PL204496B1 - Sposób wytwarzania zasadowych antagonistów peptydowych LHRH - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowego sposobu wytwarzania zasadowych antagonistów peptydowych LHRH.

W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/EP94/03904 opisano wytwarzanie słabo rozpuszczalnego peptydu, przez przereagowanie wodnego roztworu wodorosoli z roztworem zasadowego peptydu w kwasie octowym, z wytrąceniem słabo rozpuszczalnej soli addycyjnej kwasu i peptydu. Na przykład opisano wytwarzanie antagonisty LHRH, embonianu cetrorelixu.

Sposób według wynalazku, charakteryzuje się tym, że całkowicie lub częściowo rozpuszczoną addycyjną sól zasadowego antagonisty peptydowego LHRH (1) przereagowuje się w obecności odpowiedniego rozcieńczalnika z mieszaniną kwasowego i zasadowego wymieniacza jonowego, z utworzeniem wolnego peptydu zasadowego, przy czym pH podstawowych roztworów ma wartość 7,5-13 zaś temperatura wynosi 25-30°C. Następnie oddziela się wymieniacz jonowy i przereagowuje wolny peptyd zasadowy z kwasem nieorganicznym lub organicznym, w wyniku czego tworzy się pożądana słabo rozpuszczalna sól addycyjna peptydu (docelowa sól peptydu) (2), po czym usuwa się rozcieńczalnik.

Wyrażenie „peptyd zasadowy” oznacza w niniejszym opisie poliaminokwasy, nawet w sensie podstruktury w większej strukturze ogólnej, zawierające zasadowe aminokwasy, takie jak arginina, pirydyloalanina lub lizyna, albo koniec N peptydu lub po prostu co najmniej jedną grupę zasadową.

Korzystnymi wyjściowymi solami zasadowego antagonisty peptydowego LHRH są antyd, A-75998, ganirelix, antagonista Nal-Glu, cetrorelix, teverelix(Antarelix®) i antagoniści opisani w patentach US 5 942 493 i DE 19911771.3, których treść włączona jest do niniejszego opisu jako źródło literaturowe. Innymi peptydami są abarelix, azalina B, detirelix, ramorelix (Stoeckemann i Sandow, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1993, 119, 547) i RS-68439. Struktury wymienionych peptydów można znaleźć w: Behre i inni, GnRH antagonists: an overview, Proceedings of the 2nd Word Conference on Ovulation Induction, The Parthenon Publishing Group Ltd.; Kutscher i inni, Angew. Chem. 1997, 109, 2240.

Zgodnie z nowym sposobem, wyjściowa sól jest całkowicie lub częściowo rozpuszczana w rozcieńczalniku lub wytwarzana jest zawiesina tej soli w rozcieńczalniku. Następnie dodaje się rozcieńczalnik. Rozpuszczalnik i rozcieńczalnik mogą być identyczne lub różne. Dopuszczalnymi rozpuszczalnikami i rozcieńczalnikami są na przykład: woda, etanol, metanol, propanol, izopropanol, butanol, aceton, keton dimetylowy, keton metylowoetylowy, dimetyloacetamid, dimetyloformamid, N-metylopirolidon [sic], acetonitryl, pentan, heksan, heptan i ich mieszaniny. Korzystnymi są etanol, izopropanol lub aceton [sic]. Podobnie korzystna jest zawartość wody 1 do 60%, zwłaszcza 5 do 50%.

Mieszaninę wymieniacza kwasowego i zasadowego, dodaje się do roztworu lub zawiesiny wyjściowej soli antagonisty. Dopuszczalnym wymieniaczem jonowym jest na przykład Amberlite®.

Ilość wymieniacza jonowego zależy od liczby grup zasadowych w cząsteczce peptydu. Ilość tę wyznacza się przez dodawanie wymieniacza aż do osiągnięcia stałego pH. Na przykład potrzebne jest 10 g Amberlite MB-3 na 1 g cetrorelixu.

pH podstawowych roztworów podczas wytwarzania zasad jest nastawiane na wartość 7,5 do 13, w zależności od stosowanej soli związku czynnego, w szczególności w przypadku soli peptydów zawierających aminokwasy o odczynie zasadowym, a zwłaszcza w przypadku soli antagonistów LHRH (na przykład cetrorelix, D-63153, abarelix, ganirelix, ramorelix, które mogą występować na przykład w postaci octanów).

W celu uniknię cia rozkładu peptydów, temperatura nie powinna przekraczać 25-30°C. Czas reakcji wytwarzania wolnych zasad wynosi zwykle kilka minut, na przykład 20 minut wychodząc z octanu cetrorelixu. Czas ten może być także dłuższy, na przykład 1 godzina przy wychodzeniu z embonianu cetrorelixu. Po osiągnięciu stałego pH reakcja powinna być przerwana, ponieważ produkty rozkładu mogą powodować alkalizację roztworów.

