PL208972B1 - Zastosowanie selektywnego modulatora receptora estrogenu - Google Patents

Zastosowanie selektywnego modulatora receptora estrogenu

Info

Publication number
PL208972B1
PL208972B1 PL352993A PL35299300A PL208972B1 PL 208972 B1 PL208972 B1 PL 208972B1 PL 352993 A PL352993 A PL 352993A PL 35299300 A PL35299300 A PL 35299300A PL 208972 B1 PL208972 B1 PL 208972B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
hcl
rats
ovx
dhea
fat
Prior art date
Application number
PL352993A
Other languages
English (en)
Other versions
PL352993A1 (pl
Inventor
Fernand Labrie
Yves Deshaies
Denis Richard
Celine Martel
Andre Marette
Original Assignee
Endorech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Endorech filed Critical Endorech
Publication of PL352993A1 publication Critical patent/PL352993A1/pl
Publication of PL208972B1 publication Critical patent/PL208972B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/453—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with oxygen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest nowe zastosowanie selektywnego modulatora receptora antygenu („SERM”) do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania otyłości (zwłaszcza brzusznej otyłości) i zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia lub hamowania nabywania nienormalnej oporności na insulinę u podatnych ciepłokrwistych zwierząt, w tym ludzi, selektywnego modulatora receptora estrogenu („SERM”).
Związkiem stosowanym według wynalazku jest EM-652 · HCl (również nazywany EM-01538):
EM-652 · HCl daje dodatkowe korzyści w porównaniu z innymi SERM, takimi jak EM-800, ponieważ nie zawiera grup piwaloilowych, które mogą zwiększać ryzyko spadku poziomów karnityny w osoczu.
Dotychczasowy stan techniki
Otyłość, stan cechujący się nadmiernym otłuszczeniem ciała, jest dobrze znanym czynnikiem ryzyka dla wielu chorób, takich jak choroby sercowo-naczyniowe, nadciśnienie, cukrzyca i rak piersi. Ponadto, osobisty wygląd gra ważną rolę w ogólnym dobrym samopoczuciu większości ludzi.
Zwykłe terapie otyłości, takie jak różne diety (w tym dieta ograniczenia pokarmu), programy utraty masy i ćwiczenia dają różne stopnie powodzenia u różnych ludzi. Jednakże pozostaje zapotrzebowanie na inne techniki dla tych, którzy osiągają niedostateczne wyniki w dotychczas stosowanych technikach lub jako uzupełnienie dotychczas stosowanych technik.
Ostatnio ujawniono pewne związki agonistyczne/antagonistyczne estrogenu do leczenia lub zapobiegania otyłości: raloksyfen i pokrewne związki w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP 0 659 423 A1; zwią zki agonistyczne estrogenu mają ce czą stki benzotiofenowe w europejskim zgł oszeniu patentowym nr EP 0 716 855 A2; 3,4-difenylochromany w międzynarodowym zgłoszeniu nr PCT/DK96/00011; naftylowy związek agonistyczny/antagonistyczny estrogenu w międzynarodowym zgłoszeniu nr PCT/IB95/00286.
Opisano także, że tamoksyfen, inny związek agonistyczny/antagonistyczny estrogenu, zapobiega indukowanemu sulpirydem przyrostu masy ciała u samic szczurów (Baptista i in., Pharmacol., Biochem. Behav. (1997), 57 (1/2), 215-222). Podano także, że tamoksyfen naśladuje działanie estradiolu na pobór pokarmu, masę ciała i budowę ciała u szczurów (Wade i in., American Journal of Physiology 1993, 33 (6), R1219-1223).
DHEA ma również korzystny wpływ w leczeniu i/lub zapobieganiu otyłości. U dorosłych szczurów Sprague-Dawley, Schwartz (u Kenta, Geriatrics 37: 157-160, 1982) zauważył, że masa ciała zmniejszyła się o 600 do 550 g dzięki DHEA bez wpływu na pobieranie pokarmu. Schwartz (Cancer 39: 1129-1132, 1979) zauważył, że myszy C3H pobierające DHEA (450 mg/kg, 3 razy tygodniowo) przybierały znacząco mniej na wadze i żyły dłużej niż kontrolne zwierzęta, miały mniej tłuszczu w ciele i były bardziej aktywne. Zmniejszenie masy cia ła osiągnięto bez utraty apetytu lub ograniczeń pokarmowych. Ponadto, DHEA może zapobiegać przyrostowi masy ciała u zwierząt tuczonych (u Kenta, Geriatrics 37: 157160, 1982).
Podawanie DHEA chudym szczurom Zucher zmniejszyło przyrost masy ciała pomimo większego poboru pokarmu. Potraktowane zwierzęta miały więc mniejsze całkowite poduszki tłuszczu, sugerując, że DHEA zwiększa metabolizm pokarmów, powodując niższe przyrosty masy ciała i akumulację tłuszczu (Svec i in., Proc. 2nd Int. Conf. Cortisol and Anti-Cortisols, Las Vegas, Nevada, USA, str. 56 abst., 1997).
PL 208 972 B1
Otyłość ulegała poprawie u mutantów myszy AVY (Yen i in., Lipids 12: 409-413,1977) i u szczurów Zucker (Cleary i Zisk, Fed. Proc. 42: 536,1983). Potraktowane DHEA myszy C3H wyglądały młodziej niż kontrolne (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129-1132, 1979).
Tłuszcz brzuszny związano z czynnikami ryzyka metabolicznego dla choroby wieńcowej (Imbault i in., Metabolism 1999, 48 (3), 355-62; Ledoux i in. (CMAJ 1997,157. Suppl. 1; 46-53).
Streszczenie wynalazku
Celem niniejszego wynalazku jest zmniejszenie ilości tkanki tłuszczowej, zwłaszcza tłuszczu brzusznego.
Innym celem niniejszego wynalazku jest zmniejszenie ryzyka choroby wieńcowej serca i innych chorób lub stanów, dla których otyłość lub nadmiar tkanki tłuszczowej są czynnikami ryzyka.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia i/lub osłabiania rozwoju otyłości (zwłaszcza brzusznej otyłości) i zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia lub zmniejszania ryzyka rozwoju nienormalnej oporności na insulinę u podatnych ciepłokrwistych zwierząt, w tym ludzi, selektywnego modulatora receptora estrogenu („SERM”).
Związkiem stosowanym według wynalazku jest EM-652 · HCl (również nazywany EM-01538):
Lek zawierający związek o powyższym wzorze, podaje się pacjentowi potrzebującemu takiej terapii lub hamowania, w terapeutycznie skutecznej ilości, w obecności lub bez farmaceutycznego rozcieńczalnika, zaróbki lub nośnika.
Selektywny modulator receptora estrogenu, jego farmaceutycznie dopuszczalną sól chlorowodorek, podaje się dla zredukowania ilości tłuszczu brzusznego lub zmniejszenia akumulacji tłuszczu brzusznego.
W innej odmianie, prekursor sterydu pł ciowego (np. dehydroepiandrosteron, siarczan dehydroepiandrosteronu, Androst-5-eno-3b,17b-diol) podaje się jako dodatek do selektywnego modulatora receptora estrogenu (SERM) do terapii otyłości lub do hamowania przyrostu masy ciała. Ludzie w wieku ponad 50 lat powinni reagować dobrze na kombinowaną terapię , prawdopodobnie dlatego, ż e poziomy prekursora niekorzystnie spadają z wiekiem.
Tak więc, w tym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie SERM według wynalazku do wytwarzania leku do terapii otyłości lub hamowania przyrostu masy ciała, która obejmuje podawanie osobnikowi, potrzebującemu takiego hamowania lub terapii, terapeutycznie skutecznej ilości, w obecności lub bez farmaceutycznego rozcieńczalnika lub nośnika, SERM i skutecznej ilości co najmniej jednego prekursora sterydu płciowego wybranego z grupy obejmującej dehydroepiandrosteron, siarczan dehydroepiandrosteronu, androst-5-eno-3b,17b-diol i związki przekształcane in vivo w dowolny z wymienionych prekursorów.
W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie SERM według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub i zmniejszania ryzyka rozwoju oporności na insulinę, które obejmuje podawanie osobnikowi potrzebującemu takiej terapii lub zmniejszania, leczniczo skutecznej ilości SERM.
W pewnych odmianach, skuteczną ilość co najmniej jednego prekursora sterydu płciowego wybranego z grupy obejmującej dehydroepiandrosteron, siarczan dehydroepiandrosteronu, androst-5-eno-3b,17b-diol i związki przekształcane in vivo w którykolwiek z nich podaje się również jako część kombinowanej terapii.
Zestaw do terapii otyłości zawiera pierwszy pojemnik, który zawiera SERM i drugi pojemnik, który zawiera co najmniej jeden prekursor sterydu płciowego wybrany z grupy obejmującej dehydro4
PL 208 972 B1 epiandrosteron, siarczan dehydroepiandrosteronu, androst-5-eno-3b,17b-diol i związki przekształcane in vivo w którykolwiek z nich.
Farmaceutyczną zaróbkę, nośnik lub rozcieńczalnik można również umieścić w jednym lub kilku pojemnikach i mogą one obejmować konserwanty i inne dodatki znane w dziedzinie. Powyższe substancje można również dołączać do dowolnego składnika czynnego użytego tutaj.
W niniejszym wynalazku selektywny modulator receptora estrogenu (SERM) oznacza zwią zek, który bezpośrednio lub przez czynny metabolit działa jak antagonista receptora estrogenu („antyestrogen”) w tkance piersi, jak też daje estrogenopodobne działanie na tłuszcz w ciele, na tkankę kości i na poziomy cholesterolu w osoczu (to jest redukując ilość cholesterolu w osoczu).
Nie sterydowe związki działające jako antagoniści receptora estrogenu in vitro lub w tkance piersi człowieka lub szczura (zwłaszcza jeśli związek działa jako antyestrogen na komórki ludzkiego raka piersi) działają prawdopodobnie jako SERM.
Nie sterydowe antyestrogeny, które testowaliśmy i stwierdziliśmy, że działają jako SERM, obejmują EM-800, EM652, EM-652 · HCl (EM-01538), raloksyfen, tamoksyfen, idoksyfen, torimefen, LY 353381, LY 335563, GW 5638 i droloksyfen (opisane bardziej szczegółowo poniżej). SERM, według odmian wynalazku, korzystnie podaje się przy tej samej dawce, jak znana w dziedzinie, gdy te związki stosuje się jako antyestrogeny.
Nie wiążąc się z żadną teorią sądzi się, że SERM, z których wiele korzystnie ma dwa aromatyczne pierścienie związane jednym do dwu atomów węgla, powinny oddziaływać z receptorem estrogenu dzięki powyższej części cząsteczki, którą najlepiej rozpoznaje receptor.
Takie SERM również mają łańcuchy boczne, które mogą selektywnie powodować antagonistyczne właściwości w tkankach piersi i śluzówki macicy bez znaczących antagonistycznych właściwości wobec innych tkanek, zwłaszcza kości. Tak więc, SERM mogą korzystnie działać jako antyestrogeny w piersi i śluzówce macicy, podczas gdy niespodziewanie i korzystnie wykazują estrogenopodobną aktywność na tłuszcz ciała.
Zastosowanie według wynalazku obejmuje również korzystnie hamowanie dodatkowego przyrostu masy ciała lub korzystnie zapewnienie zmniejszenia masy ciała, nawet jeśli nie osiągnie się normalnej masy.
W niniejszym wynalazku, termin „otył o ść” implikuje nadmiar tkanki tł uszczowej, który prowadzi do przyrostu masy ciała. Zastosowania do zapobiegania i terapii według wynalazku obejmują inhibicję przyrostu masy ciała i indukcję utraty masy. Zastosowanie według wynalazku obejmuje terapię ludzi z otył o ś cią przez zmniejszenie masy do normalnej (i zachowanie tej masy).
Zastosowanie według wynalazku obejmuje również zapobieganie otyłości dla osób, które są podatne na podleganie takiej chorobie. Pacjenci potrzebujący tego, według wynalazku obejmują tych, którzy mają nadwagę (w porównaniu z medycznie rozpoznanymi normami) lub są zagrożeni nadwagą.
SERM można również stosować do obniżania poziomów triglicerydów we krwi według wynalazku. Np., EM800 (opisany w wynalazku) uważa się za skuteczny dla tego celu.
Pacjent potrzebujący takiej terapii lub zmniejszania ryzyka wystąpienia danej choroby lub stanu to pacjent, który ma albo uzyskał diagnozę takiej choroby lub pacjent, który jest podatny na zapadnięcie na taką chorobę.
Wynalazek jest zwłaszcza przydatny dla osób, które wskutek czynników dziedzicznych, środowiskowych lub innych znanych czynników ryzyka, są zagrożone bardziej niż ogólna populacja wystąpieniem stanu, do którego odnosi się niniejszy wynalazek.
Jeśli nie podano inaczej, korzystna dawka czynnych związków według wynalazku jest identyczna dla obu celów leczniczych i profilaktycznych. Dawka dla każdego składnika czynnego omówionego tutaj jest taka sama niezależnie od leczonej choroby (lub traktowanej profilaktycznie).
Gdy omawia się dwa i więcej różnych środków czynnych jako część kombinowanej terapii (np. inhibitor enzymu i antyandrogen), podaje się raczej wiele różnych związków niż pojedynczy związek mający liczne aktywności.
Jeśli nie podano inaczej, termin „związek” i dowolna związana struktura cząsteczkowa mogą obejmować ich dowolne możliwe stereoizomery, w postaci racemicznej mieszaniny lub w postaci optycznie czynnej.
Jeśli nie podano inaczej lub gdy tak wyniknie z kontekstu, dawki w wynalazku odnoszą się do masy czynnych związków bez farmaceutycznych zaróbek, rozcieńczalników, nośników lub innych składników, chociaż takie dodatkowe składniki dołącza się korzystnie, jak pokazano w przykładach w wynalazku.
PL 208 972 B1
Dowolne postaci dawki (kapsułka, tabletka, zastrzyk lub tym podobne), zwykle stosowane w przemyś le farmaceutycznym, są odpowiednie do stosowania w wynalazku, a terminy „zaróbka”, „rozcieńczalnik” lub „nośnik” obejmują takie nieczynne składniki, jakie typowo umieszcza się, wraz ze składnikami czynnymi, w takich postaciach dawek w przemyśle. Np., odpowiednie są typowe kapsułki, pigułki, powłoki jelitowe, stałe lub ciekłe rozcieńczalniki lub zarobki, środki smakowe, konserwanty lub tym podobne.
W pewnych odmianach, można stosować przedleki składników czynnych omówionych w wynalazku (to jest związki, które przekształcają się in vivo do składników czynnych). Znanych jest w przemyśle farmaceutycznym wiele grup funkcyjnych przekształcających się in vivo w grupy funkcyjne czynnych związków omówione w wynalazku, patrz np. rozdz. 5 „Design and Application of Prodrugs”, A Textbook of Drug Design & Development, red. Bundgaard & Larsen, Harwood Academic Publishers GmbH (Chur, Szwajcaria, 1991).
Przedleki często mogą dawać lepszą biodostępność, trwałość przy przechowywaniu i/lub łatwość wytwarzania niż odpowiednie czynne związki.
Wszystkie składniki czynne użyte w dowolnym z leków omówionych w wynalazku można komponować w kompozycje farmaceutyczne, które również obejmują jeden lub więcej innych składników czynnych.
Alternatywnie, można je podawać oddzielnie, lecz dostatecznie jednocześnie w czasie tak, że pacjent ostatecznie ma podwyższone poziomy we krwi lub inaczej odnosi korzyści z każdego ze składników czynnych (lub strategii) równocześnie.
W pewnej korzystnej odmianie, np. jeden lub wię cej składników czynnych komponuje się w pojedynczą kompozycję farmaceutyczną.
W odmianach występuje zestaw, który obejmuje co najmniej dwa odrębne pojemniki, w których zawartość co najmniej dwu odrębnych pojemników w którym zawartość co najmniej jednego pojemnika różni się, w całości lub w części, od zawartości co najmniej jednego innego pojemnika w odniesieniu do składników czynnych zawartych w nich.
Dwa lub więcej różnych pojemników stosuje się w terapiach kombinacyjnych według wynalazku. Terapie kombinacyjne omówione tutaj obejmują również zastosowanie jednego składnika czynnego kombinacji do wytwarzania leku do leczenia (lub zapobiegania) danej chorobie, gdzie leczenie lub zapobieganie obejmuje kolejny składnik czynny lub strategię kombinacji.
Tłuszcz brzuszny uważa się za różny i występujący w nieobecności, ogólnej otyłości ciała. Sądzi się też, że jest on większym czynnikiem ryzyka w chorobie serca. Tłuszcz brzuszny reaguje korzystnie na związek SERM zastosowany w niniejszym wynalazku.
SERM według wynalazku, o wzorze powyżej, nie wykazuje niepożądanego działania estrogennego w śluzówce macicy, co jest bardzo ważnym udoskonaleniem w odniesieniu do terapii SERM stosowanych w niektórych dotychczasowych sposobach.
Uważa się, że SERM użyty w zastosowaniu według wynalazku korzystnie obniżają poziomy triglicerydów we krwi, jak również oporność na insulinę.
W korzystnych odmianach omówionych w wynalazku, działanie SERM jest uzupełniane DHEA lub podobnymi prekursorami sterydu płciowego.
Nie wiążąc się z żadną teorią, jednym z wytłumaczeń synergii uzyskiwanej przez połączenie SERM i prekursorów mogłyby być co najmniej częściowo różnice w ich mechanizmach działania. DHEA, np. wydaje się zwiększać metabolizm pokarmów bez hamowania apetytu.
EM652 · HCl, będący SERM, zastosowany w obecnym wynalazku hamuje pobieranie pokarmów.
Krótki opis rysunków
Figura 1. Pokazuje wpływ 35-tygodniowej terapii zwiększonymi dawkami (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1 mg/kg, doustnie, raz dziennie) SERM EM-800, raloksyfenem, tamoksyfenem i nie aktywnego enancjomeru, EM-776 (enancjomer EM-800) na łączną ilość tłuszczu w ciele u szczura z wyciętymi jajnikami. Dane przedstawiono jako średnie ± standardowe odchylenie. **p < 0,01 doświadczalne względem odpowiednich kontrolnych.
Figura 2. Pokazuje wpływ 20-dniowej terapii na przyrost masy ciała (A), zwiększenie ilości białka (B) i zwiększenie ilości tłuszczu (C) u szczurów normalnych, szczurów z wyciętymi jajnikami i szczurów z wyciętymi jajnikami potraktowanych SERM EM652 · HCl lub estradiolem. Dane wyraż a się w gramach (g) jako średnie ± standardowe odchylenie. *p < 0,05 względem nietkniętej grupy;
'p < 0,05 względem grupy OVX + E2 (tylko dla grupy EM652 · HCl).
PL 208 972 B1
Figura 3. Pokazuje wpływ 20-dniowej terapii na skumulowane pobieranie pokarmów u szczurów normalnych, szczurów z wyciętymi jajnikami i szczurów z wyciętymi jajnikami potraktowanych EM652 · HCl lub estradiolem. Dane wyrażono w gramach (g).
Figura 4. Pokazuje wpływ 20-dniowej terapii na energię ciała w postaci białek (A) i energię ciała w postaci tł uszczu (B) u szczurów normalnych, szczurów z wycię tymi jajnikami i szczurów z wyci ę tymi jajnikami potraktowanych EM652 · HCl lub estradiolem. Dane wyrażono w kilodżulach (kJ) jako średnie ± standardowe odchylenie; *p < 0,05 względem nietkniętej grupy; Tp < 0,05 względem grupy OVX + E2 (tylko dla grupy EM652 · HCl).
Figura 5. Pokazuje wpływ 20-dniowej terapii na poziomy insuliny w osoczu i poziomy glukozy w osoczu u szczurów normalnych, szczurów z wyciętymi jajnikami i szczurów z wyciętymi jajnikami potraktowanych EM652 · HCl lub estradiolem. Dane wyrażono w nmol/l jako średnie ± standardowe odchylenia; *p < 0,05 względem nietkniętej grupy.
