 RU RU2004127975/13A patent/RU2275426C1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-10-15 US US09/978,274 patent/US20020116737A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-15 WO PCT/GB2001/004581 patent/WO2002033106A2/en not_active Ceased
- 2001-10-15 US US09/978,273 patent/US7282624B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-15 DE DE60137138T patent/DE60137138D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-15 CA CA2425321A patent/CA2425321C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-15 EP EP01974526A patent/EP1328649B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-15 PL PL362052A patent/PL204381B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-10-15 BR BR0114820-6A patent/BR0114820A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-10-15 ES ES01974526T patent/ES2316481T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-15 AT AT01974526T patent/ATE418617T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-10-15 AU AU9404101A patent/AU9404101A/xx active Pending
-
2007
- 2007-01-09 US US11/651,756 patent/US20070107079A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE418617T1 (de) | 2009-01-15 |
| PL362052A1 (pl) | 2004-10-18 |
| WO2002033106A3 (en) | 2002-08-01 |
| ES2316481T3 (es) | 2009-04-16 |
| US7282624B2 (en) | 2007-10-16 |
| US20020116737A1 (en) | 2002-08-22 |
| WO2002033106A2 (en) | 2002-04-25 |
| DE60137138D1 (de) | 2009-02-05 |
| CA2425321A1 (en) | 2002-04-25 |
| US20070107079A1 (en) | 2007-05-10 |
| AR033582A1 (es) | 2003-12-26 |
| AU2001294041B2 (en) | 2006-05-18 |
| RU2261277C2 (ru) | 2005-09-27 |
| RU2004127975A (ru) | 2006-02-20 |
| GB0025225D0 (en) | 2000-11-29 |
| RU2275426C1 (ru) | 2006-04-27 |
| AU9404101A (en) | 2002-04-29 |
| BR0114820A (pt) | 2004-02-03 |
| CA2425321C (en) | 2010-03-23 |
| US20020138869A1 (en) | 2002-09-26 |
| EP1328649A2 (en) | 2003-07-23 |
| EP1328649B1 (en) | 2008-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Walter et al. | Bean ribonuclease‐like pathogenesis‐related protein genes (Ypr10) display complex patterns of developmental, dark‐induced and exogenous‐stimulus‐dependent expression | |
| US8624086B2 (en) | Nucleic acid molecules and their use in plant sterility | |
| EP2141239B1 (en) | Dominant gene suppression transgenes and methods of using same | |
| Jang et al. | The OsFOR1 gene encodes a polygalacturonase-inhibiting protein (PGIP) that regulates floral organ number in rice | |
| Sudhakar et al. | Expression and immunolocalisation of the snowdrop lectin, GNA in transgenic rice plants | |
| CA2158584A1 (en) | Methods and compositions for controlling plant development | |
| JP3595335B2 (ja) | アブラナ亜種のタペータムに特異的なプロモーター | |
| CN101679998A (zh) | 显性基因抑制性转基因及其使用方法 | |
| Klotz et al. | Expression of the tobacco anionic peroxidase gene is tissue-specific and developmentally regulated | |
| US20070107079A1 (en) | Plant cell death system | |
| WO2004082366A2 (en) | Methods to confer enhanced floral properties to plants | |
| CA2766097A1 (en) | Bhlh subgroup 1b transcription factors that provide heat tolerance | |
| AU2001294041A1 (en) | Plant cell death system | |
| AU2001294050B2 (en) | Plant cell death system | |
| CA2272241A1 (en) | Agl15 sequences in transgenic plants | |
| AU2006201828B2 (en) | Plant cell death system | |
| WO2017021196A1 (en) | Overexpression of plant genes involved in programmed cell death for yield increase | |
| AU2001294050A1 (en) | Plant cell death system | |
| AU2005253642B8 (en) | Nucleic acid molecules and their use in plant male sterility | |
| BHJ et al. | The N. tabacum PELPs are Translocated into the Pollen Tube Walls in Inter-Specific Crosses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20141015 |