PL205747B1 - Zastosowanie inhibitora aktywności PPARδ - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie opartego na kwasie nukleinowym inhibitora aktywności PPARδ w komórce.

Homeostaza lipidowa jest ściśle kontrolowana podczas prawidłowego rozwoju oraz w prawidłowym stanie zdrowia; jednakże zaburzenie homeostazy lipidowej powoduje rozwój takich chorób jak: miażdżyca tętnic, otyłość, cukrzyca oraz nowotwór. Krytyczne regulatory homeostazy lipidowej obejmują rodzinę czynników transkrypcyjnych wyczuwających tłuszcze znanych jako receptory aktywowane proliferacją peroksysomów (ang. Peroxisome Proliferator Activated Receptors - PPAR). PPAR są członkami podrodziny receptorów hormonów steroidowych/jądrowych, które są aktywowane przez strukturalnie zróżnicowane związki chemiczne takie jak kwasy tłuszczowe, prostanoidy, leki hipolipemiczne, niesterydowe leki przeciwzapalne, czynniki zwiększające wrażliwość na insulinę oraz zanieczyszczenia środowiska (1, 2). Pierwszy opisywany PPAR, PPARa, kontroluje metabolizm tłuszczów w wątrobie i jest aktywowany przez leki obniżające poziom tłuszczów, takie jak klofibrat (3, 4). Myszy z przerwanym genem kodującym PPARa wykazują niedobór zdolności metabolizowania oraz wydalania tłuszczu wątrobowego i hepatocyty magazynują duże krople tłuszczu w odpowiedzi na leki hipolipemiczne (4). Inna izoforma PPARy, jest wymagana do rozwoju adypocytu stymulowanego przez tłuszcze. PPARy to jądrowy receptor o wysokim powinowactwie do prostanoidów (5) i jest farmakologicznym celem dla grupy tiazolidinodionowej czynników przeciwcukrzycowych takich jak rozyglitazon (BRL 49653)(6), publikacja międzynarodowa zgłoszenia numer WO 94/05659 (SmithKline Beecham PLC). Genetyczne usunięcie tego genu jest letalne (7).

Funkcja innej formy PPAR, PPARδ pozostaje nieznana. Doniesiono o bardzo niskim poziomie ekspresji PPARδ we wszystkich badanych tkankach (8); jednakże twórcy wynalazku zaobserwowali, iż PPARδ jest wyrażany selektywnie w komórkach linii monocytów/makrofagów i jest aktywowany, wraz z PPARy, podczas różnicowania makrofagów indukowanego estrem forbolu. PPARδ jest sensorem kwasu tłuszczowego i jest aktywowany przez nienasycone kwasy tłuszczowe, takie jak kwasy linolowe i olejowe, które uważa się za istotne związki sygnalizujące w różnicowaniu monocytów (9,10,11). PPARδ nie jest aktywowany przez leki fibratowe takie jak klofibrat lub przez tiazolidinodiony takie jak BRL49653.

WO 97/28149 (Merck & Co. Inc.) opisuje agonistów PPARδ, które uważa się za użyteczne do zwiększania poziomu lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) w osoczu u ssaków oraz do zapobiegania, zatrzymywania lub spowalniania postępu miażdżycowych chorób sercowo-naczyniowych.

Diety o wysokiej zawartości tłuszczu uznaje się za główny czynnik rozwoju miażdżycy, a wiele leków, które używa się w leczeniu miażdżycy modyfikuje metabolizm lipidów. Lipidy są fizycznie powiązane z patologią miażdżycy w komórkach piankowatych pochodzących z makrofagów, które są wysoce aktywowanymi makrofagami, wypełnionymi kroplami lipidów. Te komórki piankowate są obecne w wysokich stężeniach w zmianach naczyniowych znanych jako płytki, które ostatecznie pękają co powoduje zator zakrzepowy naczyń krwionośnych. Zator ten może manifestować się klinicznie jako atak serca, udar lub choroba tętnic obwodowych. Twórcy wynalazku wykazali obecnie, że makrofagi mysie oraz ludzkie linie komórkowe monocytów THP-1 wyrażają PPARδ gdy są aktywowane przez estry forbolu. Aktywowane komórki THP-1 stały się przylegające i rozpostarte na plastikowych płytkach hodowlanych. W odpowiednich warunkach pod względem kwasów tłuszczowych, komórki te wypełniają się lipidami co wykrywa się poprzez barwienie czerwienią oleistą O i stają się komórkami piankowatymi. W komórkach tych następuje ekspresja genów, które są powiązane z komórkami piankowatymi in vivo, takimi jak IL-1 β, TNFa, IGF-1, CD36, MCP-1 oraz syntaza tromboksanowa. Komórki te stanowią model tworzenia się komórek piankowatych indukowanego przez lipidy. Akumulacji tej można zapobiec lekiem-kandydatem przeciwmiażdżycowym, takim jak BRL49653, co pokazuje przeciwmiażdżycowe właściwości leku i przydatność modelu do identyfikacji leków przeciwmiażdżycowych. Test ten można przeprowadzić na płytce do mikromiareczkowania oraz optycznie oceniać ilościowo barwienie lipidów za pomocą czytnika płytek do mikromiareczkowania.

Stosując podlegający selekcji wektor ekspresyjny twórcy wynalazku zmodyfikowali komórki THP-1 do ekspresji antysensownego RNA dla PPARδ. Ta linia komórkowa rośnie normalnie w hodowli, jednakże w przypadku traktowania estrem forobolu ta linia komórkowa już się więcej nie różnicuje. Barwienie błękitem trypanu powyższej linii komórkowej po traktowaniu estrem forobolu pokazuje, że komórki umarły. A zatem hamowanie funkcji PPARδ zmieniło odpowiedź na bodziec zapalny z różnicowania na śmierć. Płytka miażdżycowa jest wypełniona wysoce aktywowanymi komórkami piankowaPL 205 747 B1 tymi pochodzącymi z makrofagów, a miejscowe stężenie mediatorów zapalnych jest bardzo wysokie w płytce. Nie ograniczając się do żadnej teorii, twórcy wynalazku uważają, iż hamowanie funkcji

PPARδ w komórkach piankowatych, np. w zmianach miażdżycowych, będzie przydatne do zapoczątkowania samodestrukcyjnej kaskady w płytce. Wykazano ostatnio, że kontrolowane usuwanie komórek piankowatych bez zapalenia lub nekrozy jest skuteczną metodą promowania regresji płytek, przy użyciu anty-sensownej terapii przeciwko BCL-X (Pollman i wsp. (1998) Nature Medicine 4, 222-227). Celowanie w PPARδ w aktywowanych makrofagach jest, jak uważają twórcy wynalazku, prawdopodobnie wysoce specyficzne, jako że jest to odpowiedź, która polega na specyficznym stanie fenotypowym aktywowanej komórki piankowatej.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitora aktywności PPARδ do wytwarzania leku do leczenia miażdżycy tętnic lub chorób związanych z miażdżycą tętnic, choroby serca, udaru, chorób tętnic obwodowych, dusznicy bolesnej, restenozy i ogniska miażdżycowego, lub choroby naczyń wybranej spośród dowolnej z: miażdżycy tętnic, choroby serca, udaru lub choroby tętnic obwodowych albo do leczenia lub profilaktyki nowotworu wybranego spośród nowotworu skóry, nowotworu piersi, nowotworu okrężnicy lub nowotworu prostaty, przy czym inhibitorem aktywności PPARδ jest oparty na kwasie nukleinowym inhibitor aktywności PPARδ w komórce będący antysensowną cząsteczką selektywną względem PPARδ lub rybozymem selektywnym względem PPARδ.

Zgodnie z wynalazkiem opisano związki i sposoby badań przesiewowych związków, które przeszkadzają w rozwoju komórek piankowatych lub prowadzą do kontrolowanego usuwania potencjalnych komórek piankowatych. Takie związki uznaje się za przydatne w promowaniu regresji płytek, a zatem zmniejszeniu ryzyka ataków serca, udarów lub zatorów.

Twórcy wynalazku pokazali, iż PPARδ pełni krytyczną rolę w aktywacji makrofagów i że wybiórcze hamowanie aktywności PPARδ może zapobiegać tworzeniu się komórek piankowatych.

Twórcy wynalazku pokazali także, iż agoniści PPARy hamują akumulację lipidów oraz, że PPARδ i PPARy działają przeciwstawnie w procesie tworzenia komórek piankowatych.

Zgodnie z wynalazkiem opisano sposób zapobiegania rozwojowi lub zmniejszania rozwoju komórek piankowatych z makrofagów lub innych komórek, lub usuwania komórek piankowatych, przy czym sposób taki obejmuje doprowadzenie do kontaktu tych makrofagów lub innych komórek lub komórek piankowatych ze skuteczną ilością inhibitora aktywności PPARδ.

Odpowiednie makrofagi lub inne komórki są tymi, które biorą udział w patologii miażdżycy.

Chociaż sposób ten znajduje zastosowanie w odniesieniu do badań makrofagów oraz komórek piankowatych w hodowli, to sposób ten jest szczególnie odpowiedni do zapobiegania rozwojowi lub redukowania rozwoju komórek piankowatych lub usuwania komórek piankowatych in vivo, w szczególności w ciele człowieka lub innego ssaka. Komórki piankowate są wypełnionymi lipidami komórkami, takimi jak leukocyty, zwykle makrofagi. Pobierają one lipidy i przechowują je jako cytoplazmatyczne krople, co nadaje tym komórkom ich charakterystyczny piankowaty wygląd w mikroskopie świetlnym.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób zapobiegania rozwojowi lub redukowania rozwoju komórek piankowatych z makrofagów lub innych komórek, lub usuwania komórek piankowatych, u pacjenta, przy czym sposób taki obejmuje podawanie pacjentowi skutecznej ilości inhibitora aktywności PPARδ.

Odpowiednie makrofagi lub inne komórki są tymi, które biorą udział w patologii miażdżycy.

Komórki, które mogą rozwinąć się w komórki piankowate obejmują nie tylko makrofagi, ale także komórki mięśni gładkich. Zalecanym inhibitorem aktywności PPARδ jest taki, który zapobiega lub redukuje rozwój komórek piankowatych z makrofagów, lub usuwa komórki piankowate pochodzące od makrofagów. Dogodniej powyżej opisany sposób może być zastosowany do zapobiegania lub redukcji rozwoju komórek piankowatych z makrofagów.

Bez uprzedzania jakiegokolwiek dalszego aspektu wynalazku, i bez wiązania się z jakąkolwiek teorią dotyczącą wynalazku, uważa się, że rozwój komórek piankowatych z makrofagów jest powiązany z różnymi stanami chorobowymi oraz że inhibitor aktywności PPARδ będzie zapobiegał lub redukował, co najmniej do pożądanego stopnia rozwój komórek piankowatych z makrofagów. Choroby, które są związane z rozwojem komórek piankowatych nieograniczająco obejmują miażdżycę, choroby serca, udar, choroby tętnic obwodowych oraz zawał.

Sposoby te mogą być także stosowane do zapobiegania restenozie i do regresji ogniska miażdżycowego.

PL 205 747 B1

Stwierdzenie, iż inhibicja aktywności PPARδ zapobiega aktywacji makrofagów sugeruje także, że sposoby te mogą być także stosowane w leczeniu chorób zapalnych. Przykłady chorób zapalnych obejmują reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie układowe oraz toczeń. Rolę PPARδ w stanach zapalnych potwierdza to, że niesterydowy przeciwzapalny lek sulindak, który blokuje aktywność transkrypcyjną PPARδ, jest niezdolny do zapobiegania indukowanego PMA (octanem mirystanianu forbolu) rozrostu i zapalenia u myszy bez PPARδ (Peters J M i wsp. (2000) Mol. and Cell Biol., 20, 5119-5128).

Istnieje szeroka różnorodność zaburzeń, które są wynikiem patologii miażdżycy, i obejmują one zawał, chorobę wieńcową serca, udar, chorobę naczyń obwodowych, chorobę Alzheimera, demencję naczyniową, stwardnienie układowe i degenerację naczyń siatkówki.

Zgodnie z wynalazkiem opisano sposób profilaktyki lub leczenia choroby naczyń związanej z tworzeniem płytek i/lub zatorem zakrzepowym naczyń krwionośnych u pacjenta, przy czym sposób taki obejmuje podawanie pacjentowi skutecznej ilości inhibitora aktywności PPARδ. Uważa się, iż sposób tu opisany jest szczególnie odpowiedni do profilaktyki lub leczenia miażdżycy, choroby wieńcowej serca, udaru lub obwodowej choroby serca.

Twórcy wynalazku pokazali, iż inhibicja aktywności PPARδ hamuje stymulowaną PMA proliferację komórek. Tak więc zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób zapobiegania lub redukcji namnażana się komórek, który to sposób obejmuje doprowadzenie do kontaktu komórek z inhibitorem aktywności PPARδ. Komórki, które są stymulowane do namnażania przez PMA obejmują komórki skóry, komórki okrężnicy, komórki piersi oraz komórki prostaty. Rolę PPARδ w genezie nowotworu potwierdza wykazanie ostatnio, że niesterydowe czynniki przeciwzapalne przejawiają swoją aktywność przeciwnowotworową w komórkach pochodzących z okrężnicy poprzez blokowanie aktywności transkrypcyjnej PPARδ oraz promowanie apoptozy (He T-C i wsp., 1999 Cell, 99, 335-343).

