PL205964B1 - Białko błony zewnętrznej Lawsonia intracellularis i jego zastosowanie - Google Patents

Białko błony zewnętrznej Lawsonia intracellularis i jego zastosowanie

Info

Publication number
PL205964B1
PL205964B1 PL351277A PL35127701A PL205964B1 PL 205964 B1 PL205964 B1 PL 205964B1 PL 351277 A PL351277 A PL 351277A PL 35127701 A PL35127701 A PL 35127701A PL 205964 B1 PL205964 B1 PL 205964B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gly
val
ala
leu
protein
Prior art date
Application number
PL351277A
Other languages
English (en)
Other versions
PL351277A1 (en
Inventor
Antonius Arnoldus Christiaan Jacobs
Paul Vermeij
Original Assignee
Intervet Int Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intervet Int Bv filed Critical Intervet Int Bv
Publication of PL351277A1 publication Critical patent/PL351277A1/xx
Publication of PL205964B1 publication Critical patent/PL205964B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy białka błony zewnętrznej Lawsonia intracellularis i jego immunogennego fragmentu oraz zastosowania tego białka albo jego immunogennego fragmentu do wytwarzania szczepionki.
Świńska proliferacyjna enteropatia (PPE lub PE) stała się ważną chorobą we współczesnym przemyśle chlewnym występującą na całym świecie. Chorobą dotkniętych jest 15% do 50% zakładanych trzód hodowlanych i do 30% poszczególnych zwierząt w zainfekowanych trzodach, w których ten problem występuje. Straty ekonomiczne na dzień dzisiejszy szacuje się na 5-10 $ USA w dodatkowej paszy i stratach czasu w przeliczeniu na jedną dotkniętą chorobą świnię. PPE to grupa przewlekłych i ostrych stanów chorobowych o szeroko zróżnicowanych objawach (śmierć, zwierzęta blade i anemiczne, wodnista, ciemna albo czerwona biegunka, depresja, zmniejszony apetyt i niechęć do poruszania się, zahamowany wzrost i zwiększony FRC). Jednakże występują dwie wspólne cechy. Pierwsza, patologiczna zmiana widoczna jedynie przy sekcji, to zmniejszenie grubości śluzówki jelita cienkiego i okrężnicy. Druga to występowanie wewnątrzcytoplazmatycznych małych, zakrzywionych bakterii w enterocytach dotkniętego chorobą jelita. Ustalono obecnie, że czynnikiem etiologicznym PPE są bakterie i nazwano je Lawsonia intracellularis.
Z biegiem lat stwierdzono, że Lawsonia intracellularis infekuje właściwie wszystkie zwierzęta, włączając w to małpy, króliki, chomiki, lisy, konie i inne zwierzęta tak odmienne jak strusie i emu. Lawsonia intracellularis jest gram ujemną, uwicioną bakterią, która namnaża się jedynie w enterocytach eukariotycznych i nie opisano dla niej hodowli bezkomórkowej. W celu przetrwania i namnażania się w komórkach, Lawsonia intracellularis musi wnikać do dzielących się komórek krypt. Bakteria łączy się z błoną komórkową i szybko dostaje się do enterocytu wewnątrz wnikającej wakuoli. Ta następnie szybko pęka (w czasie 3 godzin) i bakteria bujnie rozwija się i namnaża swobodnie w cytoplazmie). Mechanizm, poprzez który bakteria sprawia, że zainfekowana komórka nie może dojrzewać, kontynuuje zachodzenie mitozy i tworzy kryptę hipoplastyczną nie jest jeszcze zrozumiałe.
Obecnie w zrozumieniu infekcji Lawsonia intracellularis, leczeniu i kontroli choroby przeszkadza fakt, że Lawsonia intracellularis nie można hodować w pożywce bezkomórkowej. Jakkolwiek istnieją doniesienia o pomyślnym jednoczesnym hodowaniu Lawsonia intracellularis ze szczurzymi enterocytami, nie doprowadziło to do opracowania szczepionek do zwalczania Lawsonia intracellularis i istnieje wyraźne zapotrzebowanie na takie szczepionki.
Ku zaskoczeniu stwierdzono, że Lawsonia intracellularis wytwarza trzy nowe białka błony zewnętrznej (OMP), które razem albo w kombinacji mają zdolność do indukowania ochronnej odporności na Lawsonia intracellularis.
Te trzy białka błony zewnętrznej będą określane dalej jako białka 19/21 kD, 37 kD i 50 kD. Białko 19/21 kD występuje w dwóch różnych formach, w formie 19 kD i w formie 21 kD, gdzie jedno białko jest zmodyfikowaną formą drugiego, a obydwa mają identyczną sekwencję aminokwasową.
Sekwencje aminokwasowe białka 37 kD i 50 kD są przedstawione w SEK NR ID: 2 i 4. Geny kodujące te dwa białka zostały zsekwencjonowane, a ich sekwencja nukleotydowa jest pokazana w identyfikatorach sekwencji SEK NR ID: 1 i 3. Biał ko 19/21 kD charakteryzuje się trzema wewnę trznymi sekwencjami aminokwasowymi, składającymi się z 7, 12 i 12 aminokwasów, odpowiednio. Te sekwencje aminokwasowe są przedstawione w SEK NR ID: 5, 6 i 7.
Jest powszechnie wiadomym w dziedzinie, że wiele różnych sekwencji kwasów nukleinowych może kodować jedno i to samo białko. Zjawisko to jest powszechnie znane jako zasada tolerancji w drugiej, a szczególnie w trzeciej zasadzie każ dego trypletu koduj ą cego aminokwas. Zjawisko to może prowadzić do heterologii wynoszącej około 30% dla dwóch sekwencji aminokwasowych nadal kodujących to samo białko. A zatem dwie sekwencje kwasu nukleinowego wykazujące homologię sekwencji około 70% mogą nadal kodować jedno i to samo białko.
Standardowo, poziom homologii nukleotydowej można określić przy zastosowaniu programu komputerowego „BLAST 2 SEQUENCES” poprzez wybranie podprogramu: „BLASTN”, który można znaleźć pod adresem www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. Odnośnik do tego programu stanowi Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250 (1999). Zastosowanymi parametrami są parametry domyślne: Nagroda za zgodność: +1. Kara za niezgodność: -2. Utworzenie przerwy: 5. Wydłużenie przerwy: 2. Wartość x_dropoff: 50.
Ponadto, ponieważ niniejszy opis ujawnia sekwencje kwasu nukleinowego kodujące nowe białka 37 kD i 50 kD Lawsonia intracellulars możliwe jest otrzymanie tych białek w wystarczających iloPL 205 964 B1 ściach. Można tego dokonać na przykład poprzez zastosowanie systemu ekspresyjnego do uzyskiwania ekspresji genów kodujących białka.
Opis odnosi się również do fragmentów DNA zawierających określone sekwencję kwasu nukleinowego. Takimi fragmentami DNA mogą być plazmidy, w których klonuje się sekwencję kwasu nukleinowego według wynalazku. Takie fragmenty DNA są na przykład przydatne do zwiększania ilości DNA przy zastosowaniu jako startery, jak opisano poniżej.
Niezbędnym wymaganiem dla ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego jest promotor połączony funkcjonalnie z sekwencją kwasu nukleinowego tak, że sekwencja kwasu nukleinowego jest pod kontrolą promotora. Jest oczywiste dla specjalistów w dziedzinie, że wybór promotora rozciąga się na dowolny, eukariotyczny, prokariotyczny albo wirusowy promotor zdolny do kierowania ekspresją genu w komórkach używanych jako komórki gospodarza dla ekspresji białka.
A zatem, w opisie ujawniono również zrekombinowaną cząsteczkę DNA zawierającą fragment albo sekwencję kwasu nukleinowego, która jest umieszczona pod kontrolą połączonego funkcjonalnie promotora. Można ja otrzymać przy zastosowaniu standardowych technik biologii molekularnej np. (Maniatis/Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual, 1989. ISBN 0-87969-309-6). Funkcjonalnie połączonymi promotorami są promotory, które mają zdolność do kontrolowania transkrypcji sekwencji kwasu nukleinowego, z którymi są połączone. Takim promotorem może być promotor Lawsonia np. promotor uczestniczący w ekspresji in vivo genu 19/21 kD, 37 kD lub 50 kD, zakładając, że ten promotor jest funkcjonalny w komórce użytej do ekspresji. Może to być również promotor heterologiczny. Kiedy komórkami gospodarza są bakterie, przydatne sekwencje kontrolne dla ekspresji, które można zastosować obejmują promotor i operator Trp (Goeddel, i wsp., Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); promotor i operator lac (Chang, i wsp., Nature, 275, 615, 1978); promotor białka błony zewnętrznej (Nakamura, K. i Inouge, M., EMBO J., 1, 771-775, 1982); promotory i operatory bakteriofaga lambda (Remaut, E. i wsp., Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688, 1983); promotor i operator β-amylazy (B. subtilis); sekwencje terminatorowe i inne sekwencje wzmacniające i kontrolujące ekspresję odpowiednie dla wybranej komórki gospodarza.
Kiedy komórką gospodarza są drożdże, przydatne sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują np. czynnik płciowy α. Dla komórek owadzich można zastosować promotory polihedryny albo p10 bakulowirusów (Smith, G.E. i wsp., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983). Kiedy komórka gospodarza jest pochodzenia ssaczego przykładowe przydatne sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują promotor SV-40 (Berman, P.W. i wsp., Science, 222, 524-527, 1983) lub promotor metalotioneiny (Brinster, R.L., Nature, 296, 39-42, 1982) albo promotor szoku cieplnego (Voellmy i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985).
Systemy ekspresji w komórkach bakteryjnych, drożdżowych, grzybowych i ssaczych są systemami bardzo często stosowanymi. Takie systemy są dobrze znane w tej dziedzinie i generalnie dostępne, np. handlowo od Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, California 943034607, USA. Obok tych systemów ekspresyjnych, bardzo atrakcyjnymi systemami ekspresji są systemy ekspresji w oparciu o pasożyty. Takie systemy są np. opisane we francuskim zgłoszeniu patentowym z publikacją numer 2 714 074 i publikacji US NTIS nr US 08/043109 (Hoffman, S. and Rogers, W.: Public. Date 1 December 1993).
