PL204713B1

PL204713B1 - Zastosowanie antagonisty czynnika martwicy nowotworu (TNF)

Info

Publication number: PL204713B1
Application number: PL350002A
Authority: PL
Inventors: Francesco Borrelli; Mauro D'ANTONIO; Fabrizio Martelli
Original assignee: Serono Lab
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2010-02-26
Also published as: HK1043059B; KR20060128056A; NZ512585A; ZA200105263B; CA2356737A1; KR20010101397A; CN1337883A; EE200100378A; AU1997300A; KR100685106B1; PL350002A1; DE60003152T2; CN1698894A; SK10292001A3; DE60003152D1; EA003927B1; NO20013577D0; JP4601176B2; HUP0105103A2; BG65556B1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie antagonisty czynnika martwicy nowotworu (TNF).

Antagonistów czynnika martwicy nowotworu podawano w dawkach skutecznych terapeutycznie do leczenia i/lub zapobiegania endometriozie. Antagoniści według niniejszego wynalazku są zwykle wybierani spośród różnych klas cząsteczek, lecz korzystnie są to rozpuszczalne receptory TNF. Antagoniści są przydatni do uzyskiwania regresji zmian wywoływanych przez endometriozę i w połączeniu z innymi aktywnymi składnikami do uzyskiwania poprawy innych towarzyszących schorzeń, takich jak niepłodność.

Endometrioza jest chorobą żeńskich narządów płciowych, charakteryzująca się obecnością gruczołów i zrębu endometrium poza jamą i mięśniówką macicy. Lokalizacjami anatomicznymi najczęściej dotkniętymi są jajniki, więzadło odbytniczo-maciczne, jama miednicy, przegroda odbytniczo-pochwowa, szyjka macicy, pochwa, jajniki i srom. Zwykle endometrioza nacieka głęboko od przegrody odbytniczo-pochwowej do leżących głębiej tkanek i nie jest widoczna na powierzchni. Czasami ogniska endometriozy można znaleźć w lokalizacjach pozajajnikowych, takich jak płuca, pęcherz moczowy, skóra, opłucna i węzły chłonne. Ogniska endometriozy postępują; początkowo są to przezroczyste pęcherzyki, które następnie stają się czerwonymi i potem przez okres kilku lat czarnymi zmianami włóknistymi (MacSween, 1993).

Endometriozę uważa się za nowotwór łagodny, lecz ogniska endometriozy mogą w pewnych sytuacjach zezłośliwieć. Jak i w innych przypadkach nowotworów złośliwych, rozwój nowotworu wywodzącego się z endometriozy zależy od jednocześnie zachodzących zjawisk obejmujących zmiany w regulacji czynników wzrostu i/lub onkogenów (Cheung, 1996).

Endometrioza jest jedną z najczęstszych chorób ginekologicznych, występuje wśród kobiet w wieku reprodukcyjnym, u okoł o 5-10% tych kobiet (Barbieri, 1988). Wzrost tkanki endometrialnej jest całkowicie zależny od estrogenów, również w lokalizacjach ektopowych. Konsekwencją tego jest fakt, że endometrioza jest rzadka przed pierwszą miesiączką i po menopauzie, gdy u kobiet występuje niedobór estrogenów. Wrażliwość hormonalna endometriozy jest podłożem jej najczęstszych objawów, takich jak ból w okolicach miednicy i zaburzenia miesiączkowania.

Endometrioza pochodzi z komórek endometrialnych rozsianych z macicy do innych lokalizacji, gdzie żywe komórki mogą się wszczepić i rosnąć. Proponowane są dwa możliwe mechanizmy wyjaśniające rozsiew komórek inicjujących. Miesiączka wsteczna jest powszechnym zjawiskiem wśród kobiet jajeczkujących, która może umożliwiać, poprzez refluks płynów menstruacyjnych osiągnięcie przez fragmenty dotknięte endometriozą leżące w pobliżu struktury układu rozrodczego. Innym wyjaśnieniem występowania endometriozy w lokalizacjach innych niż układ rozrodczy jest rozsiew poprzez żyły jajnikowe i inwazję przez układ limfatyczny (rozsiew krwiopochodny lub limfatyczny). Również operacje ginekologiczne mogą brać udział w tym rozprzestrzenianiu (MacSween, 1993).

Oprócz rozsiewu komórek endometrialnych inne czynniki, takie jak predyspozycje genetyczne (Malinak i in., 1980), jak również zmiany immunologiczne (Ho i in., 1997) mogą determinować wrażliwość kobiet na endometriozę. Ponieważ komórki endometrialne są często obserwowane w płynie otrzewnowym u wszystkich kobiet w trakcie miesiączki, ssaki powinny posiadać mechanizm, najprawdopodobniej związany z układem odpornościowym, zapobiegający wystąpieniu endometriozy. Ogólnie, komórki endometrialne umykające odpowiedzi odpornościowej gospodarza i mające odpowiednią stymulację estrogenową mogą proliferować i tworzyć wielkie, widzialne makroskopowo zmiany. Tak więc endometrioza jest uważana za dynamiczny proces, w którym nowe zmiany tworzą się w sposób ciągły, podczas gdy zmiany istniejące mogą rosnąć, lub być niszczone przez odpowiedź odpornościową gospodarza.

Reakcje zapalne zwykle towarzyszące endometriozie zmieniają środowisko otrzewnowe, ponieważ występuje zwiększona objętość płynu otrzewnowego i makrofagi otrzewnowe zwiększają swą ilość i aktywność. Tak więc uważa się, że układ monocyty/makrofagi odgrywa wiodącą rolę w rozwoju endometriozy. Produkty wydzielania makrofagów w tym RANTES (Hornung i in., 1997), interleukina-6 (Harada i in., 1997), interleukina-8 (Arici i in., 1996a), czynnik martwicy nowotworu-alfa (Overton i in., 1996), białko chemotaksji monocytów-1 (Arici i in., 1997) znajdowane są w wyższym stężeniu w płynie otrzewnowym kobiet dotkniętych tą chorobą. Zmiany immunologiczne wykazano u kobiet z endometriozą, lecz nie wykazano, czy te zjawiska są odpowiedzialne za endometriozę, czy są wynikiem zapalenia wywoływanego przez endometriozę (Rana i in., 1996).

