PL208400B1 - Wyizolowany segment DNA kodujący MmeI restrykcyjna endonukleaza-metylaza, rekombinowany wektor, komórka gospodarza transformowana wektorem i sposób wytwarzania rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej MmeI oraz metylazy MmeI - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Tło wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest wyizolowany segment DNA kodujący Mmel, restrykcyjna endonukleaza-metylaza, rekombinowany wektor, komórka gospodarza transformowana wektorem i sposób wytwarzania rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej Mmel oraz metylazy Mmel.

Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek dotyczy fragmentu DNA (kwasu deoksyrybonukleinowego), który to fragment koduje jeden polipeptyd posiadający dwie pokrewne funkcje enzymatyczne, mianowicie funkcję enzymu, który rozpoznaję sekwencję DNA 5'-TCC(Pu)AC-3' i przecina wiązania fosfodiestrowe pomiędzy 20 a 21 resztą od końca 3' względem tej sekwencji rozpoznawanej na tej nici DNA oraz pomiędzy 18 a 19 resztą od końca 5' względem sekwencji rozpoznawanej na nici komplementarnej 5'-GT(Py)GGT-3' w celu wytworzenia zasadowego wydłużenia na końcu 3' (nazywanego dalej endonukleazą restrykcyjną Mmel) oraz drugą aktywność enzymatyczną, która rozpoznaje tę samą sekwencję DNA, 5'-TCC(Pu)AC-3', ale modyfikuje tę sekwencję poprzez dodanie grupy metylowej w celu zapobieżenia przecięciu przez endonukleazę Mmel. Niniejszy wynalazek dotyczy także wektora zawierającego wyizolowany segment DNA, transformowanego gospodarza zawierającego ten segment DNA oraz sposobu wytwarzania endonukleazy restrykcyjnej Mmel z takiego transformowanego gospodarza.

W niniejszym wynalazku opisuje się takż e procesy identyfikowania dodatkowych fragmentów DNA, które kodują enzymy mające te same ogólne właściwości co Mmel, lecz potencjalnie mające wyjątkowe sekwencje rozpoznawania DNA. Proces taki zależy od zastosowania sekwencji aminokwasowej enzymu Mmel przedstawionej w tym zgłoszeniu lub w dalszej kolejności od dodatkowych sekwencji zidentyfikowanych w przebiegu tego procesu. Możliwym jest także zidentyfikowanie, w przebiegu opisanego procesu, dodatkowych fragmentów DNA, z których każdy koduje polipeptyd mający znaczące podobieństwo sekwencji aminokwasowej do polipeptydu Mmel. Przewiduje się, że polipeptydy kodowane przez te fragmenty DNA będą wykazywać podobne funkcje do polipeptydu Mmel. W szczególności przewiduje się, że mają one posiadać podwójną funkcję enzymatyczną przecinania DNA w sposób specyficzny we względnie dalekiej odległości od specyficznej sekwencji rozpoznawania, a także modyfikowania ich sekwencji rozpoznawania w celu ochrony przed cięciem DNA gospodarza w wyniku aktywności endonukleazy. Przykładem takiego enzymu zidentyfikowanego w tym procesie jest CstMI. CstMI został zidentyfikowany jako potencjalna endonukleaza z powodu jego bardzo znacznego podobieństwa sekwencji aminokwasowej do Mmel. CstMI rozpoznaje sekwencję 5'-AAGGAG-3' i przecina wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy resztami 20 i 21 od końca 3' względem sekwencji rozpoznawania 5 na tej nici DNA oraz pomiędzy resztami 18 i 19 od końca 5' względem sekwencji rozpoznawania na nici komplementarnej 5'-CTCCTT-3' w celu wytworzenia 2 zasadowego wydłużenia od końca 3'.

Endonukleazy restrykcyjne są klasą enzymów, które w naturze występują u prokariontów. Istnieje kilka klas znanych układów restrykcyjnych, z których endonukleazy typu II są klasą mającą zastosowanie w inżynierii genetycznej. Jeśli te endonukleazy typu II zostaną oczyszczone z innych zanieczyszczających składników prokariotycznych, mogą być zastosowane w laboratorium do przecinania cząsteczek DNA na określone fragmenty. Właściwość ta umożliwia jednoznaczną identyfikację cząsteczek DNA i ich frakcjonowanie na ich składowe geny. Endonukleazy restrykcyjne okazały się nieodzownym narzędziem w nowoczesnych badaniach genetycznych. Stanowią biochemiczne „nożyczki”, z udziałem których prowadzona jest inżynieria i analiza genetyczna.

Endonukleazy restrykcyjne działają poprzez rozpoznawanie i wiązanie się do poszczególnych sekwencji nukleotydów („sekwencja rozpoznawana”) na cząsteczce DNA. Po związaniu, endonukleazy typu II przecinają cząsteczkę wewnątrz lub po jednej stronie sekwencji. Różne endonukleazy restrykcyjne wykazują powinowactwo względem różnych rozpoznawanych miejsc. Większość endonukleaz restrykcyjnych rozpoznaje sekwencje długości od 4 do 6 nukleotydów, choć ostatnio wyizolowane niewielką liczbę endonukleaz restrykcyjnych, które rozpoznają od 7 do 8 swoiście określonych nukleotydów. Większość rozpoznawanych sekwencji zawiera podwójną oś symetrii i w większości przypadków wszystkie nukleotydy są swoiście określone. Jednakże, niektóre endonukleazy restrykcyjne wykazują zdegenerowaną lub osłabioną specyficzność, jako że rozpoznają wiele zasad w jednej lub więcej pozycji w swojej sekwencji rozpoznawanej, a pewne endonukleazy restrykcyjne rozpoznają sekwencje asymetryczne. Haelll, która rozpoznaje sekwencję 5'-GGCC-3' jest przykładem endonukleazy restrykcyjnej posiadającej symetryczną, nie zdegenerowaną sekwencję rozpoznawaną; Haell,

PL 208 400 B1 która rozpoznaje 5'-(Pu)GCGC(Py)-3' stanowi przykład endonukleazy restrykcyjnej posiadającej zdegenerowaną lub mniej specyficzną sekwencję rozpoznawaną; podczas gdy BspMI, która rozpoznaje 5'-ACCTGC-3' stanowi przykład endonukleazy restrykcyjnej, której sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna. Endonukleazy typu II o symetrycznych rozpoznawanych sekwencjach na ogół przecinają symetrycznie wewnątrz lub w pobliżu rozpoznawanego miejsca, podczas gdy te, które rozpoznają sekwencje asymetryczne mają tendencję do cięcia w odległości od 1 do 20 nukleotydów po jednej stronie miejsca rozpoznawania. Enzym według niniejszego zgłoszenia, Mmel (wraz z CstMI) wyróżnia przecinanie DNA w najdalszej odległości od rozpoznawanej sekwencji spośród wszystkich znanych endonukleaz restrykcyjnych typu II. Zidentyfikowano ponad dwieście określonych endonukleaz restrykcyjnych u kilku tysięcy zbadanych dotychczas gatunków bakterii.

Drugim składnikiem układów restrykcyjnych są metylazy modyfikujące. Enzymy te są komplementarne do endonukleaz restrykcyjnych i stanowią środek, dzięki któremu bakterie mają zdolność ochrony ich własnego DNA oraz odróżniania go od obcego, zakażającego DNA. Metylazy modyfikujące rozpoznają i wiążą się z taką samą nukleotydową rozpoznawaną sekwencją, jak odpowiadająca endonukleaza restrykcyjna, ale zamiast trawić DNA, chemicznie modyfikują jeden lub inny spośród nukleotydów w obrębie sekwencji, przez dodanie grupy metylowej. Po metylacji, rozpoznawana sekwencja nie jest już więcej przecinana przez endonukleazę restrykcyjną. DNA komórki bakteryjnej jest modyfikowane w wyniku aktywności jej metylazy modyfikującej i przez to jest niewrażliwe na obecność endogennej endonukleazy restrykcyjnej. Jedynie nie zmodyfikowany, a przez to rozpoznany jako obcy, DNA jest wrażliwy na rozpoznanie przez endonukleazę restrykcyjną i przecięcie. Metylotransferazy modyfikujące są zazwyczaj enzymami oddzielnymi od ich pokrewnych partnerów endonukleazowych. W niektórych przypadkach, pojedynczy polipeptyd posiada zarówno funkcję metylotransferazy modyfikującej, jak i funkcję endonukleazy, na przykład Eco57I. W takich przypadkach, istnieje druga metylotransferaza jako część układu restrykcji-modyfikacji. W przeciwieństwie do tego, układ Mmel według niniejszego zgłoszenia nie posiada drugiej metylotransferazy towarzyszącej polipeptydowi endonukleaza-metylotransferaza.

Nazwy endonukleaz pochodzą od bakterii, z których zostały uzyskane. Zatem, gatunek Haemophilus aegyptius, wytwarza na przykład 3 różne endonukleazy restrykcyjne, nazwane Hael, Haell oraz Haelll. Enzymy te rozpoznają i przecinają odpowiednio sekwencje 5'(W)GGCC(W)-3', 5'-(Pu)GCGC(Py)-3' oraz 5'-GGCC-3'. Z drugiej strony, Escherichia coli RY13 wytwarza tylko jeden enzym, EcoRI, który rozpoznaje sekwencję 5'-GAATTC-3'.

Ogólnie sądzi się, że w naturze endonukleazy restrykcyjne odgrywają rolę ochronną w utrzymywaniu prawidłowego funkcjonowania komórki bakteryjnej. Umożliwiają one bakterii oporność na zakażenie obcymi cząsteczkami DNA, takimi jak wirusy i plazmidy, które w innym wypadku doprowadziłyby do ich zniszczenia lub pasożytowałyby na nich. Uczestniczą one w oporności poprzez wiązanie się do zakażających cząsteczek DNA i przecinanie ich w każdym miejscu, w którym pojawia się sekwencja rozpoznawana. Wynikła dezintegracja inaktywuje wiele zakażających genów i pozostawia DNA podatnym na dalszą degradację powodowaną przez endonukleazy.

Z rozmaitych szczepów bakteryjnych wyizolowano ponad 3000 endonukleaz restrykcyjnych. Ponad 240 spośród nich rozpoznaje sekwencje unikalne, podczas gdy pozostałe posiadają wspólne specyficzności rozpoznawania. Endonukleazy restrykcyjne, które rozpoznają tę samą sekwencję nukleotydową zwane są „izoschizomerami”. Choć sekwencje rozpoznawane izoschizomerów są identyczne, mogą się one między sobą różnić pod względem miejsca cięcia (np., Xmal versus Smal, Endow i wsp., J. Mol. Biol. 112: 521 (1977); Waalwijk i wsp., Nucleic Acids Res. 5: 3231 (1978)) oraz częstości przecinania rozmaitych miejsc (Xhol versus PaeRll, Gingeras i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402 (1983)).

Endonukleazy restrykcyjne tradycyjnie dzieli się na trzy główne klasy; typ I, typ II i typ III. Układy restrykcyjne typu I tworzą wielopeptydowy kompleks składający się z polipeptydów restrykcyjnych, polipeptydów modyfikujących oraz polipeptydów specyficzności lub rozpoznawania DNA. Układy typu I wymagają dwuwartościowego kationu, ATP oraz S-adenylozylometioniny (SAM) jako kofaktorów. Układy typu II przecinają DNA w przypadkowych miejscach w odległości do kilku tysięcy par zasad od ich miejsca rozpoznawania. Układy typu III rozpoznają na ogół asymetryczną sekwencję DNA i przecinają w specyficznej pozycji 20 do 30 par zasad po jednej stronie względem rozpoznawanej sekwencji. Układy takie wymagają oprócz SAM kofaktora ATP oraz kationu dwuwartościowego. Układy typu III tworzą kompleks polipeptydu endonukleazy i polipeptydu modyfikującego, który albo modyfikuje, albo przecina DNA w miejscu rozpoznawania. Z powodu owego współzawodnictwa pomiędzy ich aktywno4

PL 208 400 B1 ścią modyfikującą a aktywnością przecinania układy typu III powodują częściowe trawienie substratu DNA, w związku z czym nie są przydatne do genetycznych manipulacji.

Mmel nie wymaga ATP do aktywności przecinania DNA i przecina je całkowicie; zatem może zostać sklasyfikowana jako endonukleaza typu II. W sposób odmienny od pozostałych enzymów typu II jednak, Mmel składa się z pojedynczego polipeptydu, który łączy zarówno aktywność endonukleazową, jak i modyfikującą i jest sam przez się wystarczający do tworzenia pełnego układu restrykcyjnomodyfikacyjnego. Mmel przecina także w najdalszej odległości od specyficznej rozpoznawanej sekwencji DNA spośród wszystkich endonukleaz typu II (tak jak czyni to CstMI). Mmel jest całkiem dużych rozmiarów i wydaje się mieć trzy funkcjonalne domeny połączone w jednym polipeptydzie. Składają się one z amino-końcowej domeny, która zawiera endonukleazowy motyw cięcia DNA i która może być także zaangażowana w rozpoznawanie DNA, domenę modyfikującą DNA najbardziej podobną do klasy gamma metylotransferaz N6mA oraz domenę końca karboksylowego przypuszczalnie zaangażowaną w tworzenie dimeru i prawdopodobnie rozpoznawanie DNA. Enzym wymaga SAM zarówno do aktywności przecinającej, jak i modyfikującej. Pojedynczy polipeptyd Mmel wystarcza do modyfikowania wektora plazmidowego niosącego gen in vivo w celu zapewnienia ochrony przed przecinaniem przez Mmel in vitro, ponadto ma także zdolność przecinania nie zmodyfikowanych cząsteczek DNA in vitro, gdy zastosowany zostanie bufor endonukleazowy zawierający Mg++ oraz SAM.

Istnieje ciągłe zapotrzebowanie na nowe endonukleazy restrykcyjne typu II. Pomimo, że obecnie dostępne są endonukleazy restrykcyjne typu II, które rozpoznają wiele swoistych sekwencji nukleotydowych, nowe endonukleazy restrykcyjne, które rozpoznają nowe sekwencje zapewniają większe możliwości i zdolność manipulacji genetycznych. Każda nowa, niepowtarzalna endonukleaza umożliwia naukowcom precyzyjne przecinanie DNA w nowych miejscach w cząsteczce DNA, ze wszystkimi możliwościami, jakie to niesie.

Streszczenie wynalazku

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem dostarczany jest wyizolowany segment DNA kodujący Mmel, restrykcyjna endonukleaza-metylaza, który charakteryzuje się tym, że wyizolowany DNA uzyskuje się z plazmidu pTBMmel o numerze dostę powym ATCC PTA-4521.

Następnym przedmiotem wynalazku jest rekombinowany wektor, do którego wprowadzono segment DNA kodujący Mmel, endonukleaza-metylaza, jak zdefiniowano powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza transformowana rekombinowanym wektorem z wprowadzonym segmentem wyizolowanego DNA, jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej Mmel oraz metylazy Mmel, polegający na tym, że prowadzi się hodowlę komórki gospodarza transformowanej wektorem według wynalazku w warunkach odpowiednich do ekspresji wspomnianej endonukleazy i metylazy.

Szczegółowo, sposób ten obejmuje hodowlę transformowanego gospodarza, takiego jak E. coli, zawierającego fragment DNA kodujący polipeptyd układu restrykcyjnego Mmel, zbieranie wyhodowanych komórek, uzyskiwanie z nich wolnego od komórek ekstraktu i oddzielanie oraz pozyskiwanie endonukleazy restrykcyjnej Mmel z wolnego od komórek ekstraktu.

Niniejszy wynalazek pozwala także na przeprowadzenie wytwarzania endonukleazy restrykcyjnej kodowanej przez sekwencje DNA zidentyfikowane jako homologiczne względem Mmel. Sposób ten obejmuje hodowlę stransformowanego gospodarza, takiego jak E. coli, zawierającego gen dla tych układów restrykcyjnych, zbieranie wyhodowanych komórek, uzyskiwanie z nich wolnego od komórek ekstraktu oraz oddzielanie i pozyskiwanie endonukleazy restrykcyjnej z wolnego od komórek ekstraktu.

Endonukleaza, oznaczoną dalej „Mmel”:

(1) rozpoznaje zdegenerowaną sekwencję nukleotydową 5'-TCC(Pu)AC-3' w dwuniciowym DNA, jak to przedstawiono poniżej:

5'-TCC(Pu)AC-3'

3'-AGG(Py)TG-5' (gdzie G oznacza guaninę, C oznacza cytozynę, A oznacza adeninę, T oznacza tymidynę, (Pu) oznacza prynę albo A, albo G oraz (Py) oznacza pirymidynę, albo C, albo T);

(2) przecina DNA w miejscu wiązania fosfodiestrowego za nukleotydem w kierunku 3' od sekwencji rozpoznawanej 5'-TCC(Pu)AC-3' i przed 18 nukleotydem w kierunku 5' do komplementarnej nici rozpoznawanej sekwencji 5'-GT(Py)GGA-3' w celu wytworzenia 2 zasadowego wydłużenia od końca 3':

5'-TCC(Pu)AC(N20)/-3'

PL 208 400 B1

3'-AGG(Py)GT(18)/-5' oraz (3) metyluje sekwencję rozpoznawaną określoną w (1) in vivo w celu ochrony DNA gospodarza przed przecinaniem w wyniku aktywności endonukleazy Mmel.

W oparciu o niniejszy wynalazek moż na wytworzyć dodatkowe fragmenty DNA, o których stwierdzono, że każdy koduje polipeptydy, które są znacząco podobne pod względem sekwencji do polipeptydu restrykcyjno-modyfikującego Mmel. Fragment DNA kodujący polipeptyd Mmel umożliwia identyfikację tych dodatkowych potencjalnych endonukleaz przez zastosowanie przeszukiwania podobieństw w bazach danych, takich jak GENBANK, przy zastosowaniu programu, takiego jak BLAST (Altschul i wsp., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). Te fragmenty DNA, jak również jakiekolwiek inne fragmenty o takim podobieństwie do Mmel, które mogą być w przyszłości złożone w bazach danych, są kandydatami, które mogą kodować polipeptydy podobne do Mmel, w taki sposób, że kodowane polipeptydy działają zarówno jako endonukleazy restrykcyjne, jak i metylotransferazy. Polipeptydy te mogą, podobnie do Mmel, przecinać DNA w podobnej odległości od sekwencji rozpoznawanej, w zakresie 18 do 20 nukleotydów lub więcej, która to cecha jest niepowtarzalna i znajduje zastosowanie w pewnych technikach biologii molekularnej. Specyficznie, polipeptydy te zawierają motywy aminokwasowe wspólne dla metylotransferaz DNA N6mA w środkowej części polipeptydu, posiadają motyw wspólny dla endonukleaz restrykcyjnych znajdujący się w amino-końcowym odcinku polipeptydów, składający się z aminokwasów D/E(X8-X12)D/EXK i posiadają region kilkuset aminokwasów znajdujący się za konserwowanymi motywami metylotrasferazowymi, które są znacząco podobne do tego regionu Mmel i o których sądzi się, że służą jako domena dimeryzująca i prawdopodobnie rozpoznająca sekwencję DNA. Przedstawiono przykład takiego polipeptydu, CstMI. Wykazano, że CstMI rozpoznaje asymetryczną sekwencję 6 par zasad 5'-AAGGAG-3' i przecina DNA w taki sam sposób, jak Mmel; 5'-AAGGAGN20/N18-3'. Endonukleaza kodowana przez takie fragmenty DNA może być wytwarzana w procesie stosowanym dla Mmel, jak to opisano poniżej.

Krótki opis rysunków

Figura 1 - żel agarozowy przedstawiający trawienie przez Mmel DNA lambdy, T7, phiXl74, pBR322 oraz pUC19.

Figura 2 - sekwencja DNA locus genu Mmel (SEK ID NR: 1).

Figura 3 - sekwencja aminokwasowa locus genu Mmel (SEK ID NR: 2).

Figura 4 - żel agarozowy przedstawiający trawienie przez Mmel DNA pTBMme.1 oraz nie zmodyfikowanych substratów DNA.

Figura 5 - żel agarozowy przedstawiający trawienie przez Mmel nie zmetylowanych, półzmetylowanych i całkowicie zmetylowanych substratów DNA.

Figura 6 - inkorporacja wyznakowanych grup metylowych do nie zmetylowanych, półzmetylowanych i całkowicie zmetylowanych substratów DNA.

Figura 7 - wielokrotne przyrównanie sekwencji aminokwasowych Mmel (SEK ID NR: 3 do SEK ID NR: 14) i polipeptydów homologicznych pochodzących z publicznych baz danych.

Szczegółowy opis wynalazku

Sekwencja rozpoznawana oraz miejsce cięcia endonukleazy według niniejszego wynalazku, zostało opisane uprzednio (Boyd, Nucleic Acids Res. 14: 5255-5274 (1986)). Jednakże, wytwarzanie enzymu Mmel z naturalnego gospodarza, Methylophilus methylotrophus, okazało się trudne z powodu bardzo niskiej wydajności pozyskiwania enzymu i względnej trudności hodowli gospodarza M. methylotrophus w dużych ilościach. W celu przezwyciężenia tych ograniczeń w wytwarzaniu Mmel, niniejsze zgłoszenie opisuje identyfikację sekwencji DNA kodującej gen Mmel i ekspresję tego genu Mmel w organizmie odpowiedniego gospodarza, w danym przypadku E. coli. Ta manipulacja fragmentu DNA kodującego Mmel w rezultacie daje zarówno znaczący wzrost w ilości wytwarzanego enzymu w przeliczeniu na gram komórek, jak i znaczący wzrost w łatwości hodowli w dużych ilościach komórek zawierających enzym Mmel.

Zastosowano bez powodzenia kilka standartowych podejść wykorzystywanych typowo przez specjalistów, do klonowania Mmel. W szczególności, nie powiodła się próba selekcji metylazy (Wilson i wsp., patent USA nr 5 200 333). Stworzono kilka losowych bibliotek DNA M. methylotrophus w E. coli i poddano trawieniu za pomocą Mmel, ale nie uzyskano klonów zawierających metylazy Mmel.

Spróbowano drugiego podejścia, lecz bez powodzenia. W podejściu tym, do przeszukiwania biblioteki losowych klonów stworzonych w podstawieniowych wektorach faga lambda zastosowano przeciwciała specyficzne względem N6mA. Próba powiodła się pod względem pozyskania klonów pozytywnych na metylazę, lecz okazało się, że wszystkie przebadane klony wykazywały raczej eks6

PL 208 400 B1 presję metylotransferazy drugiego układu restrykcyjnego w M. methylotrophus, metylazy Mmell (sekwencja rozpoznawana 5'-GATC-3') niż pożądaną aktywność metylazy Mmel.

Zakończona sukcesem próba uzyskania pożądanego fragmentu DNA kodującego układ restrykcyjny Mmel obejmowała kilka etapów. Najpierw, opracowano nową procedurę oczyszczania w celu oczyszczenia peptydu endonukleazy Mmel z M. methylotrophus do osiągnięcia homogenności. Po uzyskaniu tego ultra czystego polipeptydu endonukleazy Mmel w znacznej ilości, określono sekwencję aminokwasową końca aminowego oraz wewnętrznych peptydów powstałych po degradacji bromocyjanem. Przy zastosowaniu uzyskanej sekwencji aminokwasowej, zsyntetyzowano zdegenerowane startery DNA komplementarne do DNA kodującego sekwencje aminokwasowe i zastosowano do amplifikacji PCR części genu Mmel. Określono sekwencję DNA tej części genu Mmel. Następnie uzyskano pełną sekwencję genu endonukleazy Mmel oraz otaczających sekwencji DNA wykorzystując technikę odwrotnego PCR. Zaprojektowano dużą liczbę starterów pokrywających się z uzyskaną sekwencją DNA, zsyntetyzowano i zastosowano w połączeniu z wieloma różnymi matrycami. Odwrócone matryce PCR wytworzono poprzez trawienie genomowego DNA M. methylotrophus rozmaitymi endonukleazami restrykcyjnymi, a następnie ligację pociętego DNA M. methylotrophus w niskim stężeniu w celu uzyskania cząsteczek kolistych. Wypróbowano rozmaite startery w połączeniach z rozmaitymi matrycami w celu znalezienia połączeń starter-matryca, które wytwarzały specyficzny produkt amplifikacji PCR. Produkty w ten sposób otrzymane zostały zsekwencjonowane. Po uzyskaniu sekwencji DNA kodującej pełny gen endonukleazy Mmel, zaprojektowano startery w celu specyficznego zamplifikowania genu z genomowego DNA M. methylotrophus. Namnożony gen został wstawiony do wektora ekspresyjnego i sklonowany do gospodarza E. coli. Gospodarz został sprawdzony i wykazano, że ma zdolność zarówno do ekspresji aktywności endonukleazy Mmel, jak i do modyfikowania in vivo rekombinowanego wektora ekspresyjnego w taki sposób, że był on zabezpieczony przed aktywnością endonukleazy Mmel in vitro.

Odkrycie, że pojedynczy polipeptyd kodujący endonukleazę Mmel zapewnia także in vivo ochronę przed Mmel, jest sprzeczne z uprzednio opublikowanymi informacjami dotyczącymi Mmel (Tucholski, Gene 223: 293-302 (1998)). Szczególnie, referencja ta pouczała, że polipeptyd endonukleazy Mmel nie zapewniał ochrony przed cięciem przez endonukleazę Mmel. Praca ta donosiła, że do modyfikowania miejsca Mmel na obu niciach, a tym samym blokowania cięcia przez endonukleazę Mmel wymagana jest oddzielna metylotransferaza o wielkości 48 kD. W szczególności, referencja poucza, że polipeptyd endonukleazy Mmel modyfikuje adeninę jedynie w górnej nici rozpoznawanej sekwencji 5'-TCCRAC-3' i że tak zmodyfikowane DNA jest przecinane przez endonukleazę Mmel. Fragment DNA według niniejszego wynalazku koduje gen endonukleazy Mmel, który, o ile występuje sam w gospodarzu E. coli, czyni wektor zawierający endonukleazę Mmel opornym na przecinanie przez oczyszczoną endonukleazę Mmel. Dalej, endonukleazą Mmel wytwarzana z tego fragmentu nie przecina fragmentu DNA zmodyfikowanego w pozycji adeniny górnej nici, 5'-TCCRAC-3', jeśli brak jest modyfikacji przeciwnej lub dolnej nici. Jest to sprzeczne z danymi zawartymi w referencji Tucholskiego. Endonukleaza Mmel według niniejszego zgłoszenia przecina także fragment DNA, w którym reszta adeninowa w dolnej nici jest zmodyfikowana 5-GTYGGA-3', co sprzeczne jest z danymi z referencji Tucholskiego. W przypadku, gdy zarówno górna, jak i dolna nić są zmodyfikowane w resztach adeninowych, endonukleazą Mmel nie przecina DNA. Nie znaleziono żadnego drugiego genu metylotransferazy, takiego jak opisany w referencji Tucholskiego, sąsiadującego z genem endonukleazy Mmel. Istnieje otwarta ramka odczytu bezpośrednio w kierunku 3' względem genu endonukleazy Mmel, która mogłaby kodować białko o w przybliżeniu odnotowywanym rozmiarze wykazujące drugą aktywność metylotransferazy (48 kD). Jednakże, ten potencjalny polipeptyd nie zawiera motywów aminokwasowych znajdowanych w metylotransferazach, ani, sklonowany w E. coli, nie zapewnia ochrony przed endonukleazą Mmel. O ile referencja Tucholskiego wskazuje na konieczność istnienia drugiego polipeptydu metylotransferazy w celu zapewnienia ochrony przed aktywnością endonukleazy Mmel w komórce gospodarza, w niniejszej aplikacji wykazano, że fragment DNA kodujący polipeptyd endonukleazy Mmel jest wystarczający do zapewnienia takiej ochrony. Dodatkowo, jedenaście opisanych tutaj fragmentów DNA, które kodują sekwencje aminokwasowe podobne do Mmel, nie jest oflankowanych przez jakiekolwiek rozpoznawalne DNA genów metylotransferazy. Wskazuje to na fakt, że polipeptydy te prawdopodobnie same zapewniają zarówno ochronę DNA gospodarza, jak i aktywność endonukleazy skierowaną przeciwko nie zmodyfikowanym substratom DNA, bez drugiej metylotransferazy jako części układu restrykcji-modyfikacji. Pozostaje to w sprzeczności z innymi układami restrykcji-modyfikacji typu II.

