PL205298B1 - Immunogenny preparat lub szczepionka przeciwko kalciwirusom kotów, hybrydoma oraz przeciwciało monoklonalne - Google Patents

Immunogenny preparat lub szczepionka przeciwko kalciwirusom kotów, hybrydoma oraz przeciwciało monoklonalne

Info

Publication number
PL205298B1
PL205298B1 PL352461A PL35246100A PL205298B1 PL 205298 B1 PL205298 B1 PL 205298B1 PL 352461 A PL352461 A PL 352461A PL 35246100 A PL35246100 A PL 35246100A PL 205298 B1 PL205298 B1 PL 205298B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
fcv
vaccine
feline
immunogenic preparation
strain
Prior art date
Application number
PL352461A
Other languages
English (en)
Other versions
PL352461A1 (en
Inventor
Hervé Poulet
Sylvain Gabriel Goutebroze
Original Assignee
Merial Sas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9909420A external-priority patent/FR2796281B1/fr
Application filed by Merial Sas filed Critical Merial Sas
Publication of PL352461A1 publication Critical patent/PL352461A1/xx
Publication of PL205298B1 publication Critical patent/PL205298B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/106—Picornaviridae (F), e.g. hepatitis A virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16061—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/16063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest immunogenny preparat lub szczepionka przeciwko kaliciwirusom kotów, hybrydoma zdeponowana w CNCM pod numerem dostępu I-2282 oraz przeciwciało monoklonalne wydzielane przez tę hybrydomę.
Opisane zostało zastosowanie określonych szczepów kalciwirusów kotów do wytwarzania immunogennych preparatów i szczepionek, w szczególności inaktywowanych lub podjednostkowych, przeciwko kaliciwirozie kotów. Takie preparaty immunogenne i szczepionki mogą również być łączone z preparatami immunogennymi przygotowanymi w oparciu o inne kocie czynniki patogenne w celu wytworzenia immunogennych preparatów i szczepionek poliwalentnych.
Kalciwirusy kotów (ang. Feline Calcivirus lub FCV) zostały po raz pierwszy opisane w 1957 r. (Fastier L.B. Am. J. Vet. Res. 1957. 18. 383-389). Kalciwirusy kotów wspólnie z kocimi wirusami herpes należą do dwóch głównych przyczyn chorób wirusowych górnych dróg oddechowych u kotów. Wirusy FCV atakują dużą liczbę zwierząt, ze stopniem nosicielstwa FCV rzędu 15 do 25% i częstością występowania przeciwciał w surowicy przeciwko FCV od 70 do 100% (Coutts i wsp. Vet Rec. 1994, 135, 555-556; Ellis T.M. Australian Vet. J. 1981. 57. 115-118; Harbour i wsp. Vet. Rec. 1991, 128, 77-80; Reubel i wsp. Feline Dendistry 1992, 22, 1347-1360). Po wstępnej fazie hipertermii tym chorobom dróg oddechowych towarzyszą na ogół owrzodzenia w jamie ustnej (podniebienie, język, wargi, nos), katar, zapalenie spojówek, ewentualnie anoreksja i astenia. Wirusy FCV mogą również powodować zapalenia płuc, zapalenia otrzewnej i bóle w stawach (zespół kulenia).
Przekaz wirusa FCV jest wyłącznie horyzontalny, nie ma transmisji pionowej od matki do jej kociąt w czasie ciąży (Johnson R.P. Res. Vet. Sci. 1984, 31, 114-119). Transmisja wirusa FCV zachodzi przez kontakt między zakażonymi zwierzętami i zwierzętami zdrowymi lub drogą powietrzną podczas kichania (Wardley RC. Arch. Virol. 1976, 52, 243-249).
Kocie kalciwirusy są wirusami bezotoczkowymi należącymi do rodziny Caliciviridae. Posiadają one jednoniciowy dodatni RNA o wielkości około 7,7 tys. par zasad (kbp) (Radford i wsp. Proc. 1st Symp. Caliciviruses ESVV 1997, 93-99).
Podobnie jak wiele innych wirusów RNA, populacja wirusów FCV jest wysoce heterogenna. Warianty antygenowe, wykazane na początku lat 70-tych przez doświadczenia przy użyciu seroneutralizacji krzyżowej umożliwiły podział wirusów FCV na kilka szczepów lub pseudogatunków (Radford i wsp. Proc. 1st Symp. Caliciviruses ESVV 1997, 93-99).
Zidentyfikowano i wyizolowano szereg szczepów FCV, w szczególności szczep F9 (zdeponowany w American Type Culture Collection, ATCC, pod numerem dostępu VR-782), szczep 2280 (ATCC VR 2057), szczep KCD (ATCC VR-651) i szczep CFI (ATCC VR-654).
Szczepienia przeciwko FCV zostały wprowadzone od końca lat 70-tych w oparciu o atenuowane szczepy FCV, przede wszystkim szczep F9 wyizolowany w USA w 1958 r. przez Bittle'a (Bittle i wsp., Am. J. Vet. Res. 1960, 21, 547-550) lub szczepy wyprowadzone z F9 przez pasażowanie in vitro lub in vivo (tzw. „podobne do F9).
Dostępne są również szczepionki inaktywowane. Stosowane w nich są głównie szczep 255 wyizolowany w USA w 1970 od kota wykazującego zapalenie płuc (Kahn i Gillepsie. Cornell Vet. 1970, 60, 669-683; Powvey i wsp. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1980, 177, 347-350) oraz szczep 2280 wyizolowany w USA w 1983 od kota cierpiącego na kulenie (Pedersen i wsp. Fel. Prac. 1983, 13, 26-35; Pedersen N.C. i Hawkins K.F. Vet. Microbiol. 1995, 47, 141-156).
Ze względu na dryft antygenowy w czasie, antysurowice wytworzone przeciwko szczepom szczepionkowym wyizolowanym w latach 60-70, takim jak szczepy F9, 255 lub 2280 neutralizują zaledwie część izolatów uzyskanych w latach 90. Przykładowo surowica anty-F9 neutralizuje 43% izolatów amerykańskich z okresu 1990-96, w stosunku do neutralizacji na poziomie 56% dla izolatów z okresu 1980-1989 i 86% dla izolatów z okresu 1958-79 i tylko 10% dla izolatów angielskich z okresu 19901996 (Lauritzen i wsp. Vet. Microbiol. 1997, 56, 55-63). Dlatego też szczepionki atenuowane i inaktywowane opracowane na podstawie starych szczepów FCV obecnie już nie dają wystarczającej ochrony przeciwko nowszym szczepom FCV.
Celem niniejszego wynalazku jest ujawnienie nowych szczepów FCV indukujących powstanie przeciwciał u kota, które będą wykazywały szerokie spektrum reakcji krzyżowej.
Ponadto celem wynalazku jest wytworzenie immunogennych preparatów i szczepionek przeciwko kaliciwirozie kotów w oparciu o te szczepy FCV.
PL 205 298 B1
Celem wynalazku jest również wytworzenie poliwalentnych preparatów immunogennych i poliwalentnych szczepionek przeciwko kaliciwirozie kotów i przynajmniej jednemu innemu kociemu patogenowi.