Figura 6. Pokazuje wpływ 20-dniowej terapii na parametry białej tkanki tłuszczowej: masa tkanki tłuszczowej pachwinowej (A) i zaotrzewnowej (C) (dane wyrażone w gramach (g) jako średnie ± standardowe odchylenie), aktywność lipazy lipoproteinowej białej tkanki tłuszczowej pachwinowej (B) i zaotrzewnowej (D) (dane wyrażone w μU/g białka jako średnie ± standardowe odchylenie; *p < 0,05 względem nietkniętej grupy; łp < 0,05 względem grupy OVX + E2 (tylko dla grupy EM652 · HCl)), u szczurów normalnych, szczurów z wyciętymi jajnikami i szczurów z wyciętymi jajnikami potraktowanych EM652 · HCl lub estradiolem.
Figura 7. Pokazuje wpływ 20-dniowej terapii na parametry międzyłopatkowej brunatnej tkanki tłuszczowej: (A) masa brunatny tkanki tłuszczowej (dane wyrażone w gramach (g) jako średnie ± standardowe odchylenie, *p < 0,05 względem nietkniętej grupy; łp < 0,05 względem grupy OVX + E2 (tylko dla grupy EM-652 · HCl)); (B) zawartość białka (dane wyrażone w % masy tkanki jako średnie ± standardowe odchylenie; * p < 0,05 względem nietkniętej grupy; t p < 0,05 względem grupy OVX + E2 (tylko dla grupy EM652 · HCl)), (C) aktywności lipazy lipoproteinowej (dane wyrażone w μυ/g białka).
Figura 8. Pokazuje wpływ 20-dniowej terapii na masę łydki (dane wyrażone w gramach (g) jako średnie ± standardowe odchylenie) i lipazy lipoproteinowej (dane wyrażone w μυ/g białka jako średnie ± standardowe odchylenie; *p < 0,05 względem nietkniętej grupy); u szczurów normalnych, szczurów z wyciętymi jajnikami i szczurów z wyciętymi jajnikami potraktowanych estradiolem i EM652 · HCl.
Szczegółowy opis wynalazku
EM652 · HCl, będący SERM, zastosowany w obecnym wynalazku hamuje pobieranie pokarmów, daje niespodziewaną korzyść wykazywania niewielkiego lub żadnego działania estrogennego na śluzówkę macicy, w odróżnieniu od SERM znanych w dziedzinie.
Korzystnie, SERM według wynalazku jest optycznie czynny i zawiera więcej niż 50% związku stereoizomerycznego mającego n absolutną konfigurację S na węglu 2.
Również korzystnie, ze względu na trwałość i rozpuszczalność w wodzie (biodostępność) SERM według wynalazku jest solą związku EM652, chlorowodorkiem.
Związkiem zastosowanym według wynalazku jest EM652 · HCl (również nazywany EM-01538):
EM652 · HCl daje dodatkowe korzyści w porównaniu z innymi SERM, takimi jak EM-800, ponieważ nie zawiera grup piwaloilowych, które mogą zwiększać ryzyko spadku poziomów karnityny w osoczu.
Inne SERM obejmują tamoksyfen ((Z)-2-[4-(1,2-difenylo-1-butenylo)]-N,N-dimetyloetanaminę) (dostępną z Zeneca, Wielka Brytania), toremifen (dostępny z Orion-Farmos Pharmaceuticla, Finlandia, lub Schering-Plough), droloksyfen i CP-336156 (cis-1R-[41-pirolidynoetoksyfenylo]-2S-fenylo-6-hydroksy-1,2,3,4-tetrahydronaftalen, D-(-)-winian) (Pfizer Inc., USA opisany w opisie patentowym StaPL 208 972 B1 nów Zjednoczonych Ameryki nr 5 889 042) (również nazywany lasofoksyfenem), raloksyfen (Eli Lilly and Co., USA), LY 335563 i LY 353381 (Eli Lilly and Co., USA, opisany w publikacji WO 98/45287, WO 98/45288 i WO 98/45286), idoksyfen (SmithKline Beecham, USA), lewormeloksyfen (3,4-trans-2,2-dimetylo-3-fenylo-4-[4-(2-(2-(pirolidyn-1-ylo)etoksy)fenylo]-7-metoksychroman) (Novo Nordisk, A/S, Dania) ujawniony u Shalmi i in., publikacje WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037, WO 97/25038; i Korsgaarda i in. publikacja WO 97/25036), GW5638 (opisany przez Willsona i in., Endocrinology, 138 (9), 3901-3911, 1997) i pochodne indolu (ujawnione przez Millera i in. EP 0802183A1) oraz TSE 424 i ERA 923 opracowane przez Wyeth Ayerst (USA) i ujawnione w JP10036347 (American home products corporation) i niesterydowe pochodne estrogenu opisane w WO 97/32837.
Inne SERM według wynalazku ujawniono w: WO 99/07377; WO 98/48806; EP 0823437A2; EP 0838464A1; EP 0835867A1, EP 0835868A1; EP 0792641A1; EP 0873992A1 i EP 0895989A1.
Można stosować dowolne SERM stosownie do potrzeb skuteczności (jak zaleca wytwórca do leczenia i/lub zapobiegania osteoporozie lub rakowi piersi). Odpowiednie dawki są znane w dziedzinie. Można stosować dowolny inny niesterydowy antyestrogen dostępny w handlu. Można stosować dowolny związek mając aktywność podobną do SERM (przykład: raloksyfen).
EM652 · HCl, będący SERM, zastosowany w obecnym wynalazku hamuje pobieranie pokarmów, zastosowane według wynalazku korzystnie podaje się w zakresie dawek pomiędzy 0,01 do 10 mg/kg masy ciała dziennie (korzystnie 0,05 do 1,0 mg/kg), korzystnie 60 mg dziennie, zwłaszcza 20 mg dziennie dla osoby o przeciętnej masie ciała przy podawaniu doustnym lub w zakresie dawek pomiędzy 0,003 do 3,0 mg/kg masy ciała dziennie (korzystnie 0,015 do 0,3 mg/kg masy ciała), korzystnie 20 mg dziennie, zwłaszcza 10 mg dziennie dla osoby o przeciętnej masie ciała przy podawaniu pozajelitowym (to jest domięśniowym, podskórnym lub przezskórnym).
Korzystnie, SERM podaje się razem z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem jak opisano poniżej.
Korzystnymi prekursorami sterydów płciowych są dehydroepiandrosteron (DHEA) (dostępny z Diosynth Inc., Chicago, Illinois, USA), jego przedleki (dostępne z Steraloids, Wilton, New Hampshire, USA), 5-androsteno-3b,17b-diol i jego przedleki 3-octan androst-5-eno-3b,17b-diolu i dihemibursztynian androst-5-eno-3b,17b-diolu (dostępny z Steraloids, Wilton, New Hampshire USA).
Prekursor sterydu płciowego można komponować jako alkoholowy żel zawierający 2,0 do 10% kaprylowokaprynowego triglicerydu (Neobee M-5); 10 do 20% glikolu heksylenowego; 2,0 do 10% eteru monometylowego glikolu dietylenowego (Transutol); 2,0 do 10% cyklometykonu (Dow Corning 345); 1,0 do 2% alkoholu benzylowego i 1,0 do 5,0% hydroksypropylocelulozy (Klucel HF).
PL 208 972 B1
Nośnik (dla SERM lub prekursora) może również obejmować różne dodatki zwykle stosowane w przemyś le farmaceutycznym. Np., moż na stosować ś rodki zapachowe, przeciwutleniacze, perfumy, środki żelujące, środki zagęszczające takie jak karboksymetylocelulozę, surfaktanty, stabilizatory, środki nawilżające, środki barwiące i inne podobne środki.
Gdy składniki czynne podaje się przezskórnie, miejsce nakładanie na skórę powinno się zmieniać w celu uniknięcia nadmiernego lokalnego stężenia składnika czynnego i możliwej nadmiernej stymulacji skóry i gruczołów łojowych przez androgenne metabolity prekursora sterydu płciowego.
W kompozycji farmaceutycznej do doustnego podawania, DHEA lub inny prekursor jest korzystnie obecny w stężeniu pomiędzy 5 i 98% wagowych w odniesieniu do łącznej masy kompozycji, korzystniej pomiędzy 50 i 98%, zwłaszcza pomiędzy 80 i 98%.
Pojedynczy prekursor, taki jak DHEA, może być jedynym składnikiem czynnym lub alternatywnie można stosować liczne prekursory i/lub ich analogi (np., kombinację DHEA, DHEA-S, 5-diolu lub kombinację dwu lub większej liczby związków przekształcanych in vivo w DHEA, DHEA-S lub 5-diol, lub kombinację DHEA lub 5-diolu i jednego lub większej liczby ich analogów, które przekształca się w DHEA lub 5-diol in vivo, itp.
Poziom w krwi DHEA jest końcowym kryterium adekwatności dawki, który uwzględnia indywidualną zmienność absorpcji i metabolizmu.
Korzystnie, prowadzący klinicysta będzie, zwłaszcza na początku terapii, monitorował ogólną reakcję indywidualnego pacjenta i poziomy w osoczu DHEA (w porównaniu z korzystnymi stężeniami w osoczu omówionymi powyżej) i monitorował ogólną reakcję pacjenta na terapię, ustawiając dawki tak, jak to jest potrzebne gdy metabolizm lub reakcja na terapię danych pacjentów jest nietypowa.
Zastosowanie SERM do wytwarzania leku do terapii według wynalazku jest odpowiednie dla nieoznaczonej kontynuacji. Można się spodziewać, że terapia DHEA i/lub 5-diolem lub innym prekursorem, będzie po prostu zachowywała poziomy DHEA w zakresie podobnym do występującego naturalnie u kobiet przed menopauzą (stężenie w osoczu pomiędzy 4 i 10 μg na litr) lub naturalnie u młodych dorosłych mężczyzn (stężenie w osoczu pomiędzy 4 i 10 μg na litr).
Związek SERM i/lub prekursor sterydu płciowego można również podawać drogą doustną i może być skomponowany z konwencjonalnymi farmaceutycznymi zaróbkami, np. osuszoną rozpryskowo laktozą, mikrokrystaliczną celulozą i stearynianem magnezu w tabletki lub kapsułki do doustnego podawania.
Czynną substancję można przetworzyć w rdzenie tabletek lub drażetek przez mieszanie z ciałem stałym, sproszkowanymi nośnikami, takimi jak cytrynian sodu, węglan wapnia lub fosforan diwapnia oraz środkami wiążącymi, takimi jak poliwinylopirolidon, żelatyna lub pochodne celulozy, ewentualnie dodając również środki smarujące, takie jak stearynian magnezu, laurylosiarczan sodu, „Carbowax” lub poli(glikol etylenowy). Oczywiście, polepszające smak substancje można dodawać w przypadku doustnych postaci do podawania.
Jako dalsze postaci, można stosować zamykane kapsułki, np. z twardej żelatyny, jak też zamknięte miękkie żelatynowe kapsułki zawierające zmiękczacz lub plastyfikator, np. glicerynę. Zamykane kapsułki zawierają czynną substancję, korzystnie w postaci granulatu, np. w mieszaninie z wypełniaczami, takimi jak laktoza, sacharoza, mannitol, skrobiami, takimi jak skrobia ziemniaczana lub amylopektyna, pochodnymi celulozy, lub wysoce zdyspergowane kwasy krzemowe.
W miękkich żelatynowych kapsułkach, czynną substancję korzystnie rozpuszcza się lub zawiesza w odpowiednich cieczach, takich jak oleje roślinne lub ciekłe poli(glikole etylenowe).
Postaci mleczka, maści, żelu lub kremu są możliwe i powinny być dokładnie wcierane w skórę tak, aby nie było widać wyraźnie nadmiaru i skóra nie powinna być przemywana na takim obszarze, aż do chwili zajścia penetracji przez skórę, korzystnie co najmniej 4 godziny i korzystniej co najmniej 6 godzin.
Można stosować plaster na skórę do dostarczania prekursora lub SERM zgodnie ze znanymi technikami. Typowo nakłada się go na znacznie dłuższy czas, np. 1 do 4 dni, lecz typowo styka składnik czynny z mniejszą powierzchnią, co pozwala na powolne i stałe dostarczanie składnika czynnego.
Opracowane i stosowane liczne układy przezskórnego dostarczania są odpowiednie do podawania składnika czynnego według niniejszego wynalazku. Szybkość uwalniania jest typowo kontrolowana przez dyfuzję z matrycy lub przez przepuszczanie składnika czynnego przez kontrolującą membranę.
Mechaniczne aspekty układów przezskórnych są dobrze znane u szczurów i wyjaśniają je np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 162 037, 5 154 922, 5 135 480, 4 666 441, 4 624 665, 3 742 951, 3 797 444, 4 568 343, 5 064 654, 5 071 644 i 5 071 657, których opisy dołącza
PL 208 972 B1 się niniejszym jako odnośniki. Dodatkowe informacje dostarcza europejski opis patentowy nr 0279982 i brytyjskie zgł oszenie patentowe nr 2 185 187.
Urządzenie może być dowolnego ogólnego typu znanego w dziedzinie, w tym urządzeniem przezskórnego dostarczania z przylepną matryca i typu zbiornikowego. Urządzenie może obejmować zawierające lek matryce złożone z włókien, które absorbują składnik czynny i/lub nośnik. W urządzeniu typu zbiornika, zbiornik może być zdefiniowany przez polimerową membranę nieprzepuszczalną dla nośnika i dla składnika czynnego.
W urządzeniu przezskórnym samo urządzenie utrzymuje składnik czynny w kontakcie z żądaną zlokalizowaną powierzchnią skóry, w takim urządzeniu lepkość nośnika dla składnika czynnego jest mniej istotna niż dla kremu lub żelu. System rozpuszczalników dla urządzenia przezskórnego może obejmować, np. kwas oleinowy, mleczan liniowego alkoholu i glikol dipropylenowy lub inne układy rozpuszczalników znane w dziedzinie. Składnik czynny można rozpuszczać lub zawieszać w nośniku.
Dla zamocowania na skórze przezskórny plaster można zamontować na chirurgicznej taśmie przylepnej mającej otwór na samym środku. Środek przylepny jest korzystnie pokryty warstwą uwalniającą dla ochrony przed użyciem. Typowa substancja odpowiednia do uwalniania obejmuje polietylen i papier powlekany polietylenem i korzystnie powlekany silikonem dla ułatwienia usuwania. Aby zastosować urządzenie, warstwę uwalniającą po prostu odrywa się i część przylepną przykłada do skóry pacjenta.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 135 480, którego opis dołącza się jako odnośnik, Bannon i in. opisują alternatywne urządzenie mające nieprzylepną część do mocowania urządzenia na skórze.
Układ dostarczania przezskórnego lub przezśluzówkowego można również stosować jako nowy i ulepszony uk ł ad dostarczania do zapobiegania i/lub leczenia otyło ś ci.
Przykłady zastosowania SERM według wynalazku
P r z y k ł a d 1. Wpływ 35-tygodniowej terapii związkami według wynalazku na łączną ilość tłuszczu w ciele i masę ciała szczura z wyciętymi jajnikami
Materiały i sposoby
Zwierzęta i terapia
Zastosowano 10-12-tygodniowe samice szczurów Sprague-Dawley (Crl: CD (SD) Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Kanada) ważące w przybliżeniu 225-250 g na początku terapii. Zwierzęta zaaklimatyzowano do warunków środowiska (temperatura: 22 ± 3C°; wilgotność: 50 ± 20%; cykle 12 godzin światła - 12 godzin ciemności, włączanie światła o 07:15) przez 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu. Zwierzęta trzymano po 3 w klatce i miały swobodny dostęp do wody wodociągowej i granulowanego certyfikowanego pokarmu dla gryzoni (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO). Eksperyment prowadzono w warunkach zatwierdzonych przez Canadian Council on Animal Care według poradnika CCAC Guide for Care and Use of Experimental Animals.
276 szczurów rozstawiono przypadkowo w 23 grupy po 12 zwierząt jak następuje: 1) nietknięte kontrolne; 2) kontrolne OVX; 3 do 7) OVX + EM-800 (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 lub 1 mg/kg); 8 do 12) OVX + raloksyfen (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 lub 1 mg/kg); 13 do 17) OVX + tamoksyfen (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 lub 1 mg/kg); 18 do 22) OVX + EM-776 (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 lub 1 mg/kg); 23) OVX + estradiol (E2, implant). W dniu 1 badania, zwierzęta z odpowiednich grup pozbawiono obu jajników (OVX) pod znieczuleniem izofluranem. Jeden implant silastikowy estradiolu (E2) wstawiono podskórnie w części grzbietowej każdego zwierzęcia z grupy 13. Implanty miały następujące stężenia E2 i rozmiary: E2 (E2: cholesterol (1:100, wagowo)), 0,5 cm (długość), 0,125 cala (zewnętrzna średnica) i 0,062 cala (wewnętrzna średnica). Podczas przebiegu eksperymentu, implanty E2 zastępowano co miesiąc. Terapię EM-800, raloksyfenem, tamoksyfenem i EM-776 lub nośnikiem (4% etanolu, 4% poli(glikolu etylenowego)-600, 1% żelatyną i 0,9% NaCl) rozpoczęto w dniu 2 badania. Odpowiedni związek lub sam nośnik podawano raz dziennie przez doustny zgłębnik w ilości 0,5 ml/szczura przez 37 tygodni. W przybliżeniu 24 godziny po ostatnim dawkowaniu, wyposzczone przez noc zwierzęta zabito przez wykrwawienie z tętnicy brzusznej pod znieczuleniem izofluranem.
Skład tłuszczu w ciele
Po 35 tygodniach terapii, pojedynczym szczurom pod znieczuleniem izofluranem zbadano szkielet całego ciała, jak też ich prawą kość udową skanując z użyciem absorpcjometrii rentgenowskiej o podwójnej energii (DEXA; QDR 4500A, Hologic, Waltham, MA) i oprogramowania Regional High Resolution Scan. Pole skanowania użyte dla całego ciała wynosiło 30,492 na 17,912 cm, roz10
PL 208 972 B1 dzielczość wynosiła 0,1512 na 0,0640 cm i szybkość skanowania wynosiła 2,499 mm/s. Określono skład tłuszczu w ciele.
Analiza statystyczna
Dane wyrażono jako średnie ± standardowe odchylenie. Istotność statystyczną określono według wielozakresowego testu Duncana-Kramera (1956).
Wyniki
Wpływ zwiększania dziennych doustnych dawek EM-800, raloksyfenu, tamoksyfenu i EM-776 na zawartość tłuszczu w ciele według pomiaru in vivo DEXA zilustrowano na fig. 1. Widać z tego, że EM-800 w najniższej dawce 0,01 mg/kg zmniejsza o 78% indukowaną OVX stymulację tłuszczu ciała, raloksyfen jest mniej aktywny niż EM-800, podczas gdy EM-776, enancjomer EM-800, nie miał znaczącego wpływu.
W tablicy 1 opisano wpł yw EM-800 lub raloksyfenu na masę ciał a u szczurów z wycię tymi jajnikami. Dokonano porównania ze szczurami kontrolnymi nietkniętymi i z wyciętymi jajnikami.
Widać również, że małe dawki EM-800 pozwalają osiągnąć kontrolę masy podobną jak znacząco większe ilości raloksyfenu (np. 0,03 mg/kg EM-800 daje podobne wyniki jak 0,3 mg/kg raloksyfenu). Oba zasadniczo odwracają indukowany wycięciem jajników przyrost masy ciała przy dużo wyższych dawkach.
T a b l i c a 1
Grupa Masa ciała przy sekcji (g)
Nietknięte kontrolne 356 ± 16**
Kontrolne OVX 491 ± 16
OVX + EM-800 (0,01 mg/kg) 385 ± 17**
(0,03 mg/kg) 364 ± 10**
(0,1 mg/kg) 369 ± 17**
(0,3 mg/kg) 359 ± 7**
(1 mg/kg) 368 ± 6**
OVX + OVX + raloksyfen (0,01 mg/kg) 439 ± 13*
(0,03 mg/kg) 451 ± 14*
(0,1 mg/kg) 389 ± 14**
(0,3 mg/kg) 367 ± 9**
(1 mg/kg) 342 ± 12**
P r z y k ł a d 2. 11-miesięczna terapia kombinowana związkami według wynalazku
1. Substancje testowe
1.1 Związki testowane:
DHEA: Dostępne ze Steraloids Inc. Wilton, NH Partia: H137
EM-800 syntetyzowano w UCPO Department of Lab. of Mol. Endo., CHUL
1.2 Nośnik
a) Żelatyna Lab-Grade, ACP Chemicals Inc., Montreal, Qc Partia nr F0195
b) Etanol: Commercial Alcohols Inc., Brampton, Ontario Partia nr 11296
c) Poli(glikol etylenowy)-600 (PEG-600): Omega Chemical Company Inc., Levis, Quebec.