PPARδ uczestniczy w działaniu promotora nowotworów, PMA.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób leczenia lub profilaktyki nowotworu u pacjenta, przy czym sposób taki obejmuje podawanie pacjentowi skutecznej ilości inhibitora aktywności PPARδ.

Opisany tu sposób jest szczególnie odpowiedni do zastosowania w stosunku do nowotworów skóry.

Sposób ten jest szczególnie odpowiedni do zastosowania w stosunku do nowotworów piersi.

Sposób ten jest szczególnie odpowiedni do zastosowania w stosunku do nowotworów okrężnicy.

Sposób ten jest szczególnie odpowiedni do zastosowania w stosunku do nowotworów prostaty.

Poprzez „skuteczną ilość inhibitora aktywności PPARδ należy rozumieć ilość, która jest skuteczna w zapobieganiu rozwojowi lub redukcji rozwoju komórek piankowatych z makrofagów lub innych komórek, lub usuwaniu komórek piankowatych, w szczególności ilość, która jest skuteczna w profilaktyce choroby (co twórcy wynalazku rozumieją jako zapobieganie progresji od stanu bezobjawowego do stanu objawowego) lub leczeniu choroby (przez co twórcy wynalazku rozumieją łagodzenie objawów i spowalnianie jej progresji) w klinicznie użytecznym zakresie. Zakres, który jest klinicznie użyteczny może być z łatwością określony przez lekarza.

Poprzez „inhibitor aktywności PPARδ należy rozumieć dowolny odpowiedni inhibitor, który może zmniejszać aktywność PPARδ w komórce, np. w komórce pacjenta. Szczególnie zalecane jest, jeżeli inhibitorem aktywności PPARδ jest taki, który hamuje aktywność PPARδ w komórce makrofaga lub komórce piankowatej pochodzącej z makrofaga. Termin „inhibitor aktywności PPARδ obejmuje związki, które blokują efekt agonistów PPARδ.

Zalecany inhibitor aktywności PPARδ jest selektywny wobec PPARδ. W szczególności zalecane jest, jeżeli inhibitor jest skuteczny w hamowaniu aktywności PPARδ, ale jest zasadniczo niezdolny do hamowania aktywności innych izoform PPAR takich jak PPARa lub PPARy. Jakkolwiek zalecane jest, jeżeli inhibitor aktywności PPARδ nie modyfikuje aktywności innych izoform PPAR, może być zaletą jeśli cząsteczka jest agonistą lub aktywatorem aktywności PPARy. Zalecane jest także, jeśli inhibitor aktywności PPARδ nie modyfikuje aktywności innych receptorów z rodziny receptorów hormonów steroidowych. Poprzez „selektywny należy rozumieć, że związek jest co najmniej 10 razy bardziej skuteczny w hamowaniu aktywności PPARδ niż w modyfikowaniu aktywności innych izoform PPAR. Zalecane jest, aby był on co najmniej 100 razy bardziej selektywny.

Inhibitorem może być taki inhibitor, który zapobiega ekspresji PPARδ w komórce. Poprzez „zapobiega ekspresji należy rozumieć zasadnicze zapobieganie ekspresji lub co najmniej zmniejszanie poziomu ekspresji PPARδ do przydatnego zakresu. Przeważnie związkiem, który zapobiega ekspresji PPARδ w komórce jest cząsteczka bazująca na kwasie nukleinowym.

PL 205 747 B1

Jak pokazano w przykładach, użycie sekwencji antysensownej wobec całej ludzkiej sekwencji kodującej PPARδ, łącznie z fragmentami regionów nie podlegających translacji może hamować tworzenie komórek piankowatych z makrofagów. Należy zauważyć, iż mniejsze części cDNA PPAR mogą zostać użyte jako czynniki antysensowne, zwłaszcza te odpowiadające początkowi translacji białka PPARδ.

Cząsteczki antysensowne można zaprojektować w odniesieniu do sekwencji PPARδ, ludzkiej sekwencji cDNA, która jest podana w Schmidt i wsp. (1992) Mol. Endocrinol. 6, 1634-1641 oraz w GenBank nr dostępu L07592.

Antysensowne czynniki PPARδ obejmują czynniki, które wiążą się z mRNA PPARδ i, zwłaszcza, hamują jego translację. Poprzez „czynnik antysensowny należy rozumieć także cząsteczki bazujące na kwasie nukleinowym, które są zdolne do tworzenia tripleksów z genomową sekwencją PPARδ i selektywnie zapobiegają transkrypcji lub translacji genu.

Antysensowną cząsteczką może być RNA (w którym to wypadku jest ona transkrybowana z wektora zaprojektowanego do produkcji antysensownych transkryptów) lub może to być DNA lub cząsteczki DNA-podobne, takie jak antysensowne oligonukleotydy.

Uważa się, iż nadekspresja antysensownego RNA z odpowiedniej części ludzkich sekwencji genomowych odpowiadających pozycjom 67886 do 139948 ludzkiego klonu PAC nr 109F14 będzie skuteczna w hamowaniu aktywności PPARδ. Klon PAC nr 109F14 jest dostępny z HGMP Resource Centre, Genome Campus, Hinxton, Cambridgeshire, CB 10 1SB, UK. Sekwencja genu PPARδ ma nr dostępu AL022721.

Oligonukleotydy antysensowne mogą być zaprojektowane w odniesieniu do sekwencji cDNA lub genu PPARδ.

Oligonukleotydy są poddawane działaniu degradującemu lub dezaktywującemu poprzez endogenne nukleazy komórkowe. Aby przeciwstawić się temu problemowi, możliwe jest użycie zmodyfikowanych oligonukleotydów, np. ze zmienionymi wiązaniami międzynukleotydowymi, w których naturalnie występujące wiązanie fosfodiestrowe zostało zastąpione innym wiązaniem. Np. Agrawal i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 pokazali wzrost inhibicji w hodowli tkankowej HIV-1 przy użyciu oligonukleotydów fosforoamidatowych oraz tionofosforanowych. Sarin i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451 pokazali zwiększoną inhibicję HIV-1 przy użyciu oligonukleotydów metylofosfonianowych. Agrawal i wsp. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 7790-7794 pokazali inhibicję replikacji HIV-1 zarówno we wcześnie-zainfekowanych, jak i przewlekle zainfekowanych hodowlach komórkowych, przy użyciu oligonukleotydów tionofosforanowych specyficznych wobec sekwencji nukleotydowej. Leither i wsp. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434 opisali inhibicję replikacji wirusa grypy w hodowli tkankowej poprzez oligonukleotydy tionofosforanowe.

Dowiedziono, że oligonukleotydy ze sztucznymi wiązaniami są oporne na degradację in vivo. Np. Shaw i wsp. (1991) w Nucleic Acids Res. 19, 747-750, donieśli o tym, że nie mając innej modyfikacji, oligonukleotydy stają się bardziej oporne na nukleazy in vivo, gdy są zablokowane na końcu 3' przez pewne struktury chroniące i że nie chronione oligonuklotydy tionofosforanowe nie są degradowane in vivo.

Szczegółowy opis H-fosfonianowego podejścia do syntezy oligonukleotydów tionofosforanowych jest podany przez Agrawal i Tang (1990) Tetrahedron Letters 31, 7541-7544, których wskazówki są tutaj zawarte jako odniesienie. Znane są obecnie syntezy oligonukleozydów metylofosfonianowych, ditionofosforanowych, fosforoamidatowych, ich estrów fosforanowych, z mostkami fosforoamidatowymi oraz mostkami tionofosforanowymi. Zobacz np. Agrawal i Goodchild (1987) Tetrahedron Letters 28, 3539, Nielsen i wsp. (1988) Tetrahedron Letters 29, 2911; Jager i wsp. (1988) Biochemistry 27, 7237; Uznanski i wsp. (1987) Tetrahedron Letters 28, 3401; Bannwarth (1988) Helv. Chim. Acta. 71, 1517; Crosstick i Vyle (1989) Tetrahedron Letters 30, 4693; Agrawal i wsp. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405, którego wskazówki są zawarte tutaj jako odniesienie. Inne metody syntezy lub produkcji są także możliwe. Zalecanym oligonukleotydem jest kwas deoksyrybonukleotydowy (DNA), chociaż sekwencje kwasu rybonukleinowego (RNA) mogą być także syntetyzowane i stosowane.

Oligonukleotydy przydatne w wynalazku dogodnie są projektowane tak, aby uzyskać oporność na degradację przez endogenne enzymy nukleolityczne. Degradacja in vivo oligonukleotydów skutkuje powstaniem produktów rozpadu oligonukleotydów o zmniejszonej długości. Takie produkty rozpadu częściej biorą udział w niespecyficznej hybrydyzacji i są mniej skuteczne w porównaniu z ich odpowiednikami o pełnej długości. Tak więc należy używać nukleotydów, które są oporne na degradację

PL 205 747 B1 w ciele i które mogą docierać do komórek docelowych. Prezentowane oligonukleotydy mogą stać się bardziej oporne na degradację in vivo poprzez zastąpienie jednym lub większą liczbą sztucznych wiązań pomiędzy nukleotydami natywnych wiązań fosfodiestrowych, np. poprzez zastąpienie fosforanu siarką w wiązaniu. Przykłady wiązań, które mogą być zastosowane obejmują tionofosforany, metylofosfoniany, sulfon, sulfat, ketyl, ditionofosforany, różne fosforoamidaty, estry fosforanowe, połączone mostkami tionofosforany oraz połączone mostkami fosforoamidaty. Takie przykłady raczej ilustrują niż ograniczają, ponieważ znane są w tej dziedzinie inne wiązania pomiędzy nukleotydami. Zobacz np. Cohen, (1990) Trends in Biotechnology. Synteza oligonukleotydów mających jedno lub więcej podstawień w miejsce wewnątrz nukleotydowych wiązań fosfodiestrowych jest dobrze znana w tej dziedzinie, w tym sposoby syntezy do produkcji oligonukleotydów mających mieszane wiązania międzynukleotydowe.

Oligonukleotydy można uczynić opornymi na wydłużanie przez endogenne enzymy poprzez dołączenie „czapeczki lub dołączenie podobnych grup do 5' lub 3'-końcowych nukleotydów. Odczynnikiem do dołączania czapeczki jest komercyjnie dostępny Amino-Linkll™ z Aplied BioSystems Inc, Foster City, CA. Metody dołączania czapeczki są opisane, np., przez Shaw i wsp. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750 i Agrawal i wsp. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(17), 7595-7599, których wskazówki są tutaj zawarte jako odniesienie.

Inną metodą wytwarzania oligonukleotydów opornych na atak nukleaz jest uczynienie ich „samostabilizującymi się jak to opisał Tang i wsp. (1993) Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735, zawarty tutaj jako odniesienie. Samostabilizujące się oligonukleotydy posiadają strukturę pętli spinki do włosów na swoich końcach 3', i wykazują podwyższoną oporność na degradację przez fosfodiesterazę z jadu węża, polimerazę I DNA oraz płodową surowicę wołową. Samostabilizujące się regiony oligonukleotydu nie przeszkadzają w hybrydyzacji z komplementarnymi kwasami nukleinowymi, a badania farmakokinetyczne oraz stabilności u myszy pokazały wzrost oporności in vivo samostabilizujących się oligonukleotydów w stosunku do ich liniowych odpowiedników.

Zgodnie z wynalazkiem, wrodzona specyficzność wiązania antysensownych oligonukleotydów charakterystyczna dla tworzenia par zasad jest zwiększana poprzez ograniczenie dostępności związku antysensownego do jego zamierzonego locus in vivo, pozwalając na zastosowanie mniejszych dawek oraz minimalizując efekty ogólnoustrojowe. Tak więc oligonukleotydy są stosowane lokalnie aby uzyskać pożądany efekt. Stężenie oligonukleotydów w pożądanym locus jest o wiele wyższe niż oligonukleotydów podanych ogólnoustrojowo, a skutek terapeutyczny można uzyskać przy zastosowaniu znacząco mniejszej ilości całkowitej. Miejscowe wysokie stężenie oligonukleotydów zwiększa penetrację komórek celowych i skutecznie blokuje translację docelowych sekwencji kwasu nukleinowego.

Oligonukleotydy można dostarczyć do locus za pomocą dowolnych sposobów odpowiednich do miejscowego podawania leku. Np. roztwór oligonukleotydów może być wstrzyknięty bezpośrednio do miejsca lub może być dostarczony przez wlew za pomocą pompki infuzyjnej. Oligonukleotydy mogą być także zawarte we wszczepialnym urządzeniu, które po umieszczeniu w odpowiednim miejscu, pozwala na uwalnianie oligonukleotydów do otaczającego locus.