Zgłaszający wybrał cztery szczepy FCV uzyskane z wymazów z gardła od kotów wykazujących objawy zakażenia kocim kaliciwirusem pobrane we Francji, Zjednoczonym Królestwie i USA. Są to odpowiednio szczep G1 (zdeponowany w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Instytutu Pasteura, Paryż, Francja, pod numerem dostępu I-2167) i szczep 431 (zdeponowany w CNCM pod numerem dostępu I-2166). Oba szczepy zdeponowane zostały 12 marca 1999 roku. Pozostałe dwa szczepy to szczepy amerykańskie, określane odpowiednio jako RMI6 i RMI9. Szczep FCV G1 wyizolowany we Francji nie odpowiada szczepowi FCV wyizolowanemu w Zjednoczonym Królestwie w 1978 roku przez Tohya Y. (Tohya Y. i wsp., Jpn. J. Sci., 1990, 52, 955-961), który to również został nazwany G1.
Wybór szczepów FCV 431, G1, RMI6 i RMI9 został przeprowadzony przez testy seroneutralizacji krzyżowej prowadzonych wobec izolatów FCV na panelu referencyjnym. Panel referencyjny złożony jest z 18 aktualnych izolatów FCV pobranych od kotów wykazujących objawy zakażenia kocimi kaliciwirusami, które pochodzą z trzech różnych obszarów geograficznych. Wśród nich 7 izolatów to amerykańskie izolaty zidentyfikowane jako RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 i RMI9. Natomiast 7 izolatów to izolaty francuskie, określane jako A2, F1, G1, G3, F3031, H3-2 i H4-1. Pozostałe 4 izolaty są pochodzenia angielskiego i zostały nazwane jako 431, 388b, 337 i J5.
Szczepy panelu jak i szczepy RMI6 i RMI9 są dostępne u zgłaszającego na żądanie.
Informacje o tych szczepach opublikowano w artykule, który ukazał się w czasopiśmie „Archives of Virology (Poulet i wsp. Arch. Virol, luty 2000, 145(2), 243-261), i który to jest dostępny w Internecie od daty zgłoszenia do wydawcy.
W czasie testów seroneutralizacji krzyżowej między 18 izolatami FCV panelu referencyjnego, niespodziewanie okazało się, że surowica przeciw izolatowi 431 neutralizuje 14 z 17 heterologicznych izolatów panelu referencyjnego (miano neutralizacji surowicą homologiczną nie jest uwzględniane). Dla porównania każda anty-surowica dla szczepionkowych „historycznych szczepów 255 i F9 neutralizuje tylko po 2 z 18 izolatów płytki.
W sposób nieoczekiwany zgłaszający stwierdził, że szczep FCV 431 jako szczep dominujący, może być zastosowany do ochrony kotowatych, a w szczególności do ochrony kotów przeciwko większości szczepów FCV. Za pomocą panelu z ujawnionymi tu szczepami FCV specjalista w dziedzinie będzie mógł wybrać inne dominujące szczepy FCV. Jako równoważników dla szczepu FCV 431 będzie to dotyczyło szczepów FCV ekwiwalentnych do niego, które dają przeciwciała o szerokim spektrum neutralizacji krzyżowej.
Uważa się, że równoważność występuje, jeśli surowica przeciwko szczepowi FCV seroneutralizuje przynajmniej 13 z 18 heterologicznych izolatów z panelu referencyjnego (to znaczy obejmującego FCV 431) korzystnie, gdy seroneutralizuje przynajmniej 14 z 18 heterologicznych izolatów z referencyjnego panelu, jeszcze bardziej korzystnie jeśli seroneutralizuje przynajmniej 15 z 18 heterologicznych izolatów z panelu referencyjnego.
Uważa się ogólnie, że szczep FCV seroneutralizuje inny szczep FCV, gdy miano neutralizacji surowicy heterologicznej jest większe lub równe 1,2 log10 VN50 (Povey C. i Ingersoll J., Infection and Immunity, 1975, 11, 877-885). Zgłaszający uznał tę wartość jak wartość progową wyniku pozytywnego. Jednak nie mogą być interpretowane wyniki seroneutralizacji krzyżowej uzyskane dla izolatu FCV, których miano neutralizacji dla surowicy homologicznej wynosi poniżej lub jest równe 2 log10 VN50.
Drugą metodą ustalenia równoważności szczepu FCV w stosunku do szczepu FCV 431 jest stosowanie przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla szczepu FCV 431 i testowanie kandydującego szczepu FCV za pomocą immunofluorescencji pośredniej (IFI). Deponującemu udało się w ten sposób wytworzyć kilka przeciwciał monoklonalnych, które okazały się specyficzne dla szczepu 431. Jedno z nich nazwano 44. Równoważność zaistnieje, jeżeli stwierdzi się immunofluorescencyjną reaktywność z przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi dla 431, na przykład, z przeciwciałem monoklonalnym 44. To przeciwciało monoklonalne i odpowiadająca mu hybrydoma są dostępne u zgłaszającego na żądanie jak również zostały ujawnione i opisane w artykule autorstwa Poulet i wsp. Arch. Virol. 2000, 145, 1-19. Odpowiadająca hybrydoma została zdeponowana 11 sierpnia 1999 roku w CNCM pod numerem dostę pu I-2282. Jest jednak oczywiste, ż e specjalista w dziedzinie bę dzie w stanie wytworzyć przeciwciała monoklonalne za pomocą klasycznych technik i prowadzić selekcję, w odniesieniu do panelu, w szczególnoś ci takich, które są specyficzne wzglę dem szczepu 431.
PL 205 298 B1
Wynalazek dotyczy immunogennego preparatu lub szczepionki przeciwko kaliciwirusom kotów, która obejmuje kaliciwirus kotów (FCV), rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne 44 wydzielane przez hybrydomę zdeponowaną w CNCM pod numerem dostępu I-2282, lub obejmuje białko kapsydu tego wirusa FCV oraz obejmuje weterynaryjnie dopuszczalne nośnik lub zaróbkę.
Korzystnie immunogenny preparat lub szczepionka obejmuje wyizolowany kaliciwirus kotów (FCV), który jest rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne 44 wydzielane przez hybrydomę zdeponowaną w CNCM pod numerem dostępu I-2282.
Korzystnie wirus FCV jest inaktywowany.
Równie korzystnie immunogenny preparat lub szczepionka obejmuje FCV szczepu 431 zdeponowanego w CNCM pod numerem dostępu I-2166.
Ponadto korzystne jest, gdy immunogenny preparat lub szczepionka obejmuje białko kapsydu wirusa FCV, który jest rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne 44 wydzielane przez hybrydomę zdeponowaną w CNCM pod numerem dostępu I-2282.
Korzystnie białko kapsydu pochodzi z FCV szczepu 431 zdeponowanego w CNCM pod numerem dostępu I-2166.
Równie korzystnie immunogenny preparat lub szczepionka obejmuje antygen pochodzący z innego szczepu kaliciwirusa kotów (FCV), korzystniej szczepem FCV jest szczep G1 zdeponowany w CNCM pod numerem dostępu I-2167.
Ponadto korzystne jest, jeśli inny kaliciwirus kotów (FCV) jest w postaci inaktywowanej.