Partia nr: 00-0117-EZ
d) Normalna solanka: 0,9% chlorek sodu do płukania USP Abbott Laboratories Limited, St-Laurent, Qc.
e) Glikol propylenowy (1,2-propanodiol, PPG): Sigma Chemical Co., St-Louis, MO g) Nośnik 1: 4% ETOH-4% PEG-600-1% żelatyny-0,9% NaCl-H2O do podskórnej iniekcji
PL 208 972 B1
h) Nośnik 2: 50% ETOH-50% PPG do stosowania miejscowego
2. Dane zwierząt doświadczalnych:
2.1 Gatunek: Rattus norvegicus
2.2 Szczep: szczur Sprague-Dawley (Crl: CD® (SD) BR VAF/Plus™)
2.3 Płeć: żeńska
2.4 Źródło: Charles River Canada Inc. 188 Lasalle Road, St. Constant, Quebec 1-800-561-4975
2.5 Wiek na początku dawkowania: szczury G18-29 miały po 16 tygodni
2.6 Zamieszkanie i odżywianie
a) Zamieszkanie: szczury trzymano po 2-3 w klatkach z pudełek od butów. Wszystkie klatki były wyraźnie znakowane etykietami wskazującymi protokół, liczbę, numer grupy i numer zwierzęcia.
b) Podczas badania, warunki środowiskowe w pokoju są kontrolowane (docelowe warunki: temperatura 20 do 25°C; wilgotność: 50 ± 20%). Warunki oświetlenia: 12 godzin światła: 12 godzin ciemności.
c) Pokarm i woda: pokarm gryzonia (granulki) i woda z kranu będzie dostarczana do woli.
2.7 Okres aklimatyzacji: co najmniej dwa tygodnie.
2.8 Randomizacja: szczury przypisze się przypadkowo do każdej grupy po przybyciu.
2.9 Sposób zabicia: ogólnie znieczulenie izofluranem.
3. Sposoby i projekt eksperymentu
1. Nietknięte 11 szczurów/grupę
2. OVX kontrolna łącznie 44 szczury
3. OVX + DHEA 12,5 mg
4. OVX + DHEA 12,5 mg + EM-800 (100 g)
3.1 Wytwarzanie nośnika i substancji testowanych a) Wytwarzanie EM-800:
EM-800 lub oba z nich rozpuszcza się w ETOH:PEG-600 (1:1) z mieszaniem na Fisher Scientific Stirring Hot Plate, następnie dodaje się 1% GNS do żądanej objętości.
b) Wytwarzanie DHEA:
DHEA rozpuszcza się w 50% ETOH, 50% PPG przez mieszanie.
3.2 Przygotowanie zwierząt i zabiegi:
Zwierzęta poddaje się zabiegowi raz dziennie, jak podano w punkcie 6.1. DHEA, przygotowany w 50% ETOH, 50% PPG, będzie podawany przezskórnie (P. C.) odpowiednim zwierzę tom raz dziennie (I. D.) w objętości 0,5 ml. EM-800 będzie się przygotowywać w 4% ETOH, 4% PEG-600, 1% żelatyny, 0,9% NaCl, i podawać podskórnie zwierzętom odpowiednich grup raz dziennie (S. C., I. D.) w objętości 0,5 ml. Szczury otrzymują podskórny zastrzyk 0,5 ml nośnika 1, jeś li nie są podskórnie potraktowane dowolnym związkiem testowym i otrzymują miejscowo 0,5 ml nośnika 2, jeśli nie są potraktowane 5-diolem lub DHEA.
3.3 Obserwacje i pomiary a) Obserwacje kliniczne:
Każdego szczura będzie się obserwować co najmniej raz dziennie szukając ogólnych objawów. b) Masy ciał:
Szczury będą ważone na początku i na koniec protokołu i co trzy miesiące podczas terapii.
4. Wyniki:
Jak pokazano w tablicy 2, terapia DHEA przy dziennej dawce 12,5 mg zmniejsza o 87% stymulację przez OVX masy ciała. Podawanie EM-800 przy dziennej dawce 100 μg daje efekt synergiczny i uzyskuje się 140% inhibicji stymulacji przez OVX masy ciała.
T a b l i c a 2
Terapia Łączna masa (g)
Nietknięte 479,5 ± 20,4
OVX 567,4 ± 25,7
OVX + DHEA (12,5 mg/szczura dziennie) 490,8 ± 24,1
OVX + DHEA (12,5 mg/szczura dziennie) + EM-800 (100 μg/szczura dziennie) 444,5 ± 20,5
PL 208 972 B1
P r z y k ł a d 3. Wpływ 20-dniowej terapii EM-652 · HCl na zawartość tłuszczu w ciele i parametry masy ciała u szczurów z wyciętymi jajnikami
Materiały i sposoby
Zwierzęta i terapia
Użyto 8 do 10-tygodniowych samic szczurów Sprague-Dawley (Crl: CD (SD) Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Kanada) ważących w przybliżeniu 200-225 g na początku terapii. Zwierzęta zaaklimatyzowano to warunków środowiska (temperatura: 22 ± 3°C; cykl 10 godzin światła -14 godzin ciemności, światło od godziny 06:00) przez 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu.
Zwierzęta trzymano osobno w stalowych klatkach o konwencjonalnym wyglądzie i miały swobodny dostęp do wody wodociągowej i wysokowęglowodanowego mieszanego pokarmu złożonego z (g/100 g): skrobia kukurydziana, 31,2; dekstroza, 31,2; kazeina, 20,0; olej kukurydziany, 6,4; d1-metionina, 0,3; mieszanka witaminowa, 1,0; mieszanka mineralna AIN-76, 4,9 i włókno, 5,0. Eksperyment prowadzono w warunkach zatwierdzonych przez Canadian Council on Animal Care według CCAC Guide for Care and Use of Experimental Animals.
szczurów podzielono przypadkowo pomiędzy 4 grupy po 10 zwierząt, każda jak następuje: 1) nietknięte kontrolne; 2) kontrola OVX; 3) OVX + EM-652 · HCl (0,5 mg/szczura, ~ 2,5 mg/kg); 4) OVX + estradiol (E2, implant). W dniu 1 badania, zwierzęta z odpowiednich grup pozbawiono obu jajników (OVX) pod znieczuleniem izofluranem.
Jeden silastikowy implant estradiolu (E2) wstawiono podskórnie w części grzbietowej każdego zwierzęcia z grupy 4. Implanty, dobrane we wstępnych doświadczeniach tak, aby wytwarzały fizjologiczne poziomy E2, miały następujące stężenia sterydów i rozmiary: E2:cholesterol (1:50, wagowo), 0,5 cm (długość rozcieńczonego sterydu w silastikowej rurce), 0,125 cala (zewnętrzna średnica silastikowej rurki) i 0,062 cala (wewnętrzna średnica silastikowej rurki).
Implanty estradiolu zanurzano w 0,9% NaCl w temperaturze 37°C przez noc przed ich podskórnym wprowadzeniem w zwierzęta. Terapię EM-652 · HCl lub samym nośnikiem (0,4% metylocelulozy w wodzie) rozpoczęto w dniu 2 badania.
Związek lub nośnik podawano raz dziennie przez doustny zgłębnik w ilości 0,5 ml/szczura przez 20 dni. Masy ciał i zużycie pokarmu rejestrowano co 2 dni.
W przybliżeniu 24 godziny po ostatnim dawkowaniu, wyposzczone przez noc zwierzęta znieczulono ketamineksylazyną i krew odciągnięto przez nakłucie serca. Zebrano krew, jak też białą i brunatną tkankę tłuszczową. Masy ciała, pobieranie pokarmów, i pomiary przyrostów energii, tłuszczu i białka ciała. Masy ciała, pobieranie pokarmów i przyrosty energii, tłuszczu i białka ciała określono według Deshaiesa i in., Am. J. Physiol., 1997; 273, E355-E362 (1997).
Pomiary tkanki
Aktywności lipazy lipoproteinowej określono według Deshaiesa i in., Am. J. Physiol., 1997; 273, E355-E362 (1997).
Wyniki
Można zobaczyć z fig. 2A i C, że 20-dniowa terapia EM-652 · HCl zupełnie odwróciła 4-krotny przyrost masy ciała i 3-krotne zwiększenie ilości tłuszczu, odpowiednio, zauważone po wycięciu jajników, podczas gdy ten efekt nie był tak wyraźny na zwiększenie ilości białka (fig. 2B). Estradiol ma słabsze działanie. Skumulowane pobieranie pokarmów pokazano na fig. 3. Wpływ terapii odzwierciedla przyrost masy ciała.
Estradiol częściowo zapobiegał wzrostowi ilości pobieranych pokarmów spowodowanemu Ovx, chociaż EM-652 · HCl uczynił to wydajniej niż estradiol, osłabiając pobieranie pokarmów do wartości niższej niż u nietkniętych zwierząt.
Główne czynniki bilansu energetycznego podsumowano w tablicy 3. Ovx zwiększał pobór przyswajalnej energii o 44%. Estradiol redukował pobór energii u zwierząt Ovx, lecz łączny pobór energii pozostawał o 17% wyższy niż u nietkniętych zwierząt, podczas gdy EM-652 · HCl całkowicie zapobiegał zwiększeniu indukowanego przez Ovx poboru energii.
Zysk energetyczny był proporcjonalny do pobierania pokarmów. Ponownie, estradiol redukował zysk energetyczny (do poziomów nieznacznie różnych od poziomów dla nietkniętych szczurów), lecz EM-652 · HCl był skuteczniejszy (znacząco różny od estradiolu).
Wydajność pokarmów była zwiększana przez Ovx, zmniejszana u zwierząt z Ovx przez E2 i ponadto zmniejszana przez EM-652 · HCl.
PL 208 972 B1
30% wzrost energii ciała z białek po wycięciu jajników, jak też 80% wzrost energii ciała z tłuszczu uległ również pełnemu odwróceniu przez terapię EM-652 · HCl, jak można zobaczyć na fig. 4A i B. Jak pokazano na fig. 5A, rozwój oporności na insulinę u zwierząt po Ovx potwierdziła obecność hiperinsulinemii po wyposzczeniu (która jest zwykle proporcjonalna do stopnia oporności na insulinę) i hiperglikemii (odzwierciedlenie utraty skutecznoś ci insuliny do zachowywania normalnych poziomów glukozy we krwi). Estradiol i EM-652 · HCl zapobiegał indukowanej Ovx oporności na insulinę.
Figury 6A i 6C pokazują, że OVX zwiększała masę (ilości) pachwinowej i zaotrzewnowej tkanki tłuszczowej, które są reprezentatywne dla obserwowanej zmiany w łącznej ilości tłuszczu w ciele. Taki wzrost był całkowicie usuwany przez terapię EM-652 · HCl. Dla estradiolu, efekt był mniej wyraźny. Ten sam wzór pokazują fig. 6B i 6D, gdzie przedstawiono aktywność lipazy lipoproteinowej. Ten enzym moduluje wewnątrznaczyniową hydrolizę triglicerydów i tym samym wejście kwasów tłuszczowych do magazynu tkanki tłuszczowej.
Brunatna tkanka tłuszczowa jest głównym ciepłotwórczym efektorem u gryzoni. Wycięcie jajników dało inny wzór między-łopatkowej brunatnej tkanki tłuszczowej niż białej tkanki tłuszczowej. Masa brunatnej tkanki tłuszczowej wzrosła dwa razy więcej (fig. 7A) niż białej tkanki tłuszczowej. Jednakże zawartość białka (fig. 7B) i aktywność lipoproteinowa (fig. 7C) spadły o 33 i 30%, odpowiednio, po OVX. Z tych trzech parametrów, terapia EM-652 · HCl zupełnie odwracała wpływ wycięcia jajników.
Masa mięśnia łydki jest zwykle dobrym wskaźnikiem statusu masy białkowej organizmu. Jak można się spodziewać, masa łydki, jak pokazano na fig. 8, zwiększyła się wskutek Ovx (wzrost pobierania pokarmów powoduje wzrost energii odkładanej jako tłuszcz i białko).
I terapia estradiolowi, i EM-652 · HCl zapobiegała wzrostowi masy mięśnia. Lipoproteinowa lipaza w mięśniu jest często dodatnio związana z wrażliwością na insulinę (lepsza wrażliwość to więcej lipoproteinowej lipazy w mięśniu).
Ovx zmniejsza aktywność lipazy lipoproteinowej w łydce, co jest pośrednim dowodem rozwoju oporności na insulinę w mięśniu. Terapie estradiolem i EM-652 · HCl zapobiegały spadkowi poziomu lipazy lipoproteinowej w mięśniu.
T a b l i c a 3 Bilans energetyczny
Stan jajników Nietknięte OVX
Terapia Bez E2 EM-652
Pobór przyswajalnej energii (kJ) 4708 6758a 5511a 4479b
Zysk energetyczny (kJ) 532 1677a 903 278b
Widoczny wydatek energetyczny (kJ) 4176 5081a 4609a 4201b
Wydajność pokarmu (%) 10,2 24,1a 15,9 5,9a
a b
różne od „nietkniętych”, p < 0,05 różne od „z wyciętymi jajnikami + E2, p < 0,05
Pobór przyswajalnej energii jest łączną ilością energii przyjętej podczas 20-dniowej terapii (uwzględnia nieprzyswajalną materię, taką jak włókna).
Zysk energetyczny jest ilością kilodżuli odłożonych jako tłuszcz + białko w trakcie 20-dniowej terapii. Widoczny wydatek energetyczny jest ilością energii wydatkowanej dla potrzeb metabolicznych i lokomocyjnych (obliczony z poboru energii i zysku energetycznego).
Oczekiwany większy, gdy masa bez tłuszczu jest większa (tak jak u zwierząt z Ovx). Wydajność pokarmów jest wydajnością, z którą przyswojona energia jest odkładana jako tłuszcz i białko (w kJ odłożonych na 100 kJ strawionych).
P r z y k ł a d 4. Przykład syntezy korzystnego związku według wynalazku
Synteza chlorowodorku (S)-(+)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4”-(2”'-piperydynometoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu EM-01538 (EM-652 · HCl)
PL 208 972 B1
Schemat 1
Etap A: BF3 · Et2O, toluen; 100°C; 1 godzina.
Etap C: 3,4-dihydropiran, monohydrat kwasu p-toluenosulfonowego, octan etylu; 25°C pod azotem, 16 godzin i następnie krystalizacja w izopropanolu.
Etapy D, E i F:
(1) piperydyna, toluen, aparat Deana Starka, refluks pod azotem;
(2) 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en, DMF, refluks 3 godziny;
(3) CH3MgCl, THF, -20 do 0°C następnie temperatura pokojowa przez 24 godziny;
Etapy G, H: Kwas (1S)-(+)-10-kamforosulfonowy, aceton, woda, toluen, temperatura pokojowa, 48 godzin.
Etap HH: 95% etanol, 70°C, następnie temperatura pokojowa 3 dni.
Etap HHR: Zawracanie cieczy macierzystej i przemywanie etapu HH.
Kwas (S)-10-kamforosulfonowy, refluks; 36 godzin, następnie temperatura pokojowa przez godzin.
Etap I:
(1) wodny roztwór DMF, Na2CO3, octan etylu;
(2) etanol, rozcieńczony HCl;
(3) woda.
Synteza 2-tetrahydropiranyloksy-4-hydroksy-2'-(4”-tetrahydropiranyloksyfenylo)acetofenonu (4) Zawiesinę 2,4-dihydroksy-2'-(4”-hydroksyfenylo)acetofenonu 3 (97,6 g, 0,4 mol) (dostępne z Chemsyn
PL 208 972 B1
Science Laboratories, Lenexa, Kansas) w 3,4-dihydropiranie (218 ml, 3,39 mol) i octanie etylu (520 ml) potraktowano monohydratem kwasu p-toluenosulfonowego (0,03 g, 0,158 mmol) w temperaturze około 25°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem bez zewnętrznego ogrzewania przez około 16 godzin. Mieszaninę przemyto następnie roztworem wodorowęglanu sodu (1 g) i chlorku sodu (5 g) w wodzie (100 ml). Fazy oddzielono i fazę organiczną przemyto solanką (20 ml). Każde popłuczyny ponownie ekstrahowano 50 ml octanu etylu. Wszystkie fazy organiczne połączono i przesączono przez siarczan sodu.
Rozpuszczalnik (około 600 ml) usunięto przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym i dodano izopropanol (250 ml). Dodatkowy rozpuszczalnik (około 300 ml) destylowano pod ciśnieniem atmosferycznym i dodano izopropanol (250 ml). Dodatkowy rozpuszczalnik (około 275 ml) destylowano pod ciśnieniem atmosferycznym i dodano izopropanol (250 ml). Roztwór ochłodzono w temperaturze około 25°C z mieszaniem i po około 12 godzinach krystaliczne ciało stałe przesączono, przemyto izo-propanolem i osuszono (116,5 g, 70%).
Synteza 4-hydroksy-4-metylo-2-(4'-[2”-piperydyno]etoksy)fenylo-3-(4”'-tetrahydropiranyloksy)fenylo-7-tetrahydropiranyloksychromanu (10)
Roztwór 2-tetrahydropiranyloksy-4-hydroksy-2'-(4”-tetrahydropiranyloksyfenylo)acetofenonu 4 (1 kg, 2,42 mol), 4-[2-(1-piperydyno)etoksy]benzaldehydu 5 (594 g, 2,55 mol) (dostępne z Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) i piperydyny (82,4 g, 0,97 mol) (dostępne z Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.) w toluenie (8 l) poddawano refluksowi pod azotem w aparacie Deana & Starka do zebrania jednego równoważnika wody (44 ml).
Toluen (6,5 l) usunięto z roztworu przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym. Dodano dimetyloformamid (6,5 l) i 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en (110,5 g, 0,726 mol). Roztwór mieszano przez około 8 godzin w temperaturze pokojowej dla izomeryzacji chalkonu 8 do chromanonu 9 i następnie dodano do mieszaniny wody i lodu (8 l) i toluenu (4 l). Fazy oddzielono i warstwę toluenową przemyto wodą (5 l). Połączone wodne popłuczyny ekstrahowano toluenem (3 x 4 l). Połączone toluenowe ekstrakty przemyto na koniec solanką (3 x 4 l), zatężono pod ciśnieniem atmosferycznym do 5,5 l i następnie ochłodzono do -10°C.
Przy ciągłym zewnętrznym chłodzeniu i mieszaniu pod azotem, dodano 3M roztwór chlorku metylomagnezu w THF (2,5 l, 7,5 mol) (dostępne z Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.), utrzymując temperaturę poniżej 0°C. Po dodaniu całości reagentu Grignarda zewnętrzne chłodzenie usunięto i mieszaninę pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej. Mieszaninę mieszano w tej temperaturze przez około 24 godziny.
Mieszaninę ponownie ochłodzono do około -20°C i z ciągłym zewnętrznym chłodzeniem i mieszaniem dodano powoli nasycony roztwór chlorku amonu (200 ml), utrzymując temperaturę poniżej 20°C. Mieszaninę mieszano przez 2 godziny i następnie dodano nasycony roztwór chlorku amonu (2 l) i toluen (4 l) i mieszano przez 5 minut. Fazy oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano toluenem (2 x 4 l). Połączone toluenowe ekstrakty przemyto rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym, aż roztwór stał się jednorodny, a następnie solanką (3 x 4 l). Roztwór toluenowy na koniec zatężono pod ciśnieniem atmosferycznym do 2 l. Tego roztworu użyto bezpośrednio w następnym etapie.