Najbardziej zalecane jest podawanie oligonukleotydów z zastosowaniem materiału hydrożelowego. Hydrożel nie powoduje stanów zapalnych i jest biodegradowalny. Obecnie jest znanych wiele takich materiałów, zarówno te zrobione z polimerów naturalnych, jak i syntetycznych. W zalecanym sposobie wykorzystywany jest hydrożel, który jest płynny poniżej temperatury ciała, a żelifikuje do utrzymującego swój kształt, półstałego hydrożelu w lub około temperatury ciała. Zalecanym hydrożelem są polimery powtarzających się jednostek tlenek etylenu-tlenek propylenu. Właściwości polimeru są zależne od ciężaru cząsteczkowego polimeru i względnego stosunku procentowego tlenku polietylenu oraz tlenku polipropylenu w polimerze. Zalecane hydrożele zawierają od około 10 do 80% wagowych tlenku etylenu i od około 20 do około 90% wagowych tlenku propylenu. Szczególnie zalecany hydrożel zawiera około 70% tlenku polietylenu i 30% tlenku polipropylenu. Hydrożele, które można wykorzystać są np. dostępne z Basf Corp., Parsippany, NJ pod nazwą handlową Pluronic™.

W tym wykonaniu, hydrożel jest schładzany do płynnego stanu i oligonukleotydy są mieszane z płynnym żelem w ilości około 1 mg oligonukleotydów na gram hydrożelu. Powstała mieszanka jest następnie podawana na leczoną powierzchnię, np. poprzez aerozol lub pędzlowanie podczas operacji chirurgicznej lub za pomocą cewnika lub metod endoskopowych. Po tym jak polimer się ogrzeje się, zestala się on tworząc żel, a oligonukleotydy dyfundują na zewnątrz żelu do otaczających komórek przez czas określony poprzez dokładny skład żelu.

PL 205 747 B1

Oligonukleotydy mogą być podawane za pomocą innych implantów, które są komercyjnie dostępne lub opisane w literaturze naukowej, obejmujących liposomy, mikrokulki oraz wszczepialne urządzenia. Np. implanty zrobione z biodegradowalnych materiałów takich jak polibezwodniki, poliortoestry, kwas polimlekowy oraz kwas poliglikolowy i jego kopolimery, kolagen oraz polimery białkowe lub niebiodegradowalne materiały, takie jak octan etylenowinylu (EV Ac), octan poliwinylu, alkohol etylenowinylowy oraz ich pochodne można użyć do miejscowego podania oligonukleotydów. Oligonukleotydy mogą być włączane do takiego materiału, w trakcie jego polimeryzacji lub zestalania, stosując techniki topienia lub parowania rozpuszczalnika, lub mechanicznie mieszane z materiałem. W jednym z wykonań oligonukleotydy są mieszane lub podawane na powłokach wszczepialnych urz ądzeń, takich jak pokryte dekstranem krzemowe kulki, stenty lub cewniki.

Dawka oligonukleotydów zależy od rozmiaru oligonukleotydów oraz celu ich podawania. Ogólnie zakres jest obliczany na podstawie powierzchni tkanki podlegającej leczeniu. Skuteczna dawka oligonukleotydu jest w pewnym stopniu zależna od długości oraz składu chemicznego oligonukleotydu, ale ogólnie waha się w granicach od około 30 do 3000 μg na cm² powierzchni tkanki.

Oligonukleotydy mogą być podawane pacjentom ogólnoustrojowo zarówno dla celów terapeutycznych jak i profilaktycznych. Oligonukleotydy mogą być podawane jakąkolwiek ze skutecznych metod, np. pozajelitowo (np. dożylnie, podskórnie, domięśniowo) lub doustnie, donosowo lub innymi drogami, które pozwalają oligonukleotydom dostać się i krążyć w krwioobiegu pacjenta. Oligonukleotydy podawane ogólnoustrojowo dogodnie są podawane dodatkowo względem oligonukleotydów podawanych domiejscowo, ale mają także zastosowanie przy nieobecności podawania miejscowego. Dawka w ilości od około 0,1 do około 10 gramów na podawanie dorosłym osobom zazwyczaj będzie skuteczna do tego celu.

Poza antysensownymi czynnikami opisanymi powyżej można zaprojektować rybozymy, w szczególności rybozymy o kształcie główki młota (rybozymy typu hammerhead) bazując na cDNA lub sekwencji genu PPAR5, które uważa się za użyteczne inhibitory aktywności PPAR5.

Rybozymy, które mogą być zakodowane w kwasie nukleinowym do dostarczania do celu są opisane w Cech i Herschlag „Site-specific cleavage of single stranded DNA US 5,180,818; Altman i wsp. „Cleavage of targeted RNA by RNAse P US 5,168,053, Cantin i wsp. „Ribozyme cleavage of HIV-1 RNA US 5,149,796; Cech i wsp. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods, US 5,116,742; Been i wsp. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endonucleases and methods, US 5,093,246; Been i wsp. „RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and method; cleaves single stranded RNA at specific site by transesterification, US 4,987,071, wszystkie zawarte tutaj jako odniesienie. Odpowiednie cele dla rybozymów obejmują czynniki transkrypcyjne, takie jak c-fos i c-myc oraz bcl-2. Durai i wsp. (1997) Anticancer Res. 17, 3307-3312 opisują rybozymy o kształcie główki młota (typu hammerhead) przeciwko bcl-2.

Konstrukty genetyczne, które zapewniają ekspresję rybozymów lub związki antysensowne przydatne w opisanych tu sposobach mogą być z łatwością wytworzone. Odpowiednio, konstruktami genetycznymi są takie, które są zaadaptowane do dostarczenia oraz ekspresji rybozymu lub cząsteczki antysensownej w komórce docelowej. Tak więc opisany tu sposób obejmuje metodę terapii genowej.

Terapia genowa może być przeprowadzona zgodnie z generalnie akceptowanymi metodami terapii genowej, np. jak opisano przez Friedman, 1991. Przygotowywany jest wirusowy lub plazmidowy wektor (zobacz szczegóły poniżej) zawierający kopię genu kodującego rybozym lub cząsteczkę antysensowną połączone z elementami kontrolującymi ekspresję i zdolnymi do replikacji wewnątrz komórek docelowych. Odpowiednie wektory są znane, np. takie jak ujawnione w patencie USA 5,252,479 oraz publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego numer WO 93/07282 (Boehringer Ingelheim International GmbH). Wektor jest następnie wstrzykiwany pacjentowi, albo lokalnie w miejsce docelowe albo ogólnoustrojowo. Jeśli transfekowany gen nie jest trwale włączony do genomu każdej z komórek docelowych, może istnieć konieczność okresowego powtarzania leczenia.

Systemy transferu genu znane w tej dziedzinie mogą być użyteczne w stosowaniu opisanych tu metod terapii genowej. Obejmują one wirusowe i niewirusowe metody transferu. Stosowano wiele wirusów jako wektory do transferu genów, w tym papowawirusy, np. SV40 (Madzak i wsp., 1992), adenowirusy (Berkner, 1992, Berkner i wsp., 1988; Gorzigilia i Kapikian, 1992; Quantin i wsp., 1992; Rosenfeld i wsp., 1992; Wilkinson i wsp., 1992; Stratford-Perricaudet i wsp., 1990), wirus krowianki (Moss, 1992), wirusy adenosatelitarne (Muzyczka, 1992; Ohi i wsp., 1990), herpeswirusy obejmujące HSV i EBV (Margolskee, 1992; Johnson i wsp., 1992; Fink i wsp., 1992; Breakfield i Geller, 1987; Fre8

PL 205 747 B1 ese i wsp., 1990), retrowirusy ptasie (Brandyopadhyay i Temin, 1984; Petropoulos i wsp., 1992), mysie (Miller, 1992; Miller i wsp, 1985; Sorge i wsp., 1984; Mann i Baltimore, 1985; Miller i wsp., 1988) oraz pochodzenia ludzkiego (Shimada i wsp., 1991; Helseth i wsp., 1990; Page i wsp., 1990; Buchschacher i Panganiban, 1992). Jak dotąd większość protokołów terapii genowej człowieka opierało się na unieszkodliwionych retrowirusach mysich. Zalecane są wektory bazujące na lentiwirusie.

Niewirusowe metody transferu genu, znane w tej dziedzinie, obejmują techniki chemiczne, takie jak koprecypitacja z fosforanem wapniowym (Graham i van der EB, 1973; Pellicer i wsp., 1980); techniki mechaniczne, np. mikroiniekcja (Anderson i wsp., 1980; Gordon i wsp., 1980; Brinster i wsp., 1981; Constantini i Lacy, 1981); transfer za pośrednictwem fuzji błon przez liposomy (Felgner i wsp., 1987; Wang i Huang, 1989, Kanenda i wsp., 1989; Stewart i wsp., 1992; Nabel i wsp., 1990; Lim i wsp., 1992); oraz bezpośrednie pobieranie DNA i transfer DNA za pośrednictwem receptorów (Wolff i wsp., 1990; Wu i wsp., 1991; Zenke i wsp., 1990; Wu i wsp., 1989b; Wolf i wsp., 1991; Wagner i wsp., 1990; Wagner i wsp., 1991; Cotten i wsp., 1990; Curiel i wsp., 1991a; Curiel i wsp., 1991b). Transfer genu za pośrednictwem wirusów może być połączony z bezpośrednim transferem genu in vivo za pomocą liposomów, umożliwiając kierowanie wektorów wirusowych do komórek nowotworowych a nie do otaczających niedzielących się komórek. Alternatywnie do nowotworu można wstrzyknąć linię komórkową produkującą wektor retrowirusowy (Culver i wsp., 1992). Wstrzyknięcie produkujących komórek dostarczy następnie ciągłego źródła cząsteczek wektora. Technika ta została zatwierdzona do zastosowania u ludzi z guzami nowotworowymi mózgu nie nadającymi się do operacji.

Inne odpowiednie systemy obejmują retrowirusowo-adenowirusowe systemy hybrydowe opisane przez Feng i wsp. (1997) Nature Biotechnology 15, 866-870, lub systemy wirusowe mające za cel ligandy, takie jak odpowiednie fragmenty jednołańcuchowych Fv.

W podejściu tym, które łączy fizyczne i biologiczne metody transferu genu, plazmidowy DNA dowolnego rozmiaru jest łączony ze skoniugowanym z polilizyną przeciwciałem swoistym wobec heksonowego białka adenowirusa, a powstały kompleks jest wiązany z wektorem adenowirusowym. Trzycząsteczkowy kompleks stosuje się następnie do infekowania komórek. Wektor adenowirusowy pozwala na wydajne wiązanie, internalizację i degradację endosomów zanim przyłączony DNA zostanie zniszczony.

Wykazano, iż kompleksy liposom/DNA są zdolne do pośredniczenia bezpośrednio in vivo w transferze genów. Podczas gdy w standardowych preparatach liposomowych proces transferu genu jest niespecyficzny, doniesiono o zlokalizowanym pobieraniu in vivo i ekspresji w depozytach nowotworowych, np. po bezpośrednim podaniu in situ (Nabel, 1992).

Zalecane są techniki transferu genu, które dostarczają DNA bezpośrednio do makrofagów. Na przykład transfer genu za pośrednictwem receptora jest realizowany przez łączenie DNA (zwykle w formie kowalentnie zamkniętych superskręconych plazmidów) z ligandem białkowym poprzez polilizynę. Ligandy są wybierane na podstawie obecności odpowiednich receptorów ligandu na powierzchni komórkowej docelowego rodzaju komórki/tkanki. Receptor mannozy jest raczej specyficzny dla makrofagów i przedstawiono specyficzne dostarczanie koniugatów DNA/mannoza. Te koniugaty ligand-DNA mogą być wstrzyknięte bezpośrednio do krwi jeśli istnieje taka potrzeba i są kierowane do docelowej tkanki, gdzie następuje wiązanie się z receptorem i internalizacja kompleksu DNA-białko. Aby ustrzec się problemu wewnątrzkomórkowego zniszczenia DNA, można także wykorzystać koinfekcję adenowirusem aby zakłócić funkcję endosomu.

Związkiem tu opisanym jest tentami związek, który hamuje aktywność białka PPARδ.

Odpowiednie związki mogą być wybrane przy użyciu pewnych metod opisanych poniżej.

Należy zauważyć, iż skuteczna ilość inhibitora aktywności PPARδ może być podana pacjentowi w jakikolwiek odpowiedni sposób w dowolnej odpowiedniej kompozycji. Przydatność jakiejkolwiek metody podawania dowolnej kompozycji może być z łatwością określona przez specjalistę biorąc pod uwagę naturę inhibitora. Np. inhibitory bazujące na kwasie nukleinowym mogą być przyrządzone i podawane na różne sposoby dla drobnocząsteczkowych inhibitorów, co jest dobrze znane w tej dziedzinie.