Immunogenny preparat lub szczepionka korzystnie obejmuję podjednostki innego FCV.
Immunogenny preparat lub szczepionka korzystnie obejmuje białko kapsydu innego FCV.
Również korzystne jest, gdy immunogenny preparat lub szczepionka ponadto obejmuje co najmniej jedną wartościowość szczepionki kotów indukującą odpowiedź przeciw co najmniej jednemu patogenowi kotów, korzystniej inny patogen lub patogeny kotów jest/są wybrany/e spośród herpeswirusa kotów (FHV), wirusa białaczki kotów (FeLV), wirusa panleukopenii kotów (FPV), wirusa zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów (FIPV), wirusa niedoboru immunologicznego kotów (FIV), wirusa wścieklizny, Chlamydia.
Ponadto immunogenny preparat lub szczepionka korzystnie obejmuje inną wartościowość szczepionki kotów w postaci szczepionki żywej atenuowanej, szczepionki inaktywowanej, szczepionki podjednostkowej, szczepionki rekombinowanej lub szczepionki polinukleotydowej.
Immunogenny preparat lub szczepionka ponadto korzystnie obejmuje adiuwant, korzystniej obejmuje wodorotlenek glinu, również korzystniej obejmuje polimer kwasu akrylowego lub metakrylowego lub polimer bezwodnych pochodnych maleinowych oraz pochodnych alkenylowych, najbardziej korzystnie obejmuje karbomer.
Immunogenny preparat lub szczepionka jest korzystnie w postaci emulsji olej w wodzie.
W zakres wynalazku również wchodzi hybrydoma zdeponowana w CNCM pod numerem dostę pu I-2282.
Ponadto wynalazek dotyczy przeciwciała monoklonalnego wydzielanego przez hybrydomę według wynalazku.
Wynalazek dotyczy, więc preparatów immunogennych i szczepionki wytworzonych w oparciu o kaliciwirusa kotów 431 i obejmuje jego ekwiwalenty zdefiniowane powyżej, korzystnie w formie inaktywowanej lub w postaci podjednostek, w weterynaryjnie dopuszczalnym nośniku lub zaróbce i korzystnie w obecności adiuwantu. Pojęcie preparatu immunogennego obejmuje niniejszym każdy preparat, który po podaniu kotu, może indukować odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko określonemu patogenowi kota. Przez szczepionkę należy rozumieć preparat zdolny do indukcji skutecznej ochrony.
Inne szczepy FCV G1, RMI6 i RMI9 zostały wybrane ze względu na ich komplementarność w stosunku do szczepu FCV 431, gdyż kombinacja anty-surowic przeciwko 431 i jednemu z tych trzech FCV seroneutralizuje 100% izolatów z panelu referencyjnego. Oznacza to, że te trzy szczepy FCV mają miano neutralizacji surowicą homologiczną wyższe lub równe 2 log10 VN50 i miano neutralizacji surowicą heterologiczną wyższe lub równe 1,2 log10 VN50 względem izolatów FCV panelu referencyjnego, względem których anty-surowica 431 nie seroneutralizuje lub robi to słabo (wartość niższa od 1,2 log10 VN50).
Opisane zostały również ekwiwalentne szczepy FCV, które posiadają taką samą komplementarność względem szczepu FCV 431. Można także wytworzyć i selekcjonować przeciwciała monokloPL 205 298 B1 nalne specyficzne względem tych szczepów w szczególności dla G1, co na tej podstawie pozwala następnie na określenie ich ekwiwalentów.
Opisane są również preparaty immunogenne i szczepionki zawierające poza antygenami szczepu FCV 431 lub jednego z jego ekwiwalentów antygeny przynajmniej jednego innego szczepu FCV, a zwłaszcza szczepu komplementarnego, w szczególności wybranego z grupy obejmującej G1, RMI6, RMI9, co również obejmuje ich ekwiwalenty, w nośniku lub zaróbce dopuszczalnych w weterynarii oraz ewentualnie adiuwant. Korzystnie antygeny pochodzące od innego szczepu lub szczepów FCV obejmują inaktywowany wirus lub jego podjednostki.
Wynalazek dotyczy również kombinacji dwóch szczepów FCV 431 i G1 dla wytwarzania inaktywowanych lub podjednostkowych preparatów immunogennych lub szczepionek.
Nieoczekiwanie kombinacja dwóch szczepów FCV G1 i 431 daje korzystnie efekt synergistyczny. W trakcie badań nad komplementarnością szczepów FCV G1 i 431, porównano odpowiedzi immunologiczne indukowane przez sam G1, sam 431 lub kombinację obu (G1 + 431). Grupa zwierząt immunizowana kombinacją dwóch szczepów FCV G1 i 431 wykazywała klinicznie lepszą ochronę.
Hodowlę i namnażanie wirusów FCV prowadzi się korzystnie na komórkach kocich, korzystniej na komórkach nerki kota Crandell-Reese, czyli CRFK (ang. Crandell-Reese Feline Kidney - komórki nerki kota Crandell-Reese dostępne z American Type Culture Collection pod numerem CCL-94) z wielokrotnoś cią zakaż enia (moi) od 2 do 0,01 dawek zakaż ają cych 50% komórek w hodowli (CCID50) na komórkę, korzystnie 0,5 CCID50/ komórkę.
Po zebraniu i klaryfikacji wirusy FCV przeznaczone do wytwarzania inaktywowanego preparatu immunogennego lub inaktywowanej szczepionki są inaktywowane chemiczne (przykładowo formaliną lub formaldehydem, β-propionolaktonem, etylenoiminą, etylenoiminą binarną (BEI) i/lub termiczne przez podgrzanie. Korzystnie wirusy według wynalazku są inaktywowane przez działanie etylenoiminy formowanej tuż przed użyciem z bromoetylenoaminy (BEA). Cząsteczki wirusa mogą być zatężane za pomocą klasycznych technik zatężania, w szczególności przez ultrasączenie i ewentualnie następnie oczyszczone za pomocą klasycznych sposobów oczyszczania, w szczególności technik sączenia na żelu lub selektywnego strącania w szczególności w obecności glikolu polietylenowego (PEG). Oczyszczenie może być też przeprowadzone bez uprzedniego zatężania.
Dla opracowania preparatu immunogennego lub szczepionki inaktywowanej lub podjednostkowej, cząsteczki wirusa są zawieszane w weterynaryjnie dopuszczalnym nośniku lub zaróbce i ewentualnie uzupełniane o adiuwant. Ilość antygenu odpowiada w szczególności mianu przed inaktywacją od około 105 do około 1010 CCID50 na dawkę, korzystnie od około 108 do około 109 CCID50 na dawkę.
Jako adiuwanty do preparatów immunogennych i szczepionek według wynalazku, można stosować (1) wodorotlenek glinu, (2) polimer kwasu akrylowego lub metakrylowego, polimer bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej, lub (3) formułować preparat immunogenny lub szczepionkę w formie emulsji olej-w-wodzie, a w szczególności emulsji SPT jak opisanej na str. 147 „Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach red. M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, i emulsji MF59 opisanej na str. 183 tej samej książki.