PL 208 400 B1

Ta sama grupa (Tucholski, Gene 223: 293-302 (1998) oraz Anna Podhajska, informacja przekazana osobiście) uprzednio donosiła o sekwencji aminokwasowej składającej się z ośmiu reszt dla pojedynczego wewnętrznego fragmentu trawienia CnBr (sekwencja GRGRGVGV (SEK ID NR: 50). Wielokrotnie bez powodzenia próbowano przeprowadzić PCR na podstawie tej sekwencji. Wykazano, że sekwencja ta nie jest związana z Mmel po ustaleniu rzeczywistej sekwencji aminokwasowej Mmel według niniejszego wynalazku. Zatem ustalenie poprawnych wewnętrznych sekwencji aminokwasowych, które umożliwiły klonowanie genu Mmel, zależało od nowego sposobu oczyszczania, opisanego w tej aplikacji, mającego na celu wytworzenie wystarczająco czystego Mmel w wystarczająco dużej ilości w celu ustalenia sekwencji Mmel poprzez hodowlę aminokwasowych fragmentów wewnętrznych po działaniu bromocyjankiem, jak zostało to przeprowadzone w niniejszym zgłoszeniu.

W przykł adzie II otrzymali ś my Mmel poprzez hodowl ę transformowanego gospodarza zawierającego gen Mmel, takiego jak E. coli ER2683 zawierającego pTBMmel.1 i odzyskiwanie z komórek ednonukleazy. Próbkę E. coli ER2683 zawierającą pTBMmel.1 (NEB#1457) złożono zgodnie z warunkami i zastrzeżeniami Budapest Treaty z American Type Culture Collection (ATCC) 3 lipca 2002 i przyporządkowano Nr Dostępowy Patentu PTA-4521.

W celu odzyskania enzymu według niniejszego wynalazku, E. coli zawierające pTBMmel.1 (NEB #1457) można hodować stosując każdą odpowiednią technikę. Na przykład, E. coli zawierające pTBMmel.1 można hodować w pożywce bulionowej Luria zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i inkubować w warunkach tlenowych w 37°C z napowietrzaniem. Komórki w późnej fazie logarytmicznej wzrostu indukowane są przez dodanie 0,3 mM IPTG, hodowane przez dodatkowe 4 godziny, zbierane przez odwirowanie i albo od razu niszczone albo przechowywane w formie zamrożonej w -70°C.

Enzym Mmel może być izolowany z komórek E. coli zawierających pTBMmel.1 przez tradycyjne techniki oczyszczania białka. Na przykład, osad komórek zawieszany jest w roztworze buforu i poddawany sonifikacji, dyspersji w wysokim ciśnieniu lub trawieniu enzymatycznemu w celu umożliwienia ekstrakcji endonukleazy przez roztwór buforu. Nie zniszczone komórki i resztki komórkowe są następnie usuwane przez odwirowanie w celu wytworzenia wolnego od komórek ekstraktu zawierającego Mmel. Endonukleaza Mmel, wraz jej z odpowiadającą, wewnętrzną aktywnością metylazy jest następnie oczyszczana z wolnego od komórek ekstraktu przez chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa, chromatografię sitową lub połączenie tych sposobów, w celu wytworzenia endonukleazy według niniejszego wynalazku.

Niniejszy wynalazek dotyczy także dodatkowych fragmentów DNA, z których każdy koduje polipeptyd posiadający znaczące podobieństwo sekwencji aminokwasowej do polipeptydu Mmel. Przewiduje się, że polipeptydy kodowane przez te fragmenty DNA będą wykazywać podobne do Mmel funkcje. Szczególnie, przewiduje się, że posiadają one podwójne funkcje enzymatyczne przecinania DNA w sposób specyficzny w stosunkowo dalekiej odległości od specyficznej sekwencji rozpoznawanej, a także modyfikowania ich sekwencji rozpoznawanych w celu ochrony DNA gospodarza przed przecinaniem w wyniku ich aktywności endonukleolitycznej. Po ustaleniu sekwencji aminokwasowej endonukleazy Mmel, jak to opisano w tej aplikacji, sekwencje złożone w bazach danych mogą być porównane z tą sekwencją Mmel w celu odnalezienia tych kilku sekwencji, które są wysoce znacząco podobne do Mmel. Sposób ten jest podobny do tego z patentu USA nr 6 383 770 (Roberts i wsp.), za wyjątkiem tego, że tutaj raczej poszukujemy podobieństwa do sekwencji endonukleazy Mmel niż sekwencji, które pokrywają się z bazą danych białek metylotransferazy lub endonukleazy, a następnie sprawdzamy każde niezidentyfikowane otwarte ramki odczytu znajdujące się obok potencjalnych otwartych ramkach odczytu metylotransferazy. Przed zidentyfikowaniem sekwencji aminokwasowej Mmel, sekwencje DNA kodujące białka pokrewne do Mmel, nie były włączone do bazy danych sekwencji genów enzymów restrykcyjnych i metylotransferaz, wykorzystywanej przez Roberts i wsp., powyżej, jako że sekwencje te nie były połączone z żadną znaną funkcją endonukleazową. Ujawniony tutaj sposób identyfikacji potencjalnych endonukleaz podobnych do Mmel jest zatem bardziej swoisty niż sposób według patentu USA nr 6 383 770 (Roberts i wsp.).

Przeszukiwanie podobieństw sekwencji Mmel względem sekwencji dostępnych w bazach danych, takich jak GENEBANK, wykonuje się stosując program taki jak BLAST (Altschul i wsp., Nucleic -10

Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). Sekwencję z oceną wartości oczekiwanej (E) mniejszą niż E = e^-10 rozpatruje się jako endonukleazę będącą potencjalnym kandydatem. Sekwencje dające wartości oczekiwane o wiele niższe, tak niskie jak E = e^- rozpatruje się z wysokim prawdopodobieństwem jako endonukleazy podobne do Mmel. Takie podobne do Mmel peptydy będące kandydatami są dalej badane w celu sprawdzenia czy są zgodne z architekturą domen, którą wykazuje Mmel. Prawdziwy kan8

PL 208 400 B1 dydat będzie zawierał motyw pofałdowania endonukleazy, zazwyczaj w formie (D/E)X8-X12(D/E)XK w amino-koń cowej części peptydu, (Aravind i wsp., Nucleic Acids Res. 28: 3417-3432 (2000)). Prawdziwy kandydat będzie zawierał motywy metylotransferazy w części środkowej peptydu podobne do metylotransferaz adeninowych N6-metylowych klasy gamma i sekwencje podobne do części karboksylowej Mmel w części karboksylowej peptydu kandydata. Takie wyszukiwanie BLAST wykonane 12 czerwca 2003 wykazało następujące sekwencje jako bardzo znacząco podobne do Mmel:

Nr dostępu GENEBANK	Opis	Wynik	Wartość E	SEK ID Nr
1. gi 11579486821 ref| NP_284504.11	białko hipotetyczne [Neisseri	643	0,0	6
2. gi | 99457971 gb | AAG03371.11	GcrY [Corynobacte- rium striatum ...	604	e-171	8
3. gi 1160777441 ref | NP_388558.11	białko podobne do hipotetycznego	564	e-159	7
4. gi| 28373198| ref| NP_783835.11	białko próbne YeeA [Lactoba .	531	e-149	3
5. gi | 231106381 gb | ZP_00096791.11	białko hipotetyczne [Novosph .	426	e-118	10
6. gi | 274505191 gb | AAO14619.11 AF465251_62	nieznane [Lactobacillus .	217	9e-55	4
7. gi 1158072581 ref | NP_295988.11	metylotransferaza modyfikująca DNA	213	1e-53	14
8. gi 1158077881 ref | NP_285443.11	konserwowane białko hipotetyczne	164	7e-39	13
9. gi| 21231551| ref | NP_637468.11	konserwowane białko hipotetyczne	142	2e-32	N/A
10. gi | 208039631 emb | CAD31540.11	domniemane białko metylazy DNA	134	7e-30	11
11. gi 1234518261 gb | AAN32874.11 AF461726.1	nieznane [Pseudomonas f .	98	6e-19	9
12. gi 1161250791 ref| NP_419643.11	konserwowane białko hipotetyczne	92	3e-17	12
13. gi 1109545341 ref| NP_044172.11	M. jannaschii przewidywane kodujące .	76	2e-12	N/A

Większość z tych białek, w ich wpisach w bazach danych, oznaczono jako hipotetyczne lub przypuszczalne. Wiele z nich wydaje się być polipeptydami o pełnej długości, tak jak sekwencja #2 powyżej: GcrY. Takie peptydy kandydujące mogą zostać poddane ekspresji, jak to opisano w Roberts, w celu identyfikacji oczekiwanej aktywnoś ci endonukleazy. Niektóre geny endonukleaz mogą być nieaktywne w poszczególnym szczepie zastosowanym do sekwencjonowania (Lin i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 2740-2745 (2001)). W takim wypadku ekspresja funkcjonalnej endonukleazy może okazać się prawdopodobna dzięki naprawie mutacji, które inaktywowały te geny. Kilka homologów Mmel, takich jak #7 (SEK ID NR: 14) (Deinococcus radiodurans DR2267) oraz #8 (SEK ID NR: 13) (Deinococcus radiodurans DR0119.1) posiada błędy w otwartej ramce odczytu. DR2267 posiada kodon stop, TAG, który przedwcześnie kończy otwartą ramkę odczytu, w pozycji, w której Mmel posiada kwas glutaminowy kodowany przez kodon GAG. Przez zamianę tego kodonu stop TAG na GAG możliwe może się stać przywrócenie aktywności tego potencjalnego genu endonukleazy. DR0119.1 także jest uszkodzony w taki sposób, że ma przesunięcie ramki odczytu, które uszkadza otwartą ramkę odczytu. Sekwencja Mmel może być stosowana w celu nakierowania na miejsce, w którym należy zreperować to przesunięcie ramki odczytu przez maksymalizację podobieństwa sekwencji DR0119.1 do sekwencji Mmel. Może to z powodzeniem przywrócić aktywność endonukleazy DR0119.1.

PL 208 400 B1

Alternatywna droga wytwarzania endonukleaz polega na wykorzystaniu struktury ich domen podobnych poprzez wykonanie wymiany domen. Możliwa jest wymiana domeny amino-końcowej peptydu podobnego do Mmel na domenę amino-końcową w białku Mmel, na przykład przez wymianę sekwencji potencjalnego nowego genu do pierwszego motywu metylotransferazy (motyw X, „Gly Ala His Tyr Thr Ser” w Mmel, w celu zastąpienia tej części Mmel aż do tej samej sekwencji. Podejście to może być szczególnie przydatne, kiedy dostępna jest tylko część sekwencji lub potencjalny gen stracił funkcję z powodu licznych mutacji. Podejście to wytworzy białko chimerowe, które potencjalnie posiada aktywność endonukleazy i przecina w pewnej odległości od sekwencji rozpoznawanej, podobnie jak Mmel, ale rozpoznaje nową sekwencję DNA. Można także odnaleźć w bazach danych sekwencje, które są wysoce podobne do Mmel, ale są częściowe. Na przykład, sekwencja #11 (SEK ID Nr: 9) powyżej (Pseudomonas fluorescens) pochodzi z małego fragmentu sekwencji DNA znajdującej się w bazie danych. W celu otrzymania funkcjonalnej ednonukleazy podobnej do Mmel z tej sekwencji, można zastosować odwrotny PCR lub inne techniki do otrzymania sekwencji DNA sąsiadującej z przytoczonym fragmentem, a następnie zastosować tę sekwencję w celu otrzymania nienaruszonego genu endonukleazy.

Po zidentyfikowaniu sekwencji, potencjalna endonukleaza może zostać poddana ekspresji i scharakteryzowana, jak to opisano w Roberts i wsp., powyż ej. Tutaj, jednakż e, nie ma oddzielnego genu metylotransferazy mogącego podlegać ekspresji wraz z endonukleazą. Po sklonowaniu takiej potencjalnej endonukleazy i poddaniu jej ekspresji w odpowiednim gospodarzu, takim jak E. coli, ekstrakt wolny od komórek jest przygotowywany i analizowany w celu wykrycia jakiejkolwiek aktywności endonukleazy. Takie oznaczanie endonukleazy musi obejmować kofaktor SAM wymagany przez te endonukleazy.

Po stwierdzeniu specyficznej aktywności przecinania DNA, sekwencja rozpoznawana i miejsce przecinania mogą zostać ustalone za pomocą standardowych sposobów. (Schildkraut (1984) w Genet. Eng. (NY) tom 6 (Setlow J. K., Hollaender, A. Ed.). str. 117-140. Plenum Press, New York „Screening for and characterizing restriction endonucleases.”).

Tak zidentyfikowane enzymy mogą być izolowane z komórek E. coli niosących fragmenty DNA w odpowiednim wektorze, za pomocą tradycyjnych technik oczyszczania biał ka. Na przykł ad, osad komórek zawieszany jest w roztworze buforu i poddawany sonifikacji, dyspersji w wysokim ciśnieniu lub enzymatycznemu trawieniu w celu umożliwienia ekstrakcji endonukleazy przez roztwór buforu. Nienaruszone komórki i resztki komórkowe są następnie usuwane przez odwirowywanie w celu wytworzenia ekstraktu wolnego od komórek zawierającego enzymy.

Endonukleaza wraz z odpowiadającą jej wewnętrzną aktywnością metylazy jest następnie oczyszczana z ekstraktu wolnego od komórek za pomocą chromatografii jonowymiennej, chromatografii powinowactwa, chromatografii sitowej lub połączenia tych sposobów w celu wytworzenia endonukleazy według niniejszego wynalazku.

Przewiduje się, że te fragmenty DNA, jak również jakiekolwiek inne fragmenty o takim podobieństwie do Mmel, że mogą być one złożone w przyszłości w bazach danych, kodują polipeptydy, które są podobne do Mmel, w taki sposób, że kodowane polipeptydy działają zarówno jako endonukleazą restrykcyjna, jak i metylotransferaza.

Polipeptydy te mogą, podobnie do Mmel, przecinać DNA w podobnej odległości od rozpoznawanej sekwencji, w zakresie około 18 do 20 nukleotydów lub więcej, która to cecha jest wyjątkowa i przydatna w pewnych technologiach biologii molekularnej.

Przykładem takiego enzymu zidentyfikowanego w tym procesie jest CstMI. CstMI został zidentyfikowany jako potencjalna endonukleaza z powodu swojego wysoce znaczącego podobieństwa sekwencji aminokwasowej do Mmel. CstMI kodowany jest przez sekwencję #2 powyżej (SEK ID NR: 8), dającą wysoce znaczącą wartość oczekiwaną wynoszącą e^-171 w porównaniu z Mmel za pomocą BLAST. CstMI rozpoznaje asymetryczną sekwencję 6 par zasad 5'-AAGGAG-3' i przecina DNA w ten sam sposób, co Mmel: przecina wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy 20 a 21 resztą w kierunku 3' względem tej rozpoznawanej sekwencji na tej nici DNA oraz pomiędzy 18 a 19 resztą w kierunku 5' względem sekwencji rozpoznawanej na nici komplementarnej 5'-CTCCTT-3', w wyniku czego wytwarzane jest 2 zasadowe wydłużenie od końca 3'.

Niniejszy wynalazek jest dalej zilustrowany przez następujące przykłady.

Przykłady te są dostarczone dla celów pomocniczych w zrozumieniu wynalazku i nie mają być interpretowane jako jego ograniczenie.

Cytowane powyżej i poniżej referencje zamieszczone są tutaj w formie odnośników.

PL 208 400 B1

P r z y k ł a d I. Oczyszczanie endonukleazy Mmel

Pojedynczą kolonię Methylophilus methylotrophus (NEB # 1190) hodowano przez 24 godziny w 1 litrze pożywki μΜ (0,08 μΜ CUSO₄, 0,448 μΜ MnSO₄, 0,348 μΜ ZnSO₄, 6,0 μΜ FeCl₃, 18 μΜ CaCO3, 1,6 mM MgSO4, 9,0 mM NaH2PO4, 10,9 mM K2HPO4, 13,6 mM (NH4)2SO4). Hodowlę tę stosowano do zaszczepienia 100 litrów pożywki Μ. Komórki hodowano w warunkach tlenowych w 37°C, przez noc, aż do fazy stacjonarnej. Pięć 100 litrowych fermentatorów było wymaganych do zebrania

752 gramów mokrego osadu komórkowego.

750 gramów osadu komórkowego M. methylotrophus zawieszano w 2,25 litra Buforu A (20 mWI Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 1,0 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 5% Glicerol) i przepuszczano przez homogenizator Gaulin przy ~12000 funta na cal kwadratowy. Lizat odwirowywano przy ~13000 x G przez 40 minut i zbierano nadsącz.

Roztwór nadsączu nanoszono na 500 Hyper-D (BioSepra S.A.), którą równoważono w buforze A. Zastosowano płukanie 1,0 L buforu A, a następnie nanoszono 2 l gradientu NaCl od 0,05 Μ do 1Μ w buforze A, po czym frakcje zbierano. Frakcje oznaczano na aktywność endonukleazy Mmel przez inkubowanie z 1 μg DNA Lambda (NEB) w 50 μl buforu NEB 1, uzupełnionego 32 μΜ S-adenozylo-L-metioniną (SAM) przez 15 minut w 37°C. Aktywność Mmel eluowano przy 0,3 M do 0,4 M NaCl.

Frakcje kolumny heparynowej Hyper-D zawierające aktywność Mmel łączono, rozcieńczano do 50 mM NaCl buforem A (bez NaCl) i nanoszono na 105 ml kolumnę Q Source 15 (Amersham Biotech), zrównoważoną buforem A. Stosowano płukanie 210 ml buforu A, a następnie nanoszono 1,0 L gradientu NaCl od 0,05 M do 0,7 M w buforze A. Frakcje zbierano i oznaczano aktywność endonukleazy Mmel. Aktywność Mmel znajdowano we frakcji niezwiązanej.

Pulę Source 15 Q nanoszono na 22 ml kolumnę AF-Heparin-TSK (TosoHaas), zrównoważoną buforem A. Stosowano płukanie 44 ml buforu A, po czym nanoszono liniowy gradient NaCl od 0,05 M do 1,0 M w buforze A. Frakcje zbierano i oznaczano na aktywność endonukleazy Mmel. Aktywność Mmel eluowano pomiędzy 0,26 M a 0,29 M NaCl. Frakcje zawierające aktywność pulowano i dializowano przeciw buforowi B (20 mM NaPO4 (pH 7,0), 50 mM NaCl, 1,0 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 5% Glicerol).

Przedializowaną pulę AF-Heparin-TSK nanoszono na 6 ml kolumnę Resorce 15 S (Amerscham Biotech), zrównoważoną buforem B. Stosowano płukanie 12 ml buforu B, po czym nanoszono liniowy gradient NaCl od 0,05 M do 1,0 M w buforze B. Frakcje zbierano i oznaczano na aktywność endonukleazy Mmel. Aktywność Mmel eluowano pomiędzy 0,14 M a 0,17 M NaCl.

Pulę tę nanoszono na 2 litrową kolumnę rozdzielającą pod względem wielkości Superdex 75 (Amersham Biotech), zrównoważoną buforem C (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 1,0 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 5% Glicerol). Frakcje zbierano pomiędzy 500 a 1500 ml eluatu buforem C, po czym analizowano za pomocą oznaczenia endonukleazy Mmel i elektroforezy w żelu poliakrylamidowym na 4-20% gradiencie żelowym, po którym przeprowadzano znakowanie białka barwnikiem Coomassie Brilliant Blue. Frakcje wymyte pomiędzy 775 a 825 ml odpowiadały aktywności Mmel i prążkowi białka o wielkości 105 kDa. Frakcje te pulowano i dializowano przeciw buforowi D (20 Mm NaPO4 (pH 7,0), 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% Glicerol).

Przedializowaną pulę kalibracyjną nanoszono na 16 ml kolumnę Ceramic HTP (BioRad), zrównoważoną buforem D. Po przemyciu 32 ml buforu D, nanoszono liniowy gradient od 0,02 M do 1,0 M NaPO4 w buforze D. Frakcje zbierano i oznaczano za pomocą oznaczenia endonukleazy Mmel i elektroforezy w żelu poliakrylamidowym na 4-20% gradiencie żelowym, po czym następowało znakowanie białka barwnikiem Coomassie Brilliant Blue. Mmel wymywano pomiędzy 0,26 M a 0,3 M NaPO4. Porcję kilku frakcji zawierających pojedynczy prążek homogennego białka o wielkości 105 kDa stosowano do sekwencjonowania białka. Resztę oczyszczonych frakcji Mmel pulowano (6 ml 0,36 mg/ml) i dializowano przeciw buforowi do przechowywania (10 mM Tris (pH 7,9), 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50% Glicerol). Oczyszczony enzym Mmel przechowywano w -20°C.

Oznaczenie aktywności

Próbki od 1-4 μl dodawano do 50 μl roztworu substratu składającego się z 1 x bufor NEB 1, 32 μΜ S-adenozylo-L-metioniny oraz 1 μg DNA (DNA Lambda, PhiX174 lub pUC19). Mieszaniny reakcyjne inkubowano przez 15 minut w 37°C, dodawano 20 μl roztworu stop i analizowano za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Optymalizowana aktywność endonukleazy

Po oczyszczeniu Mmel z M. methylotrophus, przeprowadzano doświadczenia w celu ustalenia optymalnych warunków reakcji dla przecinania DNA. Okazało się, że aktywność endonukleazy była

PL 208 400 B1 znacząco zwiększona w obecności potasu w buforze reakcyjnym. Reakcje przeprowadzano w 4°C do 37°C i od 5 do 60 minut bez znacznej zmiany w ilości przecinanego DNA. Do maksymalnego przecinania wymagane były stężenia enzymu w lub blisko równowagi stechiometrycznej dla miejsc DNA. Duży nadmiar enzymu blokował przecinanie. Dane te zastosowano do ponownego ustalenia aktywności Mmel i do określenia funkcjonalnej jednostki endonukleazy.

Definicja jednostki

Jedna jednostka Mmel jest określona jako ilość Mmel wymagana do całkowitego przecięcia 1 μg DNA PhiX174 w ciągu 15 minut w 37°C w buforze NEB 4 (20 mM Tris-octanu, 10 mM octanu magnezu, 50 mM octanu potasu, 1 mM ditiotreitolu (pH 7,9 w 25°C)) uzupełnionym 80 pM S-adenozylo-L-metioniną (SAM).

P r z y k ł a d II. Klonowanie endonukleazy Mmel

1. Oczyszczanie DNA: przygotowywano całkowite genomowe DNA Methylophilus methylotrophus. 5 gramów osadu komórkowego zawieszano w 20 ml 25% sacharozy, 0,05 M Tris-HCl pH 8,0, do którego dodawano 10 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0. Następnie dodawano 6 ml roztworu lizozymu (10 mg/ml lizozymu w 0,25 M Tris-HCl, pH 8,0), a zawiesinę komórek inkubowano w 4°C przez 16 godzin. Następnie dodawano 25 ml mieszaniny Lytic (1% Triton-X100, 0,05 M Tris, 62 mM EDTA, pH 8,0) oraz 5 ml 10% SDS, a roztwór inkubowano w 37°C przez 5 minut. Roztwór ekstrahowano jedną objętością zrównoważonej mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (50:48:2 obj./obj./obj.), a fazę wodną odzyskiwano i ekstrahowano jedną objętością zrównoważonej mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy (24:1 obj./obj.) dwukrotnie. Następnie dializowano roztwór wodny przeciw czterem zmianom 2 L 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0. Przedializowany roztwór DNA trawiono Rnazą (100 μg/ml) w 37°C przez 1 godzinę. DNA wytrącano przez dodanie 1/10 objętości 5 M NaCl i 0,55 objętości 2-propanolu i nawijano na szklaną pałeczkę. DNA przemywano krótko 70% etanolem, krótko suszono na powietrzu i rozpuszczano w 20 ml TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) do stężenia w przybliżeniu 500 μg/ml i przechowywano w 4°C.

2. Endonukleazę Mmel oczyszczano do homogenności, tak jak opisano w przykładzie I powyżej.

3. Sekwencje aminokwasowe endonukleazy końca aminowego oraz dla kilku wewnętrznych produktów trawienia bromocyjanem polipeptydu Mmel. Endonukleazę restrykcyjną Mmel, przygotowaną jak to opisano w przykładzie I powyżej, poddawano elektroforezie i elektroblottingowi zgodnie z procedurą Matsudaira (Matsudaira J. Biol. Chem. 262: 10035-10038, (1987)), z modyfikacjami opisanymi uprzednio (Looney i wsp., Gene 80: 193-208 (1989)). Błonę barwiono Coomassie Blue R-250, a prążek białka o wielkości w przybliżeniu 105 kDa wycinano i poddawano sekwencyjnej degradacji w sekwencjonerze ABI Procise 494 Protein/Peptide z dostarczaniem fazy gazowej (Waite-Rees i wsp., J. Bacteriol. 173: 5207-5219 (1991)). Otrzymana sekwencja aminokwasowa pierwszych 14 aminokońcowych reszt była następująca: ALSWNEIRRKAIEF (SEK ID NR: 15).