Wyżej opisane związki lub związki do zastosowania w opisanych tu sposobach lub ich kompozycje mogą być podawane dowolnym konwencjonalnym sposobem, np. doustnie i we wstrzyknięciach pozajelitowych (np. podskórnie, dożylnie lub domięśniowo). Leczenie może obejmować pojedynczą dawkę lub wiele dawek przez pewien okres czasu.

Spodziewane typowe dawki będą wahać się w granicach od 0,01 do 2 0 mg/kg.

PL 205 747 B1

Chociaż w przypadku opisanego tu związku możliwe jest podawanie go samego, zalecana jest jego prezentacja w postaci kompozycji farmaceutycznej, wraz z jednym lub większą liczbą dopuszczalnych nośników. Nośnik(nośniki) musi być „dopuszczalny w sensie zgodności ze związkiem tu opisanym i nieszkodliwy dla jego biorców. Przeważnie nośnikiem będzie woda lub roztwór soli fizjologicznej, który jest sterylny i wolny od czynników pirogennych.

Kompozycje mogą być dogodnie prezentowane w postaci jednodawkowej i mogą być przygotowane za pomocą jakichkolwiek metod dobrze znanych w dziedzinie farmacji. Takie metody obejmują etap łączenia ze sobą aktywnego składnika (związku tu opisanego lub składnika do zastosowania w sposobach tu opisanych) z nośnikiem, który stanowi jeden lub więcej dodatkowych składników. Ogólnie kompozycje są przygotowywane poprzez jednorodne i ścisłe połączenie aktywnego składnika z pł ynnymi noś nikami lub rozdrobnionymi noś nikami stał ymi lub obydwoma, a nastę pnie, jeś li potrzeba, uformowanie produktu.

Kompozycje tu opisane odpowiednie do podawania doustnego mogą mieć postać odrębnych jednostek, takich jak kapsułki, opłatki lub tabletki, przy czym każda zawiera wcześniej określoną ilość aktywnego składnika jako proszek lub granulki; jako zawiesina lub roztwór w cieczy wodnej lub nie-wodnej; lub jako płynna emulsja oleju w wodzie lub emulsja wody w oleju. Aktywny składnik może być także prezentowany jako duża dawka leku, powidełko lub pasta.

Tabletka może być wytworzona poprzez sprasowanie lub wyciskanie, alternatywnie z jednym lub większą liczbą dodatkowych składników. Sprasowane tabletki mogą być przygotowane poprzez prasowanie, w odpowiednim urządzeniu, aktywnych składników w postaci wolno unoszącej się, takiej jak proszek lub granulki, ewentualnie zmieszanych z czynnikiem łączącym (np. powidonem, żelatyną, hydroksypropylometylocelulozą), lubrykantem, obojętnym rozcieńczalnikiem, środkiem konserwującym, środkiem dezintegrującym (np. glikolanem sodowym skrobi, sieciowanym powidonem, sieciowaną karboksymetylocelulozą sodową), czynnikiem powierzchniowo czynnym lub rozpraszającym. Wyciskane tabletki mogą być wytwarzane poprzez formowanie, w odpowiednim urządzeniu, mieszanki sypkiego składnika zwilżonego obojętnym płynnym rozcieńczalnikiem. Tabletki mogą być opcjonalnie powlekane lub zarysowane i mogą być tak wytwarzane, aby zapewnić wolne lub kontrolowane uwalnianie swojego aktywnego składnika przy użyciu np. hydroksymetylocelulozy w różnych proporcjach aby dostarczyć pożądanego profilu uwalniania.

Kompozycje odpowiednie do podawania pozajelitowego obejmują wodne i niewodne sterylne roztwory do wstrzykiwania, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, czynniki bakteriostatyczne oraz roztwory, które czynią kompozycję izotoniczną względem krwi potencjalnego biorcy; oraz wodne i niewodne sterylne zawiesiny, które mogą zawierać czynniki zawieszające oraz czynniki zagęszczające. Kompozycje mogą przybierać formę jednostkowej dawki lub wielodawkowych pojemników, np. szczelnych ampułek i fiolek, i mogą być przechowywane w warunkach zamrożenia-wysuszenia (liofilizowane) wymagających jedynie dodatku sterylnego nośnika płynnego, np. wody do iniekcji, bezpośrednio przed użyciem. Improwizowane roztwory do wstrzykiwania oraz zawiesiny mogą być przygotowane ze sterylnych proszków, granulek oraz tabletek takich jak wcześniej opisane.

Zalecane kompozycje dawek jednostkowych to takie, które zawierają dawkę dzienną lub jednostkę, dzienną poddawkę lub odpowiednią jej część, aktywnego składnika.

Powinno być zrozumiałe, iż dodatkowo obok składników szczegółowo wspomnianych powyżej kompozycja tu opisana może zawierać inne czynniki typowe w tej dziedzinie, mając na uwadze rodzaj kompozycji, np. odpowiednie do podawania doustnego mogą zawierać czynniki smakowe.

Kompozycje tutaj opisane są dostarczane przy zastosowaniu standardowych metod, takich jak te opisane lub odnoszące się do takiego tekstu jak British and US Pharmacopoeias, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.), Martindale The Extra Pharmacopeia (London, The Pharmaceutical Press).

Opisane tu sposoby terapeutyczne mogą być stosowane do leczenia dowolnego ssaka, w tym ludzi. Tak więc, przewiduje się, że sposób taki można zastosować do leczenia, np. zwierząt domowych, takich jak koty i psy, lub zwierząt hodowlanych, takich jak konie, krowy, owce, kozy i świnie lub innych handlowo ważnych zwierząt. Gdy inhibitorem aktywności PPARδ jest cząsteczka bazująca na kwasie nukleinowym będzie oczywiste, iż będzie on zaprojektowany w odniesieniu do ssaczego cDNA lub genu PPARδ.

Zalecanym pacjentem, który ma być leczony jest człowiek.

Zgodnie z wynalazkiem opisano inhibitor aktywności PPARδ do zastosowania w medycynie.

PL 205 747 B1

Inhibitor jest zapakowany i prezentowany do zastosowania w medycynie. W szczególności, może być zapakowany i przedstawiony do zastosowania w leczeniu miażdżycy lub w leczeniu choroby serca lub leczeniu udaru lub leczeniu choroby tętnic obwodowych lub leczeniu chorób naczyń związanych z tworzeniem płytek lub leczeniu zatorów zakrzepowych naczyń krwionośnych lub leczeniu choroby Alzheimera lub leczeniu nowotworu.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też kompozycję farmaceutyczną zawierającą inhibitor aktywności PPARδ oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też zastosowanie inhibitora aktywności PPARδ do wytwarzania leku przeciwdziałającego lub redukującego rozwój komórek piankowatych z makrofagów lub innych komórek, lub usuwania komórek piankowatych, u pacjenta; zastosowanie inhibitora aktywności PPARδ do wytwarzania leku do profilaktyki lub do leczenia chorób naczyń związanych z tworzeniem płytek i/lub tworzeniem zatorów zakrzepowych naczyń krwionośnych.

Odpowiednie makrofagi lub inne komórki to te, które zaangażowane są w chorobę miażdżycową.

Do czasu prezentowanej pracy, nie przewidywano, że inhibitor aktywności PPARδ mógłby być przydatny, szczególnie w medycynie. Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposoby identyfikacji związków, które hamują aktywność PPARδ, a w szczególności, które hamują aktywność PPARδ w komórkach makrofagów lub w komórkach piankowatych. Związki tak zidentyfikowane mogą same być użyteczne w medycynie lub mogą być użyteczne jako wiodące związki do dalszego opracowywania medycznie przydatnych związków. Te sposoby, lub sposoby przeprowadzania takich metod, mogą być uważane jako „metody poszukiwania leku lub „testy przesiewowe dla leku.

Zgodnie z wynalazkiem opisano sposób identyfikacji związku, który może, lub który można użyć jako związek wiodący do wytwarzania związku, który może być przydatny w medycynie, gdzie sposób obejmuje selekcję związku, który hamuje aktywność PPARδ. Zazwyczaj sposób ten może obejmować badanie przesiewowe wielu testowanych związków, które są obecne w bibliotece testowanych związków. Tak więc, identyfikacja związku, który hamuje aktywność PPARδ obejmuje selekcję z biblioteki testowych związków dowolnego związku, który hamuje aktywność PPARδ.

Wyżej opisane sposoby mogą być zastosowane do selekcji związków, które hamują ekspresję genu PPARδ lub wytwarzanie białka PPARδ (tj. translację) w komórce lub która hamuje aktywność białka PPARδ.

Odpowiednie sposoby przeprowadzania testów są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie, a niektóre z nich, są bardziej szczegółowo opisane w przykładzie 3.

W odniesieniu do identyfikacji związków, które hamują ekspresję genu PPARδ, zalecane jest zastosowanie promotora genu PPARδ, operacyjnie połączonego z genem reporterowym takim jak, np. lucyferazy, β-galaktozydazy, fosfatazy alkalicznej lub tym podobnych. Ekspresja genu reporterowego w komórce może być zmierzona w obecności lub braku testowanego związku. Testowane związki, które selektywnie zmniejszają ekspresję genu reporterowego wybiera się jako związki, które mogą być użyteczne w hamowaniu lub zmniejszaniu ekspresji genu PPARδ tak, że następuje inhibicja aktywności PPARδ.

W odniesieniu do związków, które hamują aktywność białka PPARδ, jedną z konkretnych aktywności, którą pożądane jest zahamować to zdolność białka PPARδ do transkrypcyjnej aktywacji genów pod jego kontrolą. Tak więc gen reporterowy, taki jak jeden z wymienionych powyżej, jest operacyjnie połączony z promotorem lub sekwencją wzmacniającą, która jest pod kontrolą PPARδ. Geny, które są pod kontrolą PPARδ obejmują CYP4A6, oksydazy acylo-CoA oraz lipazy lipoproteinowej; tak więc promotory tych genów uważa się za użyteczne w tym wykonaniu. Syntetyczne elementy wzmacniające otrzymane z tych genów, połączone z heterologicznymi promotorami takimi jak z genu kinazy tymidynowej HSV, mogą być tu także użyteczne. Konstrukt genetyczny zawierający promotor lub wzmacniacz/gen reporterowy jest transfekowany do odpowiedniej komórki, takiej jak monocyt lub makrofag. Komórki COS-1 lub CV-1, obydwie linie pochodzące z komórek nerki makaka (African Green Monkey), mogą być także użyte. Konstrukt genetyczny kodujący PPARδ jest także transfekowany do komórki i testuje się zdolność testowanego związku do hamowania ekspresji genu reporterowego. Transfekowane komórki mogą być inkubowane ze znanym agonistą PPARδ, takim jak związek F jak ujawniono na stronie 9 WO 97/28149 (określony tu dalej jako związek F) w połączeniu ze związkiem testowanym, a następnie zostanie określona zdolność związku do przeciwdziałania działaniu agonisty. Związki, które zmniejszają lub hamują ekspresję genu reporterowego są wybierane do dalszych badań.

PL 205 747 B1

Można także zastosować test CARLA (test oddziaływania koaktywator/receptor/ligand), tak jak w przykładzie 3. Testy te polegają na zależności wiązania ko-receptorów od obecności odpowiedniego ligandu dla PPAR5. W testach CARLA, obecny jest agonista i testuje się zdolność testowanego związku do przeszkadzania w działaniu agonisty.

Szczególnie zalecane związki, które można wyselekcjonować za pomocą opisanych tu sposobów, to te, które wiążą się z częścią wiążącą ligandu PPAR5 udaremniając transkrypcję i zapobiegając w ten sposób działaniu agonistycznych ligandów PPAR5.

Zalecane może być przeprowadzanie etapu „wstępnego przeszukiwania w celu identyfikacji związków wiążących do PPAR5 przed określeniem, czy są one inhibitorem lub antagonistą aktywności PPAR5. Testy wiązania receptor-ligand są dobrze znane w tej dziedzinie i mogą być z łatwością zaprojektowane i przeprowadzone przez specjalistę.

Jako etap wstępnego przeszukiwania można przeprowadzić etap, który jest zasadniczo testem komórek piankowatych opisanym poniżej. Tak więc, w ten sposób można wybrać związki, które są aktywne w zapobieganiu i zmniejszaniu rozwoju komórek piankowatych z makrofagów lub innych komórek lub usuwaniu komórek piankowatych, i które są inhibitorami PPAR5.

Odpowiednie makrofagi lub inne komórki są tymi, które są zaangażowane w patologię miażdżycy.

Inhibitory PPAR5 mogą być identyfikowane także za pomocą podejścia dwu-hybrydowego w celu badania oddziaływań PPAR5 i koaktywatorów, takich jak SRC-1. W tym przypadku, PPAR5 (lub jego funkcjonalna część) jest poddana fuzji z białkiem wiążącym DNA (takim jak domena wiążąca DNA GAL4), a cząsteczka koaktywatora lub jego funkcjonalna część (np. SRC-1), będzie połączona z białkiem transaktywacyjnym (takim jak domena transaktywacyjna VP16). Wytwarzane są drożdże, w których następuje ekspresja obydwu tych fuzji i które mają wbudowany gen reporterowy (taki jak β-galaktozydaza) pod kontrolą promotora zależnego od białka wiążącego się z DNA (np. GAL4-zależnego).