Emulsja typu olej-w-wodzie może w szczególności być uzyskana na bazie płynnego lekkiego oleju parafinowego (typu Farmakopea europejska); oleju izoprenoidowego takiego jak skwalan, skwalen; oleju będącego wynikiem oligomeryzacji alkenów, w szczególności izobutenu lub decenu; estrów kwasów lub alkoholi zawierających liniową grupę alkilową, korzystniej olei roślinnych, oleinianu etylu, di(kaprylanu/kaprynianu) glikolu propylenowego, tri (kaprylanu/kaprynianu) glicerolu, dioleinianu glikolu propylenowego, estrów rozgałęzionych kwasów tłuszczowych lub alkoholi, w szczególności estrów kwasu izostearynowego. Olej jest stosowany w połączeniu z emulgatorami, aby wytworzyć emulsję. Emulgatory są korzystnie niejonowymi środkami powierzchniowo czynnymi w szczególności estrami sorbitanu, mannitu, glicerolu, poliglicerolu, glikolu polipropylenowego i kwasu olejowego, izostearynowego, rycynolowego, hydroksystearynowego, które są ewentualnie etoksylowane, bloki kopolimerów polioksypropylen-polioksyetylen w szczególności Pluronic®, w szczególności L121.
Polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego są w szczególności usieciowane eterami polialkenylowymi cukrów lub polialkoholi. Te związki są znane jako karbomer (Pharmeuropa tom 8, nr 2, czerwiec 1996). Specjalista w dziedzinie może znaleźć również odniesienie w US-A-2 909 462 (włączony niniejszym jako referencje), w którym opisano takie polimery akrylowe usieciowane przez związek polihydroksylowany zawierający przynajmniej 3 grupy hydroksylowe, korzystnie nie więcej niż 8, przy czym atomy wodoru przynajmniej trzech grup hydroksylowych zastąpione są przez nienasycone reszty alifatyczne o przynajmniej 2 atomach węgla. Korzystne reszty zawierają od 2 do 4 atomów wę6
PL 205 298 B1 gla, np. grup winylowych, allilowych i innych nienasyconych grup etylenowych. Reszty nienasycone mogą same zawierać inne podstawniki takie jak grupy metylowe. Produkty sprzedawane pod nazwą Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) są szczególnie odpowiednie. Są one usieciowane allilo- sacharozą lub za pomocą allilo-pentaerytiritolu. Wśród nich można wymienić Carbopol® 974P, 934P i 971P.
Wśród kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej, korzystne są EMA® (Monsanto), które są kopolimerami bezwodnika maleinowego i etylenu, liniowymi lub usieciowanymi, na przykład, usieciowanymi przez eter diwinylowy. W tej kwestii można odnieść się do publikacji J. Fields i wsp. Nature 186. 778-780, 4 czerwca 1960 roku (niniejszym włączonej jako odniesienie). Z punktu widzenia budowy polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego i kopolimery EMA® są korzystnie utworzone z podstawowych jednostek o następującym wzorze:
R, R2
----C -(CH2) χ-C -(CH2) y---COOH COOH w którym
- R1 i R2, które są takie same lub różne oznaczają H lub CH3
- x = 0 albo 1, korzystnie x = 1
- y = 1 albo 2, przy czym x + y = 2.
Dla kopolimerów EMA® x = 0 i y = 2. Dla karbomerów x = y = 1.
Stężenie polimeru w końcowej kompozycji szczepionki wynosić będzie od 0,01% do 1,5% wag./obj., bardziej korzystnie od 0,05 do 1% wag./obj., a najbardziej korzystnie od 0,1 do 0,4% wag./obj.
Możliwe jest oczywiście również wytwarzanie kombinacji wirusa inaktywowanego i podjednostek tego samego szczepu FCV zgodnie z rozwiązaniami według wynalazku i/lub różnych szczepów FCV opisanych w rozwiązaniach według wynalazku.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również wytworzenie szczepionki poliwalentnej zawierającej inaktywowaną wartościowość kaliciwirusa kota, zawierająca przynajmniej szczep FCV 431, co obejmuje jego ekwiwalenty i ewentualnie, co najmniej jeden inny szczep FCV, a zwłaszcza szczep komplementarny w znaczeniu tu opisanym, w szczególności wybrany z G1, RMI6 i RMI9 oraz co najmniej jedną wartościowość z innego patogenu kota, w nośniku lub zaróbce dopuszczalnej w weterynarii oraz korzystnie z adiuwantem, w szczególnoś ci z jednym z wyż ej opisanych. Moż na w ten sposób wytworzyć podjednostkowe szczepionki poliwalentne.
Powyższe patogeny kota będą w szczególności wybrane z grupy obejmującej wirusa nieżytu nosa i tchawicy kotów lub wirusa opryszczki kotów (herpeswirusa kotów) (FHV), wirusa białaczki kotów (FeLV), wirusa panleukopenii kotów lub parwowirusa kotów (FPV), wirusa zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów (FIPV), wirusa niedoboru immunologicznego kotów (FIV), wirusa wścieklizny, lub Chlamydia.
Szczepionki FCV według wynalazku mogą być mieszane tuż przed użyciem z inną kocią wartościowością (walencją) lub innymi kocimi wartościowościami, które mogą być wytwarzane w postaci szczepionek żywych, atenuowanych, inaktywowanych, podjednostkowych, rekombinowanych lub polinukleotydowych.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również wytworzenie poliwalentnego zestawu lub systemu do szczepienia zawierającego oddzielnie zapakowaną wartościowość dla FCV, jak opisano w wynalazku, w noś niku lub zaróbce dopuszczalnych w weterynarii, korzystnie z adiuwantem i przynajmniej jedną wartościowość przynajmniej jednego innego patogenu kotów. Wartościowość obejmująca FCV może służyć jako rozpuszczalnik dla innej kociej wartościowości, w szczególności wartościowości w formie atenuowanej, rekombinowanej lub polinukleotydowej dostarczonej w postaci liofilizowanej.
Zgodnie z przykładowym wykonaniem wynalazku, można wytworzyć preparaty immunogenne lub szczepionki podjednostkowe przez ekstrakcję kapsydu z wirusa, z ewentualną inaktywacją przed
PL 205 298 B1 lub po ekstrakcji. Takie preparaty i szczepionki zawierają więc, jako składnik czynny, jednorodny lub nie, produkt ekstrakcji zawierający przede wszystkim kapsyd białkowy i ewentualnie subfragmenty, ewentualnie inaktywowane, wytworzone z opisanych w niniejszym wynalazku szczepów, w szczególności szczepu 431, co obejmuje jego ekwiwalenty, ewentualnie także na podstawie innego szczepu FCV, w szczególności G1 lub ekwiwalentów. Te preparaty i szczepionki podjednostkowe mogą być korzystnie uzupełnione adiuwantem, przykładowo takim jak opisano powyżej. Można również mieszać preparat lub szczepionkę całkowitą inaktywowaną i preparat lub szczepionkę podjednostkową.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również wytworzenie preparatu immunogennego lub szczepionki opartych na szczepie G1, w szczególności inaktywowanych lub podjednostkowych uzyskanych przez ekstrakcję.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również prowadzenie sposobu immunizacji kotów przeciw chorobom spowodowanym przez kaliciwirusy kotów.