Dodatkową próbkę endonukleazy Mmel, 20 μq w 20 μl traktowano bromocyjanem (Sigma) rozpuszczonym w 200 μl 88% destylowanego kwasu mrówkowego przez 24 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej. Tę mieszaninę reakcyjną odparowywano do sucha i ponownie zawieszano w 20 μl buforu obciążającego (1,5 M Tris-HCl, pH 8,5, 12% glicerol, 4% SDS, 0,05% Serva Blue G, 0,05% czerwień fenolowa) w 100°C przez 5 minut. Próbkę tę poddano elektroforezie na Tris-Tricine 10 do 20% poliakrylamidowego gradientu żelowego (Invitrogen) przez trzy godziny, a następnie przenoszono na błonę dwufluorku poliwinylidenu (PVDF) (Problott, Applied Biosystems Inc.) przy zastosowaniu 10 mM buforu CAPS (10 mM kwas 3-[cykloheksylamino]-1-propanosulfonowy, 10% metanol, 0,05% SDS, 0,005% ditioterytiol, doprowadzone do pH 11,0 za pomocą NaOH) przez 18 godzin przy 200 woltach w zbiorniku elektroblottera (TE52, Hoeffer). Błonę znakowano Coomassie BlueR-250 i obserwowano główne prążki o wielkościach 25 kilodaltonów (kD), 14 kD, 7,5 kD oraz 6 kD, jak również mniejsze prążki. Te wyznakowane prążki białkowe wycinano z błony i każdy poddawano degradacji sekwencyjnej. Fragmenty inne niż fragment amino końcowy pochodzą z wewnętrznego cięcia bromocyjanem w resztach metioninowych znajdujących się w obrębie białka, powinny być zatem poprzedzone metionina.

Pierwszych 29 reszt 25 kD peptydu odpowiadało (M)KISDEFGNYFARIPLKSTXXIXEXNALQ (SEK ID NR: 16). Reszty 20, 21, 23 oraz 25, oznaczone X, nie zostały zidentyfikowane. Pierwszych 40 reszt aminokwasowych uzyskanych z 14 kD fragmentu wyglądało następująco:

(M)DAKKRRNLGAHYTSEANILKLIKPLLLDELWVVFXKVKN (SEK ID NR:17).

PL 208 400 B1

Reszta 36 nie została zidentyfikowana. Pierwszych 25 reszt 7,5 kD peptydu odpowiadało (M)KSRGKDLDKAYDQALDYFSGIAER (SEK ID NR: 18). Wykazano, że 6 kD fragment zawiera mieszaninę trzech sekwencji.

4. Amplifikacja części endonukleazy Mmel: dane dotyczące sekwencji aminowego końca peptydu, peptydu 25 kD, 14 kD i 7,5 kD zastosowano do zaprojektowania serii zdegenerowanych starterów do PCR odpowiadających kodonom dla reszt aminokwasowych. Porządek wewnętrznych fragmentów peptydu nie był znany, zatem dla tych fragmentów sporządzono zarówno starter lewy (nić sensowna), jak i starter prawy (nić antysensowna). Startery wyglądały następująco:

Fragment 25 kD: reszty DEFGNYFA (SEK ID NR: 19)

Lewy:

1) 5'-GARTTYGGNAAYTAYTTYGC-3' (SEK ID NR: 20)

Prawy:

2) 5'-AARTARTTNCCRAAYTCRTC-3' (SEK ID NR: 21)

Fragment 14 kD: reszty MDAKKR (SEK ID NR: 22)

Lewy A:

3) 5'-ATGGAYGCNAARAARCG-3' (SEK ID NR: 23)

Prawy B:

4) 5'-ATGGAYGCNAARAARAG-3' (SEK IDNR: 24)

Lewy:

5) 5'-CGNCGYTTYTTNGCRTCCAT-3' (SEK ID NR: 25)

Fragment 7,5 kD: reszty DKAYDQA (SEK ID NR: 26)

Lewy:

6) 5'-GAYAARGCNTAYGAYCARGC-3' (SEK ID NR: 27)

Prawy:

7) 5'-GCYTGRTCRTANGCYTTRTC-3' (SEK ID NR: 28) gdzie:

Y = T, C,

R = A, G,

H = A, T, C,

S = G, C,

N = A,C,G,T.

Startery 1 i 2 pozyskano z 25 kD peptydu CNBr Mmel i zostały sporządzone w celu rozpoczęcia syntezy nici sensownej (1) lub nici antysensownej (2) genu. Startery 3 do 5 pozyskano z 14 kD peptydu CNBr i zostały sporządzone w celu rozpoczęcia syntezy nici sensownej (3 i 4) lub nici antysensownej (5) genu, przy czym 3 i 4 różniły się użyciem kodonu dla reszty argininowej. Startery 6 i 7 pozyskano z 7,5 kD peptydu CNBr i zostały sporządzone w celu rozpoczęcia syntezy nici sensownej (6) lub nici antysensownej (7) genu.

Reakcje amplifikacji PCR przeprowadzano przy zastosowaniu następujących kombinacji starterów: 1 z 5, 1 z 7, 3 z 2, 3 z 7, 5 4 z 2, 4 z 7, 6 z 2 oraz 6 z 7. Część genu Mmel zamplifikowano w reakcji PCR poprzez połączenie:

μl 10x buforu Thermopol (NEB), μl 4mM roztworu dNTP (NEB), μl genomowego DNA Mmel (500 μg/ml roztworu podstawowego), μ l 100 mM MgSO4,

586 μί dH2O, μl (32 jednostki) polimerazy Vent® egzo-DNA (NEB).

Ta mieszanina wyjściowa została podzielona na 8 równych objętości po 90 μ^ do których dodano po 5 μl startera lewego (10 μΜ roztworu podstawowego) i 5 μl startera prawego (10 μΜ roztworu podstawowego). Parametry cykli wyglądały następująco: 95°C przez 3 minuty w jednym cyklu, następnie 95°C przez 30 sekund, 46°C przez 30 sekund, 72°C przez 2 minuty przez 25 cykli.

Produkty reakcji namnażania poddawano elektroforezie w 1% żelu agarozowym i analizowano. Uzyskano główne produkty namnażania DNA mające po 450 par zasad (bp) (startery 2 z 4), 650 bp (startery 5 z 6) oraz 1100 bp (startery 2 z 6). Te wielkości fragmentów zgodne są z 7,5 kD fragmentem CnBr lokalizowanym najbliżej aminowego końca białka i w przybliżeniu w odległości 650 bp od 14 kD fragmentu CnBr, przy czym 14 kD fragment znajdował się pomiędzy 7,5 kD a 25 kD fragmentem i przylegał do 25 kD fragmentu. Namnożone fragmenty DNA oczyszczano w żelu i sekwencjonowano

PL 208 400 B1 przy zastosowaniu starterów, zastosowanych do namnażania. Wynik translacji otrzymanej sekwencji DNA pokrywał się z sekwencją aminokwasowa uzyskaną z oczyszczonej endonukleazy Mmel, co wskazuje, że udało się uzyskać część sekwencji DNA genu endonukleazy Mmel.

5. Określanie sekwencji DNA dla całego genu Mmel i DNA sąsiadującego: zastosowano technikę odwrotnego PCR w celu przedłużenia sekwencji DNA po obu stronach liczącego 1060 par zasad genu Mmel otrzymanego powyżej. Aby to osiągnąć zaprojektowano i zsyntetyzowano serię starterów pokrywających się z sekwencją DNA genu Mmel i ukierunkowanych do odwrotnego PCR. Genomowe DNA Mmel zostało pocięte dużą liczbą endonukleaz restrykcyjnych i zligowane w niskim stężeniu w celu wytworzenia kolistych matryc DNA.

A. Genomowe DNA Mmel strawiono dziesięcioma różnymi endonukleazami restrykcyjnymi, a następnie koliście zligowano w celu uzyskania matryc DNA do namnażania przy zastosowaniu techniki odwrotnego PCR. Zastosowano następujące enzymy restrykcyjne:

BspHI (T/CATGA),

EcoRI (G/AATTC),

Hindlll (A/AGCTT),

HinPlI (G/CGC),

Mspl (C/CGG),

Nlalll (CATG/),

Pstl (CTGCA/G),

SacI (GAGCT/C),

SphI (GCATG/C),

Xbal (T/CTAGA).

Trawienia enzymami restrykcyjnymi przeprowadzano przez mieszanie:

μl 10 x buforu NEB zalecanego dla enzymu (zmiennie w zależności od enzymu), μl genomowego DNA M. methyloptrophus (1 μg), μί dH₂O, μl (10-20 jednostek) enzymu restrykcyjnego.

Mieszaniny reakcyjne inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Endonukleaza restrykcyjna była inaktywowana poprzez ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej w 65°C (80°C dla Pstl) przez 20 minut. Strawione DNA było następnie ligowane do fragmentów kolistych poprzez dodawanie 50 μl 10 x buforu do ligazy DNA T4, 400 μl dH₂O i 3 μl stężonej ligazy DNA T4 (6000 jednostek, New England Biolabs, Inc.) oraz inkubowane w 16°C przez 16 godzin. Zligowane DNA ekstrahowano następnie za pomocą fenolu i chloroformu, wytrącano za pomocą 2-propanolu i ponownie zawieszano w 100 μl buforu TE.

B. Amplifikacja DNA sąsiadującego z liczącym 1060 par zasad fragmentem genu endonukleazy Mmel: zaprojektowano dwie pary starterów PCR, po jednej w pobliżu każdego końca liczącej 1060 par zasad sekwencji otrzymanej z bezpośredniego PCR przeprowadzonego z zastosowaniem starterów zdegenerowanych. Sekwencje starterów były następujące:

starter IP 1:

5'-GTTGGATCCCGCACAGATTGCTCAGG-3' (SEK ID NR: 29), starter IP 2:

5'-GTTGGATCCTACGTTAATCTGAATAAGATG-3' (SEK ID NR: 30), starter IP 3:

5'-GTTGGATCCTGTTAATCTGAAACGCTGG-3' (SEK ID NR: 31), starter IP 4: 5'-GTTGGATCCTTATACCAAAATGTGAGGTC-3' (SEK ID NR: 32).

Reakcje odwrotnego PCR przeprowadzono na 10 kolistych matrycach wytworzonych powyżej przy zastosowaniu par starterów IP 1 z IP 2, IP 3 z IP 4 oraz IP 1 z IP 3. Reakcje amplifikacji przeprowadzono poprzez zmieszanie:

μl 10 x buforu Thermopol (NEB), μl 4mM roztworu dNTP (NEB), μl startera IP (lewy), μl startera IP (prawy), μl 100 mM MgSO₄,

534 μl dH2O, μl (32 jednostki) egzo-polimerazy DNA Vent® (NEB).

Mieszanina wyjściowa została podzielona na dziesięć probówek po 76 μ( do których dodano 4 μl odpowiednio strawionej, zligowanej koliście matrycy. Parametry cykli wynosiły 95°C przez 3 minu14

PL 208 400 B1 ty dla pierwszego cyklu, a następnie 95°C przez 30 sekund, 56°C przez 30 sekund, 72°C przez 3 minuty przez 25 cykli. Produkty namnażania były analizowane za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Dla starterów IP 1 oraz IP 2 z matrycą SphI i matrycą Nlalll uzyskano produkt liczący w przybliżeniu 825 par zasad. Dla starterów IP 3 i IP z matrycą BspHI uzyskano produkt liczący w przybliżeniu 800 par zasad. Dla starterów IP 1 i IP 3 z matrycą EcoRI uzyskano produkt liczący w przybliżeniu 1500 par zasad. Te namnożono fragmenty DNA oczyszczano w żelu, sekwencjonowano i składano z otrzymaną uprzednio sekwencją . Zł o ż ona sekwencja nie zawierał a peł nej ramki odczytu endonukleazy Mmel. Złożona sekwencja została zastosowana do bezpośredniej syntezy drugiej grup par starterów do odwrotnego PCR. Sekwencje tych starterów były następujące:

starter IP 5:

5'-TTCAGAAATACGAGCGATGC-3' (SEK ID NR: 33), starter IP 6:

5'-GTCAAGCCATAAACACCATC-3' (SEK ID NR: 34), starter IP 7:

5'-GAGGGTCAGAAAGGAAGCTG-3' (SEK ID NR: 35), starter IP 8:

5'-GTCCAACTAACCCTTTATGG-3' (SEK ID NR: 36).

Reakcje namnażania za pomocą odwrotnego PCR przeprowadzano jak wyżej. Przy zastosowaniu starterów IP 5 i IP 6 uzyskano produkty z matrycy Nlalll (w przybliżeniu 450 par zasad) oraz z matrycy Mspl (w przybliż eniu 725 par zasad), lecz nie z innych matryc otrzymanych po ligacji kolistej. Przy zastosowaniu starterów IP 7 i IP 8 uzyskano produkty z matrycy EcoRI (w przybliżeniu 500 par zasad), matrycy SphI (w przybliżeniu 825 par zasad) oraz z matrycy BspHI (w przybliżeniu 750 par zasad). Te fragmenty DNA zsekwencjonowano, a sekwencję składano z sekwencją uprzednio otrzymaną. Złożona sekwencja nie zawierała jeszcze całej otwartej ramki odczytu endonukleazy Mmel, wykonano więc kolejną rundę syntezy startera oraz odwrotnego PCR. Wytworzono dodatkowe matryce DNA tak jak powyżej, ale z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych Apol (R/AATY), Asel (AT/TAAT), BsaHI (GR/CGYC), Mfel (C/AATTG), Sspl (AAT/ATT) oraz EcoRV (GAT/ATC) w celu strawienia genomowego DNA M. methylotropus. Sekwencje starterów tej trzeciej rundy były następujące:

starter IP 9:

5'-TTCCTAGTGCTGAACCTTTG-3' (SEK ID NR: 37), starter IP 10:

5'-GTTGCGTTACTTGAAATGAC-3' (SEK ID NR: 38), starter IP 11:

5'-CCAAAATGGAACTTGTTTCG-3' (SEK ID NR: 39), starter IP 12:

5'-GTGAGTGCGCCCTGAATTAG-3' (SEK ID NR: 40).

Reakcje namnażania odwrotnego PCR wykonywano jak powyżej. Przy zastosowaniu starterów IP 9 oraz IP 10 uzyskano produkty z matrycy Nlalll (w przybliżeniu 425 par zasad), matrycy Mfel (w przybliżeniu 750 par zasad), matrycy Apol (w przybliżeniu 800 par zasad) oraz matrycy Mspl (w przybliżeniu 2100 par zasad). Przy zastosowaniu starterów IP 11 oraz IP 12 uzyskano produkty z matrycy SphI (w przybliżeniu 875 par zasad), matrycy BspHI (w przybliżeniu 925 par zasad), matrycy EcoRI (w przybliżeniu 950 par zasad). Te fragmenty DNA sekwencjonowano i sekwencję składano z sekwencjami otrzymanymi uprzednio. Dalsze sekwencjonowanie wykonywano na liczą cym 2100 par zasad produkcie IP 9, IP 10 Mspl przy zastosowaniu trzech dodatkowych starterów:

starter S1:

5'-GCTTCATTTCATCCTCTGTGC-3' (SEK ID NR: 41), starter S2:

5'-TAACCGCCAAAATTAATCGTG-3' (SEK ID NR: 42), starter S3:

5'-CCACTATTCATTACAACACC-3' (SEK ID NR: 43).

Ostateczna sekwencja złożona (figura 2) zawierała całkowity gen endonukleazy restrykcyjnej Mmel, jak również 1640 par zasad sekwencji poprzedzającej gen oraz 1610 par zasad sekwencji znajdującej się za genem.

6. Klonowanie genu endonukleazy Mmel w E. coli: przypuszczalna otwarta ramka odczytu endonukleazy Mmel została zidentyfikowana ze złożenia sekwencji DNA otrzymanego z sekwencjonoPL 208 400 B1 wania różnych fragmentów DNA zamplifikowanych za pomocą odwrotnego PCR. Początek otwartej ramki odczytu zidentyfikowano na podstawie dopasowania przewidywanej sekwencji aminokwasowej na końcu aminowym otwartej ramki odczytu z sekwencją określoną na podstawie białka endonukleazy Mmel. Przewidywany koniec otwartej ramki odczytu umożliwiałby kodowanie polipeptydów o wielkości w przybliżeniu 105 kDa, co pasowało do obserwowanej wielkości natywnej endonukleazy Mmel. Sekwencja aminokwasowa wydedukowana na podstawie translacji tej otwartej ramki odczytu zawierała motywy konserwowanych sekwencji DNA metylotransferaz N6mA. Jednakże, nie zaobserwowano żadnej otwartej ramki odczytu zawierającej motywy konserwowanych sekwencji pośród DNA metylotransferaz, przylegającej do genu endonukleazy Mmel, co przewidywano. Zdecydowano się podjąć próbę dokonania ekspresji endonukleazy Mmel w E. coli bez drugiej metylotransferazy obecnej w celu ochrony DNA gospodarza E. coli przez przecinaniem. Zsyntetyzowano startery oligonukleotydowe w celu specyficznej amplifikacji genu Mmel z DNA genomowego M. methylothropus w celu dokonania ekspresji w wektorze klonującym pRRS (Skoglund, Gene 88: 1-5 (1990)).

Starter lewy zawierał miejsce Pstl do klonowania, kodon stop w ramce z genem lacZ wektora, konsensusowe miejsce wiązania rybosomu E. coli, kodon ATG dla startu translacji (zamieniony z GTG stosowanym przez M. methylotrophus dla umożliwienia większej ekspresji w E. coli) oraz 20 nukleotydów, pokrywających się z sekwencją DNA M. methylotrophus:

5'-GTTCTGCAGTTAAGGATAACATATATGGCTTTAAGCTGGAACGAG-3' (SEK ID 5 NR: 44).

Starter prawy zawierał miejsce BamHI do klonowania oraz 22 nukleotydy, pokrywające się z sekwencją DNA M. methylotrophus w kierunku 3' od końca otwartej ramki odczytu Mmel:

5'-GTTGGATCCGTCGACATTAATTAATTTTGCCCTTAG-3' (SEK ID NR: 45).

Gen Mmel namnożono w reakcji PCR przez połączenie:

μl buforu Thermopol 10 x (NEB), μl 4 mM roztworu DTP,

12,5 μl lewego startera (10 μΜ roztworu wyjściowego),

12.5 μl prawego startera (10 μΜ roztworu wyjściowego), μl genomowego DNA Mmel (500 μg/ml roztworu wyjściowego),

387 μί dH₂O, _® μl (6 jednostek) polimerazy DNA Vent .

Mieszaninę reakcyjną zmieszano i rozdzielono do 5 probówek po 80 μί. Dodano MgSO₄ (100 mM roztworu wyjściowego) w celu uzyskania stężenia końcowego jonów Mg⁺⁺ wynoszącego odpowiednio 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM oraz 6 mM. Parametry cykli wynosiły: 95°C przez 30 sekund, 60°C przez 30 sekund, 72°C przez 3 minuty, przez 24 cykle. Mieszaniny analizowano za pomocą elektroforezy żelowej i reakcje zawierające 3 mM do 6 mM Mg⁺⁺ zawierały prążek DNA o pożądanej wielkości 2,8 kpz. Te mieszaniny reakcyjne łączono, a prążek 2,8 kpz oczyszczono z żelu. Namnożony fragment genu Mmel o wielkości 2,8 kpz trawiono za pomocą endonukleaz BamHI oraz Pstl (NEB) w następujących warunkach reakcyjnych:

μί buforu reakcyjnego BamHI 10 x (NEB),

1.5 μί BSA (NEB), μί zamplifikowanego fragmentu DNA genu Mmel o wielkości 2,8 kpz, μί dH₂O, μί endonukleazy BamHI (100 jednostek), μί endonukleazy Pstl (100 jednostek).

Mieszaninę reakcyjną mieszano i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Małe fragmenty odcięte z końców fragmentu DNA 2,8 kpz usuwano wraz z endonukleazami poprzez oczyszczanie na kolumnie wirówkowej Qiagen QiaPrep zgodnie z instrukcjami producenta.

Przecięty fragment DNA genu Mmel ligowano z wektorem pRRS w następujący sposób: 10 μί strawionego, oczyszczonego fragmentu Mmel 2,8 kpz mieszano z 5 μί wektora pRRS uprzednio trawionego BamHI i Pstl i oczyszczonego, 5 μί dH₂O, 20 μί buforu QuickLigase 2 x (NEB), mieszaninę reakcyjną mieszano i dodawano 2 μί ligazy QuickLigase. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. 5 μί mieszaniny reakcji ligacyjnej transformowano do 50 μί chemokompetentnych komórek E. coli ER2683, a komórki umieszczano na szalkach z pożywką L zawierającą 100 μg/ml ampicyliny i inkubowano w 37°C przez noc. Uzyskano w przybliżeniu 200 transformantów, a analizowano 18 transformantów reprezentatywnych w następujący sposób: izolowano plazmid z każdej kolonii za pomocą procedur minilizy i trawiono endonukleazami AlwNI i Ndel w celu ustalenia czy zawierają wstawkę o prawidłowej wielkości. 2 spośród 18 transformantów zawierało wstawkę

PL 208 400 B1 o prawidłowej wielkości około 2800 pz. Oba klony badano w celu sprawdzenia, czy wytwarzają one aktywność endonukleazy Mmel. Klony hodowano przez noc w 37°C w 500 ml pożywki L zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Komórki zbierano przez wirowanie, zawieszano w 10 ml buforu do sonifikacji (20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) i niszczono przez sonifikację. Nie oczyszczony lizat oczyszczano za pomocą wirowania, a nadsącz odzyskiwano. Lizat oznaczano na aktywność endonukleazy w serii rozcieńczeń lizatu w 1 x buforze reakcyjnym NEB 1 (New England Biolabs) zawierającym 20 μg/ml substratu DNA lambda i uzupełnionym SAM do stężenia końcowego 100 μM. Mieszaniny reakcyjne inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Produkty reakcji analizowano za pomocą elektroforezy żelowej na 1% żelu agarozowym w 1 x buforze TBE. Jeden z dwóch klonów posiadał aktywność endonukleazy Mmel. Ten aktywny klon oznaczono jako szczep NEB1457 i stosowano do późniejszego wytwarzania Mmel. Konstrukt plazmidowy wykazujący ekspresję aktywności Mmel w tym klonie oznaczono jako pTBMmel.1.

P r z y k ł a d III. Endonukleaza Mmel zapewnia ochronę in vitro przeciwko przecinaniu przez

Mmel

Plazmid pTBMmel.1 oczyszczano z NEB1457 przy zastosowaniu protokołu do minilizy Qiagen. Plazmid ten ma dwa miejsca Mmel w sekwencji wektora oraz jedno miejsce w genie Mmel. Plazmid trawiono Mmel w celu sprawdzenia, czy to DNA jest oporne na aktywność endonukleazy Mmel, co wskazywałoby na to, że pojedynczy gen Mmel był zdolny do metylacji DNA in vivo w celu ochrony DNA gospodarza przeciwko jego aktywności endonukleazy.

W celu sprawdzenia tego przygotowano następującą mieszaninę:

μl DNA pTBMmel.1 po minilizie, μl 10 x buforu NEB 4, μl SAM (1 mM roztworu wyjściowego),

110 μί dH₂O, μl endonukleazy Mmel (15 jednostek).

Mieszaninę reakcyjną mieszano i dzielono na trzy części. Do jednej trzeciej dodawano 0,5 μl dH₂O do drugiej części dodawano 0,5 μl wektora pRRS, a do trzeciej części dodawano 0,5 μl DNA PhiX174 w ramach kontroli pozytywnej. pTBMmel.1 nie został pocięty przez aktywność endonukleazy Mmel, podczas gdy DNA PhiX174 oraz cząsteczki DNA pRRS w tej samej reakcji ulegały przecinaniu, co wskazuje na to, że trzy miejsca Mmel w DNA pTBMmnel.1 są oporne na aktywność endonukleazy Mmel (figura 4).

P r z y k ł a d IV. Wrażliwość endonukleazy Mmel na metylację

Wcześniejsza literatura donosiła, że endonukleaza Mmel metyluje jedynie jedną nić swoich rozpoznawanych sekwencji i że taka półmetylacja nie blokuje następczego trawienia DNA przez endonukleazę (Tucholski, Gene 223 (1998) 293-302). W celu sprawdzenia tego, zsyntetyzowano zestaw czterech oligonukleotydów w taki sposób, by substrat DNA mógł powstać w postaci nie zmetylowanej (oligo 1 + oligo 2), zmetylowanej jedynie w górnej nici (oligo 3 + oligo 2), zmetylowanej jedynie w dolnej nici (oligo 1 + oligo 4) lub zmetylowanej na obu niciach (oligo 3 + oligo 4). Zsyntetyzowane oligonukleotydy miały następujące sekwencje:

Oligo 1:

5'-FAM-GTTTGAAGACTCCGACGCGATGGCCAGCGATCGIGCGCCTCAGCTTTTG-3' (SEK ID NR: 46),

Oligo 2:

5'-FAM-CAAAAGCTGAGGCGCCGATCGCTGGCCATCGCGTCGGAGTCTTCAAAC-3' (SEK ID NR: 47),

Oligo 3:

5'-FAM-GTTTGAAGACTCCG (6Ma) CGCGATGGCCAGCGATCGGCGCCTCAGCTTTTG-3' (SEK ID NR: 48),

Oligo 4:

5'-FAM-CAAAAGCTGAGGCGCCGATCGCTGGCCATCGCGT:CGG (6mA) GTCTTCAAAC-3' (SEK ID NR: 49).

(Pozostałe nukleotydy nie wchodzące w skład rozpoznawanej sekwencji Mmel były także zmetylowane dla celów innych badań, ale jako że Mmel nie ma żadnej specyficzności względem sekwencji tych nukleotydów nie wpływa to na aktywność Mmel i te pozostałe metylacje zostały tu dla jasności pominięte). Dwuniciowe DNA tworzono przez mieszanie 100 μl górnej nici oligonukleotydu (14 μM roztworu wyjściowego) ze 100 μl dolnej nici oligonukleotydu (14 μM roztworu wyjściowego), podgrzaPL 208 400 B1 nie do 85°C i powolne schładzanie do 30°C przez 20 minut. Następnie, stosowano Mmel do przecięcia par oligonukleotydów w 30 μΐ mieszaniny reakcyjnej 1 x buforu NEB 4, 2,5 μΜ oligonukleotydów, 100 μΜ SAM oraz 2,5 jednostek Mmel. Jako kontrolę stosowano także endonukleazę restrykcyjną Hpy1881 do przecinania oligo DNA.