Następnie z mieszaniny reakcyjnej usuwa się wymieniacz jonowy. Usuwanie można przeprowadzać przez odsiewanie na sicie, odsączanie, odwirowywanie lub filtrację kolumnową.

Dla sklarowania mętnego, nietrwałego roztworu wolnej zasady peptydowej, powinien on być możliwie szybko przereagowany z kwasem, w celu utworzenia pożądanej słabo rozpuszczalnej soli addycyjnej tego peptydu (2). Kwas może być dodawany w postaci substancji stałej, roztworu lub zawiesiny. W dokładnie taki sam sposób roztwór wolnej zasady peptydowej można dodawać do kwasu.

PL 204 496 B1

Czas reakcji mieści się w zakresie od kilku minut do kilku godzin. Na przykład, przy tworzeniu się embonianu cetrorelixu czas reakcji wynosi 1,5 godziny.

Klarowna zazwyczaj mieszanina reakcyjna jest następnie sterylnie filtrowana, po czym rozpuszczalnik może być usunięty, w wyniku czego otrzymuje się czystą sól peptydu. Alternatywnie, przed usuwaniem rozpuszczalnika do roztworu mogą być dodawane dodatki lub zaróbki. Zaróbki mogą być dodawane przed sterylną filtracją w postaci substancji stałej, albo po sterylnej filtracji w postaci jałowego, przefiltrowanego roztworu.

Odpowiednimi zaróbkami są na przykład mannitol, sorbitol, ksylitol i rozpuszczalna skrobia.

Zgodnie z wynalazkiem, przez dodanie odpowiednich kwasów mogą być wytworzone następujące sole: octany, adypiniany, askorbiniany, alginiany, benzoesany, benzenosulfoniany, bromki, węglany, cytryniany, chlorki, dibutylofosforany, diwodorocytryniany, dioktylofosforany, diheksadecylofosforany, fumarany, glukoniany, glukuroniany, glutaminiany, wodorowęglany, wodorowiniany, chlorowodorki, wodorocytryniany, jodki, mleczany, sole kwasu alfa-liponowego, jabłczany, maleiniany, maloniany, pamoniany, (emboniany), palmityniany, fosforany, salycyniany, stearyniany, bursztyniany, siarczany, winiany, taniniany, oleiniany i oktylofosforany.

Wynalazek zilustrowano poniższymi przykładami, nie ograniczającymi jego zakresu.

P r z y k ł a d 1:

Do 1193 g wody dodano porcjami 46,47 g D-20761 i rozpuszczono ten związek przy ciągłym mieszaniu (= roztwór 1). Następnie, przy ciągłym mieszaniu, roztwór 1 rozcieńczono 3261 g 96% etanolu (= roztwór 2). Po rozcieńczeniu roztwór 2 przesączono przez wstępny filtr z włókna szklanego i przy cią g ł ym mieszaniu przesą cz zmieszano z 390 g Amberlitu MB3 (zło ż e mieszane wymieniacza jonowego, utworzone z silnie kwasowych wymieniaczy kationowych i anionowych) (= mieszanina 1). Przy ciągłym mieszaniu rozpuszczono 316,8 g mannitolu w 1267 g wody (= roztwór 3). Po 15 minutowym mieszaniu zmierzono pH supernatantu mieszaniny 1 i po dalszym mieszaniu przez 5 minut, zmierzono ponownie pH. Po osiągnięciu pH 12,5 roztwór oddzielono od Amberlitu MB3, przez przesączenie przez sito o drobnych oczkach (= roztwór 4).

Ciągle mieszając 4162 g roztworu 4 zmieszano z 5,34 g kwasu embonowego. Mieszaninę tę intensywnie mieszano przez dalsze 1,5 godziny i dość mętny roztwór przesączono przez wstępny filtr z włókna szklanego. W roztworze tym pH wynosiło 8,4 [sic] (= roztwór 5). Wartoś ci pH mierzono elektrodą ze szkła szlifowanego, stosując lepki roztwór elektrolitu. Wartości pH mają charakter tylko porównawczy, ponieważ roztwory lub zawiesiny podlegające pomiarom zawierały etanol i wskutek tego wykazywały wartości pozornie wyższe.

Do aparatury reakcyjnej doprowadzonej do temperatury pokojowej sterylnie przesączono 3333 g roztworu 5 a 528 g roztworu 3 sterylnie przesączono, aby uzyskać roztwór 5, który mieszając doprowadzono do temperatury pokojowej (= roztwór 6).