PL 204 713 B1

Wiedza na temat endometriozy i jej wpływu na inne choroby jest ciągle ograniczona, nawet na poziomie postawienia rozpoznania. Pomimo, że endometrioza jest uważana za główną przyczynę niepłodności, badania patofizjologiczne są sprzeczne i nieukończone. Istnieje małe powiązanie pomiędzy stopniem dolegliwości bólowych lub niepłodnością i nasileniem choroby, ponieważ wczesne zmiany są bardziej aktywne metabolicznie. Stopień niepłodności jest wyższy niż w zdrowej populacji i badania królików wykazują, że wywołanie chirurgiczne endometriozy prowadzi do spadku płodności z 75% do 25% (Hahn i in., 1986). Pacjenci z bólem z lokalizowanym w okolicy miednicznej mają endometriozę w 71% przypadków, podczas gdy 84% pacjentów z bólem zlokalizowanym w okolicy miednicznej i niepłodnością ma rozpoznaną endometriozę (Koninckx i in., 1991). Generalnie, niepłodność może być rozpoznana, gdy endometrioza jest tak nasilona, że powoduje uszkodzenie prawidłowych struktur pochwy, podczas gdy odsetek ciąż jest normalny przy minimalnych zmianach endometrialnych.

Endometrioza może wpływać na płodność również w inny sposób. Poziomy przekaźników leukocytarnych, takich jak interleukina-6, interferon i czynnik martwicy nowotworu są podwyższone i wpływają ujemnie na oddziaływania pomiędzy spermą a komórką jajową. Stwierdzono, że próbki surowicy uzyskane od kobiet dotkniętych endometriozą są embriotoksyczne w mysim modelu zarodka i hamują ruchliwość nasienia in vitro (Halme, 1991); efekt ten nasila się po dodaniu rekombinowanego czynnika martwicy nowotworu-alfa (Eiserman, 1989). Jednakże, badania te nie rozwiązują problemu, jakim jest sposób wpływania cytokin na rozwój endometriozy, lecz jedynie pokazują wpływ tych cząsteczek na żywotność komórek rozrodczych i zarodkowych.

Terapia hormonalna i chirurgiczna są dwoma typowymi sposobami leczenia obecnie wykorzystywanymi w leczeniu endometriozy. Obecna terapia farmakologiczna endometriozy wymaga hormonalnego zahamowania produkcji estrogenu, tak aby niesprzyjające środowisko hormonalne blokowało wzrost tkanki ektopowej. W stosunku do leczenia hormonalnego niepłodności skojarzonej z endometriozą u pacjentek ze zmianami minimalnymi nie wykazano skuteczności, podczas gdy inne badania wykazały wzrost odsetka ciąż (Ariciiin., 1996b).

Terapia hormonalna obejmuje wysokie dawki progestagenów w połączeniu z estrogenami i progesteronem (wykorzystując pigułki antykoncepcyjne z wysokimi dawkami (OCP), lub w schemacie pseudociąży), Danazol (androgenowa pochodna etisteronu) i nowszych agonistów GnRH. Te terapie hormonalne są skuteczne w leczeniu bólu zlokalizowanego w okolicy miednicznej i powodowaniu obiektywnego wycofywania się zmian, lecz posiadają wiele wad. Estrogen może stymulować i wywoływać proliferację tkanki endometrialnej, która może nie odpowiadać na progesteron nawet w wysokich dawkach, tak że OCP może oferować częściową ulgę u ograniczonej liczby pacjentek (Dawood, 1993). Czynniki progestatyczne mogą wywoływać nieregularne krwawienia (50%), jak również depresję, przyrost masy ciała i zatrzymanie płynów. Danazol hamuje endometriozę poprzez wywołania różnych odpowiedzi, w tym zmniejszenie poziomu rozpuszczalnego czynnika martwicy nowotworu-alfa, interleukiny-1 beta i poziomów CD8 w surowicy (Matalliotakis. 1997; Mori, 1990), zahamowanie sterydogenezy de novo i wypieranie estradiolu z miejsc receptorowych. Danazol moż e prowadzić do poprawy objawów u około 66-100% pacjentek cierpiących na bóle, lecz z grubsza odsetek nawrotów po 4 latach wynosi około 40-50%. Innymi efektami ubocznymi leczenia Danazolem jest przyrost masy ciała i wpływ androgenny powodujące u 80% pacjentek rezygnację z leczenia (Barbieri, 1988). Analogi GnRH działają silniej i dłużej niż naturalny GnRH, który oddziałuje przez usunięcie wpływu estrogennego na wzrost wszystkich tkanek wrażliwych na estrogen. Uboczne wpływy analogów GnRH są wtórne przede wszystkim do głębokiej hipoestrogenemii, i są to zmniejszona gęstość kości i odsetek nawrotów po 5 latach aż do 50% (Waller i Shaw, 1993).

Zależnie od stopnia nasilenia choroby interwencja chirurgiczna może być zachowawcza, jeśli oczekujemy płodności, lub może prowadzić do usunięcia macicy, jajowodów i jajników w przypadkach znacznego nasilenia choroby. W innych przypadkach nawet oszczędzające leczenie chirurgiczne prowadzi do znaczącego zmniejszenia płodności. Odsetek ciąż po interwencji chirurgicznej wynosi od 35% do 65%, tak więc pacjentki wymagają wywołania jajeczkowania i wewnątrzmacicznego zapłodnienia, aby uzyskać prawidłową możliwość zajścia w ciążę (Koninckx i Martin, 1994). Badania kliniczne wykazują, że po laparotomii i usunięciu endometriozy około 40% pacjentek wymaga reoperacji w ciągu 5 lat. Nawet po agresywnej interwencji chirurgicznej nawracają bóle wywoływane przez endometriozę stanowiące poważny problem. Niektóre przyczyny odpowiedzialne za niepowodzenie leczenia chirurgicznego mogą obejmować niecałkowite wycięcie zmiany, która nie została rozpoznana lub pominięta. Wiele zmian jest mikroskopowych i nie ma możliwości ich zobaczenia pomimo powiększenia,

PL 204 713 B1 jakie oferuje laparoskopia. Tak więc samo leczenie chirurgiczne nie powoduje wyleczenia tej choroby (Revelli i in., 1995).

Wiele pacjentek z endometriozą cierpi na efekty uboczne tradycyjnych sposobów leczenia (w tym konsekwencje rozregulowania hormonalnego, wysoki odsetek nawrotów i niepłodność). Tak więc istnieje potrzeba dostarczenia alternatywnych sposobów leczenia endometriozy. Możliwe podejście terapeutyczne może być reprezentowane przez zastosowanie cząsteczek immunomodulujących, które mogą zarówno powodować poprawę zmian endometrialnych i środowiska immunologicznego. Takie podejście było rozważane do leczenia objawów ogólnych (Rana i in., 1996), lecz nie ma dowodów doświadczalnych wskazujących, która cytokina spośród zmieniających poziomy ekspresji po endometriozie, może być korzystnym celem dla interwencji terapeutycznej.