Taki sposób immunizacji obejmuje podawanie kotom szczepionki FCV inaktywowanej, podjednostkowej lub poliwalentnej według wynalazku. Podanie tej szczepionki może odbyć się w szczególności na drodze pozajelitowej, korzystnie na drodze podskórnej lub domięśniowej.
Specjalista posiada kompetencje potrzebne do definiowania precyzyjnie liczby iniekcji i dawek każdej szczepionki do stosowania dla każdego protokołu szczepienia.
Objętości dawki mogą być korzystnie między 0,2 ml a 2 ml, a korzystniej około 1 ml.
Wynalazek będzie obecnie opisany bardziej szczegółowo za pomocą nie ograniczających przykładów wykonania wynalazku, odnosząc się do jednej figury przedstawiającej tabelę mian seroneutralizacji krzyżowej.
Figury
Na Figurze 1 przedstawiony jest zestaw mian neutralizacji uzyskanych w czasie seroneutralizacji krzyżowej przeprowadzonych między 18 szczepami FCV i 18 surowicami.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1: Izolaty wirusowe i hybrydoma
Kaliciwirusy kota (FCV) uzyskano pobierając wymazy z gardła wykonane na kotach prezentujących objawy zakażenia przez kaliciwirusy kotów. FCV mają różne pochodzenie geograficzne.
Szczepy FCV 431, 337, J5, 388b, 220 i 393 były wyizolowane w Zjednoczonym Królestwie i dostarczone przez Profesora O. Jarrett z Uniwersytetu w Glasgow w Zjednoczonym Królestwie.
Szczepy FCV A2, G1, G3, F3031, F1, H3-2 i H1-4 zostały wyizolowane we Francji przez zgłaszającego.
Szczepy FCV RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 i RMI9 były wyizolowane w USA przez zgłaszającego.
Próbki pobrane z gardła zbierano w 2 ml podłoża minimalnego Eagle zmodyfikowanego przez Dulbecco (DMEM, Gibco BRL), uzupełnionego o 5% płodową surowicę cielęcą (Bayer Diagnostic), antybiotykami, a dokładniej 50 mg/ml gentamycyny. Każdy izolat zamrażano w -70°C do czasu testów. Przeciwciało monoklonalne 44 pochodzące z hybrydomy określanej jako 431 2 0 17 E9 T jest specyficzne względem szczepu FCV 431.
P r z y k ł a d 2: Amplifikacja izolatów wirusowych
Komórki linii nerki kota (Crandell-Reese Feline Kidney lub CRFK Nr ATCC CCL-94, Crandell i wsp. In Vitro 1973.9.176-185) umieszczono w hodowli na pł ytce z 96 doł kami lub w probówkach Falcon 25 cm2 (Falcon) z podłożem DMEM uzupełnionym 5% płodową surowicą cielęcą, zawierającym około 100000 komórek na ml. Komórki hodowano w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Po 3 dniach warstwa komórek dochodzi do konfluencji. Podłoże hodowlane jest następnie zastępowane podłożem DMEM bez surowicy, ale z dodatkiem 50 mg/ml gentamycyny i dodaje się rozmrożone próbki izolatów wirusowych FCV (Przykład 1) w objętości po 100 μΐ czterokrotnych rozcieńczeń seryjnych do dołków do klonowania w ograniczonych rozcieńczeniach wirusa FCV albo 1 ml na Falcon.
Gdy efekt cytopatyczny (ECP) dobiegnie końca (24-48 godzin od początku umieszczenia w hodowli) zbiera się zawiesiny wirusów i zamraża w -70°C. Konieczne są na ogół 3 lub 4 kolejne pasaże do produkcji partii wirusa. Partię wirusa przechowuje się w -70°C.
P r z y k ł a d 3: Wytwarzanie surowicy
Dla każdego wirusa FCV została wytworzona antysurowica przez zaszczepienie kociąt drogą donosową z 106,0 CCID50 odpowiedniego wirusa FCV. Kocięta wolne od specyficznych patogenów (SPF) mieszczą się w przedziale wiekowym od 10 do 14 tygodni.
PL 205 298 B1
Uzyskaną z każdego zwierzęcia surowicę zbierano miesiąc po zakażeniu. Surowice inaktywowano ciepłem (30 minut w 56°C), rozdzielano na równe objętości i tak przygotowane przechowuje się w -20°C.
P r z y k ł a d 4: Seroneutralizacja krzyżowa in vitro
Przeprowadzono testy seroneutralizacji krzyżowej między 18 izolatami uzyskanymi przez pobranie wymazów z gardła z kotów prezentujących objawy zakażenia kaliciwirusem kotów. 7 próbek pochodziło geograficznie z Francji, i dotyczyło to izolatów określonych jako A2, F3031, G1, G3, F1, H3-2 i H1-4. 4 izolaty pochodziły geograficznie z Wielkiej Brytanii, dotyczy to izolatów zidentyfikowanych jako J5, 337, 388b i 431. I w końcu, 7 pochodziło geograficznie z USA, i były to izobaty określane jako RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 i RMI9.
Surowica otrzymana w oparciu o każdy z izolatów (przykład 3) była testowana pod kątem zdolności do neutralizacji 18 izolatów. Surowice rozcieńcza się szeregowo trzykrotnie podłożem DMEM w płytkach po 96 studzienek do hodowli komórek. Do 0,05 ml rozcieńczonej surowicy dodaje się 0,05 ml podłoża hodowlanego zawierającego około 100 CCID50 wybranego szczepu wirusa, wytworzonego jak w przykładzie 2. Tę mieszaninę inkubuje się przez 2 godziny w 37°C w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% CO2.
Następnie do każdej mieszaniny dodaje się 0,15 ml zawiesiny komórek CFRK zawierającej około 100000 komórek na ml. Efekt cytopatyczny obserwuje się za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym po 4 dniach hodowli w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Miana neutralizujące każdej surowicy oblicza się według metody Karber'a. Miana są podane w postaci największego rozcieńczenia hamującego efekt cytopatyczny dla 50% studzienek. Miana są wyrażane w log10. Najniższe miano tak wykryte wynosi 0,7 log10 VN50. Każdą surowicę mianuje się przynajmniej dwa razy, korzystnie trzy razy.
Wyniki mian neutralizacji uzyskanych w czasie seroneutralizacji krzyżowej przeprowadzonych między 18 szczepami FCV i 18 surowicami przedstawione są na figurze 1.
P r z y k ł a d 5: Testy pośredniej immunofluorescencji (IIF)
Testy IIF przeprowadzono na 96 studzienkowych płytkach zawierających komórki CRFK hodowane w pojedynczych warstwach i infekowane przez testowany wirus FCV.