Drożdże hodowane są w obecności agonisty PPAR5 i szerokiego wachlarza testowanych związków. Hodowle z niską aktywnością β-galaktozydazy wskazują na obecność antagonisty PPAR5.

Należy zauważyć, iż sposoby identyfikowania związków, jak opisano powyżej, są przydatne w identyfikacji związków, które można, lub które mogą być zastosowane jako związek wiodący do wytwarzania związku, który może (1) zapobiegać lub redukować rozwój komórek piankowatych z makrofagów lub usuwać komórki piankowate, (2) zapobiegać lub być przydatny w leczeniu chorób naczyniowych związanych z tworzeniem płytek i/lub zatorów zakrzepowych naczyń krwionośnych, (3) zapobiegać lub być przydatny w leczeniu nowotworu, lub (4) zapobiegać być użyteczny w leczeniu choroby Alzheimera.

Po wyselekcjonowaniu związku o zdolnościach hamowania lub zmniejszania aktywności PPAR5, może być dogodne jego zastosowanie w dalszych badaniach przesiewowych w celu określenia, np. czy może on zapobiegać lub redukować rozwój komórek piankowatych z makrofagów lub innych komórek, lub usuwać komórki piankowate, czy może on zapobiegać lub jest przydatny w leczeniu chorób naczyniowych związanych z tworzeniem płytek i/lub zatorami zakrzepowymi naczyń krwionośnych, albo zapobiega lub jest użyteczny w leczeniu nowotworu, lub czy zapobiega lub jest przydatny w leczeniu choroby Alzheimera.

Odpowiednie makrofagi lub inne komórki to te, które są zaangażowane w patologię miażdżycy.

Metody badań przesiewowych do określania tych właściwości są dobrze znane z tego zgłoszenia (w odniesieniu do rozwoju komórek piankowatych z makrofagów) lub są dobrze znane w tej dziedzinie.

Inne, dalsze przydatne badania można przeprowadzić na wyselekcjonowanym związku aby określić, np. jego rozpuszczalność, jego profil farmakologiczny lub profil metabolizmu leku. Podobnie, można przeprowadzić badania aby określić selektywność związków w hamowaniu aktywności PPAR5. Na przykład można przeprowadzić badania aby określić, czy poszczególne związki mogą modyfikować aktywność innych izoform PPAR. Zazwyczaj zalecane jest wybranie związków, które zasadniczo nie modyfikują aktywności innych izoform PPAR. Jednakże może być zalecane, jeśli wybrany związek jest takim, który hamuje aktywność PPAR5, ale jest agonistą lub aktywatorem aktywności PPARy. Podobnie, może być zalecane jeśli wybrany związek hamuje aktywność PPAR5, ale jest aktywatorem lub agonistą aktywności PPARa.

Związek wybrany w opisanych tu metodach badań przesiewowych może być „związkiem lekopodobnym.

PL 205 747 B1

Termin „związek leko-podobny jest dobrze znany specjalistom w tej dziedzinie i może oznaczać związek, który ma właściwości czyniące go odpowiednim do zastosowania w medycynie, np. jako aktywny składnik w leku. Tak więc, np. związkiem leko-podobnym może być cząsteczka, którą można zsyntetyzować za pomocą technik chemii organicznej, mniej dogodnie za pomocą technik biologii molekularnej lub biochemii, i jest, dogodnie, małą cząsteczką, która może mieć masę cząsteczkową mniejszą niż 5000 daltonów i która może być rozpuszczalna w wodzie. Związek leko-podobny może dodatkowo wykazywać właściwości selektywnego oddziaływania z konkretnym białkiem lub białkami i być dostępny biologicznie i/lub zdolny do penetrowania docelowych błon komórkowych, ale oczywistym jest, iż te cechy nie są niezbędne.

Termin „związek wiodący jest podobnie dobrze znany specjalistom w tej dziedzinie, i może oznaczać, że ten związek jakkolwiek sam nie jest odpowiedni do zastosowania jako lek (np. ponieważ ma jedynie słabą siłę przeciwko zamierzonemu celowi, jest nieselektywny w działaniu, niestabilny, słabo rozpuszczalny, trudny w syntezie lub ma słabą dostępność biologiczną) może jednak dostarczyć punktu startowego do projektowania innych związków, które mają bardziej pożądane właściwości.

Terminy „związek leko-podobny oraz „związek wiodący zazwyczaj odnoszą się raczej do stosunkowo małych cząsteczek organicznych, a nie do stosunkowo dużych cząsteczek opartych na kwasach nukleinowych. Niemniej jednak, należy zauważyć fakt, iż wiele wykonań opisanych tu metod badań przesiewowych jest odpowiednich do identyfikacji cząsteczek opartych na kwasach nukleinowych, szczególnie te, które hamują ekspresję genu PPARδ lub translację białka PPARδ.

Jak dobrze wiadomo w dziedzinie poszukiwania leków, związek wiodący znaleziony w badaniach przesiewowych może być zmodyfikowany, a zmodyfikowane związki badane w celu określenia ich aktywności.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także model in vitro tworzenia komórek piankowatych indukowanego tłuszczem z diety i jego zastosowania w identyfikacji przydatnych związków.

Tworzenie komórek piankowatych jest pierwszym etapem dwuetapowego procesu, w którym komórka jest przekształcana w prekursor komórki piankowatej poprzez poddanie działaniu bodźców zapalnych, takich jak PMA, lub wchodząc w kontakt z odpowiednim czynnikiem wzrostu, takim jak GMCSF (czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów). W drugim etapie komórki prekursorowe stają się komórkami piankowatymi w obecności odpowiedniego stężenia kwasów tłuszczowych.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób identyfikacji związku, który może, lub który można użyć jako związku wiodącego do wytwarzania związku, który może (1) zapobiegać lub redukować rozwój komórek piankowatych z makrofagów lub innych komórek, dogodnie tych makrofagów lub innych komórek, które są zaangażowane w patologię miażdżycy, lub (2) usuwać komórki piankowate lub (2) zapobiegać lub być użytecznym w leczeniu chorób naczyniowych związanych z tworzeniem płytek i/lub zatorem zakrzepowym naczyń krwionośnych, przy czym sposób taki obejmuje etapy selekcji:

(a) odpowiedniej pierwotnej populacji komórek lub linii komórkowej, (b) dostarczenia linii komórkowej bodźca zapalnego lub czynnika wzrostu, który ułatwia różnicowanie do prekursora komórki piankowatej, (c) dostarczenia prekursorowi komórki piankowatej odpowiedniego stężenia kwasu tłuszczowego, i (d) mierzenia akumulacji kwasu tłuszczowego w komórce w obecności lub nie związku.

Odpowiednią pierwotną populacją komórek lub linią komórkową, jest taka, która jest zaangażowana w patologię miażdżycy.

Typem komórki może być dowolny odpowiedni typ komórki. Dogodnie jest to komórka leukocytu. Szczególnie zalecana linia komórkowa leukocytów to linia komórkowa makrofagów lub prekursora makrofagów.

Typowo komórki to THP-1 lub U937. THP-1 jest dostępna jako depozyt komórkowy w ECACC pod nr 85011440, a U937 jest dostępna jako depozyt komórkowy w ECACC pod nr 88081201. Jednakże można użyć jakiejkolwiek odpowiedniej komórki leukocytów, jakkolwiek preferowane jest zastosowanie komórek monocytowych lub makrofago-podobnych. Komórki THP-1 są „monocyto-podobne i mogą być różnicowane do komórek makrofago-podobnych przy użyciu estru forbolu (PMA).

Poprzez „dostarczanie bodźców zapalnych komórce rozumie się dostarczenie jakichkolwiek odpowiednich bodźców zapalnych, które ułatwiają stymulację komórek do komórek piankowatych.

Poprzez „czynnik wzrostu, który ułatwia różnicowanie do komórek piankowatych rozumie się jakikolwiek odpowiedni czynnik wzrostu, taki jak GMCSF oraz, w kontekście wynalazku, PMA. Zalecany jest PMA lub funkcjonalny równoważnik estru forbolu.

PL 205 747 B1

Zazwyczaj estrem forbolu jest PMA, ale może nim być jakikolwiek odpowiedni ester forbolu, który ułatwia różnicowanie komórek.

Zazwyczaj PMA jest stosowany w stężeniu pomiędzy 0,1 a 10 ng/ml.

Kwas tłuszczowy może być dostarczony do komórki w surowicy, w której hoduje się komórkę. Twórcy wynalazku stwierdzili, iż płodowa surowica cielęca inaktywowana ciepłem od Gibco ERL daje niskie tło akumulacji lipidów, podczas gdy wysoki poziom akumulacji lipidów otrzymuje się przy użyciu Controlled Process Serum Replacement (CPSR-3) z Sigmy. Alternatywnie może być on dostarczony (poprzez dodanie do wzrostowej pożywki hodowlanej) w odpowiednim stężeniu. Odpowiednie kwasy tłuszczowe obejmują mono- i wielonienasycone kwasy tłuszczowe o długości łańcucha 18-22, w tym kwas linolowy. Odpowiednie jest, jeżeli kwasy tłuszczowe są dostarczane w stężeniu pomiędzy 10 a 100 liM.

Akumulacja kwasu tłuszczowego w komórce może być zmierzona za pomocą dowolnej odpowiedniej metody. Szczególnie dogodne metody obejmują użycie barwników dla kwasów tłuszczowych, takich jak czerwień nilowa lub czerwień oleista O, które można stosować in situ i odczytywać czytnikiem płytek. Inne metody, które można użyć do mierzenia akumulacji kwasów tłuszczowych obejmują TLC, HPLC oraz LC-MS.

Akumulację kwasu tłuszczowego w komórce w obecności lub nieobecności testowanego związku mierzy się a związki, które prowadzą do zmniejszenia akumulacji kwasu tłuszczowego w komórce wybiera się do dalszych testów.

Można się łatwo zorientować, że ponieważ komórki można hodować na płytkach wielokomorowych (np. płytki hodowlane 64-komorowe) i ponieważ barwienie lipidów można oceniać ilościowo, np. optycznie w czytniku do płytek do mikromiareczkowania, metoda badań przesiewowych może być z łatwością zautomatyzowana dla badań przesiewowych o dużej wydajności.

Związki zidentyfikowane i identyfikowalne przy zastosowaniu opisanych tu metod poszukiwań uważa się za użyteczne w opisanych tu sposobach leczenia.

Wynalazek zostanie teraz opisany bardziej szczegółowo w odniesieniu do następującego opisu, przykładów i figur; gdzie

Figura 1 przedstawia ekspresję PPAR w komórkach THP-1. Analizę ekspresji z zastosowaniem RNAzy dla mRNA PPARa i δ przeprowadzono na całkowitym RNA z mysiej oraz ludzkiej wątroby i na kilku ludzkich liniach komórkowych. Linia komórkowa Huh7 to ludzka linia komórek wątroby, która zawiera identyczne ilości mRNA PPARδ (czarne słupki) i α (białe słupki) w porównaniu do całkowitego RNA wyizolowanego z ludzkiej wątroby (>1% aktyny). Zarówno Huh7 jak i ludzka wątroba nie odpowiadają na proliferatory peroksysomów biorąc pod uwagę wzrost metabolizmu tłuszczów i transkrypcję konstruktów reporterowych zawierających PPRE. Monocytowe linie komórkowe, takie jak komórki U937 oraz THP-1 wykazują stosunkowo wysokie poziomy ekspresji PPARδ (5-6% aktyny). Inne ludzkie tkanki takie jak okrężnica, jajniki, jądra, nerka, nadnercza analizowano pod kątem ekspresji α i β. We wszystkich wypadkach poziomy ekspresji były mniejsze niż 1% aktyny (dane nie pokazane). Jednakże, możliwe jest, iż pojedyncze składniki komórkowe tego kompleksu tkanek wyrażają znaczące poziomy tych receptorów.

Figura 2 przedstawia aterogenną ekspresję genów w komórkach THP-1. Całkowity RNA z komórek THP-1 analizowano za pomocą RT-PCR pod kątem ekspresji różnych produktów genowych związanych z procesem miażdżycowym. Pokazano żele agarozowe barwione bromkiem etydyny z analizy komórek THP-1 w normalnych warunkach wzrostu (-PMA), adherentnych komórek THP-1 po podaniu estru forbolu (+PMA) oraz po podaniu estru forbolu w obecności 100 μM kwasu linolowego. Wszystkie sondy zaprojektowano tak, aby przecinać granice intron/ekson i nie powielać genomowego DNA.

Figura 3 przedstawia, że kwasy tłuszczowe oraz reksynoidy promują tworzenie komórek piankowatych, które są hamowane przez rozyglitazon. Reksynoidy to leki specyficzne dla RXR, takie jak kwas 9-cis-retynowy i związek Ligand Pharmaceutical, LG100268 (Mukherjee R i wsp., 1997 Nature 386, 407-410). Rozyglitazon jest wytwarzany przez SmithKline Beecham oraz jest także znany jako Avandia i BRL 49653.