Synteza (1S)-10-kamforosulfonianu (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4”-[2”'-piperydyno]etoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu (± 12)
Do toluenowego roztworu 4-hydroksy-4-metylo-2-(4'-[-2”-piperydyno]etoksy)fenylo-3-(4”'-tetrahydropiranyloksy)fenylo-7-tetrahydropiranyloksychromanu (10) dodano aceton (6 l), wodę (0,3 l) i kwas (S)-10-kamforosulfonowy (561 g, 2,42 mol) (dostępne z Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.). Mieszaninę mieszano pod azotem przez 48 godzin, po czym stały (1S)-10-kamforosulfonian (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4”-[2”'-piperydyno]etoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu (12) przesączono, przemyto acetonem i osuszono (883 g). Tej substancji użyto w kolejnym (HH) etapie bez dalszego oczyszczania.
Synteza (1S)-10-kamforosulfonianu (2S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4”-[2”'-piperydyno]etoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu (13, sól (+)-EM-652(1S)-CSA)
Zawiesinę (1S)-10-kamforosulfonianu (2R,S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4”-[2”'-piperydyno]etoksy)fenylo)-2H-benzopiranu 12 (759 g) w 95% etanolu ogrzewano z mieszaniem do około 70°C, aż ciało stałe rozpuściło się. Roztwór pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej z mieszaniem, następnie zaszczepiono kilkoma kryształami (1S)-10-kamforosulfonianu (2S)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4”-[2”'-piperydyno]etoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu 13. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez około trzy dni łącznie. Kryształy przesączo16
PL 208 972 B1 no, przemyto 95% etanolem i osuszono (291 g, 76%). Wydajność produktu wynosiła 94,2% i czystość 98,8%.
Synteza chlorowodorku (S)-(+)-7-hydroksy-3-(4'-hydroksyfenylo)-4-metylo-2-(4”-(2”'-piperydynoetoksy)fenylo)-2H-1-benzopiranu EM-01538 (EM-652 · HCl)
Zawiesinę związku 13 (sól EM-652-(+)-CSA, 500 mg, 0,726 mmol) w dimetyloformamidzie (11 μ|, 0,15 mmol) potraktowano 0,5 M wodnym roztworem węglanu sodu (7,0 ml, 3,6 mmol) i mieszano przez 15 minut. Zawiesinę potraktowano octanem etylu (7,0 ml) i mieszano przez 4 godziny. Fazę organiczną przemyto następnie nasyconym wodnym roztworem węglanu sodu (2 x 5 ml) i solanką (1 x 5 ml) osuszono nad siarczanem magnezu i zatężono. Roztwór powstałej różowej piany (EM-652) w etanolu (2 ml) potraktowano 2N kwasem chlorowodorowym (400 μ^ 0,80 mmol), mieszano przez 1 godzinę, potraktowano wodą destylowaną (5 ml) i mieszano przez 30 minut. Powstałą zawiesinę przesączono, przemyto wodą destylowaną (5 ml), osuszono na powietrzu i pod silnie zmniejszonym ciśnieniem (65°C) z wytworzeniem kremowego proszku (276 mg, 77%): drobny białawy proszek; kalorymetria skaningowa: początek piku topnienia przy 219°C, DH = 83 J/g; [a]24D = 154 w metanolu 10 mg/ml.
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ (ppm) 1,6 (br, 2H, H-4”'), 1,85 (br, 4H, H3”'' i 5'''), 2,03 (s, 3H, CH3), 3,0 i 3,45 (br, 4H, H-2”'' i 6”'', 3,47 (t, J = 4,9 Hz, 2H, H-3”'), 4,26 (t, J = 4,9 Hz, 2H, H-2”'), 5,82 (s, 1H, H-2'''), 6,10 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-8), 6,35 (dd, J = 8,4, 2,43 Hz, 1H, H-6), 6,70 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-3' i H5'), 6,83 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-3” i H-5”), 7,01 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-2' i H-6'), 7,12 (d, J =
8.4 Hz, 1H, H5), 7,24 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-2” i H-6”);
13C RMN (CD3OD, 75 MHz) δ ppm 14,84, 22,50, 23,99, 54,78, 57,03, 62,97, 81,22, 104,38, 109,11, 115,35, 116,01, 118,68, 125,78, 126,33, 130,26, 130,72, 131,29, 131,59, 134,26, 154,42, 157,56, 158,96, 159,33.
Kompozycja pierwiastkowa: C, H, N, Cl: teoretycznie; 70,51, 6,53, 2,84, 7,18%, znalezione: 70,31, 6,75, 2,65, 6,89%.
Przykład 5 pokazuje zapobieganie indukowanemu LHRH-A wzrostowi ilości tłuszczu przez EM-652 · HCl, związek według wynalazku, sam lub w kombinacji z DHEA, prekursorem hormonu płciowego, u nietkniętych samic szczurów. Widać z tego, że 6-miesięczne terapia LHRH-A zwiększa znacząco o 58% ilość tłuszczu ciała nietkniętych samic szczurów, podczas gdy dla równocześnie podawanego EM-652 · HCl lub DHEA, ten przyrost był tylko 35% i 19%, odpowiednio. Przy kombinacji obu leków, nie obserwowano wzrostu ilości tłuszczu po terapii LHRH-A.
W przykładzie 6 przedstawiono zapobieganie otyłości u samic szczurów w okresie 20 dni. Wycięcie jajników zwiększa procent łącznej ilości tłuszczu w ciele i masę zaotrzewnowej tkanki tłuszczowej o 20% i 68%, odpowiednio. Tym przyrostom zapobiega się, a nawet zmniejsza ilość tłuszczu ciała i zaotrzewnowej tkanki tłuszczowej przez podawanie EM-652 · HCl, estradiol, DHEA lub kombinacji EM-652 · HCl i DHEA lub EM-652 · HCl i estradiolu, o 46%, 46%, 59%, 56% i 45%, odpowiednio, dla tłuszczu ciała i o 59%, 78%, 75%, 69% i 68%, odpowiednio, dla zaotrzewnowej tkanki tłuszczowej. Podobny eksperyment przedstawiono w przykładzie 7. W tym przypadku zapobieganie otyłości prowadzi się przez 34 tygodnie i wówczas procenty tłuszczu ciała i zaotrzewnowej tkanki tłuszczowej wynoszą około 60% zwiększone przez wycięcie jajników. Temu wzrostowi zapobiega się przez podawanie etynyloestradiolu, raloksyfenu (EM-1105), EM-652 · HCl (EM-1538), DHEA lub kombinacji EM-652 · HCl i DHEA.
Przykłady 8A (samce) i 8B (samice) podają dane dotyczące skuteczności wynalazku w zapobieganiu, jak też w leczeniu otyłości. Chudym i otyłym samcom i samicom szczurów Zucker podawano
2.5 mg/kg dziennie EM-652 · HCl przez 20 dni. Model zapobiegania jest reprezentowany przez chude szczury, podczas gdy model terapii otyłości jest reprezentowany przez już otyłe szczury. Dane przyrostu masy ciała, aktywności lipazy lipoproteinowej w białej zaotrzewnowej tkance tłuszczowej i mięśniu łydki, jak też stężenia w osoczu insuliny, glukozy, łącznego cholesterolu i triglicerydów przedstawiono w tablicy 7 dla samców i tablicy 8 dla samic zwierząt (patrz przykład 3 za znaczeniem tych parametrów).
Antyestrogen EM-652 · HCl zmniejsza znacząco przyrost masy ciała o 38% dla chudych samców szczurów i 35% dla otyłych samców szczurów, chociaż aktywność lipazy lipoproteinowej w białej zaotrzewnowej tkance tłuszczowej i mięśniu łydki nie jest modyfikowana u żadnej z płci. Insulina w osoczu spada o 35%, 57% i 48% u chudych samców, otyłych samców i chudych samic, odpowiednio, chociaż u otyłych samic, które wykazują znacznie wyższy poziom insuliny, EM-652 · HCl nie miało znaczącego wpływu. Cholesterol w osoczu, który jest wyższy w grupach otyłych, jest również zmniejPL 208 972 B1 szany przez podawanie EM-652 · HCl. Glukoza w osoczu nie ulega zmianom pod wpływem terapii EM-652 · HCl.
W przykładzie 9 wpływ EM-652 · HCl, DHEA lub kombinacji obu na samice szczurów nietknięte lub z wyciętymi jajnikami otrzymujące dietę bogatą w sacharozę i tłuszcz, podano na łączną masę, masę i aktywność lipazy lipoproteinowej białej pachwinowej i zaotrzewnowej tkanki tłuszczowej, brunatnej tkanki tłuszczowej, mięsień łydki i mięsień boczny kolanowy (VLM). Podano także zawartość insuliny, glukozy, łącznego cholesterolu, triglicerydów i leptyny w osoczu, jak też cholesterolu i triglicerydów w wątrobie.
Przykład 10 opisuje wpływ na przyrost masy ciała i na metabolizm lipidów-lipoprotein u szczurów terapii różnymi selektywnymi modulatorami receptora estrogenu opisanymi w literaturze (TSE 424, lasofoksyfen, LY 353381 i raloksyfen), jak też EM-652 · HCl, korzystny związek według wynalazku. Testowane związki podawano przez doustny zgłębnik przez 20 dni (0,5 mg/szczura dla każdego związku) w 0,4% metylocelulozie samicom szczurów z wyciętymi jajnikami. Szczury nietknięte kontrolne, z wyciętymi jajnikami (OVX) kontrolne i OVX potraktowano 17e-estradiolem (E2) użyto jako odnośnika. Masa ciała i zużycie pokarmu, które zwiększają się przez wycięcie jajników, znacząco spadły dzięki terapii testowanymi związkami do wysokości takiej jak u nietkniętych zwierząt kontrolnych. Masa i aktywność lipazy lipoproteinowej białej tkanki tłuszczowej pachwinowej i zaotrzewnowej maleje dzięki powyższej terapii (poza TSE 424 i LY 353381 dla białej tkanki tłuszczowej pachwinowej i TSE 424 i lasofoksyfenu dla aktywności lipazy lipoproteinowej tkanki pachwinowej) chociaż brunatna tkanka tłuszczowa i mięsień nie zmienia się znacząco. Widać z tego, że wszystkie związki testowane obniżają znacząco stężenie w osoczu cholesterolu i triglicerydów, lecz nie mają wpływu na poziomy glukozy. Poziom insuliny w osoczu zmniejszył się przez terapię OVX szczurów EM-652 · HCl, TSE 424, lasofoksyfenem, LY 353381 i raloksyfenem.
W przykładach 11 i 12, podano też skuteczność in vitro w estrogenozależnych linii komórkowych znanych antyestrogenów i związków według wynalazku. Wpływ antyestrogenów na aktywność fosfatazy alkalicznej w ludzkich komórkach gruczolakoraka Ishikawy śluzówki macicy pokazano w tablicy 11 przykładu 10. Aktywność antyestrogenowa jest podana w ostatniej kolumnie jako IC50 wyrażone w nM inhibicji stymulowanej 1 nM E2 alkalicznej fosfatazy, podczas gdy wewnętrzną estrogenną aktywność testowanych związków podano w przedostatniej kolumnie jako procent stymulacji 1 nM E2 aktywności alkalicznej fosfatazy.
Widać z tego, że najaktywniejszymi antyestrogenami są EM-652 · HCl, LY 353381, raloksyfen, lasofoksyfen i TSE 424. Inne są co najmniej 10 razy mniej aktywne. Jednakże pośród najaktywniejszych związków, pewne wykazują znaczącą resztową niepożądaną aktywność estrogenu: LY 353381 (16%), lasofoksyfen (18%) i raloksyfen (13%).
Tak więc, niniejsze dane wskazują, że związki EM-652 · HCl i TSE 424 nie wykazują znaczącej estrogennej aktywności w komórkach Ishikawy. W przykładzie 12 porównanie pomiędzy EM-652 · HCl, naszym korzystnym związkiem i TSE 424 w komórkach ludzkiego raka piersi MCF-7 pokazuje korzyści z EM-652 · HCl. Tak więc, jest on ponad cztery razy aktywniejszy niż TSE 424 jako antyestrogen (EC50 inhibicji 0,8 nM wobec 3,7 nM) (tablica 12).
W przykładzie 13, wpływ 20-dniowej terapii EM-652 · HCl, TSE 424 lub lasofoksyfenu na masę ciała, zaotrzewnowej tkanki tłuszczowej, masę macicy i poziomy cholesterolu oceniono u samic szczurów z wyciętymi jajnikami karmionych handlowym pokarmem dla gryzoni.
Wycięcie jajników indukowało 17% i 19% wzrost łącznej masy ciała i masy zaotrzewnowej tkanki tłuszczowej, odpowiednio, podczas gdy podawanie 0,5 mg EM-652 · HCl, TSE 424 lub lasofoksyfenu zapobiegało wzrostowi masy ciała o 64 i 127%, odpowiednio, i prowadziło do mas tkanki tłuszczowej poniżej obserwowanych u nietkniętych kontrolnych zwierząt dla wszystkich badanych związków.
Podawanie EM-652 · HCl i TSE 424 nie miało wpływu na masę macicy w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi z OVX. Jednakże, podawanie 0,5 mg lasofoksyfenu spowodowało 62% wzrost (p > 0,01) masy macicy, który został zupełnie odwrócony przez jednoczesne podawanie 2,5 mg EM-652 · HCl, sugerując estrogenną aktywność lasofoksyfenu. Na koniec, indukowanemu OVX wzrostowi łącznych poziomów cholesterolu w osoczu całkowicie zapobiegało podawanie EM-652 · HCl, TSE 424 i lasofoksyfenu i prowadziło ono do poziomów cholesterolu znacząco niższych niż obserwowane u nietkniętych kontrolnych zwierząt.
PL 208 972 B1
P r z y k ł a d 5. Wpływ na akumulację tłuszczu przez terapię EM-652 · HCl i DHEA, podawanymi oddzielnie lub w kombinacji, nietkniętym samicom szczurów otrzymującym lub nie otrzymującym
LHRH-A
URMA-r-04-99
Celem tego badania jest określenie wpływu na tłuszcz terapii EM-652 · HCl i dehydroepiandrosteronem (DHEA) u nietkniętych samic szczurów otrzymujących lub nie otrzymujących agonistę hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (LHRH-A, dioctan etyloamidu LHRH). W tym celu, nietknięte samice szczurów, potraktowane lub nie potraktowane LHRH-A (1 μg/szczura), otrzymywały dziennie EM-652 · HCl (2,5 mg/kg) i DHEA (100 mg/kg), same lub w kombinacji, przez 6 miesięcy.
EM-652 · HCl podawano doustnie, DHEA nakładano miejscowo, podczas gdy LHRH-A wstrzykiwano podskórnie. Wszystkie zabiegi prowadzono raz dziennie.
Testowane zwierzę
Gatunek: Rattus norvegicus
Szczep: szczur Sprague-Dawley (Crl: CD® (SD) BR VAF/Plusra)
Płeć: samica
Wiek: na początku dawkowania, szczury miały w przybliżeniu 10 do 12 tygodni
Zamieszkanie i odżywianie
a) Zamieszkanie
Szczury trzymano osobno w klatkach ze stali nierdzewnej podczas okresu przyzwyczajania i badania.
b) Temperatura i wilgotność
Warunki środowiskowe (temperatura, wilgotność) w pomieszczeniu szczurów rejestrowano w sposób ciągły stosując skomputeryzowany automatyczny system. Docelowe warunki to 22 ± 3°C i 50 i 20% względnej wilgotności.
c) Cykl światła-ciemności
Cykl oświetlenia wynosił 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Te parametry rejestrowano w sposób ciągły stosując sprawdzony komputerowy automatyczny system. Światła działały od 07:15 do 19:15.
d) Pokarm
Certyfikowany pokarm dla gryzoni (Lab Diet # 5002, granulki) i wodę z kranu dostarczano do woli. Szczury wyposzczono (tylko dostęp do wody) wieczorem przed sekcją.
Randomizacja
Szczury przypisano do każdej z grup przypadkowo podczas okresu przyzwyczajania.
Sposoby i projekt eksperymentu
Grupy testowe
120 szczurów podzielono na 8 grup po 15 zwierząt do prowadzenia badań opisanych poniżej:
Terapia Dawkowanie zawiesin podawanych doustnie Dawkowanie roztworów podawanych miejscowo LHRH-A (zastrzyki podskórne)
Dawka (mg/kg) Objętość/szczura (ml) Dawka (mg/kg) Objętość/szczura (ml) Dawka 1 μg/szczura
Nietknięte - 0,5 - 0,5 -
EM-652 · HCl 2,5 0,5 - 0,5 -
DHEA - 0,5 100 0,5 -
DHEA + EM-652 · HCl 2,5 0,5 100 0,5 -
LHRH-A - 0,5 - 0,5 0,5 ml
LHRH-A + EM-652 · HCl 2,5 0,5 - 0,5 0,5 ml
LHRH-A + DHEA - 0,5 100 0,5 0,5 ml
LHRH-A + DHEA + EM-652 · HCl 2,5 0,5 100 0,5 0,5 ml
PL 208 972 B1
Wytwarzanie testowanych substancji
LHRH-A jest dostępny w roztworze przy stężeniu 1,0 mg/ml. Rozcieńczamy ten stężony roztwór (w celu uzyskania końcowego stężenia 0,002 mg/ml) stosując następujące nośniki: 0,3% chlorek sodu i 0,25% monozasadowy fosforan sodu, monohydrat w wodzie. Wodorotlenku sodu (wodny roztwór) użyto do ustawienia pH pomiędzy 5,6-6,2.
Dawkowane zawiesiny/roztwory wytwarzano co dwa tygodnie zgodnie z ostatnią masą ciała (średnia grupowa) poza roztworem LHRH-A. Dla EM-652 · HCl podawanego doustnie, nośnik (0,4% metyloceluloza) dodawano do testowanego związku, poprzednio zważonego do szklanego naczynia, co najmniej 48 godzin przed dniem pierwszego dawkowania.
Dla zachowania jednorodności dawkowanej zawiesiny, mieszano ją co najmniej 48 godzin w temperaturze 2 do 8°C. Dawkowaną zawiesinę trzymano w temperaturze 2 do 8°C. Dla roztworu DHEA aplikowanego miejscowo, etanol dodawano do DHEA i mieszankę mieszano do rozpuszczenia DHEA.
Następnie, dodano poli(glikol propylenowy) i roztwór mieszano do jednorodności. Dawkowany roztwór trzymano w temperaturze od 2 do 8°C (część roztworu będzie się trzymać w temperaturze pokojowej dla ułatwienia miejscowego podawania zwierzęciu).
Dla roztworu LHRH-A wstrzykiwanego podskórnie, rozcieńczenie stężonego roztworu z uż yciem odpowiedniego noś nika wytwarzano co miesiąc. Dawkowany roztwór trzymano w temperaturze 2 do 8°C.
Przygotowanie zwierząt
Przed pierwszym dniem dawkowania i stosownie do potrzeb podczas badania, część skóry grzbietu (w przybliżeniu 5x5 cm) ogolono dla miejscowego podawania DHEA.
Dawkowanie
Podawanie testowanych związków lub nośnika rozpoczęto pierwszego dnia protokołu. Testowane związki podano jako zawiesinę w 0,4% metylocelulozie przez doustny zgłębnik (0,5 ml/zgłębnik/szczura) raz dziennie lub nakładano miejscowo w 50% etanolu-50% glikolu propylenowym (0,5 ml/nakładanie/szczura) raz dziennie. Szczury z grup 5 do 8 otrzymają również LHRH-A raz dziennie przez podskórny zastrzyk (0,5 ml/zastrzyk/szczura). Szczury nie otrzymujące testowanego związku doustnie i/lub miejscowo otrzymają sam odpowiedni nośnik.
Pomiar tłuszczu ciała
Skład ciała mierzono na całym szkielecie i prawej kości udowej zwierząt pod indukowanym izofluranem znieczuleniem stosując absorpcjometrię rentgenowską o podwójnej energii (DEXA; QDR 4500A, Hologic) podczas okresu przyzwyczajania i po 6 miesiącach terapii.
