PL208864B1 - Zastosowanie wektora białkowego, kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna i jej zastosowania oraz wektor białkowy - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wektora białkowego składającego się z adenylocyklazy pochodzącej z gatunku Bordetella, kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna spreparowana do podawania człowiekowi albo zwierzęciu i zawierająca wektor białkowy, zastosowania takiej kompozycji oraz wektor białkowy zawierający rekombinowaną adenylocyklazę pochodzącą z gatunku Bordetella.

Tło wynalazku

Wynalazek dotyczy nowego zastosowania toksyny cyklazy adenylowej (adenylocyklazy) Bortedella do wytwarzania wektorów do nakierowywania cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania specyficznie na komórki z ekspresją CD11b. Wynalazek dotyczy także kompozycji immunogennej, która wzbudza odpowiedź immunologiczną, do kompozycji farmaceutycznych oraz nowego wektora do dostarczania cząsteczek do komórek wykazujących ekspresję CD11b.

Bortedella pertussis, czynnik sprawczy krztuśca, wydziela kilka toksyn, włączając dobrze znaną toksynę krztuścową (PT) oraz toksynę - cyklazę adenylową (CyaA) lub także adenylocyklazę. CyaA jest krytycznym czynnikiem wirulencji B. pertussis w mysim modelu oddechowym, jaki jest konieczny dla wczesnych etapów kolonizacji płuca. W rzeczywistości, delecja genetyczna tej toksyny dramatycznie zmniejsza patologiczne skutki zakażenia B. pertussis, zmniejszając liczbę bakterii odzyskiwanych z płuca i prawie znoszą c rekrutację komórek zapalnych oraz zmiany pł ucne obserwowane po infekcji [Weiss i inni, 1984; Weiss i inni, 1989; Gross i inni, 1992; Khelef i inni, 1992; Khelef i inni, 1994; Gueirard i inni, 1998]. Ponadto, CyaA stanowi antygen ochronny przed infekcją B. pertussis w mysim modelu oddechowym [Guiso i inni, 1989; Guiso i inni, 1991].

Adenylocyklaza, początkowo odkryta przez Hewlett i innych w supernatantach hodowli B. pertussis [Hewlett i inni, 1976] jest aktywowana, jak się okazało potem, przez eukariotyczną kalmodulinę [Wolf i inni, 1980]. Ta uderzająca cecha szybko znalazła racjonalne wytłumaczenie kiedy Confer i Eaton wykazali, ż e adenylocyklaza mogł a wejść do komórek eukariotycznych gdzie po aktywacji kalmoduliną mogła wywołać duży wzrost ilości cAMP w tych komórkach docelowych [Confer i inni, 1982].

Adenylocyklaza jest kodowana przez gen cyaA, a jego ekspresja, tak jak innych genów wirulencji B. pertussis, jest regulowana w sposób skoordynowany przez sygnały środowiskowe. Gen cyaA jest częścią operonu, który zawiera także geny cya B, D i E, które są konieczne do wydzielania CyaA [Ladant i inni, 1999].

Toksyna CyaA jest białkiem bifunkcjonalnym o 1706 resztach, które składa się z N-terminalnej domeny katalitycznej o 400 aminokwasach oraz C-terminalnej części o 1306 resztach, która jest odpowiedzialna za wiązanie toksyny z błoną komórki docelowej i następnie dostarczenie cząstki katalitycznej do cytozolu komórki [Sakamoto i inni, 1992] [Ladant i inni, 1999]. Ta część wykazuje także słabą aktywność hemolityczną z powodu swej zdolności do tworzenia w błonach biologicznych kanałów selektywnych wobec kationów [Benz i inni, 1994] [Gray i inni, 1998]. Region ten jest homologiczny w stosunku do hemolizyny Escherichia coli i innych członków rodziny toksyn bakteryjnych RTX (Repeat in ToXin). W szczególności zawiera on szeregi nonapeptydowych powtórzeń bogatych w glicynę i bogatych w asparaginian, które biorą udział w wiązaniu wapnia [Rose i inni, 1995] [Coote i inni, 1992].

Polipeptyd CyaA jest syntetyzowany w postaci nieaktywnej protoksyny, która jest przekształcana w aktywną toksynę poprzez palmitoilowanie potranslacyjne dwóch wewnętrznych reszt lizyny (lizyna 856 i 963). Ta modyfikacja wymaga produktu genu pomocniczego, cyaC, który zlokalizowany jest obok cyaA na chromosomie B. pertussis.

Okazało się, że CyaA wiąże i atakuje rozmaite rodzaje komórek, łącznie z komórkami bez przejść błonowych, jak erytrocyty ssaków [Roger i inni, 1992]. Sugeruje to, że domena katalityczna CyaA jest bezpośrednio przemieszczana przez błonę do komórek docelowych. Wejście domeny katalitycznej do cytozolu komórki jest uzależnione od wapnia i temperatury, i zależy od ładunku błony plazmatycznej [Rogel i inni, 1992] [Karimova i inni, 1998] [Otero i inni, 1995]. Jednakże mechanizmy molekularne, za pomocą których toksyna transportuje swoją N-terminalną domenę katalityczną przez błonę, pozostają do dzisiaj w większości nieznane. Ponadto nie opisano specyficznego receptora wiążącego CyaA.

Konsekwencje fizjologiczne zatrucia komórkowego przez CyaA scharakteryzowano in vitro w fagocytach. Confer i Eaton pierwsi pokazali, że Cya A ekstrahowana z B. pertussis zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom cAMP w neutrofilach i makrofagach, prowadząc do chemotaksji i działania bakteriobójczego, takiego jak tworzenie nadtlenku i zdolności fagocytarnych [Confer i inni, 1982]. AkPL 208 864 B1 tywność tę potwierdzono później dla toksyn oczyszczonych lub dla mutantów bakteryjnych z delecją CyaA [Pearson i inni, 1987; Friedman i inni, 1987] [Njamkepo i inni, 2000]. Przeciwnie, i mimo znacznych zmian zawartości cAMP, zatrucie CyaA nie miało wpływu, jak się okazało, na żywotność linii komórkowych nie pochodzących od komórek krwiotwórczych [Bassinet i inni, 2000]. Ponadto, twórcy niniejszego wynalazku wcześniej wykazali, że CyaA B. pertussis może wywoływać apoptozę makrofagów in vitro [Khelef i inni, 1993; Khelef i inni, 1995] oraz in vivo [Gueirard i inni, 1998]. W tych modelach, genetyczne usunięcie CyaA znosiło apoptozę makrofagów, lecz nie śmierć neutrofili, sugerując, że CyaA i) jest głównym czynnikiem odpowiedzialnym za apoptozę makrofagów, ii) może być odpowiedzialna za apoptozę neutrofili, lecz że odpowiedzialny może być także inny czynnik.

Oprócz tego, badania in vivo przeprowadzone na modelu mysim zakażenia B. bronchiseptica (zwierzęcy homolog B. pertussis, którego CyaA jest blisko spokrewniona) wykazały, że głównym celem toksyczności CyaA B. bronchiseptica jest populacja zależna od GM-CSF oraz wrażliwa na cyklofosfamid, która kontroluje wczesne etapy zakażenia [Harvill i inni, 1999]. Kryteria te zidentyfikowały neutrofile i prawdopodobnie inne komórki, łącznie z makrofagami lub komórkami dendrytycznymi, lecz żadne dane nie opisywały ani nie sugerowały, że receptor komórkowy CD11b jest związany z nakierowywaniem przez CyaA. Te populacje komórek docelowych dla CyaA są tymi samymi, które ograniczają wczesne fazy zakażenia i sprzyjają rozwojowi nabytej odpowiedzi immunologicznej, która kontroluje późniejsze fazy zakażenia [Harvill i inni, 1999].

Inaczej niż przy innych toksynach, przez długi czas uważano, że CyaA jest niezależna od wiązania z jakimkolwiek receptorem. Bazowano na obserwacjach, że i) CyaA może zatruwać wiele różnych modelowych linii komórkowych różnego pochodzenia [Ladant i inni, 1999], ii) CyaA wiąże komórki Jurkat oraz erytrocyty owcy w sposób nienasycający [Gray i inni, 1999]. Jednakże odkryto pewną specyficzność jeśli chodzi o komórki zakażone CyaA. Rzeczywiście, badania in vivo pokazały, że podczas zakażenia mysich dróg oddechowych gatunkami Bordetella, CyaA niszczyła specyficznie leukocyty (zwłaszcza makrofagi) bez niszczenia komórek nabłonkowych [Gueirard i inni, 1998; Harvill i inni, 1999].

W zgł oszeniu patentowym WO 93/21324 zaproponowano stosowanie rekombinowanej adenylocyklazy Bordetella do indukcji odpowiedzi komórek T CD4+ lub komórek T CD8+; jednakże ze względu na to, że nie zidentyfikowano żadnego specyficznego receptora dla adenylocyklazy Bordetella, nie było wiadomo czy prezentacja antygenu była związana z wychwytem przez niewyspecjalizowaną komórkę prezentującą antygen w następstwie wzajemnego pobudzenia i prezentacji przez komórki dendrytyczne, albo czy antygen był namierzany przez wyspecjalizowane komórki prezentujące antygen (pAPC).

Równocześnie ze swoim fenotypem powierzchniowym komórki dendrytyczne (wysoki poziom ekspresji cząsteczek MHC I i II, kostymulatorowych i adhezyjnych) stanowią najsilniejsze APC w wielu próbach in vitro pobudzania naiwnych komórek T [Bell i inni, 1999; Viola i inni, 1999]. Inne APC, np. jak spoczynkowe, naiwne komórki B, mogły nawet powodować tolerancję, ponieważ wstrzyknięcie spoczynkowych komórek B samca gospodarzom - samicom prowadzi do wytworzenia swoistej tolerancji komórek T CD8+ specyficznych dla samców [Fuchs i inni, 1992]. In vitro, naiwne komórki B mogły usuwać naiwne komórki T CD8+ poprzez mechanizm zależny od Fas [Bennet i inni, 1998]. Ponadto, prezentacja Ag przez komórki dendrytyczne koreluje in vivo z indukcją odpowiedzi komórek T. Zostało to ustalone dla prezentacji Ag z restrykcją MHCII. Wstrzyknięcie Ag pozbawionego adiuwanta drogą dożylną (iv) nie indukuje pobudzania komórek T [Kyburz i inni 1993; Aichele i inni, 1994; Aichele i inni,

1995] i prowadzi do prezentacji Ag przez nieswoiste komórki B [Guery i inni, 1997] [Zhong i inni, 1997;

Reis i Sousa i inni, 1999] oraz na koniec komórki dendrytyczne [Crowley i inni, 1990] [Zhong i inni, 1997; Reis i Sousa, 1999]. Dla kontrastu, strategie miejscowej immunizacji, tak jak strategia immunizacji podskórnej (sc) zwykle w obecności adiuwanta, indukuje pobudzenie komórek T i prezentację namierzonego Ag przez komórki Langerhansa migrujące ze skóry do LN napływających do miejsca immunizacji. W tym przypadku komórki B i makrofagi nie są zaangażowane [Guery i inni, 1996]. Podobne rezultaty otrzymano po immunizacji DNA sc lub śródskórnej (id) dla kompleksów peptydowych

MHCII i MHCI: komórki dendrytyczne mogą być bezpośrednio transfekowane w miejscu wstrzyknięcia, a następnie migrować do doprowadzającego LN poprzez doprowadzające naczynie limfatyczne [Condon i inni, 1996; Casares i inni, 1997; Porgador i inni, 1998]. O migracji wiadomo, że jest kluczowym zdarzeniem immunologicznym, ponieważ mechaniczne przerwanie doprowadzających naczyń limfatycznych znosi odpowiedź komórek T wobec środków uwrażliwiających skórę albo przeszczepów skórnych [Zinkenagel i inni, 1997].

PL 208 864 B1

Zatem, nakierowanie na komórki dendrytyczne jest zasadnicze dla stymulacji komórek T CD4+ i CD8+. Ponieważ większość odpowiedzi przeciwciał jest zależ na od pomocy komórek T CD4+, to nakierowanie antygenu na komórki dendrytyczne jest głównym celem szczepienia.

Twórcy wynalazku byli zainteresowani badaniem prezentacji adenylocyklazy z gatunku Bordetella przez komórki T, i zidentyfikowali cząsteczkę specyficznego receptora występującego na specyficznych komórkach, która oddziałuje z CyaA i otwiera nowe możliwości zastosowania CyaA jako wektora białkowego dla cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania.

Genetycznie pozbawione toksyczności toksyny bakteryjne stanowią kandydatów na wektory szczepionkowe, w szczególności epitop T, z powodu ich zdolności do atakowania komórek eukariotycznych (Ladant i inni, 1999). Jednakże niewiele wektorów białkowych, jak się okazało, pobudza odpowiedzi CTL in vivo (Ballard i inni, 1996; Cabonette i inni, 1999). Ponadto, mimo licznych, obiecujących badań in vitro, żaden wektor, jak stwierdzono, nie był wyłącznie nakierowany na pAPC, szczególnie na komórki dendrytyczne, a zwłaszcza szpikowe komórki dendrytyczne.

Twórcy wynalazku dodatkowo wykazali, że inne komórki, zwłaszcza neutrofile, mogłyby być nakierowywane przez wektory zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Wynalazek zapewnia środki, które mogą, przynajmniej częściowo, spełnić te potrzeby i proponuje nowe wektory, które specyficznie nakierowują cząsteczki na określone populacje, np. pAPC, umożliwiając stymulację odpowiedzi immunologicznej.

Ponadto, cząsteczka nakierowana na pAPC i specyficzne leukocyty umożliwiałaby wytworzenie nowych wektorów użytecznych do dostarczania cząsteczki biologicznie aktywnej do w pobliże tych komórek. Komórki te np. mogłyby modulować właściwości funkcjonalne docelowych komórek lub komórek związanych z odpowiedzią immunologiczną lub odpowiedzią zapalną.

Rzeczywiście, twórcy wynalazku stwierdzili, że toksyna adenylocyklazowa Bordetella pertussis wiąże się swoiście z receptorem komórkowym oznaczonym jako receptor (CD11b/CD18) α_Μ/β₂ i że ta interakcja jest konieczna dla wewnątrzkomórkowego dostarczania domeny adenylocyklazy do cytozolu komórek i następnie dla śmierci komórki. Integryna α_Μ/β₂ (CD11b/CD18) jest dimerem z rodziny integryn β₂, przy czym ekspresja tych integryn ogranicza się do leukocytów. a_M/e₂ (CD11b/CD18) wykazuje u myszy i człowieka wzór ekspresji, która ogranicza się do neutrofili/granulocytów, makrofagów, komórek dendrytycznych, komórek NK i podzbiorów limfocytów B i T CD8+ (Jeyaseela i inni, 2000, Arnaout i inni, 1990).

Zatem, ten receptor reprezentowałby idealny cel dla nowych wektorów zaprojektowanych w szczególności do immunizacji epitopem T.

Twórcy wynalazku pokazali tu, że adenylocyklazę Bordetella można wykorzystać do nakierowywania na komórki in vivo, specyficznie na komórki wykazujące ekspresję CD11b.

W szczególności, twórcy wynalazku pokazali tu, że antygen peptydowy zawarty w toksynie adenylocyklazowej Bordetella pertussis może być skutecznie nakierowywany specyficznie na powierzchnię komórek dendrytycznych, przemieszczany do cytozolu wymienionych komórek dendrytycznych oraz może wzbudzać odpowiedź CTL.

W konkretnej postaci realizacji, wymienioną odpowiedź otrzymuje się z pominięciem adiuwanta oraz pomocy komórek T CD4+.

Wykazano także, że genetycznie modyfikowaną adenylocyklazę można chemicznie sprzęgać z peptydem będącym przedmiotem zainteresowania w celu nakierowania tego peptydu na komórki wykazujące ekspresję CD11b, zwłaszcza cytozol komórek dendrytycznych.

Wynalazek ten zapewnia więc nową skuteczną kompozycję immunogenną, jak również nowy wektor do dostarczania leku do komórek wykazujących ekspresję CD11b.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek ten dotyczy zastosowania adenylocyklazy Bordetella do wytwarzania wektora białkowego do nakierowywania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania specyficznie na komórki wykazujące ekspresję CD11b.

Wynalazek odnosi się także do zastosowania adenylocyklazy Bordetella, przy czym wymieniona adenylocyklaza jest rekombinowana z antygenem, a zwłaszcza modyfikowana przez wprowadzenie peptydu będącego przedmiotem zainteresowania lub modyfikowana przez insercję cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, w celu wytworzenia kompozycji do nakierowywania wymienionego peptydu lub cząsteczki specyficznie na komórki wykazujące ekspresję CD11b.

Określenie „specyficznie oznacza w kontekście niniejszego wynalazku, że adenylocyklaza stosowana jako wektor dla cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, jest preferencyjnie skieroPL 208 864 B1 wana na komórki wykazujące ekspresję CD11b, oferując przez to środki do nakierowania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania na powierzchnię wymienionych komórek lub do wnętrza wymienionych komórek, w sposób selektywny względem innych komórek.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wektora białkowego składającego się z adenylocyklazy gatunku Bordetella sprzężonej z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania do specyficznego nakierowywania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania na komórki wykazujące ekspresję CD11b, przy czym cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania wybrana jest z grupy składającej się z peptydów, glikopeptydów, lipopeptydów i środków chemicznych.

Korzystnie wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest wstawiona w wymienioną adenylocyklazę .

Korzystnie wymieniona adenylocyklaza jest genetycznie zmodyfikowaną adenylocyklazą gatunku Bordetella.

Korzystniej wymieniona adenylocyklaza gatunku Bordetella jest skróconą toksyną adenylocyklazową Bordetella zdolną do wiązania receptora CD11b.

Jeszcze korzystniej wymieniona skrócona toksyna adenylocyklazowa Bordetella pozbawiona jest całości lub części swej N-terminalnej domeny katalitycznej.

Najkorzystniej wymieniona skrócona toksyna adenylocyklazowa Bordetella pozbawiona jest wszystkich lub części reszt 1-373.

Korzystnie zastosowanie to jest przeznaczone do specyficznego nakierowywania wymienionej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania do cytozolu komórek wykazujących ekspresję CD11b.

Korzystnie zastosowanie to jest przeznaczone do specyficznego nakierowywania wymienionej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania na powierzchnię komórek wykazujących ekspresję CD11b.

Korzystnie zastosowanie to jest przeznaczone do specyficznego nakierowywania wymienionej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania do szlaku endocytarnego komórek wykazujących ekspresję CD11b.

Korzystnie wymienione komórki wykazujące ekspresję CD11b są komórkami dendrytycznymi, korzystniej mieloidalnymi komórkami dendrytycznymi, makrofagami albo komórkami NK.

Korzystnie wymienione komórki wykazujące ekspresję CD11b są neutrofilami.

Korzystniej wymieniona zmodyfikowana adenylocyklaza jest adenylocyklazą nietoksyczną albo detoksyfikowaną.

Korzystniej wymieniona genetycznie zmodyfikowana adenylocyklaza zawiera jedną lub więcej reszt cysteiny wstawionych w obrębie swej domeny katalitycznej w miejscach permisywnych.

Korzystnie wymieniona adenylocyklaza pochodzi z Bordetella pertussis.

Korzystnie wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest antygenem.

Korzystniej wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z wewnątrzkomórkowego antygenu komórki bakteryjnej, antygenu komórki nowotworowej, antygenu wirusowego, antygenu grzybowego i antygenu komórki pasożyta.

Jeszcze korzystniej wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z antygenu poliowirusa, antygenu wirusa HIV, antygenu wirusa grypy, antygenu wirusa zapalenia opon i splotów naczyniowych oraz antygenu nowotworowego.

Korzystnie cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania obejmuje epitop.

Korzystnie wymieniony wektor białkowy zawiera heterologiczny peptyd poddany fuzji z N-terminalnym końcem genetycznie zmodyfikowanej skróconej adenylocyklazy Bordetella pozbawionej całości lub części swej N-terminalnej domeny katalitycznej, przy czym wymieniona skrócona adenylocyklaza Bordetella zdolna jest do wiązania receptora CD11b, a korzystniej adenylocyklazy Bordetella pertussis pozbawionej reszt 1-373.

Korzystnie wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest lekiem, który jest chemicznie albo genetycznie sprzężony z wymienioną adenylocyklazą.

Korzystniej wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest lekiem, który jest sprzężony chemicznie za pomocą wiązania disiarczkowego z genetycznie wprowadzoną resztą cysteiny zlokalizowaną w domenie katalitycznej wymienionej adenylocyklazy.

Korzystniej wymieniony lek jest lekiem przeciwzapalnym.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna spreparowana do podawania człowiekowi albo zwierzęciu, zawierająca wektor białkowy składający się z ade6

PL 208 864 B1 nylocyklazy gatunku Bordetella sprzężonej z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania wybraną z grupy składającej się z peptydów, glikopeptydów, lipopeptydów i środków chemicznych.

Korzystnie wymienioną adenylocyklazę stanowi genetycznie zmodyfikowana adenylocyklaza.

Korzystniej wymienioną genetycznie zmodyfikowaną adenylocyklazę stanowi skrócona adenylocyklaza Bordetella pozbawiona całości lub części swej N-terminalnej domeny katalitycznej, zdolna do wiązania receptora CD11b.