Rozpoznawana sekwencja Hyp188I zachodzi na pierwszych 5 nukleotydów rozpoznawanej sekwencji Mmel, w tym DNA, 5'-TCNGA-3' i jest blokowana przez metylację adeniny w każdej nici DNA. Zgodnie z oczekiwaniami okazało się, że Mmel przecina nie zmetylowane DNA. W przeciwieństwie do wcześniejszych danych (Tucholski, Gene 223: 293-302 (1998)) Mmel nie przecinał półzmetylowanych DNA, gdy zmetylowana była jedynie nić górna: 5'-TCCG(N6mA)C-3'. Jeśli jedynie dolna nić była zmetylowana, Mmel przecinał DNA (figura 5).

Wynik ten jest zgodny zarówno z obserwowaną zdolnością pojedynczego enzymu Mmel do ochrony DNA gospodarza przeciwko cięciu in vivo, jak i obserwacją, że Mmel metyluje jedynie górną nić swojej rozpoznawanej sekwencji. Potwierdziliśmy doniesienie, że enzym Mmel metyluje jedynie górną nić swojej rozpoznawanej sekwencji przez metylacje powyższych par oligo stosując wyznakowany trytem H³-SAM, odpłukiwanie nie wstawionego SAM i zliczanie radioaktywności w DNA. Zarówno nie zmetylowane oligo DNA, jak i nie zmetylowane na górnej nici, a zmetylowane na dolnej nici cząsteczki DNA, miały większe niż 10-krotne zliczenia niż tło, podczas gdy nie zmetylowne na dolnej nici, a zmetylowane na górnej nici DNA oraz DNA z obiema zmetylowanymi nićmi miały zliczenia bliskie tłu (fig. 6). Wyniki te wskazują, że Mmel jest nowym typem układu restrykcji modyfikacji, który nie wymaga oddzielnego enzymu metylotransferazy do modyfikowania DNA gospodarza w celu ochrony przeciwko aktywności endonukleazy, jak to jest w przypadku enzymów typu IIG (zwanego także typem IV), takich jak Eco571.

P r z y k ł a d V. Sekwencjonowanie i analiza DNA

Sekwencjonowanie DNA: sekwencjonowanie DNA przeprowadzano na dwuniciowych matrycach w automatycznym sekwensatorze ABI 373 lub ABI 377. Namnożone fragmenty DNA oraz poszczególne klony sekwencjonowano ze starterami zsyntetyzowanymi jak powyżej lub z uniwersalnych starterów zlokalizowanych w wektorze.

Analizy komputerowe: analizy komputerowe uzyskanych sekwencji DNA przeprowadzano za pomocą programów Genetics Computer Group (Deverenx i wsp., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984), a przeszukiwanie podobieństw w bazach danych przeprowadzano za pomocą Internetu na stronie National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) przy zastosowaniu algorytmów BLASTX oraz BLASTP (Altschul i wsp., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) oraz Gish i wsp., Nature Genet. 3: 266-722 (1993)).

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΪΝ.ST25 WYKAZ SEKWENCJI <110> New England Biolabs, inc.

Morgan, Richard D.

Bhatia, Tanya Davis, Theodore Lovasco, Lindsay <120> Rekombinowane endonukleazy restrykyjne typu II, Mmei i inne pokrewne endonukleazy oraz sposoby ich wytwarzania <130> NEB-207-PIN <140>

<141>

<150> US 60/395,431 <151> 2002-07-12 <150> PCT/US03/31570 <151> 2003-07-10 <160> 50 <170> Patent w wersji 3.2 <210> 1 <211> 6010 <212> DNA <213> Methylophilus methylotrophus <220>

<221> cecha inna <222> (800)..(800) <223> n to a, c, g, lub t <400> 1

gaattccaga	taggtagtcc	tttggtactt	ccatcccaac	cagtgtcacg	ttccgcgcca	60
aaccaatcgg	ttaaagtgta	agaaagtctt	gcactgaagt	agctgtagga	caaaccgaag	120
ttaacctctg	tggtatccca	gcgaccacct	ttaggtgttt	gacggaagcc	tgctgcgtca	180
cctgccaagt	tatatttctt	ccatgaacca	cctgggtaca	ggtagctgat	caaaccagca	240
gtccaaccca	agccttcaat	agcaggaata	gttccgttat	acccaccata	aatatcaatt	300
tcggcagttg	catcagggaa	ggtatttggt	gtcacgtttg	aaccccatgc	accgacataa	360
aagccgctgt	catgagtaat	atcaataccg	ccttgaacgg	caggtttgtg	ccagttttgt	420
gaaataccac	gagcatagta	atctgaaaca	aatccaacgt	ttgcagtagc	agcccaggct	480
gatttttctt	ctttagcctc	ttcagctgcg	tatgaaactt	gggcaaaaga	taatgtgctt	540
aacactgctg	tgagcaatat	agattgacgc	attatgagtc	ctctctctgt	gaaatctttg	600
attaagttgt	tgtaaacgag	aatgaaacaa	caaccacaaa	gcaaagcacg	tgccaaacta	660
taaataacat	tataatcaat	tatttaaaat	atatttataa	tctaaaatat	taaattaatt	720
atttaataaa	ctgtttttta	ttgatttaac	tctaaaacat	atgggtgcaa	ccaccctttt	780
tactcactga	taatgctaan	atagccaaca	aaggagcctt	caccatgctg	atttcaaatg	840
aaaaaattca	ggaattatct	ttaaaaatca	aacaactaat	cgaatcaagc	cccatttcag	900

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
agctaaataa	caacttgcat	gcactaattc agggcgcact	caccaaaatg	gaacttgttt	960
cgcgtgaaga	attcgatatc	caatctgcat	tattagcgcg	cacgcaagag	caattaaaac	1020
gtcttgaaga	aaaaatcagc	cagcttgaag	aagggcaggc	atccagaaag	taaaaattaa	1080
tttacaattg	ttagcattcc	attattgagg	agtgcgctat	gagtctggcg	gtgttataca	1140
gtcgcgcgtt	aagcggcatg	gaggcgccag	aagtggtggt	agaagtccac	ttggcgaatg	1200
gactacccag	ctttaccatt	gttgaaacat	attgaaactt	taagccttag	cattttttca	1260
aatatacaaa	tgccccaagc	tggtgcatta	agaagaatgt	aacaactccc	tgcagactag	1320
gaataacttc	atgatttaac	gaacatccct	gagtttcaaa	gtcgaatctt	ctcgtgttgc	1380
aaatttctac	agcttccttt	ctgaccctct	tgcaccaaat	tgcactatgg	cgctaataaa	1440
tcttctgcta	tccaataatg	tccaactaac	cctttatgga	ctcttaaaaa	agatttaata	1500
aatgattaag	atgaattcaa	ggaatttgat	gcctggaaat	atggcaaaag	caaaaaggca	1560
gcccagtgct	gacttttttg	ttttaacatt	ggcccatata	tccaatttca	aataatttaa	1620
aaattatcgg	gagctaatct	gtggctttaa	gctggaacga	gataagaaga	aaagctattg	1680
agttttctaa	aagatgggaa	gacgcctcag	atgaaaacag	tcaagccaaa	ccctttttaa	1740
tagatttttt	cgaagttttt	ggaataacta	ataagagagt	tgcaacattt	gagcatgctg	1800
tgaaaaagtt	cgccaaggcc	cataaggaac	aatctcgagg	attcgtagat	ttgttttggc	1860
ctggcattct	tcttattgaa	atgaaaagca	gaggtaaaga	cctcgacaaa	gcgtatgacc	1920
aggcacttga	ttacttttct	ggcattgcag	aaagagactt	acccagatac	gttttagttt	1980
gcgacttcca	gcgtttcaga	ttaacagacc	taataacaaa	agagtcagtt	gaatttcttt	2040
taaaggactt	ataccaaaat	gtgaggtctt	ttggttttat	agctggttat	caaactcaag	2100
taatcaagcc	acaagaccct	attaatatta	aggcggctga	acggatgggt	aagcttcatg	2160
acaccctgaa	gttggttgga	tatgagggac	acgctttaga	actttatcta	gtgcgtttac	2220
ttttttgctt	attcgcagaa	gacacaacta	tttttgagaa	aagtttattc	caagaatata	2280
tcgagacaaa	gacgctagag	gacggcagtg	accttgcaca	tcatatcaat	acactttttt	2340
atgttctcaa	taccccagaa	caaaaaagat	taaagaatct	agacgaacac	cttgctgcat	2400
ttccatatat	caatggaaaa	cttttcgagg	agccacttcc	gccagctcag	tttgataaag	2460
caatgagaga	ggcattgctt	gacttgtgct	cattagattg	gagcaggatt	tcaccagcaa	2520
tatttggaag	tttattccaa	agcattatgg	atgctaaaaa	gagaagaaat	cttggggcac	2580
actacaccag	cgaagcaaat	attctcaagt	taatcaagcc	attgtttctt	gacgagctct	2640
gggtagagtt	cgagaaagtt	aaaaataata	aaaataaatt	actagcgttc	cacaaaaaac	2700
taagaggact	tacatttttc	gaccctgcat	gcggttgcgg	aaattttctt	gtaatcacat	2760
accgagaact	aagactttta	gaaattgaag	tgttaagagg	attgcataga	ggtggtcaac	2820
aagttttgga	tattgagcat	cttattcaga	ttaacgtaga	ccagtttttt	ggtatcgaaa	2880
tagaggagtt	tcccgcacag	attgctcagg	ttgctctctg	gcttacagac	caccaaatga	2940

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
atatgaaaat	ttcagatgag	tttggaaact actttgcccg	tatcccacta	aaatctactc	3000
ctcacatttt	gaatgctaat	gctttacaga	ttgattggaa	cgatgtttta	gaggctaaaa	3060
aatgttgctt	catattagga	aatcctccat	ttgttggtaa	aagtaaacaa	acaccgggac	3120
aaaaagcgga	tttactatct	gtttttggaa	atcttaaatc	cgcttcagac	ttagacctag	3180
ttgctgcttg	gtatcccaaa	gcagcacatt	acattcaaac	aaatgcaaac	atacgctgtg	3240
catttgtctc	aacgaatagt	attactcaag	gtgagcaagt	atcgttgctt	tggccgcttc	3300
tgctctcatt	aggcataaaa	ataaactttg	ctcacagaac	tttcagctgg	acaaatgagg	3360
cgtcaggagt	agcggcggtt	cactgcgtaa	ttatcggatt	tgggttgaag	gattcagatg	3420
aaaaaataat	ctatgagtat	gaaagtatta	atggagaacc	attagctatt	aaggcaaaaa	3480
atattaatcc	atatttgaga	gacggggtgg	atgtgattgc	ctgcaagcgt	cagcagccaa	3540
tctcaaaatt	accaagcatg	cgttatggca	acaaaccaac	agatgatgga	aatttcctat	3600
ttactgacga	agaaaaaaac	caatttatta	caaatgagcc	atcttccgaa	aaatacttca	3660
gacggtttgt	gggcggggat	gagttcataa	acaatacaag	tcgatggtgt	ttatggcttg	3720
acggtgctga	catttcagaa	atacgagcga	tgcctttggt	cttggctagg	ataaaaaaag	3780
tccaagaatt	cagattaaaa	agctcggcca	aaccaactcg	acaaagtgct	tcgacaccaa	3840
tgaagttctt	ttatatatct	cagccggata	cggactatct	gttgatacct	gaaacatcat	3900
ctgaaaacag	acaatttatt	ccaattggtt	ttgttgatag	aaatgtcatt	tcaagtaacg	3960
caacgtatca	tattcctagt	gctgaacctt	tgatatttgg	cctgctttca	tcgaccatgc	4020
acaactgctg	gatgagaaat	gtaggaggaa	ggttagaaag	tcgttataga	tattctgcca	4080
gcctggttta	caacacgttt	ccatggattc	aacccaacga	aaaacaatcg	aaagcgatag	4140
aagaagctgc	atttgcgatt	ttaaaagcta	gaagcaatta	tccaaacgaa	agtttagctg	4200
gtttatacga	cccaaaaaca	atgcctagtg	agcttcttaa	agcacatcaa	aaacttgata	4260
aggctgtgga	ttctgtctat	ggatttaaag	gaccaaacac	agaaattgct	cgaatagctt	4320
ttttgtttga	aacataccaa	aagatgactt	cactcttacc	accagaaaaa	gaaattaaga	4380
aatctaaggg	caaaaattaa	ttaatgtatt	taacattaaa	ccaccctgat	ttatttcgaa	4440
tagttcaaat	gcttccatgt	ggactaatcg	ccttcaatca	tattaaaaaa	ccgacgctag	4500
taataaaaac	ttccaaagag	gccatattaa	ccgccaaaat	taatcgtgaa	tttaaaatat	4560
atctttatca	aaccacatcg	gcttgtgttc	tagtaagtgc	attttttgac	gattctgata	4620
gtccactatt	cattacaaca	ccaattgttc	gagatgacca	acactcctta	gacttgttaa	4680
gatttttaat	caacaatgat	tttacgattt	gcttctttga	tgaactgaac	cgagaatttc	4740
tttccgttaa	cgcaactggt	aatttagtct	ctatctttga	gagcattcac	ttgatgccac	4800
tgccgagccc	agaggaagcc	cacaatgcat	tgaatgaagc	ggaattttgg	ttcagtttac	4860
gctcagctgc	tgatgatgaa	tcatctatcc	aggtttcttt	attggataat	ctatttcctg	4920
acgattttgt	aatttatgac	ctatcctcaa	acaaaaacga	tatgacatca	ttggttagag	4980

PL 208 400 B1

aaactaaacc	aggatactat	NEB caggaagcag	-207-PIN.ST25 atattgcaaa gttactaaca	agagctttta	5040
gtttggaaag	catttatcag	aatccagtga	aaacaagcga	ttcaaaagag	ttggcagacg	5100
ttgtggtatt	cggccaaaag	gaaattttaa	taattcaagc	taaagatagt	gaaaacaatc	5160
agaaacaagt	tttagaggtt	tcgttagaca	agaaatgcgc	aaagtcttca	aagaaacttt	5220
ctgaagcttt	ggcacaactc	accgacacta	tcttaacaat	atccaataca	ccaatagttg	5280
atgttcgggt	tggtaagaaa	aaatgcactc	tgaactttga	gggaaagcag	cttattggta	5340
tcgtcgttgt	taaagagctt	tttaatgata	tttacgataa	atacagtcaa	aaagtttttg	5400
agcatgtaga	gttgtctaaa	gcacccattg	tcttctttga	ctatccagaa	tttgcaagaa	5460
tgacatttca	ttgtaattct	gaggaattat	tactttatgc	tttgcatagg	atatttagtt	5520
ctgcaataga	aaatggaatg	tataaacgat	tgagatttac	tcaacctatc	ataactgatg	5580
gtcatgacag	ctacttcagg	atacaaaaca	ggccccattc	tgatgaggcc	tatttaattt	5640
gcacagagga	tgaaatgaag	ctctcaaata	agtttaaaga	ctaaatttat	attttcctca	5700
gtatcttaaa	aacaatattc	attaaattgg	aaagcccgca	atgattgttg	cagtatcaat	5760
gcgggcatca	gtatccagct	cttgcaatac	acggaagtat	caagaagcga	atcaggattc	5820
taaccatacc	tttttaattg	caacaatcta	atttccataa	catgtgtagc	tacatcgaaa	5880
aaaagacctc	gaagaggttg	caagagcgtc	cagctcgcgg	catcaaaaga	ccctagtctt	5940
ttgacaaggg	ggagccaaaa	aactgaggtg	gaggagcttg	ccgacgaagc	caggaagccc	6000

cagcgtccgg 6010 <210> 2 <211> 919 <212> PRT <213> Methylophilus methylotrophus

<400> 2 Met Ala Leu 1

Ser

Trp 5

Asn

Glu

Ile

Arg

Arg 10

Lys

Ala

Ile

Glu

Phe 15

Ser

Lys Arg Trp

Glu

Asp

Ala

Ser

Asp

Glu

Asn

Ser

Gln

Ala

Lys

Pro

Phe

20

25

30

Leu ile Asp

Phe

Phe

Glu

Val

Phe

Gly

Ile

Thr

Asn

Lys

Arg

Val

Ala

35

40

45

Thr Phe Glu

His

Ala

Val

Lys

Lys

Phe

Ala

Lys

Ala

Hi s

Lys

Glu

Gln

50

55

60

Ser Arg Gly

Phe

val

Asp

Leu

Phe

T rp

Pro

Gly

Ile

Leu

Leu

Ile

Glu

65

70

75

80

Met Lys ser

Arg

Gly

Lys

Asp

Leu

Asp

Lys

Ala

Tyr

Asp

Gln

Al a

Leu

85

90

95

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Asp

Tyr Phe

Ser 100

Gly

Ile Ala Glu Arg Asp Leu 105

Pro

Arg

Tyr 110

val

Leu

val

cys

Asp

Phe

Gin

Arg

Phe

Arg

Leu

Thr

Asp

Leu

Ile

Thr

Lys

Glu

115

120

125

Ser

val

Glu

Phe

Leu

Leu

Lys

Asp

Leu

Tyr

Gin

Asn

val

Arg

ser

phe

130

135

140

Gly

Phe

Ile

Ala

Gly

Tyr

Gin

Thr

Gin

val

Ile

Lys

Pro

Gin

Asp

Pro

145

150

155

160

Ile

Asn

Ile

Lys

Ala

Ala

Glu

Arg

Met

Gly

Lys

Leu

Hi s

Asp

Thr

Leu

165

170

175

Lys

Leu

val

Gly

Tyr

Glu

Gly

His

Ala

Leu

Glu

Leu

Tyr

Leu

Val

Arg

180

185

190

Leu

Leu

Phe

cys

Leu

Phe

Ala

Glu

Asp

Thr

Thr

Ile

Phe

Glu

Lys

Ser

195

200

205

Leu

Phe

Gin

Glu

Tyr

Ile

Glu

Thr

Lys

Thr

Leu

Glu

ASP

Gly

Ser

Asp

210

215

220

Leu

Ala

His

Hi s

ile

Asn

Thr

Leu

phe

Tyr

val

Leu

Asn

Thr

Pro

Glu

225

230

235

240

Gin

Lys

Arg

Leu

Lys

Asn

Leu

Asp

Glu

His

Leu

Ala

Ala

Phe

Pro

Tyr

245

250

255

Ile

Asn

Gly

Lys

Leu

Phe

Glu

Glu

Pro

Leu

Pro

Pro

Ala

Gin

Phe

Asp

260

265

270

Lys

Al a

Met

Arg

Glu

Al a

Leu

Leu

Asp

Leu

cys

Ser

Leu

Asp

Trp

Ser

275

280

285

Arg

Ile

Ser

Pro

Al a

Ile

Phe

Gly

Ser

Leu

Phe

Gin

Ser

Ile

Met

Asp

290

295

300

Ala

Lys

Lys

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

Ala

His

Tyr

Thr

Ser

Glu

Ala

Asn

305

310

315

320

Ile

Leu

Lys

Leu

Ile

Lys

Pro

Leu

Phe

Leu

Asp

Glu

Leu

Trp

Val

Glu

325

330

335

Phe

Glu

Lys

val

Lys

Asn

Asn

Lys

Asn

Lys

Leu

Leu

Al a

Phe

His

Lys

340

345

350

Lys

Leu

Arg

Gly

Leu

Thr

Phe

Phe

ASP

Pro

Al a

cys

Gly

cys

Gly

Asn

355

360

365

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Phe Leu 370

val

ile

Thr Tyr Arg Glu 375

Leu

Arg Leu

Leu 380

Glu

Ile

Glu

Val

Leu

Arg

Gly

Leu

His

Arg

Gly

Gly

Gin

Gin

val

Leu

Asp

Ile

Glu

His

385

390

395

400

Leu

Ile

Gin

ile

Asn

val

Asp

Gin

Phe

Phe

Gly

ile

Glu

Ile

Glu

Glu

405

410

415

Phe

Pro

Ala

Gin

Ile

Ala

Gin

Val

Ala

Leu

Trp

Leu

Thr

Asp

His

Gin

420

425

430

Met

Asn

Met

Lys

Ile

Ser

Asp

Glu

Phe

Gly

Asn

Tyr

Phe

Ala

Arg

ile

435

440

445

Pro

Leu

Lys

Ser

Thr

Pro

Hi s

Ile

Leu

Asn

Al a

Asn

Ala

Leu

Gin

Ile

450

455

460

Asp

Trp

Asn

Asp

Val

Leu

Glu

Ala

Lys

Lys

cys

cys

Phe

Ile

Leu

Gly

455

470

475

480

Asn

Pro

pro

Phe

val

Gly

Lys

ser

Lys

Gin

Thr

pro

Gly

Gin

Lys

Al a

485

490

495

Asp

Leu

Leu

ser

val

Phe

Gly

Asn

Leu

Lys

Ser

Ala

Ser

Asp

Leu

Asp

500

505

510

Leu

val

Ala

Ala

Trp

Tyr

pro

Lys

Ala

Ala

His

Tyr

ile

Gin

Thr

Asn

515

520

525

Ala

Asn

Ile

Arg

cys

Ala

Phe

Val

Ser

Thr

Asn

Ser

ile

Thr

Gin

Gly

530

535

540

Glu

Gin

Val

Ser

Leu

Leu

Trp

Pro

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

Gly

Ile

Lys

545

550

555

560

Ile

Asn

Phe

Al a

His

Arg

Thr

Phe

Ser

Trp

Thr

Asn

Glu

Ala

Ser

Gly

565

570

575

Val

Ala

Ala

val

His

Cys

Val

Ile

Ile

Gly

Phe

Gly

Leu

Lys

Asp

Ser

580

585

590

Asp

Glu

Lys

ile

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Glu

Ser

Ile

Asn

Gly

Glu

Pro

Leu

595

600

605

Ala

Ile

Lys

Al a

Lys

Asn

Ile

Asn

Pro

Tyr

Leu

Arg

Asp

Gly

Val

Asp

610

615

620

val

ile

Ala

cys

Lys

Arg

Gin

Gin

Pro

Ile

ser

Lys

Leu

pro

Ser

Met

625

630

635

640

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Arg Tyr Gly Asn

Lys 645

Pro

Thr

Asp Asp

Gly Asn 650

Phe

Leu

Phe

Thr 655

Asp

Glu

Glu

Lys

Asn

Gin

Phe

ile

Thr

Asn

Glu

Pro

Ser

Ser

Glu

Lys

Tyr

660

665

670

Phe

Arg

Arg

Phe

Val

Gly

Gly

Asp

Glu

Phe

ile

Asn

Asn

Thr

Ser

Arg

675

680

685

Trp

cys

Leu

Trp

Leu

Asp

Gly

Ala

Asp

Ile

Ser

Glu

Ile

Arg

Ala

Met

690

695

700

Pro

Leu

Val

Leu

Ala

Arg

ile

Lys

Lys

Val

Gin

Glu

Phe

Arg

Leu

Lys

705

710

715

720

ser

Ser

Ala

Lys

pro

Thr

Arg

Gin

Ser

Al a

Ser

Thr

Pro

Met

Lys

Phe

725

730

735

Phe

Tyr

Ile

Ser

Gin

Pro

Asp

Thr

Asp

Tyr

Leu

Leu

Ile

Pro

Glu

Thr

740

745

750

Ser

Ser

Glu

Asn

Arg

Gin

Phe

Ile

Pro

ile

Gly

Phe

val

Asp

Arg

Asn

755

760

765

val

Ile

Ser

ser

Asn

Ala

Thr

Tyr

His

ile

Pro

ser

Ala

Glu

Pro

Leu

770

775

780

Ile

Phe

Gly

Leu

Leu

Ser

Ser

Thr

Met

His

Asn

Cys

Trp

Met

Arg

Asn

785

790

795

800

val

Gly

Gly

Arg

Leu

Glu

Ser

Arg

Tyr

Arg

Tyr

Ser

Ala

Ser

Leu

val

805

810

815

Tyr

Asn

Thr

Phe

Pro

Trp

Ile

Gin

Pro

Asn

Glu

Lys

Gin

Ser

Lys

Ala

820

825

830

Ile

Glu

Glu

Ala

Al a

Phe

Ala

ile

Leu

Lys

Ala

Arg

Ser

Asn

Tyr

Pro

835

840

845

Asn

Glu

Ser

Leu

Al a

Gly

Leu

Tyr

Asp

Pro

Lys

Thr

Met

Pro

Ser

Glu

850

855

860

Leu

Leu

Lys

Ala

His

Gin

Lys

Leu

Asp

Lys

Ala

val

Asp

Ser

Val

Tyr

865

870

875

880

Gly

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

Thr

Glu

Ile

Ala

Arg

Ile

Ala

Phe

Leu

Phe

885

890

895

Glu

Thr

Tyr

Gin

Lys

Met

Thr

Ser

Leu

Leu

Pro

Pro

Glu

Lys

Glu

Ile

900

905

910

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Lys Lys Ser Lys Gly Lys Asn 915 <210> 3 <211> 932 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> GenBank Nr gi|28373198|ref|NP_783835.1

