PL207462B1

PL207462B1 - Zastosowanie związku trifenyloalkenowego

Info

Publication number: PL207462B1
Application number: PL344000A
Authority: PL
Inventors: Mitchell S. Steiner; Sharon Raghow
Original assignee: Univ Tennessee Res Corp
Priority date: 1998-05-07
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2010-12-31
Also published as: AU761435B2; CZ300960B6; NO20005625D0; CZ20004118A3; EA200000100A1; ATE283043T1; JP2002513755A; IL193231A0; PT1003496E; JP4482229B2; CA2323809C; HUP0102068A3; JP2008163048A; PL344000A1; BG105022A; TR200003269T2; EP1475087A2; DE69922131D1; IL138437A; NO20005625L

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest nowe zastosowanie związku trifenyloalkenowego o wzorze I do leczenia lub zapobiegania nowotworzenia śródnabłonkowego prostaty (PIN).

Tło wynalazku

Rak prostaty jest jednym z najczęściej występujących nowotworów wśród mężczyzn w Stanach Zjednoczonych, z setkami tysięcy nowych przypadków diagnozowanych każdego roku. Niestety ustalono, że ponad sześćdziesiąt procent nowo diagnozowanych przypadków raka prostaty jest zaawansowane patologicznie, bez możliwości wyleczenia i z niepomyślną prognozą. Jedno z podejść do tego problemu polega na wcześniejszym zdiagnozowaniu raka prostaty poprzez programy przesiewowe, a dzię ki temu zmniejszenia liczby chorych z zaawansowanym rakiem prostaty. Inna strategia polega jednak na opracowaniu leków zapobiegających rakowi prostaty. Jedna trzecia wszystkich mężczyzn w wieku powyżej 50 lat ma utajoną postać raka prostaty, który może zaktywować się w postać kliniczną raka prostaty zagrażającego życiu. Wykazano, że częstość występowania utajonych nowotworów prostaty zwiększa się znacznie z każdą dekadą życia od 50 (5,3-14%) do 90 lat (40-80%). Liczba mężczyzn z utajonym rakiem prostaty jest taka sama we wszystkich grupach kulturowych, grupach etnicznych i rasach, przy czym jednak częstość raka klinicznie agresywnego jest wyraźnie różna, co sugeruje, że czynniki środowiskowe mogą odgrywać pewną rolę przy uaktywnianiu się utajonego raka prostaty.

Z powodu wysokiej zachorowalnoś ci i ś miertelnoś ci w wyniku raka prostaty nakazem chwili jest opracowanie strategii zapobiegania tej chorobie z użyciem związków chemicznych.

Poznanie czynników, które przyczyniają się do powstawania raka prostaty, w tym rozpoczęcie procesu nowotworzenia, jego rozwój i postęp raka prostaty, może dostarczyć podstaw do analizy zjawisk i procesów molekularnych, jakie mogą być odpowiednie obszary interwencji, w celu zapobieżenia albo zatrzymania procesu rakotwórczego. Nowe, innowacyjne podejścia są pilnie potrzebne zarówno na poziomie nauk podstawowych, jaki i w zastosowaniu klinicznym, umożliwiające zmniejszenie zachorowalności na raka prostaty, jak również zatrzymanie albo cofnięcie się rozwoju utajonego raka prostaty. Ponieważ częstość wystąpień raka prostaty dramatycznie się zwiększa w wieku, w którym mężczyźni ulegają również innym chorobom prowadzącym do zwiększonej śmiertelności, to spowolnienie postępu gruczolakoraka prostaty może stanowić zarówno bardziej odpowiednią, jak i mniej kosztowną strategią opieki zdrowotnej.

Podejmowano wiele różnych kierunków badań do zapobiegania rakowi prostaty przez podawanie związków chemicznych. Greenwald w „Expanding Horizons in Breast and Prostate Cancer Prevention and Early Detection, J. Cancer Education, 1993, tom 8, nr 2, strony 91-107, omawia badanie inhibitorów Sa-reduktazy, takiej jak finasteryd, do zapobiegania nowotworom prostaty. Brawley i wsp. w „Chemoprevention of Prostate Cancer, Urology, 1994, tom 43, nr 5, także omawia inhibitory Sa-reduktazy, jak również difluorometyloornitynę i retynoidy jako potencjalne chemiczne środki zapobiegawcze.

Kelloff i wsp. w „Introductory Remarks; Development of Chemopreventive Agents for Prostate Cancer, Journal of Cellular Biochemistry, 1992, Supplement 16H: 1-8, opisuje badania przedkliniczne Narodowego Instytutu Zdrowia, USA, nad siedmioma środkami: N-(4-hydroksy-fenylo)-retynamidem o wszystkich konfiguracjach trans, difluorometyloornityną, dehydroepiandrosteronem, liazorolem, lowestatyną, oltyprazem i finasterydem.

Lucia i wsp. w „Chemopreventive Activity of Tamoxifen, N-(4-Hydroxyphenyl)retinamide, and Vitamin D Analogue Ro24-553 1 for Androgen-promoted Carcinomas of the Rat Seminal Vesicle and Prostate, Cancer Research, 1995, tom 55, strony 5621-5627, donoszą o zapobieganiu przy pomocy związków chemicznych nowotworom prostaty u szczurów Lobund-Wistar za pomocą tamoksyfenu, modyfikującego odpowiedź estrogenową.

Jak omówiono w pracy Pottera i wsp., A mechanistic hypothesis for DNA adduct formation by tamoxifen following hepatic oxidative metabolism, Carcinogenesis, 1994, tom 15, strony 439-442, tamoksyfen powoduje rakowatość wątroby u szczurów, co przypisuje się tworzeniu kowalencyjnych adduktów DNA. W tej publikacji podaje się także, że analogiczny do tamoksyfenu, toremifen, który wykazywał o wiele niższy poziom tworzenia się adduktu DNA w wątrobie niż tamoksyfen, nie jest rakotwórczy.

Toremifen jest przykładem związku trifenyloalkenowego, znanego z amerykańskich opisów patentowych nr US 4696949 i 5491173 zgłoszonych przez Toivola i wsp. Pozajelitowe i miejscowe poPL 207 462 B1 dawanie ssakom kompozycji zawierających toremifen jest znane z amerykańskich opisów patentowych nr US 5571534 zgłoszonych przez Jalonen i wsp. i nr US 5605700 zgłoszonych przez DeGregorio i wsp.

Kompozycje zawierające toremifen stosowane do odwracania oporności wielolekowej komórek rakowych na lek cytotoksyczny są znane z amerykańskiego opisu patentowego nr US 4990538 zgłoszonego przez Harrisa i wsp. Z amerykańskich opisów patentowych nr US 5595722 i 5599844 zgłoszonych przez Graingera i wsp., są znane sposoby identyfikowania środków, które zwiększają poziom TGFP, oraz sposoby doustnego podawania kompozycji zawierających aktywatory TGFP i stymulatory wytwarzania TGFP w celu zapobiegania albo leczenia stanów chorobowych charakteryzujących się nienormalnym rozrostem komórek mięśni gładkich, na przykład urazem naczyniowym. Do opisanych środków do zwiększania poziomów TGFP należy tamoksyfen i jego analog toremifen.