Jak wcześniej opisano, jednym z wielu produktów wydzielania makrofagów włączonych w endometrialną reakcję zapalną jest czynnik martwicy nowotworu (skrót TNF). TNF określany jako kachektyna, jest plejotropową cytokiną uwalnianą przez aktywowane limfocyty T i makrofagi. TNF jest częścią sieci cytokin: interferon, interleukina i czynnik stymulujący kolonie, odgrywającej kluczową rolę w układzie sygnalizującym w odniesieniu do patogenezy wielu zakaże ń i chorób zapalnych przez wywoływanie wielu zmian prozapalnych, w tym w produkcji innych cytokin i cząsteczek adhezyjnych (Fiers, 1991).

Dla udogodnienia, termin TNF oznacza w całym niniejszym tekście zgłoszenia zarówno czynnik martwicy nowotworu-alfa, jak i -beta pochodzenia ludzkiego i zwierzęcego, wraz z naturalnie występującymi allelami TNF-alfa (Pennica i in., 1984). TNF-beta, zwany również limfotoksyną wykazuje podobną aktywność lecz jest wytwarzany przez inny rodzaj komórek (limfocyty i limfocyty zabójcy) w odpowiedzi na bodziec antygenowy lub mitogenowy (Gray i in., 1984).

TNF jest wyrażany jako dojrzałe białko o masie 17 kDa, które jest aktywne jako trimer. Kompleks ten wykazuje swoją biologiczną aktywność przez agregację swoich receptorów powierzchniowych, które pośredniczą w swoistych oddziaływaniach w różnych narządach i tkankach. W endometrium, wyrażanie TNF jest zależne od lokalizacji i fazy cyklu menstruacyjnego (Hunt i in., 1992), i wywołuje apoptozę w endometrium zwierząt doświadczalnych (Shalaby i in., 1989). Przyleganie zrębowych komórek endometrium do komórek mezotelialnych znacznie wzrasta po wcześniejszym przeleczeniu komórek mezotelialnych TNF (Zhang i in., 1993), co może dowodzić, że TNF odgrywa rolę w wywoł aniu i/lub rozwoju endometriozy.

TNF wykazuje swoją aktywność, która jest konieczna do prawidłowego rozwoju i czynności układu odpornościowego, przez wiązanie się z rodziną błonowych receptorów wiążących obejmującą p55 receptor I TNF, określany w literaturze również jako TNF-RI, i p75 receptor TNF, określany w literaturze również jako TNF-RII (Bazzoni i Beutler, 1996). Sugeruje się przewagę TNF-I w przekazywaniu sygnału TNF, przez zdolność swoistych w stosunku do tego receptora przeciwciał agonistycznych do naśladowania większości odpowiedzi wywoływanych przez TNF (Shalaby i in., 1990). Przez wiązanie do swojego receptora błonowego, TNF uwalnia szlak sygnałowy przez mediatory cytoplazmatyczne, takie jak TRADD i TRAP-1 (dla TNF-RI) albo TRAF-1 i TRAF-2 (dla TNF-RII) wywołujące różne odpowiedzi komórkowe, takie jak proliferacja limfocytów T, liza in vitro komórek nowotworowych, martwica skóry, oporność na insulinę, apoptoza. Zewnątrzkomórkowe części obu receptorów TNF mogą zostać odcięte i te rozpuszczalne receptory utrzymują zdolność do wiązania TNF, inaktywacji TNF przez tworzenie kompleksów o wysokim powinowactwie i przez to zmniejszenia wiązania TNF do receptorów błonowych komórek docelowych (Nophar i in., 1990).

W endometrium, na poziomy receptorów TNF wiążących błonę ma wpływ podawanie estradiolu i/lub progesteronu, wywołujące czasowe i komórkowo-swoiste wyrażanie TNF-RI przez myszy (Roby i in., 1996). Jednakże, to badanie jak i liczne inne badania przeprowadzane na różnych modelach związanych z endometriozą, nie dają żadnych wskazówek, jak wygląda faktyczny wpływ in vivo TNF i TNF-RI, zarówno zwią zanego z bł oną . jak i rozpuszczalnego, na rozwój ognisk endometriozy, lecz jest jedynie opisem nieprawidłowości immunologicznych związanych z endometriozą.

Niniejszy wynalazek opiera się na założeniu, że antagonista TNF jest zdolny przez sekwestrację krążącego TNF do zablokowania rozwoju zmian endometrialnych. Założenie to zostało potwierdzone przez zjawiska opisane w przykładach, wykazujące, że antagoniści TNF znacząco zmniejszają wielkość ognisk endometriotyczno-podobnych w szczurzym modelu doświadczalnym. W wyniku tego stwierdzenia, dostarczony jest sposób leczenia i/lub zapobiegania endometriozie u osobników obejmujący podawanie terapeutycznie skutecznej ilości antagonisty TNF.

PL 204 713 B1

W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie antagonisty TNF wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zwiększania stopnia implantacji i płodności przez zmniejszenie zmian endometriotycznych, przy czym antagonista TNF jest antagonistą maskującym wybranym spośród cząsteczki receptora wiążącego się z TNF lub przeciwciała przeciwko TNF.

Wynalazek obejmuje zastosowanie antagonisty TNF wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub zapobiegania endometriozie, przy czym antagonista TNF jest antagonistą maskującym wybranym spośród cząsteczki receptora wiążącego się z TNF i przeciwciała przeciwko TNF.

Korzystnie, w obu zastosowaniach antagonistą maskującym jest cząsteczka receptora, jej pochodna albo fragment wiążące TNF.

Korzystnie cząsteczka receptora, jej pochodna albo fragment, jest wybrana z grupy obejmującej TNF-RI i TNF-RII.

Korzystnie cząsteczką receptora jest zewnątrzkomórkowa domena TNF-RI oraz ludzki rozpuszczalny rekombinowany TNF-RI.

Korzystna cząsteczka receptora TNF albo jej funkcjonalna część wiążąca TNF, która korzystnie obejmuje całość albo funkcjonalną część dwóch albo więcej domen zewnątrzkomórkowych receptorów TNF, połączonych jednym albo więcej łącznikami polipeptydowymi.

Korzystnie cząsteczką receptora jest immunoreceptorowa cząsteczka fuzyjna albo jej funkcjonalna część wiążąca TNF, która korzystnie obejmuje całość albo funkcjonalną część receptora TNF oraz łańcuch immunoglobuliny.

Korzystnie antagonistą maskującym jest przeciwciało przeciwko TNF albo jego fragment wiążący się z TNF, które korzystnie jest przeciwciałem monoklonalnym wybranym z grupy obejmującej chimeryczne przeciwciało monoklonalne, humanizowane przeciwciało monoklonalne i ich fragmenty wiążące się z TNF.

Kompozycja wytwarzana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być podawana pozajelitowo albo w postaci innej skutecznej formulacji. Każdy rodzaj podawania pozajelitowego może być przydatny, w tym dożylny, domięśniowy i podskórny. Oprócz farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika, kompozycja może również obejmować niewielkie ilości dodatków, takich jak stabilizatory, substancje pomocnicze, bufory i konserwanty.

Możliwe jest zastosowanie samego antagonisty TNF albo w połączeniu z innymi antagonistami TNF. Połączenie z jednym lub więcej aktywnymi produktami jest również możliwe, zwłaszcza w celu poprawy stanu pacjentek cierpiących na niepłodność związaną z endometriozą.

Opisany tu wynalazek jasno pokazuje nieoczekiwany wynik, że sekwestracja TNF (który jest jedną z wielu cytokin, których poziom ekspresji jest zwiększony w płynie otrzewnowym w trakcie endometriozy) za pomocą antagonisty TNF zmniejsza ogniska endometriotyczno-podobne w szczurzym modelu doświadczalnym. Model ten pokazuje również, że taki skutek jest uzyskiwany bez znaczącego wpływu na równowagę hormonalną i aktywność komórek zabójców. Zmniejszenie zmian endometriotycznych wykorzystujące antagonistów TNF może również poprawić odsetek płodności, ponieważ normalizacja struktury narządów rozrodczych ma pozytywny wpływ na odsetek zagnieżdżeń.

Podawanie skutecznej terapeutycznie ilości antagonisty TNF można łączyć z innym lekiem w sposobie leczenia niepł odnoś ci zwią zanej z endometriozą .

Aktywnymi składnikami zgłaszanych tu kompozycji są maskujący antagoniści TNF. Tacy antagoniści mogą się wiązać do albo mogą sekwestrować samą cząsteczkę TNF z wystarczającym powinowactwem i swoiście odpowiednio unieczynniać epitop TNF odpowiedzialny za wiązanie receptora TNF (zwani dalej jako „antagoniści maskujący”).

Antagonistów TNF można łatwo zidentyfikować i policzyć ewentualnych antagonistów rutynowym testem badającym wpływ natywnego TNF na wrażliwe linie komórkowe in vitro, na przykład na ludzkie limfocyty B, w których TNF wywołuje proliferację i wydzielanie Ig. Test zawiera formulacje TNF w róż nych rozcień czeniach ewentualnych antagonistów np. od 0,1 do 100-krotnych molarnych iloś ci TNF stosowanego w badaniu, kontrola bez TNF lub tylko z antagonistą (Tucci i in., 1992).

Wśród antagonistów maskujących korzystne są te polipeptydy, które wiążą TNF z wysokim powinowactwem i wykazują niską immunogenność. Cząsteczki rozpuszczalnych receptorów TNF i przeciwciała neutralizujące TNF są szczególnie korzystne. Na przykład, TNF-RI i TNF-RII są przydatne w niniejszym wynalazku. Rozgałęzione postaci tych receptorów obejmujące domeny zewnątrzkomórkowe receptora albo ich czynnościowe części są bardziej korzystnymi antagonistami według niniejszego

PL 204 713 B1 wynalazku. Rozgałęzione postaci receptorów TNF są rozpuszczalne i wykrywalne w moczu i surowicy jako białka hamujące wiązanie TNF o ciężarze 30 kDa i 40 kDa, które są oryginalnie zwane odpowiednio TBPI i TPBII (Engelmann i in., 1990). Pochodne, fragmenty, regiony i biologicznie czynne części cząsteczek receptorowych są przedstawicielami cząsteczek receptorowych, które można stosować w niniejszym wynalazku. Takie biologicznie aktywne zamienniki albo pochodne cząsteczek receptorowych odnoszą się do części wymienionego polipeptydu, albo do sekwencji kodującej cząsteczkę receptora, która posiada odpowiednią wielkość i jest zdolna do wiązania TNF z takim powinowactwem, które blokuje lub hamuje błonowy receptor TNF. W korzystnym wykonaniu, antagonistąjest ludzki rozpuszczalny TNF-RI. Naturalne i rekombinowane rozpuszczalne cząsteczki receptora TNF i sposoby ich uzyskiwania zostały opisane w europejskich zgłoszeniach patentowych EP 038,378, EP 398,327 i EP 433,900.

Multimerowe cząsteczki receptora TNF i cząsteczki fuzyjne immunoreceptora TNF, i ich pochodne i części są dodatkowymi przykładami cząsteczek receptora przydatnych w zastosowaniach według niniejszego wynalazku. Multimerowe cząsteczki receptora TNF przydatne w niniejszym wynalazku obejmują wszystkie albo czynnościowe części domeny zewnątrzkomórkowej dwóch lub więcej receptorów TNF powiązanych przez jedno lub więcej wiązań polipeptydowych. Multimerowe cząsteczki mogą następnie obejmować peptyd sygnałowy białka wydzielniczego do bezpośredniego wyrażania cząsteczki multimerowej. Te cząsteczki multimerowe i sposoby ich wytwarzania zostały opisane w europejskim zgł oszeniu patentowym EP 526,905.

Cząsteczki fuzyjne immunoreceptora TNF przydatne w niniejszym wynalazku obejmują przynajmniej jedną część jednej lub więcej cząsteczek immunoglobulin i wszystkie albo czynnościowe części jednego lub więcej receptora TNF. Te cząsteczki fuzyjne immunoreceptora TNF można uzyskiwać jako monomery, albo hetero- albo homomultimery. Te cząsteczki fuzyjne immunoreceptora mogą być również monowalentne albo multiwalentne. Cząsteczki fuzyjne immunoreceptora TNF i sposoby ich wytwarzania zostały opisane w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 620,739 odpowiadającym zgłoszeniu patentowemu PCT WO 94/06476.

Inna klasa antagonistów maskujących przydatna w zastosowaniu według niniejszego wynalazku jest reprezentowana przez przeciwciała anty-TNF, w tym monoklonalne, chimeryczne, humanizowane i przeciwciał a rekombinowane i ich fragmenty, które charakteryzują się wysoką zdolnoś cią wią zania TNF in vivo i niską toksycznością. Przeciwciała, które można wykorzystać w niniejszym wynalazku, charakteryzuje ich zdolność do leczenia pacjentów przez czas wystarczający do uzyskania dobrej do znakomitej regresji zmian endometriotycznych, ustąpienie objawów i niska toksyczność. Przeciwciała neutralizujące są łatwo uzyskiwane od zwierząt, takich jak króliki i myszy, przez immunizację TNF. Immunizowane myszy są szczególnie przydatne w uzyskiwaniu źródeł limfocytów B do wytwarzania hybrydom, które następnie są hodowane w celu wytwarzania dużych ilości przeciwciał monoklonalnych anty-TNF. Przeciwciała chimeryczne są cząsteczkami immunoglobulin charakteryzującymi się dwoma lub więcej segmentami albo częściami pochodzącymi od różnych gatunków zwierząt. Generalnie zmienne regiony przeciwciał chimerycznych pochodzą z immunoglobulin ssaczych, nie pochodzących od człowieka, takich jak mysie przeciwciało monoklonalne, a stałe regiony immunoglobulin pochodzą z cząsteczki ludzkiej immunoglobuliny. Korzystnie, oba regiony i ich kombinacja wykazują niską immunogenność oznaczaną w sposób typowy (Elliott i in., 1994). Humanizowane przeciwciała są cząsteczkami immunoglobulin wytwarzanymi metodami inżynierii genetycznej, w których mysie regiony stale są zastępowane ludzkimi odpowiednikami, z utrzymaniem mysich regionów wiążących antygen. Powstałe mysio-ludzkie przeciwciało chimeryczne powinno wykazywać zmniejszoną immunogenność i polepszoną farmakokinetykę u ludzi (Knight i in., 1993). Korzystne przykłady przeciwciał monoklonalnych i ich pochodnych o wysokim powinowactwie przydatne w niniejszym wynalazku opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 186,833 i zgłoszeniu patentowym PCT W) 92/16553.

Antagonistów TNF można podawać osobnikowi różnymi sposobami. Drogi podawania obejmują drogę doskórną, śródskórną (np. formulacje wolno uwalniające), domięśniową, dootrzewnową, dożylną, podskórną, doustną, podtwardówkową, miejscową i donosową. Można wykorzystywać wszystkie inne skuteczne terapeutycznie drogi podawania, na przykład, absorpcję przez tkanki nabłonkowe i ś ródbł onkowe, lub przez terapię genową , w której czą steczki DNA kodują ce antagonistę TNF są podawane pacjentowi (np. wektorem), co powoduje, że antagonista TNF jest wyrażany i wydzielany in vivo. Dodatkowo, antagonistę TNF można podawać łącznie z innymi składnikami biologicznie aktywnych czynników, takimi jak farmaceutycznie dopuszczalne czynniki powierzchniowe, zaróbki, rozpuszczalniki i inne nośniki.

PL 204 713 B1

Określenie „dopuszczalne farmaceutycznie” w znaczeniu tu zastosowanym obejmuje dowolny nośnik, który nie zakłóca aktywności biologicznej składnika czynnego i nie jest toksyczny dla biorcy, któremu jest podawany. Przykładowo, do podawania pozajelitowego, antagonistów TNF można formułować w jednostkowe postaci dawkowania do wstrzyknięć w takich nośnikach jak roztwór soli, roztwór dekstrozy, albumina surowicy i roztwór Ringera.

Do podawania pozajelitowego (np. dożylnego, podskórnego, domięśniowego), antagonistów TNF można formułować jako roztwór, zawiesinę, emulsję albo liofilizowany proszek w połączeniu z noś nikiem dopuszczalnym farmaceutycznie do podawania pozajelitowego (np. woda, roztwór soli, roztwór dekstrozy) i dodatkami, które zapewniają izotoniczność (np. mannitol) albo stabilność chemiczną (np. konserwanty i bufory). Formulacje sterylizuje się technikami stosowanymi powszechnie.

Dostępność biologiczna antagonistów TNF może być również polepszona przez zastosowanie procedur sprzęgania, które zwiększają okres półtrwania cząsteczki w organizmie człowieka, przykładowo, sprzęgnięcie cząsteczki z poliglikolem etylenowym, jak opisano w zgłoszeniu PCT WO 92/13095.

Ilości skuteczne terapeutycznie antagonistów TNF stanowią funkcję wielu zmiennych, w tym rodzaju antagonisty, powinowactwa antagonisty do TNF, resztkowej cytotoksyczności wykazywanej przez antagonistę, drogi podania, stanu klinicznego pacjenta (w tym konieczności utrzymywania nietoksycznego poziomu endogennej aktywności TNF), obecności wielu miejsc wiążących TNF w czynnikach sekwestracyjnych, np. przeciwciałach.

„Ilość skuteczna terapeutycznie” stanowi taką ilość, która po podaniu powoduje zahamowanie aktywności biologicznej TNF. Podana osobnikowi dawka, zarówno jako dawka pojedyncza, jak i wielokrotna, różnić się będzie w zależności od różnych czynników, w tym właściwości farmakokinetycznych antagonisty, drogi podania, stanu pacjenta i jego charakterystyki (płeć, wiek, ciężar ciała, stan ogólny, wielkość), nasilenia objawów, równoczesnego leczenia, częstości podawania i objawów niepożądanych. Ustawienie i manipulowanie w ustalonym zakresie dawek leży w zakresie możliwości specjalisty, jak również znane są sposoby mierzenia zahamowania TNF u osobnika in vivo i in vitro.

Ponieważ maksymalna tolerowana dawka TNF w badaniach klinicznych na ludziach zawiera się w okolicy 25 μg/m² pola powierzchni ciała/24 godziny, ilość podawanego antagonisty zasadniczo nie musi przekraczać dawki, która jest obliczona dla neutralizacji tej ilości TNF. Tak więc, dawka antagonisty TNF molarnie zawierać się będzie w granicach od 0,001- do 10-krotnej maksymalnej tolerowanej dawki TNF, jakkolwiek jak zaznaczono wyżej, stanowi to domenę terapeuty.

Ponadto, dane uzyskane w badaniach klinicznych, w których wykazano wzrost stężenia TNF w płynie otrzewnowym u kobiet z endometriozą przy użyciu różnych protokołów (Eisermann i in., 1988; Halme, 1991; Overton i in., 1996) mogą być również przydatne do określenia podawanej skutecznej dawki antagonisty TNF.

Zwykle, dzienna dawka składnika czynnego wynosi od około 0,01 do 100 miligramów na kilogram ciężaru ciała. Zwykle, 1 do 40 miligramów na kilogram na dzień podawane w dawkach podzielonych albo w postaci do powolnego uwalniania jest wystarczające do uzyskania pożądanego rezultatu. Drugie i kolejne podanie można przeprowadzić przy użyciu takiej samej dawki, mniejszej albo większej niż początkowa albo poprzednia dawka podawana pacjentowi. Druga i kolejna dawka może być podana podczas albo przed nawrotem endometriozy albo podobnych objawów. Określenie „nawrót” albo „ponowne wystąpienie” określa się jako pojawienie się jednego albo wielu objawów endometriozy.

Antagonistę TNF można podawać profilaktycznie albo terapeutycznie osobnikowi przed, równocześnie albo kolejno z innymi schematami leczenia albo czynnikami (np. schemat wielolekowy) w ilościach skutecznych terapeutycznie, w szczególności do leczenia niepłodności. Antagonistów TNF, których podaje się równocześnie z innymi środkami terapeutycznymi, można podawać w tej samej albo w różnych kompozycjach. W szczególności, gdy niepłodność jest zaburzeniem związanym z endometriozą można podawać biologicznie czynną ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG), hormon luteinizujący (LH), czynnik pobudzający pęcherzyki (FSH) w postaci naturalnej, wysokooczyszczonej albo rekombinowanej. Takie cząsteczki i sposoby ich wytwarzania opisano w europejskich zgłoszeniach patentowych EP 160699, EP 211894 i EP 322438.

Niniejszy wynalazek zostanie zilustrowany przykładami, które nie mają na celu ograniczania go w żaden sposób, jak również w odniesieniu do następujących Figur.

Figura 1 pokazuje wpływ Antide (2 mg/kg, podskórnie co 3 dni), rekombinowanego rozpuszczalnego TNF-RI (10 mg/kg, s.c. w dwóch dawkach dziennie przez tydzień) na wielkość wszczepu u szczurów z doświadczalna endometriozą w 2 i 9 dni po ostatniej dawce. Dane, które uzyskano od

PL 204 713 B1 zwierząt/grupę dla pierwszego punktu czasu, w którym uś miercono zwierzę ta i 5 zwierząt/grupę dla drugiego uśmiercenia zwierząt, stanowią średni odsetek zahamowania +/- SEM.

Figura 2 pokazuje wpływ rekombinowanego rozpuszczalnego TNF-RI (10 mg/kg s.c. w dwóch dawkach dziennie przez tydzień) oraz Antide (2 mg/kg, podskórnie co 3 dni) na aktywność NK splenocytów szczurzych wobec komórek YAC (uwalnianie ⁵¹Cr) 2 dnia (panel A) i 9 dnia po ostatniej dawce (panel B). Dane pokazują średni odsetek lizy +/-SEM.

Figura 3 pokazuje wpływ rekombinowanego rozpuszczalnego TNF-RI (10 mg/kg s.c. w dwóch dawkach dziennie przez tydzień) w porównaniu z kontrolą oraz Antide (2 mg/kg, podskórnie co 3 dni) na poziom 17e-estradiolu w surowicy w doświadczalnej endometriozie u szczurów. Dane stanowią średnią stężenia 17e-estradiolu +/- SEM.

P r z y k ł a d

Materiały i metody

Zwierzęta. Samice szczura Sprague-Dawley (250-275 g) zakupiono w Charles River Italia (Calco, Lecco, Włochy). Zwierzęta trzymano w warunkach laboratoryjnych: temperatura 22+/-2°C, wilgotność względna 55+/-10%, wentylacja 15+/-3 zmiany powietrza na godzinę, filtrowane na filtrach HEPA 99,997% i sztuczne oświetlenie o cyklu dziennym 12 godzin światła (7.00-19.00). Przed doświadczeniem zwierzęta pozostawiono do aklimatyzacji do tych warunków przez okres przynajmniej tygodnia. Zwierzęta karmiono ad libitum standardową dietą granulowaną.

Leki badane. Antide pochodził z Bachem (California, USA). Ludzką rekombinowaną rozpuszczalną cząsteczkę TNF-RI zastosowaną w Przykładzie, o sekwencji odpowiadającej segmentowi 20-180 ludzkiego TNF-RI (Nophar i in., 1990), wytworzoną w komórkach CHO i dostarczoną przez firmę Interpharm Laboratories Ltd (Izrael) pod nazwą r-hTBP-1.

Materiały. Materiały do hodowli tkankowej zakupiono w Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, UK). Zestaw RIA do mierzenia 17e-estradiolu zakupiono w DPC (Los Angeles, CA, USA). Inoketam zakupiono w Virbac (Carros, Francja). [⁵¹Cr]-chromian sodu zakupiono w NEN DuPont (Boston, MA, USA). Rompun zakupiono w Bayer AG (Leverkusen, Niemcy). Szew jedwabny 7.0 zakupiono w Ethicon (Pomezia, Włochy).

Model doświadczalnej endometriozy u szczurów. W celu zbadania wpływu rekombinowanego rozpuszczalnego TNF-RI na endometriozę, zastosowano uprzednio opisany model doświadczalny (Jones, 1987) z niewielkimi modyfikacjami. W znieczuleniu Inoketam/Rompun, autologiczny fragment tkanki endometrium (1 cm długości) wycięto z rogu macicy szczura i umieszczono w PBS w temperaturze 37°C. Segment macicy otworzono cięciem podłużnym, wszczepiono fragment 5x5 mm, bez usuwania miometrium, na wewnętrznej powierzchni ściany jamy brzusznej przy użyciu niewchłanialnych szwów.

Badanie wpływu badanych leków na model doświadczalnej endometriozy. Doświadczała endometriozę wywołano u szczurów chirurgicznie w znieczuleniu, jak to opisano wyżej. Oprócz tego, dodatkową grupę szczurów poddano podobnej operacji, w której również usunięto jeden z rogów macicy, ale w ścianę brzucha wszczepiono fragment 5x5 mm tkanki tłuszczowej otaczającej macicę (grupa operowana pozornie). Jeszcze inną grupę szczurów, nie poddanych żadnej operacji, trzymano jako normalną grupę kontrolną. 3 tygodnie po wywołaniu endometriozy, zwierzęta poddano drugiej laparotomii (laparotomia poprzedzająca leczenie) w celu zbadania wielkości i żywotności ektopowej tkanki endometrium. Pole powierzchni (długość x szerokość) mierzono mikrometrycznie i zapisywano. Zwierzęta wykazujące żywy przeszczep przydzielono do określonych grup leczenia jak opisano w Tablicy I, tak, że na zakończenie doświadczenia uzyskano po 6 zwierząt/grupę dla pierwszego punktu czasu i 5 zwierząt/grupę dla drugiego. Leczenie rozpoczęto po tygodniu zdrowienia. Grupy kontrolne otrzymywały sam roztwór soli, inna grupa otrzymywała trzy podskórne wstrzyknięcia 2 mg/kg Antide co 3 dni, w schemacie, który okazał się hamować aktywność jajników i podwzgórza (Sharpe i in., 1990). Kolejna grupa otrzymywała 10 mg/kg rekombinowanego rozpuszczalnego TNF-RI, w dwóch podzielonych dawkach dziennie przez tydzień.

T a b l i c a I

Przeszczep endometrium	Leczenie	dni leczenia¹	dni zabijania¹
1	2	3	4
nie	roztwór soli	28 do 34	36, 43
pozornie	roztwór soli	28 do 34	36, 43

PL 204 713 B1 cd. tablicy I

1	2	3	4
tak	roztwór soli	28 do 34	36, 43
tak	Antide (2 mg/kg)	28, 31, 34	36, 43
tak	rekombinowany rozpuszczalny TNF-RI (10 mg/kg w dwóch dawkach dziennie)	28 do 34	36, 43

¹od dnia wszczepienia (dzień 1).

W okreś lonych punktach czasu (2 i 9 dzień po zakoń czeniu leczenia, tj. 36 i 43 dni po wszczepieniu) zwierzęta znieczulano, pobierano krew z aorty brzusznej, surowicę oddzielano i przechowywano w -20°C do momentu analizy poziomu 17e-estradiolu. Śledziony wycinano w celu określenia aktywności NK. Pole powierzchni ognisk przypominających endometriozę mierzono w każdym punkcie czasu. W celu normalizacji danych, procent zmienności wartości w funkcji wartości przed laparotomią, obliczano według wzoru:

(X-Xn)/Xnx100 w którym X_n oznacza wielkość w czasie przed laparotomią zaś X oznacza wielkość w momencie zabicia. Następnie obliczono średnią wartość procentowej zmienności dla każdej z grup.

Oznaczanie aktywności NK. Wielkość aktywności NK oznaczano stosując test uwalniania ⁵¹Cr. Komórki mysiego chłoniaka YAC-1 zbierano podczas wykładniczej fazy wzrostu i płukano w pożywce (RPMI 164n z dodatkiem penicyliny/streptomycyny, L-glutaminy i 1n% inaktywowanej termicznie surowicy płodowej cielęcej). Osad komórek inkubowano z 100 LiCi [⁵¹Cr]-chromianu sodu w 37°C, 5% CO₂ przez 2 godziny. Następnie komórki płukano 3-krotnie stosując po 1n ml pożywki do badań, zawieszano w pożądanej gęstości i dodawano do płytki testowej w obecności splenocytów szczurzych. Zawieszano je w pożywce do badań w pożądanej gęstości (2x10⁶/ml) i wykonywano kolejne rozcieńczenia w pożywce do badań w potrójnym powtórzeniu w płytkach 96-studzienkowych o dnie w kształcie U, a następnie dodawano komórki docelowe znakowane ⁵¹Cr. Komórki znakowane ⁵¹Cr (5x10³) dodawano do płytki w trzech stosunkach celów do efektorów (200:1, 100:1 i 50:1) dla każdej próbki. Płytkę zawierającą mieszaninę efektor do celu odwirowano przy 200 x g przez 4 minuty i inkubowano w 37°C, 5% CO2 przez 4 godziny. Po dodatkowym odwirowaniu przy 200 x g przez 4 minuty, 20 L l supernatantu z każdej studzienki przenoszono na filtr z włókna szklanego i badano radioaktywność stosując licznik β.

Procent lizy obliczono w następujący sposób:

(cpmpróbki - cpmspontaniczne)/(cpmcałkowite - cpmspontaniczne) x 100 gdzie:

cpmpróbki oznacza średnie uwalnianie ⁵¹Cr w obecności komórek efektorowych; cpmspontaniczne oznacza średnie uwalnianie ⁵¹Cr z komórek docelowych w obecności pożywki; cpmcałkowite oznacza średnie uwalnianie ⁵¹Cr z komórek docelowych w obecności 1%Triton X100. Oznaczanie 17e-estradiolu. Stężenia 17e-estradiolu w surowicy oznaczano stosując zestaw dostępny w handlu bez etapu ekstrakcji (DPC, Los Angeles, CA, USA). Pokrótce, estradiol znakowany 125 ¹²⁵I współzawodniczy z estradiolem w próbce surowicy o miejsce wiązania na przeciwciele. Po inkubacji, oddzielenie estradiolu związanego od wolnego uzyskuje się przez dekantację. Radioaktywność probówki ocenia się w liczniku gamma (LKB-Pharmacia Wallac), przy czym zliczenia są odwrotnie proporcjonalne do ilości estradiolu w próbce surowicy. Ilość estradiolu w próbkach oznacza się przez porównanie zliczeń z krzywą kalibracyjną. Surowica odpornościowa jest wysoce swoista wobec estradiolu i ma stosunkowo niską reaktywność krzyżową wobec innych naturalnie występujących steroidów. Próbki z tej samej sesji doświadczalnej analizowano w pojedynczym teście immunologicznym.

Analiza statystyczna. Istotność statystyczna różnic obserwowanych pomiędzy leczonymi grupami badano stosując test ANOVA w oprogramowaniu Statgraphics Plus® (wersja 1.4). Przeprowadzono test wielokrotnego rozstępu Tukeya (P<0,05).

Wyniki

Badanie działania rekombinowanego rozpuszczalnego TNF-RI w doświadczalnej endometriozie

Pomyślny wzrost i rozwój tkanki endometrium wszczepionej chirurgicznie szczurom oferuje model badawczy, który zastosowano do badania niektórych aspektów endometriozy, które nie mogą być wystarczająco zbadane u ludzi (Dudley i in., 1992). Uprzednie badania na doświadczalnej endometriozie u szczurów wykazały, że Antide działa prawidłowo jako kontrola pozytywna (Sharpe i in., 1990).

PL 204 713 B1

W niniejszym przykładzie, porównywano działanie Antide z rekombinowanym rozpuszczalnym TNF-RI, pod względem wielkości wszczepu przed i po leczeniu, jak to podsumowano w Tablicy II.

T a b l i c a II

Leczenie	Dawka (mg/kg)	Okres obserwacji po ostatniej dawce (dni)	Średnia +/- SEM wartości przed leczeniem (cm²)	Średnia +/- SEM wartości po leczeniu (cm²)
roztwór soli	-	2	1,45+0,41	1,18±0,15
rozpuszczalny TNF-RI	10	2	1,43±0,38	0,77±0,09
Antide	2	2	1,43±0,34	0,08±0,02
roztwór soli		9	1,28±0,24	0,97±0,11
rozpuszczalny TNF-RI	10	9	1,42±0,38	0,54±0,19
Antide	2	9	1,41±0,32	0,19±0,09

Wyniki pokazano na Figurze 1 jako średni procent zahamowania wszczepionych fragmentów endometrium (obliczone jak to opisano wyżej).

Antide skutecznie zmniejszał wielkość ognisk przypominających endometriozę (Fig. 1), wywołując niemal całkowitą (94% i 88% w porównaniu z wielkością oryginalną) i istotną statystycznie (p<0,05, ANOVA i test Tukeya) remisję w obu punktach czasu po przerwaniu leczenia. 1 -tygodniowe leczenie ludzkim rekombinowanym rozpuszczalnym TNF-RI (10 mg/kg, dwie dawki dziennie) powodowało istotne zmniejszenie wielkości (33% i 64% w porównaniu z wielkością oryginalną) ognisk endometriozy w obu punktach czasu, ale istotn ą statystycznie (p<0,05, ANOVA i test Tukeya) remisję tylko w dniu 9. Nie obserwowano wszczepów u zwierząt operowanych pozornie.

Badanie aktywności NK

Aktywność NK badana testem in vitro ze splenocytami i komórkami YAC nie wykazała różnic pomiędzy grupami (Fig. 2), podobnie jak nie obserwowano jej na pawianach, u których wykazano brak różnic w cytotoksyczności przeciwko endometrium i aktywności komórek NK u zwierząt z endometriozą i bez (D'Hooghe i in., 1995). To stwierdzenie jest w sprzeczności z danymi na ludziach, gdzie wykazano obniżenie aktywności NK u pacjentek z endometriozą z istotną korelacją pomiędzy zmniejszeniem otrzewnowej aktywności NK i ciężkością endometriozy (Oosterlynck i in., 1992).

Badanie poziomu 17e-estradiolu w surowicy

Stężenia 17e-estradiolu mierzono testem radioimmunologicznym w obu punktach czasowych obserwacji. Obserwowano istotną statystycznie różnicę pomiędzy grupami leczonymi Antide i grupą kontrolną nieleczone w drugim punkcie czasu. Nie obserwowano istotnych statystycznie różnic pomiędzy grupami leczonymi rekombinowanym rozpuszczalnym TNF-RI w porównaniu z kontrolą (Fig. 3; p<0,05, ANOVA i test Tukeya).

Wnioski

W modelu doświadczalnej endometriozy u szczurów, podawanie antagonisty TNF, rozpuszczalnej postaci TNF-RI, dostarcza dowodów na potencjalną skuteczność opartej na cytokinach, niehormonalnej terapii tego schorzenia. Tak więc, antagoniści TNF stanowią alternatywę istniejącego leczenia w sensie zmniejszonych objawów ubocznych. Wyniki te pozwalają ocenić zastosowanie antagonistów TNF w leczeniu niepłodności związanej z endometriozą.

Specjaliści w dziedzinie zauważą bez dodatkowych doświadczeń możliwość zastosowania wielu ekwiwalentów opisanych tu, konkretnych wykonań wynalazku. Te rozwiązania i wszystkie ekwiwalenty objęte są poniższymi zastrzeżeniami patentowymi.

Claims

1. Zastosowanie antagonisty TNF wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym noś nikiem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub zapobiegania endometriozie, przy czym antagonista TNF jest antagonistą maskującym wybranym spośród cząsteczki receptora wiążącego się z TNF i przeciwciał a przeciwko TNF.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że antagonistą maskującym jest cząsteczka receptora, jej pochodna albo fragment wiążące TNF.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że cząsteczka receptora, jej pochodna albo fragment, jest wybrana z grupy obejmującej TNF-RI i TNF-RII.

4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, ż e cząsteczką receptora jest zewnątrzkomórkowa domena TNF-RI.

5. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że cząsteczką receptora jest ludzki rozpuszczalny rekombinowany TNF-RI.

6. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że cząsteczką receptora jest multimeryczna cząsteczka receptora TNF albo jej funkcjonalna część wiążąca TNF.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że multimeryczna cząsteczka receptora TNF obejmuje całość albo funkcjonalną część dwóch albo więcej domen zewnątrzkomórkowych receptorów TNF, połączonych jednym albo więcej łącznikami polipeptydowymi.

8. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że cząsteczką receptora jest immunoreceptorowa cząsteczka fuzyjna albo jej funkcjonalna część wiążąca TNF.

9. Zastosowanie wedł ug zastrz. 8, znamienne tym, ż e immunoreceptorowa cz ą steczka fuzyjna obejmuje całość albo funkcjonalną część receptora TNF oraz łańcuch immunoglobuliny.

10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że antagonistą maskującym jest przeciwciało przeciwko TNF albo jego fragment wiążący się z TNF.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym wybranym z grupy obejmującej chimeryczne przeciwciało monoklonalne, humanizowane przeciwciało monoklonalne i ich fragmenty wiążące się z TNF.

12. Zastosowanie antagonisty TNF wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zwiększania stopnia implantacji i płodności przez zmniejszenie zmian endometriotycznych, przy czym antagonista TNF jest antagonistą maskującym wybranym spośród cząsteczki receptora wiążącego się z TNF lub przeciwciała przeciwko TNF.

13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że antagonistą maskującym jest cząsteczka receptora, jej pochodna albo fragment wiążące TNF.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że cząsteczka receptora, jej pochodna albo fragment, jest wybrana z grupy obejmującej TNF-RI i TNF-RII.

15. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że cząsteczką receptora jest zewnątrzkomórkowa domena TNF-RI.

16. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że cząsteczką receptora jest ludzki rozpuszczalny rekombinowany TNF-RI.

17. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że cząsteczką receptora jest multimeryczna cząsteczka receptora TNF albo jej funkcjonalna część wiążąca TNF.

18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że multimeryczna cząsteczka receptora TNF obejmuje całość albo funkcjonalną część dwóch albo więcej domen zewnątrzkomórkowych receptorów TNF, połączonych jednym albo więcej łącznikami polipeptydowymi.

19. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że cząsteczką receptora jest immunoreceptorowa cząsteczka fuzyjna albo jej funkcjonalna część wiążąca TNF.

20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że immunoreceptorowa cząsteczka fuzyjna obejmuje całość albo funkcjonalną część receptora TNF oraz łańcuch immunoglobuliny.

21. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że antagonistą maskującym jest przeciwciało przeciwko TNF albo jego fragment wiążący się z TNF.

22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym wybranym z grupy obejmującej chimeryczne przeciwciało monoklonalne, humanizowane przeciwciało monoklonalne albo ich fragmenty, które wiążą się z TNF.