Roztwór 6 ogrzano do 40°C i pod zmniejszonym ciśnieniem oddestylowano mieszaninę etanolu i wody, aż do <= 1931 g (= zawiesina 1). Zawiesinę 1 embonianu cetrorelixu ozię biono do temperatury pokojowej i mieszając rozcieńczono do 3000 g sterylnie przefiltrowaną wodą do iniekcji (= zawiesina 2). Następnie, gotową do użycia zawiesinę 2 doprowadzoną do temperatury pokojowej dawkowano po 3,0 g do 10 ml fiolek do zastrzyków, zaopatrzonych w zatyczki do liofilizacji, i fiolki te przeniesiono do urządzenia liofilizującego (suszącego w zamrożeniu).

Fiolki do zastrzyków zamrożono w urządzeniu liofilizującym, przy temperaturze płytki -40°C. Suszenie przeprowadzono za pomocą programu suszenia, przy temperaturze płytki rosnącej od -40°C do 20°C. Urządzenie liofilizujące napełniono sterylnie przefiltrowanym azotem, fiolki do zastrzyków uszczelniono i nałożono zagniataną nasadkę.

Po liofilizacji, uszczelnione fiolki do zastrzyków sterylizowano promieniowaniem gamma przy 12 kGy (min) - 15 kGy. To ostatnie postępowanie jest opcjonalne.

140,0 (7) mg fiolka do zastrzyków zawierała 34,07 mg embonianu cetrorelixu, co odpowiada 30 mg cetrorelixu, i 106 g mannitolu. Dla przywrócenia pierwotnej postaci leku stosowano 2 ml wody do iniekcji. Otrzymana zawiesina może być podawana domięśniowo (i.m.) lub podskórnie (s.c).

Działanie biologiczne:

Z liofilizatu embonianu cetrorelixu (2:1) (30 mg), otrzymanego zgodnie z przykł adem 1, wytwarza się ponownie zawiesinę w 2 ml wody do iniekcji i można ją następnie podawać pozajelitowo, korzystnie podskórnie (s.c.) lub domięśniowo (i.m.).

W przypadku podawania podskórnego stwierdzono dla embonianu cetrorelixu (2:1) dostę pność biologiczną około 30-50% (100% = dożylnie podawany octan cetrorelixu). Szczególną zaletą liofilizatu

PL 204 496 B1 embonianu cetrorelixu (2:1) jest mały lub w ogóle nie występujący u pacjentów „efekt uderzeniowy” (burst effect). Czas trwania działania jest zależny od dawki i wynosi 2-8 tygodni lub dłużej, przy dawce 30-150 mg. Liofilizat embonianu cetrorelixu (2:1) według wynalazku już był badany na ludziach w fazie klinicznej I.

Fig. przedstawia przebieg zmian stężenia cetrorelixu w osoczu ludzi, w zależności od czasu (w godzinach), poczynając od podania domięśniowego 60 mg liofilizatu embonianu cetrorelixu (2:1) według przykładu 1. Nie stwierdzono występowania efektu uderzeniowego (około 100 ng/ml). Okres działania był dłuższy od 700 godzin. Od 150 godziny po podaniu stały poziom w osoczu wynosił około 2 ng/ml. Dostępność biologiczna wynosiła około 40%.

Obszarem działania soli według wynalazku są na przykład BPH (łagodny przerost gruczołu krokowego), mięśniak i endometrioza.

Claims (5)

1. Sposób wytwarzania zasadowych antagonistów peptydowych LHRH, znamienny tym, że całkowicie lub częściowo rozpuszczoną addycyjną sól zasadowego antagonisty peptydowego LHRH (1) przereagowuje się w obecności odpowiedniego rozcieńczalnika z mieszaniną kwasowego i zasadowego wymieniacza jonowego, z utworzeniem wolnego peptydu zasadowego, przy czym pH podstawowych roztworów ma wartość 7,5-13 zaś temperatura wynosi 25-30°C, następnie oddziela się wymieniacz jonowy i przereagowuje wolny peptyd zasadowy z kwasem nieorganicznym lub organicznym, w wyniku czego tworzy się pożądana słabo rozpuszczalna sól addycyjna peptydu (docelowa sól peptydu) (2), po czym usuwa się rozcieńczalnik.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wyjściową sól zasadowego antagonisty peptydowego LHRH stosuje się cetrorelix, teverelix, abarelix, ganirelix, azalinę B, antyd, A-75998, detirelix, ramorelix i RS-68439.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako kwas stosuje się kwas embonowy, kwas stearynowy lub kwas salicylowy.

4. Sposób według jednego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że molowy stosunek cetrorelixu do kwasu embonowego wynosi 2:1.

5. Sposób według jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że rozcieńczalnik usuwa się przez liofilizację.