<400> 3 Met Pro Thr 1

Arg

Gin 5

Gin

Al a

Al a

Arg

Glu 10

Phe

val

Lys

Thr

τ rp 15

Ser

Ser Asp Lys

Lys

Gly

Arg

Glu

Asp

Ala

Asp

Arg

Gin

Thr

Phe

Trp

Asn

20

25

30

Asp Leu Leu

Gin

Arg

val

Tyr

Gly

Ile

Asp

Asn

Tyr

Tyr

Asp

Tyr

Ile

35

40

45

Thr Tyr Glu

Lys

Asp

val

Gin

val

Lys

Al a

Asp

Gly

Lys

Val

Thr

Thr

50

55

60

Arg Arg ile

Asp

Gly

Tyr

ile

Pro

Ser

Thr

Lys

Ile

Met

val

Glu

Met

65

70

75

80

Lys Gly Lys

Asn

Ile

Lys

Asp

Leu

Ser

Lys

Pro

Ile

Thr

Gin

Ser

Gly

85

90

95

Gly Asp Glu

Leu

Thr

Pro

Phe

Glu

Gin

Al a

Lys

Arg

Tyr

Ala

Asn

Phe

100

105

110

Leu Pro Asn

Ser

Glu

Gin

Pro

Arg

Trp

Ile

Leu

val

Ser

Asn

Phe

Asn

115

120

125

Glu ile Asp

ile

His

Asp

Met

Glu

Arg

Pro

Leu

Asp

Glu

Pro

Lys

val

130

135

140

ile Lys Leu

Glu

Asp

Leu

Pro

Lys

Lys

val

Lys

Ser

Leu

Glu

Phe

Met

145

150

155

160

Val Asp Ala

Asn

Gin

Gin

Gin

val

ile

Asp

Glu

Lys

Gin

Leu

Ser

val

165

170

175

Asp Ala Gly

Asn

Leu

val

Ala

Lys

ile

Tyr

Asn

Glu

Leu

Thr

Asn

Ala

180

185

190

Tyr Ala Ala

Gly

Arg

Gly

Ile

Asp

Val

Asn

Glu

Pro

Arg

ile

Gin

Arg

195

200

205

Ser Leu Asn

Met

Leu

ile

Val

Arg

Leu

Val

Phe

Leu

Leu

Tyr

Ala

Asp

210

215

220

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Asp 225

Ser Asn

Leu Phe Gly 230

Lys Glu Asp Ile

Phe Gin Ala 235

Phe

Ile

Glu 240

Arg

Arg

Glu

Pro

Arg

Asp

Ile

Arg

Arg

Asp

Leu

Ser

Glu

Leu

Phe

Lys

245

250

255

Val

Leu

Asp

Gin

Pro

Glu

Glu

Gin

Arg

Asp

Pro

Tyr

Leu

Asp

Asp

Glu

260

265

270

Phe

Asn

Gin

Phe

Ala

Tyr

Val

Asn

Gly

Gly

Met

Phe

Ser

Asp

Glu

Asn

275

280

285

val

Ile

Ile

Pro

Gin

Phe

Thr

Asp

Glu

Leu

Lys

Arg

Leu

Ile

val

Glu

290

295

300

Asp

Ala

Gly

Arg

Gly

Phe

Asp

Trp

Ser

Gly

Ile

Ser

Pro

Thr

Ile

Phe

305

310

315

320

Gly

Ala

val

Phe

Glu

Ser

Thr

Leu

Asn

Pro

Glu

Thr

Arg

Arg

Ser

Gly

325

330

335

Gly

Met

His

Tyr

Thr

Ser

Ile

Glu

Asn

Ile

Hi s

Lys

Val

Ile

Asp

Pro

340

345

350

Leu

Phe

Leu

Asn

Asp

Leu

His

Asp

Glu

Phe

Asp

Lys

Ile

Gin

Asn

Met

355

360

365

Gly

Asn

Arg

Arg

Gin

Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Lys

Ala

Phe

Arg

Asp

Lys

370

375

380

Leu

Gly

Lys

Leu

Lys

Phe

Phe

Asp

Pro

Ala

Cys

Gly

Ser

Gly

Asn

Phe

385

390

395

400

Leu

Thr

Glu

Thr

Tyr

Leu

Ser

Leu

Arg

Lys

Met

Glu

Asn

Glu

Cys

Leu

405

410

415

Arg

Ile

Ile

Val

Gly

Asn

Gin

Gly

Ala

Leu

Al a

Leu

Thr

Asp

Glu

Ser

420

425

430

Glu

Pro

Lys

Val

Lys

Ile

Gin

Asn

Phe

Tyr

Gly

ile

Glu

Ile

Asn

Asp

435

440

445

Phe

Ala

Val

Ser

Val

Al a

Arg

Thr

Ala

Met

Trp

ile

Ala

Glu

Ser

Gin

450

455

460

Met

T rp

Glu

Gin

Thr

Lys

Asp

Ile

Thr

Phe

Ala

Asn

Lys

Asp

Phe

Leu

465

470

475

480

Pro

Leu

Asp

Ser

Asn

Asp

Ser

Ile

Tyr

Glu

Gly

Asn

Ala

Leu

Arg

Met

485

490

495

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Asp Trp Asn Asp ile

val

Lys

Pro Tyr Glu 505

Leu

Asp

Tyr

Ile 510

Met

Gly

500

Asn

Pro

pro

Phe

val

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gln

Thr

Lys

Glu

Gln

Lys

Gln

515

520

525

Asp

Ile

Lys

Gln

Glu

Phe

Phe

Lys

Tyr

Thr

Asp

Lys

Tyr

Gly

Lys

Phe

530

535

540

Asp

Tyr

Val

Ser

Gly

T rp

Tyr

Ile

Lys

Gly

Ala

Lys

Tyr

Ile

Gl n

Asn

545

550

555

560

Ser

Thr

Ile

Lys

Val

Gly

Phe

val

Ser

Thr

Asp

Ser

ile

Ile

Gln

Gly

565

570

575

Glu

Gln

Ala

Pro

Glu

Ile

Trp

Lys

val

Leu

Phe

Asn

Asp

Phe

Hi s

Ile

580

585

590

Phe

Ile

Asn

Tyr

Gly

Tyr

Arg

Ser

Phe

Glu

Trp

Asn

Asn

Glu

Ala

Ala

595

600

605

Asn

Lys

Ala

Lys

val

Asp

Val

Val

Ile

val

Gly

Phe

Ser

Thr

Lys

Glu

610

615

620

Asp

Lys

Asn

Pro

Thr

Ile

Tyr

Asp

Glu

Gln

Lys

Ile

Ile

Ser

Ala

Lys

625

630

635

640

His

Ile

Asn

Gln

Tyr

Met

Tyr

Asp

Ser

Asp

Asn

Ile

Phe

Ile

Asp

Thr

645

650

655

Thr

Arg

Lys

Tyr

Ile

Glu

Ala

Met

Pro

Lys

Met

Lys

Thr

Gly

Asn

Arg

660

665

670

pro

Ala

Asp

Gly

Gly

Al a

Leu

Ile

Leu

Ser

Pro

Lys

Glu

Ala

Lys

Glu

675

680

685

Leu

val

Asn

Glu

Glu

pro

Gln

Ser

Lys

Gln

Phe

Ile

Lys

Lys

Leu

Thr

690

695

700

Gly

ser

Lys

Glu

Phe

ile

Thr

Gly

Lys

Tyr

Arg

Tyr

cys

Leu

Trp

Leu

705

710

715

720

val

Asn

val

Thr

Pro

Lys

Gln

Leu

Arg

ser

Met

Pro

Leu

val

Leu

Lys

725

730

735

Arg

val

Glu

Gln

Cys

Lys

Glu

Asn

Arg

Leu

ser

Gly

Ala

Pro

ASp

Arg

740

745

750

Gln

Lys

Leu

Ala

Ala

Thr

Pro

His

Leu

Phe

Arg

Glu

Gln

Met

Asn

Pro

755

760

765

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Asp Asn Tyr

Met

ile val

Pro Leu 775

Val

Thr

Gly

cys 780

Arg

Arg

Lys

Tyr

770

Val

Pro

Phe

Gly

Tyr

Leu

Gly

Asn

Asp

ile

ile

Pro

Thr

Asn

Leu

Ala

785

790

795

800

Thr

Ile

ile

Pro

Glu

Al a

Asp

His

Tyr

Ala

Phe

Gly

val

Leu

Glu

Ser

805

810

815

Ile

Val

Hi s

Met

Al a

Trp

Met

Arg

val

Val

Ala

Gly

Arg

Lys

Gly

Thr

820

825

830

Ser

Tyr

Arg

Tyr

Ser

Lys

Asn

Leu

val

Tyr

Thr

Asn

Phe

Pro

Trp

Pro

835

840

845

val

val

ASP

ile

Asn

Gin

Lys

Glu

Lys

ile

Thr

Ile

Thr

Ala

Gin

Asp

850

855

860

Ile

Leu

Asn

Ala

Arg

Asn

Leu

Tyr

Pro

Asp

Ser

Ser

Leu

Ala

Asp

Leu

865

870

875

880

Tyr

Asp

Pro

Leu

Thr

Met

Pro

Ile

Glu

Leu

Arg

Lys

Ala

His

Glu

Ala

885

890

895

Asn

Asp

Lys

Ala

Val

Leu

Lys

Al a

Tyr

Gly

Leu

Lys

Pro

Ser

Ala

Thr

900

905

910

Glu

pro

Glu

ile

val

Gin

Hi s

Leu

Phe

Lys

Met

Tyr

Glu

Lys

Leu

Thr

915

920

925

Lys

Lys

Asp

T rp

930 <210> 4 <211> 354 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223>	GenBank	Nr gi|27450519|gb|AA014619.1|AF465251_62
<400>	4
Val Leu	Phe Asn	Asp Phe His Ile Phe Ile Asn Tyr Gly Tyr Arg Ser
1		5 10 15
Phe Glu	Trp Asn	Asn Glu Ala Ala Asn Lys Ala Lys val Asp val val
	20	25 30
Ile Val	Gly Phe	Ser Thr Lys Glu Asp Lys Asn Pro Thr Ile Tyr Asp
	35	40 45

PL 208 400 B1

NEB-207-PIN.ST25

Ser Ser Asn Ile Ser His Cys

Lys Asn Ile

Asn

Gly 60

Tyr

Leu

Phe

Asp

50

55

Gly

Asn

Asn

ile

Phe

Val

Thr

Asn

Arg

Pro

Ala

Pro

Leu

Ser

Asn

val

65

70

75

80

pro

Arg

Met

His

Asn

Gly

cys

Lys

Leu

Leu

ASP

Gly

Gly

Phe

Tyr

Thr

85

90

95

Leu

Thr

Ser

Gin

Glu

Arg

Lys

Glu

Ala

Ile

Ser

Lys

Asp

Pro

Tyr

Al a

100

105

110

Asp

Lys

Phe

ile

Arg

Pro

Tyr

Leu

Gly

Ala

Lys

Asn

Phe

ile

Hi s

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Arg

Tyr

cys

ile

Trp

Leu

Lys

Asp

Al a

Asn

pro

Lys

Asp

Ile

130

135

140

His

Gin

Ser

Pro

Phe

ile

Leu

Asp

Arg

Ile

Asn

Lys

Val

Al a

Glu

Phe

145

150

155

160

Arg

Ser

Gin

Gin

Lys

Ser

Lys

Asp

Thr

Gin

Lys

Tyr

Ala

Lys

Arg

Pro

165

170

175

Met

Leu

Pro

Thr

Arg

Leu

Ala

Tyr

Tyr

Ser

Hi s

Asp

Glu

Hi s

Thr

Asp

180

185

190

Met

Leu

Ile

val

Pro

Al a

Thr

ser

ser

Gin

Arg

Arg

Glu

Tyr

Leu

Pro

195

200

205

Ile

Gly

Tyr

val

Ser

Glu

Lys

Asn

ile

val

Ser

Tyr

Ser

Leu

Met

Leu

210

215

220

Ile

Pro

Asn

Ala

Ser

Asn

Phe

Asn

Phe

Gly

Ile

Leu

Glu

Ser

Lys

Val

225

230

235

240

His

Tyr

Ile

Trp

Leu

Lys

Asn

Phe

cys

Gly

Arg

Leu

Lys

Ser

ASP

Tyr

245

250

255

Arg

Tyr

Ser

Asn

Thr

Ile

Ile

Tyr

Asn

Asn

Phe

Pro

Trp

Pro

Thr

val

260

265

270

Gly

Asp

Lys

Gin

Glu

Gin

Asn

Ile

Ser

Glu

Thr

Ala

Gin

Gly

Ile

Leu

275

280

285

Asn

Thr

Arg

Lys

Leu

Tyr

Pro

Asp

Ser

ser

Leu

Ala

ASP

Leu

Tyr

Asp

290

295

300

Pro

Leu

Thr

Met

Pro

val

Glu

Leu

Arg

Lys

Ala

Hi s

Glu

Ala

Asn

Asp

305

310

315

320

PL 208 400 B1

NEB-207-PIN.ST25

Lys

Al a

val

Leu

Lys

Ala

Tyr

Gly

Leu ser pro Lys

Ala

Thr

Glu

Gin

325

330

335

Glu

Ile

Val

Glu

His

Leu

Phe

Lys

Met Tyr Glu Lys

Leu

Thr

Lys

Gly

340 345 350

Glu Arg <210> 5 <211> 919 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> M. methylotrophus aminokwas <400> 5

Met Ala Leu ser Trp

Asn

Glu

Ile Arg Arg Lys Ala 10

Ile

Glu

Phe 15

Ser

1

5

Lys

Arg

Trp

Glu

ASp

Ala

ser

Asp

Glu

Asn

ser

Gin

Ala

Lys

Pro

Phe

20

25

30

Leu

Ile

Asp

Phe

Phe

Glu

Val

Phe

Gly

Ile

Thr

Asn

Lys

Arg

Val

Ala

35

40

45

Thr

Phe

Glu

Hi s

Al a

Val

Lys

Lys

Phe

Ala

Lys

Ala

Hi s

Lys

Glu

Gin

50

55

60

Ser

Arg

Gly

Phe

val

Asp

Leu

Phe

Trp

Pro

Gly

Ile

Leu

Leu

Ile

Glu

65

70

75

80

Met

Lys

Ser

Arg

Gly

Lys

Asp

Leu

Asp

Lys

Ala

Tyr

Asp

Gin

Ala

Leu

85

90

95

Asp

Tyr

Phe

Ser

Gly

ile

Ala

Glu

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg

Tyr

val

Leu

100

105

110

val

cys

Asp

Phe

Gin

Arg

Phe

Arg

Leu

Thr

Asp

Leu

Ile

Thr

Lys

Glu

115

120

125

Ser

Val

Glu

Phe

Leu

Leu

Lys

Asp

Leu

Tyr

Gin

Asn

val

Arg

Ser

Phe

130

135

140

Gly

Phe

Ile

Ala

Gly

Tyr

Gin

Thr

Gin

Val

Ile

Lys

Pro

Gin

Asp

Pro

145

150

155

160

ile

Asn

ile

Lys

Al a

Ala

Glu

Arg

Met

Gly

Lys

Leu

His

Asp

Thr

Leu

165

170

175

Lys

Leu

val

Gly

Tyr

Glu

Gly

His

Ala

Leu

Glu

Leu

Tyr

Leu

Val

Arg

180

185

190

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Leu

Leu Phe Cys 195

Leu

Phe Ala Glu 200

Asp Thr Thr

ile

Phe 205

Glu

Lys

Ser

Leu

Phe

Gin

Glu

Tyr

Ile

Glu

Thr

Lys

Thr

Leu

Glu

Asp

Gly

Ser

Asp

210

215

220

Leu

Ala

Hi s

Hi s

ile

Asn

Thr

Leu

Phe

Tyr

val

Leu

Asn

Thr

Pro

Glu

225

230

235

240

Gin

Lys

Arg

Leu

Lys

Asn

Leu

Asp

Glu

His

Leu

Al a

Ala

Phe

pro

Tyr

245

250

255

ile

Asn

Gly

Lys

Leu

Phe

Glu

Glu

Pro

Leu

Pro

Pro

Ala

Gin

Phe

Asp

260

265

270

Lys

Ala

Met

Arg

Glu

Ala

Leu

Leu

Asp

Leu

cys

ser

Leu

ASp

Trp

Ser

275

280

285

Arg

Ile

Ser

Pro

Ala

Ile

Phe

Gly

Ser

Leu

Phe

Gin

ser

Ile

Met

Asp

290

295

300

Ala

Lys

Lys

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

Al a

His

Tyr

Thr

Ser

Glu

Ala

Asn

305

310

315

320

Ile

Leu

Lys

Leu

Ile

Lys

Pro

Leu

Phe

Leu

Asp

Glu

Leu

Trp

val

Glu

325

330

335

Phe

Glu

Lys

val

Lys

Asn

Asn

Lys

Asn

Lys

Leu

Leu

Ala

Phe

His

Lys

340

345

350

Lys

Leu

Arg

Gly

Leu

Thr

Phe

Phe

Asp

Pro

Ala

cys

Gly

Cys

Gly

Asn

355

360

365

Phe

Leu

Val

Ile

Thr

Tyr

Arg

Glu

Leu

Arg

Leu

Leu

Glu

Ile

Glu

val

370

375

380

Leu

Arg

Gly

Leu

His

Arg

Gly

Gly

Gin

Gin

Val

Leu

Asp

Ile

Glu

His

385

390

395

400

Leu

Ile

Gin

Ile

Asn

val

Asp

Gin

Phe

Phe

Gly

Ile

Glu

Ile

Glu

Glu

405

410

415

Phe

Pro

Ala

Gin

Ile

Al a

Gin

Val

Ala

Leu

Trp

Leu

Thr

Asp

Hi s

Gin

420

425

430

Met

Asn

Met

Lys

Ile

ser

Asp

Glu

Phe

Gly

Asn

Tyr

Phe

Al a

Arg

Ile

435

440

445

Pro

Leu

Lys

Ser

Thr

Pro

Hi s

ile

Leu

Asn

Ala

Asn

Ala

Leu

Gin

Ile

450 455 460

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

ASP 465

Trp Asn

Asp val

Leu Glu 470

Ala

Lys

Lys Cys Cys Phe ile Leu Gly

475

480

Asn

Pro

Pro

Phe

val

Gly

Lys

Ser

Lys

Gin

Thr

Pro

Gly

Gin

Lys

Ala

485

490

495

Asp

Leu

Leu

Ser

Val

Phe

Gly

Asn

Leu

Lys

Ser

Ala

Ser

Asp

Leu

Asp

500

505

510

Leu

val

Ala

Ala

Trp

Tyr

Pro

Lys

Al a

Ala

Hi s

Tyr

Ile

Gl n

Thr

Asn

515

520

525

Al a

Asn

ile

Arg

cys

Al a

Phe

val

Ser

Thr

Asn

Ser

ile

Thr

Gin

Gly

530

535

540

Glu

Gin

Val

Ser

Leu

Leu

T rp

Pro

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

Gly

Ile

Lys

545

550

555

560

ile

Asn

Phe

Ala

His

Arg

Thr

Phe

ser

Trp

Thr

Asn

Glu

Al a

Ser

Gly

565

570

575

val

Ala

Ala

val

His

cys

val

ile

Ile

Gly

Phe

Gly

Leu

Lys

ASP

Ser

580

585

590

Asp

Glu

Lys

Ile

Ile

Tyr

Glu

Tyr

Glu

Ser

ile

Asn

Gly

Glu

Pro

Leu

595

600

605

Ala

Ile

Lys

Ala

Lys

Asn

ile

Asn

Pro

Tyr

Leu

Arg

Asp

Gly

val

Asp

610

615

620

val

Ile

Al a

cys

Lys

Arg

Gin

Gin

pro

ile

Ser

Lys

Leu

Pro

Ser

Met

625

630

635

640

Arg

Tyr

Gly

Asn

Lys

Pro

Thr

Asp

Asp

Gly

Asn

phe

Leu

Phe

Thr

ASP

645

650

655

Glu

Glu

Lys

Asn

Gin

Phe

Ile

Thr

Asn

Glu

Pro

Ser

Ser

Glu

Lys

Tyr

660

665

670

Phe

Arg

Arg

Phe

Val

Gly

Gly

Asp

Glu

Phe

Ile

Asn

Asn

Thr

Ser

Arg

675

680

685

Trp

cys

Leu

Trp

Leu

Asp

Gly

Ala

Asp

Ile

Ser

Glu

Ile

Arg

Ala

Met

690

695

700

Pro

Leu

val

Leu

Ala

Arg

Ile

Lys

Lys

val

Gin

Glu

Phe

Arg

Leu

Lys

705

710

715

720

Ser

Ser

Ala

Lys

Pro

Thr

Arg

Gin

Ser

Ala

Ser

Thr

Pro

Met

Lys

Phe

725

730

735

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Phe Tyr

ile Ser 740

Gin

Pro

Asp

Thr Asp 745

Tyr

Leu

Leu

Ile

Pro 750

Glu

Thr

Ser

Ser

Glu

Asn

Arg

Gin

Phe

Ile

pro

ile

Gly

Phe

val

ASp

Arg

Asn

755

760

765

val

ile

ser

Ser

Asn

Ala

Thr

Tyr

His

ile

Pro

Ser

Ala

Glu

Pro

Leu

770

775

780

Ile

Phe

Gly

Leu

Leu

Ser

Ser

Thr

Met

His

Asn

cys

Trp

Met

Arg

Asn

785

790

795

800

val

Gly

Gly

Arg

Leu

Glu

Ser

Arg

Tyr

Arg

Tyr

Ser

Al a

Ser

Leu

val

805

810

815

Tyr

Asn

Thr

Phe

Pro

Trp

ile

Gin

Pro

Asn

Glu

Lys

Gin

Ser

Lys

Ala

820

825

830

Ile

Glu

Glu

Ala

Al a

Phe

Ala

Ile

Leu

Lys

Ala

Arg

Ser

Asn

Tyr

Pro

835

840

845

Asn

Glu

Ser

Leu

Ala

Gly

Leu

Tyr

Asp

Pro

Lys

Thr

Met

Pro

Ser

Glu

850

855

860

Leu

Leu

Lys

Ala

His

Gin

Lys

Leu

Asp

Lys

Ala

val

Asp

ser

val

Tyr

865

870

875

880

Gly

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

Thr

Glu

ile

Ala

Arg

Ile

Ala

Phe

Leu

Phe

885

890

895

Glu

Thr

Tyr

Gin

Lys

Met

Thr

Ser

Leu

Leu

Pro

Pro

Glu

Lys

Glu

Ile

900

905

910

Lys

Lys

ser

Lys

Gly

Lys

Asn

915 <210> 6 <211> 936 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> GenBank Nr gi|15794682jref|ΝΡ_284504.1 <400> 6

Met 1

Lys

Thr

Leu

Leu 5

Gin

Leu

Gin

Thr

Ala 10

Ala

Gin

Asn

Phe

Ala 15

Ala

Tyr

Tyr

Lys

Asp

Gin

Thr

Asp

Glu

Arg

Arg

Glu

Lys

Asp

Thr

Phe

Asn

25 30

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Glu Phe Phe

Ala

ile

Phe Gly ile 40

Asp Arg

Lys

Asn

Val 45

Al a

Hi s

Phe

35

Glu

Tyr

Pro

val

Lys

Asp

Pro

Al a

Asp

Asn

Thr

Gln

Phe

Val

Asp

ile

50

55

60

Phe

Trp

Glu

Gly

ile

Phe

Leu

Ala

Glu

Hi s

Lys

Ser

Al a

Asn

Lys

Asn

65

70

75

80

Leu

Thr

Lys

Ala

Lys

Glu

Gln

Ala

Glu

Arg

Tyr

Leu

Gln

Glu

Ile

Gly

85

90

95

Arg

Thr

Lys

Pro

ser

Ala

Leu

Pro

Glu

Tyr

Tyr

Ala

Val

Ser

Asp

Phe

100

105

110

Ala

Hi s

Phe

Hi s

Leu

Tyr

Arg

Arg

Val

Pro

Glu

Glu

Gly

Ala

Glu

Asn

115

120

125

Gln

Trp

Gln

Phe

pro

Leu

Glu

Glu

Leu

Pro

Glu

Tyr

Ile

Thr

Arg

Gly

130

135

140

val

Phe

Asp

Phe

Met

Phe

Gly

Ile

Glu

Ala

Lys

val

Arg

Gln

Ile

Gln

145

150

155

160

Glu

Glu

Ala

Asn

ile

Gln

Ala

Al a

Ala

Thr

ile

Gly

Arg

Leu

His

Asp

165

170

175

Ala

Leu

Lys

Glu

Glu

Gly

Ile

Tyr

Glu

Glu

Hi s

Glu

Leu

Arg

Leu

Phe

180

185

190

Ile

Thr

Arg

Leu

Leu

Phe

Leu

Phe

Phe

Ala

Asp

Asp

Ser

Ala

val

Phe

195

200

205

Arg

Arg

Asn

Tyr

Leu

Phe

Gln

Asp

Phe

Leu

Glu

Asn

Cys

Lys

Glu

Ala

210

215

220

Asp

Thr

Leu

Gly

Asp

Lys

Leu

Asn

Gln

Leu

Phe

Glu

Phe

Leu

Asn

Thr

225

230

235

240

Pro

Asp

Gln

Lys

Arg

Ser

Lys

Thr

Gln

Ser

Glu

Lys

Phe

Lys

Gly

Phe

245

250

255

Glu

Tyr

Val

Asn

Gly

Gly

Leu

Phe

Lys

Glu

Arg

Leu

Arg

Thr

Phe

Asp

260

265

270

Phe

Thr

Ala

Lys

Gln

Hi s

Arg

Al a

Leu

Ile

Asp

cys

Gly

Asn

Phe

Asp

275

280

285

Trp

Arg

Asn

ile

Ser

Pro

Glu

ile

Phe

Gly

Thr

Leu

Phe

Gln

Ser

val

290

295

300

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Met

Asp

Ala

Gin

Glu

Arg

Arg

Glu

Ala

Gly

Ala

His

Tyr

Thr

Glu

Ala

305

310

315

320

Ala

Asn

Ile

Asp

Lys

val

ile

Asn

Gly

Leu

Phe

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

325

330

335

Ala

Glu

Phe

Glu

Ala

Val

Lys

Ala

Leu

Lys

Arg

Asp

Lys

Ala

Lys

Lys

340

345

350

Leu

Ala

Ala

Phe

Tyr

Gin

Lys

Ile

Gin

Asn

Leu

Gin

Phe

Leu

Asp

Pro

355

360

365

Al a

cys

Gly

cys

Gly

Asn

Phe

Leu

ile

val

Al a

Tyr

Asp

Arg

ile

Arg

370

375

380

Ala

Leu

Glu

Asp

Asp

Ile

Ile

Ala

Glu

Ala

Leu

Lys

Asp

Lys

Ala

Asp

385

390

395

400

Gly

Leu

Phe

Asp

Ser

Pro

Ser

val

Gin

cys

Arg

Leu

Lys

Gin

Phe

Hi s

405

410

415

Gly

Ile

Glu

ile

Asp

Glu

Phe

Ala

val

Leu

ile

Ala

Arg

Thr

Ala

Met

420

425

430

Trp

Leu

Lys

Asn

Hi s

Gin

cys

Asn

Ile

Arg

Thr

Gin

ile

Arg

Phe

Asp

435

440

445

Gly

Glu

Val

Ala

cys

Hi s

Thr

Leu

Pro

Leu

Glu

Asp

Ala

Ala

Glu

Ile

450

455

460

Ile

His

Ala

Asn

Ser

Leu

Arg

Thr

Pro

Trp

Gin

Ala

Ala

Asp

Tyr

ile

465

470

475

480

Phe

Gly

Asn

Pro

Pro

Phe

Ile

Gly

Ser

Thr

Tyr

Gin

Thr

Lys

Glu

Gin

485

490

495

Lys

Asn

Asp

Leu

Glu

Ser

Ile

Cys

Gly

His

ile

Lys

Gly

Tyr

Gly

Leu

500

505

510

Leu

Asp

Tyr

val

cys

Asn

Trp

Tyr

val

Lys

Ala

Ala

Gly

Ile

Met

Ala

515

520

525

Gin

Hi s

Pro

Gin

val

Gin

Thr

Ala

Phe

Val

Ser

Thr

Asn

Ser

ile

Cys

530

535

540

Gin

Gly

Gin

Gin

Val

Glu

Ile

Leu

Trp

Gly

Ser

Leu

Leu

Asn

Gin

Gly

545

550

555

560

Ile

Glu

ile

His

Phe

Al a

Hi s

Arg

Thr

phe

Gin

Trp

Thr

Ser

Gin

Ala

565

570

575

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Ala	Gly	Lys	Ala 580	Ala	val	Hi s	cys
Pro	Pro	Met 595	Pro	Ser	Glu	Lys	Thr 600
Gly	Glu 610	Pro	Glu	Lys	Hi s	Al a 615	val
Asp 625	Ala	pro	Asp	Leu	ile 630	Ile	Ala
Glu	Pro	Asp	Met	val 645	Asn	Gly	Ser
Ile	Leu	Ser	Thr 660	Ala	Glu	Lys	Asp
Ala	Glu	Gin 675	Tyr	Ile	Arg	Pro	Phe 680
Gly	Lys 690	Thr	Arg	Trp	cys	Leu 695	Trp
Arg 705	Asn	Hi s	Asp	Leu	Lys 710	Gin	Met
Ala	val	Lys	Thr	Met 725	Arg	Glu	Al a
Asp	Ala	Ala	Thr 740	Pro	Trp	Leu	Phe
Gly	Asn	Tyr 755	Leu	ile	ile	Pro	ser 760
Ile	Pro 770	Ile	Gly	Tyr	Leu	Ser 775	Phe
Phe 785	Ile	Leu	Pro	Asn	Ala 790	Thr	Leu
Thr	Met	His	Asn	Ala 805	Phe	Met	Arg
Asp	Tyr	Arg	Tyr 820	ser	Asn	Thr	val
Glu	Ser	Cys	Arg	Leu	Pro	Ser	Glu

835 840

Ile	Val	Gly	Phe	Arg 590	Gin	Lys
Tyr	Asp	Tyr	Pro 605	Asp	Ile	Lys
Asn	Ile	Asn 620	pro	Tyr	Leu	ile
Arg	Ser 635	Arg	Pro	ile	Hi s	cys 640
Pro 650	Thr	Glu	Gly	Gly	Asn 655	Leu
Leu	Ile	Ala	Ala	Glu 670	Pro	Leu
Gly	Ala	Asp	Glu 685	Phe	Leu	Asn
Hi s	Gly	Val 700	Ser	Asp	Val	Lys
Gin	val 715	Gin	Ala	Arg	Ile	Gin 720
Ser 730	Asp	Lys	Gin	Thr	Gin 735	Lys
Lys	ile	Arg	Gin	pro 750	Ser	Asp
ser	ser	Glu	Ser 765	Arg	Arg	Phe
Thr	Val	val 780	Ser	Asn	Leu	Ala
Hi s	Phe 795	Gly	ile	Leu	Ser	Ser 800
val 810	Ala	Gly	Arg	Leu	Lys 815	Ser
Tyr	Asn	Asn	Phe	Pro 830	Phe	Pro
Asp	Arg	Pro	Asp	Pro	Leu	Arg

845

PL 208 400 B1

Ala Ala Val 850

Glu

Ala

NEB-207-PIN.ST25

Gly

Gin

Ala

Ala 855

Gin

Thr

val

Leu

Asp 860

Ala Arg

Tyr

Arg

Arg

Glu

Ala

Gin

Glu

Ala

Gly

Leu

Pro

Glu

Pro

Thr

Leu

Ala

865

870

875

880

Glu

Leu

Tyr

Ala

pro

ASp

Ala

Gly

Tyr

Thr

Ala

Leu

Asp

Lys

Ala

Hi s

885

890

895

Ala

Thr

Leu

Asp

Lys

Al a

Val

Asp

Lys

Al a

Tyr

Gly

Tyr

Lys

Thr

Gly

900

905

910

Lys

Asn

Thr

ASP

ASP

Glu

Ala

Glu

Arg

val

Ala

Phe

Leu

Phe

Glu

Leu

915

920

925

Tyr

Arg

Lys

Ala

Ala

Ala

ile

Al a

930

935

<210> 7 <211> 879 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> GenBank Nr gi|16077744|ref|ΝΡ_388558.1 <400> 7

Met Ala 1

Leu

Ile

Asp 5

Leu Glu Asp Lys Ile Ala Glu Ile Val 10

Asn 15

Arg

Glu

Asp

His

Ser

Asp

Phe

Leu

Tyr

Glu

Leu

Leu

Gly

val

Tyr

ASP

val

20

25

30

Pro

Arg

Ala

Thr

Ile

Thr

Arg

Leu

Lys

Lys

Gly

Asn

Gin

Asn

Leu

Thr

35

40

45

Lys

Arg

val

Gly

Glu

Val

His

Leu

Lys

Asn

Lys

Val

Trp

Phe

Lys

Glu

50

55

60

Ala

Lys

Lys

Gly

Lys

Leu

Phe

Asp

Ala

Leu

Ile

ASP

Ile

Glu

Gin

Gin

65

70

75

80

val

Glu

Tyr

Leu

Ser

Ala

Lys

Pro

Arg

Tyr

Leu

Leu

Val

Thr

Asp

Tyr

85

90

95

Asp

Gly

val

Leu

Al a

Lys

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

Glu

Ala

Leu

Asp

val

100

105

110

Lys

Phe

Glu

Glu

Leu

Pro

Gin

Tyr

Phe

Asp

Phe

Phe

Leu

Ala

Trp

Lys

115

120

125

Gly

Ile

Glu

Lys

val

Glu

Phe

Glu

Lys

Glu

Asn

Pro

Ala

Asp

Ile

Lys

130

135

140

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Ala 145

Ala Glu

Arg

Phe

Ala 150

Arg

Ile

Tyr Asp val 155

Leu

Arg

Lys

Glu

Asn 160

Asn

Ile

Ile

Glu

Thr

Asn

Arg

Gly

Leu

Asp

Leu

Phe

Leu

Ile

Arg

Leu

165

170

175

Leu

Phe

cys

Phe

Phe

Ala

Glu

Asp

Thr

Asp

ile

Phe

Lys

Arg

Asn

Ser

180

185

190

Phe

Thr

Asn

Leu

Ile

Lys

Thr

Leu

Thr

Glu

Glu

Asp

Gly

Ser

Asn

Leu

195

200

205

Asn

Lys

Leu

Phe

Ala

Asp

Leu

Phe

Ile

Val

Leu

Asp

Lys

Asn

Glu

Arg

210

215

220

Asp

Asp

Val

Pro

Ser

Tyr

Leu

Lys

Glu

Phe

Pro

Tyr

val

Asn

Gly

Gin

225

230

235

240

Leu

Phe

Thr

Glu

Pro

His

Thr

Glu

Leu

Glu

Phe

Ser

Al a

Lys

Ser

Arg

245

250

255

Lys

Leu

Ile

Ile

Glu

cys

Gly

Glu

Leu

Leu

Asn

Trp

Ala

Lys

Ile

Asn

260

265

270

Pro

Asp

Ile

Phe

Gly

Ser

Met

ile

Gin

Ala

val

Ala

Ser

Glu

Glu

Ser

275

280

285

Arg

ser

Tyr

Leu

Gly

Met

His

Tyr

Thr

Ser

val

Pro

Asn

Ile

Met

Lys

290

295

300

Val

Ile

Lys

Pro

Leu

Phe

Leu

Asp

Lys

Leu

Asn

Gin

Ser

Phe

Leu

Asp

305

310

315

320

Ala

Tyr

ASp

Asp

Tyr

Thr

Lys

Leu

Glu

Asn

Leu

Leu

Thr

Arg

Ile

Gly

325

330

335

Lys

Ile

Lys

Phe

Phe

Asp

Pro

Ala

cys

Gly

Ser

Gly

Asn

Phe

Leu

ile

340

345

350

ile

Thr

Tyr

Lys

Glu

Leu

Arg

Arg

Met

Glu

Ile

Asn

Ile

Ile

Lys

Arg

355

360

365

Leu

Gin

Glu

Leu

Leu

Gly

Glu

Tyr

Leu

Tyr

val

Pro

ser

val

Thr

Leu

370

375

380

Ser

Gin

Phe

Tyr

Gly

Ile

Glu

Ile

Glu

Asp

Phe

Ala

Hi s

Asp

val

Ala

385

390

395

400

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Ile

Ala

Glu

His

Gin

Met

Asn

Glu

Glu

Leu

Lys

405 410 415

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Asn Glu

val

His 420

Asn

Al a

Val

Arg

Pro 425

Thr

Leu

Pro

Leu

Hi s 430

Thr

Ala

Gly

Asp

Ile

Arg

cys

Ala

Asn

Ala

Ile

Arg

val

Glu

Trp

Thr

Glu

Val

435

440

445

cys

Pro

Ala

Gin

Gly

Ser

Glu

Glu

Val

Tyr

Val

Phe

Gly

Asn

Pro

Pro

450

455

460

Tyr

Leu

Gly

Ser

Lys

Lys

Gin

Asn

Lys

Glu

His

Lys

Ser

Asp

Met

Leu

465

470

475

480

Ser

Ile

Phe

Gly

Lys

val

Lys

Asn

Gly

Lys

Met

Leu

Asp

Tyr

Ile

Ser

485

490

495

Ala

Trp

Phe

Tyr

Phe

Gly

Ala

Lys

Tyr

Ala

Ser

Thr

Thr

Asn

Ala

Lys

500

505

510

Val

Al a

Phe

Val

Ser

Thr

Asn

Ser

Val

Thr

Gin

Gly

Glu

Gin

Val

Ser

515

520

525

ile

Leu

Trp

Asn

Glu

Leu

Phe

Lys

Phe

Gly

Ile

Gin

Ile

Asn

Phe

Al a

530

535

540

Tyr

Lys

Ser

Phe

Lys

Trp

Ala

Asn

Asn

Ala

Lys

Asn

Asn

Ala

Ala

val

545

550

555

560

ile

val

val

ile

val

Gly

phe

Gly

pro

Leu

ASP

Thr

Lys

val

Asn

Lys

565

570

575

Tyr

Leu

Phe

val

Asp

Glu

Thr

Lys

Lys

Leu

val

ser

Asn

Ile

ser

Pro

580

585

590

Tyr

Leu

Thr

Asp

Gly

Glu

Asn

Ile

Leu

val

ser

ser

Arg

Thr

Lys

Pro

595

600

605

ile

ser

Asp

Leu

Pro

Lys

Leu

Hi s

Phe

Gly

Asn

Met

pro

Asn

ASp

Gly

610

615

620

Gly

Gly

Leu

Leu

Phe

Thr

Ile

Thr

Glu

Tyr

Thr

Asp

Ala

Ile

Asn

Lys

625

630

635

640

Tyr

Pro

Glu

Leu

val

Pro

Tyr

Phe

Lys

Lys

Phe

Ile

Gly

Ser

Val

Glu

645

650

655

Phe

Ile

Asn

Gly

Gly

Leu

Arg

Tyr

cys

Leu

T rp

Leu

Asn

Glu

Al a

Lys

660

665

670

Tyr

Glu

Lys

Ile

Lys

Ser

Asn

Pro

Leu

Ile

Gin

Glu

Arg

Ile

Ser

Ile

675

680

685

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

ser

Lys 690

Asn His

Arg

Glu

Lys 695

ser Thr Asp

Lys

Gly 700

Thr

Asn

Lys

Leu

Ala

Leu

Thr

Pro

Trp

Lys

Phe

Arg

Asp

Thr

Hi s

Glu

Thr

Thr

Asn

Tyr

705

710

715

720

Ser

ile

val

Val

Pro

Ser

val

Ser

Ser

Glu

Α5Π

Arg

Phe

Tyr

ile

pro

725

730

735

Met

Gly

Leu

Ala

Gly

Ala

Asp

Thr

ile

Leu

Ser

Asn

Leu

Ile

Tyr

Val

740

745

750

ile

Tyr

Asp

Ala

Glu

Ile

Tyr

Leu

Leu

Gly

ile

Leu

Met

Ser

Arg

Met

755

760

765

Hi s

Met

Thr

T rp

val

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Arg

Leu

Lys

Thr

Asp

Tyr

770

775

780

Arg

Tyr

Ser

Ala

Gly

Leu

cys

Tyr

Asn

Thr

Phe

Pro

Ile

Pro

Glu

Leu

785

790

795

800

Ser

Thr

Arg

Arg

Lys

Asn

Glu

Ile

Glu

Glu

Ala

ile

Leu

Glu

Ile

Leu

805

810

815

Asp

Leu

Arg

Glu

Glu

Gln

Gly

Gly

Thr

Leu

Ala

Glu

Leu

Tyr

Asn

Pro

820

825

830

Ser

Thr

Met

Pro

Ile

Glu

Leu

Lys

val

Ala

Hi s

Glu

Lys

Leu

Asp

Gly

835

840

845

Ile

Val

Glu

Arg

Ala

Tyr

Arg

Gln

Lys

Gln

Phe

Glu

Ser

Asp

Glu

Glu

850

855

860

Arg

Leu

Glu

val

Leu

Leu

Lys

Leu

Tyr

Gln

Glu

Met

Thr

Glu

Arg

865

870

875

<210> 8 <211> 952 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> GenBank Nr gi|9945797|gb|AAG03371.1 <400> 8

Met

val

Met

Ala

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Asp

Arg

Ala

Thr

ile

Arg

Hi s

1

5

10

15

Asn

Leu

Thr

Glu

Phe

Lys

Leu

Arg

Trp

Leu

Asp

Arg

Ile

Lys

Gln

Trp

25 30

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Glu

Ala Glu Asn Arg 35

Pro Ala Thr Glu Ser Ser His Asp Gin

Gin

Phe

40

45

Trp

Gly

Asp

Leu

Leu

Asp

cys

Phe

Gly

Val

Asn

Ala

Arg

Asp

Leu

Tyr

50

55

60

Leu

Tyr

Gin

Arg

Ser

Ala

Lys

Arg

Ala

Ser

Thr

Gly

Arg

Thr

Gly

Lys

65

70

75

80

Ile

Asp

Met

Phe

Met

Pro

Gly

Lys

val

ile

Gly

Glu

Ala

Lys

ser

Leu

85

90

95

Gly

val

Pro

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

Gin

Ala

Leu

Asp

Tyr

Leu

Leu

100

105

110

Gly

Gly

Thr

Ile

Ala

Asn

Ser

His

Met

Pro

Al a

Tyr

Val

Val

cys

Ser

115

120

12 5

Asn

Phe

Glu

Thr

Leu

Arg

val

Thr

Arg

Leu

Asn

Arg

Thr

Tyr

Val

Gly

130

135

140

Asp

Ser

Ala

Asp

Trp

Asp

Ile

Thr

Phe

Pro

Leu

Ala

Glu

Ile

Asp

Glu

145

150

155

160

Hi s

Ile

Glu

Gin

Leu

Al a

Phe

Leu

Ala

Asp

Tyr

Glu

Thr

Ser

Al a

Tyr

165

170

175

Arg

Glu

Glu

Glu

Lys

Al a

ser

Leu

Glu

Ala

ser

Arg

Leu

Met

val

Glu

180

185

190

Leu

Phe

Arg

Ala

Met

Asn

Gly

Asp

Asp

Val

Asp

Glu

Ala

Val

Gly

Asp

195

200

205

Asp

Ala

Pro

Thr

Thr

Pro

Glu

Glu

Glu

Asp

Glu

Arg

val

Met

Arg

Thr

210

215

220

Ser

Ile

Tyr

Leu

Thr

Arg

Ile

Leu

Phe

Leu

Leu

Phe

Gly

Asp

Asp

Ala

225

230

235

240

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Pro

His

Leu

Phe

Ala

Asp

Phe

Val

Arg

Asn

Glu

245

250

255

Thr

Thr

Pro

Glu

Ser

Leu

Gly

Pro

Gin

Leu

Asn

Glu

Leu

Phe

Ser

Val

260

265

270

Leu

Asn

Thr

Al a

Pro

Glu

Lys

Arg

Pro

Lys

Arg

Leu

Pro

Ser

Thr

Leu

275

280

285

Al a

Lys

Phe

Pro

Tyr

val

Asn

Gly

Ala

Leu

Phe

Al a

Glu

Pro

Leu

Al a

290

295

300

PL 208 400 B1

Ser 305

Glu Tyr

Phe

NEB-207-PIN.ST25

cys 320

Asp

Tyr 310

Gin Met

Arg

Glu

Al a 315

Leu

Leu

Ala

Al a

Asp

Phe

Asp

Trp

Ser

Thr

ile

ASp

val

ser

val

Phe

Gly

Ser

Leu

Phe

325

330

335

Gin

Leu

Val

Lys

Ser

Lys

Glu

Ala

Arg

Arg

Ser

Asp

Gly

Glu

Hi s

Tyr

340

345

350

Thr

Ser

Lys

Ala

Asn

ile

Met

Lys

Thr

Ile

Gly

Pro

Leu

Phe

Leu

Asp

355

360

365

Glu

Leu

Arg

Ala

Glu

Ala

Asp

Lys

Leu

Val

Ser

Ser

Pro

Ser

Thr

Ser

370

375

380

val

Ala

Al a

Leu

Glu

Arg

Phe

Arg

Asp

Ser

Leu

Ser

Glu

Leu

val

Phe

385

390

395

400

Ala

Asp

Met

Ala

cys

Gly

Ser

Gly

Asn

Phe

Leu

Leu

Leu

Al a

Tyr

Arg

405

410

415

Glu

Leu

Arg

Arg

Ile

Glu

Thr

Asp

Ile

Ile

val

Ala

ile

Arg

Gin

Arg

420

425

430

Arg

Gly

Glu

Thr

Gly

Met

Ser

Leu

Asn

Ile

Glu

Trp

Glu

Gin

Lys

Leu

435

440

445

Ser

Ile

Gly

Gin

Phe

Tyr

Gly

Ile

Glu

Leu

Asn

Trp

Trp

Pro

Ala

Lys

450

455

460

Ile

Ala

Glu

Thr

Ala

Met

Phe

Leu

Val

Asp

His

Gin

Ala

Asn

Lys

Glu

465

470

475

480

Leu

Ala

Asn

Ala

val

Gly

Arg

Pro

Pro

Glu

Arg

Leu

Pro

ile

Lys

Ile

485

490

495

Thr

Al a

His

Ile

Val

Hi s

Gly

Asn

Ala

Leu

Gin

Leu

Asp

Trp

Ala

Asp

500

505

510

Ile

Leu

ser

Al a

ser

Ala

Ala

Lys

Thr

Tyr

ile

Phe

Gly

Asn

pro

pro

515

520

525

Phe

Leu

Gly

His

Ala

Thr

Arg

Thr

Al a

Glu

Gin

Ala

Gin

Glu

Leu

Arg

530

535

540

Asp

Leu

Trp

Gly

Thr

Lys

Asp

Ile

Ser

Arg

Leu

Asp

Tyr

val

Thr

Gly

545

550

555

560

Trp

Hi s

Al a

Lys

cys

Leu

Asp

Phe

Phe

Lys

Ser

Arg

Glu

Gly

Arg

Phe

565

570

575

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Ala Phe val

Thr 580

Thr

Asn

ser ile Thr 585

Gin Gly

Asp

Gin

val 590

Pro

Arg

Leu

Phe

Gly

Pro

Ile

Phe

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

ile

Arg

Phe

Ala

His

595

600

605

Arg

Thr

Phe

Al a

Trp

Asp

ser

Glu

Al a

Pro

Gly

Lys

Ala

Ala

val

Hi s

610

615

620

Cys

Val

Ile

Val

Gly

Phe

ASP

Lys

Glu

Ser

Gin

Pro

Arg

Pro

Arg

Leu

625

630

635

640

Trp

Asp

Tyr

Pro

Asp

val

Lys

Gly

Glu

Pro

val

Ser

val

Glu

val

Gly

645

650

655

Gin

Ser

Ile

Asn

Ala

Tyr

Leu

val

Asp

Gly

Pro

Asn

val

Leu

Val

Asp

660

665

670

Lys

Ser

Arg

His

Pro

Ile

Ser

Ser

Glu

Ile

Ser

Pro

Ala

Thr

Phe

Gly

675

680

685

Asn

Met

Ala

Arg

Asp

Gly

Gly

Asn

Leu

Leu

Val

Glu

Val

Asp

Glu

Tyr

690

695

700

Asp

Glu

val

Met

Ser

Asp

Pro

val

Ala

Ala

Lys

Tyr

val

Arg

Pro

Phe

705

710

715

720

Arg

Gly

Ser

Arg

Glu

Leu

Met

Asn

Gly

Leu

Asp

Arg

Trp

Cys

Leu

Trp

725

730

735

Leu

Val

Asp

val

Ala

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Gin

Ser

Pro

Val

Leu

Lys

740

745

750

Lys

Arg

Leu

Glu

Ala

val

Lys

Ser

Phe

Arg

Ala

Asp

Ser

Lys

Al a

Ala

755

760

765

Ser

Thr

Arg

Lys

Met

Al a

Glu

Thr

Pro

His

Leu

Phe

Gly

Gin

Arg

Ser

770

775

780

Gin

Pro

Asp

Thr

Asp

Tyr

Leu

Cys

Leu

Pro

Lys

Val

Val

Ser

Glu

Arg

785

790

795

800

Arg

Ser

Tyr

Phe

Thr

Val

Gin

Arg

Tyr

Pro

Ser

Asn

val

Ile

Ala

Ser

805

810

815

Asp

Leu

val

Phe

Hi s

Al a

Gin

Asp

Pro

Asp

Gly

Leu

Met

Phe

Ala

Leu

820

825

830

Ala

Ser

Ser

Ser

Met

Phe

Ile

Thr

Trp

Gin

Lys

Ser

Ile

Gly

Gly

Arg

835

840

845

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Leu

Lys ser Asp Leu 850

Arg

Phe 855

Ala

Asn

Thr

Leu

Thr 860

Trp

Asn

Thr

Phe

Pro

val

Pro

Glu

Leu

ASp

Glu

Lys

Thr

Arg

Gin

Arg

ile

Ile

Lys

Ala

865

870

875

880

Gly

Lys

Lys

Val

Leu

Asp

Ala

Arg

Al a

Leu

Hi s

Pro

Gl u

Arg

ser

Leu

885

890

895

Ala

Glu

His

Tyr

Asn

Pro

Leu

Ala

Met

Ala

Pro

Glu

Leu

Ile

Lys

Al a

900

905

910

Hi s

Asp

Ala

Leu

Asp

Arg

Glu

Val

Asp

Lys

Ala

Phe

Gly

Ala

Pro

Arg

915

920

925

Lys

Leu

Thr

Thr

Val

Arg

Gin

Arg

Gin

Glu

Leu

Leu

Phe

Al a

Asn

Tyr

930

935

940

Glu

Lys

Leu

Ile

Ser

Hi s

Gin

Pro

945 950 <210> 9 <211> 168 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> GenBank I	ίγ gi	|23451826|gb|AAN32874.1
<400> 9
Pro Ala Asp Glu	Arg	ser Gin Met Asp Ala Gly Gly Lys Pro val Glu
1	5	10 15
Gly Gly Asn Leu	Leu	Phe Ala Glu Glu Glu Lys Gin Arg Leu val Glu
20		25 30
Gly Asn val Asp	val	val Lys Phe Leu Lys Arg Val Tyr Gly Ala Ser
35		40 45
Glu Tyr Ile Arg	Gly	Glu val Arg Phe Cys Leu Trp ile Ser Asp Ser
50		55 60
Gin Glu Gin Glu	Al a	Lys Ser Asn Ser Asp Ile Asn Cys Lys Leu Asn
65		70 75 80
Ala Val Ala Ala	Phe	Arg Leu Lys Ser Pro Lys Ala Ala Thr Lys Lys
	85	90 95
Gly Ala Ala Trp	Pro	His Lys Phe Glu Glu Val Lys Gin Ile Gly Asn
100		105 110
Glu val val Thr	Ile	Val Pro Lys val Ser Ser Glu Ser Arg Glu Tyr
115		120 125

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Leu

Pro

val

Gly

Leu

Leu

Pro

Arg

Gly

Ser

Ile

Val

Thr

ASp

Leu

Ala

130

135

140

Phe

Al a

Leu

Tyr

Asp

Al a

Pro

Leu

τ rp

Asn

Met

Al a

Leu

ile

Al a

Ser

145

150

155

160

Arg

Leu

Hi s

Leu

Val

Trp

ile

Gly

165 <210> 10 <211> 909 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> GenBank Nr gb|23110638|gb|ZP00096791.1 <400> 10

Met Asn 1

Pro

val

Glu 5

Ile

Glu

Glu

Ala

Val 10

Ser Asp Leu Ala

Arg 15

Al a

Pro

Tyr

Asp

Ala

Ser

Glu

Phe

Pro

Phe

Gin

Phe

Leu

Ala

Al a

Phe

Gly

20

25

30

Asn

Lys

Gin

Thr

Thr

Leu

Gin

Arg

Leu

Arg

Ala

Gly

Asn

Ser

Asn

Gin

35

40

45

Ser

ASP

Leu

Pro

Gly

Al a

val

Leu

Gin

Arg

Asn

His

Ile

Hi s

ile

Ala

50

55

60

Thr

cys

Asp

Ala

Gly

Asn

val

Asp

Arg

Thr

Leu

Ala

Ala

Leu

Arg

Lys

65

70

75

80

Ser

Pro

Lys

Thr

Ala

Ser

Gin

Lys

Ala

Arg

Phe

ile

Leu

Al a

Thr

Asp

85

90

95

Gly

val

Al a

Phe

Gin

Ala

Glu

ASp

Met

Ala

Ser

Gly

Glu

Thr

val

Ala

100

105

110

cys

Asn

Tyr

Ala

Ala

Phe

Pro

Asp

Lys

Phe

Ala

Phe

Phe

Leu

pro

Leu

115

120

125

Ala

Gly

Ile

Thr

Thr

Val

Gin

Gin

ile

Arg

Glu

Ser

Ser

Phe

Asp

ile

130

135

140

Lys

Ala

Thr

Gly

Arg

Leu

Asn

Lys

Leu

Tyr

val

Glu

Leu

Leu

Lys

ASp

145

150

155

160

Asn

Pro

Asp

Trp

Al a

Ser

Arg

Ser

Glu

Asp

Met

Asn

Hi s

Phe

Met

Ala

165

170

175

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Arg

Leu ile Phe cys Phe 180

Phe Ala Glu Asp Thr 185

Asp ile

Phe 190

val

Gly

Glu

Gly

Leu

Phe

Ser

Arg

Thr

val

Glu

Thr

Met

Ser

Ala

Arg

Asp

Ala

195

200

205

Ser

Asp

Thr

Hi s

Met

Val

Ile

Ala

Glu

Ile

Phe

Arg

Ala

Met

ASP

Thr

210

215

220

Arg

Leu

Ala

Asp

Arg

Al a

Ala

Ala

Gly

ile

Lys

Ser

Trp

Al a

Asp

val

225

230

235

240

Phe

Pro

Tyr

val

Asn

Gly

Gln

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Thr

Glu

Cys

Pro

245

250

255

Arg

Phe

Ser

Lys

Ile

Ala

Arg

Ser

Tyr

Leu

Leu

Hi s

Ile

Gly

Ser

Leu

260

265

270

Asp

Trp

Gln

Lys

Ile

Asn

Pro

Asp

Ile

Phe

Gly

ser

Met

Ile

Gln

Ala

275

280

285

val

Ala

Asp

Asp

Glu

Glu

Arg

Gly

Ala

Leu

Gly

Met

His

Tyr

Thr

Ser

290

295

300

Val

Pro

Asn

He

Leu

Lys

Val

Leu

Asn

Pro

Leu

Phe

Leu

Asp

Asp

Leu

305

310

315

320

Arg

Ala

Lys

Leu

Glu

Glu

Ala

Gly

Asp

Asn

Ser

Arg

Lys

Leu

Leu

Asn

325

330

335

Leu

Arg

Asn

Arg

Met

Ala

Lys

Ile

Arg

Val

Phe

Asp

Pro

Ala

Cys

Gly

340

345

350

Ser

Gly

Asn

Phe

Leu

Val

Ile

Al a

Tyr

Lys

Gln

Met

Arg

Glu

Leu

Glu

355

360

365

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Arg

Arg

Gly

Glu

Ala

Asp

Arg

Arg

Ser

Asp

ile

370

375

380

Pro

Leu

Thr

Asn

Phe

Arg

Gly

Ile

Glu

Leu

Arg

Asn

Phe

Pro

Ala

Glu

385

390

395

400

Ile

Ala

Arg

Leu

Ala

Leu

Ile

Ile

Al a

Glu

Tyr

Gln

Cys

Asp

val

Leu

405

410

415

Tyr

Arg

Gly

Gln

Lys

Glu

Ala

Leu

Ala

Glu

Phe

Leu

pro

Leu

Asp

Ser

420

425

430

Gln

Asn

Trp

Ile

Thr

cys

Gly

Asn

Al a

Leu

Arg

Leu

Asp

Trp

Leu

Ser

435

440

445

PL 208 400 B1

Ile Cys 450

Pro Pro

NEB-207-PIN.ST25

Leu

Thr

Gly

Thr 455

Ala

val

Lys

Leu Gin Ala 460

Asn

Asp

phe

Glu

Met

pro

Leu

Asp

Gin

Al a

Glu

Ile

Asp

Phe

Glu

Asn

Glu

Gly

465

470

475

480

Gly

Glu

Thr

Tyr

Ile

Cys

Gly

Asn

Pro

Pro

Tyr

Leu

Gly

Ala

Lys

Lys

485

490

495

Lys

Ser

Ser

Asp

Gin

Ile

Glu

Asp

Met

Lys

Arg

val

Gly

Leu

Asp

Lys

500

505

510

Ala

Gin

Leu

Leu

Asp

Tyr

Val

Ser

Al a

Phe

ile

val

Arg

Gly

Leu

Pro

515

520

525

Leu

val

Ala

Gin

Gin

Arg

Cys

Asp

Met

Ala

Leu

Val

Ser

Thr

Ser

Ser

530

535

540

Ile

cys

Gin

Gly

Glu

Gin

val

Ser

Leu

ile

Trp

Pro

Arg

Ile

Leu

Lys

545

550

555

560

Ser

Ala

Asn

val

Lys

Phe

Al a

Tyr

Arg

Pro

Phe

Arg

Trp

Ser

Asn

Ser

565

570

575

Ala

Ala

Asn

Asn

Ala

Gly

val

Tyr

cys

Thr

Ile

Ile

Gly

Leu

Thr

Gly

580

585

590

Ser

Glu

val

Ser

Asn

Lys

Lys

Leu

Phe

Gly

Glu

Gly

Ser

Val

val

Glu

595

600

605

Cys

Ser

Ser

ile

Ala

Pro

Tyr

Leu

Val

Pro

Gly

Pro

Glu

Ile

Ile

Cys

610

615

620

Ala

Pro

Arg

Gin

Ser

Ser

Ile

Ser

Gly

Phe

Ala

Arg

Met

val

Met

Gly

625

630

635

640

ser

Asn

Pro

val

Asp

Gly

Lys

Arg

Leu

Ile

Phe

Glu

Gin

Asp

Glu

Lys

645

650

655

Glu

Ser

Val

val

Ala

Ala

Asp

Pro

Arg

Ser

Glu

Arg

Phe

Phe

Lys

Arg

660

665

670

Tyr

Gly

Gly

Thr

Gin

Glu

Leu

val

Asn

Gly

val

Asp

Arg

Trp

Cys

Leu

675

680

685

Trp

Ile

Asn

Asp

Asp

Gin

Val

Asp

Asp

Ala

Lys

Ala

Ile

Ala

Glu

ile

690

695

700

Ala

Lys

val

Leu

Glu

Ser

Cys

Arg

Ser

Tyr

Arg

Gin

Gly

Ala

Gly

Arg

705 710 715 720

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Asp

Ala Gin

Lys

Ala Ala Asn Arg Pro His

Ser

Phe Cys

Tyr

Arg 735

Thr

725

730

Phe

Gin

Glu

Asn

Ile

Gly

ile

His

Val

Gly

Leu

Thr

Ile

Gly

Asn

Gly

740

745

750

Leu

Ser

Hi s

val

Pro

Al a

Asp

Leu

Lys

Ser

Ser

Gly

Phe

val

Ser

Ser

755

760

765

Hi s

Thr

Al a

Tyr

Met

Ile

Tyr

Gly

Trp

His

Pro

Val

Glu

Phe

Ala

Leu

770

775

780

Leu

Asn

Ser

Arg

Leu

Met

Leu

val

Trp

Thr

Glu

Thr

val

Gly

Gly

Arg

785

790

795

800

Leu

Gly

Asn

Gly

Met

Arg

Phe

Ser

Asn

Thr

Ile

Val

Tyr

Asn

Thr

Phe

805

810

815

Pro

val

Pro

Ser

Leu

Thr

Asp

Gin

Asn

Lys

Ala

Asp

Leu

Thr

Arg

cys

820

825

830

Ala

Glu

Asp

ile

Leu

Leu

Al a

Arg

Glu

Ser

His

Phe

Pro

Al a

Thr

ile

835

840

845

Ala

Asp

Leu

Tyr

Asp

Pro

Glu

Thr

Met

Pro

Glu

Ser

Leu

Arg

Ala

Ala

850

855

860

Hi s

Asp

Arg

Asn

Asp

Glu

val

Leu

Glu

Arg

Ile

Tyr

Ile

Gly

Arg

Arg

865

870

875

880

Phe

Arg

Asn

Asp

Thr

Glu

Arg

Leu

Glu

Lys

Leu

Phe

Glu

Leu

Tyr

Thr

885

890

895

Lys

Met

Thr

Gly

Gly

Arg

Ser

Ser

Glu

Gly

Gly

Ala

Ala

900 905 <210> 11 <211> 1048 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223>	GenBank	Nr g-	i|20803963|emb|CAD31540.	1
<400>	11
Met ser	Leu Gly	Ala	Ala Gly Leu Thr Pro ile	Thr Pro Ala Ala Phe
1		5	10	15
Ile Lys	Lys Trp	Arg	Lys ser Glu Leu Gly Glu	Arg Gin Ala Ala Gin
	20		25	30
Glu His	Phe Leu	Asp	Ile Cys Ser Leu Val Gly	His Pro Ser Pro Ser
	35		40	45

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

ASP Glu ASP Pro 50

Thr

Gly

Ala Phe Phe Ala Phe Glu

Lys

Gly

Ala

Asn

55

60

Lys

Leu

Gly

Gly

Gly

Lys

Gly

Phe

Ala

Asp

Val

Trp

Lys

Lys

Gly

Hi s

65

70

75

80

Phe

Al a

Trp

Glu

Tyr

Lys

Arg

Lys

Lys

Gly

Asn

Leu

Asp

Glu

Ala

Leu

85

90

95

Leu

Gin

Leu

Met

Arg

Tyr

Ala

Pro

Al a

Leu

Leu

Ser

Pro

Pro

Leu

His

100

105

110

Ile

Val

cys

Asp

ile

Glu

Arg

Leu

Arg

Ile

His

Thr

Al a

Trp

Thr

Asn

115

120

125

Thr

val

Pro

ser

Thr

Tyr

val

Ile

Thr

Leu

Asp

Asp

Leu

Ala

Glu

pro

130

135

140

Ser

Ala

Arg

Glu

Met

Leu

His

Asn

val

Phe

Phe

Ser

Pro

Glu

Lys

Leu

145

150

155

160

Arg

Pro

Thr

Arg

Thr

Arg

Ala

Ala

val

Thr

Lys

Glu

Ala

Ala

Asp

Lys

165

170

175

Phe

ser

Al a

ile

Ala

Leu

Arg

val

Gin

Gly

Arg

Gly

Thr

Pro

Asp

Glu

180

185

190

Ile

Ala

His

Phe

Val

Asn

Gin

Leu

val

Phe

cys

Phe

Phe

Ala

Gin

ser

195

200

205

val

ser

Leu

Leu

pro

Asp

Gly

Leu

Phe

Thr

Lys

Leu

Leu

Lys

Arg

ser

210

215

220

Ala

Arg

Ala

Pro

Glu

Arg

Ala

Met

Ser

Tyr

Leu

Asp

Lys

Leu

Phe

Glu

225

230

235

240

Ala

Met

Glu

Arg

Gly

Gly

Glu

Phe

Asp

Leu

Thr

ASp

ile

Thr

Trp

Phe

245

250

255

Asn

Gly

Gly

Leu

Phe

Asp

Gly

Arg

Arg

Ala

Leu

Arg

Leu

Asp

Asp

Gly

260

265

270

Asp

Ile

Gly

Leu

Leu

Val

Ala

Ala

Asp

Ser

Leu

Asp

Trp

Gly

Leu

Ile

275

280

285

Asp

Pro

Thr

Ile

Phe

Gly

Thr

Leu

Phe

Glu

Arg

Phe

Leu

Asp

Pro

Glu

290

295

300

Lys

Arg

Ala

Gin

Ile

Gly

Al a

His

Tyr

Thr

Asp

Pro

Glu

Lys

ile

Met

305

310

315

320

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Arg Leu

Gin Ala

Pro Met

Ala Glu 370

Leu Asp 385

Gly val

Gly Met ile Glu

Ile Gly 450

Ile Pro 465 val Arg

Leu Leu

Pro Glu

Leu Met 530 val Tyr 545

Val Glu

Gly Leu val Asp

Arg Arg 340

Arg Arg 355 val Arg

Pro Ala

Lys Asp

Pro Ala 420

Ile Asn 435

Asp Ile

Ile Leu

Gin Ala

Ala Ala 500

Ala Glu 515

Arg Gin

Asp Gly

Lys Ser val Thr 580

Pro val 325

Glu Ile

Gin Gin

Ser Arg

Cys Gly 390

Ile Glu 405

Gin Leu

Met Met

Gin Trp

Arg Lys 470

Gin Asp 485

Leu Gin

Phe ile

Ala Leu

Arg val 550

Arg Ala 565

Thr Asn ile Leu Arg Pro Leu Arg 330

Gin Glu val Glu Leu Leu Asn Gly 345

Ser Arg Arg Met Lys Arg 360

Phe Thr Glu Arg Leu Arg 375 380

Ser Gly Asn Phe Leu Tyr 395

His Arg Ala Asn Leu Asp 410

Pro Leu Val Gly Pro Glu 425

Ala Ala 440

Glu Leu

Ala Arg

Gin Ile 455

Leu Asp

Val Asp

Pro Val val Gly 520

Gly Asp 535

Ser Arg

Ala Val ser ile

Lys Asn

Ala Ile

Thr Ala 490

Ser Glu 505

Asn Pro

Pro Thr

Gly Ile 460

Glu Arg 475

Arg Asp

Asp Ala

Pro Phe val Asp 540

Glu Ala

Asp Leu 555

Ala Ala 570

Asp Arg

Arg Gly 585

Gly Ala

Asn Arg 350

Glu Glu 365

Lys Leu

Leu Ala

Cys Glu

Ile Leu 430

Thr Thr 445

Arg Ser

Arg Asp

Ala Gin

Glu Ala 510 val Gly 525

Arg Leu val cys

Thr Arg

Asn Arg 590

Trp Glu 335

Lys Pro

Ala Ala

Arg ile

Leu Gin 400

Met Leu 415

Arg Gly

Ile Trp

Lys Ser

Ala Leu 480

Gly Asp 495

Glu Trp val Arg

Phe Asp

Tyr Trp 560

Arg val 575

Arg val

PL 208 400 B1

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Pro 865

Ala

val

Arg Tyr

Glu 870

Lys

Asp Ser Arg Ala Ile Ala Ile 875

Ser

Lys 880

Al a

Al a

Lys

Arg

Leu

Asp

Asp

Ile

Arg

Asn

Ala

Trp

Leu

Asn

Pro

Ser

885

890

895

Asp

Leu

val

Gin

Ile

Lys

Pro

Glu

Val

Val

Pro

Gly

Tyr

Pro

Asp

Arg

900

905

910

Ile

Leu

Pro

Lys

Asp

ile

Ala

Ser

Asp

Ala

Ile

Leu

Arg

Asp

Arg

Thr

915

920

925

Leu

Thr

Asn

Leu

Tyr

Asn

Arg

Arg

Pro

Gin

Trp

Leu

Val

Asp

Al a

His

930

935

940

Ser

ASp

Leu

Asp

Ala

Al a

val

Ala

Gly

Ala

Tyr

Gly

Trp

Pro

Al a

Asp

945

950

955

960

Ile

ser

Glu

Asp

Glu

Al a

Leu

Ala

Asn

Leu

Leu

Glu

Leu

Asn

Leu

Ala

965

970

975

Arg

Glu

Al a

Phe

Asn

Glu

Hi s

Al a

Lys

Ser

Gly

Leu

Lys

Thr

Arg

Lys

980

985

990

Pro Arg Arg Arg Pro Thr Pro Glu Glu Val Arg Arg Ala Pro Gin Mel 995 1000 1005

Lys Leu Pro ile Ala Gly Gly Arg Lys Ser Val val Gly Pro Gin 1010 1015 1020

Gin Leu Thr Thr Lys Asp Arg Glu Asn Gin Pro Thr Ser Ala Glu 1025 1030 1035

Arg Pro Arg Asn Thr Lys Arg Arg Thr Ser 1040 1045 <210> 12 <211> 959 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> GenBank Nr gi|16125079|ref|np_419643.1 <400> 12

Asp Leu Cys Arg Met Leu Glu val Pro Thr Pro Ala Glu Asp Asp Pro 15 10 15

Leu Gly Glu Arg Tyr Cys Phe Glu Arg Gly Ala Ala Lys Thr Gly Gly 20 25 30

PL 208 400 B1

NEB-207-ΡΙΝ.ST25

Gly Asp Gly 35

Trp

Ala Asp val

Trp Arg Lys Gly Cys 40

Phe 45

Gly

Trp

Glu

Tyr

Lys

Gly

Lys

Hi s

Lys

Asn

Leu

Asp

Al a

Al a

Leu

Arg

Gin

Leu

Gin

50

55

60

Ala

Tyr

Al a

Leu

Asp

Leu

Gin

Asn

pro

pro

Tyr

Leu

Val

val

Ser

Asp

65

70

75

80

Met

Glu

Arg

Ile

ile

val

His

Thr

Asn

Trp

Thr

Asn

Thr

ile

ser

Arg

85

90

95

Lys

ile

Glu

Phe

Thr

Leu

Asp

Asp

Leu

Hi s

Glu

pro

Glu

Lys

Leu

Ala

100

105

110

Met

Leu

Arg

Gin

Val

Phe

Asp

Gly

ser

Asp

ser

Leu

Lys

pro

Lys

ile

115

120

125

Ser

Pro

Gin

Glu

Leu

Thr

Ala

Lys

Val

Ala

Gin

Arg

Phe

Gly

Asp

Leu

130

135

140

Gly

Arg

Arg

Leu

Gin

Glu

Arg

Gly

His

His

Pro

Arg

Asp

Val

Al a

His

145

150

155

160

Phe

Leu

Asn

Arg

Val

val

Phe

cys

Met

Phe

Ala

Glu

Asp

Al a

Lys

Leu

165

170

175

Leu

Pro

Glu

Gly

Leu

Phe

Thr

Arg

Leu

Thr

Arg

Ser

Met

Gin

Met

Arg

180

185

190

Pro

Pro

Ala

Glu

Al a

Al a

Pro

Gin

Phe

Asp

Ala

Leu

Phe

Ala

Met

Met

195

200

205

Arg

Al a

Gly

Gly

Met

Phe

Gly

Ala

Asp

Ile

Val

Hi s

Trp

Phe

Asn

Gly

210

215

220

Gly

Leu

Phe

Asp

Glu

Lys

Pro

Al a

Leu

Pro

Leu

Glu

Arg

Ala

Asp

Ile

225

230

235

240

Lys

Leu

ile

His

Asp

Thr

Al a

Ala

Glu

Hi s

Asp

Trp

Ser

Asp

Leu

Asp

245

250

255

Pro

Ser

val

Phe

Gly

Asn

Met

Phe

Glu

Glu

Al a

Leu

Lys

Al a

Thr

Arg

260

265

270

Glu

Arg

Ala

Ala

Leu

Gly

Ala

Hi s

Tyr

Thr

Asp

Arg

Glu

Lys

Ile

Leu

275

280

285

Lys

Ile

Ile

Asp

Pro

val

Ile

Thr

Trp

Pro

Leu

Met

Al a

Gin

Trp

Glu

290

295

300

PL 208 400 B1

Thr 305

Ala Leu

Ala Glu

NEB-207-PIN.ST25

Ala 320

Ile Arg Ala Ala Leu Asp

Ala

Arg

Ala

Al a

310

315

Glu

Al a

Glu

Arg

Lys

Ala

val

Leu

Glu

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Met

Arg

325

330

335

Ala

Asp

Pro

Val

Lys

Al a

Lys

Ala

Gly

Glu

Ala

Ala

Arg

Arg

Lys

Thr

340

345

350

Leu

Thr

Ala

Ile

Ala

Lys

Arg

Ser

ASp

Ala

Ala

Leu

Gly

Gin

Ala

Lys

355

360

365

Asp

Arg

Leu

Glu

Ala

Phe

Leu

Ser

Arg

Leu

Ala

Ala

Phe

Arg

Val

Leu

370

375

380

Asp

Pro

Al a

cys

Gly

Ser

Gly

Asn

Phe

Leu

Tyr

Val

Al a

Leu

Hi s

Ala

385

390

395

400

Leu

Lys

Asp

ile

Glu

Arg

Arg

Ala

Leu

Val

Asp

Ala

Glu

Arg

Leu

Gly

405

410

415

Leu

Glu

val

Pro

Thr

Pro

Arg

Val

Gly

Leu

Al a

cys

val

Arg

Gly

Ile

420

425

430

Glu

Ile

Glu

Glu

Tyr

Ala

Ala

Glu

Leu

Ala

Arg

val

Thr

Leu

Trp

Ile

435

440

445

Gly

Asp

Leu

Gin

Trp

His

Ala

Lys

Asn

Asn

Tyr

Arg

Gly

Phe

Ala

Glu

450

455

460

Pro

Ile

Leu

Ser

Ser

Leu

Asp

Gin

Ile

Glu

Cys

Arg

Asp

Ala

Leu

Leu

465

470

475

480

Asn

Ala

Asp

Gly

Thr

Glu

Ala

Gin

Trp

Pro

Ala

val

Asp

val

ile

Val

485

490

495

Gly

Asn

Pro

Pro

Phe

Leu

Gly

Ser

Lys

Arg

Leu

Arg

Asp

Gly

Leu

Gly

500

505

510

Asn

Asp

Tyr

val

Glu

Arg

Leu

Phe

ser

Thr

Tyr

Arg

Gly

Lys

val

Pro

515

520

525

Ala

Glu

Al a

Asp

Phe

val

Al a

Tyr

Trp

Ile

Ala

Lys

Ala

Trp

Glu

Leu

530

535

540

val

Gin

Ala

Gin

Gin

Gly

Arg

Arg

Al a

Gly

Leu

val

Thr

Thr

Asn

ser

545

550

555

560

Val

Arg

Gly

Gly

Al a

Ser

Arg

Lys

Val

Leu

ASP

Pro

Ile

Ala

Asp

Ala

565 570 575

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Gly

Ala Leu Met 580

Glu

Ala Trp Ala Asp 585

Glu

Pro Trp

Ala

Leu 590

Glu

Gly

Al a

Al a

val

Arg

val

Ser

Met

Phe

Gly

Phe

Gly

Asp

Gly

Phe

Ala

Glu

595

600

605

Arg

Arg

Leu

Glu

Gly

Arg

Lys

Al a

Glu

His

Leu

His

Ser

Asp

Phe

Arg

610

615

620

Gly

Ala

Ser

Thr

Asp

val

Thr

Lys

Ala

Leu

Arg

Leu

Lys

Glu

Asn

Ala

625

630

635

640

Ser

Ile

Al a

Phe

Met

Gly

Asp

Thr

Lys

Gly

Gly

Ala

Phe

Asp

val

ser

645

650

655

Gly

Glu

Ile

Ala

Arg

Glu

Trp

Leu

Arg

Leu

Pro

Leu

Asn

Pro

Asn

Gly

660

665

670

Arg

Pro

Asn

Ser

Asp

Val

Leu

Lys

Pro

Trp

Arg

Asn

Ala

Met

Asp

Met

675

680

685

Thr

Arg

Arg

ser

ser

Asp

Lys

Trp

Ile

Ile

Asp

Phe

Gly

Trp

Thr

Met

690

695

700

Ser

Glu

Al a

Asp

Al a

Ala

Leu

phe

Glu

Thr

pro

Phe

Arg

His

val

Leu

705

710

715

720

Leu

His

val

Lys

Pro

Glu

Arg

Asp

Arg

Asn

Asn

Arg

Glu

Met

Tyr

Arg

725

730

735

Leu

Asn

Trp

T rp

Lys

Hi s

val

Glu

Pro

Arg

Gin

Gly

Leu

Met

Lys

Arg

740

745

750

val

pro

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Leu

Val

Thr

Pro

Glu

val

Ser

Lys

Hi s

755

760

765

Arg

Leu

Phe

ile

Trp

Leu

Asp

Ala

Arg

Val

Leu

Pro

Asp

Hi s

Lys

Leu

770

775

780

Gin

val

Val

Thr

Leu

Asp

Asp

Asp

cys

Ser

Phe

Gly

val

Leu

His

Ser

785

790

795

800

Arg

Phe

Hi s

Glu

Val

Trp

Ala

Leu

Ala

Ala

Gly

Ser

Trp

His

Gly

Ser

805

810

815

Gly

Asn

Asp

Pro

Arg

Tyr

Thr

ile

Ser

Thr

Thr

Phe

Glu

Thr

Phe

Pro

820

825

830

Phe

Pro

Glu

Gly

Leu

Thr

Pro

Asn

Ile

Al a

Ala

Val

Asp

Tyr

Glu

Gly

835

840

845

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Asp Pro

Arg

Ala Gln

Al a

Ile Ala Ala Ala Ala Ala

Glu

Leu Asn Arg

850

855

860

Leu

Arg

Glu

Al a

Trp

Leu

Asn

Pro

Pro

Asp

Leu

Val

Arg

Ile

Glu

Pro

865

870

875

880

Glu

val

val

Pro

Gly

Tyr

Pro

Asp

Arg

val

Leu

Pro

Val

Ser

Pro

Glu

885

890

895

Ala

Gly

Ala

Glu

Leu

Lys

Lys

Arg

Thr

Leu

Thr

Asn

Leu

Tyr

Asn

Gln

900

905

910

Arg

Pro

Ala

T rp

Leu

Asp

Met

Al a

Hi s

Gln

Arg

Leu

Asp

Ala

Ala

Val

915

920

925

Ala

Ala

Ala

Tyr

Gly

Trp

Pro

Asp

Gly

Leu

Thr

Asp

Asp

Glu

Ile

Leu

930

935

940

Glu

Arg

Leu

Phe

Ala

Leu

Asn

Gln

Glu

Arg

Ala

Al a

Ala

Gly

Arg

945

950

955

<210> 13 <211> 909 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> GenBank Nr gi|15807788|ref|ΝΡ_285443.1 <400> 13