Wyniki
T a b l i c a 4
Terapia Tłuszcz (%)
Nietknięte 23,1 ± 1,6
EM-652 · HCl 19,1 ± 1,4
DHEA 20,2 ± 2,3
DHEA + EM-652 · HCl 18,8 ± 1,3
LHRH-A 36,4 ± 2,2
LHRH-A + EM-652 · HCl 31,2 ± 2,0
LHRH-A + DHEA 27,4 ± 2,1
LHRH-A + DHEA + EM-652 · HCl 25,0 ± 1,7
P r z y k ł a d 6. Wpływ 20-dniowej terapii EM-652 · HCl, estradiolem i DHEA na parametry zawartości tłuszczu w ciele i masy ciała u samic szczurów z wyciętymi jajnikami. URMA-r-27-00
Celem tego badania było określenie wpływu na parametry zawartości tłuszczu w ciele i masy ciała EM-652 · HCl, estradiolu i DHEA podawanego doustnie oddzielnie lub w kombinacji, samicom szczurów z wyciętymi jajnikami (OVX) otrzymującym wzbogacony pokarm węglowodanowy.
PL 208 972 B1
Zwierzę testowane
Gatunek: Rattus norvegicus
Szczep: szczur Sprague-Dawley (Crl: CD® (SD) BR VAF/Plus™)
Płeć: samica
Masy ciała: na początku dawkowania, masy ciała wynosiły w przybliżeniu 200-250 g.
Zamieszkanie i odżywianie
a) Zamieszkanie: szczury trzymano osobno w klatkach ze stali nierdzewnej konwencjonalnego rodzaju podczas aklimatyzacji i badania.
b) Temperatura i wilgotność: warunki środowiskowe (temperaturę, wilgotność) w pomieszczeniu szczurów rejestrowano w sposób ciągły stosując skomputeryzowany automatyczny system. Docelowe warunki to 2,2 ± 3°C i 50 ± 20% względnej wilgotności.
c) Cykl światła-ciemności: cykl światła-ciemności wynosił 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Te parametry rejestrowano w sposób ciągły stosując skomputeryzowany automatyczny system. Światła włączano od 07:15 do 19:15.
d) Pokarm: certyfikowany pokarm dla gryzoni (Lab Diet # 5002, granulki) i wodę z kranu dostarczano do woli podczas okresu przyzwyczajania. Podczas okresu badania szczury będą otrzymywały wzbogacony pokarm węglowodanowy do woli.
Wzbogacony pokarm (pokarm # 3) składał się z (g/100 g): skrobia kukurydziana, 31,3; dekstroza, 31,2; kazeina, 20,0; olej kukurydziany, 6,4; d1-metionina, 0,3; mieszanka witaminowa, 1,0; AIN-76 mieszanka mineralna, 4,9; włókno, 5,0. Na dzień przed sekcją szczury wyposzczono (tylko dostęp do wody) po południu (około 16:00).
Randomizacja
Szczury przypisano do każdej z grup przypadkowo w dniu 0 badania.
Sposoby i projekt eksperymentu
Grupy testowe: 80 szczurów przydzielono do 8 grup po 10 szczurów dla prowadzenia badania przedstawionego poniżej:
Terapia Dawkowanie zawiesiny
Dawka (mg/ml) Objętość/szczura (ml)
Nietknięte 0 0,5 ml
OVX 0 0,5 ml
OVX + EM-652 · HCl 0,5 0,5 ml
OVX + E2 0,5 0,5 ml
OVX + DHEA 100 0,5 ml
OVX + EM-652 · HCl + DHEA 0,5 + 100 0,5 ml + 0,5 ml
OVX + EM-652 · HCl + E2 0,5 + 0,5 0,5 ml + 0,5 ml
Przygotowanie zwierząt
W dniu 0 badania, szczurom z grupy 2 do 8 wycięto jajniki, przez boczne obustronne nacięcie, pod znieczuleniem indukowanym izofluranem. Szczury z grupy 1 operowano pozornie.
Dawkowanie
Podawanie testowanych substancji lub nośnika rozpoczęto w dniu 1 (dzień po wycięciu jajników). Testowane związki podawane jako zawiesiny w 0,4% metylocelulozie przez doustny zgłębnik (0,5 ml/zgłębnik) przez 20 dni.
Pomiar składu ciała
W dniu 21 badania (przed sekcją), skład ciała określono na całym szkielecie ciała zwierzęcia pod indukowanym izofluranem znieczuleniem z użyciem absorpcjometrii rentgenowskiej o podwójnej energii (DEXA; QDR 4500A, Hologic) w celu określenia wpływu terapii na procent tłuszczu.
Zebrane narządy i tkanki
Zebrano i zważono prawą i lewą zaotrzewnową tkankę tłuszczową.
PL 208 972 B1
Wyniki
T a b l i c a 5
Terapia Tłuszcz (%) Zaotrzewnowa tkanka tłuszczowa (g)
Nietknięte 15,7 ± 0,8 2,20 ± 0,20
OVX 18,9 ± 1,5 3,70 ± 0,41
OVX + EM-652 · HCl 10,2 ± 1,2 1,52 ± 0,18
OVX + E2 10,3 ± 0,6 0,81 ± 0,17
OVX + DHEA 7,8 ± 0,8 0,92 ± 0,17
OVX + EM-652 · HCl + DHEA 8,4 ± 0,9 1,15 ± 0,17
OVX + EM-652 · HCl + E2 10,4 ± 0,7 1,17 ± 0,19
P r z y k ł a d 7. Wpływ 34-tygodniowej terapii etynyloestradiolem, EM-652 · HCl, raloksyfenem i DHEA na parametry zawartości tłuszczu w ciele i masy ciała samic szczurów z wyciętymi jajnikami. URMA-r-42-98
Celem tego badania była ocena wpływu kombinowanej terapią EM-652 · HCl i DHEA na parametry zawartości tłuszczu w ciele i masy ciała u szczurów z wyciętymi jajnikami.
W tym celu, szczury z wycię tymi jajnikami otrzymywały dziennie EM-652 · HCl (1 mg/kg) i DHEA (80 mg/kg) oddzielnie lub w kombinacji, przez 34 tygodnie. EM-652 · HCl podawano doustnie, podczas gdy DHEA nałożono miejscowo na skórę grzbietu.
Jedną z grup zwierząt potraktowano doustnie 17a-etynyloestradiolem (0,1 mg/kg) i raloksyfen (EM-1105; 1 mg/kg) dla porównania.
Materiały i sposoby
Zwierzęta i terapia
Użyto 10 do 12-tygodniowych samic szczurów Sprague-Dawley (Crl: CD (SD) Br) ważących w przybliżeniu 235-250 g na początku terapii.
szczurów rozłożono przypadkowo pomiędzy 7 grup od 11 do 12 zwierząt na grupę, jak następuje:
1) nietknięte kontrolne;
2) kontrola OVX;
3) OVX + EE2 (0,1 mg/kg);
4) OVX + raloksyfen (1 mg/kg);
5) OVX + EM-652 · HCl (1 mg/kg);
6) OVX-DHEA (80 mg/kg);
7) 0VX + EM-652 · HCl + DHEA. W dniu 1 badania, zwierzęta z odpowiednich grup poddano obustronnemu 5 wycięciu jajników (OVX) ze znieczuleniem izofluranem.
EM-652 · HCl, raloksyfen i EE2 (Steraloids) podawano raz dziennie przez doustny zgłębnik jako zawiesinę w 0,4% metylocelulozie (0,5 ml/szczura) przez 34 tygodnie, a DHEA nakładano miejscowo raz dziennie na skórę grzbietu jako roztwór w 50% etanolu 50% glikolu propylenowego (0,5 ml/szczura) przez ten sam czas.
W przybliżeniu 24 godziny po ostatnim dawkowaniu, wyposzczone przez noc zwierzęta zabito przez wykrwawienie z tętnicy brzusznej pod znieczuleniem izofluranem.
Zebrano i zważono prawą i lewą zaotrzewnową tkankę tłuszczową.
Pomiar składu ciała
Po 34 tygodniach terapii, pojedynczym szczurom pod znieczuleniem izofluranem zeskanowano szkielet całego ciała z użyciem absorpcjometrii rentgenowskiej o podwójnej energii (DEXA; QDR 4500A, Hologic, Waltham, MA) i oprogramowaniem Regional High Resolution Scan. Określono skład ciała (obejmujące procent tłuszczu).
Analiza statystyczna
Dane wyrażono jako średnie ± standardowe odchylenie.
PL 208 972 B1
Wyniki
T a b l i c a 6
Terapia Prawa zaotrzewnowa tkanka tłuszczowa (g) Lewa zaotrzewnowa tkanka tłuszczowa (g) Tłuszcz (%)
Nietknięte 1,43 ± 0,12 1,80 ± 0,26 25,7 ± 2,5
OVX kontrolne 2,53 ± 0,24 2,64 ± 0,18 42,1 ± 1,5
OVX + EE2 (0,1 mg/kg) 1,29 ± 0,22 1,15 ± 0,18 19,8 ± 1,9
OVX + raloksifen (1 mg/kg) 1,29 ± 0,12 1,41 ± 0,13 22,8 ± 1,6
OVX + EM652 · HCl (1 mg/kg) 2,07 ± 0,18 2,19 ± 0,28 27,7 ± 1,8
OVX + DHEA (80 mg/kg) 2,16 ± 0,25 1,98 ± 0,17 26,8 ± 2,3
OVX + EM652 · HCl + DHEA 1,62 ± 0,18 1,47 ± 0,18 25,1 ± 1,8
P r z y k ł a d 8A. Wpływ EM652 · HCl na bilans energetyczny i metabolizm lipidowo-lipoproteinowy u chudych i otyłych samców szczurów Zucker. URMA-r-61-99
Celem tego badania było określenie wpływu EM652 · HCl na bilans energetyczny i metabolizm lipidowo-lipoproteinowy u chudych i otyłych samców szczurów Zucker. W tym celu EM652 · HCl (2,5 mg/kg) podawano doustnie (zgłębnik) raz dziennie przez 14 dni nietkniętym chudym i otyłym samcom szczurów Zucker.
Zwierzę testowane
Gatunek: Rattus norvegicus
Szczep: Zucker
Płeć: samce
Masy ciała: na początku dawkowania, masy ciała wynosiły w przybliżeniu: chude szczury: 175 ± 15 g; otyłe szczury: 235 ± 15 g
Aklimatyzacja
Szczury przyzwyczajono do warunków laboratoryjnych co najmniej na pięć dni przed rozpoczęciem eksperymentu.
Zamieszkanie i odżywianie
a) Zamieszkanie: szczury trzymano osobno w klatkach ze stali nierdzewnej konwencjonalnego rodzaju podczas okresu przyzwyczajania i badania.
b) Temperatura: temperaturę w pomieszczeniu szczurów rejestrowano dziennie. Docelową temperaturą było 22 ± 3°C.
c) Cykl światła-ciemności: cykl światła-ciemności wynosił 10 godzin światła i 14 godzin ciemności. Światła włączano o 07:00 i gaszono o 17:00.
d) Pokarm: podczas okresu przyzwyczajania, szczury będą otrzymywały handlowy pokarm dla gryzoni (Purina # 5075) i wodę z kranu do woli.
Podczas okresu badania szczury będą otrzymywały następujący pokarm (pokarm # 3) złożony z (g/100 g): skrobia, 31,2; dekstroza, 31,2; kazeina, 20,0; olej kukurydziany, 6,4; d1-metionina 0,3; mieszanka witaminowa, 1,0, mieszanka mineralna AIN-76, 4,9; włókno, 5,0.
Szczury wyposzczono (tylko dostęp do wody) około 07:00 rano w dniu sekcji.
Randomizacja:
Na jeden dzień przed dniem pierwszego dawkowania, szczury zważono i przypisano do grup w celu uzyskania grup o równoważnej średniej masie ciała.
Sposoby i projekt eksperymentu
Grupy testowe chudych i 16 otyłych nietkniętych samców szczurów przydzielono do 4 grup po 8 szczurów do prowadzenia badań pokazanych poniżej.
PL 208 972 B1
Liczba szczurów w grupie Rodzaj szczura Terapia Dawka (mg/kg)
8 chude EM652 · HCl 2,5
8 otyłe EM652 · HCl 2,5
8 chude kontrolne 0
8 otyłe kontrolne 0
Dawkowanie
Podawanie testowanego związku lub nośnika rozpoczęło się w dniu 1 badania. Testowany związek EM652 · HCl podawano jako zawiesinę w 0,4% metylocelulozie przez doustny zgłębnik (0,5 ml/zgłębnik/szczura) raz dziennie przez 14 dni. Szczury z kontrolnych grup dostawały sam nośnik (0,5 ml/zgłębnik/szczura) przez ten sam czas.
Masy cia ł a
Podczas okresu przyzwyczajania, zwierzęta zważono jeden dzień przed początkiem dawkowania dla randomizacji. Następnie, szczury zważono w pierwszym dniu dawkowanie i co 2 dni, jak też w dniu sekcji. Masy ciał rejestrowano z dokładnością do 1 g.
Zużycie pokarmu
Zużycie pokarmu oceniano co 2 dni podczas okresu badania.
Sposób zabijania
Po około 6 godzinach postu, zwierzęta sekcjonowano (w przybliżeniu 30 godzin po ostatnim dawkowaniu). Znieczulono je ketaminą-ksylazyną i krew pobrano przez nakłucie serca.
Próbki krwi
Poziom lipidów we krwi (łączny cholesterol (CHOL) i triglicerydy (TG)) oraz glukozy mierzono na zamrożonych próbkach osocza stosując Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Analyzer (Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems). Hormony i substraty w krążeniu (leptyna, insulina) mierzono na zamrożonych próbkach osocza następującymi zestawami:
Leptyna: zestaw Linco RIA
Insulina: zestaw Linco RIA
Zebrane narządy i tkanki
Kawałek wątroby (~1 g) zamrożono w ciekłym azocie do dalszego określenia zawartości TG i CHOL (sposób Folcha). Zaotrzewnową tkankę tłuszczową i łydkę (mięsień) zebrano i zamrożono w ciekłym azocie do dalszego określenia aktywności lipazy lipoproteiny (LPL). Zebrano stercz, jądra i pęcherzyki nasienne. Stercz, jądra (razem prawe i lewe) i prawy pęcherzyk nasienny zważono. Prawe pęcherzyki nasienne odrzucono.
T a b l i c a 7 Samce szczurów Zucker
Grupa Zwiększenie masy Aktywność lipazy lipoproteiny w białej zaotrzewnowej tkance Aktywność lipazy lipo- proteiny w łydce Insulina w osoczu Glukoza w osoczu Łączny cholesterol w osoczu Triglicerydy w osoczu
Fenotyp Terapia (g) (μθ/g) (μθ/g) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l)
Chude Kontrolne 73,02 ± 4,2 2066 ± 353 71,7 ± 7,9 0,095 ± 0,027 10,74 ± 0,87 2,10 ± 0,15 1,47 ± 0,20
Chude EM652 · HCl 2,5 mg/kg 44,9 ± 3,5 1701 ± 348 69,5 ± 8,4 0,062 ± 0,005 9,35 ± 0,31 1,18 ± 0,09 1,52 ± 0,13
Otyłe Kontrolne 110,5 ± 6,7 7233±511 51,9 ± 8,8 1,092 ± 0,369 11,06 ± 0,84 3,07 ± 0,28 4,21 ± 0,78
Otyłe EM652 · HCl 2,5 mg/kg 71,6 ± 3,3 7046 ± 1185 58,1 ± 4,6 0,473 ± 0,087 11,84 ± 0,62 2,28 ± 0,25 7,16 ± 1,06
PL 208 972 B1
P r z y k ł a d 8B. Wpływ EM652 · HCl na bilans energetyczny i metabolizm lipidowo-lipoproteinowy u chudych i otyłych samic szczurów Zucker. URMA-r-47-99
Celem tego badania było określenie wpływu EM652 · HCl na bilans energetyczny i metabolizm lipidowo-lipoproteinowy u chudych i otyłych samic szczurów Zucker. W tym celu EM652 · HCl (2,5 mg/kg) podawano doustnie (zgłębnik) raz dziennie przez 14 dni nietkniętym chudym i otyłym samicom szczurów Zucker.
Specyfikacja testowanych zwierząt
Gatunek: Rattus norvegicus
Szczep: Zucker
Płeć: samice
Masy ciała: na początku dawkowania, masy ciała wynosiły w przybliżeniu: chude szczury: 114 ± 2 g; otyłe szczury: 182 ± 6 g
Aklimatyzacja
Szczury przyzwyczajono do warunków laboratoryjnych co najmniej na pięć dni przed rozpoczęciem eksperymentu.
Zamieszkanie i odżywianie
a) Zamieszkanie: szczury trzymano osobno w klatkach ze stali nierdzewnej konwencjonalnego rodzaju podczas okresu przyzwyczajania i badania.
b) Temperatura: temperaturę w pomieszczeniu szczurów rejestrowano raz dziennie. Docelową temperaturą było 22 ± 3°C.
c) Cykl światła-ciemności: cykl światła-ciemności wynosił 10 godzin światła i 14 godzin ciemności. Światła włączano o 07:00 i gaszono o 17:00.
d) Pokarm: podczas okresu przyzwyczajania, szczury będą otrzymywały handlowy pokarm dla gryzoni (Purina # 5075) i wodę z kranu do woli. Podczas okresu badania szczury będą otrzymywały następujący pokarm (pokarm # 3) złożony z (g/100 g) : skrobia, 31,2; dekstroza, 31,2; kazeina, 20,0; olej kukurydziany, 6,4; dl-metionina 0,3; mieszanka witaminowa, 1,0, mieszanka mineralna AIN-76, 4,9; włókno, 5,0. Szczury wyposzczono (tylko dostęp do wody) około 07:00 rano w dniu sekcji.
Randomizacja dni przed dniem pierwszego dawkowania, szczury zważono i przypisano do każdej grupy w celu uzyskania grup o równoważnej średniej masie ciała.
Sposoby i projekt eksperymentu
Grupy testowe: 16 chudych i 16 otyłych nietkniętych samic szczurów przydzielono do 4 grup po 8 szczurów do prowadzenia badań pokazanych poniżej.
Liczba szczurów w grupie Rodzaj szczura Terapia Dawka (mg/kg)
8 chude EM652 · HCl 2,5
8 otyłe EM652 · HCl 2,5
8 chude kontrolne 0
8 otyłe kontrolne 0
Dawkowanie
Podawanie testowanego związku lub nośnika rozpoczęło się w dniu 1 badania. Testowany związek EM652 · HCl podawano jako zawiesinę w 0,4% metylocelulozie przez doustny zgłębnik (0,5 ml/zgłębnik/szczura) raz dziennie przez 14 dni. Szczury z kontrolnych grup dostawały sam nośnik (0,5 ml/zgłębnik/szczura) przez ten sam czas.
Masy cia ła
Podczas okresu przyzwyczajania, zwierzęta zważono jeden dzień przed początkiem dawkowania dla randomizacji. Następnie, szczury zważono w pierwszym dniu dawkowanie i co 2 dni, jak też w dniu sekcji. Masy ciał rejestrowano z dokładnością do 1 g.
Zużycie pokarmu
Zużycie pokarmu oceniano co 2 dni podczas okresu badania.
PL 208 972 B1
Sposób zabijania
Po około 6 godzinach postu, zwierzęta sekcjonowano (w przybliżeniu 30 godzin po ostatnim dawkowaniu). Znieczulono je ketaminą-ksylazyną i krew pobrano przez nakłucie serca.
Próbki krwi
Poziom lipidów we krwi (łączny cholesterol (CHOL) i triglicerydy (TG)) oraz glukozy mierzono na zamrożonych próbkach osocza stosując Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Analyzer (Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems). Hormony i substraty w krążeniu (leptyna, insulina, kortykosteron) mierzono na zamrożonych próbkach osocza następującymi zestawami:
Leptyna: zestaw Linco RIA
Insulina: zestaw Linco RIA
Zebrane narządy i tkanki
Wątrobę pobrano i zważono. Kawałek wątroby (~1 g) zamrożono w ciekłym azocie do dalszego określenia zawartości TG i CHOL (sposób Folcha).
Nadnercza zebrano, zważono (lewe i prawe razem) i odrzucono.
Macice i jajniki pobrano, zważono i trzymano w 10% buforowanej formalinie do dalszego badania histologicznego. Lewe i prawe jajniki (bez jajowodów) zważono razem.