200 μl na studzienkę zawiesiny komórek CRFK z 90000 komórek/ml w podłożu F15 (Gibco BRL, Nr katalogowy 045-1075) zawierającej 5% płodowej surowicy cielęcej umieszczono w hodowli na 96-dołkowych płytkach. Przy konfluencji, 320 CCID50 FCV zaszczepiono pod 100 μl podłoża F15. Kiedy pierwsze ogniska CPE komórki płucze się zimnym PBS bez wapnia i magnezu (PBS; Sigma), a następnie utrwala w -20°C przez 30 minut zimnym acetonem zawierającym 5% obj./obj. wody. Po wyschnięciu zakażone i utrwalone komórki kontaktuje się przez 30 minut w 37°C z 100 μl na studzienkę płynu puchlinowego odpowiadającego monoklonalnemu przeciwciału 44 anty-FCV 431 (hybrydoma 431 2 0 17 E9 T) rozcieńczenie do 1/5000 w buforze 50 mM TRIS-HCl o pH 7,6.
Po dwóch płukaniach w PBS wizualizowano połączenie przeciwciał przez inkubację w tych samych warunkach z przeciwciałem kozim anty-mysim IgG skoniugowanym z izotiocyjanianem fluoresceiny (Biosys, koniugat FITC 2 mg/ml) i rozcieńczano 1/150 buforem TRIS-HCl 50 mM pH 7,6. Odczyt prowadzono pod mikroskopem optycznym w świetle UV.
To przeciwciało monoklonalne testowano w stosunku do każdego z izolatów panelu. Wiązało się ono wyłącznie z komórkami CRFK zakażonymi przez FCV 431.
Test ten może być stosowany do określenia ekwiwalentów szczepu FCV 431. Ekwiwalentnymi będą te szczepy, do których wiąże się przeciwciało monoklonalne 44.
P r z y k ł a d 6: Synergia kocięta SPF, nie szczepione, w wieku około 9 tygodni losowo rozdzielono do 4 grup (określonych jako od A do D) po 8 kociąt każda, przy czym każda grupa była trzymana w oddzielnym boksie.
Po rozmrożeniu zawiesin wirusa (przykład 2) i rozcieńczeniu w PBS tak, aby otrzymać pożądane miano, koty szczepiono przez iniekcję podskórną 1 ml inokulum FCV G1 103,3 CCID50/ml dla grupy B, 1 ml inokulum FCV 431 103,5 CCID50/ml dla grupy C i 0,5 ml inokulum FCV G1 103,3 CCID50/ml i 0,5 ml inokulum FCV 431 103,5 CCID50/ml (w innym miejscu iniekcji) dla grupy D. Grupa A była grupą kontrolną.
Połowa każdej grupy od A do D została rozdzielona losowo na dwie grupy 1 i 2 i umieszczona w oddzielnych klatkach. Zwierzęta badano w 31 dniu po szczepieniu (d31).
PL 205 298 B1
Zwierzęta grupy 1 prowokowano przez podanie 1 ml szczepu wirusa testowego FCV 220 o mianie 107,2 CCID50/ml drogą nosowo-doustną (0,5 ml drogą doustną i 0,25 do każdego nozdrza).
Zwierzęta z grupy 2 testowano przez podanie 1 ml szczepu wirusa testowego FCV 393 o mianie 106,8 CCID50/ml drogą nosowo-doustną (0,5 ml drogą doustną i 0,25 do każdego nozdrza).
Wybrano szczepy wirulentne 220 i 393 ponieważ są one oddalone pod względem seroneutralizacji krzyżowej od szczepów wirusa FCV G1 i 431.
Starannie unikano skażenia krzyżowego między dwoma boksami. Ogólne badania kliniczne zwierząt z dwóch grup przeprowadzono przez pomiar temperatury w odbycie i objawy kliniczne zwierząt, w których oceniano ogólny stan, obecność wrzodów języka i podniebienia, obecność zapalenia dziąseł, obecność kataru, obecność zapalenia spojówek, występowanie kulenia, zgon zwierzęcia.
Całkowity wynik kliniczny dla każdego zwierzęcia był liczony przez dodanie wyników uzyskanych dla każdej grupy objawów klinicznych według następującego schematu:
- temperatura w odbycie
- poniż ej 39°C
- wię ksza lub równa 39°C i ni ż sza od 39,5°C
- wię ksza lub równa 39,5°C i niż sza od 40°C
- wię ksza lub równa 40°C.
- stan ogólny:
- zachowanie normalne
- osowiało ść
- wrzody języka i podniebienia (suma ś rednic tych wrzodów, jeś li jest ich kilka)
- brak wrzodu
- ś rednica od 1 do 5 mm
- ś rednica od 6 do 10 mm
- ś rednica powyżej 10 mm - zapalenie dziąseł
- brak zapalenia dzią seł
- zapalenie dzią seł - katar:
- brak kataru
- katar z surowiczym wyciekiem z nosa
- katar z wyciekiem z nosa ś luzowatym lub ś luzowo-ropnym - zapalenie spojówek:
- brak zapalenia spojówek
- zapalenie spojówek z wyciekiem surowiczym
- zapalenie spojówek z wyciekiem ś luzowo-ropnym - kulenie
- brak kulenia
- kulenie
- zgon
- przeżycie
- zgon
Uzyskano następujące średnie wyniki kliniczne
Grupa/test FCV 220 FCV 393
Kontrola (grupa A) 31 30
FCV G1 (grupa B) 5 23
FCV 431 (grupa C) 6 18
FCV G1 + FCV 431 (grupa D) 2 9
Tak uzyskane wyniki wykazują synergię między szczepami FCV G1 i FCV 431 przez znaczącą różnicę między wartością średnią uzyskaną dla najlepszych szczepów a tymi uzyskanymi dla połączenia obu szczepów (test Kruskal-Wallis).
PL 205 298 B1
P r z y k ł a d 7: Wytwarzanie inaktywowanej szczepionki
Komórki CRFK hodowano w 37°C w 2 litrowych walcowatych butelkach hodowlanych (850 cm2) w zmodyfikowanym podłożu Eagle (MEM, Gibco BRL), uzupełnionym 2,5% hydrolizatem laktoalbuminy (Gibco BRL) i 5% płodową surowicą cielęcą (Gibco BRL). Dodawano 300 ml zawiesiny komórkowej w podłożu MEM na około 100000 komórek/ml do każdej butelki hodowlanej. Po 3 dniach warstwa komórek jest konfluentna. Następnie zastępuje się podłoże hodowlane podłożem MEM bez surowicy i dodaje wirus FCV przy wielokrotności zakażenia (moi) 0,5 CCID50/komórkę. Hodowla wirusowa jest utrzymywana w 37°C przez 24 do 48 godzin do uzyskania efektu cytopatycznego dla całości warstwy komórek. Zawiesinę wirusową zbierano, a następnie klarowano na filtrze kieszeniowym o porowatości 1,5 μm. Miano wirusa FCV przy zebraniu wynosi 8,5 +/- 0,3 log 10 CCID50/ml.
Wirus jest inaktywowany etylenoiminą w stężeniu około 8 mM w temperaturze 22°C przez 18 godzin.
Etylenoiminę przygotowywano tuż przed użyciem przez rozpuszczenie 28 g wodorotlenku sodu w pastylkach w 200 ml wody destylowanej i dodanie 68,1 g bromoetylenoaminy (BEA), co odpowiadało roztworowi około 1,2 M (H. Bahnemann, Arch. Virol. 1975, 47, 47-56). Inaktywowaną zawiesinę wirusa zatężano 100 razy na kasecie do ultrasączenia typu Ultrasette z progiem odcięcia 100 kDa (Filtron), a następnie zamrażano w -70°C.