Met Hi s 1

Pro

Gln

Glu 5

Phe Ala Asp Thr Trp 10

Ser Arg

Arg

Ala

Leu 15

Lys

Ala

Thr

Glu

Arg

Asp

Ser

Tyr

Val

Gln

Hi s

Trp

Leu

Asp

Leu

Cys

Gln

20

25

30

Leu

Leu

His

Hi s

Glu

Al a

Pro

Gly

Ala

Asp

Pro

Asp

Tyr

Lys

Phe

Glu

35

40

45

Arg

Arg

val

Thr

Lys

Val

Gly

Thr

Lys

Asp

Lys

Gly

Phe

Ala

Asp

val

50

55

60

Phe

Lys

Lys

Ala

Hi s

Phe

Ile

Thr

Glu

Tyr

Lys

Arg

Pro

Gly

Ser

Asp

65

70

75

80

Leu

Gly

Ala

Al a

Leu

Gln

Gln

Al a

Thr

Leu

Tyr

Ser

Arg

Asp

Leu

Gly

85

90

95

Asn

Pro

Pro

Leu

Leu

Leu

Thr

Ser

Asp

Phe

Gln

Arg

ile

Glu

Ile

Asn

100

105

110

Thr

Ala

Phe

Thr

Gly

Thr

Ser

Pro

Lys

Ser

Tyr

Leu

ile

Thr

Leu

Asp

115

120

125

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Asp ile Ala

Glu Asn

Arg

Val 135

val

Gly Gly Asn

Asp 140

val

Pro

Ala

Leu

130

Gin

ile

Leu

His

ser

Ala

Leu

Hi s

Gin

Pro

Tyr

Asp

Leu

Asp

Pro

Arg

145

150

155

160

Leu

Phe

Arg

Glu

Arg

Ile

Thr

Thr

Asp

Ala

Thr

Arg

Gl n

Val

Gly

Leu

165

170

175

Val

Ala

Arg

Arg

Leu

Gly

Glu

Arg

Glu

Gly

Arg

Thr

Arg

Al a

Ala

His

180

185

190

Met

Met

Met

Arg

Val

Val

Phe

Al a

Leu

Phe

Ala

Glu

Asp

Thr

Gly

Met

195

200

205

Leu

Glu

Arg

Gly

Ile

Val

Thr

Arg

Leu

Leu

Glu

Arg

Al a

Arg

Al a

Pro

210

215

220

Pro

Gly

Glu

Asp

Gin

Leu

Tyr

Phe

Gin

Asp

Leu

Phe

Gly

Ala

Met

Lys

225

230

235

240

Gly

Gly

Gly

Glu

Phe

Trp

Gly

Thr

Asp

Ile

Arg

Hi s

Phe

Asn

Gly

Gly

245

250

255

Leu

Phe

Asp

Ser

Glu

Asp

Al a

Leu

Al a

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ala

Al a

260

265

270

Ala

Leu

Ile

Ile

Al a

Ala

Lys

Leu

Asp

Trp

Ser

Glu

val

Glu

Pro

Ser

275

280

285

Ile

Phe

Gly

Thr

Leu

Phe

Glu

Asn

Ser

Leu

Asp

val

Asp

Thr

Arg

ser

290

295

300

Arg

Arg

Gly

Ala

His

Tyr

Thr

Ser

val

Asn

Asp

Ile

Glu

Arg

Ile

val

305

310

315

320

Asp

Arg

val

val

Met

Glu

pro

Leu

Trp

Ala

Glu

Trp

Asp

Ala

Leu

Arg

325

330

335

Leu

ser

Leu

pro

Glu

Leu

Lys

Lys

Asn

val

Arg

Leu

Glu

Arg

Leu

Phe

340

345

350

Ala

phe

Gin

Asp

Arg

Leu

Thr

Al a

Val

Arg

Ile

Leu

Asp

Pro

Al a

cys

355

360

365

Gly

ser

Gly

Asn

Phe

Leu

Phe

Val

Al a

Leu

Lys

Lys

Leu

Leu

Asp

Leu

370

375

380

Glu

Tyr

Gin

val

Arg

Met

Al a

Ala

Val

Met

Asn

Asp

Ile

Gly

Glu

Phe

385

390

395

400

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Glu Met

Pro

Pro

Leu val 405

Hi s

pro

Gin Gin 410

Met

Leu Gly ile Glu 415

ile

Glu

Thr

Phe

Al a

His

Glu

Leu

Al a

Ser

Ile

Thr

Leu

Trp

Met

Gly

Tyr

420

425

430

Phe

Gin

Trp

Lys

Arg

Ala

His

Gly

Gly

His

Trp

Glu

Thr

pro

Ile

Leu

435

440

445

Gin

Arg

Leu

Asp

Asn

Ile

Gin

Asn

Arg

Asp

Ala

Leu

Leu

Asn

Pro

Asp

450

455

460

Gly

Thr

Glu

Ala

Thr

Trp

Pro

Arg

Ala

Asp

Phe

ile

val

Gly

Asn

pro

465

470

475

480

Pro

Phe

Leu

Gly

Asp

Lys

Met

Met

Arg

ser

Gin

Leu

Gly

Glu

Ala

Tyr

485

490

495

Thr

Thr

Gin

Leu

Arg

Glu

Thr

phe

Lys

Asp

Arg

Leu

Pro

Gly

Gin

Ser

500

505

510

Asp

Leu

val

Cys

Tyr

Trp

Pro

Glu

Lys

Ala

Arg

Ala

Leu

Ile

Glu

Ala

515

520

525

Gly

Val

Thr

Thr

Arg

Al a

Gly

Phe

val

Thr

Thr

Asn

Ser

Ile

Arg

Gly

530

535

540

Gly

Lys

Asn

Arg

val

val

Leu

Glu

Arg

ile

Lys

Al a

Thr

Gly

Asp

Leu

545

550

555

560

Phe

Met

Ala

Trp

Pro

Asp

Glu

Pro

Trp

Gin

Gin

Asn

Gly

Ala

Ala

Val

565

570

575

Arg

val

ser

Leu

Phe

Gly

Phe

ASP

Asn

Gly

Thr

Glu

Thr

Leu

Arg

Thr

580

585

590

Leu

Asn

Asp

Gly

His

val

Gly

val

Ile

Asn

Ala

Asp

Leu

Asn

Ala

Gly

595

600

605

Thr

Asp

val

Lys

Gin

Ala

Gin

Lys

Leu

pro

Glu

Asn

Ala

Gly

val

Ser

610

615

620

Phe

Ile

Gly

Thr

Gin

Lys

Gly

Gly

Al a

Phe

Asp

Ile

Pro

Gly

Asp

Leu

625

630

635

640

Ala

Arg

ser

Trp

Leu

Ser

Val

Pro

Asn

Pro

Asp

Arg

Val

Ser

Asn

Ala

645

650

655

Asp

val

Leu

Lys

Pro

Trp

val

Asn

Gly

Met

Asp

Leu

Thr

Arg

Arg

Pro

660

665

670

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Ser

Gly Arg 675

Trp

ile ile Asp Phe 680

Ala Gin

Met

Asp

Glu 685

Gly

Glu

Al a

Arg

Gin

Tyr

Leu

Gin

Pro

Met

Ala

Tyr

Val

Glu

Gin

Lys

Ile

Arg

Pro

690

695

700

Glu

Arg

Ala

Thr

Asn

Ser

Asp

Arg

Pro

ser

Arg

Glu

Arg

Trp

Trp

Leu

705

710

715

720

His

Gl n

Arg

Ser

Arg

Pro

Glu

Leu

Arg

Glu

Ala

Thr

Ile

Glu

Leu

Asp

725

730

735

Arg

Phe

Ile

Gly

Ile

Pro

Arg

Val

Ala

Lys

His

Leu

Leu

Pro

val

Trp

740

745

750

Leu

Pro

Glu

Gly

Thr

Leu

pro

Asp

Ser

Gin

val

val

val

Ile

Ala

Arg

755

760

765

Asp

Asp

Asp

Phe

Ile

Phe

Gly

Val

Leu

Ala

Ser

Thr

Ile

His

Arg

Ser

770

775

780

Trp

Ala

Arg

Met

Gin

Gly

Thr

Tyr

Met

Gly

Val

Gly

Asn

Asp

Leu

Arg

785

790

795

800

Tyr

Thr

Pro

Ser

Thr

cys

Phe

Glu

Thr

Phe

Pro

Val

Pro

Ala

Pro

Thr

805

810

815

Asp

Glu

Gin

Arg

Ala

Glu

Ile

Glu

Lys

Trp

Ala

Lys

Tyr

ile

val

Gin

820

825

830

Leu

Arg

Glu

Hi s

Leu

Leu

Asn

Gin

Asp

Ala

Lys

Gly

Thr

Leu

Thr

Gly

835

840

845

Ile

Tyr

Asn

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Arg

Asn

Ser

Pro

Asp

Al a

Al a

Hi s

850

855

860

Pro

val

Ser

Al a

Leu

Ala

Thr

Al a

Hi s

Asp

Lys

Leu

Asp

Gin

Al a

Val

865

870

875

880

Ala

Thr

Ala

Tyr

Gly

Trp

Glu

τ rp

Pro

Leu

Asn

Glu

Asp

Gin

val

Leu

885

890

895

Glu

Arg

Leu

Leu

Al a

Leu

Asn

Leu

Glu

Arg

cys

Pro

Ala

900

905

<210>	14
<211>	955
<212>	PRT
<213>	ni eznane
<220>

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 <223> GenBank Nr gi|15807258|ref|NP_295988.1 <220>

<221> cecha inna <222> (920)..(920) <223> Xaa może byc naturalnie występującym aminokwasem <400> 14

Met 1

Pro Gin Thr

Glu 5

Thr Ala Gin

Arg Met Glu 10

Asp

Phe

Val

Ala 15

Tyr

Trp

Arg

Thr

Leu

Lys

Gly

ASp

Glu

Lys

Gly

Glu

Ser

Gin

val

Phe

Leu

20

25

30

Asp

Arg

Leu

Phe

Gin

Ala

Phe

Gly

Hi s

Ala

Gly

Tyr

Lys

Glu

Ala

Gly

35

40

45

Ala

Glu

Leu

Glu

Tyr

Arg

val

Ala

Lys

Gin

Gly

Gly

Gly

Lys

Lys

Phe

50

55

60

Al a

Asp

Leu

Leu

Trp

Arg

pro

Arg

val

Leu

ile

Glu

Met

Lys

Lys

Arg

65

70

75

80

Gly

Glu

Lys

Leu

Ala

Asn

Hi s

Tyr

Gin

Gin

Ala

Phe

Asp

Tyr

Trp

Leu

85

90

95

Lys

Leu

val

Pro

ASP

Arg

Pro

Arg

Tyr

Ala

val

Leu

cys

Asn

Phe

Asp

100

105

110

Glu

Leu

Trp

val

Tyr

Asp

Phe

Asn

Gin

Gin

Leu

Asp

Glu

Pro

Met

Asp

115

120

125

Arg

Leu

Arg

ile

Glu

Glu

Leu

Pro

Glu

Arg

Tyr

Thr

Val

Leu

Asn

Phe

130

135

140

Met

phe

Glu

Gin

Glu

Arg

Al a

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn

Asn

Arg

Val

Asp

145

150

155

160

val

Thr

Arg

Glu

Ala

Al a

Asp

Ser

Val

Ala

Lys

val

Leu

Asn

Ser

val

165

170

175

Ile

Ala

Arg

Gly

Glu

Asp

Arg

Ala

Arg

Ala

Gin

Arg

Phe

Leu

Leu

Gin

180

185

190

Cys

val

Met

Ala

Met

Phe

Ala

Glu

Asp

Phe

Glu

Leu

ile

Pro

Arg

Gly

195

200

205

Phe

Phe

Thr

Glu

Leu

Ala

Asp

Asp

Ala

Arg

Al a

Gly

Arg

Gly

ser

Ser

210

215

220

Phe

Asp

Leu

Phe

Gly

Gly

Leu

Phe

Arg

Gin

Met

Asn

Thr

Ser

Glu

Arg

225

230

235

240

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Ala

Arg

Gly

Gly

Arg

Phe

Al a

Pro

Ile

Pro

Tyr

Phe

Asn

Gly

Gly

Leu

245

250

255

Phe

Arg

Ala

val

Asp

Pro

Ile

Glu

Leu

Asn

Arg

Asp

Glu

Leu

Tyr

Leu

260

265

270

Leu

Hi s

Lys

Al a

Ala

Leu

Glu

Asn

Asn

Trp

Ala

Arg

Ile

Gin

Pro

Gin

275

280

285

ile

Phe

Gly

val

Leu

Phe

Gin

Ser

Ser

Met

Asp

Lys

Lys

Glu

Gin

His

290

295

300

Al a

Lys

Gly

Ala

Hi s

Tyr

Thr

Ser

Glu

Ala

Asp

Ile

Met

Arg

val

val

305

310

315

320

Leu

Pro

Thr

Ile

val

Thr

Pro

Phe

Gin

Arg

Gin

Ile

Glu

Al a

Ala

Thr

325

330

335

Thr

Gin

Lys

Glu

Leu

Arg

Ala

Ile

Leu

Asp

Glu

Leu

Ala

ser

Phe

Gin

340

345

350

val

Leu

Asp

Pro

Ala

Cys

Gly

Ser

Gly

Asn

Phe

Leu

Tyr

val

Al a

Tyr

355

360

365

Arg

Glu

Leu

Arg

Arg

Leu

Glu

Ala

Arg

Ala

Leu

Leu

Arg

Leu

Arg

Asp

370

375

380

Leu

Ser

Ala

Pro

Gly

Thr

Ala

Leu

Pro

Pro

Ala

Arg

Val

Ser

Ile

Arg

385

390

395

400

Gin

Met

Hi s

Gly

Leu

Glu

Tyr

Asp

Pro

Phe

Gly

Val

Glu

Leu

Ala

Lys

405

410

415

val

Thr

Leu

Thr

Leu

Al a

Lys

Glu

Leu

Ala

Ile

Arg

Glu

Met

His

Asp

420

425

430

Leu

Leu

Gly

Asn

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Asp

Gin

Pro

Leu

Pro

Leu

Asp

435

440

445

Asn

Leu

Asp

Asp

Arg

Ile

val

Gin

Gly

Asp

Ala

Leu

Phe

Thr

Pro

Trp

450

455

460

Pro

Arg

Val

Asp

Ala

Ile

Val

Gly

Asn

Pro

Pro

Phe

Gin

Ser

Lys

Asn

465

470

475

480

Lys

Leu

Gin

Arg

Glu

Met

Gly

Ala

Ala

Tyr

val

Lys

Lys

Leu

Arg

Ala

485

490

495

Hi s

Tyr

Pro

Asp

val

Pro

Gly

Arg

Ala

Asp

Tyr

cys

val

Tyr

Trp

Ile

500

505

510

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Arg Lys

Ala 515

His Asp

Gln

Leu

Gly Ser Gly 520

Gln

Arg

Ala 525

Gly

Leu

Val

Gly

Thr

Asn

Thr

ile

Arg

Gln

Asn

Asp

ser

Arg

val

Gly

Gly

Leu

Asp

530

535

540

Tyr

val

val

Gln

Hi s

Gly

Gly

Thr

ile

Thr

Asp

Ala

val

Gly

Thr

Gln

545

550

555

560

val

Trp

Ser

Gly

Asp

Ala

Al a

val

His

val

Ser

ile

Val

Asn

Trp

val

565

570

575

Lys

Gly

Pro

Al a

Glu

Gly

pro

Lys

Hi s

Leu

Al a

Trp

Gln

val

Gly

Asp

580

585

590

Hi s

Arg

Thr

Ser

Pro

Trp

Gln

ser

Thr

Glu

Leu

Pro

val

ile

Asn

Ser

595

600

605

Ala

Leu

ser

Al a

Gly

Thr

Asp

val

Thr

Gln

Ala

Gln

Lys

Leu

Arg

val

610

615

620

Asn

Met

Asn

Ser

Gly

Al a

cys

Tyr

Gln

Gly

Gln

Thr

His

Gly

Hi s

Lys

625

630

635

640

Gly

Phe

Leu

Leu

Asp

Gly

Leu

Glu

Ala

Gly

Gln

Met

Leu

Ser

Al a

Glu

645

650

655

Arg

Lys

Asn

Ala

Glu

Val

Ile

phe

Pro

Tyr

Leu

Thr

Gly

Asp

Glu

Leu

660

665

670

Leu

Arg

Thr

Ser

Pro

Pro

His

Pro

Thr

Arg

Tyr

Val

Ile

Asp

phe

Gln

675

680

685

Pro

Arg

Asp

Val

phe

Gly

Al a

Arg

Ala

Tyr

Lys

Leu

Pro

Phe

Al a

Arg

690

695

700

Ile

Glu

Arg

Glu

val

Leu

Pro

Thr

Arg

Gln

Ala

Ala

Ala

Ala

Glu

Glu

705

710

715

720

Glu

Al a

Arg

Asn

Ala

Glu

Val

Leu

Ala

Al a

Asn

Pro

Lys

Ala

Lys

Thr

725

730

735

Asn

Lys

Hi s

Hi s

Arg

Asn

Phe

Leu

Asn

Gln

Trp

Trp

Ala

Leu

Ser

Tyr

740

745

750

Gly

Arg

Ser

Glu

Met

Ile

Glu

Lys

Ile

Ser

Ser

Leu

Ser

Arg

Tyr

Ile

755

760

765

Val

cys

Ser

Arg

Val

Thr

Lys

Arg

Gln

Val

Phe

Glu

Phe

Leu

Asp

Asn

770

775

780

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Gly ile Arg Pro 785

ser

Asp Gly Leu Gin 790

Ile

Phe Ala 795

Phe

Glu

Asp

Asp 800

Tyr

Ser

Phe

Gly

Val

Ile

Gin

Ser

Ser

val

Hi s

Trp

Gin

Trp

Leu

Ile

805

810

815

Ala

Arg

Gly

Gly

Thr

Leu

Thr

Ala

Arg

Leu

Met

Tyr

Thr

Ser

ASP

Thr

820

825

830

val

phe

Asp

Thr

Phe

Pro

Trp

Pro

Asp

Pro

Thr

Leu

Ala

Gin

Val

Arg

835

840

845

Ala

Val

Ala

Ala

Ala

Al a

Val

Lys

Leu

Arg

Glu

Leu

Arg

Asn

Lys

val

850

855

860

Met

Arg

Glu

Gin

Gly

Trp

Ser

Leu

Arg

Asp

Leu

Tyr

Arg

Thr

Leu

Asp

865

870

875

880

Met

Pro

Gly

Lys

Asn

Pro

Leu

Arg

Asp

Ala

Gin

Glu

Arg

Leu

Asp

Al a

885

890

895

Ala

val

Ser

Ala

Al a

Tyr

Gly

Leu

Pro

Ala

Gly

Ala

Asp

Met

Leu

Asp

900

905

910

Phe

Leu

Leu

Ala

Leu

Asn

Ala

xaa

val

Ala

Al a

Ala

Glu

Ala

Arg

Gly

915

920

925

Al a

Ala

val

Thr

Gly

Pro

Gly

Leu

pro

Ala

Gly

Leu

Asn

Thr

Al a

Asp

930

935

940

Phe

val

Thr

Ala

Asp

Al a

val

Arg

pro

Leu

Gly

945

950

955

<210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> pierwszych 14 reszt końca aminowego Mmei <400> 15

Ala Leu Ser Trp Asn Glu ile Arg Arg Lys Ala ile Glu Phe 1 5 10 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> pierwszych 29 reszt peptydu 25kD

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

<220> <221> <222> <223>	cecha inna ¢20)..(20) X = Xaa (każdy	ami nokwas)
<220> <221> <222> <223>	cecha inna (21)..(21) X = xaa (każdy	ami nokwas)
<220> <221> <222> <223>	cecha inna ¢23)..(23) x = xaa (każdy	ami nokwas)
<22O> <221> <222> <223>	cecha inna ¢25)..(25) x = xaa (każdy	ami nokwas)
<400>	16

Met Lys ile ser Asp Glu Phe Gly Asn Tyr Phe Ala Arg Ile Pro Leu 15 10 15

Lys ser Thr xaa xaa ile xaa Glu xaa Asn Ala Leu Gin 20 25

<210>	17
<211>	40
<212>	PRT
<213>	ni eznane
<220>
<223>	pierwszych 40	i reszt aminokwasowych uzyskanych z fragmentu 14 kD
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(36)..(36)
<223>	X=Xaa (każdy	ami nokwas)
<400>	17
Met Asp Ala Lys Lys	Arg Arg Asn Leu Gly Ala His Tyr Thr Ser Glu

10 15

Ala Asn ile Leu Lys Leu ile Lys Pro Leu Leu Leu Asp Glu Leu Trp 20 25 30

Val Val Phe Xaa Lys Val Lys Asn 35 40 <210> 18 <211> 25 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> pierwszych 25 reszt peptydu 7,5 kD <400> 18

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

Met Lys Ser Arg Gly Lys Asp Leu Asp Lys Ala Tyr Asp Gin Ala Leu 15 10 15

Asp Tyr Phe Ser Gly Ile Ala Glu Arg 20 25 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> starter fragmentu 25 kD <400> 19

Asp Glu Phe Gly Asn Tyr Phe Ala

1	5 '
<210>	20
<211>	20
<212>	DNA
<213>	nieznane
<220>
<223>	starter lewy
<220>
<221>	cecha inna
<222>	¢3)..(3)
<223>	R = A lub G
<220>
<221>	cecha inna
<222>	¢6)..(6)
<223>	γ = τ lub c
<220>
<221>	cecha inna
<222>	¢9)..(9)
<223>	n to a, c, g,
<220>
<221>	cecha inna
<222>	¢12)..(12)
<223>	γ = τ lub c
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(15)..(15)
<223>	Y = T lub C
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(18) . . (18)
<223>	γ = τ lub c
<400>	20
garttyggna aytayttygc
<210>	21
<211>	20

PL 208 400 B1

NEB-207-PIN.ST25 <212> DNA <213> nieznane <220>

<223> starter prawy <220>

<221> cecha inna <222> (3)..(3) <223> R = A lub G <220>

<221> cecha inna <222> (6)..(6) <223> R = A lub G <22Ο>

<221> cecha inna <222> (9)..(9) <223> η to a, c, g, lub t <220>

<221>	cecha	i nna
<222>	(12)..	(12)
<223>	R = A	lub G
<220>
<221>	cecha	i nna
<222>	(15)..	.(15)
<223>	Y = T	lub C
<220>
<221>	cecha	i nna
<222>	(18) . .	.(18)
<223>	R = A	1 ub G
<400>	21

aartarttnc craaytcrtc 20 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> starter fragmentu 14 kD <400> 22

Met Asp Ala Lys Lys Arg

1	5
<210> <211> <212> <213>	23 17 DNA ni eznany
<220> <223>	starter lewy
<220> <221> <222> <223>	cecha inna (6)..(6) Y = T lub C

PL 208 400 B1

<220>
<221>	cecha inna
<222>	(9)..(9)
<223>	η to a, c, g,
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(12)..(12)
<223>	R = A lub G
<220>
<221>	cecha inna
<222>	¢15)..(15)
<223>	R = A lub G
<400>	23
atggaygcna araarcg
<210>	24
<211>	17
<212>	DNA
<213>	nieznany
<220>
<223>	starter prawy
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(6).. (6)
<223>	γ = τ lub c
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(9) · (9)
<223>	n to a, c, g,
<220>
<221>	cecha inna
<222>	¢12)..(12)
<223>	R = A lub G
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(15)..(15)
<223>	R = A lub G
<400>	24
atggaygcna araarag
<210>	25
<211>	20
<212>	DNA
<213>	ni eznany
<220>
<223>	starter prawy
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(3)..(3)
<223>	n to a, c, g,
<220>
<221>	cecha inna

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 <222> (6)..(6) <223> Υ = Τ lub C <220>

<221> cecha inna <222> (9)..(9) <223> Υ = Τ lub C <220>

<221> cecha inna <222> (12)..(12) <223> η to a, c, g, or t <220>

<221> cecha inna <222> (15)..(15) <223> R = A lub G <400> 25 cgncgyttyt tngcrtccat 20 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> starter fragmentu 7.5 kD <400> 26

Asp Lys Ala Tyr Asp Gin Ala

1	5
<210>	27
<211>	20
<212>	DNA
<213>	ni eznany
<220>
<223>	starter lewy
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(3)..(3)
<223>	Y = T lub C
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(6)..(6)
<223>	R = A lub G
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(9)..(9)
<223>	n to a, c, g
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(11) dl)
<223>	Y = T lub C
<220>
<221>	cecha inna
<222>	(14) .. (14)

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 <223> Υ = Τ lub C <220>

<221> cecha inna <222> (17)..(17) <223> R = A lub G <400> 27 gayaargcnt aygaycargc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter prawy <220>

<221> cecha inna <222> (3)..(3) <223> Υ = Τ lub C <220>

<221> cecha inna <222> (6)..(6) <223> R = A lub G <220>

<221> cecha inna <222> (9)..(9)

<223>	R = A lub G
<22Ο>
<221>	cecha	i nna
<222>	(12) . .	(12)
<223>	η to a	L, C, i
<220>
<221>	cecha	inna
<222>	(15)..	(15)
<223>	Υ = Τ	lub C
<220>
<221>	cecha	i nna
<222>	(18)..	(18)
<223>	R = A	lub G
<400>	28

gcytgrtcrt angcyttrtc 20 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter ΙΡ 1 <400> 29 gttggatccc gcacagattg ctcagg 26 <210> 30 <211> 30

PL 208 400 B1

<212>	DNA
<213>	nieznany
<220>
<223>	starter ip 2

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 <400> 30 gttggatcct acgttaatct gaataagatg 30 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter IP 3 <400> 31 gttggatcct gttaatctga aacgctgg 28 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter IP 4 <400> 32 gttggatcct tataccaaaa tgtgaggtc 29 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter IP 5 <400> 33 ttcagaaata cgagcgatgc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter IP 6 <400> 34 gtcaagccat aaacaccatc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter IP 7
<400> 35 gagggtcaga aaggaagctg	20

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25

<210>	36
<211>	20
<212>	DNA
<213>	nieznany
<220>
<223>	starter IP 8

<400> 36 gtccaactaa ccctttatgg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter IP 9 <400> 37 ttcctagtgc tgaacctttg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter IP 10 <400> 38 gttgcgttac ttgaaatgac 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter IP 11 <400> 39 ccaaaatgga acttgtttcg 20

<210>	40
<211>	20
<212>	DNA
<213>	ni eznany
<22O>
<223>	starter IP 12
<400>	40
gtgagtgcgc cctgaattag
<210>	41
<211>	21
<212>	DNA
<213>	nieznany
<220>

PL 208 400 B1 <223> starter sl

NEB-207-PIN.ST25 <400> 41 gcttcatttc atcctctgtg c <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter S2 <400> 42 taaccgccaa aattaatcgt g 21 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> starter S3 <400>

<400> 43 ccactattca ttacaacacc <210> 44 <211> 43 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> 20 nukleotydów, które pasują do sekwencji dna m. methyltrophus <400> 44 gttctgcagt taaggataac atatggcttt aagctggaac gag 43 <210> 45 <211> 37 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> 22 nukleotydów, które pasują do sekwencji DNA M. methylotrophus <400> 45 gttggatccg tcgacattaa ttaatttttg cccttag <210> 46 <211> 48 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> oligonukleotyd 1 <400> 46 gtttgaagac tccgacgcga tggccagcga tcggcgcctc agcttttg 48 <210> 47 <211> 48

PL 208 400 B1

ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> oligonukleotyd 2 <400> 47 caaaagctga ggcgccgatc gctggccatc gcgtcggagt cttcaaac 48 <210> 48 <211> 48 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> oligonukleotyd 3 <220>

<221> cecha inna <222> (15)..(15) <223> A = 6-metyloadenina <400> 48 gtttgaagac tccgacgcga tggccagcga tcggcgcctc agcttttg 48 <210> 49 <211> 48 <212> DNA <213> nieznany <220>

<223> oligonukleotyd 4 <220>

<221> cecha inna <222> (38)..(38) <223> A = 6-metyloadenina <400> 49 caaaagctga ggcgccgatc gctggccatc gcgtcggagt cttcaaac 48 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> nieznane <220>

<223> fragment pojedycznego wewnętrznego trawienia CnBr <400> 50

Gly Arg Gly Arg Gly val Gly val

Claims (4)

1. Wyizolowany segment DNA kodujący Mmel, restrykcyjna endonukleaza-metylaza, znamienny tym, że wyizolowany DNA uzyskuje się z plazmidu pTBMmel o numerze dostępowym ATCC PTA-4521.

2. Rekombinowany wektor, do którego wprowadzono segment DNA kodujący Mmel, endonukleaza-metylaza, jak zdefiniowano w zastrz. 1.

3. Komórka gospodarza transformowana wektorem, jak zdefiniowano w zastrz. 2.

4. Sposób wytwarzania rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej Mmel oraz metylazy Mmel, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórki gospodarza transformowanej wektorem zdefiniowanym w zastrz. 2 w warunkach odpowiednich do ekspresji wspomnianej endonukleazy i metylazy.