Z amerykańskich opisów patentowych nr 5629007 i 5635107 zgłoszonych przez Audia i wsp., których jest znany sposób zapobiegania rozwojowi raka prostaty z ryzykiem rozwoju takiego raka, na przykład u pacjenta z łagodnym rozrostem prostaty, drogą podawania pacjentowi związku oktahydrobenzo[f]chinolinonu.

Z ameryka ń skiego opisu patentowego nr US 5595985 zgł oszonego przez Labie jest znany sposób leczenia łagodnego rozrostu prostaty, z wykorzystaniem połączenia inhibitora 5a-reduktazy i związku, który wiąże i blokuje dostęp do receptorów androgenowych. Jednym z przykładów związków, które blokują receptory androgenowe, jest flutamid.

Z amerykańskich opisów patentowych nr US 4329364 i nr US 4474813 zgłoszonych przez Neri i wsp., są znane preparaty farmaceutyczne zawierające flutamid, stosowane do opóźniania i ewentualnie zapobiegania inicjacji raka prostaty. Preparat może mieć postać kapsułki, tabletki, czopka albo eliksiru. Pomimo tych opracowań wciąż istnieje potrzeba opracowania nowych środków i sposobów skutecznego zapobiegania rakowi prostaty. Niniejszy wynalazek jest odpowiedzią na tę potrzebę.

Streszczenie wynalazku

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem opracowano zastosowanie związku i chemicznego, w zwłaszcza, toremifenu i jego analogów albo metabolitów, w celu zapobiegania rakowi prostaty, szczególnie zapobieżenia nawrotowi, leczenia, spowolnienia albo zahamowania rozwoju raka prostaty, w tym do leczenia nowotworzenia śródnabłonkowego prostaty (zwanego czasem rozrostem wewnątrzbłonkowym prostaty) PIN.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku trifenyloalkenowego o wzorze I

w którym R1 i R2, które mogą być takie same albo różne i oznaczają H albo OH, R3 oznacza OCH2CH2NR4R5, gdzie R4 i R5, które mogą być takie same albo różne i oznaczają H albo grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, estrów albo N-tlenków i ich mieszanin, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do zapobiegania rozwojowi lub do leczenia raka prostaty.

W korzystnej odmianie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze I, jak określono powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia nowotworzenia śródnabłonkowego prostaty (PlN) a zwłaszcza o wysokim stopniu agresywności.

Korzystnie związek jest wybrany z grupy obejmującej toremifen, jego N-tlenek i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub ich mieszaniny.

PL 207 462 B1

Wynalazek został opisany na rysunku, na którym:

fig. 1 przedstawia wykres ilustrujący działanie profilaktyczne związku chemicznego, toremifenu, w modelu TRAMP, fig. 2A-2C stanowią obrazy skrawków histologiczne H&E przedstawiających komórki prostaty od strony brzusznej, u myszy normalnych i raka prostaty u poddanych badaniom myszy TRAMP, fig. 3 przedstawia wpływ toremifenu na rozwój stercza od strony brzusznej u myszy TRAMP, fig. 4 przedstawia wpływ toremifenu na występowanie nowotworów u myszy TRAMP, fig. 5 przedstawia wpływ toremifenu na rozwój nowotworu w modelu TRAMP, fig. 6A-6B przedstawia porównanie działania placebo i toremifenu na wzrost nowotworu.

Szczegółowy opis wynalazku

Zgodne z niniejszym wynalazkiem opracowano wykorzystanie chemicznego środka zapobiegawczego, korzystnie toremifenu jego analogi lub metabolity, do przeciwdziałania rozwojowi raka prostaty, spowalniania albo hamowania rozwoju raka prostaty, zmniejszania ryzyka rozwoju raka prostaty i zwię kszania stopnia przeż ycia pacjentów.

Jak wykazano tutaj, toremifen jest chemicznym środkiem zapobiegawczym przeciwko rakowi prostaty. W przedstawionych tu doświadczeniach gruczoły krokowe poddano sekcji oraz badaniu histologicznemu, wraz z pełną analizą pod kątem leczenia raka prostaty. Toremifen badano także na heteroprzeszczepach u nagich myszy LNCaP. Jak wykazano, uzyskane dane były rewelacyjne, gdyż toremifen nie tylko hamował wzrost, lecz także był zdolny do powodowania cofania się nowotworów.

W korzystnym rozwią zaniu wynalazku stosuje się zwią zek, toremifen, o nazwie chemicznej 4-chloro-1,2-difenylo-1-[4-[2-(N,N-dimetyloamino)etoksy]-fenylo]-1-buten o wzorze (I), w którym każdy R1 i R2 oznacza H, a każdy R4 i R5 oznacza metyl. Toremifen okazał się bezpiecznym i skutecznym związkiem przeciwnowotworowym i wykazywał działanie typu hormonalnego jako środek estrogenny lub jako środek przeciwestrogenny, w zależności od stosowanej dawki.

Po podaniu, toremifen ulega przekształceniu do kilku rodzajów metabolitów, które są także biologicznie czynne.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem przedmiotem jest także zastosowanie analogów toremifenu albo jego metabolitów, które są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Innymi przykładami chemicznych środków zapobiegawczych o wzorze (I), objętych zakresem wynalazku są następujące związki 4-chloro-1,2-difenylo-1-[4-[2-(N-metyloamino)etoksy]-fenylo]-1-buten, 4-chloro-1,2-difenylo-1-[4-[2-(N,N-dietyloamino)etoksy]fenylo]-1-buten, 4-chloro-1,2-difenylo-1-[4-aminoetoksy)fenylo]-1-buten, 4-choro-1-(4-hydroksyfenylo)-1-[4-[2-(N,N-dimetyloamino)etoksy]-fenylo]-2-fenylo-1-buten, 4-chloro-1-(4-hydroksyfenylo)-1-[4-[2-(2-(N-metyloamino)etoksy]-fenylo]-2-fenylo-1-buten i 4-chloro1,2-bis(4-hydroksyfenylo)-1-[4-[2-(N,N-dimetyloamino)etoksy]fenylo]-1-buten.

Wynalazek obejmuje swoim zakresem czyste izomery (Z) i (E) związków i ich mieszaniny, jak również czyste pary enancjomeryczne (RR, SS) i (RS, SR) i ich mieszaniny.

Związki o wzorze (I) otrzymuje się według znanych sposobów uzyskiwania opisanych w amerykańskich opisach patentowych nr US 4696949 i 5491173 zgłoszonych przez Toivola i wsp.

Wynalazek obejmuje swoim zakresem farmaceutycznie akceptowalne sole aminopodstawionych związków otrzymane w reakcji z organicznymi albo nieorganicznymi kwasami, na przykład z kwasem cytrynowym i kwasem chlorowodorowym. Wynalazek obejmuje również N-tlenki aminowych podstawników związków o wzorze (I).