A. Kwasy tłuszczowe współdziałają z reksynoidami w tworzeniu komórek piankowatych.

Komórki THP-1 traktowano 5 ng/ml PMA i DMSO (dimetylosulfotlenek; 0,5%), kwasem linolowym (30 liM), LG 100268 (5liM) oraz kwasem linolowym z LG100268. Traktowanie kontynuowano przez 3 dni i komórki utrwalano w 0,66 M paraformaldehydzie, zabarwiono nasyconym roztworem czerwieni oleistej O, a następnie barwiono kontrastowo za pomocą hematoksyliny. Zwiększoną kumu14

PL 205 747 B1 lację lipidu zaobserwowano po podaniu kwasu linolowego lub LG100268. Dodatek obydwu związków daje addytywny efekt na akumulację tłuszczu.

B. Rozyglitazon promuje usuwanie lipidów.

Komórki THP-1 traktowane PMA podano działaniu 20 μM BRL49653 przez 3 dni i barwiono pod kątem akumulacji lipidów jak opisano powyżej.

Figura 4 przedstawia, że rozyglitazon moduluje ekspresję genów w komórkach THP-1.

A. Ekspresja IL-1 β jest zmniejszana przez rozyglitazon.

Analiza ochrony przed RNazą dla poziomów mRNA interleukiny 1β w komórkach THP-1 traktowanych PMA (+PMA), PMA i komórkach traktowanych kwasem linolowym (+PMA+FA), oraz komórkach PMA i BRL49653 traktowanych (+ PMA+BRL). Pokazano także sygnał aktyny dla normalizacji.

B. Ekspresja TNFa jest zmniejszana przez rozyglitazon.

Analiza ochrony przed RNazą dla poziomów mRNA TNFa w komórkach kontrolnych THP-1 (-PMA), komórkach traktowanych PMA (+PMA), komórkach traktowanych PMA oraz kwasem linolowym (+PMA+FA), oraz komórkach traktowanych PMA i BRL49653 (+PMA+BRL). Pokazano także sygnał aktyny dla normalizacji.

C. Ekspresja CD36 jest zwiększana poprzez rozylitazon.

Analiza ekspresji poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS, ang. Fluorescence Activated Cell Sorting) dla ekspresji antygenu CD36 w kontrolnych komórkach THP-1 (- PMA), oraz komórkach traktowanych PMA i BRL 49653 (+PMA+BRL). Traktowanie trwało przez 48 godzin przy 50 μM BRL49653. Komórki zeskrobywano z płytek hodowlanych, utrwalano i inkubowano wraz z FITC (izotiocyjanian fluorosceiny) połączonej z przeciwciałem wobec CD36 (Coulter Immunotech). Analiza FACS została przeprowadzona za pomocą sortera komórek Coulter EPIC V.

Figura 5 przedstawia wytwarzanie linii komórkowych z konstytutywną ekspresją PPARδ. Całą sekwencję kodującą ludzkiego PPARδ sklonowano w eukariotycznym wektorze ekspresyjnym pCLDN (Brighty D W i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7802-7805 (1991)). Powstałe plazmidy transfekowano do komórek THP-1 za pomocą zmodyfikowanej procedury DEAE-Dextran (Fujita i wsp. (1986) Cell 46, 401-407). Komórki utrzymywano w pożywce zawierającej 1 mg/ml G418 i 10% kondycjonowanej pożywki z THP-1 z rygorystycznymi procedurami płukania w celu usuwania martwych komórek.

Kontynuowano to aż do zatrzymania zabijania komórek i zaobserwowania silnego wzrostu. Uzyskano 6 linii dla każdego pCLDN (pusty wektor), pCLDNPPARδ, pCLDNPPARδAS, pCLDNP PARa i pCLDNPPARaAS. „AS oznacza konstrukt antysensowny. Wszystkie te linie komórkowe były zasadniczo identyczne we wzroście i żywotności. Początkowe eksperymenty różnicowania przeprowadzono na liniach komórkowych PPARδ w podłożu selekcyjnym. Zaobserwowano wyniki negatywne dla wszystkich konstruktów, w tym linii kontrolnych zawierających pusty wektor. Komórki dla wszystkich konstruktów były ciągle żywe po traktowaniu PMA z wyjątkiem antysensownych linii PPARδ, które wykazały pobieranie błękitu trypanu. Następnie komórki hodowano bez G418 dopóki linie kontrolne z pustym wektorem odpowiadały na PMA w podobny sposób jak kontrole rodzicielskie. Pokazało to, iż wszystkie linie pCLDNPPARδ różnicowały się w podobny sposób, ale linie pCLDNPPARδAS nie różnicowały się.

RNA oraz białko przygotowano z sensownych linii komórkowych dla PPARδ i analizowano pod kątem mRNA PPARδ poprzez ochronę przed RNazą (B) i pod kątem białka PPARδ poprzez analizę western (C). Wszystkie 6 linii wykazywało >10 krotny wzrost ekspresji mRNA PPARδ w stosunku do linii komórek rodzicielskich. Poziomy te są dużo większe niż te zaobserwowane w komórkach traktowanych PMA. Wysokie poziomy białka PPARδ zaobserwowano w liniach oznaczonych delta-1 oraz delta-2. Inne 4 linie nie były analizowane za pomocą techniki western. Wszystkie następne eksperymenty przeprowadzono na tych liniach.

Figura 6 przedstawia, iż nadekspresja PPARδ promuje tworzenie komórek piankowatych.

A. Komórki rodzicielskie THP-1 oraz komórki pCLDNPPARδ traktowano 5 ng/ml PMA i DMSO (0,5%) lub BRL49653 (50 μM). Traktowanie kontynuowano przez 3 dni a komórki umieszczano w 0,66 M formaldehydzie, barwiono nasyconym roztworem czerwieni oleistej O, a następnie barwiono kontrastowo za pomocą hematoksyliny. Następne eksperymenty pokazały, iż działanie BRL49653 jest skuteczne w submikromolarnych stężeniach.

B. Hodowle traktowano jak powyżej, a następnie ekstrahowano metanolem/chloroformem/PBS (1:1:1 obj./obj.). Fazę organiczną rozdzielono na płytkach TLC z żelem krzemionkowym (Merck:Kieselgel 60 ze strefą zatężania) z heptanem (80%), eterem dietylowym (18%) oraz kwasem octowym (2%) jako

PL 205 747 B1 rozpuszczalnikiem. Tłuszcze następnie barwiono aerozolem kwasu fosforomolibdenowego w metanolu. Pokazano względną ruchliwość wolnego cholesterolu (FCHOL), wolnego kwasu arachidonowego (FFA), wysoce nienasyconego triacyloglicerolu (TG), estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), estrów cholesterolu oraz butylowanego hydroksyanizolu (BHT), który jest obecny w układzie rozpuszczalnika.

Figura 7 przedstawia, że wypływ kwasów tłuszczowych ulega represji w aktywowanych komórkach z nadekspresją PPARδ.

A. Pobieranie kwasu tłuszczowego milion komórek w 2 ml podłoża inkubowano z 5 μ Ci ³H-kwasu oleinowego przez noc wraz z lub bez 100 μM kwasu linolowego (odpowiednio HIGH FAT i LOW FAT). Komórki następnie osadzano, przemywano i ponownie zawieszano w świeżym podłożu bez wyznakowanych kwasów tłuszczowych. Procent włączenia określono poprzez zliczanie scyntylacyjne porcji podłoża i przemytych komórek. Wszystkie testy przeprowadzano trzykrotnie.

B. Wypływ kwasu tłuszczowego

Przemyte komórki inkubowano przez dalszych 50 godzin, a uwolnienie radioaktywności było monitorowane w czasie. Komórki rodzicielskie w wysokim tłuszczu są zaznaczone rombami a w niskim tłuszczu jako kwadraty. Komórki z nadekspresją PPARδ w wysokim tłuszczu pokazano jako trójkąty a w niskim jako kółka.

C. Wypływ kwasu tłuszczowego z komórek aktywowanych PMA

Komórki traktowano PMA i inkubowano z radiologicznie znakowanym kwasem olejowym jak opisano powyżej. Adherentne komórki przemyto a uwalnianie radioaktywności z tych komórek mierzono w czasie. Linia komórek rodzicielskich (kwadraty) wykazuje wyższy poziom uwolnienia radioaktywności niż komórki z nadekspresją PPARδ (romby).

Figura 8 przedstawia, że ekspresja genu ApoE jest regulowana poprzez kwasy tłuszczowe poprzez PPARδ.

Całkowity RNA był przygotowany z rodzicielskich komórek THP-1 traktowanych PMA (THP-1) lub PMA i kwasem linolowym (THP-1+FA) oraz nietraktowanej linii komórkowej z nadekspresją PPARδ (DELTA). cDNA przygotowano z tych próbek RNA, a cDNA analizowano pod kątem sekwencji ApoE przy użyciu procedur TAQMAN. Pokazany wynik to względna ekspresja normalizowana wobec ekspresji β-aktyny a słupki błędu pokazują standardowe odchylenie w dwóch powtórzeniach próbek.

Figura 9 przedstawia, iż inhibicja PPARδ zapobiega tworzeniu komórek piankowatych. Komórki traktowano poprzez noc 5 ng/ml PMA i badano pod kątem różnicowania (przyleganie do płytek hodowlanych) i żywotności (wykluczanie błękitu trypanu). Komórki rodzicielskie THP-1 oraz komórki z nadekspresją PPARδ (Sensowny) dobrze różnicowały się w obecności PMA. Jednakże komórki z ekspresją antysensownego PPARδ (Antysensowny) nie różnicowały się wcale i stały się zupełnie przepuszczalne dla błękitu trypanu. Komórki z antysensownym PPARδ rosły prawidłowo z wyższą żywotnością w nieobecności PMA.

Figura 10 przedstawia, że ochrona przez PPARδ przed śmiercią nie jest poniżej PKC. Komórki rodzicielskie oraz z antysensownym PPARδ inkubowano z PMA i inhibitorem aktywności PKC (Bis) oraz dwoma inhibitorami aktywności PLA2 (OBAA i mepakryna). Inhibitory te były użyte w stężeniach takich jak w poprzednich badaniach.

Bis to bisindolilomaleamid I i jest dostępny od Sigma. OBAA to kwas 3-(4-oktadecylo)benzyloakrylowy i jest dostępny od Calbiochem. Mepakryna to 6-chloro-9-[(4-dietyloamino)-1-metylobutylo]amino-2-metoksy-akrydyna i jest dostępna z Calbiochem.

Wszystkie inhibitory zapobiegały różnicowaniu komórek rodzicielskich THP-1 (A). Potwierdza to rolę PKC w działaniu estru forbolu. Działanie inhibitorów PLA2 wydaje się ukazywać nowy aspekt różnicowania makrofagów. Jednakże gdy twórcy wynalazku badali żywotność tych komórek poprzez wykluczanie błękitu trypanu (B) stwierdzono, że nie blokują one indukowanej PMA „śmierci linii komórkowej z antysensownym PPARδ (czarne słupki). Tylko mepakryna wydaje się mieć oznaki toksyczności w komórkach rodzicielskich (białe słupki).

Figura 11 przedstawia, że akumulacja lipidów jest promowana przez agonistę PPARδ, związek F.

Figura 12 przedstawia, że związek F, agonista PPARδ, promuje tworzenie makrofagowych komórek piankowatych z komórek glejowych THP-1.

Figura 13 przedstawia, że związek F promuje tworzenie makrofagowych komórek piankowatych z pierwotnych monocytów ludzkich.

Figura 14 przedstawia akumulację lipidu w komórkach glejowych promowaną przez PPARδ.

PL 205 747 B1

Figura 15 przedstawia, że związek F stymuluje namnażanie linii komórkowych raka prostaty.

Opis: Rola PPARδ w tworzeniu komórek piankowatych.

Hodowla tkankowa

Ludzkie komórki glejaka gwiaźdźiaka 373 rosły w podłożu hodowlanym RPMI 1640 wzbogaconym 10% obj./obj. płodową surowicą wołową dezaktywowaną ciepłem (GibcoBRL, Paisley, Szkocja), penicyliną (5000 IU/ml)(GibcoBRL, Paisley, Szkocja) oraz streptomycyną (5000 μg/ml) (Gibco, Paisley, Szkocja). Hodowle rosły w 37°C i 5% CO2 i były pasażowane gdy otrzymano 100% konfluencji.

Traktowanie lekiem linii komórkowej

Konfluentne komórki wysiewano na sześcio-studzienkowe płytki testowe w 2 ml podłoża stosowanego do hodowli tkankowej opisanej powyżej i podano 5 μM oraz 10 μM specyficznego wobec agonisty PPARδ - związku F. DMSO użyto jako kontrolę. Związek oraz podłoże odnawiano co trzy dni, a komórki traktowano przez jeden tydzień.