Inaktywowaną zawiesinę wirusową po rozmrożeniu rozcieńczono 1/33 w buforze PBS (NaCl 8 g/l; KCl 0,2 g/l; KH2PO4 0, 2 g/l; Na2HPO4. 2 H2O 1, 44 g/l). Szczepionkę przygotowuje się w sposób następujący: 167 ml fazy wodnej złożonej z rozcieńczenia inaktywowanego wirusa emulgowano w 83 ml fazy olejowej zawierającej 7% wag./obj. oleinianu anhydromannitolu, 8% wag./obj. kwasu olejowego etoksylowanego z średnio 11 cząsteczkami tlenku etylenu (OE) i 85% obj./obj. lekkiego płynnego oleju parafinowego (typu Farmakopea europejska) za pomocą emulgatora turbinowego Silverson w 32°C przez 2 min. Następnie szczepionkę przechowuje się w 5°C.
Alternatywna metoda przygotowania szczepionki polega na formowaniu emulsji w trzech pasażach przez homogenizator wysoko-ciśnieniowy model Y110 (Microfluidics Corp.) z ciśnieniem 600 barów i temperaturą pomiędzy 30°C a 40°C i mieszaniną 5% wag./obj. skwalanu, 2,5% wag./obj. Pluronic® L121, 0,2% wag./obj. Tween 80, 92,3% obj./obj. inaktywowanej zawiesiny wirusowej rozcieńczonej po rozmrożeniu 1:46 buforem PBS. Następnie szczepionkę przechowuje się w 5°C.
Inna alternatywna metoda polega na przygotowaniu roztworu 0,4% wag./obj. Carbopol® 974P w soli fizjologicznej (NaCl 9 g/l), pH doprowadzono do 7,3-7,4 wodorotlenkiem sodu. Roztwór Carbopol następnie mieszano w równych proporcjach z zawiesiną inaktywowanego wirusa FCV rozcieńczoną 1/25 po rozmrożeniu. Następnie szczepionkę przechowuje się w 5°C.
Faza wodna emulsji lub faza wodna zmieszana z Carbopol® jest złożona z rozcieńczenia w PBS zatężonej zawiesiny inaktywowanego wirusa odpowiadającej albo szczepowi FCV 431 albo szczepowi FCV G1 albo mieszaninie równych części szczepów FCV 431 i G1.
P r z y k ł a d 8: Kontrola immunogenności inaktywowanego FCV 431 kociąt SPF nie szczepionych w wieku około 9 tygodni rozdzielono losowo na 2 grupy (określone jako A i B) pierwsza grupa składała się z 12 kociąt, a druga z 7 kociąt, każda grupa była trzymana w izolowanym boksie.
Szczepionka została przygotowana z adiuwantem złożonym z oleinianu anhydromannitolu, kwasu olejowego etoksylowanego i lekkiego płynnego oleju parafinowego tak jak opisano w przykładzie 7.
Koty szczepiono dwukrotnie (w dniu 0 i dniu 28) za pomocą iniekcji podskórnej 1 ml inokulum FCV 431 107 CCID50/ml dla grupy A. Grupa B jest grupą kontrolną.
Zwierzęta prowokowano w 42 dniu po pierwszym szczepieniu (dzień 42) przez podanie 1 ml szczepu testowego FCV 431 o mianie 106 CCID50/ml drogą ustnonosową (0,5 ml doustnie i 0,25 ml do każdego nozdrza).
Śledzono miano przeciwciał neutralizujących anty-FCV 431 jak i stan kliniczny. Całkowity stan kliniczny każdego zwierzęcia wyliczono przez dodanie wyników uzyskanych dla każdej grupy oznak klinicznych według schematu podanego w przykładzie 6.
Uzyskano następujące wyniki:
Miana przeciwciał neutralizujących anty-FCV 431 wyrażanych w log10 VN50/ml
Grupa Przeciwciała w dniu 0 Przeciwciała w dniu 28 Przeciwciała w dniu 42
szczepionka FCV431 (grupa A) 0,24 1,61 2,87
kontrole (grupa B) 0,24 0,24 0,24
PL 205 298 B1
Średnie stany kliniczne w okresie od dnia 42 do dnia 56.
Grupa Stan kliniczny
szczepionka FCV431 (grupa A) 0,7
kontrola (grupa B) 33,7
Wyniki te wykazują znakomitą ochronę kliniczną przeciwko prowokacji homologicznej i dobrą serokonwersję.
Należy rozumieć, że wynalazek zdefiniowany przez załączone zastrzeżenia nie jest ograniczony do poszczególnych wykonań podanych w powyższym opisie, ale obejmuje warianty, które nie wykraczają poza zakres niniejszego wynalazku.

Claims (21)

1. Immunogenny preparat lub szczepionka przeciwko kaliciwirusom kotów, znamienna tym, że obejmuje kaliciwirus kotów (FCV), który jest rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne 44 wydzielane przez hybrydomę zdeponowaną w CNCM pod numerem dostępu I-2282, lub obejmuje białko kapsydu tego wirusa FCV oraz obejmuje weterynaryjnie dopuszczalne nośnik lub zaróbkę.
2. Immunogenny preparat lub szczepionka wedł ug zastrz. 1, znamienna tym, ż e obejmuje wyizolowany kaliciwirus kotów (FCV), który jest rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne 44 wydzielane przez hybrydomę zdeponowaną w CNCM pod numerem dostępu I-2282.
3. Immunogenny preparat lub szczepionka wed ł ug zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, ż e wirus FCV jest inaktywowany.
4. Immunogenny preparat lub szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienna tym, że obejmuje FCV szczepu 431 zdeponowanego w CNCM pod numerem dostępu I-2166.
5. Immunogenny preparat lub szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienna tym, że obejmuje białko kapsydu wirusa FCV, który jest rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne 44 wydzielane przez hybrydomę zdeponowaną w CNCM pod numerem dostępu I-2282.
6. Immunogenny preparat lub szczepionka wedł ug zastrz. 5, znamienna tym, ż e biał ko kapsydu pochodzi z FCV szczepu 431 zdeponowanego w CNCM pod numerem dostępu I-2166.
7. Immunogenny preparat lub szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że ponadto obejmuje antygen pochodzący z innego szczepu kaliciwirusa kotów (FCV).
8. Immunogenny preparat lub szczepionka wedł ug zastrz. 7, znamienna tym, ż e innym szczepem FCV jest szczep G1 zdeponowany w CNCM pod numerem dostępu I-2167.
9. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. 7 albo 8, znamienna tym, że inny kaliciwirus kotów (FCV) jest w postaci inaktywowanej.
10. Immunogenny preparat lub szczepionka według jednego z zastrz. 7 do 9, znamienna tym, że obejmuję podjednostki innego FCV.
11. Immunogenny preparat lub szczepionka według jednego z zastrz. 7 do 10, znamienna tym, że obejmuje białko kapsydu innego FCV.
12. Immunogenny preparat lub szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 11, znamienna tym, że ponadto obejmuje co najmniej jedną wartościowość szczepionki kotów indukującą odpowiedź przeciw co najmniej jednemu patogenowi kotów.
13. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. 12, znamienna tym, że inny patogen lub patogeny kotów jest/są wybrany/e spośród herpeswirusa kotów (FHV), wirusa białaczki kotów (FeLV), wirusa panleukopenii kotów (FPV), wirusa zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów (FIPV), wirusa niedoboru immunologicznego kotów (FIV), wirusa wścieklizny, Chlamydia.
14. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. 12 albo 13, znamienna tym, że obejmuje inną wartościowość szczepionki kotów w postaci szczepionki żywej atenuowanej, szczepionki inaktywowanej, szczepionki podjednostkowej, szczepionki rekombinowanej lub szczepionki polinukleotydowej.
15. Immunogenny preparat lub szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 14, znamienna tym, że ponadto obejmuje adiuwant.
16. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że obejmuje wodorotlenek glinu.
PL 205 298 B1
17. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że obejmuje polimer kwasu akrylowego lub metakrylowego lub polimer bezwodnych pochodnych maleinowych oraz pochodnych alkenylowych.
18. Immunogenny preparat lub szczepionka według zastrz. 17, znamienna tym, że obejmuje karbomer.
19. Immunogenny preparat lub szczepionka według jednego z zastrz. 1 do 14, znamienna tym, że jest w postaci emulsji olej w wodzie.
20. Hybrydoma zdeponowana w CNCM pod numerem dostępu 1-2282.
21. Przeciwciało monoklonalne wydzielane przez hybrydomę jak określona w zastrz. 20.
PL352461A 1999-07-16 2000-07-13 Immunogenny preparat lub szczepionka przeciwko kalciwirusom kotów, hybrydoma oraz przeciwciało monoklonalne PL205298B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9909420A FR2796281B1 (fr) 1999-07-16 1999-07-16 Vaccin inactive contre la calicivirose feline
FR0001759A FR2796282B1 (fr) 1999-07-16 2000-02-11 Vaccin inactive contre la calicivirose feline
PCT/FR2000/002050 WO2001005835A1 (fr) 1999-07-16 2000-07-13 Vaccin inactive contre la calicivirose feline

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL352461A1 PL352461A1 (en) 2003-08-25
PL205298B1 true PL205298B1 (pl) 2010-04-30

Family

ID=26212168

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL352461A PL205298B1 (pl) 1999-07-16 2000-07-13 Immunogenny preparat lub szczepionka przeciwko kalciwirusom kotów, hybrydoma oraz przeciwciało monoklonalne

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP1194450B1 (pl)
JP (1) JP4841775B2 (pl)
KR (3) KR100934687B1 (pl)
AR (1) AR024770A1 (pl)
AT (1) ATE280182T1 (pl)
AU (1) AU6576400A (pl)
BR (1) BR0012500B1 (pl)
CA (1) CA2378802C (pl)
DE (1) DE60015127T2 (pl)
DK (1) DK1194450T3 (pl)
ES (1) ES2231233T3 (pl)
FR (1) FR2796282B1 (pl)
HU (1) HU228430B1 (pl)
MX (1) MXPA02000536A (pl)
PL (1) PL205298B1 (pl)
PT (1) PT1194450E (pl)
WO (1) WO2001005835A1 (pl)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7850978B2 (en) * 1999-07-16 2010-12-14 Merial Limited Vaccine against feline calicivirus
US20040161741A1 (en) 2001-06-30 2004-08-19 Elazar Rabani Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification
PL1734992T3 (pl) * 2004-01-21 2012-02-29 Merial Inc Ulepszone inaktywowane szczepionki fcv
CN103550767B (zh) * 2005-07-28 2017-04-19 硕腾服务有限责任公司 疫苗施用方法、新猫杯状病毒、及抗猫细小病毒和猫疱疹病毒的动物免疫方法
KR102796617B1 (ko) * 2022-07-14 2025-04-24 대한민국 고양이 바이러스 감염 질병의 예방 또는 경감용 조성물 및 이의 용도

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE119545T1 (de) * 1989-07-21 1995-03-15 Upjohn Co Felincalicivirus-capsid-protein und nukleotidsequenz.
JP3514482B2 (ja) * 1992-02-28 2004-03-31 財団法人化学及血清療法研究所 抗ネコカリシウイルス組換え抗体および該抗体からなる治療剤
US6231863B1 (en) * 1997-06-10 2001-05-15 American Cyanamid Company DNA sequences, molecules, vectors and vaccines for feline calicivirus disease and methods for producing and using same

Also Published As

Publication number Publication date
EP1194450B1 (fr) 2004-10-20
PT1194450E (pt) 2005-03-31
DK1194450T3 (da) 2005-02-21
FR2796282A1 (fr) 2001-01-19
DE60015127T2 (de) 2005-10-13
BR0012500B1 (pt) 2011-03-22
MXPA02000536A (es) 2002-07-30
AU6576400A (en) 2001-02-05
DE60015127D1 (de) 2004-11-25
JP4841775B2 (ja) 2011-12-21
HUP0202389A3 (en) 2003-12-29
ATE280182T1 (de) 2004-11-15
KR100859824B1 (ko) 2008-09-23
HUP0202389A2 (hu) 2002-12-28
CA2378802A1 (en) 2001-01-25
HU228430B1 (en) 2013-03-28
FR2796282B1 (fr) 2001-10-26
AR024770A1 (es) 2002-10-23
KR20080012405A (ko) 2008-02-11
KR100934687B1 (ko) 2009-12-31
PL352461A1 (en) 2003-08-25
CA2378802C (en) 2012-01-24
KR20090007803A (ko) 2009-01-20
EP1194450A1 (fr) 2002-04-10
JP2003505400A (ja) 2003-02-12
KR20020020785A (ko) 2002-03-15
ES2231233T3 (es) 2005-05-16
WO2001005835A1 (fr) 2001-01-25
BR0012500A (pt) 2002-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2005284940B2 (en) Hemorrhagic feline calicivirus, calicivirus vaccine and method for preventing calicivirus infection or disease
US6534066B1 (en) Inactivated vaccine against feline calicivirosis
US7850978B2 (en) Vaccine against feline calicivirus
PL205298B1 (pl) Immunogenny preparat lub szczepionka przeciwko kalciwirusom kotów, hybrydoma oraz przeciwciało monoklonalne
JP4873632B2 (ja) 改良された不活化ｆｃｖワクチン
RU2340672C2 (ru) Мутант вируса инфекционной бурсальной болезни (ibdv), экспрессирующий вирус-нейтрализующие эпитопы, специфичные для классического и вариантного штаммов ibdv
ZA200201232B (en) Inactivated vaccine against feline calicivirus disease.
CA2397861C (en) Vaccination against canine herpesvirosis and vaccines therefor
US20050058664A1 (en) Infectious bursal disease virus (IBDV) mutant expressing virus neutralising epitopes specific for classic-and variant IBDV strains
Huang et al. Assessment of Efficacy and Safety of Inactivated Duck Reovirus (Drv) Vaccine Formulated with Different Adjuvants
HK1110225A (en) Improved vaccine against feline calicivirus
HK1110225B (en) Improved vaccine against feline calicivirus