Farmaceutycznie akceptowalne sole można wytwarzać także ze związków fenolowych w wyniku traktowania zasadami nieorganicznymi, na przykład wodorotlenkiem sodowym. Także i estry związków fenolowych można wytwarzać z alifatycznymi albo aromatycznymi kwasami karboksylowymi, na przykład estry kwasu octowego albo benzoesowego.

Stosowane tu określenie „kompozycja farmaceutyczna oznacza terapeutycznie skuteczne ilości środka razem z odpowiednimi rozcieńczalnikami, środkami konserwującymi, środkami ułatwiającymi rozpuszczalność, emulgatorami, środkiem wspomagającym i ewentualnie nośnikami. Stosowane tu określenie „terapeutycznie skuteczna ilość oznacza taką ilość, która zapewnia efekt terapeutyczny dla danego stanu chorobowego i trybu podawania. Kompozycje są uzyskiwane w postaci cieczy albo poddane liofilizacji albo wysuszone w inny sposób i zawierają rozcieńczalniki o różnej zawartości buforów (na przykład Tris-HCI, octan, fosforan), pH i sile jonowej, dodatki, takie jak albumina albo żelatyna w celu zapobiegania absorpcji na powierzchniach, ś rodki powierzchniowo czynne (na przykł ad polisorbuty (Tweed 20) (Tween 80), blokowy kopolimer (Pluronic F68) sole kwasów żółciowych), środki ułatwiające rozpuszczanie (na przykład gliceryna, polietylenogliceryna), przeciwutleniacze (na przyPL 207 462 B1 kład kwas askorbinowy, metawodorosiarczyn sodowy), środki konserwujące (na przykład timerosal, alkohol benzylowy, parabeny), substancje nadające objętość albo środki do uzyskania odpowiedniej toniczności (na przykład laktoza, manitol, środki kowalencyjnie wiążące się z polimerami, takie jak poliglikol etylenowy z białkami, środki kompleksujące jony metali albo di wprowadzania materiału do albo na preparaty w postaci cząstek związków polimerycznych, takich jak kwas polimliekowy, kwas poliglikolowy, hydrożele, itp., albo na liposomy, mikroemulsje, micele, pęcherzyki jednolamelarne albo wielolamelarne, błony erytrocytów albo sferoplasty. Takie kompozycje będą mieć wpływ na stan fizyczny, rozpuszczalność, trwałość, szybkość wydzielania in vivo I szybkość oczyszczania in vivo. Kompozycje o ustalonym albo przedłużonym wydzielaniu obejmują kompozycje w zbiornikach lipofilowych (na przykład kwasy tłuszczowe, woski, oleje). W realizacji wynalazku stosowane są także kompozycje w postaci cząstek powleczonych polimerami (na przykład poloksamery albo poloksaminy). W innych rozwiązaniach) wynalazku mogą być wykorzystywane różne postacie cząstek, powłoki ochronne, inhibitory proteaz albo środki wzmacniające przepuszczalność przy różnych drogach podawania, włącznie z podawaniem pozajelitowym, płucnym, donosowym i doustnym. W jednym z rozwiązań kompozycję farmaceutyczną podaje się pozajelitowo, przyrakowo, poprzezśluzówkowo, przezskórnie, domięśniowo, dożylnie, doskórnie, podskórnie, wewnątrzotrzewnowo, wewnątrzkomorowo, wewnątrzczaszkowo i wewnątrznowotworowo.

Stosowane tu określenie „farmaceutycznie akceptowalny/dopuszczalny nośnik jest dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie i obejmuje, między innymi 0,01-0,1 M, zwłaszcza 0,05 M bufor fosforanowy albo 0,8% roztwór soli. Poza tym takie farmaceutycznie akceptowalne nośniki mogą być roztworami, zawiesinami i emulsjami wodnymi albo niewodnymi. Przykładem niewodnego rozpuszczalnika jest glikol propylenowy, poliglikol etylenowy, oleje roślinne, takie jak oliwa, oraz organiczne estry do wstrzykiwania, takie jak oleinian etylu. Do nośników wodnych należy woda, roztwory, emulsje albo zawiesiny alkoholowo-wodne, włącznie z roztworami solankowymi i buforami. Nośniki pozajelitowe obejmują roztwór chlorku sodowego, dekstrozę Ringera, dekstrozę i chlorek sodu, mleczanowe oleje Ringera albo oleje stałe. Do nośników dożylnych należą ciekłe i odżywcze dopełniacze, dopełniacze elektrolityczne, takie jak dopełniacze oparte na dekstrozie Ringera, itp. Obecne mogą być także środki konserwujące i inne dodatki, takie jak na przykład środki przeciwbakteryjne, przeciwutleniacze, środki łączące, gazy obojętne, itp.

Określenie „środek wspomagający/adiuwant dotyczy związku albo mieszaniny, która wzmaga reakcję odpornościową na antygen. Środek wspomagający może służyć jako zbiornik tkankowy, który może powoli uwalniać antygen, a także jako aktywator układu limfatycznego, który wzmaga niespecyficznie reakcję odpornościową. (Hood i wsp., Immunology, drugie wydanie, 1984, Benjamin/Cummings: Menio Park, California, strona 384). Zasadniczo, prowokacja tylko samym antygenem często zawodzi, gdy nie ma środka wspomagającego w wywoływaniu humoralnej albo komórkowej reakcji immunologicznej. Środki wspomagające, adiuwanty obejmują między innymi, pełny adjuwant Freunda, saponinę, żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, poliole pluronowe, polianiony, emulsje olejowe albo węglowodorowe, hemocyjaniny z pijawek Diodora cayenensis, dynitrofenol oraz potencjalnie użyteczny ludzki środek wspomagający, taki jak BCG (bacille Calmette-Guerin) i Corynebactehum parvum. Środek wspomagający jest korzystnie środkiem dopuszczalnym farmaceutycznie.

Do kompozycji o ustalonym albo przedłużonym wydzielaniu należy kompozycja w zbiornikach lipofilowych (na przykład kwasy tłuszczowe, woski, oleje). Wynalazkiem objęte są także kompozycje w postaci cząstek, powleczone polimerami (na przykład poloksamerami albo poloksaminami) i związek sprzężony z przeciwciałami skierowanymi przeciwko receptorom specyficznym dla tkanki, ligandom albo antygenom albo sprzężony z ligandami receptorów specyficznych dla tkanki. Do innych kompozycji według wynalazku należą powłoki ochronne w postaci cząstek, inhibitory proteaz, środki wspomagające przepuszczalność w różnych sposobach podawania, włącznie z podawaniem pozajelitowym, płucnym, donosowym albo doustnym. Związki zmodyfikowane przez przyłączenie wiązaniem kowalencyjnym rozpuszczalnych w wodzie polimerów, takich jak glikol polietylenowy, kopolimery glikolu polietylenowego i glikolu poli-propylenowego, karboksymetyloceluloza, dekstran, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidon albo poliprolina, wykazują znacząco dłuższy czas półtrwania we krwi po zastrzyku dożylnym niż odpowiadające im związki niezmodyfikowane (Abuchowski i wsp., 1981, Newmark i wsp., 1982, i Katre i wsp., 1987). Takie modyfikacje mogą przyczynić się także do zwiększenia rozpuszczalności związków w roztworze wodnym, eliminują agregację i zwiększają fizyczną i chemiczną trwałość związku oraz znacznie zmniejszają immunogenność i reaktywność związku. Dzięki

PL 207 462 B1 temu pożądaną aktywność biologiczną in vivo można osiągnąć podając takie addukty polimer-związek rzadziej i przy niższych dawkach niż w przypadku związku niemodyfikowanego.