Eksperymenty z barwieniem

Barwienie czerwienią oleistą O z barwieniem kontrastowym hematoksyliną przeprowadzono na komórkach z każdego traktowania opisanego w paragrafie powyżej. Pożywkę usuwano, a studzienki przemywano PBS (2 ml). Komórki utrwalano w 10% formalinie (1 ml) przez jedną godzinę, a następnie dwukrotnie przemywano PBS przed szybkim płukaniem w 60% alkoholu izopropylowym. Dodawano roztworu czerwieni oleistej O (1 ml) (Sigma) i usuwano po trzech godzinach. Studzienki następnie przemywano dwukrotnie PBS. Do barwienia kontrastowego dodawano hematoksylinę (1:10, 1 ml) (Sigma) i usuwano po pięciu minutach poprzez dwukrotne przemycie PBS. Drugie płukanie pozostawiono w studzienkach.

Wyniki

Po tygodniu, komórki kontrolne nie wykazywały żadnej akumulacji lipidów. Dla komórek traktowanych związkiem F, zaobserwowano akumulację lipidu i wyraźne makropęcherzyki co oznacza, że akumulacja lipidu była obecna nie tylko w okolicy około jądrowej ale także w wypustkach astrocytowych (zobacz figura 14).

P r z y k ł a d 1: Rola PPARδ w tworzeniu miażdżycowych komórek piankowatych

Aktywowane makrofagi wyrażają wszystkie trzy formy receptorów aktywowanych proliferacją peroksysomów, nazywanych alfa(a), gammafy) oraz delta (δ). W pracy opisanej w przykładzie 1 twórcy wynalazku wykazali, że ekspresja PPARδ jest wymagana do aktywacji makrofagów przez estry forbolu i, że PPARδ promuje tworzenie makrofagowych komórek piankowatych. Pokazano poprzednio, że agoniści PPARy negatywnie regulują aktywację makrofagów i mają silne działanie przeciwzapalne. W tym przykładzie twórcy wynalazku pokazali, iż agonista PPARy, rozyglitazon hamuje tworzenie komórek piankowatych. Dlatego też PPARy oraz PPARδ pośredniczą w przeciwnych procesach w makrofagowym metabolizmie lipidów oraz różnicowaniu. Te wyniki pokazują, iż, ku zaskoczeniu, antagonistyczne ligandy PPARδ są mocnymi kandydatami jako leki do zapobiegania chorobom sercowo-naczyniowym.

Materiały eksperymentalne oraz metody są opisane w legendzie do figur.

Wyniki

Ocena modelu komórek piankowatych

Linie komórek monocytowych są szeroko stosowane w badaniach podstawowych dotyczących podstaw molekularnych miażdżycy. Twórcy wynalazku badali wpływ lipidów i tłuszczów w diecie oraz wpływ stresu i stanów zapalnych. Najbardziej wszechstronna linia komórkowa do tego badania to ludzka linia komórek THP-1. Linia ta rośnie w zawiesinie w normalnych warunkach, jednakże bodźce zapalne, takie jak estry forbolu powodują silne różnicowanie oraz odpowiedź zapalną, gdzie komórki stają się adherentne i bardziej „makrofago-podobne. Wiadomo również, że ta linia komórkowa odpowiada na kwasy tłuszczowe i utleniony LDL poprzez zmiany w ekspresji genów, i pokazano, że utleniony LDL promuje akumulację lipidu cytoplazmatycznego. Te zjawiska regulacyjne są uznawane jako początkowe wydarzenia, które pojawiają się w czasie tworzenia płytki miażdżycowej (12).

Twórcy wynalazku stwierdzili istotny związek pomiędzy procesem zapalnym i patologią lipidową tych komórek poprzez obserwację, że stymulacja komórek THP-1 przez ester forbolu prowadzi do dużego wzrostu w poziomach mRNA PPARδ. Inne grupy pokazały, iż bodziec zapalny zwiększa ekspresję PPARy w mysich i ludzkich makrofagach, jak również liniach komórkowych pochodzących z monocytów takich jak THP-1 oraz U937 (13-15). Pokazano również ekspresję PPARδ we wzbudzanych tioglikolanem otrzewnowych makrofagach z myszy (13). Pokazano także, iż aktywowane komórki THP-1 wyrażają wiele zapalnych produktów genowych związanych z genezą miażdżycy, takich jak

PL 205 747 B1

MCP (monocytowe białko chemotaktyczne), IL-8, II-1 β oraz syntaza tromboksanowa (figura 2), oraz stwierdzono, iż ekspresja kilku z tych produktów genowych po aktywacji jest modulowana przez kwasy tłuszczowe. Znaczące jest stwierdzenie, że ekspresja apoliproteiny E wzrasta po aktywacji i, że jest to silnie hamowane przez kwasy tłuszczowe. Rezultaty te pokazują, iż system ten odpowiada na kwasy tłuszczowe oraz bodziec zapalny w odpowiedni sposób, aby można było brać go pod uwagę jako dobry model ludzkiej choroby naczyń. Twórcy wynalazku zaobserwowali również, iż traktowanie adherentnych komórek THP-1 wielonienasyconymi kwasami tłuszczowymi, takimi jak kwas linolowy, prowadzi do akumulacji kropelek lipidu w cytoplazmie (figura 3A). Te naładowane lipidem makrofagi są znane jako komórki piankowate. Udział heterodimeru PPAR/RXR w regulacji procesu tworzenia komórek piankowatych był zasugerowany przez obserwację, iż aktywujący ligand receptora retinoidu X (LG100268) promował tworzenie komórek piankowatych w kooperacji z kwasami tłuszczowymi. Kwas linolowy nie jest bardzo specyficznym ligandem dla PPAR, jednakże pokazano, że aktywuje wydajnie PPAR alfa oraz delta, podczas gdy jest raczej słabym aktywatorem PPARy. Traktowanie tych komórek aktywatorem PPARa, Wy14,643 nie miało efektów, co jest zgodne z niskim poziomem ekspresji tej izoformy w aktywowanym makrofagu (figura 1). Użycie rozyglitazonu, BRL49653, także nie dawało komórek piankowatych; jednakże wiadomo, iż te komórki zawierały PPARy. Faktycznie, traktowanie BRL49653 powoduje redukcję depozytów lipidowych w porównaniu do komórek nietraktowanych (figura 3A) i może hamować promowanie komórek piankowatych przez kwas linolowy oraz reksynoid (dane nie pokazane). Dane te razem sugerują po raz pierwszy, że PPARδ jest celem molekularnym dla kwasów tłuszczowych w promowaniu tworzenia komórek piankowatych oraz to, że PPARy jest negatywnym regulatorem funkcji komórek piankowatych.

Rozyglitazon (BRL49653) działa przeciwstawnie na tworzenie komórek piankowatych.

Dane te potwierdzają rolę PPARy w antagonizmie aktywacji makrofagów oraz akumulacji lipidów. Zaobserwowano także, iż przyleganie komórek THP-1 po traktowaniu BRL49653 jest wolniejsze niż to zaobserwowano dla komórek nietraktowanych (dane nie pokazane). Powyższa rola inhibitorowa była także zasugerowana przez dwa artykuły w Nature, w których wykazano negatywną regulację czynników pośredniczących w zapaleniu poprzez PPARy (13, 14). Potwierdzono przeciwzapalne działanie TZD poprzez badanie efektu BRL49653 na ekspresję IL-1e. Rzeczywiście traktowanie BRL49653 prowadzi do spadku poziomów mRNA IL-1 β (figura 4A). Zaobserwowano także redukcję mRNA TNFa, w porównaniu do aktyny, jednakże ta redukcja nie była tak dramatyczna (figura 4B). Pokazano, że pobieranie lipidu przez wyłapujący receptor CD36 był regulowany przez PPARy w komórkach THP-1 (16,17), przy czym stwierdzono, iż CD36 jest regulowany przez TZD w aktywowanych komórkach THP-1 (Fig. 3C), jednakże komórki te nie tworzą komórek piankowatych (Fig. 2). Tak więc zwiększenie poziomu CD36 nie jest wystarczające do tworzenia komórek piankowatych, a całościowy efekt aktywacji PPARy to przeciwdziałanie tworzeniu komórek piankowatych. TZD należą do klasy leków tiazolidinodionowych, które obejmują BRL49653.

Genetyczna modulacja modelu komórek piankowatych

Aby upewnić się czy PPARδ był zaangażowany czy nie w tworzenie komórek piankowatych indukowane kwasem tłuszczowym, wytworzono linie komórkowe z komórek THP-1, z nadekspresją PPARδ lub z ekspresją antysensownego mRNA PPARδ. cDNA kodujący PPARδ wklonowano do wektora (pCLDN), który kieruje transkrypcją pod kontrolą silnego wzmacniacza z ludzkiego cytomegalowirusa (fig. 5A). Wektor ten zawiera także gen oporności na neomycynę do selekcji komórek docelowych. cDNA wstawiono w dwóch orientacjach w celu ekspresji sensownego DNA dla ekspresji białka PPARδ (pCLDNPPARδ-S) oraz w kierunku antysensownym aby zablokować ekspresję PPARδ (pCLDNPPARδ-AS). Komórki THP-1 transfekowano pCLDNPPARδ-S lub pCLDNPPARδ-AS i selekcjonowano za pomocą 1 mg/ml G418 aż do momentu gdy zaobserwowano silny wzrost w G418. Komórki następnie uwolniono z selekcji G418, ponieważ nawet kontrole z samym wektorem nie różnicowały się w obecności G418. G418 jest uważany za inhibitor aktywności białkowej kinazy C i dlatego też jest antagonistą aktywności estru forbolu. Po wyjściu z selekcji G418, potwierdzono nadekspresję PPARδ w sześciu niezależnie transfekowanych poliklonalnych liniach komórkowych za pomocą ochrony przed RNAazą (fig. 5B) oraz techniki western (fig. 5C). Te linie komórkowe rosły normalnie i nie wykazywały żadnego przylegania do butelek do hodowli tkankowych, jednakże po traktowaniu PMA, stały się przylegające i akumulowały dużą ilość wewnątrzkomórkowego lipidu w porównaniu do komórek typu dzikiego, nawet w nieobecności dodawanych kwasów tłuszczowych (fig. 6). Traktowanie BRL49653 może zapobiegać tworzeniu komórek piankowatych kierowanemu przez PPARδ. Analiza kwasów tłuszczowych pokazała, że wzrosty lipidu komórkowego dotyczą głównie triglicerydów, a ta

PL 205 747 B1 pula jest eliminowana poprzez działanie BRL49653 (fig. 6B). Stosując wyznakowany trytem kwas olejowy twórcy wynalazku analizowali pobieranie oraz wypływ kwasów tłuszczowych w liniach komórkowych rodzicielskich i nadekspresją PPARδ. Stwierdzono, iż pobieranie i wypływ są zasadniczo identyczne pomiędzy dwiema liniami komórkowymi w stanie nieaktywowanym (fig. 7A oraz B). W aktywowanych komórkach, jednakże, wydaje się, iż wypływ jest znacząco niższy niż w liniach komórkowych z nadekspresją PPARδ (fig. 7C).

Komórki z nadekspresją PPARδ wykazują poziomy mRNA ApoE, które są dramatycznie zmniejszone (35 razy) w porównaniu do linii komórek rodzicielskich (fig. 8). Ważne jest, aby zauważyć, iż apoE jest zmniejszane do tych samych poziomów co obserwowane w linii komórek rodzicielskich po traktowaniu kwasem linolowym. Dane te ujawniają, że PPARδ pośredniczy w represji przez kwas tłuszczowy ekspresji genu apoE. Komórki z ekspresją antysensownego RNA dla PPARδ (PPARδAS) także rosną normalnie; jednakże, gdy komórki te potraktowane zostaną PMA, to nie różnicują się (fig. 9A). Różnicowania nie zaobserwowano w żadnym stężeniu PMA (0,1 ng - 25 ng/ml). Całonocne barwienie błękitem trypanu komórek PPARδAS traktowanych PMA ujawniło, iż komórki te umarły po traktowaniu (fig. 9B). Nie było dowodów na kondesację DNA co oceniano na podstawie barwienia DAPI (4N,6-diamidino-2-fenyloindol, Molecular Probes, Oregon)(dane nie pokazane). Nie zaobserwowano fragmentacji DNA po elektroforezie w żelu agarozowym genomowego DNA przygotowanego z martwych komórek (dane nie pokazane). Tak więc komórki z antysensownym PPARδ traktowane PMA nie wydają się umierać poprzez apoptozę. Poprzez użycie inhibitorów PKC i fosfolipazy A twórcy wynalazku pokazali, iż możemy zablokować różnicowanie komórek rodzicielskich THP-1 (figura 10A); jednakże wydaje się, że komórki z antysensownym PPARδ umierają w obecności estru forbolu oraz tych inhibitorów (fig. 10B). Sugeruje to, iż powód śmierci to nie zdarzenia poniżej aktywacji PKC w procesie różnicowania.

Twórcy wynalazku wykazali, iż PPARδ jest wymagany do aktywacji zapalnej makrofagów (jak pokazano przez aktywację komórek THP-1) i, że PPARδ promuje tworzenie komórek piankowatych. Nadekspresja PPARδ znacznie zmienia przechowywanie lipidów w tych komórkach co jest częściowo osiągnięte poprzez zmianę ekspresji genu kodującego apoliproteinę E. Hamowanie (antagonizm) aktywności PPARδ może zapobiegać tworzeniu komórek piankowatych a opracowywanie leków, które są inhibitorami aktywności PPARδ jest przydatne w zapobieganiu i/lub leczeniu szerokiej liczby zaburzeń, które pojawiają się jako konsekwencja miażdżycy.

P r z y k ł a d 2: Akumulacja lipidów jest promowana poprzez agonistę PPARδ

Agonista selektywny wobec PPARδ (związek F na stronie 9 WO 97/28149) promuje akumulację lipidów i promuje tworzenie komórek piankowatych w teście THP-1 opisanym w przykładzie 1. Chociaż WO 97/28149 proponuje użycie agonisty PPARδ (jak również innych opisanych tu związków) do leczenia chorób sercowo-naczyniowych, twórcy wynalazku pokazali, że składnik ten promuje tworzenie komórek piankowatych. Efekt ten jest widoczny przy mniej niż 500 nM i jest maksymalny pomiędzy 5 a 10 μM (zobacz Figura 11A). Związek F współpracuje z ligandem RXR LG100268 w promowaniu tworzenia komórek piankowatych (zobacz figura 11B). Tę aktywność farmakologiczną możnaby przewidzieć na podstawie badań opisanych w przykładzie 1. Związek F promuje także tworzenie makrofagowych komórek piankowatych zarówno w komórkach THP-1 (figura 12), jak i pierwotnych ludzkich monocytach (zobacz figura 13).

P r z y k ł a d 3: Badanie przesiewowe pod kątem inhibitorów aktywności PPARδ

Testy wiązania:

Testy filtracyjne z wyznakowanym radioaktywnie ligandem

Rekombinowany hPPARδ zmieszano z radioaktywnym ligandem [³H]₂ L-783483 jak opisano w WO 97/28149 i Berger i wsp. (1999) J. Biol. Chem. 274, 6718-6725 w obecności testowanego związku. L-783483 ma Kd=1 nM. Mieszanka jest podawana do mieszanych filtrów celulozowych, a płyn przechodzi przez nie pod ciśnieniem próżni. Radioaktywna pozostałość na filtrze będzie reprezentować L-783483 związane z PPARδ. Spadek w związanej radioaktywności będzie wskazywał na obecność związku współzawodniczącego z PPARδ. Test ten określa właściwości wiążące testowanego związku.

Wypieranie fluoroscencyjnego kwasu tłuszczowego

Wiązanie cis lub trans kwasu parynarowego dostarcza testu fluorescencyjnego dla ligandów PPARδ. „kwas cis-parynarowy „to kwas 9,15-cis, 11, 13 trans-parynarowy. „Kwas trans-parynarowy to kwas 9,11,13,15 trans-parynarowy. Obydwa są dostępne z Molecular Probes, Oregon. Rekombinowany PPARδ zmieszano z tymi kwasami, a testowany związek będzie produkował mniej fluoroscencji

PL 205 747 B1 niż obserwowana w obecności samego kwasu tłuszczowego/ PPAR jeśli pojawi się znaczące wiązanie testowanego związku.

Test ten określa czy testowany związek wiąże PPARδ.

Test ten z łatwością będzie mógł być zautomatyzowany poprzez przeprowadzenie go w wielo-studzienkowych płytkach z odpowiednim urządzeniem do pomiaru fluoroscencji, co da wysoką przepustowość.

Test oddziaływania koaktywator/receptor/ligand (CARLA)

Wiązanie białek koaktywatora, takich jak RIP140 lub SRC-1, do PPARδ jest zależne od obecności ligandu. RIP 140 oraz SRC-1 to białka wiążące PPARδ (Krey i wsp. (1997) Mol. Endocrinol. 11, 779-791). Koaktywatory są uzyskane poprzez translację in vitro w obecności znakowanej ³⁵S metioniny i mieszane z oczyszczonym rekombinowanym hPPARδ w obecności testowanych związków. hPPAR będzie poddany immunoprecypitacji, a osad będzie analizowany za pomocą SDS/PAGE, a następnie autoradiografii, obecność sygnału radioaktywności odpowiadającego koreceptorowi będzie wskazywał na obecność Uganda PPARδ. Test ten może być zastosowany do identyfikacji wiązania koaktywatora, który może okazać się antagonistą; otrzymuje się to na podstawie obecności znanego agonisty w każdym teście (zobacz powyżej).

Testy funkcjonalne

Test dla przejściowej transfekcji konstruktu reporterowego

Komórki Cos-1 lub CV-1 transfekuje się ekspresyjnym konstruktem dla PPARδ i konstruktem reporterowym z lucyferazą pod kontrolą zależnego od PPAR wzmacniacza. Wzmacniacze zależne od PPARδ obejmują te otrzymane z genów acylo-CoA oksydazy i cytochromu P4504A6. Może to być przeprowadzone w różnych wielostudzienkowych płytkach hodowlanych, a transfekowane komórki są traktowane znanym agonistą PPARδ oraz testowanymi związkami. Komórki poddaje się lizie in situ i testuje pod kątem aktywności lucyferazy w luminometrze. Dostępne są luminometry nadające się do badań przesiewowych na dużą skalę. Opisany powyżej test bada zdolność związków testowych do blokowania aktywności agonisty PPARδ.

Test dla stabilnych linii komórkowych z konstruktem reporterowym

Linie komórkowe są transfekowane konstruktami podobnymi do opisanych powyżej z tą różnicą, że kodują również markery oporności na antybiotyki. Umożliwia to selekcję linii komórkowych ze stabilną ekspresją PPARδ, które zawierają sekwencje reporterowe włączone do genomu. Tę linię komórkową hoduje się i używa do wykrywania związków aktywujących PPARδ bez potrzeby przeprowadzania powtarzanych i kosztownych transfekcji.

P r z y k ł a d 4: Testy dla komórek piankowatych

Testy dla komórek piankowatych stosowane są do identyfikacji potencjalnych związków przeciw-miażdżycowych. Komórki THP-1 w hodowli w 96-studzienkowych płytkach traktowano od 0,1 do 10 ng/ml PMA aby zaindukować różnicowanie makrofagów. Komórki THP-1 są dostępne z ECACC nr dostępu 88081201.

Źródłem kwasu tłuszczowego może być zarówno surowica (zamiennik surowicy CPSR-3 z Sigma) lub 20-100 μM kwas linolowy.

Akumulacja kwasu tłuszczowego w różnicujących się komórkach makrofagów mierzono w obecności lub nieobecności testowanych związków po 3 do 7 dniach stosując barwienie czerwienią nilową.

Związki testowane, które zmniejszają akumulację tłuszczu w porównaniu do nieobecności testowanego związku wybrano jako potencjalne czynniki przeciw-miażdżycowe składniki lub jako związki wiodące.

P r z y k ł a d 5: Testy dla komórek raka prostaty

Twórcy wynalazku stwierdzili, że agonista PPARδ, związek F, może stymulować wzrost nabłonka prostaty. Zarówno minimalnie stransformowane komórki PNT1A oraz niepodlegające transformacji komórki raka prostaty (LNCaP) wykazały wzrost stymulowany aż do 40% poprzez niskie stężenia związku F. Efekt ten jest także widoczny po zastosowaniu ligandu RXR LG100268. Również, niskie stężenia zarówno związku F jak i LG100268, które nie zwiększyły znacząco wzrostu komórek, stymulują wzrost komórek, gdy zostaną dodane razem do pożywki hodowlanej. Wysoce stransformowana linia komórkowa raka prostaty PC3 rośnie najszybciej z tych linii i nie jest stymulowana przez związek F.

Twórcy wynalazku transfekowali komórki PC3 konstruktami ekspresyjnymi dla antysensownego RNA PPARδ; wszystkie nie rosły. W przeciwieństwie do tego, utworzono linie komórkowe z ekspresją antysensownego RNA PPARy, które wykazywały zmieniony, ale ciągły wzrost. We wszystkich eksperymentach wytworzono linie komórkowe zawierające pusty wektor ekspresyjny i nie miały one żadne20

PL 205 747 B1 go fenotypu. Eksperymenty te potwierdzają, iż PPARδ promuje proliferację i że antagonista PPARδ będzie przydatny w leczeniu raka.

Linie komórkowe wysiewano w ilości 2500 komórek na studzienkę w 24-studzienkowej płytce i hodowano w RPMI zawierającym 5% traktowany węglem drzewnym FCS opłaszczony dekstranem. Zwiększające się stężenia związku F lub LG100268 zawarto w podłożu hodowlanym a hodowle prowadzono przez 7 dni zmieniając leki oraz pożywkę co 48 godzin. Końcową liczbę komórek w każdej studzience określano następnie przez test kolorometryczny (Landegreen U. J. Immunol. Meth. 67, 379-388, (1984)) a względny wzrost wyrażono jako procent liczby komórek w studzienkach kontrolnych.

Bibliografia

1. Issemann, I. & Green, S.(1990) Activation of a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxsisome proliferators Nature 347, 645, 645-50.

2. Dreyer, C. i wsp. (1992) Control of the peroxisomal beta-oxidation pathway by a novel family of nuclear hormone receptors Cell 68, 879-87.

3. Palmer, C.N.A i wsp. (1998) Peroxisome proliferator activated receptor-alpha expression in human liver Molecular Pharmacology 53, 14-22.

4. Lee, S.S-T. i wsp. (1995) Targeted disruption of the alpha isoform of the peroxisome proliferator-activated receptor gene in mice results in abolishment of the pleiotropic effects of peroxisome proliferators Mol. Cell. Biol. 15, 3012-3022.

5. Forman, B.M. i wsp. (1995) 15-Deoxy-delta 12,14-prostaglandin J2 is a ligand for the adipocyte determination factor PPAR gamma Cell 83, 803-812.

6. Lehmann, J.M. i wsp. (1995) An anti-diabetic thiazolidinedione is a high affinity ligand for Peroxisome proliferator activated receptor γ J. Biol. Chem. 270, 12953-12956.

7. Barak, Y. i wsp. (1998) PPARy-null mice-Early embryonic lethality due to a putative placental defect Abstract No 303. Keystone Symposium on The Nuclear Recepror Gene Family. Incline Village, Nevada.

8. Schmidt, A i wsp. (1992) Identification of a new member of the steroid hormone receptor superfamily that is activated by a peroxsisome proliferator and fatty acids Molecular Endocrinology 6, 1634 1641.

9. Saxena, U i wsp. (1992) Lipoprotein lipase-mediated lipolysis of very low density lipoproteins increases monocyte adhesion to aortic endothelial cells Biochemical & Biophysical Research Communications 189, 1653-1658.

10. Frostegard, J. i wsp. (1990) Oxidized low density lipoprotein induces differentiation and adhesion of human monocytes and the monocytic cell line U937 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87, 904-908.

11. Terkeltaub, R. i wsp. (1984) Oxidized LDL induces monocytic cell expression of interleukin-8, a chemokine with T-lymphocyte chemotactic activity Arterioscler. Thromb. 14, 14, 47-53.

12. Ross, R. (1993) The pathogenesis of atherosclerosis, A perspective for the 1990s Nature 362, 801.

13. Ricote, M. i wsp. (1998) „The peroxisome proliferator activated receptor-γ is a negative regulator of macrophage activation Nature 391, 79-82.

14. Jiang, C. i wsp. (1998) PPARy agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines Nature 391, 82-86.

15. Marx, N. i wsp. (1998) Macrophages in human atheroma contain PPARy Am. J. Pathol. 153, 17-23.

16. Tontonoz, P. i wsp. (1998) PPARy promotes monocyte/ macrophage differentiation and uptake of oxidised LDL Cell 93, 241-252.

17. Nagy, L. i wsp. (1998) Oxidised LDL regulates macrophage gene expression through ligand activation of PPARy Cell 93, 229-240.

Claims (1)

1. Zastosowanie inhibitora aktywności PPAR5 do wytwarzania leku do leczenia miażdżycy tętnic lub chorób związanych z miażdżycą tętnic, choroby serca, udaru, chorób tętnic obwodowych, dusznicy bolesnej, restenozy i ogniska miażdżycowego, lub choroby naczyń wybranej spośród dowolnej z: miażdżycy tętnic, choroby serca, udaru lub choroby tętnic obwodowych albo do leczenia lub profilaktyki nowotworu wybranego spośród nowotworu skóry, nowotworu piersi, nowotworu okrężnicy lub nowotworu prostaty, przy czym inhibitorem aktywności PPAR5 jest oparty na kwasie nukleinowym inhibitor aktywności PPAR5 w komórce będący antysensowną cząsteczką selektywną względem PPAR5 lub rybozymem selektywnym względem PPAR5.