T a b l i c a 8
Grupa Masa Aktywność lipazy lipoproteiny w białej zaotrzewnowej tkance Aktywność lipazy lipoproteiny w łydce Insulina w osoczu Glukoza w osoczu Łączny cholesterol w osoczu Triglicerydy w osoczu
Fenotyp Terapia (g) (MU/g) (MU/g) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l)
Chude Kontrolne 175 ± 4 1586± 155 55,8 ± 8,1 0,122 ± 9,45 ± 2,33 ± 1,25 ± 0,16
0,02 0,68 0,10
Chude EM652 · 154 ± 5 1349±246 60,8 ± 11,1 0,063 ± 9,60 ± 1,57 ± 0,83 ± 0,07
HCl 2,5 mg/kg 0,012 0,11 0,14
Otyłe Kontrolne 319 ± 9 3980 ± 327 36,9 ± 8,6 0,410 ± 10,63 ± 4,83 ± 12,51 ±
0,033 0,55 0,27 3,25
Otyłe EM652 · 291 ± 9 3819±485 36,6 ± 7,1 0,515 ± 11,70 ± 3,27 ± 22,20 ±
HCl 2,5 mg/kg 0,091 0,47 0,97 4,44
P r z y k ł a d 9. Wpływ EM652 · HCl i DHEA, podawanych oddzielnie lub w kombinacji, na bilans energetyczny i metabolizm lipidowo-lipoproteinowy u szczurów. URMA-r-03-99
Celem tego badania było określenie wpływu EM652 · HCl i DHEA, podawanych oddzielnie lub w kombinacji, na bilans energetyczny i metabolizm lipidowo-lipoproteinowy u szczurów. Wpływ terapii oceniono na wielu parametrach po 20-dniowej terapii EM652 · HCl (0,5 mg/szczura, ~ 2,5 mg/kg doustnie) i DHEA (20 mg/szczura, ~ 100 mg/kg, miejscowe nakładanie), podawanych oddzielnie lub w kombinacji, samicom szczurów nietkniętym (FNT) i z wyciętymi jajnikami (OVX) otrzymującym wysokosacharozowo-wysokotłuszczowy pokarm.
Dla porównania, jedna kontrolna grupa nietknięta i z wyciętymi jajnikami otrzymuje wzbogacony pokarm, podczas gdy inne kontrolne zwierzęta (nietknięte i OVX) będą otrzymywały handlowy pokarm dla gryzoni.
Zwierzę testowane
Gatunek: Rattus norvegicus
Szczep: szczur Sprague-Dawley (Crl: CD® (SD) BR VAF/Plus™)
Płeć: samica
Masa ciała: na początku dawkowania, masy ciała wynosiły w przybliżeniu 190-220 g.
Aklimatyzacja
Szczury zaaklimatyzowano do warunków laboratoryjnych co najmniej 5 dni przed początkiem eksperymentu.
PL 208 972 B1
Zamieszkanie i odżywianie
a) Zamieszkanie: szczury trzymano osobno w klatkach ze stali nierdzewnej konwencjonalnego rodzaju podczas aklimatyzacji i badania.
b) Temperatura: temperaturę w pomieszczeniu szczurów rejestrowano raz dziennie. Docelową temperaturą było 22 ± 3°C.
c) Cykl światła-ciemności: cykl światła-ciemności wynosił 10 godzin światła i 14 godzin ciemności. Światła włączano o 06:00 i gaszono o 16:00.
d) Pokarm: podczas okresu przyzwyczajania, szczury będą otrzymywały handlowy pokarm dla gryzoni (Purina # 5075) i wodę z kranu do woli. Podczas okresu badania grupy 1 i 2 będą wciąż otrzymywały handlowy pokarm, podczas gdy grupy 3 do 10 będą otrzymywały wysokosacharozowo-wysokotłuszczowy pokarm złożony z (g/100 g): sacharozy, 45; oleju kukurydzianego 10; smalcu, 10; kazeiny, 22,5; d1-metioniny, 0,3; mieszanki witaminowej 1,2; mieszanki mineralnej AIN-7, 5,5; włókna, 5,5. Szczury wyposzczono (tylko dostęp do wody) około 22:00 wieczorem przez sekcją.
Randomizacja
Kilka dni po przybyciu szczury zważono i przypisano każdej grupie w celu uzyskania grup o równoważnej średniej masie ciała.
Sposoby i projekt eksperymentu
Grupy testowe: 80 szczurów przydzielono do 10 grup po 8 szczurów do prowadzenia badań pokazanych poniżej.
Pokarm Terapia Dawka (mg/szczura)
doustna miejscowa
Karma1 Nietknięte 0 0
OVX 0 0
Nietknięte 0 0
Pokarm specjalny2 Nietknięte + EM-652 · HCl 0,5 0
Nietknięte + DHEA 0,5 20
Nietknięte + EM-652 · HCl + DHEA 0,5 20
OVX 0 0
OVX + EM-652 · HCl 0,5 0
OVX + DHEA 0 20
OVX + EM-652 · HCl + DHEA 0,5 20
1 Handlowa karma dla gryzoni 2 Wysokosacharozowo-wysokotłuszczowy pokarm
Przygotowanie zwierząt
W dniu 0 badania, szczurom z odpowiednich grup wycięto jajniki (obustronne boczne nacięcie) pod znieczuleniem izofluranem. Nietknięte szczury operowano pozornie.
Dawkowanie
Podawanie testowanych związków lub nośnika rozpoczęto w dniu po wycięciu jajników (dzień 1). Testowany związek EM-652 · HCl podawano jako zawiesinę w 0,4% metylocelulozie przez doustny zgłębnik (0,5 ml/zgłębnik/szczura) raz dziennie przez 20 dni, podczas gdy DHEA nakładano miejscowo na skórę grzbietu (0,5 ml/nakładanie/szczura) raz dziennie przez ten sam czas. Szczury z kontrolnych grup dostawały sam nośnik (doustnie i miejscowo). Szczury zabijano w dniu 21 badania w przybliżeniu 24 godziny po ostatnim dawkowaniu.
Masy ciała
Szczury zważono w dniu 0 (zabieg chirurgiczny), co 2 dni podczas okresu badania i w dniu sekcji. Masy ciał rejestrowano z dokładnością 1,0 g.
Zużycie pokarmu
Zużycie pokarmu oceniano co 2 dni podczas okresu badania.
PL 208 972 B1
Sposób zabijania
W dniu 21 badania, wyposzczone przez noc szczury zabijano w przybliżeniu 24 godziny po ostatnim dawkowaniu. Znieczulono je ketaminą-ksylazyną i krew pobrano przez nakłucie serca.
Próbki krwi
Poziom lipidów we krwi (łączny cholesterol i triglicerydy) mierzono na zamrożonych próbkach osocza stosując Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Analyzer (Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems). Hormony i substraty v krążeniu (insulina, leptyna, glukoza) mierzono w próbkach osocza, jak następuje.
Insulina: zestaw Linco RIA
Glukoza: automatyczny analizator glukozy Beckmann
Leptyna: zestaw Linco RIA
Zebrane narządy i tkanki
Poniższe tkanki zebrano i zważono dla wszystkich zwierząt: mięsień (łydki i VLM), tłuszcz (zaotrzewnowy i pachwinowy), serce, brunatna tkanka tłuszczowa. Mózg będzie się pobierać również. Kawałek wątroby zamrożono do późniejszego określania zawartości TG i CHOL (sposób Folchisa) i inne tkanki przetworzono dla określenia aktywności LPL. Macicę (i jajniki w nietkniętych grupach) usunięto, oczyszczono z reszty tłuszczu, zważono i trzymano w 10% buforowanej formalinie.
Wyniki
T a b l i c a 9a
Grupa Łączna masa Łączna tkanka tłuszczowa pachwinowa Łączna tkanka tłuszczowa zaotrzewnowa Brunatna tkanka tłuszczowa
Pokarm Terapia (g) Masa (g) Aktywność lipazy lipoproteinowej (pU/g białka) Masa (g) Aktywność lipazy lipoproteinowej (pU/g białka) Masa (g) Aktywność lipazy lipoproteinowej (pU/g białka)
Karma Kontrolne 239 ± 6 0,410 ± 252 ± 55 0,983 ± 1526±217 0,329 ± 1053±138
pozorne 0,043 0,104 0,035
Karma Kontrolne 294 ± 6 0,888 ± 570±100 1,472 ± 2415±147 0,466 ± 688 ± 88
OVX 0,0146 0,199 0,041
Sacharoza Kontrolne 257 ± 10 0,716 ± 344 ± 73 1,765 ± 1470±242 0,376 ± 1073± 152
+ tłuszcz pozorne 0,107 0,292 0,030
Sacharoza Pozorne 238 ± 5 0,435 ± 160 ± 23 1,058 ± 1277 ± 56 0,306 ± 1196 ± 83
+ tłuszcz + EM652 0,043 0,162 0,044
· HCl
Sacharoza Pozorne 252 ± 5 0,659 ± 194 ± 45 1,067 ± 1177±188 0,373 ± 982 ± 72
+ tłuszcz + DHEA 0,075 0,149 0,036
Sacharoza Pozorne 294 ± 4 0,489 ± 224 ± 45 0,909 ± 1349 ± 133 0,322 ± 885 ± 78
+ tłuszcz + EM652 · HCl +DHEA 0,083 0,124 0,026
Sacharoza Kontrolne 316 ± 8 1,800 ± 725±106 3,058 ± 2503±215 0,519 ± 867 ± 99
+ tłuszcz + OVX 0,251 0,297 0,064
Sacharoza OVX + 268 ± 5 0,709 ± 310 ± 63 1,370 ± 1612 ± 186 0,408 ± 678 ± 65
+ tłuszcz EM652 · HCl 0,085 0,211 0,025
Sacharoza OVX + 274 ± 9 0,885 ± 583±134 1,699 ± 1905±112 0,342 ± 1069±96
+ tłuszcz DHEA 0,156 0,151 0,049
Sacharoza EM652 · 263 ± 5 0,658 ± 306 ± 42 1,436 ± 1542 ± 118 0,373 ± 876 ± 75
+ tłuszcz HCl +DHEA 0,088 0,162 0,040
PL 208 972 B1
T a b l i c a 9b
Grupa Mię sie ń ł ydki Mięsień boczny kolanowy Wątroba
Pokarm Terapia Masa (g) Aktywność lipazy lipo- proteinowej ^U/g białka) Masa (g) Aktywność lipazy lipoproteinowej ^U/g białka) Masa (g) Aktywność lipazy lipoproteinowej ^U/g białka)
Karma Kontrolne pozorne 0,106 ± 62,7 ± 3,0 0,872 ± 11,7 ± 3,5 0,76 ± 0,134 ±
0,002 0,027 0,004 0,019
Karma Kontrolne + OVX 0,116 ± 43,8 ± 3,3 1,000 ± 13,1 ± 3,7 0,082 ± 0,169 ±
0,005 0,042 0,004 0,027
Sacharoza Kontrolne pozorne 0,096 ± 55,0 ± 5,1 0,927 ± 13,1 ± 3,2 0,083 ± 0,123 ±
+ tł uszcz 0,005 0,040 0,002 0,014
Sacharoza Pozorne + EM652 · HCl 0,098 ± 53,9 ± 3,3 0,965 ± 16,2 ± 3,1 0,096 ± 0,360 ±
+ tł uszcz 0,005 0,034 0,011 0,102
Sacharoza Pozorne + DHEA 0,105 ± 53,6 ± 7,5 0,893 ± 11,5 ± 2,0 0,068 ± 0,038 ±
+ tł uszcz 0,004 0,043 0,003 0,007
Sacharoza Pozorne + EM652 · HCl 0,098 ± 56,4 ± 4,5 0,971 ± 19,5 ± 3,5 0,101 ± 0,184 ±
+ tł uszcz + DHEA 0,005 0,029 0,008 0,033
Sacharoza Kontrolne + OVX 0,110 ± 39,2 ± 3,9 1,037 ± 10,9 ± 1,82 0,097 ± 0,262 ±
+ tł uszcz 0,004 0,026 0,007 0,052
Sacharoza OVX + EM652 · HCl 0,104 ± 39,1 ± 5,0 0,944 ± 10,8 ± 3,2 0,092 ± 0,348 ±
+ tł uszcz 0,004 0,030 0,006 0,078
Sacharoza OVX + DHEA 0,103 ± 46,9 ± 4,7 0,920 ± 13,1 ± 5,4 0,079 ± 0,165 ±
+ tł uszcz 0,005 0,049 0,005 0,047
Sacharoza OVX + EM652 · HCl + 0,101 ± 48,4 ± 4,8 0,929 ± 11,0 ± 4,1 0,106 ± 0,273 ±
+ tł uszcz DHEA 0,001 0,038 0,008 0,031
T a b l i c a 9c
Grupa Insulina w osoczu Glukoza w osoczu Łączny cholesterol w osoczu Triglicerydy w osoczu Lepetyna w osoczu
Pokarm Terapia mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l ng/l
Karma Kontrolne pozorne 0,071 ± 0,010 7,56 ± 0,24 1,61 ± 0,17 0,49 ± 0,12 1,404 ± 0,224
Karma Kontrolne OVX 0,146 ± 0,027 8,69 ± 0,57 2,10 ± 0,10 0,68 ± 0,10 2,388 ± 0,224
Sacharoza + tłuszcz Kontrolne pozorne 0,079 ± 0,013 9,07 ± 0,48 1,60 ± 0,12 0,66 ± 0,17 3,572 ± 0,699
Sacharoza + tłuszcz Pozorne + EM652 · HCl 0,057 ± 0,004 9,03 ± 0,49 1,15 ± 0,06 0,60 ± 0,12 2,019 ± 0,402
Sacharoza + tłuszcz Pozorne + DHEA 0,048 ± 0,012 8,05 ± 0,51 1,59 ± 0,17 0,61 ± 0,11 1,977 ± 0,225
Sacharoza + tłuszcz Pozorne + EM652 · HCl + DHEA 0,049 ± 0,013 7,99 ± 0,44 0,93 ± 0,08 0,95 ± 0,21 1,071 ± 0,162
Sacharoza + tłuszcz Kontrolne + OVX 0,125 ± 0,022 10,46 ± 0,72 1,62 ± 0,26 0,83 ± 0,13 7,90 ± 1,982
Sacharoza + tłuszcz OVX + EM652 · HCl 0,089 ± 0,013 9,06 ± 0,30 1,15 ± 0,11 0,97 ± 0,16 1,989 ± 0,326
Sacharoza + tłuszcz OVX + DHEA 0,052 ± 0,009 8,64 ± 0,24 1,57 ± 0,12 0,62 ± 0,08 2,757 ± 0,631
Sacharoza + tłuszcz OVX + EM652 · HCl + DHEA 0,060 ± 0,010 8,65 ± 0,38 0,87 ± 0,09 0,92 ± 0,21 1,672 ± 0,327
PL 208 972 B1
P r z y k ł a d 10. Wpływ EM-652 · HCl, TSE 424, lasofoksyfenu, LY 353381 i raloksyfenu na bilans energetyczny i metabolizm lipidowo-lipoproteinowy u samic szczurów z wyciętymi jajnikami. URMA-r-45-00
Celem tego badania było określenie wpływu na bilans energetyczny i metabolizm lipidowolipoproteinowy u szczurów terapii różnymi selektywnymi modulatorami receptorów estrogenu opisanymi w literaturze oraz porównanie z wynikami uzyskanymi dla EM-652 · HCl.
W tym celu testowane związki podawano doustnie przez zgłębnik przez 20 dni (0,5 mg/szczura dla każdego związku; 0,5 ml/szczura) w 0,4% metylocelulozie samicom szczurów z wyciętymi jajnikami. Nietknięte kontrolne, kontrolne z wyciętymi jajnikami (OVX) i szczury OVX potraktowano 17β-estradiolem (E2) użytym jako odnośnik.
Zwierzę testowane
Gatunek: Rattus norvegicus
Szczep: szczur Sprague-Dawley (Crl: CD® (SD) BR VAF/Plus™)
Płeć: samica
Masa ciała: na początku dawkowania, masy ciała wynosiły przybliżeniu 200-225 g
Zamieszkanie i odżywianie
a) Zamieszkanie: szczury trzymano osobno w klatkach ze stali nierdzewnej konwencjonalnego rodzaju podczas aklimatyzacji i badania.
b) Temperatura: warunki środowiskowe (temperaturę, wilgotność) w pomieszczeniu szczurów rejestrowano w sposób ciągły stosując skomputeryzowany automatyczny system. Docelowe warunki to 22 ± 3°C i 50 ± 20% względnej wilgotności.
c) Cykl światła-ciemności: cykl światła-ciemności wynosił 10 godzin światła i 14 godzin ciemności. Światła włączano o 07:15 i gaszono o 17:15.
d) Pokarm: podczas okresu przyzwyczajania, szczury otrzymywały certyfikowany pokarm dla gryzoni (LabDiet # 5002, granulki) i wodę z kranu do woli, podczas gdy podczas okresu badania szczury otrzymywały pokarm wysokowęglowodanowy (pokarm # 3) i wodę 5 z kranu do woli. Pokarm składał się z (g/100 g): skrobi kukurydzianej, 31,2; dekstrozy, 31,2; kazeiny, 20,0: oleju kukurydzianego, 6,4, d1-metioniny, 0,3; mieszanki witaminowej, 1,0; mieszanki mineralnej AIN-76, 4,9; włókna, 5,0. Szczury wyposzczono (tylko dostęp do wody) około 07:00 rano w dniu 30 sekcji.
Randomizacja
Szczury przydzielono do każdej grupy w celu uzyskania równoważnych średnich mas ciała.
Sposoby i projekt eksperymentu
Grupy testowe szczurów przydzielono do 8 grup po 9-10 szczurów do prowadzenia badań pokazanych poniżej.
Liczba szczurów Terapia Dawkowane zawiesiny
Dawka (mg/szczura) Objętość (ml)
9 Nietknięte 0 0,5 ml
9 OVX 0 0,5 ml
10 OVX- EM-652 · HCl 0,5 0,5 ml
10 OVX + TSE424 (EM-3527) 0,5 0,5 ml
10 OVX + lasofoksyfen (EM-3555) 0,5 0,5 ml
10 OVX + LY 353381 (EM-1665) 0,5 0,5 ml
10 OVX + raloksyfen (EM-1105) 0,5 0,5 ml
9 OVX + E2 0,5 0,5 ml
Przygotowanie zwierząt
W dniu 0 badania, szczurom z grup 2 do 8 wycięto jajniki (przez obustronne boczne nacięcie) pod znieczuleniem izofluranem. Szczury z grupy I operowano pozornie.
PL 208 972 B1
Masy cia ła
Szczury zważono w dniu 0 (zabieg chirurgiczny), następnie co 2 dni podczas okresu badania i w dniu sekcji.
Zużycie pokarmu
Zużycie pokarmu oceniano co 2 dni.
Skład ciała (% tłuszczu)
W celu określenia wpływu terapii na procent tłuszczu, skład ciała mierzono w dniu 17 badania stosując absorpcjometrię rentgenowską o podwójnej energii (DEXA; QDR 4500A, Hologic, Waltham, MA).
Sposób zabijania
W dniu 21 badania, w przybliżeniu 24 godziny po ostatnim dawkowaniu i 6 godzinach postu, zwierzęta znieczulone ketaminą-ksylazyną zabito przez wykrwawienie z tętnicy brzusznej.
Próbki krwi
Poziom lipidów we krwi (łączny cholesterol i triglicerydy) i oraz glukozy mierzono na zamrożonych próbkach osocza stosując Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Analyzer (Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems).
Hormony i substraty w krążeniu (leptyna, insulina) mierzono na zamrożonych próbkach osocza następującymi zestawami:
Leptyna: zestaw Linco RIA
Insulina: zestaw Linco RIA
Zebrane narządy i tkanki
Poniższe tkanki zebrano i zważono: mięsień (łydki i VLM), tłuszcz (prawy zaotrzewnowy i prawy pachwinowy), brunatną tkankę tłuszczową, serce, wątrobę, macicę i pochwę.
Kawałek wątroby (~ 0,5 g) zamrożono w ciekłym azocie do dalszego określenia zawartości TG i CHOL (sposób Folcha).
Kawałek ~0,1 g każdej tkanki (poza macicą i pochwą) zamrożono w ciekłym azocie i trzymano w -80°C do dalszego określenia aktywności lipazy lipoproteiny (LPL).