W jeszcze innym rozwią zaniu wynalazku zwią zek moż e być stosowany w kompozycji farmaceutycznej o ustalonym czasie uwalniania substancji aktywnej. Na przykład środek można podawać stosując wlew dożylny, odpowiednią do wszczepienia pompkę osmotyczną, plaster przezskórny, liposomy i inne sposoby podawania. W jednym z rozwiązań stosować można pompkę (patrz Langer, jak wyżej, Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987), Buchwald i wsp., Surgery 88:507 (1980), Saudek i wsp., N. Engl. J. Med. 321-574 (1989). W innym rozwiązaniu wynalazku układ o regulowanym uwalnianiu można umieścić w pobliżu miejsca poddawanego leczeniu, na przykład w obrębie mózgu, dzięki czemu podawany jest tylko ułamek dawki stosowanej przy podawaniu układowym (patrz na przykład Goodson, Medical Applications of Controlled Release, jak wyżej, tom 2, strony 115-138 (1984). Urządzenie do regulowanego uwalniania wprowadza się korzystnie do organizmu pacjenta w pobliżu miejsca nieprawidłowej aktywacji immunologicznej albo nowotworu. Inne układy do regulowanego uwalniania są omówione w pracy przeglądowej Langera (Science 249:1527-1533 (1990)).

Preparat farmaceutyczny może zawierać chemiczny środek zapobiegawczy samodzielnie albo może zawierać dodatkowo farmaceutycznie akceptowalny nośnik i może mieć postać stałą albo płynną, taką jak tabletki, proszki, kapsułki, pastylki, roztwory, zawiesiny, eliksiry, emulsje, żele, kremy albo czopki, włącznie z czopkami doodbytniczymi albo do cewki moczowej. Do farmaceutycznie akceptowalnych nośników należą gumy, skrobie, cukry, celulozy i ich mieszaniny. Preparat farmaceutyczny zawierający chemiczny środek zapobiegawczy można podawać pacjentom na przykład drogą podskórnego wszczepienia pastylki. W kolejnym rozwiązaniu wynalazku pastylka taka zapewnia regulowane wydzielanie chemicznego środka zapobiegawczego w ciągu pewnego okresu. Preparat można podawać także dożylnie, przez dożylny albo domięśniowy zastrzyk z preparatu płynnego, doustnie podając preparat płynny albo stały, albo miejscowo. Podawanie można prowadzić także stosując czopek doodbytniczy albo czopek do cewki moczowej. Preparat farmaceutyczny może być także kompozycją pozajelitową. W jednym z rozwiązań wynalazku kompozycja stanowi liposom, który zawiera kompleks chemicznego środka zapobiegawczego, takiego jak na przykład toremifen i związek cyklodekstrynowy, jak opisano już poprzednio w amerykańskim opisie patentowym nr US 5571534 dla Jalonena i wsp.

Preparaty farmaceutyczne według wynalazku można wytwarzać znanymi sposobami rozpuszczania, mieszania, granulowania albo prasowania tabletek. W przypadku podawania doustnego środki chemozapobiegawcze albo ich farmaceutycznie tolerowane pochodne, takie jak sole, estry, N-tlenki, itp., miesza się ze stosowanymi zwykle do tego celu dodatkami, takimi jak nośniki, stabilizatory albo obojętne rozpuszczalniki, i przekształca zwykłymi sposobami w postać odpowiednią do podawania, taką jak tabletki, powleczone tabletki, kapsułki z twardej albo miękkiej żelatyny, roztwory wodne, alkoholowe albo oleiste. Przykładem odpowiednich nośników obojętnych są konwencjonalne podstawy tabletek, takie jak laktoza, sacharoza albo skrobia zbożowa w połączeniu ze spoiwami, takim jak guma arabska, skrobia zbożowa, żelatyna, albo ze środkami rozpadowymi, takimi jak skrobia zbożowa, skrobia ziemniaczana, kwas alginowy, albo ze środkiem poślizgowym, takim jak kwas stearynowy albo stearynian magnezowy.

Przykładem odpowiednich nośników olejowych albo rozpuszczalników są oleje roślinne albo zwierzęce, takie jak olej słonecznikowy albo tran rybny. Preparaty można wytwarzać w postaci zarówno suchych, jak i mokrych granulek. W przypadku podawania pozajelitowego (zastrzyk podskórny, dożylny, dotętniczy albo domięśniowy) chemiczne środki zapobiegawcze albo ich fizjologicznie tolerowane pochodne, takie jak sole, estry, N-tlenki, itp., przekształca się w roztwór, zawiesinę albo emulsję, jeżeli jest to pożądane, stosując typowe, odpowiednie substancje, na przykład środki ułatwiające rozpuszczanie albo inne środki pomocnicze. Ich przykładem są sterylne ciecze, takie jak woda albo oleje, z dodatkiem albo bez dodatku środka powierzchniowo czynnego albo innych farmaceutycznie akceptowalnych środków wspomagających. Przykładowymi olejami są oleje pochodzenia naftowego, zwierzęcego, roślinnego albo syntetycznego, na przykład olej arachidowy, olej sojowy albo olej mineralny. Na ogół korzystnymi ciekłymi nośnikami, zwłaszcza do roztworów do zastrzyków, jest woda, roztwór soli, wodny roztwór dekstrozy i podobne roztwory cukrów oraz glikole, takie jak glikole propylenowe albo glikol polietylenowy.

Wytwarzanie kompozycji farmaceutycznych, które zawierają składnik czynny, jest dobrze znane w tej dziedzinie. Takie kompozycje wytwarza się typowo w postaci aerozolu polipeptydu podawanego

PL 207 462 B1 do części nosowej gardła albo jako zastrzyki w postaci ciekłych roztworów lub zawiesiny, chociaż można jednak wytwarzać postacie stałe odpowiednie do utworzenia roztworów albo zawiesin w cieczy przed zastrzykiem. Preparat może być także w postaci emulsji. Aktywny składnik terapeutyczny miesza się często z rozczynnikami, które są dopuszczalne farmaceutycznie i odpowiednimi dla składnika czynnego. Do odpowiednich rozczynników należy na przykład woda, roztwór soli, dekstroza, gliceryna, etanol, itp., i ich) połączenia. Ponadto kompozycja, jeżeli jest to pożądane, może zawierać mniejsze ilości substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające i emulgujące, środki do buforowania pH, które polepszają skuteczność składnika czynnego.

Składnik czynny może być włączony do kompozycji w postaci obojętnych, farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Do farmaceutycznie dopuszczalnych soli należą sole addycyjne z kwasami (utworzone z wolnymi aminowymi grupami cząsteczki polipeptydu albo przeciwciała), powstające w wyniku reakcji z kwasami nieorganicznymi, takimi jak na przykład kwas chlorowodorowy albo fosforowy, albo kwasami organicznymi, takimi jak kwas octowy, szczawiowy, winowy, migdałowy, itp. Sole utworzone z wolnych grup karboksylowych można również uzyskiwać także w reakcji z zasadami nieorganicznymi, takimi jak na przykład wodorotlenek sodowy, potasowy, amonowy, wapniowy albo żelazowy lub zasadami organicznymi, takimi jak izopropyloamina, trimetyloamina, 2-etyloaminoetanol, histydyna, prokaina, itp.

W przypadku podawania miejscowego na powierzchnię ciał a, chemiczne ś rodki zapobiegawcze albo ich fizjologicznie tolerowane pochodne, takie jak sole, estry, N-tlenki, itp. stosuje się w postaci na przykład kremów, żeli, kropli, itp. które otrzymuje się z roztworów, zawiesin albo emulsji w fizjologicznie akceptowalnym rozcieńczalniku z albo bez nośnika.

W innym rozwiązaniu wynalazku związek czynny moż na wprowadzać do pę cherzyków, a zwłaszcza liposomów (patrz Langer, Science 249:1527-1533 (1990), Treat i wsp., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein i Fidler (redaktorzy), Liss, Nowy Jork, strony 353-365 (1989), Lopez-Berestein, j.w., strony 317-327, patrz ogólnie j.w.).

Zastosowanie kompozycji farmaceutycznych według niniejszego wynalazku jest szczególnie użyteczne w przypadku pacjenta, u którego występuje podwyższone ryzyko rozwinięcia się raka prostaty. Do pacjentów wysokiego ryzyka należą na przykład ci, którzy mają łagodny rozrost prostaty, nowotworzenie śródnabłonkowe prostaty (PIN) albo nienormalnie wysoki poziom krążącego, specyficznego dla prostaty przeciwciała (PSA), albo którzy mają rodzinną skłonność do raka prostaty.

Chemiczny środek zapobiegawczy stosowany przeciwko rakowi prostaty można podawać ponadto w połączeniu z innymi cytokinami, czynnikami wzrostu, które obejmują między innymi, IFN-γ albo - α, IFN-β, interleukina (IL) 1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, czynnik martwicy nowotworowej (TNF) α, TNF-β, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), CSF granulocytów/makrofagów (GM-CSF), cząsteczki pomocnicze, obejmujące związki należące do nadrodziny integryny i nadrodziny Ig, takimi jak, między innymi, kostymulatory komórek T LFA-1, LFA-3, CD22 i B7-1,B7-2 i lCAM-1.

Chemiczny środek zapobiegawczy może być podawany przed albo po podaniu środka uszkadzającego DNA, w okresie od minut do tygodni. Protokoły i sposoby podawania są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Środki uszkadzające DNA są znane specjalistom w tej dziedzinie i oznaczają związek chemiczny albo sposób leczenia, powodujący uszkodzenie DNA, jeżeli jest ono zastosowane do komórki. Do takich środków i czynników należy promieniowanie indukujące uszkodzenie DNA, takie jak promieniowanie gamma, promienie X, promieniowanie UV, mikrofale, emisje elektronów, itp. Szereg związków chemicznych, opisanych także jako „środki chemoterapeutyczne, działa indukując uszkodzenie DNA i wszystkie te środki są użyteczne w opisanych tu sposobach skojarzonego leczenia. Do środków chemoterapeutycznych uważanych za użyteczne należy na przykład adriamycyna, 5-fIuorouracyl (5FU), etopozyd (VP-16), kamptotecyna, aktynomycyna-D, mitomycyna C, cisplatyna (CDDP), a nawet nadtlenek wodoru. Wynalazek obejmuje swoim zakresem także zastosowanie połączenia jednego albo więcej środków uszkadzających DNA, niezależnie od tego, czy są oparte na promieniowaniu, czy stanowią rzeczywiste środki, takie jak zastosowanie promieni X z cisplatyną albo zastosowanie cisplatyny z etopozydem.

W innym rozwiązaniu wynalazku można napromieniać miejsce występowania nowotworu za pomocą promieniowania uszkadzającego DNA, takiego jak promienie X, promieniowanie UV, promienie gamma albo nawet mikrofale. Alternatywnie do komórek nowotworowych można dostarczać środek uszkadzający DNA podając pacjentowi terapeutycznie skuteczne ilości kompozycji farmaceutycznej zawierającej związek uszkadzający DNA, taki jak adriamycyna, 5-fluorouracyl, etopozyd, kamptotecyna, aktynomycyna-D, mitomycyna C, a zwłaszcza cisplatyna. Do środków, które uszkadzają DNA,

PL 207 462 B1 należą także związki, które uniemożliwiają replikację DNA, mitozę i segregację chromosomową. Do takich związków chemoterapeutycznych należy adriamycyna, znana także jako doksorubicyna, etopozyd, werapamil, podofylotoksyna, itp.

Do innych czynników, które powodują uszkodzenie DNA i są szeroko stosowane, należą te, które są znane powszechnie jako promienie gamma, promienie X oraz ewentualnie bezpośrednie doprowadzenie radioizotopów do komórek rakowych. Rozważane są także i inne postacie czynników uszkadzających DNA, takie jak mikrofale i promieniowanie UV. Najbardziej prawdopodobnie wszystkie te czynniki wpływają na prekursory DNA, replikację i regenerację DNA oraz zespół i zachowywanie chromosomów, prowadząc ogólnie do uszkodzenia DNA.

Specjalista w dziedzinie łatwo stwierdzi, że sposoby i kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku są odpowiednie do podawania ssakowi, a zwłaszcza człowiekowi.

Rozróżnienie pomiędzy zapoczątkowaniem a pełnym rozwojem nowotworzenia umożliwiają biomarkery skutków pośrednich, mierzalne zmiany biologiczne w tkance (takie jak np. poziom cholesterolu w osoczu knA/i w przypadku choroby wieńcowej serca). Uważa się, że zmodyfikowanie przynajmniej jednego z biomarkerów skutków pośrednich w wyniku podania chemicznego środka zapobiegawczego może odwzorowywać prawdziwe zahamowanie rozwoju raka. Biomarker taki zostałby w pełni potwierdzony, jeś li ostateczny punkt końcowy, to jest pojawienie się raka, został zniesiony w wyniku podania przypuszczalnego chemicznego ś rodka zapobiegawczego. Biomarkery poś rednie w przypadku nowotworów moż na zaklasyfikować do czterech następujących grup: markery histologiczne, związane z namnażaniem, różnicowaniem i markery biochemiczne. W każdej strategii obejmującej chemoprewencję ważnym punktem wyjściowym jest dostępność histologicznie rozpoznawalnych i akceptowanych organicznych zmian chorobowych przedrakowych. W przypadku prostaty markerem histologicznym może być nowotworzenie śródnabłonkowe prostaty (PIN), będące prekursorem przedrakowym gruczolakoraka prostaty. Nowotworzenie śródnabłonkowe prostaty występuje w postaci nieprawidłowego rozrostu w obrębie przewodzików przewodu krokowego obejmującego przed-rakowe ogniska komórek o nieprawidłowej budowie i raka śródnabłonkowego bez nacieczenia zrębowego. Nowotworzenie śródnabłonkowe prostaty i histologiczny rak prostaty są podobne pod względem morfometrycznym i fenotypowym. Zatem rozwój nowotworzenia śródnabłonkowego prostaty wysokiego stopnia może stanowić ważny etap w szlaku rozwojowym, w którym zdrowa prostata ulega nowotworzeniu śródnabłonkowemu, powstaje histologiczny rak prostaty, inwazyjny kliniczny rak prostaty i przerzuty.

P r z y k ł a d 1: Prostata u transgenicznej myszy z gruczolakorakiem

Badania nad zapobieganiem rakowi prostaty przez zastosowanie środków chemicznych i znacząco utrudnił brak odpowiednich modeli zwierzęcych). Ponowne wznowienie tych badań umożliwiło opracowanie w ostatnim czasie modelu gruczolakoraka prostaty u myszy transgenicznej TRAMP (transgenic adenocarcinoma mouse prostate). W modelu TRAMP, opisanym przez Greenberga i wsp., „Prostate cancer in a transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, tom 92, strony 3439-3443, transgen kodujący duży antygen T (PB-Tag) PB-SV40 specyficznie ulega ekspresji w komórkach nabłonka prostaty myszy. Dzięki temu, model ten ma kilka zalet w porównaniu z modelami aktualnie istniejącymi: 1) u myszy rozwijały się postępujące postacie nowotworów nabłonka prostaty już po 10 tygodniach, a inwazyjny gruczolakorak - w wieku około 18 tygodni, 2) tryb przerzutowego rozprzestrzeniania się raka prostaty przypominał raka prostaty u ludzi, z typowymi miejscami przerzutów do węzłów chłonnych, płuc, nerek, nadnerczy i kości, 3) rozwój, jak również postęp raka prostaty może następować w ciągu stosunkowo krótkiego okresu czasu 10-30 tygodni, 4) nowotwory występowały z 100% czę stoś cią i 5) w celu przeprowadzenia badań bezpo ś rednich leczenia chemicznymi ś rodkami zapobiegawczymi, które mogą zmienić przebieg raka prostaty, selekcję zwierząt można przeprowadzić przed zapoczątkowaniem klinicznego raka prostaty, dzięki obecności transgenu raka prostaty.

Model TRAMP oparty na myszach transgenicznych jest doskonałym modelem in vivo do wyznaczania mechanizmów inicjowania i pobudzania rozwoju raka prostaty oraz do badania skuteczności ewentualnych chemicznych środków zapobiegawczych. U myszy tych rozwijał się postępująco nowotwór nabłonka prostaty (PIN) a następnie rak prostaty w ciągu krótkiego okresu czasu (< 17 tygodni).

Leczenie chemicznym środkiem zapobiegawczym hybrydowej myszy TRAMP rozpoczynano 30 dni po urodzeniu, stosując środki zapobiegawcze na poziomie około 0,5-50 mg/kg masy ciała/dzień, a zwłaszcza około 6-30 mg/kg masy ciała/dzień. Środki przygotowywano dogodnie w postaci pastylek uwalniających substancję czynną w ciągu 21- i 90-dni (przygotowanych przez lnnovative Research of America, Sarasota, FI, USA) i podawano jako podskórne implanty. Zwierzęta kontrolne

PL 207 462 B1 otrzymywały implanty z placebo. W każdej grupie, której podawano środki zapobiegawcze zwierzęta uśmiercano w wieku 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40 i 50 tygodni aż do rozwinięcia się namacalnego nowotworu. Krew zbierano i łączono w obrębie tego samego punktu czasowego leczenia, w celu wyznaczenia zmian testosteronu i estradiolu w surowicy krwi. Tkanki sterczowe pobierano do badań morfometrycznych, histologicznych i molekularnych.

W badaniach zastosowano następujące sposoby postę powania:

1) Pełną analizę prostaty prowadzono seryjnie w celu wykrycia zmian morfologicznych przewodu prostaty w zależności od czasu u zwierząt leczonych i nie leczonych, przykłady pokazano na fig. 2. Skrawki tkanek analizowano histologicznie stosując standardowe barwienie H&E i włosków Massona. Określano obecność i stopień pojawienia się PIN (I - łagodny, III - ostry).

2) Wyznaczano poziomy estradiolu i całkowitego testosteronu w surowicy krwi (RIA) w każdym przedziale wiekowym, aby ustalić obecność zmian poziomów tych hormonów w wyniku stosowania chemicznych środków zapobiegawczych.

P r z y k ł a d 2: Analiza danych immunohistochemicznych

Obrazy mikroskopowe każdego skrawka tkankowego oceniano korzystając ze wspomaganej komputerowo (komputer i monitor Mac 9500-1 32) oceny ilościowej obrazu (NIH-lmage 1,6PPC) stosując kamerę Kodak DCS 460 z mikroskopem Nikon Microphot-FX i wyznaczano ilościowo stosując analizę obrazową wspomaganego barwą układu ilościowego (IPLab Spectrum 3.1, Scanalytics, Inc., VA, USA), która rozróżnia różnice barw wybarwionych skrawków tkanki. Wyznaczono wartości w celu identyfikacji różnych składników tkankowych prostaty. Gęstości pikseli w badanym obszarze, odpowiadające każdemu z tych składników tkankowych, oblicza się dla każdego całego ekranu monitora kolorowego. Uśredniano wyniki odczytu 5 ekranów na skrawek z prostaty. Obrazy immunohistoehemiczne można poddać analizie cyfrowej i ilościowej, aby przeprowadzić ocenę statystyczną wyznaczając współczynniki korelacji próbek i prawdopodobieństwa (dwóch końcówek krzywej).

P r z y k ł a d 3: Badania aktywności środka chemicznego zapobiegawczego

Badania podjęto w celu ustalenia skuteczności chemicznych środków zapobiegawczych u zwierząt transgenicznych TRAMP (PBTag X FVBwt, dostarczonych przez dr Normana Greenberga, Baylor College of Medicine, TX, USA). U myszy tych wykazano wstępne oznaki raka już po 10 tygodniach życia.

Transgeniczne męskie mioty TRAMP badano pod kątem obecności transgenu dużego Tag, zwierzęta płci męskiej, u których) stwierdzono obecność tego transgenu wykorzystywano w dalszych badaniach. Przeciwestrogenowy toremifen, który miał być badany pod kątem możliwych działań zapobiegawczych, wprowadzano w specjalnych pastylkach (lnnovative Research of America, Sarasota, FL, USA), a zapobiegawcze leczenie myszy rozpoczynano 30 dni po urodzeniu (średnia masa myszy 14 g). Każ de ze zwierząt z czterech grup złożonych z 10-12 osobników otrzymywała podskórne wszczepy zawierających toremifen pastylek o 90-dniowym czasie uwalniania substancji czynnej. Dawkę dyfundującego leku, uwzględniającą zmiany masy zwierzęcia związane z jego wzrostem, ustawiono tak, aby dostarczyć toremifen w małej dawce (6 mg/kg) albo w dużej dawce (30 mg/kg). Zwierzęta kontrolne (n = 10) otrzymywały implanty z placebo. Skuteczność leczenia wykazywano przez brak tworzenia się namacalnego nowotworu. Nowotwory prostaty u myszy pobierano i analizowano technikami molekularnymi i histologicznymi.

Korzystając z transgenicznego modelu raka prostaty TRAMP, w którym u każdego zwierzęcia, które dziedziczy gen raka prostaty, rozwija się rak prostaty, wykazano, że toremifen zarówno wydłuża stan utajenia, jak i zmniejsza ryzyko wystąpienia raka prostaty.

Jak pokazano na fig. 1, małe i duże dawki toremifenu były równie skuteczne. Tworzenie się nowotworu prostaty od strony brzusznej u myszy TRAMP odnotowano po 17 tygodniach dla grupy otrzymującej placebo (n = 10), po 18 tygodniach dla grupy traktowanej dużą dawką toremifenu (n =12) i po 28 tygodniach dla grupy traktowanej małą dawką toremifenu (n = 12). Zatem 5-krotne podanie toremifenu znacznie wydłużyło okres utajenia do 11 tygodni w przypadku rozwoju raka prostaty od strony brzusznej u myszy TRAMP.

Ponieważ w okresie prowadzenia badań, zwierzęta, którym podawano toremifen nie osiągały 50% rozwoju nowotworu, to porównywano czas, w ciągu którego u 25% zwierząt rozwinęły się nowotwory. Nowotwory były wyczuwalne palpacyjnie u 25% z 10 zwierząt do 23 tygodnia w grupach otrzymujących placebo i po 30-31 tygodniach w grupach otrzymujących małą i dużą dawkę toremifenu, a więc zyskiwano opóźnienie 7-8 tygodni. Wyniki zarówno dla małych, jak i dużych dawek toremifenu

PL 207 462 B1 w porównaniu do placebo były znaczące w skali log i analizie statystycznej Wilcoxona, jak przedstawiono niżej w tabeli 1.

T a b e l a 1 Analiza statystyczna

	Skala Log P	Wilcoxon P
Niska dawka toremifen względem placebo	0,0003*	0,0004*
Wysoka dawka toremifen względem placebo	0,0017*	0,0071*

* istotność P < 0,05

W 33 tygodniu, to jest w czasie, gdy nowotwór rozwinął się u wszystkich zwierząt kontrolnych, 72% zwierząt traktowanych małą dawką toremifenu i 60% zwierząt traktowanych dużą dawką toremifenu było wciąż wolne od nowotworu. Zatem leczenie za pomocą toremifenu zarówno przy małej, jak i dużej dawce, prowadziło do znacznie obniżonej zapadalności na nowotwory w obrębie prostaty brzusznej u myszy TRAMP.

Wyniki te, uzyskane zgodnie z niniejszym wynalazkiem, nie mogły być przewidziane na podstawie wyników podanych we wspomnianym artykule Lucia i wsp., w którym opisano podawanie, przy dwóch poziomach dawek, tamoksyfen, będący bliskim strukturalnym analogiem toremifenu, szczurom Lobund-Wistar, u których rozwinęły się nowotwory prostaty w wyniku indukowania połączeniem inicjatora i promotora. W pracy Lucia i wsp. podano, że tylko 22-26% zwierząt przyjmujących mniejszą dawkę i tylko 32-50% zwierząt przyjmujących większą dawkę pozostawało wolne od nowotworów prostaty przedniej. Należy nadmienić, że przednia prostata gryzonia, inaczej niż w przypadku prostaty brzusznej, nie ma odpowiadającej jej części w prostacie człowieka.

W pracy Lucia i wsp. stwierdzono ponadto, że połączenie inicjator-promotor stosowane w opisanych sposobach postępowania, chociaż skuteczne przy indukowaniu raka w przedniej prostacie zwierząt kontrolnych, zawodziło przy indukowaniu nowotworów w prostacie brzusznej. Nie może być zatem podstaw, aby oczekiwać zapobiegawczego wpływu środka chemicznego na nowotwory w prostacie brzusznej w wyniku podawania tamoksyfenu szczurom Lobund-Wistar albo ludziom.

Jak już omówiono, podawanie toremifenu prowadzi do znaczącego zapobiegawczego działania w leczeniu nowotworów prostaty brzusznej u myszy TRAMP. Wynik ten stanowi pierwszy krok to wykorzystania tego korzystnego wpływu w przypadku ludzi, gdyż prostata u mężczyzn również zawiera część odpowiadającą prostacie brzusznej u gryzoni.

P r z y k ł a d 4: Badanie histologiczne tkanki prostaty

Nowotwory pobrane od zwierząt z grup traktowanych placebo i dużą dawką toremifenu w trakcie badania palpacyjnego analizowano histologicznie. Na fig. 2A przedstawiono skrawek histologiczny barwiony metodą H&E brzusznej prostaty od normalnej, dorosłej myszy w wieku 17-tygodni. Przedstawiony na fig. 2B skrawek histologiczny brzusznej prostaty od 16-tygodniowej myszy TRAMP traktowanej placebo wskazuje, że inaczej niż w przypadku budowy normalnej prostaty, pokazanej na fig. 2A, prostata brzuszna u myszy TRAMP charakteryzuje się warstwami niezróżnicowanych, anaplastycznych komórek o wysokim współczynniku mitozy. Przeciwnie, jak pokazano na fig. 2C, prostata u 30-tygodniowej myszy TRAMP traktowanej toremifenem zachowuje wiele cech normalnej struktury gruczołowej i nowotwory o bardziej zróżnicowanej strukturze, przy czym współczynnik mitotyczny jest o wiele niższy niż w przypadku zwierzęcia traktowanego placebo. Te wyniki wskazują, że toremifen, nawet w małej dawce, jest skuteczny w hamowaniu rozwoju raka prostaty w modelu myszy TRAMP.

P r z y k ł a d 5: Zastosowanie aktywności zapobiegawczej toremifenu przeciw rakowi prostaty w modelu myszy TRAMP

W przedstawionym doświadczeniu potwierdzono i wykazano zapobiegawczą skuteczność środka chemicznego, toremifenu. Przedmiotem badania są histologiczne i molekularne zmiany związane z rozwojem nowotworu prostaty u zwierząt kontrolnych oraz mechanizm zapobiegawczego działania toremifenu u zwierząt TRAMP, które hodowano, selekcjonowano i traktowano lekiem w postaci pastylek o przedłużonym uwalnianiu. W określonych punktach czasowych po 5 zwierząt z każdej grupy uśmiercano i pobierano ich prostaty do analizy. Gruczoły krokowe oceniano pod względem obecności nowotworu histologicznie, z pełnym preparowaniem i immunohistochemicznie, oznaczając antygen dużego T. Aktualnie, podawanie placebo i toremifenu zakończono dla 7-, 10-, 15- i 20-tygodni, a wyniki opisano niżej.

PL 207 462 B1

Wyniki: Po zakończeniu podawania w 7, 10, 15 i 20 tygodniu dla różnych grup zwierząt, przeprowadzono pełną analizę, która ujawniła, że u myszy traktowanych placebo nowotwory prostaty rozwinęły się w wieku 15-20 tygodni, podobnie jak w poprzednich badaniach pilotowych. Co więcej, u zwierząt traktowanych toremifenem występowało opóźnienie pojawiania się raka prostaty do 20 tygodni (fig. 3). Przy 20 tygodniach, występuje uderzające opóźnienie do 35 tygodni wystąpienia nowotworu w grupie zwierząt otrzymujących toremifen. Te dane potwierdzają, że nawet przy bardziej czułym oznaczaniu nowotworzenia, toremifen wykazywał aktywność zapobiegawczą. W przypadku oceny histologicznej, próbki tkanek utrwalano, poddawano obróbce i zatapiano w parafinie. Skrawki histologiczne (o grubości 5 pM) cięto i barwiono rutynowym sposobem H&E. Toremifen hamował rozwój przewodów i różnicowanie tkanek (porównaj rak prostaty u 17-tygodniowej myszy TRAMP względem myszy typu dzikiego (fig. 4), b) histologię prostaty traktowanej toremifenem względem placebo przy 15 tygodniach (fig. 5). Jakościowo immunohistochemia tkanek traktowanych) placebo i toremifenem wykazała obecność antygenu T w prostacie brzusznej. Zatem aktywność zapobiegawcza środka chemicznego obecna przy podawaniu toremifenu, nie wydaje się być spowodowana supresją promotora probazyny w modelu myszy TRAMP.

Wnioski: Zdolność toremifenu do zapobiegania występowaniu raka prostaty w modelu TRAMP została potwierdzona przez zastosowanie bardziej czułych technik ustalania nowotworzenia. Mechanizm aktywności zapobiegawczej toremifenu nie wydaje się być wynikiem utraty transgenu kodującego białko dużego antygenu T.

P r z y k ł a d 6: Toremifen indukuje regresję rozwiniętych ludzkich nowotworów prostaty w modelu nagiej myszy

Rak prostaty pozostaje aktualnie najczęściej diagnozowanym rakiem u mężczyzn w Stanach Zjednoczonych Ameryki Północnej. Jednak pozostają problemy związane z etiologią i leczeniem tej choroby, zwłaszcza w postaciach zaawansowanych. Standardowym sposobem leczenia nawrotów i zaawansowanego raka prostaty, pomimo powszechnego rozwoju chorób odpornych na hormony, pozostaje terapia hormonalna. Stąd konieczne było opracowanie nowego podejścia do zapobiegania i leczenia raka prostaty, aby sprostać rosnącej liczbie mężczyzn, u których te choroby zdiagnozowano. Przedstawione niżej doświadczenia i wyniki wykazują, że u nagich myszy bez grasicy toremifen hamuje wzrost nowotworu LNCaP wrażliwego na hormony.

Materiały i metody; Milion komórek LNCaP w Matrigelu wstrzyknięto podskórnie do każdego boku nagich myszy bez grasicy. Ogółem wstrzyknięciu poddano 40 myszy. Po, w przybliżeniu, 3-4 tygodniach rozwinęły się widoczne nowotwory. Po określeniu wielkości nowotworów w dwóch wymiarach myszy podzielono na grupy, w których zwierzęta otrzymywały placebo lub leczenie, tak aby zwierzęta miały równoważne masy nowotworów. Pomiędzy łopatki każdej myszy wprowadzono podskórnie jako implant jedną pastylkę (placebo lub 35 mg toremifenu) i co tydzień rejestrowano wielkość nowotworu, a następnie obliczano objętość nowotworu (objętość nowotworu =0,5 (L + W) x L x W x 0,5236, gdzie L = długość nowotworu, a W = szerokość). Objętość nowotworu w czasie wprowadzenia implantu z pastylki stanowiła punkt odniesienia w dalszym oznaczaniu zmian wielkości nowotworu. Tygodniowe zmiany objętości każdego z nowotworów zapisywano jako procentowe różnice względem pomiaru początkowego oznaczonego przed wprowadzeniem pastylki.

Wyniki: Dwie myszy padły wkrótce po wprowadzeniu pastylki na skutek śmiertelnych ran zadanych przez inne myszy. Jedną mysz traktowaną toremifenem wykluczono z badań na skutek nadmiernego rozwoju nowotworu, krwotoku i krwiaka nowotworowego. U wszystkich myszy rozwinęły się widoczne nowotwory, u części jednostronnie u innych dwustronnie. Przez cały czas trwania doświadczenia każdy nowotwór badano niezależnie. Dwadzieścia cztery zwierzęta z nowotworami traktowano placebo, a 28 zwierząt z nowotworami traktowano toremifenem. Wyniki pokazano w tabeli 2 i na fig. 6A i 6B.

T a b e l a 2

Grupa zwierząt otrzymujących placebo

Tydzień	Nr	% zmian objętości względem zerowego dnia traktowania
3	11	9,44
4	8	115,27
5	8	271,71
6	8	600,88

PL 207 462 B1

Grupa zwierząt otrzymujących toremifen

Tydzień	Nr	% zmiany objętości względem zerowego dnia traktowania
3	11	-34,58
4	7	-61,01
5	7	-74,52
6	5	-61,72

Kolejny przedział czasowy będzie uzupełniany na bieżąco w badanej populacji i nadal gromadzone są badania nad innymi zwierzętami.

Wniosek: Toremifen hamuje i indukuje cofanie się rozwiniętych nowotworów LNCaP. Mimo, że mechanizm w jaki toremifen działa, nie jest znany, to wykazana aktywność stanowi doskonałą podstawę do zastosowania toremifenu jako środka leczniczego w przypadku raka prostaty i do zapobiegania nawrotowi raka prostaty u pacjentów wysokiego ryzyka przy mikroprzerzutach z rozwiniętego raka prostaty.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie związku trifenyloalkenowego o wzorze I w którym R1 i R2, które mogą być takie same albo róż ne i oznaczają H albo OH, R3 oznacza OCH2CH2NR4R5, gdzie R4 i R5, które mogą być takie same albo różne i oznaczają H albo grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, estrów albo N-tlenków i ich mieszanin, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do zapobiegania rozwojowi lub do leczenia nowotworzenia śródnabłonkowego prostaty (PIN).
2. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia nowotworzenia śródnabłonkowego prostaty (PIN) o wysokim stopniu agresywności.
3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, związku wybranego z grupy obejmującej toremifen, jego N-tlenek i farmaceutycznie dopuszczalne sole lub ich mieszaniny.