Jeszcze korzystniej wymienioną genetycznie zmodyfikowaną adenylocyklazę stanowi skrócona adenylocyklaza Bordetella pertussis pozbawiona reszt 1-373.

Korzystniej wymieniona genetycznie zmodyfikowana adenylocyklaza zawiera jedną lub więcej reszt wstawionych w obrębie swej domeny katalitycznej w miejscu permisywnym lub miejscach permisywnych.

Korzystnie wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi lek.

Korzystniej wymieniony lek stanowi lek przeciwzapalny.

Korzystnie wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi antygen.

Korzystniej wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z wewnątrzkomórkowego antygenu komórki bakteryjnej, antygenu komórki nowotworowej, antygenu wirusowego, antygenu grzybowego i antygenu komórki pasożyta.

Jeszcze korzystniej wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z antygenu poliowirusa, antygenu wirusa HIV, antygenu wirusa grypy, antygenu wirusa zapalenia opon i splotów naczyniowych oraz antygenu nowotworowego.

Korzystnie wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest wstawiona do domeny katalitycznej wymienionej adenylocyklazy Bordetella.

Korzystnie wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi heterologiczny peptyd poddany fuzji z N-terminalną częścią genetycznie zmodyfikowanej adenylocyklazy Bordetella pozbawionej swej N-terminalnej domeny katalitycznej, zdolną do wiązania receptora CD11b.

Korzystniej wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi heterologiczny peptyd poddany fuzji z adenylocyklazą Bordetella pertussis pozbawioną reszt 1-373.

Korzystniej wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi peptyd heterologiczny.

Korzystnie kompozycja ta pozbawiona jest adiuwantów stymulujących.

Korzystnie wymieniona adenylocyklaza pochodzi z Bordetella pertussis.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie immunogennej lub farmaceutycznej kompozycji jak zdefiniowano powyżej, spreparowanej do podawania człowiekowi albo zwierzęciu, zawierającej wektor białkowy składający się z adenylocyklazy gatunku Bordetella sprzężonej z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania wybraną z grupy składającej się z peptydów, glikopeptydów, lipopeptydów i środków chemicznych, którą stanowi antygen, do indukcji lub stymulacji odpowiedzi immunologicznej ze specyficznym udziałem komórek dendrytycznych.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie immunogennej lub farmaceutycznej kompozycji jak zdefiniowano powyżej, spreparowanej do podawania człowiekowi albo zwierzęciu, zawierającej wektor białkowy składający się z adenylocyklazy gatunku Bordetella sprzężonej z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania wybraną z grupy składającej się z peptydów, glikopeptydów, lipopeptydów i środków chemicznych, którą stanowi antygen, do wytwarzania szczepionki lub kompozycji immunoterapeutycznej.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor białkowy zawierający rekombinowaną adenylocyklazę gatunku Bordetella sprzężoną z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania wybraną z grupy składającej się z peptydów, glikopeptydów, lipopeptydów i środków chemicznych, do specyficznego dostarczania wymienionej cząsteczki do komórek wykazujących ekspresję CD11b.

Korzystnie wymienione komórki wykazujące ekspresję CD11b stanowią komórki dendrytyczne, korzystniej mieloidalne komórki dendrytyczne, makrofagi albo komórki NK.

Korzystnie adenylocyklazę stanowi genetycznie zmodyfikowana adenylocyklaza.

Korzystniej wymieniona genetycznie zmodyfikowana adenylocyklaza zawiera genetycznie wstawioną resztę (reszty) cysteiny w miejscu permisywnym lub miejscach permisywnych w obrębie swej domeny katalitycznej.

Korzystniej wymienioną adenylocyklazę stanowi adenylocyklaza nietoksyczna albo detoksyfikowana.

PL 208 864 B1

Korzystniej wymienioną genetycznie zmodyfikowaną adenylocyklazę stanowi skrócona adenylocyklaza Bordetella, pozbawiona całości lub części swej N-terminalnej domeny katalitycznej, zdolna do wiązania receptora CD11b.

Jeszcze korzystniej wymienioną adenylocyklazę stanowi skrócona adenylocyklaza Bordetella pertussis pozbawiona reszt 1-373.

Korzystnie adenylocyklaza pochodzi z Bordetella pertussis.

Korzystnie wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi lek chemicznie lub genetycznie sprzężony z wymienioną adenylocyklazą.

Korzystnie wymieniony lek stanowi lek przeciwzapalny.

Korzystnie wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi epitop albo antygen.

Korzystniej wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z wewnątrzkomórkowego antygenu komórki bakteryjnej, antygenu komórki nowotworowej, antygenu wirusowego, antygenu grzybowego i antygenu komórki pasożyta.

Jeszcze korzystniej wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z antygenu poliowirusa, antygenu wirusa HIV, antygenu wirusa grypy, antygenu wirusa zapalenia opon i splotów naczyniowych oraz antygenu nowotworowego.

Korzystniej wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi epitop sprzężony chemicznie z genetycznie zmodyfikowaną adenylocyklazą zawierającą genetycznie wstawioną resztę (reszty) cysteiny w miejscu permisywnym lub miejscach permisywnych w swej domenie katalitycznej.

Korzystnie wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest wstawiona do domeny katalitycznej wymienionej adenylocyklazy Bordetella pertussis.

W jednej postaci realizacji wynalazku czą steczka bę d ą ca przedmiotem zainteresowania jest zasadniczo skierowana na komórki wykazujące ekspresję CD11b.

Stosowane w niniejszym zgłoszeniu określenie „komórki wykazujące ekspresję CD11b odnosi się do komórek, które wykazują na swej powierzchni ekspresję receptora CD11b/CD18 α_Μ/β₂. W szczególności komórki te to granulocyty/neutrofile, makrofagi, komórki NK, podzbiory komórek B i T CD8+ oraz szpikowe komórki dendrytyczne.

Ze względu na to, że komórki wykazujące ekspresję CD11b, a konkretniej szpikowe komórki dendrytyczne, neutrofile i makrofagi są zaangażowane w podstawowe funkcje odporności i wrodzonego systemu obronnego, w szczególności w odpowiedzi zapalne i swoiste odpowiedzi immunologiczne, to zgodnie z wynalazkiem opisano wytwarzanie wektora białkowego lub kompozycji zdolnej do nakierowywania cząsteczki lub danego peptydu, na te komórki wykazujące ekspresję CD11b, zwłaszcza szpikowe komórki dendrytyczne, neutrofile lub makrofagi.

W szczególności w jednej postaci realizacji nakierowywanie wymienionej cząsteczki lub peptydu jest skuteczne in vivo.

Wynalazek zapewnia przez to środki odpowiednie do projektowania kompozycji odpowiednich do podawania gospodarzom będącym zwierzęciem lub człowiekiem, wymagającym namierzenia pewnych leukocytów, a w szczególności szpikowych komórek dendrytycznych, neutrofili lub makrofagów.

Adenylocyklaza Bordetella jest adenylocyklazą zależną od kalmoduliny, wydzielaną przez gatunki Bordetella, lub jej fragmentem, przy czym wymieniony fragment zachowuje właściwości funkcyjne adenylocyklazy, cechę głównego czynnika wirulencji dla początkowych etapów kolonizacji bakterii w płucach. Adenylocyklaza jest syntetyzowana i wydzielana w postaci polipeptydu długości 1706 aminokwasów: aktywność katalityczna zależna od kalmoduliny jest umiejscowiona w pierwszych 400 aminokwasach. Aby być aktywną, wymieniona toksyna adenylocyklazowa staje się inwazyjna i hemolityczna przez modyfikację potransdukcyjną w wyniku koekspresji produktu genowego cyaC.

Następujące specyficzne cechy toksyny adenylocyklazowej Bordetella wskazują, że toksynę tę można wykorzystać przy wytwarzaniu wektora białkowego do nakierowywania in vivo cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania na komórki wykazujące ekspresję CD11b:

a) adenylocyklaza ta wiąże się specyficznie z komórkami wykazującymi ekspresję CD11b.

b) N-terminalna domena katalityczna przemieszczana jest do cytozolu komórek wykazujących ekspresję CD11b.

c) C-terminalna domena wiąże się z błoną komórek wykazujących ekspresję CD11b i może ulec internalizacji na drodze endocytozy.

PL 208 864 B1

d) epitop chemicznie sprzężony z genetycznie modyfikowaną adenylocyklazą może wzbudzić in vivo swoistą odpowiedź CTL.

Wyrażenie „adenylocyklaza obejmuje, w zakresie niniejszego wynalazku, naturalną lub modyfikowaną adenylocyklazę, włączając genetycznie lub chemicznie modyfikowaną adenylocyklazę, zapewniającą końcowy produkt zdolny do nakierowywania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania specyficznie na komórki wykazujące ekspresję CD11b.

Zgodnie z wynalazkiem opisano więc zastosowanie adenylocyklazy Bordetella jak określono powyżej, a zwłaszcza zastosowanie modyfikowanej lub rekombinowanej adenylocyklazy, do nakierowywania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania specyficznie na komórki wykazujące ekspresję CD11b.

Konkretniej, rekombinowane adenylocyklazy obejmują adenylocyklazy, które zostały genetycznie zmodyfikowane dostarczając albo adenylocyklazy z sekwencją peptydową lub resztami cysteiny wprowadzonymi do domeny katalitycznej, albo skrócone adenylocyklazy pozbawione całej domeny katalitycznej lub jej części.

Z powodu specyficznej interakcji między toksyną adenylocyklazową Bordetella i receptorem

CD11b/CD18 α_Μ/β₂, cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest specyficznie nakierowywana przynajmniej na powierzchnię komórek wykazujących ekspresję CD11b. W szczególnej postaci realizacji, toksyna adenylocyklazowa Bordetella jest wykorzystywana do wytwarzania białkowego wektora do dostarczania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania albo do cytozolu komórek wykazujących ekspresję CD11b, na powierzchnię komórek wykazujących ekspresję CD11b albo do komórek wykazujących ekspresję CD11b, na drodze endocytozy.

Wektory ekspresyjne do wytwarzania rekombinowanej adenylocyklazy Bordetella są opisane w zgłoszeniu patentowym WO 93/21324 (Institut Pasteur). Nowe wektory ekspresyjne do wytwarzania genetycznie modyfikowanej adenylocyklazy Bordetella odpowiedniej do chemicznego sprzęgania peptydu będącego przedmiotem zainteresowania, są także opisane w części doświadczalnej poniżej. Konkretniej, wektory ekspresyjne można konstruować kierując ekspresją zarówno genu cyaA jak i genu cyaC (Sebo i inni, 1991). Równolegle można skonstruować drugorzędowy plazmid niosący geny konieczne do wydzielania cytotoksycznej adenylocyklazy w E. coli, takie jak hlyB i hlyD, jakie opisano np. u Meckman i innych, 1985. W szczególności, można wykorzystać plazmid ekspresyjny pCACT3 opisany w WO 93/21324. Stosując ten plazmid, adenylocyklaza może ulegać ekspresji w E. coli i może być wydzielana przez tę bakterię w dużych ilościach. Jest ona także łatwa do oczyszczenia przy użyciu chromatografii powinowactwa na żywicy CaM Affi-Gel lub innych publikowanych procedur, takich jak te wykorzystujące DEAE-sefarozę i fenylosefarozę (Guermonprez i inni, 2000).

W jednej postaci realizacji wynalazku, adenylocyklaza jest rekombinowaną, genetycznie modyfikowaną adenylocyklazą. W szczególności, można uzyskać mutacje, takie jak mutacje punktowe, delecje lub insercje przy użyciu zwykłych technik mutagenezy ukierunkowanej lub losowej, pod warunkiem, że domeny konieczne do wiązania z komórkami wykazującymi ekspresję CD11b oraz ewentualnie do translokacji do cytozolu, są wciąż czynne. Testy oceniające swoiste wiązanie rekombinowanych toksyn i ich fragmentów z komórkami wykazującymi ekspresję CD11b i ewentualnie późniejszą translokację domeny katalitycznej, są opisane w następującej dalej części doświadczalnej.

W innej postaci realizacji rekombinowaną adenylocyklazą z gatunków Bordetella, jest fragment natywnej, modyfikowanej lub rekombinowanej toksyny adenylocyklazowej z gatunku Bordetella, przy czym wymieniony fragment jest zdolny do wiązania receptora CD11b. W szczególności, zgodnie z niniejszym wynalazkiem stwierdzono, że fragment obejmujący reszty 373 do 1706 (CyaA 373-1706) zawiera struktury zasadniczo konieczne do interakcji z receptorem CD11b/CD18. Tak więc, korzystnym fragmentem toksyny adenylocyklazowej gatunku Bordetella jest toksyna adenylocyklazowa Bordetella bez całej N-terminalnej domeny katalitycznej albo jej części, a konkretniej adenylocyklazy Bordetella pertussis pozbawionej wszystkich lub części reszt 1-373.

Swoiste wiązanie z CD11b można oszacować in vitro z użyciem przeciwciał monoklonalnych anty-CD11b, jak zilustrowano w przykładach.

W przypadku zastosowania do wytwarzania wektora białkowego lub sporządzenia kompozycji adenylocyklaza jest korzystnie nietoksyczna. Nietoksyczne mutanty toksyny adenylocyklazowej są dobrze opisane w dziedzinie (Betsou i inni, 1993; Betsou i inni, 1995).

W korzystnej postaci realizacji tego wynalazku adenylocyklaza pochodzi z Bordetella pertussis.

PL 208 864 B1

W konkretnych postaciach realizacji, czą steczkę bę d ą c ą przedmiotem zainteresowania wybiera się z grupy obejmującej: peptydy, glikopeptydy, lipopeptydy, polisacharydy, oligosacharydy, kwasy nukleinowe, lipidy i środki chemiczne.

W konkretnych postaciach realizacji cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania jest heterologiczny antygen. Użyty tu termin „heterologiczny odnosi się do antygenu innego niż adenylocyklaza, która jest użyta w samym wektorze.

W zalecanym wykonaniu wynalazku wytwarzanie białkowego wektora obejmuje wprowadzenie heterologicznej cząsteczki, a zwłaszcza peptydu do domeny katalitycznej adenylocyklazy, w miejscu permisywnym.

Gdy stosuje się tu określenie „miejsce permisywne odnosi się ono do miejsca, do którego można wprowadzić heterologiczną cząsteczkę, a zwłaszcza peptyd, bez zasadniczego wpływu na pożądane właściwości funkcjonalne toksyny adenylocyklazowej, czyli bez wpływu na domeny konieczne dla swoistego wiązania z receptorem CD11b/CD18, a w szczególności bez wpływu na proces translokacji domeny katalitycznej. W zalecanej postaci realizacji zachowana jest dodatkowo zdolność toksyny CyaA do pobudzania syntezy cAMP w namierzonych komórkach.

Metody selekcji pod względem miejsc permisywnych są przedstawione np. w WO 93/21324 oraz u Ladant i innych 1992. W szczególności, metodyka wykorzystująca podwójną selekcję (oporność na antybiotyki oraz test kalorymetryczny na płytkach przez α-komplementację) umożliwia łatwą identyfikację insercji oligonukleotydów (które zachowują ramkę odczytu) w części genu kodującej N-terminalną domenę katalityczną toksyny. Konsekwencje funkcjonalne tych mutacji w stosunku do aktywności katalitycznej toksyny można łatwo przeanalizować, zarówno genetycznie (komplementacja funkcjonalna szczepu E. coli cya^-) jak i biochemicznie (charakteryzacja stabilności modyfikowanych adenylocyklaz, ich aktywności enzymatycznej, interakcji z caM, itd). Ta metodyka umożliwiła przesiew licznych mutacji, aby zidentyfikować miejsca, które są potencjalnie dogodne do insercji determinant antygenowych.

Zgodnie z wynalazkiem miejsce permisywne może być wybrane z grupy obejmującej reszty 137-138, reszty 224-225, reszty 228-229, reszty 235-236, reszty 317-318 i reszty 335-236 adenylocyklazy Bordetella pertussis.

Jednakże w niniejszym wynalazku mogą być wykorzystywane inne miejsca permisywne, które można identyfikować np. stosując metodykę zaznaczoną powyżej, zwłaszcza miejsca między resztami

400 i 1700.

Wytwarzanie białkowego wektora może także obejmować etap fuzji cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, np. peptydu heterologicznego, na końcu N-terminalnym adenylocyklazy Bordetella, pozbawionej całości lub części jej N-terminalnej domeny katalitycznej, a zwłaszcza adenylocyklazy Bordetella pertussis pozbawionej reszt 1-373.

W zalecanej postaci realizacji adenylocyklazę według jednej z powyższych definicji wykorzystuje się do wytwarzania wektora białkowego lub kompozycji specyficznie zaprojektowanych do wzbudzania odpowiedzi cytotoksycznych komórek T CD8+ (odpowiedzi CTL), przy czym wymieniona odpowiedź następuje po nakierowaniu modyfikowanej adenylocyklazy (zwłaszcza rekombinowanej lub sprzężonej) z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania, na komórki wykazujące ekspresję CD11b, po czym następuje translokacja cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania do cytozolu wymienionych komórek wykazujących ekspresję CD11b, a w szczególności szpikowych komórek dendrytycznych. W tym kontekście, cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania stanowi, lub obejmuje, korzystnie epitop lub antygen.

Gdy stosuje się tu określenie „epitop odnosi się ono do heterologicznej cząsteczki, a zwłaszcza heterologicznego peptydu, który może indukować odpowiedź immunologiczną.

W konkretnej postaci realizacji, antygen wybrany jest z grupy obejmującej wewnątrzkomórkowy antygen komórki bakteryjnej, antygen komórki nowotworowej, antygen wirusowy, antygen grzybowy lub antygen komórki pasożyta.

W zalecanej postaci realizacji adenylocyklazę, np. naturalną, modyfikowaną lub rekombinowaną adenylocyklazę według jednej z powyższych definicji, wykorzystuje się do wytwarzania wektora białkowego albo do wytwarzania kompozycji specyficznie zaprojektowanych do pobudzania odpowiedzi komórki CD4+, przy czym wymieniona odpowiedź następuje po nakierowaniu adenylocyklazy modyfikowanej (zwłaszcza rekombinowanej lub sprzężonej) z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania na komórki wykazujące ekspresję CD11b, w szczególności szpikowe komórki dendrytyczne.

PL 208 864 B1

W tym kontekście, cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania stanowi, lub obejmuje, epitop lub antygen.

Cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania może być zwłaszcza antygen wybrany z grupy obejmującej: antygen wirusa polio, antygen wirusa HIV, antygen wirusa grypy, epitop wirusa zapalenia opon i splotów naczyniowych, antygen nowotworowy.

Właściwości funkcjonalne komórek wykazujących ekspresję CD11b określają ponadto nowe zastosowanie toksyny adenylocyklazowej Bordetella do wytwarzania wektora białkowego do nakierowywania leku na te specyficzne komórki. W tym kontekście, w jednej konkretnej postaci realizacji wynalazku, tak zwaną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania jest lek. Wymieniony lek może być chemicznie lub genetycznie sprzężony z adenylocyklazą. Metody sprzęgania leku z polipeptydem są dobrze znane w technice i obejmują np. wiązanie disiarczkowe za pomocą sulfhydrylu aktywowanego N-pirydylosulfonylem.

Korzystnie, cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania jest lek przeciwzapalny, który, po sprzężeniu z toksyną adenylocyklazową, jest specyficznie nakierowywany na powierzchnię komórek biorących udział w odpowiedzi zapalnej, takich jak neutrofile.

W szczególności, pokazuje się po raz pierwszy w części doświadczalnej, że możliwe jest szczepienie cząsteczek na CyaA przez wiązanie chemiczne lub przez insercję genetyczną, w celu nakierowania in vivo na komórki prezentujące antygen CD11b+, a zwłaszcza na cytozol komórek prezentujących antygen CD11b+. Rzeczywiście, po sprzężeniu cząsteczki odpowiadającej danemu epitopowi komórki T CD8+ z domeną katalityczną CyaA pozbawionej toksyczności, albo za pomocą wiązania disiarczkowego albo przez insercję genetyczną, stwierdzono, że zbudowana cząsteczka może wywoływać in vivo swoistą odpowiedż CTL, pokazując przez to, że wymieniony epitop komórki T CD8+ uległ translokacji do cytozolu komórek wykazujących ekspresję CD11b.

Konkretniej, prezentacja antygenu dla selektywnego pobudzenia cytotoksycznych komórek CD8+ jest przeprowadzana głównie przez szpikowe komórki dendrytyczne.

W związku z tym, w konkretnej postaci realizacji, rekombinowaną adenylocyklazę stosowaną do wytwarzania wektora białkowego jest genetycznie modyfikowana adenylocyklaza zawierająca jedną lub więcej cząsteczek chemicznie sprzężonych za pomocą wiązania disiarczkowego z genetycznie wprowadzoną resztą lub resztami cysteiny umiejscowioną lub umiejscowionymi wewnątrz domeny katalitycznej wymienionej adenylocyklazy.

Rzeczywiście, wiele cząsteczek można sprzęgać chemicznie z adenylocyklazą za pomocą wiązania disiarczkowego, z różnymi resztami cysteiny umiejscowionymi w różnych miejscach permisywnych wewnątrz domeny katalitycznej.

Twórcy wynalazku wykazali także, że CTL swoista dla antygenu połączonego z wektorem, może być wzbudzona in vivo po pojedynczym wstrzyknięciu dożylnym rekombinowanej toksyny, zwłaszcza bez potrzeby zapewniania heterologicznego adiuwanta. Te wyniki ukazane w części doświadczalnej, a w szczególności specyficzne nakierowanie epitopu na szpikowe komórki dendrytyczne, umożliwiają nowe strategie immunizacyjne z pominięciem wymogu zastosowania adiuwanta oraz pomocy komórek T CD4+.

Zatem zgodnie z wynalazkiem opisano także zastosowanie toksyny adenylocyklazowej Bordetella rekombinowanej cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania, a zwłaszcza peptydem, do wytwarzania kompozycji spreparowanej do podawania dożylnego i umożliwiającej odpowiedź immunologiczną komórek T CD8+ in vivo, przy czym wymieniona kompozycja jest pozbawiona heterologicznego adiuwanta. Wynalazek obejmuje także tę kompozycję jako taką.

Wynalazek w szczególności dotyczy także immunogennej kompozycji spreparowanej do podawania, zwłaszcza podawania dożylnego, gospodarzowi będącemu zwierzęciem lub człowiekiem, przy czym obejmuje ona rekombinowaną adenylocyklazę Bordetella, które zawiera antygen wprowadzony do domeny katalitycznej.

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji farmaceutycznej do podawania człowiekowi lub zwierzęciu, spreparowanej do nakierowywania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania specyficznie na komórki wykazujące ekspresję CD11b, przy czym wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest sprzężona z adenylocyklazą z gatunku Bordetella.

Cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest wybrana z grupy obejmującej: peptydy, glikopeptydy, lipopeptydy, polisacharydy, oligosacharydy, kwasy nukleinowe, lipidy i środki chemiczne.

W korzystnej postaci realizacji cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania jest antygen.

PL 208 864 B1

Zgodnie z wynalazkiem opisano też kompozycję farmaceutyczną lub immunogenną obejmującą konstrukt kwasu nukleinowego kodujący rekombinowaną adenylocyklazę gatunku Bordetella, obejmującą rekombinowaną adenylocyklazę gatunku Bordetella sprzężoną z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania.

W konkretnej postaci realizacji adenylocyklaza pochodzi z toksyny Bordetella pertussis.

W innych konkretnych postaciach realizacji, toksyna adenylocyklazowa jest toksyn ą genetycznie modyfikowaną. W jednej korzystnej postaci realizacji adenylocyklaza jest nietoksyczną adenylocyklazą, zwłaszcza adenylocyklazą pozbawioną toksyczności (detoksyfikowaną).

W jednej korzystnej postaci realizacji, genetycznie modyfikowana adenylocyklaza jest zdolna do przemieszczania danej cząsteczki do cytozolu komórek wykazujących ekspresję CD11b.

W szczególności, wymieniona genetycznie modyfikowana adenylocyklaza jest adenylocyklazą Bordetella pozbawioną całości lub części swej katalitycznej domeny N-terminalnej, a konkretniej adenylocyklazą Bordetella pertussis pozbawioną reszt 1-373.

Korzystnie, genetycznie modyfikowana adenylocyklaza obejmuje jedną lub więcej reszt cysteiny wprowadzonych w obrębie domeny katalitycznej w miejscach permisywnych. Taka genetycznie modyfikowana adenylocyklaza może być sprzężona z jedną lub więcej cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania, za pomocą wiązania(wiązań) disiarczkowego(disiarczkowych) przy wprowadzonej reszcie(resztach) cysteiny.

W zalecanej postaci realizacji, cząsteczkę, a zwłaszcza antygen, można wprowadzać w miejscach permisywnych wybranych z grupy obejmującej reszty 137-138, reszty 224-225, reszty 228-229, reszty 235-236 i reszty 317-318 adenylocyklazy Bordetella pertussis, albo cząsteczkę poddaje się fuzji z N-terminalną częścią adenylocyklazy Bordetella pozbawioną całości lub części jej N-terminalnej domeny katalitycznej, a konkretniej z N-terminalną częścią adenylocyklazy Bordetella pertussis pozbawioną reszt 1-373.

W konkretnej postaci realizacji, cz ą steczka to antygen, którym jest wewną trzkomórkowy antygen komórki bakteryjnej, antygen komórki nowotworowy, antygen wirusowy, antygen grzybowy lub antygen komórki pasożyta.

W korzystnych postaciach realizacji, czą steczką bę d ą c ą przedmiotem zainteresowania jest antygen wybrany z grupy obejmującej epitop poliowirusa, antygen wirusa HIV, antygen wirusa grypy, epitop wirusa zapalenia opon i splotów naczyniowych, antygen nowotworowy.

W innej postaci realizacji, genetycznie modyfikowana toksyna jest zdolna do dostarczania cz ą steczki będącej przedmiotem zainteresowania specyficznie na powierzchnię komórek wykazujących ekspresję CD11b lub na szlak endocytozy.

Twórcy wynalazku wykazali, że podawanie dożylne in vivo kompozycji immunogennej gospodarzowi będącemu zwierzęciem lub człowiekiem, jak określono w niniejszym wynalazku, bez adiuwanta(adiuwantów) jest wystarczające do skutecznego pobudzenia odpowiedzi immunologicznej w wymienionym gospodarzu będącym zwierzęciem lub człowiekiem.

W szczególno ś ci, kompozycje immunogenne wedł ug wynalazku są zdolne do indukowania lub stymulowania in vivo lub in vitro, komórkowej odpowiedzi immunologicznej obejmującej specyficznie komórki dendrytyczne.

W konsekwencji, w specyficznej postaci realizacji, kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna jest korzystnie pozbawiona pobudzających adiuwantów powszechnie stosowanych w dziedzinie, takich jak wodorotlenek glinu.

W jednej konkretnej postaci realizacji, czą steczką bę d ą c ą przedmiotem zainteresowania jest lek, korzystnie lek przeciwzapalny.

Ponadto, wynalazek dotyczy także zastosowania kompozycji immunogennej jak określono powyżej, do wytwarzania szczepionki lub kompozycji immunoterapeutycznej, do podawania gospodarzowi będącemu zwierzęciem lub człowiekiem.

Gdy stosuje się tu określenie „kompozycja immunoterapeutyczna odnosi się ono do kompozycji, która prowadzi do odpowiedzi immunologicznej i która jest związana z traktowaniem leczniczym, takim jak leczenie przeciwrakowe, przeciw infekcjom wirusowym, infekcjom pasożytniczym lub infekcjom bakteryjnym.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób immunizacji gospodarza będącego zwierzęciem lub człowiekiem obejmujący następujące etapy:

a) dostarczenia kompozycji immunogennej jak określono powyżej;

PL 208 864 B1

b) podania wymienionej kompozycji immunogennej, dogodnie drogą dożylną, wymienionemu gospodarzowi, aby pobudzić odpowiedź immunologiczną.

Wynalazek odnosi się wreszcie do wektora białkowego do dostarczania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania specyficznie na komórki wykazujące ekspresję CD11b, przy czym wymieniony wektor obejmuje adenylocyklazę z gatunku Bordetella, a korzystniej rekombinowaną lub modyfikowaną adenylocyklazę gatunku Bordetella sprzężoną z wymienioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania.

Wektor białkowy zdolny jest do nakierowania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania na komórki wykazujące ekspresję CD11b poprzez swoiste wiązanie adenylocyklazy Bordetella z CD11b/CD18 α_πβ₂, który występuje na powierzchni specyficznych komórek. W jednej konkretnej postaci realizacji, wektor jest także zdolny do dostarczenia cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania specyficznie do cytozolu komórek wykazujących ekspresję CD11b.

W konkretnych postaciach realizacji, wektor białkowy zdolny jest do nakierowania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania na komórki dendrytyczne, szczególnie szpikowe komórki dendrytyczne lub neutrofile.

Cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest chemicznie lub genetycznie sprzężona z adenylocyklazą, zwłaszcza rekombinowaną toksyną adenylocyklazową. Metody sprzęgania cząsteczki z polipeptydem są dobrze znane w dziedzinie. Przykładowo, twórcy wynalazku wykazali, że pochodna biotyny, biotyno-HDPD może być selektywnie sprzężona z unikalną resztą cysteiny genetycznie wprowadzoną do domeny katalitycznej. Peptydy syntetyczne były podobnie sprzęgane z toksyną adenylocyklazową zawierającą cysteinę albo z genetycznie modyfikowaną adenylocyklazą pozbawioną natywnej reszty cysteiny, lecz zawierającej unikalną, genetycznie wprowadzoną resztę cysteiny.

W innej konkretnej postaci realizacji, cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania sprzężoną z adenylocyklazą jest epitop chemicznie sprzężony z genetycznie modyfikowaną adenylocyklazą pozbawioną natywnej reszty cysteiny, lecz zawierającą genetycznie wprowadzoną resztę lub reszty cysteiny w miejscu permisywnym wewnątrz domeny katalitycznej.

W konkretnej postaci realizacji, wektor białkowy obejmuje genetycznie modyfikowaną adenylocyklazę. W jednej dogodnej postaci realizacji, adenylocyklazą jest rekombinowana nietoksyczna adenylocyklaza z Bordetella pertussis.

Wynalazek dotyczy zwłaszcza wektora białkowego, który składa się z rekombinowanej adenylocyklazy Bordetella pozbawionej całości lub części N-terminalnej domeny katalitycznej, a zwłaszcza Bordetella pertussis pozbawionej reszt 1-373.

Innym zalecanym wektorem białkowym według wynalazku jest genetycznie modyfikowana adenylocyklaza Bordetella pozbawiona natywnej reszty cysteiny, lecz zawiera genetycznie wprowadzoną resztę lub reszty cysteiny w miejscu permisywnym wewnątrz domeny katalitycznej.

Korzystnie, w jednej konkretnej postaci realizacji wynalazku, dostarczanym lekiem jest lek przeciwzapalny, który po sprzężeniu z toksyną adenylocyklazową, jest nakierowywany na powierzchnię lub cytozol komórek biorących udział w odpowiedzi zapalnej, takich jak neutrofile.

Następujące przykłady zilustrują niniejszy wynalazek bez ograniczania zakresu zastrzeganego wynalazku. Konkretniej, w części A, ukazane są dane doświadczalne, które ujawniają swoiste wiązanie toksyny adenylocyklazowej z receptorem CD11b/CD18, a w szczególności swoiste wiązanie toksyny adenylocyklazowej z komórkami wykazującymi ekspresję CD11b in vitro. W części B, wyniki doświadczeń ukazują możliwość nakierowania genetycznie sprzężonej cząsteczki, konkretniej antygenu, in vitro oraz in vivo, specyficznie na cytozol komórek wykazujących ekspresję CD11b, a w szczególności na szpikowe komórki dendrytyczne. Ponadto, wyniki ukazują, że w nakierowywaniu pośredniczy receptor CD11b, oraz że obserwuje się pobudzenie CTL po układowej immunizacji przy braku adiuwanta. W części C, wykazuje się, że można przeprowadzić swoiste sprzężenie peptydów epitopu za pomocą wiązania disiarczkowego na fragmentach CyaA, z dostarczeniem nowych wektorów białkowych. W części D, wykazuje się, że tylko C-terminalna część CyaA jest konieczna i wystarczająca do interakcji z receptorami CD11b.

Wreszcie, wyniki pokazują, że inaczej niż w wielu innych odpowiedziach CTL, jak tych wzbudzanych przeciw antygenowi pobudzającemu krzyżowo, pomoc komórek T CD4+ nie była niezbędna do wzbudzenia odpowiedzi CTL.

Objaśnienia figur

Fig. 1: Możliwe do nasycenia wiązanie CyaA koreluje z ekspresją CD11b

PL 208 864 B1 a: Wiązanie CyaA z powierzchnią makrofagów (J774A.1), komórek B (LB27.4) oraz komórek T (EL4) przeprowadzono w temperaturze 37°C przez 20 minut. CyaA związany z powierzchnią wykrywano z użyciem biotynylowanego przeciwciała poliklonalnego anty-CyaA, wywoływano streptoawidyno-PE i wykrywano przez cytometrię przepływową na żywych komórkach, jak opisano w sekcji materiałów i metod. Wiązanie wyraża się jako ΔMFI = (średnia wartość intensywności fluorescencji komórek inkubowanych z CyaA)-(średnia intensywność fluorescencji komórek bez CyaA).

b, c,d,e: Ekspresja powierzchniowa integryn β2 na komórkach J774A.1, LB27.4 i EL4. Ekspresję CD11a (b), CD11b (c), CD11c (d) i CD18 (e) określano przez cytometrię przepływową przy użyciu swoistych mAb sprzężonych z PE. Ekspresja integryn jest wyrażona jako ΔMFI = (średnia wartość intensywności fluorescencji komórek barwionych swoistym mAb)-(średnia intensywność fluorescencji komórek barwionych izotypowym kontrolnym mAb).

Fig. 2: Wiązanie CyaA z mysimi liniami komórkowymi jest blokowane przez anty-CD11b mAb.

Komórki wstępnie inkubowano w temperaturze 4°C przez 15 minut z 20 μg/ml swoistych mAb lub bez, a potem inkubowano w temperaturze 4°C przez 20 minut z 5 μg/ml CyaA oraz z 10 μg/ml swoistych mAb jeśli występowały podczas wstępnej inkubacji. CyaA związane z powierzchnią wykrywano biotynylowanymi przeciwciałami poliklonalnymi anty-CyaA, wywoływano streptoawidyno-PE i wykrywano przez cytometrię przepływową na żywych komórkach, jak opisano w sekcji materiałów i metod.

a,b: Wpływ anty-CD11b mAb M1/70 na wiązanie różnych dawek CyaA. Komórki dendrytyczne FSDC (a) lub makrofagi J774A.1 (b) wstępnie inkubowano z samą pożywką (O) lub z mAb anty-CD11b M1/70 (•), a następnie inkubowano z CyaA z mAb anty-CD11b M1/70 lub bez. Określono Bmax przez dopasowanie punktów doświadczalnych uzyskanych z doświadczeń przeprowadzonych bez mAb do ΔMFI = Bmax*[CyaA]/(Kd+[CyaA]). Wiązanie CyaA jest naniesione na wykres jako % wykresu Bmax w stosunku do stężenia CyaA.

c, d: Wpływ swoistych mAb na ustaloną dawkę wiązania CyaA. Komórki FSDC (c) lub J774A.1 (d) wstępnie inkubowano ze swoistymi mAb (anty-CD11a, 2D7, anty-CD11b, M1/70 i 5C6, anty-CD11c, HL3, anty-CD18, C17/16, kontrolne A95-1) lub bez, i inkubowano z CyaA przy ustalonym stężeniu wynoszącym 5 μg/ml. Wartości ΔMFI uzyskane dla wiązania CyaA na komórkach traktowanych swoistymi mAb, znormalizowano jako wartości ΔMFI uzyskane dla wiązania CyaA bez mAb.

Fig. 3: Wiązanie CyaA z ludzkimi neutrofilami jest blokowane przez mAb anty-CD11b i antyCD18.

a,b,c: Histogramy fluorescencji świeżo oczyszczonych neutrofili inkubowano wstępnie z samą pożywką (a), mAb anty-CD11b 44 (b) lub dopasowanym do izotypu kontrolnym mysim mAb (c), a następnie inkubowano z biotynylowanym CyaA (szare) lub bez (puste) i wywoływano streptoawidyno-PE. Liczbę komórek nanosi się na wykres przeciwko logarytmowi fluorescencji PE.

d: Wpływ swoistych mAb na wiązanie CyaA z neutrofilami (anty-CD11b, 44, M1/70, anty-Cd18, TS/18, kontrolna mysia IgG2a, kontrolna szczurza IgG2b, A95-1). Świeżo oczyszczone neutrofile inkubowano wstępnie ze swoistymi mAb lub bez i inkubowano z CyaA. Wartości ΔMFI uzyskane dla wiązania CyaA na komórkach traktowanych swoistymi mAb, znormalizowano jako % wartości ΔMFI uzyskane dla wiązania CyaA bez mAb.

Fig. 4: Wzrost wewnątrzkomórkowego cAMP i śmierć komórkowa za pośrednictwem CyaA są swoiście blokowane przez mAb anty-CD11b w komórkach J774A.1.

a: Wpływ na swoiste mAb na wewnątrzkomórkową akumulację cAMP. Komórki J774A.1 inkubowano wstępnie w temperaturze 4°C przez 1 godzinę z 10 μg/ml swoistych mAb (anty-CD11b, M1/70, anty-CD18, C17/16) lub bez, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 20 minut z 5 μg/ml i z 10 μg/ml mAb jeśli są obecne podczas wstępnej inkubacji. Zawartości wewnątrzkomórkowego cAMP określono zgodnie z opisem w sekcji materiałów i metod.

b: Wpływ swoistych mAb na śmierć komórkową za pośrednictwem CyaA. Komórki J774A/1 inkubowano wstępnie w temperaturze 4°C przez 1 godzinę z samą pożywką lub z 10 μg/ml swoistych mAb (anty-CD11a, 2D7, anty-CD11b, M1/70, anty-CD11c, HL3, anty-CD18, C71/16, kontrola, 2.4G2). Następnie inkubowano je w temperaturze 37°C przez 2 godziny z 0,5 μg/ml CyaA i z 10 μg/ml swoistych mAb jeśli były obecne podczas wstępnej inkubacji. Lizę komórkową określono przez uwalnianie LDH, przy użyciu testu Cytotox 96™.

Fig. 5: Komórki CHO wiążą CyaA i stają się wrażliwe na CyaA po transfekcji CD11b, lecz nie CD11c.

PL 208 864 B1 a,b: Wiązanie CyaA na powierzchni transfektantów CHO. Komórki CHO transfekowane ludzkim CD11b/CD18 (·), ludzkim CD11c/CD18 (O) lub fałszywie transfekowane (♦) inkubowano z różnymi dawkami CyaA przez 20 minut, w temperaturze 37°C (a) lub 4°C (b). CyaA związane z powierzchnią wykrywano biotynylowanym poliklonalnym przeciwciałem anty-CyaA, wywoływano streptoawidyno-PE i wykrywano przez cytometrię przepływową na żywych komórkach, jak opisano w sekcji materiałów i metod. Wiązanie jest wyrażone jako ΔMFI = (średnia wartość intensywności fluorescencji komórek inkubowanych z CyaA)-(średnia intensywność fluorescencji komórek bez CyaA).

c: Wewnątrzkomórkowa akumulacja cAMP w transfektantach CHO. Komórki CHO transfekowane ludzkim CD11b/CD18 (·), ludzkim CD11c/CD18 (O) lub fałszywie transfekowane (♦) inkubowano z CyaA lub bez, przez 20 minut, w temperaturze 37°C. Zawartości wewnątrzkomórkowego cAMP określano zgodnie z opisem w sekcji materiałów i metod.

d: Liza komórkowa w transfektantach CHO. Komórki CHO transfekowane ludzkim CD11b/CD18, ludzkim CD11c/CD18 lub fałszywie transfekowane inkubowano z 5 μg/ml CyaA przez godziny w temperaturze 37°C. Lizę komórkową określono przez uwalnianie LDH przy użyciu testu Cytotox 96™.

Fig. 6: Dożylna immunizacja CyaAOVA wzbudza odpowiedzi CTL anty-OVA w komórkach B, w sposób niezależny od CD4 i CD4.

Myszy C57BL/6 WT + / + (a), CD-/- (b), CD40-/- (c) lub IgM-/- (d) immunizowano dożylnie 50 μg CyaAOVA, genetycznie pozbawionej toksyczności postaci CyaA niosącej epitop SIINFEKL ograniczony H-2K^b z OVA (·, O) lub CyaAE5, kontrolną pozbawioną toksyczności toksyną bez epitopu OVA (♦, Δ). Siedem dni później zwierzęta uśmiercono i splenocyty ponownie stymulowano in vitro przez dni 10 μg/ml syntetycznego peptydu pOVA w obecności napromieniowanych splenocytów C57BL/6. Aktywność CTL szacowano w 4-godzinnym teście uwalniania chromu⁵¹ przeciwko komórkom EL4 H-2K^b uprzednio poddanym pulsom pOVA w ilości 10 μg/ml (·, ♦) lub nie poddanym (O, Δ).

Fig. 7: Identyfikacja komórek prezentujących antygen śledziony biorących udział w prezentacji CyaAOVA in vitro lub in situ, po immunizacji dożylnej.

Frakcja o niskiej gęstości splenocytów prezentuje CyaAOVA swoistym komórkom T hybrydomy anty-OVA CD8 + (a, b):

Test in vitro (a): Frakcje o niskiej (LDF, •) i wysokiej (HDF, ♦) gęstości albo niefrakcjonowane całkowite splenocyty od myszy nie immunizowanych (TSC, , □) hodowano z B3Z, hybrydomą komórek T CD8+ swoistą dla peptydu pOVA, w kontekście H-2K^b. Po 18 godzinach wspólnej hodowli w obecności rekombinowanej pozbawionej toksyczności CyaA niosącej peptyd OVA (CyaAOVA, ·, ♦, ) lub kontrolnego peptydu (CyaALCMV, □) o różnych stężeniach, mierzono uwalnianie w supernatantach IL-2, w teście proliferacji CTLL. Wyniki wyrażono w Δcpm i naniesiono przeciwko stężeniu CyaA podczas próby Δcpm = [cpm+CyaA]-[cpm-CyaA]).

Test ex vivo (b): Komórki śledziony otrzymano od myszy uprzednio immunizowanych iv (6-12 godzin) 50 μg CyaAOVA (·, ♦, ) lub CyaALCMV (O) i podzielono na frakcje LDF i HDF. Różne liczby komórek odzyskanych od TSC (), LDF (·, O) lub HDF(^) albo niefrakcjonowanych splenocytów () bezpośrednio umieszczono w hodowli z B3Z bez dodania rekombinowanej CyaA. Uwalnianie IL-2 szacowano po 18 godzinach hodowli, jak opisywano przedtem. Wyniki, wyrażone w cpm, naniesiono przeciwko liczbie APC obecnych w każdej studzience.

Komórki dendrytyczne (CD11c⁺) są skuteczniejszymi APC dla CyaAOVA niż komórki CD11b^wysoki+CD11c^- lub komórki B (CD45R⁺) (c, d):

Test in vitro (c): Komórki CD11c+ odsortowane z LDF, CD11b^wysokl+CD11c^- (O) oraz komórki CD45R+ () odsortowane z TSC, umieszczono w hodowli z B3Z na 18 godzin w obecności różnych stężeń CyaAOVA. IL-2 szacowano jak powyżej.

Test ex vivo (d): Komórki odsortowane przez cytometrię przepływową z myszy C57BL/6 uprzednio (6-12 godzin) immunizowanych 50 μg CyaAOVA, użyto jako APC. Komórki CD11c+ (·), CD11b^wysoki+CD11c^- (O), CD45R+ () odsortowane ze splenocytów o niskiej gęstości, umieszczono bezpośrednio w hodowli na 18 godzin z B3Z w różnych ilościach komórek na studzienkę, bez dodatku CyaAOVA. IL-2 szacowano jak powyżej.

Podzbiór szpikowych komórek dendrytycznych CD8a^- stanowi skuteczniejsze APC dla CyaA niż podzbiór limfoidalnych komórek dendrytycznych CD8a+ (e, f):

Komórki o niskiej gęstości CD11c+ od myszy naiwnych (e) lub myszy uprzednio (6-12 godzin) immunizowanych iv 50 μg CyaAOVA (f) podzielono na frakcje szpikowych komórek dendrytycznych CD11c+ CD8a-, ·) oraz limfoidalnych komórek dendrytycznych CD11c+ CD8a+, O) przez cytometrię

PL 208 864 B1 przepływową i użyto jako APC w testach in vitro (e) i ex vivo (f) stymulacji B3Z. IL-2 szacowano jak powyżej.

Genetyczna utrata komórek B nie zaburza prezentacji CyaAOVA przez splenocyty (g, h):

TSC (, □), LDF (·, O) lub HDF (♦, Δ) od myszy C57BL/6 WT (, ·, ♦) lub myszy z deficytem komórek B (□, O, Δ), użyto jako APC w teście in vitro (g, , □) lub w teście ex vivo (h, , ·, ♦, □, O, Δ) do stymulacji B3Z jak w a. Myszy były albo naiwne (g) albo uprzednio (1,5 godziny) immunizowane iv 50 μg CyaAOVA (h). IL-2 szacowano jak powyżej.

Fig. 8: Prezentacja CyaAOVA przez komórki dendrytyczne wymaga transporterów TAP in vitro oraz in vivo po immunizacji dożylnej.

Test in vitro (a): TSC (♦, Δ) lub CD11c+ (·, O) odsortowane od myszy kontrolnych C57BL/6 Tap+/+ (♦, ·) lub TAP-/- (Δ, O) hodowano z B3Z w obecności różnych dawek CyaAOVA lub bez. IL-2 szacowano jak opisano w fig. 6a. Wyniki wyrażono w cpm naniesionych przeciwko stężeniu antygenu.

Test ex vivo (b): Komórki TSC (♦, Δ) lub CD11c+ (·, O) odsortowane od myszy kontrolnych C57BL/6 Tap+/+ (♦, ·) lub TAP-/- (Δ, O) uprzednio immunizowanych iv 50 μg CyaAOVA hodowano z B3Z przez 18 godzin. IL-2 szacowano jak opisano w fig. 6a. Wyniki wyrażono w cpm naniesionych przeciwko liczbie wspólnie hodowanych komórek.

Fig. 9: Rola integryny a_Me₂ (CD11b) w wiązaniu CyaAOVA z komórkami.

Wiązanie CyaAOVA-biotyna z TSC jest blokowane przez anty-CD11b (a): Zawiesiny TSC inkubowano w temperaturze 4°C z 10 μg/ml mAb anty-CD11b M1/70 lub izotypowym kontrolnym mAb lub bez. Następnie, CyaAOVA-biotyna w ilości 2 μg/ml (lewe panele) lub różnymi stężeniami (prawe panele) dodano do komórek na 30 minut w temperaturze 4°C. Po przemyciu, CyaAOVA-biotyna wywołano streptoawidyno-PE przez 30 minut (Strep-PE). Potem, po przemyciu, komórki ponownie zawieszono w PBS zawierającym jodek propidyny. Wielkość (FSC) żywych komórek bramkowanych przez ekskluzję jodkiem propidyny naniesiono przeciwko fluorescencji Strep-PE. Procent leukocytów pozytywnych pod względem CyaAOVA-biotyna naniesiono przeciwko stężeniu CyaAOVA-biotyna podczas barwienia.

Wiązanie CyaAOVA-biotyna z komórkami o niskiej gęstości koreluje z ekspresją CD11b (b): LDF potrójnie zabarwiono pod względem CD11c, CD8a i CyaAOVAbiotyna (lub pożywka) albo, w oddzielnych doświadczeniach z CD11c, CD8a i CD11b (lub kontrolnym mAb). Po przemyciu, komórki barwiono przez 30 minut Strep-PE, aby ujawnić CyaAOVA-biotyna, anty-CD11c-FITC i anty-CD8a-APC. Bramki wykonano na komórkach limfoidalnych DC (CD11c+CD8a+), szpikowych DC (CD11c+CD8a^-), T CD8+ (CD11c^-CD8a+) i innych komórkach (CD11c^-CD8a^-). Dla każdej bramki, barwienie CyaAOVA-biotyna lub barwienie CD11b nanosi się przeciwko liczbie komórek w oddzielnych histogramach. Lewe histogramy: zawiesiny LDF inkubowano z 0 (histogramy wypełnione szarym), 2,5 (wąskie, otwarte histogramy) lub 10 μg/ml (grube, otwarte histogramy) CyaAOVA-biotyna przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Prawe histogramy: izotypowy kontrolny-PE (histogram wypełniony na szaro), CD11b-PE (grube, otwarte histogramy).

Fig. 10: Rola integryny a_Me₂ (CD11b) w prezentacji CyaAOVA przez MHC I

Test prezentacji antygenu in vitro z TSC (a, b): Takie same doświadczenia jak w a, b przeprowadzono z TSC od naiwnych myszy C57BL/6 jako APC. Stymulację B3Z oszacowano przez uwalnianie IL-2 w supernatantach wspólnej hodowli mierzonego w teście proliferacji CTLL. Wyniki naniesiono w cpm przeciwko stężeniu CyaAOVA lub pOVA.

Test prezentacji antygenu ex vivo z TSC lub frakcjami CD11b+ i CD11b- (c, d): Myszy C57BL/6 immunizowano dożylnie 50 μg CyaAOVA (c) lub 10 μg pOVA (d). Komórki CD11b+ (·) i CD11b- (O) oddzielono przez cytometrię przepływową od TSC (Δ) i umieszczono w hodowli przy różnej liczbie komórek na studzienkę, z B3Z. Po 18 godzinach wspólnej hodowli, stymulację B3Z oszacowano przez uwalnianie IL-2. Wyniki, wyrażone w cpm, nanosi się przeciwko liczbom APC od immunizowanych zwierząt, obecnych w każdej studzience.

Fig. 11: Omówienie metodyki chemicznego sprzęgania epitopów z rekombinowanymi CyaA przez wiązanie disiarczkowe.

Fig. 12: Wykres wektora dla chemicznego sprzęgania epitopów CTL.

Fig. 13: Wykres ukazujący uwalnianie IL-2 przez B3Z mierzone w teście proliferacji CTLL.

3.10⁵ komórek od myszy C57BL/6 hodowano wspólnie przez 18 godzin z 105 komórek B3Z, w obecności różnych stężeń cyklazy. Uwalnianie IL2 przez B3Z mierzono w teście proliferacji CTLL.

Fig. 14: Wykres ukazujący aktywność cytotoksyczną mierzoną na komórkach docelowych EL4 znakowanych ⁵¹Cr poddanych pulsom (A) 50 μM peptydu OVA lub nie (B).

PL 208 864 B1

Myszom C57BL/6 wstrzyknięto iv 50 μg różnych CyaA. Siedem dni później komórki śledziony stymulowano in vitro peptydem OVA. Aktywność cytotoksyczną mierzono na komórkach docelowych znakowanych ⁵¹Cr.

Fig. 14 ukazuje zdolność in vivo wektorów białkowych według wynalazku do indukowania odpowiedzi CTL specyficznych wobec OVA.

Fig. 15: Inhibicja wiązania CyaA z CD11b przez fragmenty CyaA-E5 i CyaA

Komórki CHO transfekowane z CD11b/Cd18 inkubowano wstępnie na lodzie przez 1 godzinę z różnymi stężeniami CyaA-E5 (czarny trójkąt), CyaA 1-383 (czarny kwadrat) lub CyaA-373-1706 (czarny romb), a następnie inkubowano na lodzie przez 30 minut z 5 μg/ml biotynylowanej CyaA-E5. Cyklazę związaną z powierzchnią ujawniono przy użyciu streptoawidyno-PE i analizowano przez cytometrię przepływową na żywych komórkach. Wyniki wyrażono jako średnią intensywność fluorescencji (A), procent komórek pozytywnych (B) i procent inhibicji (C).

Fig. 16: Schematyczne przedstawienie wektora ekspresji pTRAC-373-1706.

Duże strzałki reprezentują otwarte ramki odczytu β-laktamazy (b1a), termoczułego represora cl⁸⁵⁷ faga lambda (λ,^⁸⁵⁷), genu cyaC i skróconego genu 'cyaA (strzałki są skierowane w kierunku translacji odpowiadających genów). Początek ColEI (Ori), promotor Pr (XPr) i pewne istotne miejsca restrykcyjne są także zaznaczone. Region wewnątrzgenowy między genami cyaC i skróconym 'cyaA jest wyszczególniony w niższej części. Pokazuje ona nowe przedłużenie końca C cyaC (w dół w stosunku do Arg182 dzikiego typu CyaC), kodon przestankowy (pokreślony), inicjator Met i pierwsze kodony CyaA373-1706 (w górę w stosunku do Ser373 dzikiego typu CyaA).

P r z y k ł a d y

A. Toksyna cyklazy adenylanowej Bordetella ulega interakcji specyficznie z integryną α_Μβ₂ (CD11b/CD18)

A.1 Materiały i metody

A.1.1 Rekombinowane toksyny i przeciwciała

Protokół wytwarzania CyaA został już opisany gdzie indziej [Karimova i inni, 1998]. Toksyny CyaA wytworzono w szczepie BLR E. coli posiadającym plazmid ekspresyjny, pCACT3, który niesie gen strukturalny cyaA dla CyaA pod kontrolą promotora lacUV5 i gen pomocniczy cyaC konieczny dla aktywacji protoksyny. Po rozpuszczeniu w 8M moczniku, Hepes-Na 20 mM, pH 7,5, CyaA oczyszczono do ponad 95% jednorodności (jak oceniono przez analizę na żelu SDS, nie ukazane) za pomocą kolejno DEAE-sefarozy i fenylosefarozy. Skonstruowano rekombinowaną pozbawioną toksyczności toksynę CyaA, CACTE5-Cys-Ova, posiadającą unikalną cysteinę wprowadzoną do wewnątrz genetycznie inaktywowanej domeny katalitycznej przez insercję odpowiedniego oligonukleotydu o podwójnej nici między miejsca BsiwI i KpnI pCACT-Ova-E5 [Guermonprez i inni, 2000]. W otrzymanym białku CACTE5-Cys-Ova, sekwencja aminokwasowa ASCGSIINFEKLGT jest wprowadzona między reszty 224 i 225 CyaA. Rekombinowana toksyna uległa ekspresji i została oczyszczona zgodnie z wcześniejszym opisem. Oczyszczone białko oznakowano na jego unikalnej Cys wysoce specyficznym odczynnikiem sulfhydrylowym N-(6-(biotynoamido)heksylo))-3'-(2'-pirydylotio)propionoamidem (biotyno-HPDP, PIERCE) zgodnie z instrukcjami producenta. Biotynylowaną CyaA ponownie oczyszczono na DEAE-sefarozie, aby usunąć nieprzereagowany odczynnik Biotyno-HPDP. Stężenia toksyny określano spektrofotometrycznie z adsorpcji przy 280 nm przy użyciu współczynnika ekstynkcji molekularnej wynoszącego 142 M^-1 x cm^-1 (miejsca wiązania) lub stosując system testowania białka Biorad (akumulacja cAMP i badania śmierci komórkowej).

Oczyszczone mAb swoiste dla mysiego CD11a (2D7, Rat IgG2, κ), mysiego i ludzkiego CD11b (M1/70, Rat IgG2b, κ), mysiego CD11c (HL3, Hamster 1, λ), mysiego CD18 (C71/16, Rat IgG2a, κ), kontroli (A95-1 lub anty-CD16/32, 2.4G2, Rat IgG2b, κ) pochodziły od Pharmingen (San Diego, USA). Supernatanty hybrydomy anty-ludzkiego CD11b (44, Mouse IgG2a, κ) i anty-ludzkiego CD18 (TS/18, Mouse IgG1, κ) były uprzejmym darem i były użyte w rozcieńczeniu 1/2 w doświadczeniach blokowania. Supernatanty anty-mysiego CD11b (5C6, Rat IgG2b, κ) były uprzejmym darem od G.Milon (Pasteur Institute, Paryż) i były użyte w końcowym rozcieńczeniu 1/2 w próbach inhibicji wiązania. Przeciwciała poliklonalne anty-CyaA otrzymano od królika immunizowanego podskórnie oczyszczoną CyaA. Przeciwciała wytrącono z surowicy odpornościowej siarczanem amonu (33%). Po wirowaniu, grudki białek ponownie zawieszono w 20 mM Hepes-Na, 150 mM NaCl, Ph 7,5 (bufor C) i intensywnie dializowano przeciwko temu samemu buforowi. Następnie przeciwciała poddano biotynylowaniu przez inkubację z estrem N-hydroksysukcynoimidowym biotynoamidokapronianu (SIGMA, rozpuszczony w dimetylosulfotlenku) przez 130 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodano 100 mM etanoPL 208 864 B1 loaminę, pH 9,0 i po 30 minutach dodatkowej inkubacji, mieszaninę intensywnie dializowano w temperaturze 4°C przeciwko buforowi C. Biotynylowane przeciwciała przechowywano w temperaturze -20°C.

A.1.2 Komórki i pożywki hodowlane

EL4, J774A.1, LB27.4, THP-1 otrzymano od American Type Culture Collection (ATCC) i hodowano w RPMI 1640 uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminą, z 5x10^-5 M 2-merkaptoetanolu lub bez (kompletna pożywka). FSDC [Girolomoni i inni, 1995] hodowano w kompletnej pożywce. Komórki CHO transfekowane dla ludzkich CD11b/CD18 lub CD11c/CD18 albo transfekowane tylko wektorem, otrzymano od D. Golenbock (Boston, USA) i hodowano w obecności neomycyny, zgodnie z wcześniejszym opisem [Rieu i inni, 1992].

A.1.3 Testy wiązania CyaA

Wszystkie testy wiązania przeprowadzono w DMEM 4,5 mg/ml glukozy (Life Technologies) bez surowicy, w 96-studzienkowych płytkach do hodowli (Costar). 2x10⁵ komórek/studzienkę inkubowano przez 20 minut (w temperaturze 4°C lub 37°C w zależności od doświadczenia) w końcowej objętości 200 gl. W niektórych doświadczeniach komórki wstępnie inkubowano przez 20 minut w temperaturze 4°C w obecności blokujących mAb w końcowej objętości 100 gl. Roztwór toksyny dodawano do studzienek przy ciągłej obecności mAb w całkowitej objętości 200 gl w temperaturze 4°C. Następnie płytki wirowano z prędkością 1500 obrotów na minutę przez 5 minut i supernatanty usuwano. Komórki inkubowano w temperaturze 4°C przez 25 minut z biotynylowanymi króliczymi przeciwciałami poliklonalnymi anty-CyaA (1/400 w DMEM, 50 gl/studzienkę) w obecności kontrolnej (nieodpornościowa lub przedodpornościowa) surowicy królika jako czynnika nasycającego (1/50).

Po wirowaniu i usunięciu supernatantu komórki barwiono streptoawidynofikoerytryną (PE) (Pharmingen) w rozcieńczeniu 1/300 (50 gl/studzienkę). Po przemyciu komórki analizowano przez cytometrię przepływową na urządzeniu FACStar (Becton-Dickinson, Mountain View, USA) w obecności 5 gg/ml jodku propidyny. Wykonano bramkowanie aby wykluczyć agregaty komórkowe i martwe komórki przez ekskluzję jodkiem propidyny. Punkty doświadczalne dopasowano do hiperbolowego modelu ΔMFI=Bmax*[CyaA]/(K_d+[CyaA]), przy Bmax = % maksymalnego wiązania, przy użyciu programu Prism.

A.1.4 Test cAMP

Akumulację cAMP mierzono testem immunologicznym współzawodnictwa z antygenem [Karimova i inni, 1998, w którym pożywka inkubacyjna składała się z DMEM bez surowicy, lecz zawierającej 4,5 mg/ml glukozy i 20 jednostek/ml heksokinazy. Dodano heksokinazę, która katalizuje zależną od ATP fosforylację glukozy, usuwając ze środowiska zewnątrz komórkowego wszelkie ślady ATP, zapobiegając w ten sposób zewnątrzkomórkowej syntezie cAMP. Zatem, ilość zmierzonego cAMP jest reprezentatywna dla akumulacji ściśle wewnątrzkomórkowego cAMP.

5x10⁵ komórek inkubowano wstępnie w 96-studzienkowych płytkach, w ilości 100 gl/studzienkę, z 10 gg/ml swoistych mAb lub bez, w temperaturze 4°C przez 1 godzinę, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 20 minut z 0,05, 0,5 lub 5 g/ml CyaA oraz z 10 gg/ml swoistych mAb jeśli były obecne podczas wstępnej inkubacji. Dla wpływu CyaA zależnego od dawki, komórki inkubowano bezpośrednio z toksyną przez 20 minut, w temperaturze 37°C. Po wprowadzeniu toksyny, komórki wirowano z prędkością 2500 obrotów na minutę przez 5 minut. Próbki poddano lizie z użyciem 100 gl 0,1 NHCl, gotowano przez 5 minut w temperaturze 120°C i zobojętniono 100 gl 0,125 M Tris, 0,2 M NaCl. Płytki do mikromianowania powlekano koniugatami cAMP-BSA rozcieńczonymi 1/4000 w 0,1 MNa2CO3, pH 9,5. Przemyto je dwukrotnie 0,1% PBS-Tween. Próbki i standard cAMP (Sigma) dodano bezpośrednio do płytek powleczonych koniugatami cAMP-BSA i seryjnie rozcieńczono mieszaniną 1/1 0,1 N HCl i 0,125 M Tris-0,2 M NaCl. Dodano królicze przeciwciało anty-cAMP rozcieńczone 1/2500 w 2% PBS-BSA i inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Płytki przemyto pięć razy 0,1% PBS-Tween. Dodano anty-królicze przeciwciała sprzężone z peroksydazą chrzanową (Amersham), rozcieńczone 1/2500 w 2% PBS-BSA, inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę i wywołano przy użyciu klasycznej reakcji peroksydazy. Punkty doświadczalne krzywej standardowej dopasowano do modelu esowatego, wykorzystując program Prism.

A.1.5 Test toksyczności

Śmierć komórkową oceniano zgodnie z wcześniejszym opisem [Khelef i inni, 1993; Khelef i inni, 1995]. W skrócie, 10⁵ komórek inkubowano przez 24 godziny w 96-studzienkowej płytce w kompletnej pożywce i przemyto raz pożywką pozbawioną surowicy. Wszystkie inkubacje komórek przeprowadzono dodatkowo w pożywce pozbawionej surowicy. Wpływ odpowiedzi na dawkę oceniano przez bezpo18

PL 208 864 B1 średnie nałożenie różnych stężeń CyaA na komórki CHO w temperaturze 37°C przez 4 godziny. Dla inhibicji cytotoksyczności, komórki wstępnie inkubowano w temperaturze 4°C przez 1 godzinę, z 10 μg/ml swoistych mAb lub bez, a potem inkubowano w temperaturze 37°C z 0,5 μg/ml CyaA przez 2 godziny dla komórek J774A.1A.1 albo z 5 μg/ml przez 4 godziny dla komórek CHO oraz z 10 μg/ml swoistych mAb jeśli były obecne podczas inkubacji wstępnej. Lizę komórkową oceniano przy użyciu testu Cytotx 96™ (Promega), który ocenia ilościowo ilość dehydrogenazy mleczanowej (LDH) uwalnianej do pożywki przez umierające komórki.

A.2 Wyniki

A. 2.1 Możliwe do wysycenia wiązanie CyaA koreluje z obecnością CD11b na powierzchni komórek docelowych

Aby scharakteryzować swoistość komórkową CyaA w kierunku populacji leukocytów, wybieramy trzy reprezentatywne mysie linie komórkowe wykazujące ekspresję różnych kombinacji integryn β2: J774A.1, makrofaga nowotworowego; EL4, grasiczaka komórek T oraz LB27.4, chłoniaka komórek B. Po 20 minutach inkubacji z CyaA w temperaturze 37°C, wiązanie CyaA z powierzchnią komórkową tych komórek monitorowano przez cytometrię przepływową przy użyciu biotynylowanych przeciwciał anty-CyaA i streptoawidyno-PE. W tych warunkach, zaobserwowalno skuteczne, zależne od dawki i możliwe do wysycenia wiązanie CyaA na linii komórkowej J774A.1. Powinowactwo CyaA do komórek J774A.1 było wysokie, ponieważ widoczne Kd wynosiły odpowiednio, 9,2±4,5 nM i 3,2±1,9 nM. Obserwowano słabe wiązanie CyaA z komórkami EL4 i LB27.4, ale nie było ono możliwe do wysycenia przy testowanych stężeniach.

Aby określić, czy wiązanie CyaA z liniami komórkowymi J774A.1 było skorelowane z ekspresją jednego z członków rodziny integryn β2, przeprowadzono analizę fenotypową tych komórek przez cytometrię przepływową, z użyciem przeciwciał monoklonalnych (mAb) swoistych dla trzech łańcuchów α dobrze scharakteryzowanych integryn β2 (CD11a, CD11b i CD11c) i dla wspólnego łańcucha β (CD18) (fig. 1b,c,d,e). Komórki J774A.1 wykazywały ekspresję w większości CD11b i CD18, lecz były także pozytywne pod względem CD11a. Komórki EL4 i komórki LB27.4 wykazywały ekspresję głównie CD11a i CD18. Podsumowując, dane te ukazują, że skuteczne i możliwe do wysycenia wiązanie CyaA z J774A.1 było skorelowane z obecnością integryny CD11b/CD18.

A.2.2 Możliwe do wysycenia wiązanie CyaA jest specyficznie blokowane przez mAb antyCD11b

Następnie badano, czy CD11b/CD18 mogły być bezpośrednio związane z wiązaniem CyaA z komórkami wykazującymi ekspresję tej integryny. Przeprowadziliśmy analizę ilościową inhibicji uzyskanej z mAb anty-CD11b M1/70 przez obliczenie procentu wartości średniej fluorescencji przy braku mAb, przy ustalonych lub zmiennych stężeniach CyaA (fig. 2). Inhibicja wiązania CyaA uzyskana z mAb anty-CD11b M1/70 była prawie całkowita przy większości testowanych stężeń CyaA (fig. 2a,b). Ta inhibicja była swoista, ponieważ mAb anty-CD11a, CD11c, CD18 lub kontrolne nie hamowało wiązania CyaA. Drugie mAb anty-CD11b (klon 5c6) także hamowało wiązanie CyaA (fig. 2c.d). Podobne wyniki uzyskano z FSDC, linią komórkową niedojrzałych komórek dendrytycznych wykazujących ekspresję CD11b (fig. 2a,c) oraz linią komórkową makrofagów J774A.1 (fig. 2b,d).

Aby zbadać, czy CyaA mogła podobnie oddziaływać z ludzkim CD11b, przeprowadzono badania wiązania CyaA na ludzkich neutrofilach, których wysoka ekspresja CD11b jest dobrze ustalona. Ponieważ uzyskano wysoką fluorescencję tła w następstwie inkubacji ludzkich komórek szpikowych z króliczymi przeciwciałami anty-CyaA (dane nie ukazane), przeprowadzono kolejną próbę wiązania. Pozbawioną toksyczności postać CyaA specyficznie biotynylowano na unikalnych resztach cysteinowych, genetycznie wprowadzonych do jej domeny katalitycznej. Przy użyciu tego systemu można było wykryć wiązanie CyaA z neutrofilami (fig. 3). Wstępna inkubacja neutrofili z mAb anty-CD11b 44 lub M1/70 prowadziła do odpowiednio, pełnej lub częściowej inhibicji wiązania CyaA (fig. 3a i b). Odwrotnie jak w przypadku C71/16, anty-mysiego CD18 mAb, które nie blokowało wiązania CyaA z komórkami myszy, wstępna inkubacja z ludzkim mAb anty-CD18 TS/18 prowadziła do pełnej inhibicji wiązania CyaA z ludzkimi neutrofilami (fig. 3b). Podobne wyniki uzyskano z linią komórkową ludzkich monocytowych THP-1 (dane nie ukazane).

Podsumowując, okazało się, że wiązanie CyaA z powierzchnią trzech linii komórek szpikowych zarówno pochodzenia mysiego jak i ludzkiego (J774A.1, FSDC, THP-1), jak również świeżo oczyszczonych ludzkich neutrofili, miało miejsce głównie za pośrednictwem integryny CD11b/CD18.

A.2.3 Wzrost cAMP za pośrednictwem CyaA oraz toksyczność są specyficznie blokowane przez mAb anty-CD11b

PL 208 864 B1

Aby ocenić istotność fizjologiczną wiązania CyaA zależnego od CD11b/CD18, badano wpływ blokujących mAb na cytotoksyczność CyaA. Najpierw zmierzono ilość cAMP wytworzonego w komórkach J774A.1 zetkniętych z CyaA w obecności różnych mAb. Jak ukazano w fig. 4a, zwiększenie zawartości wewnątrzkomórkowego cAMP indukowane przez CyaA było całkowicie zniesione, gdy komórki wstępnie inkubowano z anty-CD11b mAb M1/70. Anty-mysie CD18 mAb C17/16, które nie blokowało wiązania CyaA z komórką (fig. 2) nie miało wpływu na wewnątrzkomórkową zawartość cAMP w komórkach traktowanych CyaA. Tak więc, dane te mocno sugerują, że zwiększenie wewnątrzkomórkowego cAMP indukowane przez CyaA jest zależne od interakcji toksyny z CD11b. Aby dodatkowo przeanalizować wymagania tej cząsteczki wobec toksyczności CyaA, oceniano wpływ mAb swoistych wobec różnych łańcuchów rodziny integryn β2, na śmierć komórkową za pośrednictwem CyaA. Fig. 4b ukazuje, że anty-CD11b J774A.1 dramatycznie redukowało śmierć komórkową indukowaną przez CyaA (88% inhibicji). Śmierć komórkowa indukowana przez CyaA była niezakłócona, gdy J774A.1 wstępnie inkubowano z mAb, które nie blokują wiązania toksyny z komórkami (mAb antyCD11a, CD11c lub CD18 albo kontrolne).

Podsumowując, dane te wskazują, że wiązanie CyaA z udziałem CD11b jest ściśle wymagane dla toksyczności za pośrednictwem CyaA w komórkach J774A.1.

A.2.4 Transfekcja komórek CHO CD11b/CD18 nadaje wrażliwość wobec CyaA

Aby potwierdzić rolę CD11b w wiązaniu CyaA, wykorzystano komórki CHO transfekowane ludzkimi integrynami CD11b/CD18 lub CD11c/CD18 lub transfekowane fałszywie (sam wektor). Jak ukazano w fig. 5a, CyaA mogła się wiązać, w temperaturze 37°C, z tymi liniami komórkowymi. Jednakże wiązanie CyaA było skuteczne i możliwe do wysycenia w komórkach CHO wykazujących ekspresję CD11b/CD18, ale nie w komórkach CD11c/CD18 lub komórkach transfekowanych fałszywie. Powinowactwo CyaA do komórek transfekowanych CD11b/CD18 było w zakresie nM (Kd = 0,7 ± 0,09 nM). W temperaturze 4°C skuteczność wiązania CyaA była mniejsza w porównaniu z wiązaniem w temperaturze 37°C (fig. 5b). W tej temperaturze różnice między komórkami transfekowanymi CD11b/CD18 i dwoma innymi liniami komórkowymi były bardziej wymowne.

Ponieważ stwierdzono, że CD11b był konieczny dla toksyczności za pośrednictwem CyaA w J774A.1, określono potem, czy ekspresja CD11b była wystarczająca do nadania transfekowanym komórkom CHO fenotypu wrażliwego na CyaA. W zgodzie z innymi doniesieniami [Gordon i inni, 1988], CyaA indukowała istotną ilość wewnątrzkomórkowego cAMP w komórkach CHO transfekowanych CD11b/CD18 lub w kontrolnych, fałszywie transfekowanych komórkach, lecz tylko w wysokich stężeniach toksyny (5 μg/ml, fig. 5c). Przeciwnie, CyaA zwiększała wewnątrzkomórkowy poziom cAMP w komórkach CHO transfekowanych CD11b/CD18 nawet przy najniższych badanych stężeniach (0,05 μg/ml). Ponadto, produkcja cAMP w odpowiedzi na 5 μg/ml CyaA była 4 do 5 razy wyższa w komórkach transfekowanych CD11b/CD18 w porównaniu z komórkami transfekowanymi CD11c/CD18 lub fałszywie transfekowanymi.

Oceniano także rolę CD11b/CD18 w śmierci komórkowej za pośrednictwem CyaA. Jak ukazano w fig. 5d, ponad 50% CHO transfekowanych CD11b/CD18 było zabitych po 4 godzinach inkubacji z 5 μg/ml CyaA, podczas gdy komórki CD11c/CD18 lub fałszywie transfekowane nie uległy wpływowi tego traktowania.

W sumie, wyniki te wyraźnie pokazały więc, że ekspresja ludzkiej integryny CD11b/CD18 jest wystarczająca aby stworzyć w komórkach CHO receptor o wysokim powinowactwie do CyaA.

A.3 Omówienie: Receptor dla CyaA

Inaczej niż inne toksyny, CyaA była uznawana przez długi czas za niezależną od wiązania z jakimkolwiek receptorem. Było to oparte na obserwacjach, że i) CyaA może zatruć in vitro wiele różnych modelowych linii komórkowych rozmaitego pochodzenia [Ladant i inni, 1999] ii) CyaA wiąże się z komórkami Jurkat i erytrocytami owcy w sposób niewysycający [Gray i inni, 1999]. W rzeczywistości, te obserwacje stanowiły, że niespecyficzna adsorpcja CyaA do błon lipidowych prowadzi do pewnych translokacji domeny katalitycznej do cytozolu. Jednakże nie uzasadniały istnienia swoistego receptora. Wykazano tu w tym badaniu na szpikowych liniach komórkowych, że wiązanie i właściwości toksyczne CyaA są zależne od jej interakcji z integryną CD11b/CD18. Skuteczne i wysycalne wiązanie koreluje z ekspresją CD11b i jest w pełni i specyficznie blokowane przez mAb anty-CD11b. Ponadto, ekspresja CD11b/CD18 w komórkach CHO dramatycznie wzmacnia wiązanie CyaA, powodując zwiększoną wrażliwość na zatrucie tą toksyną. Wyniki uzyskane przez twórców niniejszego wynalazku są pierwszym dowodem potwierdzającym interakcję CyaA z cząsteczką powierzchniowo komórkową ulegającą ekspresji specyficznie na leukocytach. Prawie całkowita blokada wiązania CYaA przez mAb

PL 208 864 B1 anty-CD11b sugeruje, że CD11b jest głównym receptorem dla CyaA w testowanych liniach komórkowych. Brak skutecznego wiązania z transfektantami CD11c/CD18 czy komórkami wykazującymi ekspresję CD11a/CD18, takimi jak EL4 lub LB27.4 sugeruje, że CD11b/CD18 jest jedyną integryną z rodziny β2 biorącą udział w wiązaniu CyaA z komórkami docelowymi.

Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, zaobserwowano tu wykrywalne wiązanie CyaA ze wszystkimi testowanymi liniami komórkowymi. Ponadto CyaA w wysokich stężeniach wywołuje mały, lecz wykrywalny wzrost cAMP w fałszywie transfekowanych komórkach CHO, co nie jest związane ze śmiercią komórkową. Tak więc, w wysokich stężeniach CyaA może wiązać i przemieszczać się do bardzo wielu różnych linii komórkowych, ale skuteczne i wysycalne wiązanie, translokacja i zabicie jest cechą szczególną komórek wykazujących ekspresję CD11b.

Wiązanie CyaA z członkiem rodziny integryn β2 przypomina zachowanie innych toksyn RTX, które jak ostatnio stwierdzono, wchodzą w interakcje z tymi cząsteczkami [Lally i inni, 1997; Li i inni, 1999; Ambagala i inni, 1999; Jeyaseelan i inni, 2000]. HlyA E. coli, która wykazuje silną homologię z CyaA tworzy kationowe kanaliki w błonie plazmatycznej. HlyA wykazuje specyficzność wobec leukocytów, lecz tylko w niskim stężeniu [Welch i inni, 1991]. W tej względnej specyficzności jak się okazało, pośredniczy jej interakcja z integryną CD11a/CD18 [Lally i inni, 1997]. Podobnie, leukotoksyna A. actinomycetemcomitans i P.heamoliytica (odpowiednio LtxA i LktA), które są mniej ogólnymi toksynami RTX swoistymi odpowiednio, dla ludzkich i bydlęcych leukocytów, ulegają także interakcji z CD11a/CD18 [Lally i inni, 1997; Li i inni, 1999; Ambagala i inni, 1999; Jeyaseelan i inni, 2000]. Oprócz jej silnej homologii z HlyA, CyaA rozpoznaje inną integrynę β2 (CD11b/CD18), której rozmieszczenie na komórce jest inne. Rzeczywiście, CD11b ulega ekspresji głównie na makrofagach, neutrofilach i komórkach dendrytycznych, lecz nie na większości komórek T i B, podczas gdy CD11a ulega ekspresji na wszystkich leukocytach łącznie z limfocytami T i B.

To swoiste nakierowywanie CyaA na komórki wykazujące ekspresję CD11b jest wykorzystane w niniejszym wynalazku do specyficznego namierzania tego szczególnego podzbioru komórek. Pozbawione toksyczności mutanty CyaA, które pozostają inwazyjne, mogłyby być użyte do dostarczania farmakologicznie aktywnych cząsteczek do komórek pozytywnych pod względem CD11b bez zauważalnego wpływu na inne rodzaje komórek.

B. Ukierunkowane dostarczanie antygenu do cytozolu szpikowych komórek dendrytycznych i selektywne wzbudzanie CTL

B.1. Materiały i metody

B.1.1 Rekombinowane toksyny cyklazy adenylanowej i peptydy

Syntetyczny peptyd pOVA (SIINFEKL) pochodził z NEOSYSTEM i został rozcieńczony w PBS do ilości 1 mg/ml.

B.1.2 Immunizacja i test wykrywania cytotoksycznych komórek T

Użyto samice C57BL/6 (H-2^b) od Iffa Credo (L'arbresle, Francja) między 6 i 8 tygodni życia. Rasa TAP-/- (Van Kaer i inni, 1992), CD4-/- (Killeen i inni, 1993), CD40-/- (Kawabe i inni, 1994) i z deficytem komórek B μMT (Kitamura i inni, 1991) hodowana na bazie C57BL/6, pochodziła z hodowli CDTA (CNRS, Orleans, Francja) i była hodowana w hodowli Institut Pasteur. Zwierzęta immunizowano dożylnie Ag w PBS. Siedem dni po wstrzyknięciu, zwierzęta uśmiercono i usunięto śledzionę. Pojedyncze zawiesiny komórkowe splenocytów (2,5x10⁷ komórek) ponownie stymulowano w 10 ml CM (patrz poniżej) z napromieniowanymi komórkami śledziony (2,5x10⁷) przez 5 dni w obecności 1 μg/ml pOVA. Próbę toksyczności przeprowadzono dokładnie tak jak opisano wcześniej (Fayolle inni, 1999).

B.1.3 Linie komórkowe

B3Z (Karttunen i inni, 1992), hybrydoma komórek T CD8+ swoista wobec peptydu OVA 257264 (SIINFEKL) w kontekście H-2K^b była szczególnym darem od Dr N. Shastri (University of California, Berkeley, USA).

B.1.4 Testy prezentacji antygenu

Wszystkie testy prezentacji antygenu przeprowadzono przez wspólną hodowlę APC z B3Z w 96-studzienkowych płytkach do mikromianowania (0,2 ml końcowej objętości) w RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęcej, 100 jednostkami/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, mM L-glutaminy i 5x10^-5 M 2-merkaptoetanolu (kompletna pożywka, CM). Stymulację komórek B3Z (10⁵ komórek/studzienkę) monitorowano przez uwalnianie IL-2 w supernatantach 18-24-godzinnych hodowli w obecności APC. IL-2 mierzono w teście CTLL jak opisano wcześniej (Guermonprez i inni, 1999). W niektórych doświadczeniach (patrz objaśnienia rycin) stymulację B3Z szacowano przy użyciu

PL 208 864 B1 testu reportera lacZ NF-AT. Aktywność lacZ w lizatach komórkowych szacowano za pomocą substratu CPRG zgodnie z wcześniejszym opisem (Karttunen i inni, 1992). Przeprowadzono dwa testy prezentacji antygenu: i) test in vitro: APC pochodzące od niestymulowanych myszy hodowano wspólnie (10⁵ komórek/studzienkę) z B3Z w obecności Ag, w różnych stężeniach. W niektórych doświadczeniach, APC inkubowano wstępnie z mAb w ilości 10 μg/ml przez 40 minut w temperaturze 4°C lub bez, następnie do komórek dodawano Ag w końcowej objętości wynoszącej 100 μ!, przy stałej obecności mAb. Po 4 godzinnym impulsie, APC przemyto dwukrotnie i umieszczono we wspólnej hodowli z B3Z. Oczyszczonymi użytymi mAb było mAb przeciwko CD11b (M1/70 szczurza IgG2b, κ) lub izotypowa kontrola i pochodziły z Pharmingen (San Diego, USA). ii) Test ex vivo: APC pochodziły od myszy uprzednio immunizowanych dożylnie różnymi Ag, i zostały umieszczone w hodowli z B3Z w końcowej objętości 0,2 ml z różnymi ilościami APC na studzienkę.

B.1.5 Komórki prezentujące antygen i sortowanie

Przygotowano frakcje wszystkich komórek śledziony (TSC), niskiej gęstości (LDF) i wysokiej gęstości (HDF), zgodnie z protokołem Steimann modyfikowanym przez Vremec i innych (Vremec i inni, 1992). W skrócie, śledziony trawiono kolagenazą przez 40 minut w temperaturze 37°C, a następnie porozrywano i przygotowano w stałej obecności 5 mM EDTA. Komórki wirowano na gęstym roztworze BSA. Supernatant i grudki komórek zebrano oddzielnie i określono frakcje o niskiej i wysokiej gęstości. Barwienie CD11c przeprowadzono w temperaturze 4°C w PBS uzupełnionej 5% płodową surowicą cielęcą i 2 mM EDTA (PBS-FACS) z chomiczym mAb HL3 sprzężonym z fikoerytryną (PE), izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) lub biotynylowanym, a następnie wywołano streptawidynoPE. Barwienie CD8a przeprowadzono z użyciem mAb 53-7.6 sprzężonym z PE. Barwienie CD11b przeprowadzono z użyciem mAb B220 sprzężonym z PE lub biotynylowanym i wywołano streptoawidyno-PE. Wszystkie mAb pochodziły od Pharmingen. Po dwóch przemyciach, komórki posortowano przy użyciu FACStar (Beckton Dickinson, Mountain View, USA). Komórki aseptycznie odzyskano w CM. Czystość posortowanych komórek sprawdzano na równej ilości sortowanych komórek analizowanych w urządzeniu FACScan (Beckton Dickinson, Mountain View, USA). Czystość sortowanych komórek wynosiła zwykle 80-98%. W innych doświadczeniach (jakie wymieniono w objaśnieniach rycin) komórki CD11c+ były sortowane bezpośrednio z produktów trawienia śledziony kolagenazą, przy użyciu CD11c Micro Beads oraz technologii Magnetic Sorting zgodnie z protokołem dostawcy (MACS, MiltenyiBiotec, Bergish Gladbach, Niemcy). Czystość sortowanych komórek wynosiła około 80% według tej techniki.

B.2 Wyniki

B.2.1 Wzbudzenie CTL niezależnie od CD4 i CD40 po immunizacji układowej CyaAOVA przy braku adiuwanta

Jako doświadczalnego modelowego epitopu użyto epitop SIINFEKL, z owoalbuminy kurzej, ograniczonej H-2K^b. Wprowadzono ją genetycznie do domeny katalitycznej pozbawionego toksyczności, ciągle inwazyjnego mutanta CyaA. Myszy C57BL/6 (H-2^b) immunizowano iv, jednorazowo, 50 μg rekombinowanej toksyny lub kontrolnego fizjologicznego roztworu soli. Siedem dni po immunizacji, wykryto aktywność CTL swoistą dla pOVA, w splenocytach myszy C57BL/6 immunizowanych CyaAOVA, lecz nie u myszy, którym wstrzyknięto sól lub kontrolną CyaA (fig. 6a). Podobne wyniki otrzymano dla myszy z brakiem CD4 lub CD40, co pokazało, że inaczej niż wiele innych odpowiedzi CTL (jak te wzbudzone przeciwko krzyżowo-pobudzającemu Ag (Bennett i inni, 1997; 1998 ; Schoenberger i inni, 1998, Ridge i inni, 1998) pomoc komórek T CD4+ nie była niezbędna do pobudzenia odpowiedzi CTL przez CyaAOVA (fig. 6b, c). Ponadto, komórki B nie były konieczne, ponieważ odpowiedzi CTL otrzymano także u myszy z brakiem komórek B (IgM-/-, fig. 6d). Zanieczyszczenie LPS, prawdopodobnie działające jak adiuwant, nie ma udziału w stymulacji odpowiedzi CTL na CyaAOVA, ponieważ myszy C57BL10ScSc i wykazujące słabą odpowiedź wobec LPS C57BL10ScCr przedstawiały podobną odpowiedź CTL swoistą dla OVA, po wstrzyknięciu CyaAOVA (nie ukazane).

B.2.2 Nakierowywanie in vitro oraz in vivo prezentacji CyaAOVA na komórki wykazujące ekspresję CD11b

Aby lepiej zrozumieć immunogenność CyaAOVA zamierzano określić APC związane z prezentacją komórkom CD8+. Wykorzystując wydzielanie IL-2 jako odczyt dla stymulacji, pokazano tu, że B3Z, ograniczona H-2K^b hybrydoma komórki T anty-OVA CD8+, jest stymulowana in vitro przez masę spelnocytów w obecności CyaAOVA, ale nie CyaALCMV (fig. 7a). Zamierzano przeanalizować zdolność APC trzech dobrze określonych APC śledziony: DC (CD11c+), komórek B (CD45R+) i makrofagów/granulocytów (CD11b^wysoki+CD11c-). Z powodu niskiego procentu CD11c+ w całkowitych spleno22

PL 208 864 B1 cytach (<1%), przeprowadzono frakcjonowanie pod względem gęstości i odsortowano CD11c+ od populacji o niskiej gęstości (4-10%), bogatej w DC, za pomocą cytometrii przepływowej. Frakcja o wysokiej gęstości zawierała jedynie śladowe ilości komórek CD11c+. Przeciwnie, rozmieszczenie komórek CD45R+ i CD11b^wysoki+CD11c- (złożonych z granulocytów/makrofagów) w obu frakcjach, pozwoliło na sortowanie całej populacji pod względem tych markerów. Jak ukazano w fig. 7c, CyaAOVA była prezentowana najskuteczniej przez DC, mniej skutecznie przez komórki CD11b^wysoki+CD11c- i B. Koreluje to z niemal wyłącznym rozmieszczeniem zdolności prezentowania antygenu we frakcji splenocytów o niskiej gęstości (fig. 7a). Absolutnie przeciwnie, zarówno frakcje o wysokiej jak i niskiej gęstości splenocytów były zdolne do stymulacji B3Z w odpowiedzi na pOVA (nie ukazane).

Aby wykryć kompleksy K^b-OVA utworzone in vivo po immunizacji, APC wytworzone z myszy immunizowanych iv 8-15 godzin wcześniej 50 gg CyaAOVA, hodowano wspólnie z B3Z in vitro bez dodawania Ag (test ex vivo). Jak dla testów in vitro, APC odpowiedzialne za prezentację CyaAOVA były obecne wyłącznie we frakcji splenocytów o niskiej gęstości, wzbogaconej w DC (fig. 7b). Swoistość testu sprawdzano z APC od myszy immunizowanych CyaALCMV, które nie stymulowały B3Z (fig. 7b). Aby dodatkowo scharakteryzować APC niskiej gęstości zaangażowane w prezentację CyaAOVA, przeprowadzono sortowanie komórek: wyniki ukazane w fig. 7d pokazują, że frakcja DC (CD11c+ była skuteczniejszą APC. Makrofagi/granulocyty (CD11b^wysoki+CD11c-) oraz komórki B (CD45R+) wysortowane z tej samej frakcji bardzo nieskutecznie stymulowały B3Z.

Aby dodatkowo scharakteryzować APC zaangażowane w CyaAOVA, przeprowadzono subfrakejonowanie komórek śledziony o niskiej gęstości CD11c+DC w podzbiorze szpikowym CD11c+CD8a- oraz limfoidalnym podzbiorze CD11c+CD8a+. Testy in vitro oraz ex vivo (fig. 7e i f odpowiednio) pokazały, że zdolność do prezentowania antygenu dla CyaAOVA była zachowana przez podzbiór szpikowy, który także wykazywał ekspresję CD11b+, inaczej niż podzbiór limfoidalny wykazujący niski poziom ekspresji tej integryny (Pulendran i inni, 1997; Vremec i inni, 1997). Niezdolność podzbioru limfoidalnego CD11c+CD8a+ do prezentacji CyaAOVA była specyficzna dla CyaAOVA, ponieważ CD11c+CD8a+ oraz CD11c+CD8a- prezentowały równie dobrze syntetyczny peptyd pOVA, wobec B3Z.

Testy in vitro oraz ex vivo przeprowadzone ze splenocytami od myszy kontrolnych (C57BL/6) lub z niedoborem komórek B (IgM-/-) potwierdziły słaby udział komórek B w prezentacji CyaAOVA in vitro oraz in vivo (fig. 7g i h). Zgodnie z tymi wynikami, odpowiedzi CTL indukowane przez CyaAOVA nie ulegały istotnemu wpływowi u myszy z niedoborem komórek B, w porównaniu z myszami kontrolnymi (fig. 5d).

B.2.3 Prezentacja CyaAOVA z restrykcją MHCI przez komórki dendrytyczne zależy od dostarczania do cytozolu rekombinowanej toksyny, zarówno in vitro jak i in vivo

Aby określić, czy prezentacja CyaAOVA zależy od dostarczania do cytozolu epitopu OVA, czy obciążenia zewnątrzkomórkowego, przeprowadzono testy prezentacji Ag z całkowitymi splenocytami albo CD11c+ DC z TAP-/- lub kontrolnych TAP+/+ komórek śledziony oczyszczonych ze zwierząt niestymulowanych (in vitro fig. 8a) lub od zwierząt immunizowanych iv CyaAOVA (ex vivo, fig. 8b). Wyniki pokazują, że prezentacja CyaAOVA przez komórki dendrytyczne jest w pełni zależna od TAP, in vitro lub in vivo. Ponieważ prezentacja pOVA jest zjawiskiem niezależnym od TAP, sprawdzono funkcjonalność TAP-/- DC wysortowanych z myszy immunizowanych CyaAOVA, przez stymulację B3Z tymi komórkami obciążonym in vitro peptydem pOVA (nie ukazane). Wyniki te pokazują, że prezentacja in vivo CyaAOVA zależy od jej dostarczenia do cytozolu.

B.2.4 Interakcja CyaA z CD11b jest konieczna do wiązania z komórką i dostarczenia wprowadzonego antygenu na szlak cytozolowy dla prezentacji antygenu przez MHC I

Pokazano tu w części A, że wysycalne i skuteczne wiązanie CyaA WT z komórkami CD11b+ może być blokowane przez mAb antyCD11b. Ponadto, transfekcja CD11b specyficznie przyczyniała się do wysycalnego wiązania i wrażliwości wobec CyaA WT wobec z drugiej strony komórek CD11bopornych wobec CyaA WT. Blokada wiązania komórkowego przez mAb anty-CD11b hamowała późniejsze dostarczenie wewnątrzkomórkowe domeny katalitycznej cyklazy adenylanowej, podniesienie cAMP i śmierć komórkową indukowaną przez CyaA WT. Ponieważ wyniki te otrzymano na liniach komórkowych, pozostaje określić, czy CyaA wiąże się ze splenocytami. Przeprowadzono tu test cytometrii przepływowej aby wykryć ustalenie biotynylowanej, pozbawionej toksyczności formy CyaA niosącej peptyd OVA (CyaAOVAbiotyna) w stosunku do zawiesiny całkowitych splenocytów, za pomocą streptawidyny sprzężonej z fikoerytryną. Przy użyciu tego testu zaobserwowano, że CyaAOVA wiąże się z podzbiorem leukocytów w zawiesinie całkowitych splenocytów (5-7%). Wstępna inkubacja z mAb

PL 208 864 B1 antyCD11b M1/70, lecz nie kontrolnym mAb, zniosła to wiązanie (fig. 9a). Ponadto, istnieje korelacja między ekspresją CD11b i wiązaniem CyaAOVA z komórkami o niskiej gęstości: CyaAOVA wiąże skutecznie CD11c+CD8a-, które wykazują ekspresję na wysokim poziomie CD11b, mniej skutecznie CD11c+CD8a+, które wykazują ekspresję na niskim poziomie CD11b i bardzo słabo z komórkami T CD11c-CD8a+, które nie wykazują ekspresji CD11b (fig. 9b). Można zauważyć, że CyaAOVA wiąże się skutecznie z małym procentem komórek T CD11c-CD8a- w korelacji z obecnością CD11 b^wysokl+ do tej populacji CD11c-. Tak więc, wiązanie CyaAOVAbiotyna zachodzi za pośrednictwem CD11b (jak dla CyaA WT) i przewiduje zdolność danego typu komórek do prezentacji CyaAOVA.

Wykazano, in vitro, że mAb antyCD11b M1/70 blokuje prezentację CyaAOVA przez komórki TSC wobec B3Z (fig. 10a). Blokada ta jest swoista, ponieważ i) kontrolne mAb lub mAb swoiste wobec innych członków rodziny integryn β2 (anty-CD11a, CD11c) miały mały lub w ogóle nie miały wpływu (fig. 10a i dane nie pokazane), ii) anty-CD11b ani żadne z tych mAb nie miało wpływu na prezentację pOVA (fig. 10b i dane nie pokazane). Potwierdza to, że CD11b jest głównym receptorem dla CyaAOVA, co najmniej w śledzionie, oraz że interakcja CyaAOVA-CD11b jest niezbędna dla prezentacji wprowadzonego epitopu.

Wreszcie, aby upewnić się co do roli komórek wykazujących ekspresję CD11b w prezentacji CyaAOVA, przeprowadzono doświadczenia sortowania na całości komórek śledziony od myszy immunizowanych CyaAOVA lub pOVA. Całkowite splenocyty posortowano na frakcje CD11b+ i CD11b-. Podczas gdy dwie subpopulacje stymulowały B3Z po dożylnej immuniacji pOVA (fig. 10d) tylko subpopulacja CD11b+ stymulowała B3Z po dożylnej immunizacji CyaAOVA (fig. 10c).

Podsumowując wyniki te wyraźnie stwierdzają, że prezentacja peptydu OVA z CyaAOVA jest zależna od wiązania z komórką, a więc od interakcji z CD11b.

B.3 Omówienie

W niniejszym badaniu, przy użyciu pozbawionej toksyczności cyklazy adenylanowej Bordetella pertussis jako wektora dostarczania epitopu, ustalono strategię immunizacji, która wzbudza odpowiedzi CTL po pojedynczym wstrzyknięciu, omijając potrzebę konieczności adiuwanta. Zidentyfikowano mechanizmy, które przyczyniają się do wysokiej skuteczności pozbawionej toksyczności CyaA jako wektora:

B.3.1 CyaA namierza szpikowe komórki dendrytyczne poprzez jej interakcję z integryną CD11b

Test prezentacji antygenu swoistej hybrydomie komórki T CD8+ przy użyciu APC obciążonej in vitro lub in vivo (odpowiednio test in vitro oraz ex vivo) pokazał, że najskuteczniejszymi APC dla CyaAOVA są DC CD11c+CD11b^wysoki+. Rzeczywiście, cała zdolność prezentacji Ag wobec CyaAOVA należała do frakcji o niskiej gęstości splenocytów, które zachowują DC. Sortowanie komórkowe określonych rodzajów komórek ujawniło, że komórki DC CD11c+CD11b^wysoki+ są znacznie skuteczniejsze niż komórki CD11c-CD11b^wysoki+ jeśli chodzi o prezentację CyaAOVA. Mniejszy udział obserwowany dla komórek B (CD45R+) potwierdzono przez skuteczną prezentację CyaAOVA (in vitro oraz ex vivo) oraz odpowiedzi CTL u myszy z deficytem komórek B.

B.3.2 CyaA dostarcza Ag do szlaku cytozolowego dla prezentacji przez MHC klasy I in vivo

Ukazano tutaj zależność prezentacji CyaAOVA wobec całkowitych splenocytów in vitro. Co uderzające, ukazano także, że ma także miejsce prezentacja CyaAOVA in vivo, zgodnie ze szlakiem zależnym od TAP. Prowadzi to do wniosku, że skuteczność prezentacji CyaAOVA in vivo wynikała z dostarczenia do cytozolu, a nie z ostatecznego rozkładu zewnątrz komórkowego.

B.3.3 Wzbudzenie CTL omija pomoc komórek T CD4 + i jest niezależne od sygnału CD40

Dojrzewanie z fazy niedojrzałej ku fazie dojrzałej charakteryzuje się i) spadkiem zdolności do wychwytu Ag, ii) wzrostem zdolności do pobudzania komórek T, iii) migracją od miejsc próbkowania Ag (strefa brzeżna w śledzionie) ku obszarowi komórek T (pola okołotętniczkowe w śledzionie) gdzie maksymalizują prawdopodobieństwo napotkania komórek T swoistych wobec Ag (De smedt i inni, 1996). Oprócz prezentacji Ag przez DC, faza dojrzewania jak się obecnie przypuszcza, jest wstępnie wymagana dla pobudzenia komórek T. Badania in vitro naświetliły rolę komórek T CD4+ w wysyłaniu sygnałów dojrzewania DC, szczególnie przez interakcję CD40L-CD40 (Bell i inni, 1999). W przypadku wzbudzenia komórek T CD8+ po krzyżowym pobudzeniu komórkowego Ag, komórki T CD4+ udzielają swej pomocy komórkom T CD8+ poprzez mechanizm zależny od CD40 (Schuurhuis i inni, 2000; Bennett i inni, 1998; Schoenberger i inni, 1998; Ridge i inni, 1998). Ponieważ CyaAOVA pobudza CTL w sposób niezależny od CD4 i CD40, należy przypuszczać, że pozbawiona toksyczności CyaA mogłaby być wyposażona w naturalną zdolność działania jako adiuwant.

PL 208 864 B1

B. 3.4 Wnioski

Niniejsze badanie stanowi pierwszą charakterystykę, zgodnie z wiedzą twórców wynalazku, wektora białkowego szczepionki, który nadaje się zarówno do namierzania wyspecjalizowanych APC, dostarczania cytozolowego Ag zaopatrzonego w wektor oraz wzbudzania CTL bez adiuwanta. Ponadto, naświetlono mechanizm namierzania komórek przez pokazanie, że prezentacja Ag jest zależna od interakcji między CyaA i CD11b, jej receptorem. Skutkiem tego, swoistość komórkowa CyaA jest w sposób zadziwiający dostosowana do dostarczania Ag. Wreszcie, swoistość komórkowa CyaA lub innych toksyn bakteryjnych może służyć do dostarczania cytozolowego szerokiej gamy cząsteczek istotnych farmaceutycznie, których działanie powinno być nakierowane na ograniczony zbiór komórek.

C. Zastosowanie adenylocyklazy do dostarczania chemicznie sprzężonych antygenów do komórek dendrytycznych in vivo

C.1. Metody sprzęgania cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania z wektorami pochodnymi CyaA

Opisano tu generalną metodykę tworzenia rekombinowanych toksyn CyaA przez szczepienie cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania z CyaA za pomocą wiązań disiarczkowych.

Dla zilustrowania usieciowano chemicznie syntetyczny peptyd długości 12 aminokwasów, odpowiadający epitopowi komórki T CD8+ z owoalbuminy, poprzez wiązanie disiarczkowe, z resztą cysteiny genetycznie wprowadzoną do domeny katalitycznej CyaA w pozycji 235 (dzikiego typu CyaA nie posiada reszt cysteiny). Spodziewane zalety tej nowej architektury to:

(i) uniwersalność: pojedyncze białko nośne CyaA może być łatwo sprzęgane z jakimikolwiek żądanymi peptydami syntetycznymi;

(ii) immunogenność: po dostarczeniu do cytozolu APC epitopy chemicznie sprzężone z CyaA powinny być uwolnione z wektora (z powodu redukujących warunków wewnątrzkomórkowych) i wprowadzone bezpośrednio do szlaku prezentacji MHC klasy I, omijając w ten sposób potencjalnie ograniczający etap obróbki proteolitycznej przez proteosomy.

Generalna procedura sprzęgania syntetycznych peptydów z CyaA przez wiązania disiarczkowe jest zarysowana w fig. 11.

W etapie pierwszym, wytwarza się rekombinowaną toksynę CyaA, która zawiera pojedynczą resztę cysteiny genetycznie wprowadzoną do domeny katalitycznej CyaA (dzikiego typu CyaA nie posiada reszt cysteiny).

Rekombinowaną toksynę CyaA, ACTM235, scharakteryzowano wcześniej (Heveker i Ladant, 1997). W szczególności, ACTM235 posiada dipeptyd Cys-Ser wprowadzony między aminokwas 235 i 236, i jest w pełni toksyczna. Toksynę tę uzyskano z ekspresji i oczyszczono do jednorodności zgodnie z wcześniejszym opisem w A.1.1.

W drugim etapie, zaplanowano syntetyczny peptyd odpowiadający epitopowi komórki CD8+ z owoalbuminy: oprócz sekwencji SIINFEKL (jednoliterowy kod dla aminokwasów), która jest dokładną sekwencją epitopu, na końcu N peptydu dodano resztę cysteiny z aktywowaną grupą tiolową N-pirydynosulfonylotiolową (Cys-NPys), podczas syntezy chemicznej. Aktywowaną NPys-cysteinę oddzielono od sekwencji SIINFEKL za pomocą elastycznego ugrupowania GGA, aby ułatwić dodatkową obróbkę proteolityczną peptydu w APC. Peptyd (Cys-Npys-OVA, masa cząsteczkowa: 1405 da) został zsyntetyzowany przez Neosystem (Strasbourg, Francja).

W trzecim etapie, peptyd Cys-Npys-OVA sprzężono z ACTM235 przy użyciu następującej procedury.

Dziesięć mg oczyszczonej ACTM235 w 8 M moczniku, 20 mM Hepes-Na, pH 7,5 zredukowano przez inkubację przez 12 godzin w obecności 10 mM Ditiotreitolu (DTT). Skuteczność redukcji sprawdzano przez analizę SDS-Page w warunkach nieredukujących: zasadniczo całe białko ACTM235 migrowało w postaci pojedynczego prążka wielkości 200 kDa, odpowiadając odmianie monomerycznej bez oznaki odmiany dimerycznej (ciężar cząsteczkowy około 400 kDa). Zredukowane białko załadowano następnie na kolumnę DEAE-sefarozy (Amersham Pharmacia Biotech) (5 ml upakowanej żywicy) zrównoważonej w 8 M moczniku, 20 mM Hepes-Na, pH 7,5. Białko ACTM235 było całkowicie zatrzymane na żywicy DEAE-sefarozy, którą następnie gruntownie przemyto 8 M mocznikiem, 20 mM Hepes-Na, pH 7,5, 0,1 M NaCl (>100 ml) aby usunąć jakiekolwiek ślady DTT (brak resztkowego DTT sprawdzano przy użyciu klasycznej reakcji Ellmana z kwasem 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoesowym), DTNB). Zredukowane białko ACTM235 wymywano następnie z żywicy DEAE-sefaroza w 7 ml 8 M mocznika, 20 mM Hepes-Na, pH 7,5, 0,5 M NaCl. Trzy mg (około 2 μmole) peptydu Cys-Npys-OVA dodano potem do zredukowanego białka ACTM235 (8 mg, około 45 nmoli) i mieszaninę inkubowano

PL 208 864 B1 przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie, dodano 25 ml 20 mM Hepes-Na, pH 7,5 i 8 ml 5 M NaCl i następnie tę rozcieńczoną mieszaninę załadowano na kolumnę fenylosefarozową (Amersham Pharmacia Biotech) (10 ml upakowanej żywicy) zrównoważoną w 20 mM Hepes-Na, pH 7,5, 1 M NaCl. Żywicę Phenyl-Sepharose przemyto 50 ml 20 mM Hepes-Na, pH 7,5, 1 M NaCl, a następnie 50 ml 20 mM Hepes-Na, pH 7,5. Derywatyzowane białko ACTM235 wymywano potem w 8 M moczniku, 20 mM Hepes-Na, pH 7,5. Stężenie toksyny określano spektrofotometrycznie z absorpcji przy 280 nm przy użyciu współczynnika ekstynkcji molekularnej wynoszącego 142000 M^-1. cm^-1.

Peptyd Cys-Npys-OVA sprzężono stosując tę samą procedurę z drugą rekombinowaną toksyną CyaA, CyaAE5-LCMVgp, która jest pozbawioną toksyczności odmianą (to znaczy pozbawioną aktywności enzymatycznej w wyniku genetycznej insercji 2 aminokwasów LQ między reszty 188 i 189). Toksyna ta zawiera także sekwencję peptydową długości 15 aminokwasów (PASAKAVYNFATCGT) wprowadzoną między reszty 224 i 225 CyaA i która zawiera pojedyncze reszty Cys. Plazmid kodujący tę rekombinowaną toksynę jest pochodną pCACT-ova-E5 (Guermonprez i inni, 2000) modyfikowaną przez insercję między miejscami restrykcyjnymi Stul i KpnI odpowiedniego syntetycznego dwuniciowego oligonukleotydu kodującego sekwencję PASAKAVYNFATCGT. Białko CyaE5-LCMVgp uzyskano z ekspresji i oczyszczono zgodnie z wcześniejszym opisem w A.1.1.

Peptydy ukazane w tabeli 1 także podobnie sprzężono z inną pozbawioną toksyczności rekombinowaną toksyną CyaA, CyaAE5-CysOVA, która zawiera taką samą dipeptydową insercję LQ w miejscu katalitycznym oraz 14-aminokwasową sekwencję wprowadzoną między reszty 224 i 225 CyaA. Ten insert zawiera resztę Cys sąsiadującą z epitopem OVA, jak ukazano w fig. 12. Plazmid kodujący tę rekombinowaną toksynę jest pochodną pCACT-ova-E5 modyfikowaną przez insercję między miejsca restrykcji BsiWI i KpnI odpowiedniego syntetycznego, dwuniciowego oligonukleotydu kodującego sekwencję ASCGSIINFEKLGT. Białko CyaAE5-CysOVA uzyskano z ekspresji i oczyszczono zgodnie z wcześniejszym opisem w A.1.1.

CyaAE5-CysOVA można uznać za ogólny pozbawiony toksyczności wektor do sprzęgania chemicznego epitopów CTL przez mostki disiarczkowe. Obecność epitopu OVA w CyaAE5-CysOVA pozwala na łatwy test in vitro funkcjonalności w dostarczaniu epitopu, przez pomiar prezentacji epitopu OVA swoistej hybrydomie komórki T jaką opisano wcześniej w B.1.4.

T a b e l a 1

Peptydy NPysCTL sprzężone z CyaAE5-CysOVA
nazwa epitopu	Sekwencja aminokwasowa peptydu
CEA 571	Cys (NPys) -GGYLSGANLNL
Gp100	Cys (NPys) -GGITDQVPFSV
MelanA	Cys (NPys) -GGEAAGIGILTV
Tyrozynaza	Cys (NPys) -GGYMDGTMSQV

Alternatywnie, grupy tiolowe rekombinowanych toksyn CyaA można aktywować 2,2'-ditodipirydyną (Sigma) i derywatyzować peptydami zawierającymi zredukowaną cysteinę (procedura redukcji Cys w peptydach syntetycznych jest podana przez producenta). Byłoby to szczególnie odpowiednie gdyby żądany peptyd zawierał wewnętrzną resztę cysteiny.

C.2 Analiza immunogenności in vitro oraz in vivo epitopu OVA sprzężonego chemicznie z CyaA

Przeanalizowano najpierw in vitro dostarczanie epitopu OVA do cząsteczek MHC klasy I przez CyaA po sprzęganiu chemicznym (CyaA-gp-S-S-OVA E5) lub genetycznym (CyaAOVA E5), przez zbadanie ₅ prezentacji tych cząsteczek hybrydomie anty-OVA B3Z komórka T CD8+ przez splenocyty. 3.10⁵ komórek ₅ śledziony od myszy C57BL/6 hodowano wspólnie przez 18 godzin z 10⁵ komórek B3Z w obecności różnych stężeń rekombinowanej CyaA. Uwalnianie IL przez B3Z mierzono w teście proliferacji CTLL.

Jak ukazano w fig. 13, obserwowano wysoki poziom ekspresji IL-2 podczas stymulacji B3Z albo CyaA-gp-S-S-OVA E5 albo CyaAOVA E5, pokazując w ten sposób, że epitop OVA chemicznie połączony z CyaA został równie skutecznie dostarczony do szlaku cytozolowego komórek prezentujących antygen jak po sprzężeniu genetycznym. Nie zaobserwowano wytwarzania IL-2 gdy B3Z były stymulowane cząsteczkami CyaA bez epitopu OVA, ukazując w ten sposób swoistość wytwarzania IL-2.

W drugim etapie, przeanalizowano zdolność tych cząsteczek do indukcji odpowiedzi CTL swoistych wobec OVA in vivo. Myszy C57BL/6 immunizowano przez wstrzyknięcie iv 50 μg różnych CyaA.

PL 208 864 B1

Siedem dni później, 25.10⁶ komórek śledziony poszczególnych myszy stymulowano ponownie 0,1 μg peptydu OVA w obecności 25.10⁶ napromieniowanych jednorodnych komórek śledziony przez pięć dni.

Aktywność cytotoksyczną komórek efektorowych mierzono na docelowych komórkach EL4 znakowanych ⁵¹Cr poddanych impulsom 50 μM peptydu OVA lub nie.

Jak ukazano w fig. 14, silne odpowiedzi CTL indukowano u myszy immunizowanych albo CyaAgp-S-S-OVA E5 albo CyaAOVA E5, pokazując w ten sposób porównywalną skuteczność sprzęgania chemicznego lub genetycznego epitopu OVA. Nie zaobserwowano odpowiedzi CTL u myszy immunizowanych kontrolnymi cząsteczkami CyaA bez epitopu OVA lub gdy użyto nie powleczonych EL4 jako komórek docelowych, ukazując w ten sposób swoistość obserwowanych odpowiedzi CTL.

Podsumowując, wyniki te wyraźnie pokazują, że epitop komórki T CD8+ połączony chemicznie z wektorami białkowymi pochodzącymi od CyaA jest bardzo skutecznie dostarczany do szlaku cytozolowego do prezentacji przez MHC klasy I i indukuje silną odpowiedź CTL in vivo.

D. Identyfikacja fragmentu pochodzącego od CyaA, który wiąże się z CD11b/CD18 i może być stosowany jako skuteczny dostarczający cząsteczki

Jako próbę zmapowania regionu, który bierze udział w interakcji między CyaA i receptorem CD11b/CD18, skonstruowano różne subfragmenty CyaA i testowano pod względem ich zdolności do współzawodniczenia z biotynylowaną toksyną CyaA o wiązanie z CD11b/CD18 na powierzchni transfekowanych komórek CHO, przy użyciu metod opisanych wcześniej, w paragrafie A.

D.1 Ekspresja CyaA373-1706

Wytworzono białko CyaA373-1706 w E. coli przy użyciu nowego wektora ekspresyjnego pTRAC-373-1706 (fig. 16). Jest to pochodna plazmidu Pdl1312 (Ladant, 1995), skonstruowanego przez zastąpienie genu neurokalcyny plazmidu pDL1312 genem cyaC (który koduje CyaC, która jest związana z konwersją proCyaA w aktywną toksynę przez palmitoilowanie potranslacyjne Lys 860 i 983 CyaA) oraz części 3' genu cyaA, który koduje domenę C-terminalną - kodony 373 do 1706 CyaA (patrz fig. 16). Zarówno gen cyaC jak i 'cyaA są umieszczone w tym samym ugrupowaniu transkrypcyjnym pod kontrolą promotora Pr faga λ. Koniec 3' genu cyaC zmodyfikowano aby wprowadzić przed kodonem przestankowym, miejsce wiązania rybosomu, aby wzmocnić początek translacji genu o kierunku zgodnym 'cyaA (fig. 16). Uzyskana modyfikacja polipeptydu CyaC (ostatnie 3 aminokwasy GlyThr-Ala na końcu C CyaC zastąpiono sekwencją Asn-Arg-Glu-Glu) nie miała żadnego wpływu na jego zdolność do acylowania CyaA. Koniec 5' genu cyaA (kodujący domenę katalityczną toksyny powyżej unikalnego miejsca BstBI cyaA) usunięto i zastąpiono przez odpowiedni syntetyczny, dwuniciowy oligonukleotyd kodujący sekwencję MGCGN (fig. 16).

pTRAC-373-1706 koduje także termoczuły represor λ Cl⁸⁵⁷, który silnie hamuje transkrypcję genową przy promotorze Pr λ w temperaturach poniżej 32°C, początek replikacji colE1 i gen beta-laktamazy, który nadaje oporność na ampicylinę.

Ekspresję białka CyaA373-1706 przeprowadzono w szczepie E. coli BLR. Komórki transformowane pTRAC-373-1706 hodowano w temperaturze 30°C w pożywce LB zawierającej 150 mg/l ampicyliny aż do fazy środkowo-logarytmicznej wzrostu, a następnie indukowano syntezę CyaC i skróconej CyaA, przez zwiększenie temperatury hodowli do 42°C. Bakterie zebrano po 3-4 godzinach dodatkowego wzrostu w temperaturze 42°C. Następnie białko CyaA373-1706 oczyszczono jak opisano dla CyaA dzikiego typu (Guermonprez i inni, 2000). CyaA373-1706 jest pozbawione aktywności syntezy cAMP, wykazuje aktywność hemolityczną erytrocytów owcy i zawiera także unikalne reszty cysteinowe w swej N-terminalnej sekwencji MGCGN.

D. 2 Inhibicja wiązania CyaA-E5 z CD11b przez fragmenty CyaA-E5 i CyaA: 1-383 (domena katalityczna) i 373-1706 (domeny hydrofobowa i powtórzenia)

Jak ukazano w fig. 15, uzyskano silną inhibicję wiązania biotynylowanej CyaA-E5 po inkubacji transfekowanych komórek CHO z CyaA-E5. Podobną inhibicję otrzymano po inkubacji tych komórek z fragmentem CyaA-373-1706 podczas gdy CyaA 1-383 nie miał znaczącego wpływu na wiązanie biotynylowanej CyaA-E5.

Tak więc, wyniki te wyraźnie pokazują, że fragment CyaA, który obejmuje reszty 373 do 1706, CyaA373-1706 zawiera struktury zasadniczo konieczne dla interakcji CyaA z receptorem CD11b/CD18.

E. Wnioski

Ponieważ cząsteczki MHC klasy I zwykle prezentują peptydy pochodzące z endogennie syntetyzowanych białek, epitopy muszą być dostarczone do cytozolu komórek prezentujących antygen aby wzbudzić odpowiedź CTL. Ustalono wcześniej, że aktywność pobudzająca CTL rekombinowanego

PL 208 864 B1 białka ACT polega co najmniej częściowo na jego zdolności do dostarczania epitopów komórek T CD8+ do cytozolu komórek prezentujących antygen (APC). W jednym podejściu, epitopy były genetycznie wprowadzane do domeny katalitycznej CyaA jako, że wiadomo, że dla toksyny typu dzikiego, ta część polipeptydu osiąga cytozol komórek docelowych gdzie wywiera swój toksyczny efekt (to znaczy syntezę cAMP). Po wejściu do komórek domena katalityczna CyaA obejmująca insert epitopu musi być obrobiona proteolitycznie aby uwolnić dojrzały epitop komórki T CD8+, który następnie będzie przemieszczony do retikulum endoplazmatycznego aby zasocjować z cząsteczkami MHC klasy I.

Ta obróbka proteolityczna, przeprowadzana przez proteosom, mogła być etapem ograniczającym w licznych przypadkach (Pamer i Cresswell, 1998; Cascio i inni, 2001), prowadząc do znaczącego zmniejszenia całkowitej wydajności uzyskiwania dojrzałego epitopu. Alternatywne podejście tu opisywane, które obejmuje łączenie epitopów z domeną katalityczną CyaA za pomocą wiązania disiarczkowego, oferuje znaczącą zaletę polegającą na tym, że dzięki temu planowi, dojrzałe epitopy (wymagające tylko skrócenia N-terminalnego) będą uwalniane ilościowo z CyaA do cytozolu APC. Oprócz tego, powinien to być uniwersalny system, jako że pojedyncze białko nośne CyaA mogłoby być łatwo i szybko sprzęgane z każdym żądanym syntetycznym peptydem. Ponadto, łatwo będzie wprowadzić przez inżynierię genetyczną reszty cysteiny do domeny katalitycznej (tak jak we wcześniej zmapowanych miejscach permisywnych, WO 93/21324 (INSTITUT PASTEUR)) rekombinowanej, pozbawionej toksyczności toksyny CyaA tak, aby można było sprzęgać wiele peptydów na tej samej cząsteczce CyaA. Powinno to zwiększyć całkowite dostarczanie epitopu i immunogenność rekombinowanego białka.

Mapowanie deiecji pozwoliło na identyfikację C-terminalnej części CyaA (aminokwasy 373-1706) jako regionu, który bierze udział w interakcji toksyny z jej receptorem CD11b/CD18. Skrócone białko CyaA373-1706 można zatem stosować jako moduł białka do namierzania komórek CD11b+ in vivo. W szczególności, polipeptydy lub białka odpowiadające antygenom będącym przedmiotem zainteresowania można poddać fuzji genetycznej z CyaA373-1706 w celu dostarczenia do komórek dendrytycznych, aby wzbudzić swoistą odpowiedź immunologiczną. Podobne sprzęganie można przeprowadzić na rekombinowanym białku CyaA373-1706, które zawierało także unikalną cysteina na jego końcu N-terminalnym.

Bibliografia

1. Aichele, P., D. Kyburz, P.S. Ohashi, B. Odermatt, R.M. Zinkemagel, H. Hengartner, i H. Pircher. 1994. Peptideinduced T-cell tolerance to prevent autoimmune diabetes in a transgenic mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, nr. 2:444-8.

2. Aichele, P., K. Brduscha-Riem, R.M. Zinkemagel, H. Hengartner, i H. Pircher. 1995. T cell priming versus T cell tolerance induced by synthetic peptides. Journal of Experimental Medicine 182, nr. 1:261-6.

3. Ballard, J.D.. R.J. Collier, and M.N. Stambach. 1996. Anthrax toxin-mediated delivery of a cytotoxic T-cell epitope in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, nr. 22:12531-4.

4. Bassinet, L, P. Gueirard, B. Maitre, B. Housset, P. Gounon, i N. Guiso. 2000. Role of adhesins and toxins in invasion of human tracheal epithelial cells by Bordetella pertussis. Infect Immun 68, nr. 4:1934-41.

5. Bell, D., J.W. Young, i J. Banchereau. 1999. Dendritic cells. Advances in Immunology 72:255-324.

6. Bennett. S.R., F.R. Carbone. F. Karamalis, J.F. Miller, i W.R. Heath. 1997. Induction of a CD8+ cytotoxic T lymphocyte response by cross-priming requires cognate CD4+ T celf-help. Journal of Experimental Medicine 186, nr. 1:65-70.

7. Bennett. S.R.. F.R. Carbone, T. Toy, J.F. Miller i W.R. Heath. 1998. B cells directly tolerize CD8(+) T cells. Journal of Experimental Medicine 188, nr. 11:1977-83.

8. Bennett, S.R., F.R. Carbone, F. Karamalis, R.A. Flavell, J.F. Miller i W.R. Heath. 1998. Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 signalling [see comments]. Nature 393, nr. 6684:478-80.

9. Betsou i inni Infect. Immun. wrzesień 1993, 61 (9) 3583-3589.

10. Betsou i inni Infect. Immun. wrzesień 1995, 63 (9) 3309-3315.

PL 208 864 B1

11. Benz, R., E. Maier, D. Ladant, A. Ullmann i P. Sebo. 1994. Adenylate cyclase toxin (CyaA) of Bordetella pertussis. Evidence for the formation of small ion-permeable channels and comparison with HlyA of Escherichia coli. Journal of Biological Cnemistry 269, nr. 44:27231-9.

12. Carbonetti. N.H.. T.J. Irish. C.H. Chen, C.B. O'Connell. G.A. Hadiey, U. McNamara, R.G. Tuskan i G.K. Lewis. 1999. Intracellular delivery of a cytolytic T-lymphocyte epitope peptide by pertussis toxin to major histocompatibility complex class I without involvement of the cytosolic class I antigen processing pathway. Infection & Immunity 67. nr. 2:602-7.

13. Casares, S., K. Inaba, T.D. Bmmeanu, R.M. Steinman i CA Bona. 1997. Antigen presentation by dendritic cells after immunization with DMA encoding a major histocompatibility complex class II-restricted viral epitope. Journal of Experimental Medicine 186, nr. 9:1481-6.

14. Condon. C, S.C. Watkins, CM. Celluzzi, K. Thompson i LD. Falo, Jr. 1996. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine 2, nr. 10:1122-8.

15. Confer, D.L i J.W. Eaton. 1982. Phagocyte impotence caused by an invasive bacterial adenylate cyclase. Science 217, nr. 4563:948-50.

16. Coote, J.G. 1992. Structural and functional relationships among the RTX toxin determinants of gram-negative bacteria. FEMS Microbiol Rev 8. nr. 2:137-61.

17. Crowley, M. , K. Inaba i R.M. Steinman. 1990. Dendritic cells are the principal cells in mouse spleen bearing immunogenic fragments of foreign proteins. Journal of Experimental Medicine 172, nr. 1:383-6.

18. De Smedt, T., B. Pajak, E. Muraille, L Lespagnard. E. Heinen, P. De Baetselier, J. Urbain, O. Leo i M. Moser. 1996. Regulation of dendritic cell numbers and maturation by lipopolysaccharide in vivo. Journal of Experimental Medicine 184, nr. 4:1413-24.

19. C. Fayolle, P. Sebo. D. Ladant, A. Ullmann i C. Leclerc, (1996) In vivo induction of CTL responses by recombinant adenylate cyclase of Bordetella pertussis carrying viral CD8(+) T-cells epitopes, J. Immunol. 156.4697-4706

20. Fayolle, C, D. Ladant, G. Karimova, A. Ullmann i C. Leclerc. 1999. Therapy of murine tumors with recombinant Bordetella pertussis adenylate cyclase carrying a cytotoxic T cell epitope. Journal of Immunology 162, nr. 7:4157-62.

21. Friedman, R.L, R.L Fiederiein. L. Glasser i J.N. Galgiani. 1987. Bordetella pertussis adenylate cyclase: effects of affinity-purified adenylate cyclase on human polymorphonuclear leukocyte functions. Infection & Immunity 55, nr. 1:135-40.

22. Fuchs, E.J. i P. Matzinger. 1992. B cells turn off virgin but not memory T cells. Science 258, nr. 5085:1156-9.

23. Gray, M. , G. Szabo, A.S. Otero, L. Gray i E. Hewlett. 1998. Distinct mechanisms for K+ efflux, intoxication i hemolysis by Bordetella pertussis AC toxin. Journal of Biological Chemistry 273, nr. 29:18260-7.

24. Gross, M.K.. D.C. Au, A.L. Smith i D.R. Storm. 1992. Targeted mutations that ablate either the adenylate cyclase or hemolysin function of the bifunctional cyaA toxin of Bordetella pertussis abolish virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, nr. 11:4898-902.

25. Gueirard, P., A. Druilhe, M. Pretolani i N. Guiso. 1998. Role of adenylate cyclase-hemolysin in alveolar macrophage apoptosis during Bordetella pertussis infection in vivo. Infection & Immunity 66, nr. 4:1718-25.

26. Guermonprez, P.. D. Ladant, G. Karimova, A. Ullmann i C. Leclerc. 1999. Direct delivery of the Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to the MHC class I antigen presentation pathway. Journal of Immunology 162, nr. 4:1910-6.

27. P. Guermonprez, C. Fayolle, C. Leclerc, G. Karirnova, A. Ullmann i D. Ladant (2000) Bordetella pertussis adenylate cydase toxin: a vehicle to deliver CD8+ T-cell epitopes into antigen presenting cells, wn Methods in Enzymology, Chimeric Genes and Proteins, 326, 527-542. J. Abelson, S. Emr i J. Thorner (Eds) Academie Press Inc.

28. Guery, J.C., F. Ria i L. Adormi. 1996. Dendritic cells but not B cells present antigenic complexes to class II-restricted T cells after administration of protein in adjuvant. Journal of Experimental Medicine 183. nr. 3:751 -7.

29. Guery, J.C., F. Ria, F. Galbiati, S. Smiroido i L. Adorini. 1997. The mode of protein antigen administration determines preferential presentation of peptide-class II complexes by lymph node dendritic or B cells. International Immunology 9, nr. 1:9-15.

PL 208 864 B1

30. Guiso, N., M. Rocancourt, M. Szatanik i J.M. Alonso. 1989. Bordetella adenylate cyclase is a virulence associated factor and an immunoprotective antigen. Microbial Pathogenesis 7, nr. 5:373-80.

31. Guiso, N. , M. Szatanik i M. Rocancourt. 1991. Protective activity of Bordetella adenylate cyclase-hemolysin against bacterial colonization. Microbial Pathogenesis 11, nr. 6:423-31.

32. Harvill, E.T., P.A. Cotter, M.H. Yuk. and J.F. Miller. 1999. Probing the function of Bordetella bronchiseptica adenylate cyclase toxin by manipulating host immunity. Infection & Immunity 67, nr. 3:1493-500.

33. N. Heveker and D. Ladant. (1997) Characterization of mutant Bordetella pertussis adenylate cyclase toxins with reduced affinity for calmodulin. Implications for the mechanism of toxin entry into target cells, Eur. J. Biochem., 243,643-649.

34. Hewlett, E. i J. Wolff. 1976. Soluble adenylate cyclase from the culture medium of Bordetella pertussis: purification and characterization. Journal of Bacteriology 127, nr. 2:890-8.

35. Jeyaseelan, S., S.L Hsuan, M.S. Kannan, B. Walcheck. J.F. Wang, M.E. Kehrii, E.T. Lally.

G.C. Stock, and S.K. Maheswaran. 2000. Lymphocyte function-associated antigen 1 is a receptor for Pasteurella haemolytica leukotoxin in bovine leukocytes. Infection & Immunity 68, nr. 1:72-9.

36. Karimova, G.. C. Fayolle, S. Gmira, A. Ullmann. C. Leclerc i D. Ladant. 1998. Chargedependent translocation of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin into eukaryotic cells: implication for the in vivo delivery of CD8(+) T cell epitopes into antigen-presenting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, nr. 21:12532-7.

37. Karttunen, J., S. Sanderson i N. Shastri. 1992. Detection of rare antigen-presenting cells by the lacZ T-cell activation assay suggests an expression cloning strategy for T-cell antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, nr. 13:6020-4.

38. Kawabe, T., T. Naka, K. Yoshida, T. Tanaka, H. Fujiwara, S. Suematsu, N. Yoshida, T. Kishimoto i H. Kikutani. 1994. The immune responses in CD40-deficient mice: impaired immunoglobulin class switching and germinal center formation. Immunity 1, nr. 3:167-78.

39. Khelef, N., H. Sakamoto i N. Guiso. 1992. Both adenylate cyclase and hemolytic activities are required by Bordetella pertussis to initiate infection. Microbial Pathogenesis 12, nr. 3:227-35.

40. Khelef, N.. A. Zychlinsky i N. Guiso. 1993. Bordetella pertussis induces apoptosis in macrophages: role of adenylate cyclase-hemolysin. Infection & Immunity 61. nr. 10:4064-71.

41. Khelef, N. i N. Guiso. 1995. Induction of macrophage apoptosis by Bordetella pertussis adenylate cyclase-hemolysin. FEMS Microbiology Letters 134. nr. 1:27-32 .

42. Khelef, N., CM. Bachelet, B.B. Vargaftig i N. Guiso. 1994. Characterization of murine lung inflammation after infection with parental Bordetella pertussis and mutants deficient in adhesins or toxins. Infection & Immunity 62, nr. 7:2893-900.

43. Killeen, N., S. Sawada i D.R. Liftman. 1993. Regulated expression of human CD4 rescues helper T cell development in mice lacking expression of endogenous CD4. EMBO Journal 12, nr. 4:1547-53.

44. Kitamura, D., J. Roes, R. Kuhn. and K. Rajewsky. 1991. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature 350, nr. 6317:423-6.

45. Kyburz, D., P. Aichele. D.E. Speiser, H. Hengartner, R.M. Zinkemagel i H. Pircher. 1993. T cell immunity after a viral infection versus T cell tolerance induced by soluble viral peptides. European Journal of Immunology 23, nr. 8:1956-62.

46. Ladant D., Glaser P. and A. Ullmann. 1992. Insertional mutagenesis of Bordetella pertussis Adenylate cyclase. Journal of Biological Chemistry (4), nr. 267:2244-2250 .

47. Ladant D., Calcium and membrane binding properties of bovine neurocalcin delta expressed in Escherichia coli, J Biol Chem 270 (1995)317 9-3185.

48. Ladant, D. i A. Ullmann. 1999. Bordetella pertussis adenylate cyclase: a toxin with multiple talents. Trends in Microbiology 7, nr. 4:172-6.

49. Njamkepo, E., F. Pinot. D. Francois, N. Guiso, B.S. Polla i M. Bachelet. 2000. Adaptive responses of human monocytes infected by bordetella pertussis: the role of adenylate cyclase hemolysin. J Cell Physiol 183, nr. 1:91-9.

50. Otero. A.S., X.B. Yi, M.C. Gray, G. Szabo i E.L. Hewlett. 1995. Membrane depolarization prevents cell invasion by Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin. Journal of Biological Chemistry 270. nr. 17:9695-9697.

PL 208 864 B1

51. Porgador, A., K.R. Irvine, A. Iwasaki, B.H. Barber, N.P. Restifo i R.N. Germain. 1998. Predominant role for directly transfected dendritic cells in antigen presentation to CD8+ T cells after gene gun immunization. Journal of Experimental Medicine 188, no. 6:1075-82.

52. Pulendran, B., J. Lingappa. M.K. Kennedy, J. Smith, M. Teepe, A. Rudensky, C.R. Maliszewski i E. Maraskovsky. 1997. Developmental pathways of dendritic cells in vivo: distinct function, phenotype i localization of dendritic cell subsets in FLT3 ligand-treated mice. Journal of Immunology 159, nr. 5:2222-31.

53. Reis e Sousa. C. i R.N. Germain. 1999. Analysis of adjuvant function by direct visualization of antigen presentation in vivo: endotoxin promotes accumulation of antigen-bearing dendritic cells in the T cell areas of lymphoid tissue. Journal of Immunology 162, nr. 11:6552-61.1

54. Ridge, J.P., F. Di Rosa i P. Matzinger. 1998. A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ T-helper and a T-killer cell. Nature 393, nr. 6684:474-8.

55. Rogel, A., i E. Hanski. 1992. Distinct steps in the penetration of adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis into sheep erythrocytes. The Journal of Biological Chemistry 267, nr. 31:22599-22605.

56. Rose, T., P. Sebo, J. Bellalou i D. Ladant. 1995. Interaction of calcium with Bordetella pertussis adenylate cyctase toxin. Characterization of multiple calcium-binding sites and calcium-induced conformational changes. Journal of Biological Chemistry 270, nr. 44:26370-6.

57. Sakamoto, H., J. Bellalou, P. Sebo i D. Ladant. 1992. Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin. Structural and functional independence of the catalytic and hemolytic activities. Journal of Biological Chemistry 267, nr. 19:13598-602.

58. M.F. Saron, C. Fayolle, P. Sebo, D. Ladant, A. Ullmann i C. Leclerc. (1997) Anti-viral protection conferred by recombinant adenylate cyclase toxins from Bordetella pertussis canying a CD8+ T-cell epitope from LCMV. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 3314-3319.

59. Schoenberger, S.P., R.E. Toes, E.l. van der Voort, R. Offringa i C.J. Melief. 1998. T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions [patrz komentarze]. Nature 393, nr. 6684:480-3.

60. Schuurhuis, D.H., S. Laban, R.E. Toes, P. Ricciardi-Castagnoli, M.J. Kleijmeer, E.l. van Der Voort, D. Rea, R. Offringa. H.J. Geuze, C.J. Melief i F. Ossendorp. 2000. Immature dendritic cells acquire CD8(+) cytotoxic T lymphocyte priming capacity upon activation by T helper cell-independent or -dependent stimuli [w omówieniu procesu]. J Exp Med 192, nr. 1:145-50.

61. Sebo. P., Glaser. P., Sakamoto, H. i Ullmann, A. 1991. Gene 104.19-24.

62. Viola, A., G. lezzi i A. Lanzavecchia. 1999. The role of dendntic cells in T cell priming: the importance of being professional. In Dendntic cells. T.L. Lotze i A.W. Thomson, wydawcy. Academie Press, San Diego. 251-253.

63. Vremec, D. i K. Shortman. 1997. Dendritic cell subtypes in mouse lymphoid organs: cross-correlation of surface markers, changes with incubation i differences among thymus, spleen i lymph nodes. Journal of Immunology 159. nr. 2:565-73.

64. Vremec, D., M. Zorbas. R. Scollay, DJ. Saunders, C.F. Ardavin, L. Wu i K. Shortman. 1992. The surface phenotype of dendritic cells purified from mouse thymus and spleen: investigation of the CD8 expression by a subpopulation of dendritic cells. Journal of Experimental Medicine 176, nr. 1:47-58.

65. Weiss, A.A., E.L. Hewlett, G.A. Myers i S. Faikow. 1984. Pertussis toxin and extracytoplasmic adenylate cyclase as virulence factors of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases 150, nr. 2:219-22

66. Weiss, AA i M.S. Goodwin. 1989. Lethal infection by Bordetella pertussis mutants in the infant mouse model. Infection & Immunity 57, nr. 12:3757-64.

67. Wolff, J., G.H. Cook, A.R. Goldhammer i SA. Berkowitz. 1980. Calmodulin activates prokaryotic adenylate cyclase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 77, nr. 7:3841-4.

68. Zhong, G., C.R. Sousa i R.N. Germain. 1997. Antigen-unspecific B cells and lymphoid dendritic cells both show extensive surface expression of processed antigen-major histocompatibility complex class II complexes after soluble protein exposure in vivo or in vitro. Journal of Experimental Medicine 186, nr. 5:673-82.

69. Zinkemagel, R.M., S. Ehl, P. Aichele, S. Oehen, T. Kundig i H. Hengartner. 1997. Antigen localisation regulates immune responses in a dose- and time-dependent fashion: a geographical view of immune reactivity. Immunological Reviews 156:199-209.

70. WO 93/21324 (INSTITUT PASTEUR). Recombinant mutants for inducing specific immune response.

PL 208 864 B1

Lista sekwencji <110> INSTITUT PASTEUR

CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE <120> Zastosowanie wektora białkowego, kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna i jej zastosowania oraz wektor białkowy <130> B4669A -AD/DBO

<140>	PCT/EP 01/11315
<141>	2001-09-14
<150>	E? 00402562.3
<151>	2000-09-15
<160>	11
<170>	Patentin wersja 2.1
<210>	1
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Opis sekwencji sztucznej: peptyd syntetyczny
<220>
<221>	PEPTYD
<222>	(1) (14)
<223>	Epitop owoalbuminy
<400>	1

Ala Ser Cys Gly Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Gly Thr

1	5 10
<210>	2
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>

PL 208 864 B1 <223> Opis sekwencji sztucznej: peptyd syntetyczny <220>

<221> PEPTYD <222> (1) . . (8) <223> Peptyd syntetyczny pOVA <400> 2

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: peptyd syntetyczny <220>

<221> PEPTYD <222> (1). . (15) <223> Epitop CMVgp <400> 3

Pro Ala Ser Ala Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Thr 15 10 15 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: peptyd syntetyczny <220>

<221> PEPTYD <222> (1) . . (12)

PL 208 864 B1 <223> Epitop CEA 571 <400> 4

Cys Gly Gly Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu

10

<210>	0
<211>	12
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>

<223>	Opis sekwencji sztucznej: peptyd syntetyczny
<220>

<221>	PEPTYD
<222>	(1) - - (12)
<223>	Epitop gplOO
<400>	5

Cys Gly Gly Ile Thr Asp Gin Val Pro Phe Ser Val

10

<210>	6
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>

<223>	Opis sekwencji sztucznej: peptyd syntetyczny
<220>

<221>	PEPTYD
<222>	(1) · · (13)
<223>	Epitop MelanA
<400>	6

Cys Gly Gly Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Va

10

PL 208 864 B1 <210> 7

<211>	12
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: peptyd syntetyczny <220>

<221>	PEPTYD
<222>	(1) - · (12)
<223>	Epitop tyrozynazy
<400>	7

Cys Gly Gly Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gin Val

10

<210>	8
<211>	45
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>

<223>	Opis sekwencji sztucznej: region wewnątrzgenowy
<220>

<221>	CDS
<222>	(1) · (15)
<223>	Wydłużenie C-terminalne CyaC
<220>

<221>	CDS
<222>	(22)..(45)
<223>	Pierwsze kodony CyaA 373-1706

<400> 8

PL 208 864 B1 cgg aat aag gag gaa taa cat atg ggc tgc ggg aat tcg aag ttc 45

Arg Asn Lys Glu Glu Met Gly Cys Gly Asn Ser Lys Phe

1	5 10
<210	9
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<223>	Opis sekwencji sztucznej: region wewnątrzgenowy
<400>	9

Arg Asn Lys Glu Glu

1	5
<210>	10
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<223>	Opis sekwencji sztucznej: region wewnątrzgenowy
<400>	10

Met Gly Cys Gly Asn Ser Lys Phe

5

<210>	11
<211>	16
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Opis sekwencji sztucznej: peptyd syntetyczny
<220
<221>	PEPTYD
<222>	(1) · (16)
<223>	epitop 0VA
<400>	11

Arg Ala Ser Cys Gly Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Gly Thr Ala

Claims (55)

1. Zastosowanie wektora białkowego składającego się z adenylocyklazy gatunku Bordetella sprzężonej z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania do specyficznego nakierowywania cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania na komórki wykazujące ekspresję CD11b, przy czym cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania wybrana jest z grupy składającej się z peptydów, glikopeptydów, lipopeptydów i środków chemicznych.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest wstawiona w wymienioną adenylocyklazę.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymieniona adenylocyklaza jest genetycznie zmodyfikowaną adenylocyklazą gatunku Bordetella.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że wymieniona adenylocyklaza gatunku Bordetella jest skróconą toksyną adenylocyklazową Bordetella zdolną do wiązania receptora CD11b.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że wymieniona skrócona toksyna adenylocyklazowa Bordetella pozbawiona jest całości lub części swej N-terminalnej domeny katalitycznej.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że wymieniona skrócona toksyna adenylocyklazowa Bordetella pozbawiona jest wszystkich lub części reszt 1-373.

7. Zastosowanie według zastrz. 1, do specyficznego nakierowywania wymienionej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania do cytozolu komórek wykazujących ekspresję CD11b.

8. Zastosowanie według zastrz. 1, do specyficznego nakierowywania wymienionej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania na powierzchnię komórek wykazujących ekspresję CD11b.

9. Zastosowanie według zastrz. 1, do specyficznego nakierowywania wymienionej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania do szlaku endocytarnego komórek wykazujących ekspresję CD11b.

10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymienione komórki wykazujące ekspresję CD11b są komórkami dendrytycznymi, korzystniej mieloidalnymi komórkami dendrytycznymi, makrofagami albo komórkami NK.

11. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymienione komórki wykazujące ekspresję CD11b są neutrofilami.

12. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że wymieniona zmodyfikowana adenylocyklaza jest adenylocyklazą nietoksyczną albo detoksyfikowaną.

13. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że wymieniona genetycznie zmodyfikowana adenylocyklaza zawiera jedną lub więcej reszt cysteiny wstawionych w obrębie swej domeny katalitycznej w miejscach permisywnych.

14. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymieniona adenylocyklaza pochodzi z Bordetella pertussis.

15. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest antygenem.

16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z wewnątrzkomórkowego antygenu komórki bakteryjnej, antygenu komórki nowotworowej, antygenu wirusowego, antygenu grzybowego i antygenu komórki pasożyta.

17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z antygenu poliowirusa, antygenu wirusa HIV, antygenu wirusa grypy, antygenu wirusa zapalenia opon i splotów naczyniowych oraz antygenu nowotworowego.

18. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania obejmuje epitop.

19. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymieniony wektor białkowy zawiera heterologiczny peptyd poddany fuzji z N-terminalnym końcem genetycznie zmodyfikowanej skróconej adenylocyklazy Bordetella pozbawionej całości lub części swej N-terminalnej domeny katalitycznej, przy czym wymieniona skrócona adenylocyklaza Bordetella zdolna jest do wiązania receptora CD11b, a korzystniej adenylocyklazy Bordetella pertussis pozbawionej reszt 1-373.

20. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest lekiem, który jest chemicznie albo genetycznie sprzężony z wymienioną adenylocyklazą.

21. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest lekiem, który jest sprzężony chemicznie za pomocą wiązania diPL 208 864 B1 siarczkowego z genetycznie wprowadzoną resztą cysteiny zlokalizowaną w domenie katalitycznej wymienionej adenylocyklazy.

22. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że wymieniony lek jest lekiem przeciwzapalnym.

23. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna spreparowana do podawania człowiekowi albo zwierzęciu, zawierająca wektor białkowy składający się z adenylocyklazy gatunku Bordetella sprzężonej z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania wybraną z grupy składającej się z peptydów, glikopeptydów, lipopeptydów i środków chemicznych.

24. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 23, znamienna tym, że wymienioną adenylocyklazę stanowi genetycznie zmodyfikowana adenylocyklaza.

25. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 24, znamienna tym, że wymienioną genetycznie zmodyfikowaną adenylocyklazę stanowi skrócona adenylocyklazą Bordetella pozbawiona całości lub części swej N-terminalnej domeny katalitycznej, zdolna do wiązania receptora CD11b.

26. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 25, znamienna tym, że wymienioną genetycznie zmodyfikowaną adenylocyklazę stanowi skrócona adenylocyklaza Bordatella pertussis pozbawiona reszt 1-373.

27. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 24, znamienna tym, że wymieniona genetycznie zmodyfikowana adenylocyklaza zawiera jedną lub więcej reszt wstawionych w obrębie swej domeny katalitycznej w miejscu permisywnym lub miejscach permisywnych.

28. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 23, znamienna tym, że wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi lek.

29. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 28, znamienna tym, że wymieniony lek stanowi lek przeciwzapalny.

30. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 23, znamienna tym, że wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi antygen.

31. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 30, znamienna tym, że wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z wewnątrzkomórkowego antygenu komórki bakteryjnej, antygenu komórki nowotworowej, antygenu wirusowego, antygenu grzybowego i antygenu komórki pasożyta.

32. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 31, znamienna tym, że wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z antygenu poliowirusa, antygenu wirusa HIV, antygenu wirusa grypy, antygenu wirusa zapalenia opon i splotów naczyniowych oraz antygenu nowotworowego.

33. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 23, znamienna tym, że wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest wstawiona do domeny katalitycznej wymienionej adenylocyklazy Bordetella.

34. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 23, znamienna tym, że wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi heterologiczny peptyd poddany fuzji z N-terminalną częścią genetycznie zmodyfikowanej adenylocyklazy Bordetella pozbawionej swej N-terminalnej domeny katalitycznej, zdolną do wiązania receptora CD11b.

35. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi heterologiczny peptyd poddany fuzji z adenylocyklazą Bordetella pertussis pozbawioną reszt 1-373.

36. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 33, znamienna tym, że wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi peptyd heterologiczny.

37. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 23, znamienna tym, że kompozycja ta pozbawiona jest adiuwantów stymulujących.

38. Kompozycja immunogenna lub farmaceutyczna według zastrz. 23, znamienna tym, że wymieniona adenylocyklaza pochodzi z Bordetella pertussis.

39. Zastosowanie immunogennej lub farmaceutycznej kompozycji jak zdefiniowano w zastrz. 30 do indukcji lub stymulacji odpowiedzi immunologicznej ze specyficznym udziałem komórek dendrytycznych.

40. Zastosowanie immunogennej lub farmaceutycznej kompozycji jak zdefiniowano w zastrz. 30 do wytwarzania szczepionki lub kompozycji immunoterapeutycznej.

PL 208 864 B1

41. Wektor białkowy zawierający rekombinowaną adenylocyklazę gatunku Bordetella sprzężoną z cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania wybraną z grupy składającej się z peptydów, glikopeptydów, lipopeptydów i środków chemicznych, do specyficznego dostarczania wymienionej cząsteczki do komórek wykazujących ekspresję CD11b.

42. Wektor białkowy według zastrz. 41, znamienny tym, że wymienione komórki wykazujące ekspresję CD11b stanowią komórki dendrytyczne, korzystniej mieloidalne komórki dendrytyczne, makrofagi albo komórki NK.

43. Wektor białkowy według zastrz. 41, znamienny tym, że adenylocyklazę stanowi genetycznie zmodyfikowana adenylocyklaza.

44. Wektor białkowy według zastrz. 43, znamienny tym, że wymieniona genetycznie zmodyfikowana adenylocyklaza zawiera genetycznie wstawioną resztę (reszty) cysteiny w miejscu permisywnym lub miejscach permisywnych w obrębie swej domeny katalitycznej.

45. Wektor białkowy według zastrz. 43, znamienny tym, ze wymienioną adenylocyklazę stanowi adenylocyklaza nietoksyczna albo detoksyfikowana.

46. Wektor białkowy według zastrz. 43, znamienny tym, że wymienioną genetycznie zmodyfikowaną adenylocyklazę stanowi skrócona adenylocyklaza Bordetella, pozbawiona całości lub części swej N-terminalnej domeny katalitycznej, zdolna do wiązania receptora CD11b.

47. Wektor białkowy według zastrz. 46, znamienny tym, że wymienioną adenylocyklazę stanowi skrócona adenylocyklaza Bordetella pertussis pozbawiona reszt 1-373.

48. Wektor białkowy według zastrz. 41, znamienny tym, że adenylocyklaza pochodzi z Bordetella pertussis.

49. Wektor białkowy według zastrz. 41, znamienny tym, że wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi lek chemicznie lub genetycznie sprzężony ze wymienioną adenylocyklazą.

50. Wektor białkowy według zastrz. 41, znamienny tym, że wymieniony lek stanowi lek przeciwzapalny.

51. Wektor białkowy według zastrz. 41, znamienny tym, że wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi epitop albo antygen.

52. Wektor białkowy według zastrz. 51, znamienny tym, że wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z wewnątrzkomórkowego antygenu komórki bakteryjnej, antygenu komórki nowotworowej, antygenu wirusowego, antygenu grzybowego i antygenu komórki pasożyta.

53. Wektor białkowy według zastrz. 52, znamienny tym, że wymieniony antygen wybrany jest z grupy składającej się z antygenu poliowirusa, antygenu wirusa HIV, antygenu wirusa grypy, antygenu wirusa zapalenia opon i splotów naczyniowych oraz antygenu nowotworowego.

54. Wektor białkowy według zastrz. 51, znamienny tym, że wymienioną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania stanowi epitop sprzężony chemicznie z genetycznie zmodyfikowaną adenylocyklazą zawierającą genetycznie wstawioną resztę (reszty) cysteiny w miejscu permisywnym lub miejscach permisywnych w swej domenie katalitycznej.

55. Wektor białkowy według zastrz. 41, znamienny tym, że wymieniona cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest wstawiona do domeny katalitycznej wymienionej adenylocyklazy Bordetella pertussis.