Macicę i pochwę trzymano w 10% buforowanej formalinie do dalszego histologicznego badania.
Szkielet zwierzęcia wprowadzono do metalowego pudełka i trzymano w temperaturze -20°C do pomiaru bilansu energii.
Wyniki
T a b l i c a 10a
Terapia Łączna masa (g) Biała tkanka tłuszczowa pachwinowa Biała tkanka tłuszczowa zaotrzewnowa Biała tkanka tłuszczowa
Masa (g) Aktywność lipazy lipoproteinowej (μυ/g białka) Masa (g) Aktywność lipazy lipoproteinowej (μυ/g białka) Masa (g) Aktywność lipazy lipoproteinowej (μυ/g białka)
Nietknięte 232 ± 7 0,350 ± 0,037 379 ± 69 1,31 ± 0,009 1537±253 0,410 ± 0,030 973±115
OVX 284 ± 5 0,320 ± 0,048 797 ± 97 1,55 ± 0,15 2664 ± 338 0,380 ± 0,027 880±130
OVX + EM-652 · HCl 252 ± 4 0,244 ± 0,028 684±216 1,32 ± 0,21 1917±365 0,339 ± 0,038 900 ± 91
OVX + TSE424 260 ± 5 0,326 ± 0,042 766±173 1,27 ± 0,15 1750±140 0,350 ± 0,019 1017±83
OVX + lasofoksyfen 210 ± 2 0,187 ± 0,023 801 ±138 0,867 ± 0,132 1417±163 0,244 ± 0,022 982 ± 98
OVX + LY353381 231 ± 4 0,290 ± 0,038 559±165 0,968 ± 0,120 1365±191 0,368 ± 0,031 888 ± 65
OVX + raloksifen 230 ± 3 0,245 ± 0,047 579 ± 46 1,32 ± 0,24 1510±52 0,307 ± 0,26 960±116
OVX + E2 198 ± 4 0,158 ± 0,019 416 ± 74 0,550 ± 0,102 1442±243 0,211 ± 0,021 1198±62
PL 208 972 B1
T a b l i c a 10b
Terapia Mięsień łydki Mięsień boczny kolanowy
Masa (g) Aktywność lipazy lipoproteinowej (μύ/g białka) Masa (g) Aktywność lipazy lipoproteinowej (μύ/g białka)
Nietknięte 0,113 ± 0,020 17,2 ± 2,2 0,924 ± 0,031 BD
OVX 0,108 ± 0,006 17,6 ± 3,9 0,963 ± 0,045 BD
OVX + EM-652 · HCl 0,118 ± 0,018 14,5 ± 4,1 1,000 ± 0,470 BD
OVX + TSE424 0,100 ± 0,004 11,7 ± 1,9 0,993 ± 0,330 BD
OVX + lasofoksyfen 0,096 ± 0,003 10,9 ± 1,5 0,800 ± 0,048 BD
OVX + LY353381 0,092 ± 0,002 10,1 ± 1,0 0,955 ± 0,200 BD
OVX + raloksyfen 0,099 ± 0,003 10,2 ± 2,0 0,795 ± 0,005 BD
OVX + E2 0,086 ± 0,003 10,9 ± 2,0 0,718 ± 0,026
T a b l i c a 10c
Terapia Skumulowany pokarm (g) Insulina w osoczu (mmol/l) Glukoza w osoczu (mmol/l) Łączny cholesterol w osoczu (mmol/l) Triglicerydy w osoczu (mmol/l) Leptyna w osoczu (ng/l)
Nietknięte 322 ± 14 0,086 ± 011 13,6 ± 0,7 2,41 ± 0,16 0,62 ± 0,07 2,46 ± 0,37
OVX 398 ± 8 0,178 ± 0,03 15,9 ± 1,9 2,58 ± 0,11 0,63 ± 0,05 3,48 ± 0,40
OVX + EM-652 · HCl 324 ± 5 0,122 ± 0,021 15,9 ± 1,4 1,41 ± 0,09 0,91 ± 0,17 1,10 ± 0,22
OVX + TSE424 347 ± 9 0,113 ± 0,029 16,5 ± 2,7 1,66 ± 0,16 0,93 ± 0,24 2,12 ± 0,44
OVX + lasofoksyfen 283 ± 14 0,095 ± 0,017 15,8 ± 1,32 1,29 ± 0,06 0,81 ± 0,21 0,97 ± 0,29
OVX + LY353381 312 ± 7 0,104 ± 0,11 17,1 ± 0,72 1,15 ± 0,08 1,23 ± 0,28 1,22 ± 0,21
OVX + raloksyfen 307 ± 8 0,077 ± 0,10 13,8 ± 1,2 1,19 ± 0,08 1,20 ± 0,35 1,39 ± 0,30
OVX + E2 255 ± 9 0,070 ± 0,007 11,8 ± 1,35 2,03 ± 0,15 0,43 ± 0,04 0,309 ± 0,097
P r z y k ł a d 11. Wpływ związków według wynalazku, jak też dotychczasowych związków, na aktywność zasadowej fosfatazy w ludzkich komórkach gruczakolakoraka Ishikawy śluzówki macicy
Substancje
Utrzymanie magazynowych kultur komórek
Ludzką linię komórek Ishikawa pochodzących z dobrze zróżnicowanego gruczakolakoraka śluzówki macicy uprzejmie dostarczył Dr. Erlio Gurpide, The Mount Sinai Medical Center, New York, NY. Komórki Ishikawa rutynowo trzymano w minimalnej podstawowej pożywce Eagle (MEM) zawierającej 5% (objętościowo) FBS i uzupełnionej 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,1 mM roztworem endogennych aminokwasów. Komórki umieszczono w kolbach Falcon T75 przy gęstości komórek 1,5 x 106 w temperaturze 37°C.
Eksperymenty z kulturą komórek godziny przed rozpoczęciem eksperymentu pożywkę prawie zlanych komórek Ishikawa zastąpiono świeżą wolną od estrogenów podstawową pożywką (EFBM) złożoną z mieszaniny 1:1 (objętościowo) wolnej od czerwieni fenolowej Ham's F-12 i pożywki Eagle modyfikacji Dulbecco (DMEM) uzupełnionej 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM glutaminy i 5% FBS potraktowaną dwukrotnie powlekanym dekstranem węglem aktywowanym dla usunięcia endogennych sterydów.
PL 208 972 B1
Komórki zebrano następnie 0,1% pankreatyna (Sigma) i 0,25 mM HEPES, zawieszono ponownie w EFBM i umieszczono na 96-dołkowych płaskodennych płytkach mikromiareczkowych Falcon przy gęstości 2,2 x 104 komórek/dołek w objętości 100 μl i pozostawiono do przywarcia do powierzchni płytek przez 24 godziny.
Następnie, pożywkę zastąpiono świeżą EFBM zawierającą wskazane stężenia związków w końcowej objętości 200 l. Komórki inkubowano przez 5 dni, ze zmianą pożywki po 48 godzinach.
Test na zasadową fosfatazę
Na koniec okresu inkubacji płytki mikromiareczkowe odwrócono i pożywkę wzrostu zlano. Płytki przepłukano 200 μl na dołek PBS (0,15M NaCl, 10 mM fosforanu sodu, pH 7,4).
PBS usunięto następnie z płytek ostrożnie zostawiając nieco PBS i procedurę przemywania powtórzono jeszcze raz.
Buforowaną solankę zlano, a odwrócone płytki osuszono ostrożnie papierowym ręcznikiem.
Po zastąpieniu pokrywek płytki umieszczono w temperaturze -80°C przez 15 minut, następnie rozmrażano w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Płytki umieszczono następnie na lodzie i dodano 50 μl lodowato zimnego roztworu zawierającego 5 mM fosforanu p-nitrofenylu, 0,24 mM MgCl2 i 1M dietanolaminę (pH 9,8).
Płytki ogrzano następnie do temperatury pokojowej i pozwolono wywołać żółty kolor z wytwarzania p-nitrofenylu (8 minut).
Płytki monitorowano przy 405 nm w czytniku płytek testowych ze związanym z enzymem immunosor-bentem (BIO-RAD, model 2550 EIA Reader).
Obliczenia
Krzywe dawka-reakcja, jak i wartości IC50 obliczono z użyciem ważonej iteracyjnej nieliniowej regresji kwadratowej.
PL 208 972 B1
T a b l i c a 11
Nazwa Nazwa kodowa Struktura Stymulacja zasadowej fosfatazy przez testowane związki % stymulacji ΙηΜ E2* (liczba doświadczeń) Inhibicja stymulacji przez lnM E2 zasadowej fosfatazy przez testowane związki IC50 (nM) (liczba doświadczeń)
EM-652-HC1 EM- 652-HCl; EM1538 ~ Jęęcr 1,8810,26 (22) 1,5210,22 (18)
OH- tamoksyfen EM-882 '7X5'' Ó) 32,412,2 (8) 31, 916,0 (5)
0H- toremifen EM-880 *50 1 ./Ό 29, 612,1 (6) 72,117,6 (3)
Idoksyfen EM-1750 dc. 25.111,5 (5) ' >1000 (2)
GW-5638 EM-1796 7,7515,5 (2) Bez inhibicji
Droloksyfen EM-835 CkJ 23,813,1 (7) 2911115 (4)
Raloksyfen LY 156758 EM-1105 12,811,7 (8) 3,3910,9 (6)
LY 353381 EM-1665 „aACA· 15,510,25 (5) 1,8710,07 (2)
Lasofoksy- fen (wolna zasada) EM-3114 9rr „AaJ 17, 9 (1) 4,24 (1)
TSE 424 EM-3527 Ο>Ό- r, 0,6 (1) 5,84 (1)
* % stymulacji 1 nM E2 = OD 405 nm związku - OD 405 nm podstawowe/OD 405 nm 1nM E2-OD 405 nm podstawowe; patrz także Labrie i in. EM-652 (SCH 57068), a third generation SERM active as pure antiestrogen in the mammary gland and endometrium, J. Steroid Biochem. and Mol. Bio.
PL 208 972 B1
P r z y k ł a d 12. Wpływ EM-652 · HCl i FCE 424 na rozrost linii komórek ludzkiego raka piersi MCF-7
Sposoby
Utrzymanie magazynowych kultur komórek
Komórki ludzkiego raka piersi MCF-7 otrzymano z American Type Culture Collection # HTB 22 na pasażu 47 i rutynowo hodowano w wolnej od czerwieni fenolowej pożywce Eagle modyfikacji Dulbecco-Ham's F12, w uzupełnieniach wspomnianych powyżej i 5% FBS. Linię komórek gruczakolakoraka MCF-7 ludzkiej piersi pochodzącą z wysięku opłucnowego 69-letniej kobiety z Kaukazu. Komórek MCF-7 użyto pomiędzy pasażami 148 i 165 i poddano hodowli pochodnej przez tydzień.
Badania rozrostu komórek
Komórki w późnej fazie logarytmicznego rozwoju zebrano 0,1% pankreatyną (Sigma) i umieszczono w zawiesinie w odpowiedniej pożywce zawierającej 50 ng wołowej insuliny/ml i 5% (objętościowo) FBS potraktowanej dwukrotnie powlekanym dekstranem węglem aktywowanym dla usunięcia endogennych sterydów. Komórki umieszczono na 24-dołkowych plastykowych płytkach mikromiareczkowych Falcon (2 cm2/dołek) przy wskazanej gęstości i pozostawiono do przywarcia do powierzchni płytek przez 72 godziny. Następnie, pożywkę zastąpiono świeżą pożywką zawierającą wskazane stężenia związków rozcieńczoną z roztworów magazynowych 1000 x w 99% redestylowanym etanolu w obecności lub w nieobecności E2. Komórki kontrolne otrzymały tylko etanolowy nośnik (0,1% EtOH, objętościowo). Komórki inkubowano przez określony czas z niewielkimi zmianami co 2 lub 3 dni. Liczbę komórek określono przez pomiar zawartości DNA.
Obliczenia i statystyczna analiza
Krzywe dawka-odpowiedź, jak też wartości IC50 obliczono stosując obliczono z użyciem ważonej iteracyjnej nieliniowej regresji kwadratowej. Wszystkie wyniki wyrażono jako średnie ± standardowe odchylenie.
T a b l i c a 12
Nazwa Nazwa kodowa Stymulacja DNA przez testowane związki % stymulacji przez 1 nM E2* Inhibicja stymulacji przez 1 nM E2 DNA przez testowane związki IC50 (nM)
EM-652 · HCl EM-652 · HCl; EM-1538 N. S. 0,796
TSE 424 EM-3527 N. S. 3,68
P r z y k ł a d 13. Porównywalny wpływ na masę macicy, tłuszczu i lipidu EM-652 · HCl, TSE 424 i lasofoksyfenu, podawanego oddzielnie lub w kombinacji z EM-652 · HCl, samicom szczurów z wyciętymi jajnikami. URMA-r-44-00
Celem tego badania jest porównanie wpływu na histologię macicy i pochwy po terapii EM-652 · HCl, TSE424 i lasofoksyfenu, podawanymi oddzielnie lub w kombinacji z EM-652 · HCl, samicom szczurów z wyciętymi jajnikami. W tym celu, każdy związek podawano doustnie przez 20 dni samicom szczurów z wyciętymi jajnikami i na koniec okresu terapii macicę i tłuszcz zebrano i zważono.
Specyfikacja zwierzęcia testowanego
Gatunek: Rattus norvegicus
Szczep: szczur Sprague-Dawley (Crl: CD® (SD) BR VAF/Plus™)
Płeć: samice
Masy ciała: na początku dawkowania, masy ciał wynosiły w przybliżeniu 225-250 g.
Zamieszkanie i odżywianie
a) Zamieszkanie: szczury trzymano osobno w klatkach ze stali nierdzewnej konwencjonalnego wyglądu podczas okresu przyzwyczajania i badania.
b) Temperatura i wilgotność: warunki środowiskowe (temperaturę, wilgotność) w pomieszczeniu szczurów rejestrowano w sposób ciągły stosując skomputeryzowany automatyczny system. Docelowe warunki to 22 ± 3°C i 50 ± 20% względnej wilgotności.
c) Cykl światła-ciemności: cykl światła-ciemności wynosił 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Te parametry rejestrowano w sposób ciągły stosując sprawdzony skomputeryzowany system automatyczny. Światła włączano o 07:15 do 19:15.
PL 208 972 B1
d) Pokarm: certyfikowany pokarm dla gryzoni (Lab Diet # 5002, granulki) i wodę z kranu dostarczano do woli.
Randomizacja
Szczury przypisano do każdej z grup przypadkowo w okresie wycinania jajników.
Grupy testowe szczurów podzielono na 7 grup 9 do 11 zwierząt do prowadzenia badań opisanych poniżej
Terapia Dawkowanie zawiesin Dawka (mg/szczura)
Nietknięte -
OVX -
OVX + EM-652 · HCl 0,5
OVX + EM-3527 0,5
OVX + EM-652 · HCl + EM-3527 2,5 + 0,5
OVX+ EM-3555 0,5
OVX + EM-652 · HCl + EM-3555 2,5 + 0,5
Przygotowanie zwierząt
Zwierzętom z grup 2 do 9 wycięto jajniki pod znieczuleniem indukowanym izofluranem w dniu 1 badania.
Dawkowanie
Nośnik lub testowane związki podawano jako zawiesinę w 0,4% metylocelulozie przez doustny zgłębnik (0,5 ml/zgłębnik/szczura) od dnia 2 do dnia 21 badania.
Masy ciała
Szczury zważono w dniu 1 badania i przy sekcji (dzień badania 22).
Sposób zabijania
W przybliżeniu 24 godziny po ostatnim dawkowaniu, wyposzczone przez noc szczury pod znieczuleniem indukowanym izofluranem zabito przez wykrwawienie z tętnicy brzusznej.
Zebrane narządy i tkanki
Macicę i zaotrzewnową tkankę tłuszczową usunięto i zważono.
T a b l i c a 13
Terapia Końcowa masa ciała (g) Zaotrzewnową tkanka tłuszczowa (g) Masa macicy (mg) Cholesterol (mmol/l)
Nietknięte 222 ± 5** 1,04 ± 0,13* 485,8 ± 28,4* 1,52 ± 0,09**
OVX 226 ± 5 1,42 ± 0,24 152,9 ± 4,7 1,91 ± 0,09
OVX + EM-652 · HCl 238 ± 4** 0,63 ± 0,08** 173,0 ± 7,1 1,00 ± 0,11**
OVX + TSE424 248 ± 5** 0,84 ± 0,09** 162,6 ± 5,2 1,20 ± 0,10**
OVX + TSE424 + EM-652 · HCl (2,5 mg) 241 ± 1** 0,91 ± 0,17** 180,2 ± 5,2 0,99 ± 0,07**
OVX + lasofoksylen 210 ± 3** 0,52 ± 0,05** 247,4 ± 9,1** 0,95 ± 0,09**
OVX + lasofoksylen + EM-652 · HCl (2,5 mg) 243 ± 3** 0,74 ± 0,10** 182,3 ± 4,6 0,95 ± 0,07**
* p < 0,05 ** p < 0,001, grupa eksperymentalna względem kontrolnej OVX
PL 208 972 B1
Przykłady kompozycji farmaceutycznych
Poniżej, przykładowo, a nie jako ograniczenie, przedstawiono kilka kompozycji farmaceutycznych wykorzystujących korzystny czynny SERM EM-800 lub EM-652 · HCl same lub w kombinacji z jednym z korzystnych czynnych prekursorów sterydów płciowych DHEA, 3-octanu androst-5-eno-3b,17b-diolu lub dihemibursztynianu androst-5-eno-3b,17b-diolu.
Inne związki według wynalazku lub ich kombinacje można stosować w miejsce (lub poza) EM-800 lub EM-652 · HCl, DHEA, 3-octanem androst-5-eno-3b,17b-diolu lub dihemibursztynianem androst-5-eno-3b,17b-diolu.
Stężenie składnika czynnego może się zmieniać w szerokim zakresie, jak omówiono w wynalazku. Ilości i typy innych składników, które można dołączać, są dobrze znane w dziedzinie.
Korzystne SERM według wynalazku podaje się doustnie.
P r z y k ł a d A Tabletka
Składnik % wagowych (względem masy całej kompozycji)
EM-652 · HCl 5,0
Żelatyna 5,0
Laktoza 73,5
Skrobia 16,5
P r z y k ł a d B Kapsułki
Składnik % wagowych (względem masy całej kompozycji)
EM-652 · HCl 5,0
Uwodniona laktoza 80,0
Skrobia 4,8
Celuloza mikrokrystaliczna 9,8
Stearynian magnezu 0,4
Farmaceutyczna kompozycja do terapii kombinowanych
P r z y k ł a d C Tabletka
Składnik % wagowych (względem masy całej kompozycji)
EM-652 · HCl 5,0
DHEA 15,0
Żelatyna 5,0
Laktoza 58,5
Skrobia 16,5
P r z y k ł a d D Kapsułka żelatynowa
Składnik % wagowych (względem masy całej kompozycji)
1 2
EM-652 · HCl 5,0
PL 208 972 B1 cd. tabeli D
1 2
DHEA 15,0
Uwodniona laktoza 65,0
Skrobia 4,8
Celuloza mikrokrystaliczna 9,8
Stearynian magnezu 0,4
Przykłady zestawów
Poniżej, przykładowo, a nie jako ograniczenie, przedstawiono kilka zestawów wykorzystujących korzystny czynny SERM EM-800 lub EM-652 · HCl i korzystny prekursor sterydu płciowego DHEA, 3-octan androst-5-eno-3b,17b-diolu lub dihemibursztynian androst-5-eno-3b,17b-diolu.
Inne związki według wynalazku lub ich kombinacje można stosować w miejsce (lub poza) EM800 lub EM-652 · HCl, DHEA, 3-octanem androst-5-eno-3b,17b-diolu lub dihemibursztynianem androst-5-eno-3b,17b-diolu.
Stężenie składnika czynnego (czynnych) może się zmieniać w szerokim zakresie, jak omówiono w wynalazku. Ilości i typy innych składników, które można dołączać, są dobrze znane w dziedzinie. SERM podaje się doustnie, podczas gdy prekursor sterydu płciowego podaje się przezskórnie.