W praktycznej realizacji niniejszego wynalazku stosuje się żywe zrekombinowane przenośniki (Live Recombinant Carriers (LRCs), zawierające sekwencję kwasu nukleinowego kodującą białko 19/21 kD albo jego immunogenną część według wynalazku jak również białko 37 kD lub 50 kD albo jego immunogenną część, fragment DNA albo zrekombinowaną cząsteczkę DNA. Takimi przenośnikami są na przykład bakterie i wirusy. Te LCR to mikroorganizmy lub wirusy, w których została sklonowana dodatkowa informacja genetyczna, w tym przypadku sekwencja kwasu nukleinowego kodująca białko 19/21 kD, 37 kD lub 50 kD albo jego immunogenną część według wynalazku. Zwierzęta infekowane takimi LCR będą dawały odpowiedź immunologiczną nie tylko wobec immunogenów przenośnika, ale również wobec immunogennej części białka(ek), dla których sklonowana jest w LCR dodatkowa informacja genetyczna, np. gen 19/21 kD, 37 kD lub 50 kD. Jako przykład bakteryjnego LCR, korzystna jest możliwość zastosowania atenuowanych szczepów Salmonella znanych specjalistom w dziedzinie. Żywy zrekombinowany przenośnikowy pasożyt został opisany przez Vermeulen, A. N. (Int. Journ. Parasitol. 28: 1121-1130 (1998)). Ponadto, jako sposób przenoszenia sekwencji kwasu nukleinowego do komórki docelowej można zastosować wirusy LRC. Żywe zrekombinowane wirusy przenośnikowe zwane są również wirusami wektorowymi. Wirusami często stosowanymi jako wektory są wirusy krowianki (Panicali i wsp; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 4927 (1982), herpetowirusy
PL 205 964 B1 (E.P.A. 0473210A2) i retrowirusy (Valerio, D. i wsp; in Baum, S.J., Dicke, K.A., Lotzova, E. and Pluznik, D.H. (Eds.), Experimental Haematology today - 1988. Springer Verlag, New York: pp. 92-99 (1989)).
Do wprowadzania zrekombinowanej sekwencji kwasu nukleinowego do genomu wybranej bakterii, pasożyta albo wirusa zdolnych do indukowania ekspresji wstawionej sekwencji kwasu nukleinowego w zwierzętach będących gospodarzem można zastosować technikę rekombinacji homologicznej in vivo, dobrze znaną specjalistom w dziedzinie.
Ponadto, w praktyce wykorzystuje się także komórki gospodarza zawierające sekwencję kwasu nukleinowego, fragmentu DNA zawierającego taką sekwencją kwasu nukleinowego albo zrekombinowanej cząsteczki DNA zawierającej taką sekwencję pod kontrolą dołączonego funkcjonalnie promotora. W wykonaniu tym można stosować również komórki gospodarza zawierające żywy zrekombinowany przenośnik zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko 19/21 kD albo jego fragment według wynalazku, bądź też białko 37 kD lub 50 kD albo jego fragment.
Komórką gospodarza może być komórka pochodzenia bakteryjnego, np. Escherichia coli, Bacillus subtilis i Lactobacillus species w kombinacji z opartymi o bakterie plazmidami, takimi jak pBR322 albo bakteryjnymi wektorami wirusowymi takimi jak pGEX albo z bakteriofagami. Komórka gospodarza może być również pochodzenia eukariotycznego, np. komórka drożdży w kombinacji ze cząsteczkami wektorowymi specyficznymi dla drożdży albo komórki wyższych eukariontów, takie jak komórki owadzie (Luckow i wsp.; Biotechnology 6: 47-55 (1988)) w kombinacji z wektorami albo zrekombinowanymi bakulowirusami, komórki roślinne w kombinacji z wektorami opartymi o plazmidy Ti albo roślinne wektory wirusowe (Bartom K.A. i wsp.; Cell 32: 1033 (1983), komórki ssacze, takie jak Hela, komórki jajnika chińskiego chomika (CHO) albo komórki nerki Crandell Feline Kidney również z odpowiednimi wektorami albo zrekombinowanymi wirusami.
Tak więc przedmiot wynalazku stanowi białko błony zewnętrznej Lawsonia intracellularis o masie cząsteczkowej 19/21 kD, które można otrzymać w procesie obejmującym etapy
a) obróbki preparatu błony zewnętrznej na SDS-PAGE b) wycięcia z żelu prążka 19 albo 21 kD albo immunogenny fragment tego białka.
Korzystnie białko to posiada N-końcową sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 70% homologiczna z sekwencją aminokwasową jak przedstawiona w SEK NR ID: 5, wewnę trzną sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 70% homologiczna z sekwencję aminokwasową jak przedstawiona w SEK NR ID: 6 albo wewnętrzną sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 70% homologiczna z sekwencją aminokwasową jak przedstawiona w SEK NR ID: 7 albo immunogenny fragment tego białka. Jeszcze korzystniej białko to wykazuje homologię sekwencji wynoszącą co najmniej 80%, korzystnie 90%, a korzystniej 95% z sekwencją aminokwasową jak przedstawiona w SEK NR ID: 5, 6 albo 7 albo immunogenne fragmenty tego biał ka.
W Przykł adzie 1 szczegół owo opisane są etapy otrzymywania biał ka wedł ug wynalazku: najpierw opisany jest etap izolacji L. intercellularis z zainfekowanych niedrożnych jelit, po czym zamieszczony jest wyczerpujący opis otrzymywania preparatu białka błony zewnętrznej Lawsonia intercellularis. Ponadto, w części dotyczącej „Sekwencjonowania białka błony zewnętrznej” wyjaśniono w jaki sposób izolować prążek 19 lub 21 kD z żelu.
Poziom homologii białka można określić przy pomocy programu komputerowego „BLAST 2 SEQUENCES” poprzez wybranie podprogramu: „BLASTP”, który można znaleźć pod adresem www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. Odnośnikiem do tego programu jest Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250 (1999). Zastosowana tablica porównań: „blosum62”. Zastosowanymi parametrami są parametry domyślne: Utworzenie przerwy: 11. Wydłużenie przerwy: 1. Wartość x_dropoff: 50.
Dla specjalisty w dziedzinie będzie oczywistym, że dla przedstawionych tu poszczególnych białek, mogą istnieć naturalne różnice między poszczególnymi szczepami Lawsonia intracellulars. Różnice te mogą polegać na różnicach aminokwasowych w całej sekwencji albo na delecjach, podstawieniach, wstawieniach, odwróceniach albo addycjach aminokwasu(ów) w takiej sekwencji. Opisano podstawienia aminokwasowe, które nie zmieniają zasadniczo aktywności biologicznej i immunologicznej np. przez Neurath i wsp., w „The Proteins” Academic Press New York (1979). Podstawieniami aminokwasowymi pomiędzy spokrewnionymi aminokwasami albo podstawieniami, które następowały często w ewolucji są między innymi Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (patrz Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, tom 5, suppl. 3).
PL 205 964 B1
Innymi podstawieniami aminokwasowymi są Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val i Ala/Glu. W oparciu o te informacje, Lipman i Pearson opracowali metodę szybkiego i czułego porównywania białek (Science, 227, 1435-1441, 1985) i określania funkcjonalnego podobieństwa pomiędzy homologicznymi białkami. Takie podstawienia aminokwasowe przykładowych wykonań według tego wynalazku, jak również odmiany mające delecje i/lub wstawienia są w zakresie wynalazku o ile otrzymane w rezultacie białka zachowują reaktywność immunologiczną. To wyjaśnia dlaczego białka Lawsonia intracellularis według wynalazku, kiedy izoluje się je z różnych izolatów mogą mieć poziom homologii około 70%, wciąż reprezentując to samo białko z tymi samymi w ł a ś ciwoś ciami immunologicznymi. Te zró ż nicowania w sekwencji aminokwasowej pewnych białek według wynalazku, które nadal dają białko zdolne do indukowania odpowiedzi immunologicznej wobec infekcji Lawsonia intracellularis albo co najmniej wobec objawów klinicznych infekcji uważa się jako „nie wpływające istotnie na immunogenność”.
Kiedy białko stosuje się np. dla celów szczepienia albo uzyskiwania przeciwciał, nie jest niezbędne stosowanie całego białka. Możliwe jest również użycie fragmentu takiego białka, które jest zdolne jako takie albo w połączeniu z nośnikiem, takim jak KLH, do indukowania odpowiedzi immunologicznej wobec tego białka, tak zwanego fragmentu immunogennego. Jako „fragment immunogenny” rozumie się więc fragment białka pełnej długości, który nadal zachowuje zdolność do indukowania odpowiedzi immunologicznej u gospodarza, tj. zawiera epitop dla komórki B albo T. Obecnie dostępnych jest wiele technik dla łatwej identyfikacji fragmentów DNA kodujących antygenne fragmenty (determinanty). Metoda opisana przez Geysen i wsp. (zgłoszenie patentowe WO 84/03564, zgłoszenie patentowe WO 86/06487, Patent USA nr 4,833,092, Proc. Natl Acad. Sci. 81: 3998-4002 (1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274 (1987), tak zwana metoda PEPSCAN jest łatwą do przeprowadzenia, szybką i dopracowaną metodą wykrywana epitopów, ważnych immunologicznie regionów białka. Sposób ten jest szeroko stosowany i jako taki dobrze znany specjalistom w dziedzinie. Metoda ta (doświadczalna) jest szczególnie odpowiednia do wykrywania epitopów dla komórek B. Ponadto, dysponując sekwencją genu kodującego dowolne białko, algorytmy komputerowe umożliwiają zaprojektowanie specyficznych fragmentów białkowych jako ważnych immunologicznie epitopów na podstawie zgodności ich sekwencji albo struktury ze znanymi już epitopami. Ustalenie tych regionów opiera się na połączeniu kryteriów hydrofilowości według Hopp i Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 38248-3828 (1981) i aspektów struktury drugorzędowej według Chou i Fasman (Advances in Enzymology 47: 45-148 (1987) oraz Patent USA 4,554,101). Epitop dla komórek T można podobnie przewidywać z sekwencji przy uż yciu komputera posł ugują c się kryterium amfifilowoś ci Berzofskiego (Science 235, 1059-1062 (1987) i zgłoszenie patentowe USA NTIS US 07/005,885). Zwarty przegląd można znaleźć w: Shan Lu na temat ogólnych zasad: Tibtech 9: 238-242 (1991), Good i wsp. na temat epitopów Malaria; Science 235: 1059-1062 (1987), Lu, praca przeglądowa; Vaccine 10: 3-7 (1992), Berzowsky na temat epitopów HIV; The FASEB Journal 5: 2412-2418 (1991).
A zatem, białko według wynalazku może być wykorzystywane przykładowo do wytwarzania szczepionki zdolnej do ochrony świń przed infekcją Lawsonia intracellularis, która zawiera jeden albo większą liczbę białek albo immunogennych fragmentów takiego białka według tego wynalazku jak opisano powyżej łącznie z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem.
W związku z powyż szym, wynalazek dotyczy takż e biał ka Lawsonia intracellularis wedł ug wynalazku do zastosowania w szczepionce.
Kolejny przedmiot wynalazku stanowi zastosowanie białka Lawsonia intracellularis według wynalazku do wytwarzania szczepionki do zwalczania infekcji Lawsonia intracellularis.
Jednym ze sposobów wytwarzania szczepionki zawierającej białko według wynalazku jest oczyszczanie biologiczne białek lub ich immunogennych fragmentów według wynalazku z bakterii otrzymanych z wyskrobin śluzówkowych pobranych z zainfekowanej ściany jelita. Jest to jednakże bardzo czasochłonny sposób wytwarzania szczepionki.
Jest zatem znacznie dogodniejsze zastosowanie w szczepionkach produktów ekspresji genów kodujących białka albo ich immunogenne fragmenty według wynalazku. Sekwencje kwasów nukleinowych genów kodujących białka 37 kD i 50 kD są przedstawione w niniejszym wynalazku. Gen kodujący białko 19/21 kD można łatwo zlokalizować i wyizolować przy zastosowaniu mieszanej sondy hybrydyzacyjnej jak opisano w Maniatis (Maniatis/Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual, 1989. ISBN 0-87969-309-6). Sekwencje aminokwasowe przedstawione w SEK NR ID: 5, 6 i 7 stanowią podstawę dla mieszanych sond o następujących sekwencjach:
PL 205 964 B1
Peptyd 1 Peptyd 2 Peptyd 3
Startery „w przód Startery „w przód” Startery „w przód”
ggl acl caR gaR taY aaY tt gcl taY gaY taY ttR gtl atg TtY taY gtl atg gtl tgg ac
ggl acl caR gaR taY aaY ct gcl taY gaY taY ctl gtl atg
Startery „w tył” Startery „w tył” Startery „w tył”
AaR ttR taY tcY tgl gtl cc cat Iac Yaa Rta Rtc Rta Igc Gtc cal acc atl acR taR aa
AaR ttR taY tcY tgl gtl cc cat Iac lag Rta Rtc Rta Igc
Przy zastosowaniu tych sekwencji można zlokalizować i wyizolować gen kodujący białko 19/21 kD w podobny sposób jak wyizolowano geny kodują ce biał ka (patrz Przykł ad 1; „Amplifikacja genów dla białka błony zewnętrznej”).
Takie szczepionki otrzymane w oparciu o produkty ekspresji tych genów można łatwo wytworzyć poprzez zmieszanie jednego albo większej liczby białek według wynalazku albo ich immunogennych fragmentów według wynalazku z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, jak opisano poniżej.
Alternatywnie, szczepionka może zawierać żywe zrekombinowane przenośniki jak opisano powyżej, zdolne do wyrażania białek albo ich immunologicznych fragmentów według wynalazku. Takie szczepionki, np. otrzymane w oparciu o nośnik Salmonella albo przenośnik wirusowy infekujący śródbłonek żołądka mają przewagę nad szczepionkami podjednostkowymi, taką, że lepiej naśladują naturalny sposób infekcji Lawsonia intracellularis. Ponadto, ich samopowielanie się jest zaletą, ponieważ jedynie niewielkie ilości zrekombinowanego nośnika są niezbędne dla właściwej immunizacji.
Szczepionki opisane powyżej mogą uczestniczyć w aktywnym szczepieniu, tj. system immunologiczny gospodarza jest włączany przez jedno albo większą liczbę białek według wynalazku albo ich immunogennych fragmentów dla wytworzenia przeciwciał wobec tych białek. Alternatywnie, takie przeciwciała można uzyskać na przykład w króliku albo można otrzymać z linii komórkowych wytwarzających przeciwciało, jak opisano poniżej. Przeciwciała te można następnie podawać zwierzęciugospodarzowi. Sposób szczepienia, szczepienie bierne, jest szczepieniem z wyboru wówczas, kiedy zwierzę jest już zainfekowane i nie ma czasu na umożliwienie włączenia naturalnej odpowiedzi immunologicznej. Jest to również korzystny sposób szczepienia zwierząt z osłabioną odpornością. Podawane przeciwciało wobec Lawsonia intracellularis może w tym przypadku wiązać się bezpośrednio z bakteriami. Ma to tę zaletę, ż e natychmiast zmniejsza albo zatrzymuje wzrost Lawsonia intracellularis. A zatem, szczepionka może zawierać przeciwciała przeciw dowolnemu z białek Lawsonia intracellularis.
Szczepionki mogą również opierać się na komórkach gospodarza jak opisano powyżej, które zawierają białka lub ich immunogenne fragmenty według wynalazku.
Alternatywnym i bardzo wydajnym sposobem szczepienia jest bezpośrednie szczepienie DNA kodującym odpowiedni antygen. Bezpośrednie szczepienie z użyciem DNA kodującego białko okazało się skuteczne dla wielu różnych białek (praca przeglądowa np. Donnely i wsp., The immunologist 2: 20-26 (1993)). Ten sposób szczepienia jest bardzo atrakcyjny w przypadku szczepienia świń przeciw infekcji Lawsonia intracellularis.
A zatem, szczepionki mogą zawierać sekwencje kwasu nukleinowego kodują ce biał ko wedł ug wynalazku albo jego immunogenne fragmenty według wynalazku.
Szczepionki mogą również zawierać zrekombinowane cząsteczki DNA.
Szczepionki z DNA można łatwo podawać poprzez zastosowanie doskórne, np. stosując strzykawkę bezigłową. Ten sposób podawania dostarcza DNA bezpośrednio do komórek zwierzęcia, które ma być zaszczepione. Ilości DNA w mikrogramach w zakresie od 1 do 100 μg dostarczają bardzo dobrych wyników.
Dla specjalisty w dziedzinie jest oczywistym również, iż szczepionka może zawierać dodatkowo jeden albo większą liczbę antygenów pochodzących z innych organizmów patogennych i wirusów świń albo informację genetyczną kodującą takie antygeny. W przypadku zastosowania do wytwarzania szczepionki białka według wynalazku korzystne jest, jeżeli takie organizmy i wirusy są wybrane z grupy obejmującej: wirusa pseudowścieklizny, świńskiego wirusa grypy, świńskiego parwowirusa, wirusa zakaźnego zapalenia żołądka i jelit, rotawirusa, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, BorPL 205 964 B1 detella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae oraz Actinobacillus pleuropneumoniae.
Wszystkie szczepionki zawierają farmaceutycznie akceptowalny nośnik. Farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem stosowanym do wytwarzania szczepionki zawierającej białko albo jego immunogenny fragment według wynalazku może być np. sterylna woda albo sterylny roztwór soli fizjologicznej. W bardziej złożonej postaci nośnikiem może być np. bufor.
Sposoby wytwarzania szczepionki obejmują mieszanie białka według wynalazku albo jego immunogennego fragmentu i dopuszczalnego farmaceutycznie nośnika.
Szczepionki mogą zawierać również adiuwant. Adiuwanty zasadniczo obejmują substancje, które wzmagają odpowiedź immunologiczną gospodarza w sposób niespecyficzny. W dziedzinie znanych jest wiele różnych adiuwantów. Przykładami adiuwantów są kompletny i niekompletny adiuwant Freunda, witamina E, niejonowe polimery blokowe, muramilodipeptydy, Quill A®, olej mineralny np. Bayol® lub Markol®, vegetable oil oraz Carbopol® (homopolimer) lub Diluvac® Forte.
Szczepionka może także zawierać tak zwane „nośniki”. Nośnik jest cząsteczką, do której polipeptyd przywiera, nie będąc z nią kowalencyjnie związany. Często stosowanymi związkami nośnikowymi są wodorotlenek, fosforan albo tlenek glinu, krzemionka, kaolin i Bentonit. Specyficzną postacią takiego nośnika, w której antygen jest częściowo uwięziony w nośniku jest tak zwany ISCOM (EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).
Ponadto, szczepionka może zawierać jeden albo większą liczbę odpowiednich aktywnych powierzchniowo związków albo emulgatorów, np. Span albo Tween.
Często szczepionka jest zmieszana ze stabilizatorami, np. w celu ochrony przed degradacją podatnych na rozkład polipeptydów, w celu zwiększenia okresu trwałości szczepionki albo w celu zwiększenia wydajności liofilizacji. Przydatnymi stabilizatorami są między innymi SPGA (Bovarnik i wsp.; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), wę glowodany, np. sorbitol, mannitol, trehaloza, skrobia, sacharoza, dekstran albo glukoza, białka takie jak albumina lub kazeina albo produkty ich rozkładu oraz bufory, takie jak fosforany metali alkalicznych.
Ponadto szczepionka może być zawieszona w fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalniku. Wiadomym jest, że możliwe są inne, znane w dziedzinie sposoby stosowania adiuwantów, dodawania cząsteczek nośnikowych albo rozcieńczalników, emulgowania i stabilizowania polipeptydu.
Szczepionki można podawać odpowiednio w ilościach wahających się w zakresie 1 i 100 mikrogramów, jakkolwiek mogą być zasadniczo stosowane również mniejsze dawki. Dawka przekraczająca 100 mikrogramów będzie, jakkolwiek immunologicznie bardzo odpowiednia, mniej korzystna ze względów handlowych.
Szczepionki oparte na żywych atenuowanych zrekombinowanych nośnikach, takich jak wirusy i bakterie LRC jak opisano powyż ej mogą być podawane w znacznie mniejszych dawkach, ponieważ namnażają się one w czasie infekcji. A zatem, bardzo przydatne ilości będą wahać się miedzy 103 i 109 CFU/PFU dla bakterii i wirusów, odpowiednio.
Można zastosować wiele dróg podawania. Odpowiednią drogą podawania jest podawanie ogólnoustrojowe, na przykład poprzez podawanie szczepionki domięśniowo. Jeżeli stosuje się tę drogę podawania, bardzo odpowiednie są standardowe procedury znane w tej dziedzinie dla podawania ogólnoustrojowego. Bardzo korzystną drogą podawania może być podawanie doustne, ponieważ infekcja jest infekcją przewodu pokarmowego. Korzystną drogą podawania doustnego, znaną i często stosowaną w tej dziedzinie, jest pakowanie szczepionki do kapsułek, które rozpadają się w wysoce zakwaszonym przewodzie pokarmowym. Ponadto, szczepionkę można zmieszać ze związkami znanymi w dziedzinie jak zwiększające przejściowo pH żołądka.
Odpowiednie jest również podawanie ogólnoustrojowe, np. poprzez podawanie domięśniowe szczepionki. Jeżeli stosuje się tę drogę podawania, bardzo odpowiednie są standardowe procedury znane w tej dziedzinie dla podawania ogólnoustrojowego.
Z punktu widzenia ochrony przeciw chorobie, waż na jest szybka i prawidł owa diagnoza infekcji Lawsonia intracellularis. A zatem, innym konieczne jest stosowanie narzędzi diagnostycznych odpowiednich do wykrywania infekcji Lawsonia intracellularis.
Test diagnostyczny do wykrywania Lawsonia intracellularis opiera się na przykład na reakcji bakteryjnego DNA wyizolowanego ze zwierzęcia, które ma być testowane, ze specyficznymi sondami albo starterami PCR w oparciu o sekwencję kodującą genów 19/21 kD, 37 kD i 50 kD. Jeżeli DNA Lawsonia intracellularis jest obecny u zwierzęcia, będzie się on wiązał ze specyficznymi starterami do PCR, a następnie będzie powielany w reakcji PCR. Produkt reakcji PCR można łatwo wykrywać na
PL 205 964 B1 drodze elektroforezy DNA w żelu. DNA można najłatwiej wyizolować z mikroorganizmów obecnych w wymazach pobranych z przewodu pokarmowego zwierząt, które mają być testowane. Standardowe podręczniki do PCR podają metody ustalania długości starterów do wybiórczych reakcji PCR z DNA Lawsonia intracellularis. Często stosowane są startery o sekwencjach nukleotydowych składających się z co najmniej 12 nukleotydów, ale startery o długości ponad 15, korzystniej 18 nukleotydów są z jakiegoś powodu bardziej wybiórcze. W szczególności można stosować startery o długości co najmniej 20, korzystnie co najmniej 30 nukleotydów. Techniki PCR są szeroko opisane w (Dieffenbach i Dreksler; PCR primers, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-5 (1995)).
Sekwencje kwasów nukleinowych kodujące białko Lawsonia intracellularis albo część tych sekwencji kwasów nukleinowych o długości co najmniej 12, korzystnie 15, korzystniej 18, a jeszcze korzystniej 20, 22, 25, 30, 35 lub 40 nukleotydów w tej kolejności preferencji, gdzie sekwencje kwasów nukleinowych albo ich części mają co najmniej 70% homologii z sekwencjami kwasów nukleinowych jak przedstawiono w SEK NR ID: 1 lub 3 są również ujawnione w niniejszym opisie. Umożliwia to szybkie powielenie specyficznych sekwencji nukleotydowych do zastosowania jako narzędzie diagnostyczne, np. do wykrywania Lawsonia w tkankach jak wskazano powyżej.
Inny test w oparciu o DNA polega na hodowaniu materiału bakteryjnego otrzymanego z wymazów, a następnie klasycznym oczyszczaniu, po którym następuje klasyczna hybrydyzacja z wyznakowanymi radioaktywnie albo barwnie fragmentami DNA specyficznymi wobec białek 19/21 kD, 37 kD i 50 kD. Zarówno reakcje PCR, jak i reakcje hybrydyzacji są dobrze znane w tej dziedzinie i są opisane np. w Maniatis/Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6).
Test diagnostyczny do wykrywania DNA Lawsonia intracellularis może zawierać sekwencję kwasu nukleinowego albo jego fragmentu, który jest specyficzny wobec DNA kodującego białko 19/21 kD. Jako fragment, który jest specyficzny wobec tego DNA rozumie się fragment, który w porównywalnych warunkach wiąże się lepiej z DNA Lawsonia intracellularis niż z DNA innych baterii dzięki wyższej homologii z DNA Lawsonia intracellularis, np. starter o długości co najmniej 12 nukleotydów jak opisano poniżej.
Testem diagnostycznym do wykrywania przeciwciał na Lawsonia intracellularis w surowicy może być na przykład prosty standardowy test kanapkowy ELISA, w którym białkiem 19/21 kD, albo jego antygenowymi fragmentami według wynalazku opłaszcza się ścianki studzienek na płytce do ELISA. Sposobem wykrywania takich przeciwciał, jest na przykład inkubacja białka 19/21 kD albo jego antygenowych fragmentów z surowicą ze zwierząt, które mają być testowane, a następnie inkubacja z wyznakowanym przeciwciał em wobec odpowiedniego przeciwciał a ssaczego. Reakcja barwna moż e następnie wykazać obecność albo nieobecność przeciwciał wobec Lawsonia intracellularis. Innym przykładem systemu testu diagnostycznego jest na przykład inkubacja filtrów Western zawierających białko 19/21 kD albo jego antygenowych fragmentów według wynalazku z surowicą ssaków, które mają być testowane, a następnie analiza filtru.
Testy diagnostyczne do wykrywania przeciwciał wobec Lawsonia intracellularis zawierają białko albo ich antygenowe fragmenty według wynalazku.
Test diagnostyczny oparty o wykrywanie materiału antygenowego ze specyficznych dla białka 19/21 kD Lawsonia intracellularis antygenów, a zatem przydatny do wykrywania infekcji Lawsonia intracellularis może stanowić również standardowy test ELISA. W jednym z przykładów takiego testu, ścianki studzienek na płytce do ELISA opłaszcza się przeciwciałami skierowanymi wobec białka 19/21 kD. Po inkubacji z materiałem, który ma być testowany, do studzienek dodaje się wyznakowane przeciwciała anty-Lawsonia intracellularis. Reakcja barwna wykazuje obecność materiału antygennego z Lawsonia intracellularis. Takie testy zawierają przeciwciała wobec białka albo jego fragmentu według wynalazku.
Do wytwarzania przeciwciał, które mogą być poliklonalne, monospecyficzne albo monoklonalne (albo ich pochodnych) można stosować polipeptydy albo fragmenty immunologiczne. Jeżeli pożądane są przeciwciała poliklonalne, techniki do wytwarzania i obróbki poliklonalnych surowic są dobrze znane specjalistom w dziedzinie (np. Mayer i Walter, wyd. Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987)
Przeciwciała monoklonalne wykazujące reakcje wobec polipeptydu można wytworzyć poprzez immunizację wsobnych myszy technikami znanymi w tej dziedzinie (Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).
PL 205 964 B1
Jeszcze inne wykonanie wynalazku dotyczy sposobów wykrywania materiału antygenowego z Lawsonia intracellulars, gdzie sposób ten obejmuje inkubację surowicy, tkanki albo płynów ciała z przeciwciałami wobec białka 19/21 kD, 37 kD lub 50 kD albo jego fragmentu według wynalazku.
W opisie ujawniono sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko Lawsonia intracellulars. Sekwencje te albo części takich sekwencji kwasu nukleinowego mające długość co najmniej 20, korzystnie 25, 30, 35 albo 40 nukleotydów w kolejności preferencji, gdzie sekwencje kwasu nukleinowego albo jego części mają co najmniej 70% homologii z sekwencjami kwasu nukleinowego przedstawionymi w SEK NR ID: 1 lub 3 można zastosować jako startery w reakcji PCR w celu zwiększenia ilości DNA, które są w nich zakodowane. Umożliwia to szybkie powielenie specyficznych sekwencji nukleotydowych do zastosowania jako narzędzie diagnostyczne, np. do wykrywania Lawsonia w tkankach jak wskazano powyżej.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1
Izolowanie L. intracellularis z zainfekowanej krętnicy świni
Krętnice zainfekowane L. intracellularis, co potwierdzono na podstawie histopatologii i szybkiego kwaśnego barwienia Ziehl-Neelsen, pobierano ze świń nieżywych z powodu PE i przechowywano w -80°C. Po rozmrożeniu, bakterie L. intracellularis izolowano ze wyskrobin śluzówkowych pobranych z zainfekowanej ściany jelita. Wyskrobiny krętnicy homogenizowano wielokrotnie w PBS i uniwersalnym mikserze w celu uwolnienia wewnątrzkomórkowej bakterii jak opisano przez Lawson i wsp. (Vet. Microbiol. 10: 303-323 (1985)). Supernatant otrzymany po wirowaniu przy niskiej prędkości w celu usunięcia resztek komórek filtrowano przez filtry 5,0, 3,0, 1,2 i 0,8 μm (Millipore). Filtrat wirowano następnie przy 8000 g przez 30 min, uzyskując mały osad bakterii L. intracellularis. Bakterie te oczyszczano następnie przy zastosowaniu gradientu Percoll. Oczyszczone bakterie identyfikowano poprzez PCR (Jones i wsp., J. Clin. Microbiol. 31: 2611-2615 (1993)) natomiast czystość wyizolowanych bakterii (>95%) testowano poprzez mikroskopię w kontraście fazowym w celu wykrycia obecności jakichkolwiek zanieczyszczających bakterii albo zawartości żołądka.
Otrzymywanie białka błony zewnętrznej L. intracellularis
Białko błony zewnętrznej (OMP) z L. intracellularis oczyszczano zasadniczo jak opisano w Barenkamp i wsp., J. Inf. Dis. 148: 1127 (1983)). Pokrótce, bakterie oczyszczone w gradiencie Percoll rozbijano ultradźwiękami. Fragmenty błony zbierano poprzez różnicowe wirowanie, traktowano Sarkozylem i nierozpuszczalne w Sarkozylu OMP osadzano poprzez ultrawirowanie. Osad rozpuszczano ponownie w 50 mM TRIS/HCl (pH 7.5). OMP rozdzielano na żelu poliakryloamidowym 4-12% BIS/TRIS NuPAGE SDS (NOVEX) zgodnie z opisem producenta (Fig. 1; panel A). W sąsiedniej ścieżce nałożono całkowite białko komórkowe L. intracellularis. Białka barwiono przy zastosowaniu Coomassie Brilliant Blue R250. W preparacie błony zewnętrznej widać wyraźnie wzmocnienie prążków białkowych odpowiadających wielkości 50, 37 i 19/21 kDa w porównaniu do preparatu całych komórek, wskazując, że białka te są OMPs.
Surowica odpornościowa uzyskana wobec oczyszczonego białka błony zewnętrznej i całych komórek oraz po doświadczalnej prowokacji
Surowicę odpornościową wobec całych komórek L. intracellularis i oczyszczonemu OMPs otrzymano w królikach. Królikom wstrzykiwano domięśniowo preparat całych komórek (R291) albo OMP 5 (R279) w n-GNE (woda:olej = 45:55). Próbki krwi zbierano z żyły usznej przed immunizacją. Surowice otrzymywano również ze świni, która była eksperymentalnie prowokowana doustnie oczyszczoną w gradiencie Percoll bakterią i u której rozwinęły się kliniczne objawy i pośmiertne zmiany typowe dla infekcji L. intracellularis (BIG304T4).
Charakterystyka antygenowa białek błony zewnętrznej L. intracellularis
W celu zbadania antygenowości białek OMP L. intracellularis, preparat OMP ładowano na 4-12% BIS/TRIS NuPAGE SDS-PAGE (NOVEX). Po rozdzieleniu białka przenoszono na błonę Immobilon-P PVDF (Millipore) w 0,025 M TRIS/0,192 M glicyna/20% metanol zasadniczo zgodnie z Towbin i wsp. (Natl. Proc. Acad. Sci., 76: 4350-4354 (1979)). Błonę blokowano w 1% odtłuszczonym mleku w proszku w 0,04 M PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (PBST), a następnie inkubowano z króliczą surowicą odpornościową R279 (Fig. 1; panel B) i z króliczą surowicą odpornościową R291 (Fig. 1; panel C) przez 1 godzinę, po czym dwukrotnie płukano PBST. Surowicę króliczą użyto w rozcieńczeniu 500 w 1% odtłuszczonym mleku/PBST. Skoniugowane z HRP kozie anty-królicze immunoglobuliny, rozcieńczone 1:2000, zastosowano do wykrywania króliczych przeciwciał. Produkty wykazujące reakcję z surowicą wykrywano poprzez wzmocnioną chemoluminescencję Enhanced Chemolu10
PL 205 964 B1 minescence (ECL, Amersham) zgodnie z protokołem producenta. Obydwie surowice odpornościowe (R279 i R291) rozpoznawały opisane powyżej białka. Sygnały na poziomie 50 i 37 kDa wzmacniały się najbardziej przy porównywaniu całego białka komórkowego z preparatem OMP, wskazując ponownie, że te dwa białka to OMP.
Sekwencjonowanie białka błony zewnętrznej
Dla celów sekwencjonowania, zawiesinę OMP ładowano na preparatywny żel SDS-PAGE przy użyciu systemu BioRad Protean II zgodnie z instrukcją. Cztery prążki białkowe (19/21, 37 i 50 kD) wycinano z żelu i wysyłano do Eurosequence (Groningen, Holandia) w 4°C. Sekwencja białkowa N-końca i z wyizolowanych peptydów po trawieniu trypsyną całego białka ustalano poprzez automatyczny rozkład Edmana w sekwenartorze Applied Biosystems 120A PTH Sequenator. Otrzymane sekwencje białkowe (Tabela I) użyto do wytworzenia starterów do PCR do amplifikacji kodujących je genów. Z sekwencji białkowych wywnioskowano, że białko 19 kD i 21 kD zasadniczo reprezentuje to samo białko. Różnica w wielkości jest prawdopodobnie skutkiem postranslacyjnej(ych) modyfikacji.
Amplifikacja genów dla białek błony zewnętrznej
W celu powielenia genów dla OMP, genomowy DNA L. intracellulars wyizolowano z bakterii oczyszczonych na gradiencie Percoll przy użyciu QIAGEN Genomic Tip 100 jak opisano przez producenta. Ten DNA użyto następnie w reakcji PCR stosując zdegenerowane startery w oparciu o otrzymane sekwencje białkowe. DNA kodujący białko 50 kD powielono przy zastosowaniu starterów 911 (ggl gtl tgg gaY ttY aa) i 912 (tec cal gcR taR tcY tt). DNA kodujący białko 37 kD powielano przy użyciu starterów 990 (tcR aal gcR aaR ttl acl cc) i 1021 (gcl gaR gtl acl gcl ag) stosując system EXPAND (Boehringer Mannheim) z 2,5 mM MgCl2. Następnie pobierano 1 ml z mieszaniny PCR i stosowano w zagnież dż onej reakcji PCR stosując te same startery. To dało prążki o wielkości 1260 bp i 656 bp dla białek 50 kD i 37 kD, odpowiednio. Produkty PCR wycinano następnie z agarozy i oczyszczano przy użyciu zastawu QIAGEN spinprep kit i klonowano w pCR-TOPO-blunt II (Novagen). Mieszaninę do klonowania transformowano do E. coli TOP10F. Przypuszczalne transformanty przeszukiwano pod kątem wstawki poprzez kolonijny PCR, stosując lewy i prawy starter dla M13. Z przypuszczalnych klonów zawierających plazmid ze wstawką, izolowano plazmidowy DNA przy użyciu zestawu QIAGEN miniprep Kit. Następnie wstawki sekwencjonowano przy użyciu zestawu PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Sequencing Kit (Applied Biosystems) zgodnie z protokołem producenta przy użyciu przedniego i końcowego startera dla M13.
C-końcową część regionu kodującego białko 50 kD powielono przy użyciu PCR z ogonem C stosując starter 923 (tat agc tgt tga tgg tgc tt) w pierwszej reakcji PCR i 936 (ggt gat aat atg ctt tac t) i starter poli-G (ata tgg ggg ggg ggg ggg g) w zagnieżdżonej reakcji PCR. To dało prążek 840 bp, który sklonowano i zsekwencjonowano jak wyżej.
Klonowanie DNA kodującego białko 50 kD w pET24a
Przy użyciu jako matrycy chromosomowego DNA L. intracellulars, powielono DNA kodujący dojrzałą część białka 50 kD stosując startery 967 (gga att cca tat gta ttg att tta agg caa a) i 968 (cgc gga tec gcg ate ctt gat aat tea agg) oraz system EXPAND. Produkt PCR wyizolowano z żelu i przecięto Ndel i BamHI, a następnie poddano ligacji z pET24a przeciętym Ndel i BamHI (Novagen) uzyskując plazmid pP5-a. Teoretycznie, indukcja ekspresji białka 50 kD za pośrednictwem pP5-a powinna dawać białko 50 kD zlokalizowane w cytoplazmie, ponieważ analiza sekwencji białkowej sklonowanego P5 nie doprowadziła do identyfikacji jakiegokolwiek sygnału wydzielania. Dobrze wiadomo, że OMP fałduje się prawidłowo, a zatem jest aktywny jako antygen jedynie wtedy, gdy po ekspresji następuje eksport do jego naturalnego miejsca lokalizacji w błonie zewnętrznej. W celu umożliwienia eksportu białka 50 kD do błony zewnętrznej, zastosowano PCR z zachodzącymi na siebie przedłużeniami przy użyciu starterów 972 (gga att cca tat gaa aat gaa aaa gag cac tct ggc) i 969 (ccg etc gag gaa ttg ata ctt cat att taa) w celu dołączenia sekwencji sygnałowej phoE E. coli na początku białka 50 kD. Konstrukt sklonowano w pCR-TOPO-blunt II. Po identyfikacji prawidłowego klonu poprzez sekwencjonowanie wstawki, wstawkę wycinano z plazmidu pCR-TOPO-blunt II przy użyciu Ndel i XhoI. Fragment DNA poddano następnie ligacji z pET24a przeciętym Ndel i XhoI uzyskując plazmid pP5-f. Starter 969 zaprojektowano tak, aby klonowanie doprowadziło do dodania znacznika 6xHis do końcowej części białka 50 kD.
Nadekspresja białka 50 kD w E. coli BL21 (DE3)
Plazmidy pP5-a i pP5-f transformowano do BL21 (DE3). Otrzymane szczepy BL21P5-a i BL21-P5-f po hodowaniu przez noc na wytrząsarce orbitalnej (180 rpm) w 37°C rozcieńczano 1:100 w 5 ml świeżej pożywki LB. Po 3 godzinach hodowli polimerazę RNA T7 indukowano 50 μΜ izopropylotiogaPL 205 964 B1 laktozydem (IPTG) i hodowlę kontynuowano przez 3 godziny. Komórki zbierano poprzez wirowanie i próbki nakładano z odpowiednimi kontrolami na dwa żele poliakryloamidowe 4-12% BIS/TRIS NuPAGE SDS (NOVEX) zgodnie z opisem producenta. Pierwszy żel barwiono błękitem Coomassie brilliant blue 250R (Fig. 2; panel A). Drugi żel użyto do analizy Western. Filtr inkubowano z surowicą ze świni (BIG304T4; Fig. 2; panel B). Po indukcji pojawił się dodatkowy prążek w szczepie BL21-P5-a (ścieżka 2) i BL21 P5-f (ścieżka 3), którego brak w kontroli negatywnej (ścieżka 5). Białko wytworzone w szczepie BL21-P5-f wędrowało jako białko o wyższej masie cząsteczkowej niż natywne białko natywne białko 50 kD (ścieżka 4) prawdopodobnie na skutek obecności C-końcowego znacznika His.
T a b e l a 1. Otrzymane sekwencje białkowe
Białko Peptyd Sekwencja
19 kD Wewnętrzny AAYEYLVMLGVN
Wewnętrzny PFYVMVW
Wewnętrzny GTQEYNLALGER
21 kD Wewnętrzny AAYEYLVMLGVN
Wewnętrzny PFYVMVW
Wewnętrzny GTQEYNLALGER
37 kD N-końcowy AEVTASCTKRVG
Wewnętrzny SDLEIFGR
Wewnętrzny GVNFAFDSFALDDTAK
50 kD N-końcowy IDFKAKGWDFN
Wewnętrzny KDYAWEYDFDT
Legendy do Figur
Fig. 1. Elektroforeza SDS-PAGE i testy immunologiczne dla całych komórek L. intracellularis i preparatów biał kowych z zewnę trznej bł ony komórkowej L. intracellularis inkubowanych z króliczymi surowicami odpornościowymi. Ścieżki: 1, barwny wskaźnik wielkości Prestained Precision Markers (BioRad); 2, całkowity ekstrakt komórkowy L. intracellularis; 3, preparat zewnętrznej błony komórkowej L. intracellularis. Panel; A: uwidocznienie białek błękitem Coomassie brilliant blue, B: filtr inkubowany z surowicą uzyskaną wobec oczyszczonych białek błony zewnętrznej (R279); C, filtr inkubowany z surowicą uzyskaną wobec cał ych komórek (R291). Biał ka 19/21 kD, 37 kD i 50 kD są oznaczone jako P1/P2, P4 i P5, odpowiednio.
Fig. 2. Nadekspresja białka 50 kD. Nadekspresję białka uzyskano w BL21 (DE3) zawierającej różne pochodzące od pET24a konstrukty jak opisano w tekście. Całkowite ekstrakty komórkowe rozdzielano poprzez SDS-PAGE i albo barwiono błękitem Coomassie brilliant blue (Panel A) albo przenoszono na filtr Immobilon-P PVDF i inkubowano z surowicą odpornościową otrzymana z eksperymentalnie zainfekowanych świń (Panel B). Ścieżka 1: prążek 45 KDa w barwnym wskaźniku wielkości Prestained Precision Marker (BioRad); ścieżka 2: BL21-P5-a; ścieżka 3: BL21-P5-f; ścieżka 4: oczyszczone białka zewnętrznej błony komórkowej L. intracellularis (widoczne jedynie białko 50 kD); ścieżka 5: niezaindukowany BL21-P5-a.
PL 205 964 B1
Lista sekwencji <110> AKZO Nobel N.V.
<120> Szczepionka przeciw Lawsonia intracellularis <13 o > szczepionka przeciw Lawsonia intracellularis <140>
<141>
<160> 20 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 656 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <220>
<221> CDS <222> (1)..(654} <400> 1
gcg gag gtg acg Thr gcg Ala 5 agt tgt act aaa cgt gtt gaa agc Ser tat aat tat 48
Ala 1 Glu Val Ser cys Thr Lys Arg 10 Val Glu Tyr Asn 15 Tyr
ctt gtg gat tat tca ggc tct atg atg atg aaa cat gtt gćt gtt aga 96
Leu Val Asp Tyr Ser Gly Ser Met Met Met Lys His Val Ala Val Arg
20 25 30
gag aaa ata gaa tta gca aaa gaa gct ata tta aaa att aat gcg 144
Glu Pro Lys Ile Glu Leu Ala Lys Glu Ala Ile Leu Lys Ile Asn Ala
35 40 45
gca atg cct aaa atg tca tat caa ggt gga tta tat act ttt gca cct 192
Ala Met Pro Lys Met Ser Tyr Gin Gly Gly Leu Tyr Thr Phe Ala Pro
50 55 60
tat tct gta att att ccc caa ggt tct tgg aat tca tgt gtt gcc gaa 240
Tyr Ser Val Ile Ile Pro Gin Gly Ser Trp Asn Ser Cys Val Ala Glu
65 70 75 80
tgt gcg gtt aat aca att aag tct gat tta gaa att ttt ggt cgt ctt 288
Cys Ala Val Asn Thr Ile Lys Ser Asp Leu Glu Ile Phe Gly Arg Leu
85 90 95
PL 205 964 B1
act Thr cct Pro gtg Val gga Gly 100 gac Asp ggc Gly ata Ile aaa Lys atg Met 105 cat His gaa Glu aca Thr gtc Val att Ile 110 aat Asn caa Gin
atg ccc cct cag gca gcc gtt att ctt ctc act gat ggt cat aat aat
Met Pro Pro Gin Ala Ala Val Ile Leu Leu Thr Asp Gly His Asn Asn
115 120 125
tta ggg atg aat cct gtt gag gaa gta aaa tet ata tat caa aca aat
Leu Gly Met Asn Pro Val Glu Glu Val Lys Ser Ile Tyr Gin Thr Asn
130 135 140
cct aat gtt tgt ttt cat gta gtt tea ttt gca gat gat get gaa ggc
Pro Asn Val Cys Phe His Val Val Ser Phe Ala Asp Asp Ala Glu Gly
145 150 155 160
aaa gca ata att gat caa att gtt gca ctt aat agt gga agt gtt ctt
Lys Ala Ile Ile Asp Gin Ile Val Ala Leu Asn Ser Gly Ser Val Leu
165 170 175
gtt gat ggt tta cag ctt eta caa aat cct get gtt tgc caa gaa ttt
Val Asp Gly Leu Gin Leu Leu Gin Asn Pro Ala Val Cys Gin Glu Phe
180 185 190
gtt aat agt gtt ttt tgt caa gag caa att ctt gtt aca gaa gaa gtt
Val Asn Ser Val Phe Cys Gin Glu Gin Ile Leu Val Thr Glu Glu Val
195 200 205
gtt gta ctt cgt ggc gtc aac ttt gcc ttc ga
Val Val Leu Arg Gly Val Asn Phe Ala Phe
210 215
<210> 2 <211> 218 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 2
Ala Glu Val Thr Ala Ser Cys Thr Lys Arg Val Glu Ser Tyr Asn Tyr 15 10 15
Leu Val Asp Tyr Ser Gly Ser Met Met Met Lys His Val Ala Val Arg 20 25 30
Glu Pro Lys Ile Glu Leu Ala Lys Glu Ala Ile Leu Lys Ile Asn Ala 35 40 45
PL 205 964 B1
Ala Met 50 Pro Lys Met Ser Tyr 55 Gin Gly Gly Leu Tyr 60 Thr Phe Ala Pro
Tyr Ser Val Ile Ile Pro Gin Gly Ser Trp Asn Ser Cys Val Ala Glu
65 70 75 80
Cys Ala Val Asn Thr Ile Lys Ser Asp Leu Glu Ile Phe Gly Arg Leu
85 90 95
Thr Pro Val Gly Asp Gly Ile Lys Met His Glu Thr Val Ile Asn Gin
100 105 110
Met Pro Pro Gin Ala Ala Val Ile Leu Leu Thr Asp Gly His Asn Asn
115 120 125
Leu Gly Met Asn Pro Val Glu Glu Val Lys Ser Ile Tyr Gin Thr Asn
130 135 140
Pro Asn Val Cys Phe His Val Val Ser Phe Ala Asp Asp Ala Glu Gly
145 150 155 160
Lys Ala Ile Ile Asp Gin Ile Val Ala Leu Asn Ser Gly Ser Val Leu
165 170 175
Val Asp Gly Leu Gin Leu Leu Gin Asn Pro Ala Val Cys Gin Glu Phe
180 185 190
Val Asn Ser Val Phe Cys Gin Glu Gin Ile Leu Val Thr Glu Glu Val
195 200 205
Val Val Leu Arg Gly Val Asn Phe Ala Phe
210 215
<210> 3 <211> 1428 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <220>
<221> CDS <222> (1)..(1425) <400> 3 gct att gat ttt aag gca aag ggg gtg tgg gac ttc aat ttt gag tgg 48
Ala Ile Asp Phe Lys Ala Lys Gly Val Trp Asp Phe Asn Phe Glu Trp
PL 205 964 B1
1 5 10 15
caa caa tct agt ttt atg aag ggc gat gga gat caa cgt ttt teg cct 96
Gin Gin Ser Ser 20 Phe Met Lys Gly Asp 25 Gly Asp Gin Arg Phe 30 Ser Pro
aaa caa cgt tta cgt act caa ata gac att gtt gca tca gag agt ctt 144
Lys Gin Arg 35 Leu Arg Thr Gin Ile 40 Asp Ile Val Ala Ser 45 Glu Ser Leu
aag ggt gtt gta ttc ttt gaa tta ggt aag act atc tgg gga cgt ggt 192
Lys Gly 50 Val Val Phe Phe Glu 55 Leu Gly Lys Thr Ile 60 Trp Gly Arg Gly
gtt gat ggt gct tct att gga aca gat ggt aaa aat gtt ata aag ctc 240
Val 65 Asp Gly Ala Ser Ile 70 Gly Thr Asp Gly Lys 75 Asn Val Ile Lys Leu 80
cgt tat tcc tat gtt gat tgg gtt att cct tac aca gat gtg caa gtc 288
Arg Tyr Ser Tyr Val 85 Asp Trp Val Ile Pro 90 Tyr Thr Asp Val Gin 95 Val
cgt atg ggt tta caa cct tat gtc ctt cca gga ttt gtt gca ggt tct 336
Arg Met Gly Leu 100 Gin Pro Tyr Val Leu 105 Pro Gly Phe Val Ala 110 Gly Ser
aca ata tta gat gct gat gga gca ggt gtt act gtt tct gct gta ttt 384
Thr Ile Leu 115 Asp Ala Asp Gly Ala 120 Gly Val Thr Val Ser 125 Ala Val Phe
aat gat tat tta ggt gct aca gct ttc tgg atg cgt gca ttg cat aaa 432
Asn Asp 130 Tyr Leu Gly Ala Thr 135 Ala Phe Trp Met Arg 140 Ala Leu His Lys
aac tat gat agt aat tat gga ata tca aag eta cct aac ttt aaa ggt 480
Asn 145 Tyr Asp Ser Asn Tyr 150 Gly Ile Ser Lys Leu 155 Pro Asn Phe Lys Gly 160
aca aca tta gat gta gtt gga tta act att cct gta aca ata tct gat 528
Thr Thr Leu Asp Val 165 Val Gly Leu Thr Ile 170 Pro Val Thr Ile Ser 175 Asp
ata aaa att gct cca tgg ggt atg ttt gct ttt gca ggt aag aag agc 576
Ile Lys Ile Ala 180 Pro Trp Gly Met Phe 185 Ala Phe Ala Gly Lys 190 Lys Ser
tta tta ggg gaa agc tat gga gat att gaa gat gta aga gca ggt ctt 624
Leu Leu Gly Glu Ser Tyr Gly Asp Ile Glu Asp Val Arg Ala Gly Leu
PL 205 964 B1
195 200 205
tta Leu cca Pro 210 gca Ala atg Met cca Pro gca Ala gga Gly 215 ttt Phe gga Gly tat Tyr age Ser tgg Trp 220 gga Gly gct Ala ggt Gly aat Asn 672
cca ttt gga gat gtt ttt cca aat aaa aag cgt ggt aat gca tgg tgg 720
Pro 225 Phe Gly Asp Val Phe 230 Pro Asn Lys Lys Arg 235 Gly Asn Ala Trp Trp 240
gtt ggt tta tca gct gaa ctt gct ggc tca agt cct ttg cat ata gct 768
Val Gly Leu Ser Ala 245 Glu Leu Ala Gly Ser 250 Ser Pro Leu His Ile 255 Ala
gtt gat ggt gct tat gga ega gca gac tta gga agt ctt aga aat gtt 816
Val Asp Gly Ala 260 Tyr Gly Arg Ala Asp 265 Leu Gly Ser Leu Arg 270 Asn Val
gtt att ggt gac ttc tta eta gat aag att gat tta aaa cgt caa ggt 864
Val Ile Gly 275 Asp Phe Leu Leu Asp 280 Lys Ile Asp Leu Lys 285 Arg Gin Gly
tgg tat gca gca tta tta gca gaa tat aaa ttt gaa tat gta act cca 912
Trp Tyr 290 Ala Ala Leu Leu Ala 295 Glu Tyr Lys Phe Glu 300 Tyr Val Thr Pro
ggg gtt ata ggt tgg tat gcc tca gga gat aaa gtt gat tca cgt ggc 960
Gly 305 Val Ile Gly Trp Tyr 310 Ala Ser Gly Asp Lys 315 Val Asp Ser Arg Gly 320
gcc tct aaa aga ata cca aca tta gtt gga aac tgg tca gca aca agt 1008
Ala Ser Lys Arg Ile 325 Pro Thr Leu Val Gly 330 Asn Trp Ser Ala Thr 335 Ser
ttt gga tat agt gga gcc tat ggt ata ggc aaa gat tct gtt ttt gga 1056
Phe Gly Tyr Ser 340 Gly Ala Tyr Gly Ile 345 Gly Lys Asp Ser Val 350 Phe Gly
aat act att gct ggc tca tgg ggt gtt gta gtt cag ttg aaa gat att 1104
Asn Thr Ile 355 Ala Gly Ser Trp Gly 360 Val Val Val Gin Leu 365 Lys Asp Ile
tct ttc tta gaa aat eta act cat gtt atc cgt gga gct aga att cag 1152
Ser Phe 370 Leu Glu Asn Leu Thr 375 His Val Ile Arg Gly 380 Ala Arg Ile Gin
ggt aca aat aat aaa gac gtt cct gaa cac tta ggt tta tca tac gtt 1200
Gly Thr Asn Asn Lys Asp Val Pro Glu His Leu Gly Leu Ser Tyr Val
PL 205 964 B1
385 390 395 400
act acc att tat gac aca cgt ggt ggt gat aat atg ctt tac tta aca 1248
Thr Thr Ile Tyr Asp Thr Arg Gly Gly Asp Asn Met Leu Tyr Leu Thr
405 410 415
aag aaa gat tat gct tgg gaa gta gat ttt gat act gaa tat aaa atc 1296
Lys Lys Asp Tyr Ala Trp Glu Val Asp Phe Asp Thr Glu Tyr Lys Ile
420 425 430
tat aaa gac tta agt gta gct ctt gaa ctg tea tat att cgt ctt gaa 1344
Tyr Lys Asp Leu Ser Val Ala Leu Glu Leu Ser Tyr Ile Arg Leu Glu
435 440 445
ctt gat aaa aaa eta tgg aac ctt caa aga gaa gtt gat aag aat gee 1392
Leu Asp Lys Lys Leu Trp Asn Leu Gin Arg Glu Val Asp Lys Asn Ala
450 455 460
tat cgt gct ggt tta aat atg aag tat caa ttc taa 1428
Tyr Arg Ala Gly Leu Asn Met Lys Tyr Gin Phe
465 470 475 <210> 4
<211> 475 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis
<400> 4
Ala Ile Asp Phe Lys Ala Lys Gly Val Trp Asp Phe Asn Phe Glu Trp
1 5 10 15
Gin Gin Ser Ser Phe Met Lys Gly Asp Gly Asp Gin Arg Phe Ser Pro
20 25 30
Lys Gin Arg Leu Arg Thr Gin Ile Asp Ile Val Ala Ser Glu Ser Leu
35 40 45
Lys Gly Val Val Phe Phe Glu Leu Gly Lys Thr Ile Trp Gly Arg Gly
50 55 60
Val Asp Gly Ala Ser Ile Gly Thr Asp Gly Lys Asn Val Ile Lys Leu
65 70 75 80
Arg Tyr Ser Tyr Val Asp Trp Val Ile Pro Tyr Thr Asp Val Gin Val
85 90 95
Arg Met Gly Leu Gin Pro Tyr Val Leu Pro Gly Phe Val Ala Gly Ser
PL 205 964 B1
100
Thr Ile Leu Asp Ala Asp Gly Ala 115 120
Asn Asp Tyr Leu Gly Ala Thr Ala 130 135
Asn Tyr Asp Ser Asn Tyr Gly Ile 145 150
Thr Thr Leu Asp Val Val Gly Leu 165
Ile Lys Ile Ala Pro Trp Gly Met 180
Leu Leu Gly Glu Ser Tyr Gly Asp 195 200
Leu Pro Ala Met Pro Ala Gly Phe 210 215
Pro Phe Gly Asp Val Phe Pro Asn 225 230
Val Gly Leu Ser Ala Glu Leu Ala 245
Val Asp Gly Ala Tyr Gly Arg Ala 260
Val Ile Gly Asp Phe Leu Leu Asp 275 280
Trp Tyr Ala Ala Leu Leu Ala Glu 290 295
Gly Val Ile Gly Trp Tyr Ala Ser 305 310
Ala Ser Lys Arg Ile Pro Thr Leu 325
Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Tyr Gly 340
Asn Thr Ile Ala Gly Ser Trp Gly
105 110
Gly Val Thr Val Ser Ala Val Phe 125
Phe Trp Met Arg Ala Leu His Lys 140
Ser Lys Leu Pro Asn Phe Lys Gly 155 160
Thr Ile Pro Val Thr Ile Ser Asp 170 175
Phe Ala Phe Ala Gly Lys Lys Ser 185 190
Ile Glu Asp Val Arg Ala Gly Leu 205
Gly Tyr Ser Trp Gly Ala Gly Asn 220
Lys Lys Arg Gly Asn Ala Trp Trp 235 240
Gly Ser Ser Pro Leu His Ile Ala 250 255
Asp Leu Gly Ser Leu Arg Asn Val 265 270
Lys Ile Asp Leu Lys Arg Gin Gly 285
Tyr Lys Phe Glu Tyr Val Thr Pro 300
Gly Asp Lys Val Asp Ser Arg Gly 315 320
Val Gly Asn Trp Ser Ala Thr Ser 330 335
Ile Gly Lys Asp Ser Val Phe Gly 345 350
Val Val Val Gin Leu Lys Asp Ile
PL 205 964 B1
355 360 365
Ser Phe Leu Glu Asn Leu Thr His Val Ile Arg Gly Ala Arg Ile Gin
370 375 380
Gly Thr Asn Asn Lys Asp Val Pro Glu His Leu Gly Leu Ser Tyr Val
385 390 395 400
Thr Thr Ile Tyr Asp Thr Arg Gly Gly Asp Asn Met Leu Tyr Leu Thr
405 410 415
Lys Lys Asp Tyr Ala Trp Glu Val Asp Phe Asp Thr Glu Tyr Lys Ile
420 425 430
Tyr Lys Asp Leu Ser Val Ala Leu Glu Leu Ser Tyr Ile Arg Leu Glu
435 440 445
Leu Asp Lys Lys Leu Trp Asn Leu Gin Arg Glu Val Asp Lys Asn Ala
450 455 460
Tyr Arg Ala Gly Leu Asn Met Lys Tyr Gin Phe
465 470 475 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 5
Ala Ala Tyr Glu Tyr Leu Val Met Leu Gly Val Asn 15 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 6 \
Gly Thr Gin Glu Tyr Asn Leu Ala Leu Gly Glu Arg 15 10 <210> 7
PL 205 964 B1 <211> 11 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 7
Pro Phe Tyr Val Met Val Trp Thr Pro Arg Arg 15 10 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <400> 8 tatagctgtt gatggtgctt <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <400> 9 ggtgataata tgctttact <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <400> 10 atatgggggg ggggggggg <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <400> 11 ggaattccat atgtattgat tttaaggcaa a <210> 12 <211> 30
PL 205 964 B1 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <400> 12 cgcggatccg cgatccttga taattcaagg <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <400> 13 ggaattccat atgaaaatga aaaagagcac tctggc <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <400> 14 ccgctcgagg aattgatact tcatatttaa <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 15
Ala Glu Val Thr Ala Ser Cys Thr Lys Arg Val Gly 15 10 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 16
Gly Val Asn Phe Ala Phe Asp Ser Phe Ala Leu Asp Asp Thr Ala Lys 15 10 15 <210> 17
PL 205 964 B1 <211> 12 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 17
Ile Asp Phe Lys Ala Lys Gly Val Trp Asp Phe Asn 15 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 18
Lys Asp Tyr Ala Trp Glu Val Asp Phe Asp Thr 15 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 19
Ala Ala Tyr Glu Tyr Leu Val Met Leu Gly Val Asn 15 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 20
Gly Thr Gin Glu Tyr Asn Leu Ala Leu Gly Glu Arg 15 10
PL 205 964 B1

Claims (5)

1. Białko błony zewnętrznej Lawsonia intracellularis o masie cząsteczkowej 19/21 kD, znamienne tym, że można je otrzymać w procesie obejmującym etapy
a) obróbki preparatu błony zewnętrznej na SDS-PAGE b) wycięcia z żelu prążka 19 albo 21 kD albo immunogenny fragment tego białka.
2. Białko Lawsonia intracellularis według zastrz. 1, znamienne tym, że ma N-końcową sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 70% homologiczna z sekwencją aminokwasową jak przedstawiona w SEK NR ID: 5, wewnętrzną sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 70% homologiczna z sekwencję aminokwasową jak przedstawiona w SEK NR ID: 6 albo wewnętrzną sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 70% homologiczna z sekwencją aminokwasową jak przedstawiona w SEK NR ID: 7 albo immunogenny fragment tego białka.
3. Białko Lawsonia intracellularis według zastrz. 2, znamienne tym, że wykazuje homologię sekwencji wynoszącą co najmniej 80%, korzystnie 90%, a korzystniej 95% z sekwencją aminokwasową jak przedstawiona w SEK NR ID: 5, 6 albo 7 albo immunogenne fragmenty tego białka.
4. Białko Lawsonia intracellularis jak określone w zastrz. 1-3 do zastosowania w szczepionce.
5. Zastosowanie białka Lawsonia intracellularis określonego w zastrz. 1-3 do wytwarzania szczepionki do zwalczania infekcji Lawsonia intracellularis.
PL351277A 2000-12-20 2001-12-19 Białko błony zewnętrznej Lawsonia intracellularis i jego zastosowanie PL205964B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00204660 2000-12-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL351277A1 PL351277A1 (en) 2002-07-01
PL205964B1 true PL205964B1 (pl) 2010-06-30

Family

ID=8172486

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL351277A PL205964B1 (pl) 2000-12-20 2001-12-19 Białko błony zewnętrznej Lawsonia intracellularis i jego zastosowanie

Country Status (12)

Country Link
US (2) US6921536B2 (pl)
EP (2) EP1586646B1 (pl)
JP (1) JP4237960B2 (pl)
AT (2) ATE501258T1 (pl)
AU (1) AU783210B2 (pl)
CA (1) CA2365494A1 (pl)
DE (2) DE60144201D1 (pl)
DK (2) DK1586646T3 (pl)
ES (2) ES2360225T3 (pl)
HU (1) HUP0105379A3 (pl)
PL (1) PL205964B1 (pl)
PT (1) PT1219711E (pl)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2360225T3 (es) * 2000-12-20 2011-06-02 Intervet International Bv Vacuna contra lawsonia intracellularis.
EP1514927B1 (en) 2002-05-29 2010-05-19 Yamasa Corporation Method for producing nucleoside diphosphate using polyphosphate: amp phosphotransferase
CA2536989A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-24 Akzo Nobel N.V. Lawsonia intracellularis subunit vaccine
CA2554472A1 (en) 2004-01-22 2005-08-04 Intervet International B.V. Lawsonia intracellularis subunit vaccines
EP1609870A1 (en) * 2004-06-24 2005-12-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method of diagnosing lawsonia intracellularis
MY146476A (en) 2004-06-24 2012-08-15 Boehringer Ingelheim Vetmed Method of diagnosing lawsonia intracellularis
AU2005308583A1 (en) * 2004-11-24 2006-06-01 Pharmacia & Upjohn Company Llc Methods for cultivating Lawsonia intracellularis
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
EP1874804A4 (en) * 2005-04-18 2009-05-20 Boehringer Ingelheim Vetmed A LAWSONIA PROTEIN SUITABLE AS A COMPONENT OF A SUBUNIT VACCINE, AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
US8398994B2 (en) 2005-07-15 2013-03-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia vaccine and methods of use thereof
US8470336B2 (en) 2006-05-25 2013-06-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of young animals against Lawsonia intracellularis infections
US20080241190A1 (en) * 2006-11-13 2008-10-02 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of horses against lawsonia intracellularis
EP2859900A1 (en) 2006-12-11 2015-04-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
WO2009037262A2 (en) 2007-09-17 2009-03-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of preventing early lawsonia intracellularis infections
TWI551295B (zh) 2008-04-18 2016-10-01 英特威特國際股份有限公司 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）用疫苗
TWI449533B (zh) * 2008-04-18 2014-08-21 Intervet Int Bv 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗
US8557254B2 (en) * 2008-07-22 2013-10-15 Intervet Inc. Lawsonia intracellularis bacterium of a novel serotype, vaccine based on that bacterium, antibodies suitable for diagnosing the novel Lawsonia intracellularis serotype and hybridomas for producing the said antibodies
KR101837768B1 (ko) 2011-05-25 2018-03-12 건국대학교 산학협력단 돼지 증식성 회장염을 진단하기 위한 단백질 및 그 응용
US20140017268A1 (en) * 2012-06-05 2014-01-16 Regents Of The University Of Minnesota Composition and Methods for Detecting or Preventing Lawsonia intracellularis Infections
US10751405B2 (en) 2015-02-04 2020-08-25 Intervet Inc. Vaccine for use against subclinical Lawsonia infection in a pig
ES2798282T3 (es) 2015-02-04 2020-12-10 Intervet Int Bv Una vacuna para usar contra la infección asintomática por Lawsonia en un cerdo
RU2744193C2 (ru) * 2015-10-16 2021-03-03 Канзас Стейт Юниверсити Рисерч Фаундейшн Иммуногенные композиции для иммунизации свиней против цирковируса типа 3 и способы их получения и применения
CL2017002196A1 (es) * 2017-08-30 2017-11-17 Univ De Concepción Vacuna recombinante contra enteropatía proliferativa en animales.
CN113528683A (zh) * 2021-07-09 2021-10-22 南京农业大学 一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量pcr引物对、试剂盒及检测方法
CN120559226A (zh) * 2025-06-26 2025-08-29 杭州缇牧生物科技有限公司 猪胞内劳森菌抗体检测试纸及其应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4310993A (en) 1980-01-07 1982-01-19 Louvers & Dampers, Inc. Louver assembly
ES2056565T3 (es) 1990-07-30 1994-10-01 Akzo Nobel Nv Virus recombinante de la enfermedad de marek.
WO1993004163A1 (en) 1991-08-23 1993-03-04 Massachusetts Institute Of Technology Strain of chlamydia
US5610059A (en) 1992-11-09 1997-03-11 University Of Arizona Etiological agent for porcine enteritis
FR2714074B1 (fr) 1993-12-20 1996-03-01 Pasteur Institut Promoteurs des gènes GRA1, GRA2, GRA5 et GRA6 de toxoplasma gondii et vecteurs d'expression comprenant lesdits promoteurs.
US5885823A (en) 1995-06-05 1999-03-23 Nobl Laboratories, Inc. Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
US5714375A (en) 1995-06-05 1998-02-03 Nobl Laboratories, Inc. Ileal symbiont intracellularis propagation in suspended host cells
ATE329031T1 (de) * 1995-11-30 2006-06-15 Agriculture Victoria Serv Pty Therapeutische zusammensetzungen zur behandlung von lawsonia intracellularis infektionen
JP2003501013A (ja) 1999-05-13 2003-01-14 ファイザー プロダクツ インコーポレーティッド ローソニア由来の遺伝子及び関連ＳｏｄＣポリペプチド、ぺプチド及びタンパク質並びにそれらの使用
JP2003516113A (ja) 1999-05-13 2003-05-13 ファイザー プロダクツ インコーポレーティッド ローソニア由来の遺伝子及び関連ＦｌｇＥポリペプチド、ぺプチド及びタンパク質並びにそれらの使用
MXPA01011570A (es) * 1999-05-13 2003-08-20 Australian Pork Ltd Gen derivado de lawsonia y polipeptidos, peptidos y proteinas relacionadas con peptido h de membrana externa.
CA2372105A1 (en) 1999-05-13 2000-11-23 Pfizer Products Inc. Lawsonia derived gene and related hemolysin polypeptides, peptides and proteins and their uses
EP1094070A3 (en) 1999-10-22 2002-01-09 Pfizer Products Inc. Lawsonia intracellularis proteins, and related methods and materials
US6605696B1 (en) * 1999-10-22 2003-08-12 Pfizer, Inc. Lawsonia intracellularis proteins, and related methods and materials
ES2360225T3 (es) * 2000-12-20 2011-06-02 Intervet International Bv Vacuna contra lawsonia intracellularis.

Also Published As

Publication number Publication date
US20050250150A1 (en) 2005-11-10
HUP0105379A3 (en) 2004-07-28
EP1219711A3 (en) 2002-11-06
HU0105379D0 (en) 2002-02-28
AU9737101A (en) 2002-06-27
ES2360225T3 (es) 2011-06-02
CA2365494A1 (en) 2002-06-20
US7491401B2 (en) 2009-02-17
PL351277A1 (en) 2002-07-01
ATE501258T1 (de) 2011-03-15
ATE330013T1 (de) 2006-07-15
EP1219711B1 (en) 2006-06-14
JP4237960B2 (ja) 2009-03-11
US20050069559A1 (en) 2005-03-31
EP1586646B1 (en) 2011-03-09
EP1219711A2 (en) 2002-07-03
DK1219711T3 (da) 2006-09-25
AU783210B2 (en) 2005-10-06
DK1586646T3 (da) 2011-06-27
EP1586646A3 (en) 2007-08-01
DE60120621T2 (de) 2006-12-14
EP1586646A2 (en) 2005-10-19
DE60144201D1 (de) 2011-04-21
HUP0105379A2 (hu) 2003-01-28
US6921536B2 (en) 2005-07-26
JP2003000276A (ja) 2003-01-07
ES2266090T3 (es) 2007-03-01
PT1219711E (pt) 2006-10-31
DE60120621D1 (de) 2006-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1586646B1 (en) Lawsonia intracellularis vaccine
US8025884B2 (en) Lawsonia intracellularis subunit vaccines
US7662390B2 (en) Lawsonia intracellularis subunit vaccine
US20070212373A1 (en) Lawsonia Intracellularis 26 Kd Subunit Vaccine
EP1238983A1 (en) &#34;Babesia canis vaccine&#34;
US7479284B2 (en) Babesia canis vaccine
AU2004297018A1 (en) Lawsonia intracellularis 26 KD subunit vaccine
MXPA06006282A (en) Lawsonia intracellularis 26 kd subunit vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20111219