P r z y k ł a d A
Kompozycja SERM do doustnego podawania (kapsułki)
Składnik % wagowych (względem masy całej kompozycji)
EM-652 · HCl 5,0
Uwodniona laktoza 80,0
Skrobia 4,8
Celuloza mikrokrystaliczna 9,8
Stearynian magnezu 0,4
Kompozycja prekursora sterydu płciowego do miejscowego podawania (żel)
Składnik % wagowych (względem masy całej kompozycji)
DHEA 10,0
Trigliceryd kaprylowy-kaprynowy (Neobee M-5) 5,0
Glikol heksylenowy 15,0
Transkutol (eter monometylowy glikolu dietylenowego) 5,0
Alkohol benzylowy 2,0
Cyklometykon (Dow Corning 345) 5,0
Etanol (absolutny) 56,0
Hydroksypropyloceluloza (1500 cps) (KLUCEL) 2,0
SERM i prekursor sterydu płciowego podaje się doustnie.
PL 208 972 B1
P r z y k ł a d B
Niesterydowa kompozycja antyestrogenowa do doustnego podawania (kapsułki)
Składnik % wagowych (względem masy całej kompozycji)
EM-652 · HCl 5,0
Uwodniona laktoza 80,0
Skrobia 4,8
Celuloza mikrokrystaliczna 9,8
Stearynian magnezu 0,4
Kompozycja prekursora sterydu płciowego do doustnego podawania (kapsułka żelatynowa)
Składnik % wagowych (względem masy całej kompozycji)
DHEA 15,0
Celuloza mikrokrystaliczna 84,6
Stearynian magnezu 0,4
Inne SERM można stosować zamiast EM-800 lub EM-652 · HCl w powyższych preparatach, jak też inne inhibitory sterydów płciowych można stosować zamiast DHEA, 3-octanu androst-5-eno-3b,17b-diolu lub dihemibursztynianu androst-5-eno-3b,17b-diolu. Można dołączać więcej niż jeden SERM lub więcej niż jeden prekursor, i w tym przypadku połączony procent wagowy jest korzystnie procentem wagowym pojedynczego prekursora lub pojedynczego SERM podane w przykładach powyżej. Wynalazek opisano w kategoriach korzystnych odmian i przykładów, lecz nie jest on nimi ograniczony. Specjaliści w dziedzinie łatwo rozpoznają szerszą stosowalność i zakres wynalazku, który jest ograniczony tylko zastrzeżeniami patentowymi w wynalazku.

Claims (2)

1. Zastosowanie selektywnego modulatora receptora estrogenu chlorowodorku związku o następującej budowie:
EM-652 · HCl, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia lub osłabiania rozwoju otyłości.
2. Zastosowanie selektywnego modulatora receptora estrogenu chlorowodorku związku o następującej budowie:
EM-652 · HCl, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia lub zmniejszania ryzyka rozwoju oporności na insulinę.
PL352993A 1999-07-06 2000-07-05 Zastosowanie selektywnego modulatora receptora estrogenu PL208972B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14240799P 1999-07-06 1999-07-06
PCT/CA2000/000798 WO2001001969A2 (en) 1999-07-06 2000-07-05 Methods of treating and/or suppressing weight gain

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL352993A1 PL352993A1 (pl) 2003-09-22
PL208972B1 true PL208972B1 (pl) 2011-07-29

Family

ID=22499734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL352993A PL208972B1 (pl) 1999-07-06 2000-07-05 Zastosowanie selektywnego modulatora receptora estrogenu

Country Status (25)

Country Link
US (2) US6710059B1 (pl)
EP (1) EP1196163B1 (pl)
JP (1) JP4790178B2 (pl)
KR (1) KR101141763B1 (pl)
CN (1) CN1390126B (pl)
AR (1) AR034091A1 (pl)
AT (1) ATE447947T1 (pl)
AU (3) AU5957500A (pl)
BR (1) BR0012354A (pl)
CA (1) CA2376158C (pl)
DE (1) DE60043305D1 (pl)
DK (1) DK1196163T3 (pl)
HK (1) HK1046240B (pl)
HU (1) HU230543B1 (pl)
IL (2) IL147485A0 (pl)
MX (1) MX270786B (pl)
MY (1) MY134574A (pl)
NO (1) NO329614B1 (pl)
NZ (1) NZ516453A (pl)
PL (1) PL208972B1 (pl)
RU (3) RU2327461C2 (pl)
TR (2) TR200502284T2 (pl)
TW (1) TWI359015B (pl)
WO (1) WO2001001969A2 (pl)
ZA (1) ZA200200085B (pl)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7005428B1 (en) * 1998-06-11 2006-02-28 Endorecherche, Inc. Medical uses of a selective estrogen receptor modulator in combination with sex steroid precursors
US6465445B1 (en) * 1998-06-11 2002-10-15 Endorecherche, Inc. Medical uses of a selective estrogen receptor modulator in combination with sex steroid precursors
MXPA00012304A (es) * 1998-06-11 2003-05-15 Endorech Inc Composiciones farmaceuticas y usos para el androst-5-ene-3beta, 17 beta-diol.
US6560217B1 (en) 1999-02-25 2003-05-06 3Com Corporation Virtual home agent service using software-replicated home agents
CA2376158C (en) * 1999-07-06 2011-03-15 Endorecherche, Inc. Use of selective estrogen receptor modulators in the manufacture of medicaments for treating and/or suppressing weight gain
AU7896100A (en) * 1999-10-14 2001-04-23 Endorecherche Inc. Selective estrogen receptor modulators in the treatment or reduction of the riskof acquiring hypertension, cardiovascular diseases, and insulin resistance
BR0108107A (pt) * 2000-01-28 2003-03-11 Endorech Inc Moduladores seletivos dos receptores de estrogênio em combinação com estrogênios; kits e composições farmacêuticas para praticar tal combinação; bem como a administração da referida combinação
MXPA04002249A (es) 2001-09-24 2004-06-29 Bayer Pharmaceuticals Corp Preparacion y uso de derivados de 1,5,6,7,-tetrahidro-pirrolo[3,2-c]piridina para el tratamiento de la obesidad.
JP3813152B2 (ja) 2002-03-12 2006-08-23 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド 置換アミド類
WO2004054573A1 (en) * 2002-12-13 2004-07-01 N.V. Nutricia Method and composition for inhibiting carbohydrate digestion
US7074779B2 (en) 2003-07-02 2006-07-11 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Estrieno[3,2-b]/[3,4-c]pyrrole derivatives useful as modulators of the estrogen receptors
US8835413B2 (en) * 2004-10-20 2014-09-16 Endorecherche, Inc. Sex steroid precursors alone or in combination with a selective estrogen receptor modulator and/or with estrogens and/or a type 5 cGMP phosphodiesterase inhibitor for the prevention and treatment of vaginal dryness and sexual dysfunction in postmenopausal women
US20060234993A1 (en) * 2005-04-13 2006-10-19 Eric Marchewitz Use of androstane derivatives for enhancing physical performance
US20070009564A1 (en) * 2005-06-22 2007-01-11 Mcclain James B Drug/polymer composite materials and methods of making the same
WO2007002823A2 (en) * 2005-06-29 2007-01-04 Wyeth Formulations of conjugated estrogens and bazedoxifene
WO2007011707A2 (en) 2005-07-15 2007-01-25 Micell Technologies, Inc. Polymer coatings containing drug powder of controlled morphology
WO2007011708A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Micell Technologies, Inc. Stent with polymer coating containing amorphous rapamycin
ES2540059T3 (es) 2006-04-26 2015-07-08 Micell Technologies, Inc. Recubrimientos que contienen múltiples fármacos
WO2008042909A2 (en) 2006-10-02 2008-04-10 Micell Technologies Inc. Surgical sutures having increased strength
CA2667228C (en) * 2006-10-23 2015-07-14 Micell Technologies, Inc. Holder for electrically charging a substrate during coating
CA2679712C (en) 2007-01-08 2016-11-15 Micell Technologies, Inc. Stents having biodegradable layers
US11426494B2 (en) 2007-01-08 2022-08-30 MT Acquisition Holdings LLC Stents having biodegradable layers
BRPI0810370A2 (pt) * 2007-04-17 2014-10-29 Micell Technologies Inc Stent revestido, e, método para preparar um stent
AU2008256684B2 (en) * 2007-05-25 2012-06-14 Micell Technologies, Inc. Polymer films for medical device coating
US8268806B2 (en) 2007-08-10 2012-09-18 Endorecherche, Inc. Pharmaceutical compositions
US20100298928A1 (en) * 2007-10-19 2010-11-25 Micell Technologies, Inc. Drug Coated Stents
CN102083397B (zh) * 2008-04-17 2013-12-25 米歇尔技术公司 具有生物可吸收层的支架
JP2011528275A (ja) 2008-07-17 2011-11-17 ミセル テクノロジーズ，インク． 薬物送達医療デバイス
US8834913B2 (en) * 2008-12-26 2014-09-16 Battelle Memorial Institute Medical implants and methods of making medical implants
EP2411440B1 (en) * 2009-03-23 2018-01-17 Micell Technologies, Inc. Improved biodegradable polymers
US20100241220A1 (en) * 2009-03-23 2010-09-23 Mcclain James B Peripheral Stents Having Layers
CA2756386C (en) * 2009-03-23 2019-01-15 Micell Technologies, Inc. Drug delivery medical device
WO2010120552A2 (en) 2009-04-01 2010-10-21 Micell Technologies, Inc. Coated stents
EP3366326A1 (en) 2009-04-17 2018-08-29 Micell Technologies, Inc. Stents having controlled elution
AU2014201406B2 (en) * 2009-06-16 2016-08-11 Endorecherche, Inc. Treatment of hot flushes, vasomotor symptoms, and night sweats with sex steroid precursors in combination with selective estrogen receptor modulators
US20100317635A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Endorecherche, Inc. Treatment of hot flushes, vasomotor symptoms, and night sweats with sex steroid precursors in combination with selective estrogen receptor modulators
EP2453834A4 (en) 2009-07-16 2014-04-16 Micell Technologies Inc MEDICAL DEVICE DISPENSING MEDICINE
WO2011007882A1 (ja) * 2009-07-16 2011-01-20 国立大学法人九州大学 インスリン産生細胞誘導剤、グルコース取込み促進剤および糖尿病または糖尿病合併症の治療薬
EP2531140B1 (en) 2010-02-02 2017-11-01 Micell Technologies, Inc. Stent and stent delivery system with improved deliverability
US8795762B2 (en) 2010-03-26 2014-08-05 Battelle Memorial Institute System and method for enhanced electrostatic deposition and surface coatings
EP2560576B1 (en) 2010-04-22 2018-07-18 Micell Technologies, Inc. Stents and other devices having extracellular matrix coating
RS56042B1 (sr) 2010-06-10 2017-09-29 Seragon Pharmaceuticals Inc Modulatori estrogenih receptora i njihove upotrebe
EA026675B1 (ru) 2010-06-16 2017-05-31 Эндорешерш, Инк. Способы лечения или предотвращения эстрогензависимых заболеваний
WO2012009684A2 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Micell Technologies, Inc. Drug delivery medical device
WO2012166819A1 (en) 2011-05-31 2012-12-06 Micell Technologies, Inc. System and process for formation of a time-released, drug-eluting transferable coating
CA2841360A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Micell Technologies, Inc. Drug delivery medical device
US10188772B2 (en) 2011-10-18 2019-01-29 Micell Technologies, Inc. Drug delivery medical device
WO2013090829A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 Aragon Pharmaceuticals, Inc. Estrogen receptor modulators and uses thereof
EP2791128A4 (en) 2011-12-16 2015-04-22 Olema Pharmaceuticals Inc NOVEL BENZOPYRAN COMPOUNDS, COMPOSITIONS AND USES THEREOF
KR20150143476A (ko) 2013-03-12 2015-12-23 미셀 테크놀로지즈, 인코포레이티드 생흡수성 생체의학적 임플란트
HK1222313A1 (zh) 2013-05-15 2017-06-30 Micell Technologies, Inc. 可生物吸收的生物医学植入物
US9744177B2 (en) 2014-03-10 2017-08-29 Endorecherche, Inc. Treatment of male androgen deficiency symptoms or diseases with sex steroid precursor combined with SERM
CA3006683A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-29 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Benzopiperidine derivative, preparation method thereof and medical use thereof
US20180207264A1 (en) * 2017-01-23 2018-07-26 Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Air Force Porcine immune modulation model
EP4667008A3 (en) 2020-06-02 2026-03-18 Model Medicines, Inc. Methods and compositions for treating rna viral infections
CN114315851B (zh) * 2022-01-03 2023-10-24 安徽大学绿色产业创新研究院 一种光甘草定药物中间体的合成方法
JP7440838B1 (ja) 2023-07-06 2024-02-29 株式会社インタートレードヘルスケア 卵巣機能欠落生体の内臓脂肪蓄積抑制飲食品、及び卵巣機能欠落生体の内臓脂肪蓄積抑制薬

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2504119B1 (fr) * 1981-04-17 1985-09-20 Aury Jean Pierre Beton isolant ainsi que son procede de fabrication
DE3117979A1 (de) * 1981-05-07 1983-01-20 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Neue(delta)1-pyrrolin-thiolactimaether und verfahren zu ihrer herstellung
US5395842A (en) * 1988-10-31 1995-03-07 Endorecherche Inc. Anti-estrogenic compounds and compositions
US5254568A (en) * 1990-08-09 1993-10-19 Council Of Scientific & Industrial Research Benzopyrans as antiestrogenic agents
US6060503A (en) * 1991-12-02 2000-05-09 Endorecherche, Inc. Benzopyran-containing compounds and method for their use
HU218419B (hu) * 1992-03-06 2000-08-28 E.R. Squibb And Sons, Inc. Mikroszomális triglicerid transzfer protein (MTP) nagy molekulatömegű alegységének rekombináns úton történő előállítására és a protein és inhibitorainak kimutatására szolgáló eljárások
TW366342B (en) 1992-07-28 1999-08-11 Lilly Co Eli The use of 2-phenyl-3-aroylbenzothiophenes in inhibiting bone loss
DE69405491T2 (de) 1993-06-24 1998-02-19 Lilly Co Eli Antiöstrogene 2-Phenyl-3-Aroylbenzothiophene als hypoglykämische Mittel
US5446061A (en) * 1993-11-05 1995-08-29 Eli Lilly And Company Methods for lowering serum cholesterol
US5527788A (en) * 1994-01-18 1996-06-18 Louisiana State Univ. Medical Center Foundation Method and composition for treating obesity comprising dehydroepiandrosterone (DHEA), or a derivative thereof, and an anorectic agent
US5441986A (en) 1994-07-19 1995-08-15 Pfizer Inc. Estrogen agonists as remedies for prostate and cardiovascular diseases
US5552412A (en) * 1995-01-09 1996-09-03 Pfizer Inc 5-substitued-6-cyclic-5,6,7,8-tetrahydronaphthalen2-ol compounds which are useful for treating osteoporosis
ZA965346B (en) * 1995-06-30 1997-12-24 Lilly Co Eli Methods of treating neuropeptide Y-associated conditions.
RU2098330C1 (ru) * 1996-01-05 1997-12-10 Акционерное общество открытого типа "ХИТОН" Способ подачи и аэрозольного распылиения жидкого активного продукта и устройство для его осуществления
IL120266A (en) * 1996-02-28 2005-05-17 Pfizer Use of estrogen antagonists and estrogen agonists in the preparation of medicaments for inhibiting pathological conditions
US5843984A (en) 1996-05-09 1998-12-01 Eli Lilly And Company Sulfated benzothiophene derivatives, methods of use and formulations containing same
AU8102398A (en) * 1997-07-09 1999-02-08 Central Drug Research Institute (dl)-2,3-diaryl-2h-1-benzopyrans
WO1999002152A1 (en) * 1997-07-10 1999-01-21 Novo Nordisk A/S Use of 3,4-diphenylchromans for the manufacture of a pharmaceutical composition for increasing insulin sensitivity
DE69840126D1 (de) * 1997-08-15 2008-11-27 Univ Duke Verfahren zur prophylaxis oder behandlung von östrogen-abhängigen krankheiten
BR9812859A (pt) * 1997-10-08 2000-08-08 S W Patentverwertungs Ges Mbh Enrijecimento e/ou redução de partes do corpo contendo células adiposas
EA005932B1 (ru) 1998-05-15 2005-08-25 Уайт 2-фенил-1-[4-(2-аминоэтокси)бензил]индол в комбинации с эстрогенами
US7005428B1 (en) 1998-06-11 2006-02-28 Endorecherche, Inc. Medical uses of a selective estrogen receptor modulator in combination with sex steroid precursors
US6465445B1 (en) * 1998-06-11 2002-10-15 Endorecherche, Inc. Medical uses of a selective estrogen receptor modulator in combination with sex steroid precursors
MXPA00012304A (es) 1998-06-11 2003-05-15 Endorech Inc Composiciones farmaceuticas y usos para el androst-5-ene-3beta, 17 beta-diol.
AU771352B2 (en) * 1999-06-18 2004-03-18 Stephen James Cordell Finishing tool
CA2376158C (en) 1999-07-06 2011-03-15 Endorecherche, Inc. Use of selective estrogen receptor modulators in the manufacture of medicaments for treating and/or suppressing weight gain

Also Published As

Publication number Publication date
IL147485A0 (en) 2002-08-14
DE60043305D1 (de) 2009-12-24
TR200403328T2 (tr) 2005-03-21
ZA200200085B (en) 2003-06-25
NO329614B1 (no) 2010-11-22
RU2327461C2 (ru) 2008-06-27
JP4790178B2 (ja) 2011-10-12
HUP0202363A3 (en) 2005-02-28
KR20020020776A (ko) 2002-03-15
ATE447947T1 (de) 2009-11-15
TR200502284T2 (tr) 2005-08-22
MY134574A (en) 2007-12-31
AU2009200258A1 (en) 2009-02-26
DK1196163T3 (da) 2010-03-29
HK1046240A1 (en) 2003-01-03
TWI359015B (en) 2012-03-01
CN1390126B (zh) 2012-06-13
IL195860A (en) 2013-06-27
AU2009200258B2 (en) 2012-01-12
RU2013148518A (ru) 2015-05-10
US8609695B2 (en) 2013-12-17
AU5957500A (en) 2001-01-22
CA2376158A1 (en) 2001-01-11
CA2376158C (en) 2011-03-15
AR034091A1 (es) 2004-02-04
BR0012354A (pt) 2002-04-02
NO20020037D0 (no) 2002-01-04
PL352993A1 (pl) 2003-09-22
EP1196163A2 (en) 2002-04-17
HK1046240B (en) 2010-09-30
WO2001001969A2 (en) 2001-01-11
JP2003503446A (ja) 2003-01-28
HUP0202363A2 (en) 2002-10-28
US20040034000A1 (en) 2004-02-19
AU2005229713A1 (en) 2005-12-01
KR101141763B1 (ko) 2012-05-08
MXPA02000075A (es) 2003-05-23
NZ516453A (en) 2004-04-30
RU2008101793A (ru) 2009-07-27
MX270786B (es) 2009-10-08
WO2001001969A3 (en) 2001-08-02
RU2636498C2 (ru) 2017-11-23
EP1196163B1 (en) 2009-11-11
US6710059B1 (en) 2004-03-23
RU2519642C2 (ru) 2014-06-20
NO20020037L (no) 2002-03-04
CN1390126A (zh) 2003-01-08
TW200803838A (en) 2008-01-16
HU230543B1 (hu) 2016-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2636498C2 (ru) Способы лечения и/или подавления прироста массы
TWI612044B (zh) 以性類固醇前驅物組合選擇性雌激素受體調節物治療熱潮紅、血管舒縮症狀及夜汗之技術
HUP0204211A2 (hu) Szelektív ösztrogén receptor modulátorok és ösztrogének kombinációi és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények
JP2007191484A (ja) 選択的エストロゲン受容体モジュレーターと性ステロイド前駆体の組合せの医学的使用
TWI293246B (pl)
TWI293251B (en) Selective estrogen receptor modulators incombination with estrogens
HK1167602A (en) Treatment of hot flushes, vasomotor symptoms, and night sweats with sex steroid precursors in combination with selective estrogen receptor modulators

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification