PL209402B1

PL209402B1 - Ziołowa kompozycja do leczenia przewlekłej, stabilnej dusznicy bolesnej i zastosowanie takiej kompozycji ziołowej do wytwarzania leków

Info

Publication number: PL209402B1
Application number: PL362562A
Authority: PL
Inventors: Xijun Yan; Naifeng Wu; Zhixin Guo; Zhengliang Ye; Yan Liu
Original assignee: Tianjin Tasly Pharmaceutical
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-12-18
Publication date: 2011-08-31
Also published as: WO2002058625A3; NO20032893L; IL156543A0; RU2310466C2; MXPA03005666A; CN1520307A; BR0116589A; JP2004522952A; HK1067072A1; HUP0303906A3; NO20032893D0; NZ526995A; SK288060B6; EP1351698B1; IL156543A; PL362562A1; EP1351698A4; AU2002246730B2; JP5121038B2; EP1351698A2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest ziołowa kompozycja do leczenia przewlekłej, stabilnej dusznicy bolesnej i zastosowanie takiej kompozycji ziołowej do wytwarzania leków.

Przewlekła, stabilna dusznica bolesna wywołana jest przejściowym niedokrwieniem mięśnia sercowego. Zwykle stosowanymi lekami do leczenia dusznicy bolesnej są aspiryna, azotany, leki blokujące receptory beta-adrenergiczne i leki blokujące kanał wapniowy stosowane same lub w połączeniu jeden z drugim.

Aspiryna jako środek przeciwzakrzepowy przeznaczona jest do objawowego leczenia przewlekłej, stabilnej dusznicy bolesnej.

Azotany stosuje się do leczenia dusznicowych epizodów i mogą one być skutecznie stosowane w profilaktyce u pacjentów z przewidywalnymi objawami. W odniesieniu do wszystkich azotanów, uciążliwy ból głowy może powodować ograniczanie ich stosowania w przypadku pewnych wrażliwych osobników.

Leki blokujące receptory beta-adrenergiczne, jakkolwiek posiadają utrwaloną pozycję jako podstawowe leki w leczeniu dusznicy bolesnej, są szczególnie przeciwwskazane dla pacjentów z chorobami niedrożności dróg oddechowych i ciężką niewydolnością komorową, oraz są względnie przeciwwskazane w przypadku cukrzycy oraz dla pacjentów z chorobą naczyń obwodowych, rzadkoskurczem sercowym lub z blokiem serca.

Antagoniści wapnia są rzeczywiście skuteczni w leczeniu dusznicy bolesnej, dzięki ich działaniu rozkurczowemu na mięśnie gładkie tętnic wieńcowych i krążenia obwodowego, zwiększającemu zaopatrzenie mięśnia sercowego i zmniejszającemu pracę mięśnia sercowego.

Jakkolwiek obserwuje się postęp w wielolekowym leczeniu dusznicy bolesnej, zgodnie z którym większość pacjentów rozpoczyna leczenie azotanami w połączeniu z lekiem blokującym receptory beta-adrenergiczne lub antagonistą wapnia, to nadal istnieje zapotrzebowanie na lek do leczenia przewlekłej, stabilnej dusznicy bolesnej, który byłby bardzo skuteczny, mógłby być podawany przez długi okres czasu i wykazywałby bardzo niską toksyczność.

Ze względu na problemy towarzyszące powyżej wymienionym lekom, poczyniono godne uwagi wysiłki zastosowania medycyny ziołowej jako alternatywnej drogi w odniesieniu do standardowego leczenia przewlekłej, stabilnej dusznicy bolesnej. W tym zakresie wiele wnosi tradycyjna medycyna chińska.

Opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5288485 i 5433957 dotyczą ekstraktu z Hypericum erectum thunb do leczenia lub zapobiegania chorobom wywołanym przez zaburzenia w krążeniu krwi, takim jak dusznica bolesna.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5776463 dotyczy doustnej kompozycji farmaceutycznej zawierającej płatki ogórecznika lekarskiego lub ekstrakt z płatków ogórecznika lekarskiego do zapobiegania lub leczenia stresu, który jest związany z chorobami układu sercowonaczyniowego, w tym z dusznicą bolesną.

Poza Hypericum erectum thunb i płatkami ogórecznika lekarskiego, do leczenia dusznicy bolesnej stosowano wiele innych roślin zielarskich. Jedną z takich roślin jest Valeriana officinalis latifolia. Yang G. Y. i in. (1994 r.) opisali, że 82 pacjentów z dusznicą bolesną leczono Valeriana officinalis latifolia, wśród których przed leczeniem w 50 przypadkach występowały zmiany ST-T wynikające z niedokrwienia, obserwowane za pomocą EKG. Całkowity stopień skuteczności w przypadkach prostej dusznicy bolesnej (bez wykrytych przypadków niedokrwienia) wynosił 87,80%; zaś w przypadkach dusznicy bolesnej z wykrytym niedokrwieniem 88,00%. Ponadto stwierdzono, że Valeriana officinalis latifolia może obniżać również stężenie lipidów w osoczu. Nie stwierdzono toksycznych działań w odniesieniu do wątroby, nerek i tkanki krwiotwórczej. (1)

Wu Y. (1990 r.) opisał, że skuteczność leczenia wynoszącą 93,3% uzyskano po podawaniu kapsułek zawierających Xintongkang grupie 267 pacjentów cierpiących na dusznicę bolesną.

Do leczenia dusznicy bolesnej stosowano także inny ziołowy preparat zwany Shenshao tongguan pian. W 1990 r. Hu J. X. i in. opisali, że Shenshao tongguan pian zawiera głównie saponiny z łodygi i liści żeń-szenia, Radix Paeoniae Alba i tym podobnych. Całkowity stopień skuteczności w leczeniu dusznicy bolesnej wynosił 94,71%. Stopień poprawienia wyniku uzyskiwanego za pomocą EKG wynosił 63,38%. Ponadto badania laboratoryjne ujawniły, że Shenshao tongguan pian może zwiększać pojemność minutową lewej komory serca, obniżać lepkość krwi i hamować agregację płytek krwi. Badania toksyczności ostrej i przewlekłej wykazały, że Shenshao tongguan pian nie towarzyszą toksyczne ani uboczne działania.

PL 209 402 B1

Granulki Kuo-guan są innym ziołowym preparatem na dusznicę bolesną. Li Y. i in. (1990 r.) opisali zmiany stężenia cynku, miedzi i erytrocytowej peroksydazy glutationowej w osoczu zmierzone za pomocą atomowej spektrometrii absorbcyjnej i badań kolorymetrycznych DTNB zaobserwowane u 31 pacjentów cierpiących na choroby wieńcowe serca z dusznicą bolesną przed i po podawaniu granulek Kuo-Guan w czasie jednego miesiąca. Wyniki wskazują, że przed leczeniem stężenia cynku i erytrocytowej peroksydazy glutationowej w osoczu były niższe, zaś stężenie miedzi było wyższe u pacjentów niż u zdrowej grupy kontrolnej (P<0,01), natomiast po leczeniu stężenie cynku i erytrocytowej peroksydazy glutationowej w osoczu wzrastało, a stężenie miedzi zmniejszało się (P<0,01). Wyniki te sugerują, że mechanizm leczniczego działania granulek Kuo-Guan w przypadkach choroby wieńcowej serca z dusznicą bolesną może polegać na regulowaniu zaburzeń w zawartości śladowych pierwiastków w organizmie.

Saponina z Tribulus terrestris była inną ziołową kompozycją stosowaną w leczeniu dusznicy bolesnej.

Fufang Danahen Pian jest ludowym przepisem na tabletki Dan Shen, które zaleca się w leczeniu przewlekłej, stabilnej dusznicy bolesnej wywołanej niedokrwieniem tętnic wieńcowych i jest oficjalnie zarejestrowany na liście leków w wydaniach chińskiej farmakopei od 1977 r. oraz stosowany w klinicznym użyciu od dziesięcioleci.

Fufang Danahen Pian zawiera wiele aktywnych ekstraktów botanicznych obejmujących Danshen (Radix Salviae Miltiorrhizae) i Sanchi (Radix Notoginseng). Obydwa te preparaty roślinne były pierwotnie dokumentowane w Shen Nong Ben Cao Jing (Ziołowa Farmakopea z Shen-nong) zebrana w roku 200. Fufang Danshen Pian zawiera także syntetyczny borneol, odmianę naturalnego borneolu (Bingpian). Naturalny borneol został po raz pierwszy udokumentowany w Tang Ren Cao (Ziołowa Farmakopea z dynastii Tang) ułożonej około roku 659.

Li Cheng-zhu i in. (1979 r.) w Acta Acad. Med. Prim., Shanghai opisali doświadczalne badania aktywności przeciwzakrzepowej dla Radix Salviae Miltiorrhizae. Wpływ na tworzenie się skrzepów in vitro, czynność płytek krwi i krzepnięcie oraz fibrynolizę badano na królikach. Po iniekcyjnym podaniu Radix Salviae Miltiorrhizae stwierdzono, że 3 czynniki odgrywają ważną rolę w hamowaniu tworzenia się skrzepów in vitro: (1) hamowanie czynności płytek krwi; (2) hamowanie krzepnięcia; oraz (3) ułatwianie fibrynolizy. Pierwsze dwa z tych mechanizmów są bardziej intensywne. Wyniki uzyskane w leczeniu chorób zakrzepowych, zwłaszcza tętniczych chorób zakrzepowych, zgodne są z tymi mechanizmami.

Chiang W. T. i in. (1982 r.) w Acta Acad. Med. Prim., Shanghai opisali działanie „Danshensu i innych dwóch rozpuszczalnych w wodzie składników Salvia Miltiorrhizae na niedokrwiony mięsień sercowy psa i na wyizolowane tętnice wieńcowe świni. Działanie trzech nowych, rozpuszczalnych w wodzie składników, to znaczy, Danshensu (DS-182, kwasu D(+)-3,4-dihydroksyfenylomlekowego), aldehydu protokatechusowego (PCAD) i nieoczyszczonego kwasu diterpenowego (DS-187) izolowanych z Salvia miltiorrhiza Bunge, było porównywalne z działaniem dipirydamolu. Wyniki uzyskane u myszy (1) wskazują, że DS-182 zapewnia znaczną ochronę przed niedotlenieniem, podczas gdy PCAD okazał się nieskuteczny; (2) DS-182 może zlikwidować elektrokardiograficzne niedokrwienne uniesienie odcinka ST-T wywołane pituitryną lecz nie wykazuje wpływu na zmniejszenie częstości akcji serca. DS-187, PCAD i dipirydamol wykazują tylko niepełną ochronę; (3) w modelu psa z ostrym stanem zawałowym wywołanym podwiązaniem przedniej zstępującej gałęzi lewej tętnicy wieńcowej, o korzyściach uzyskanych dzięki dożylnej iniekcji DS-182 świadczyły lepsze niż w przypadku podawania DS-187 i PCAD wskaźniki czynności lewej komory, szczytowe ciśnienie skurczowe w lewej komorze (LVPSP) i ciśnienie końcoworozkurczowe w lewej komorze (LVEDP). Przeciwnie PCAD, powodował działanie uboczne w odniesieniu do LVPSP i LVEDP. Dipirydamol podawany dożylnie, jakkolwiek nie powoduje zmian LVEDP, silnie obniża LVPSP z wywołaniem efektu znacznego niedociśnienia. Wszystkie te składniki Salvia i dipirydamol znacznie zmniejszały ostateczną rozległość zawału mięśnia sercowego (wyznaczoną przez N-BT); DS-182 był najskuteczniejszy, dipirydamol i DS-187 następne, podczas gdy PCAD był najmniej skuteczny; (4) w badaniu na wyizolowanej, poddawanej perfuzji tętnicy wieńcowej świni, DS-182 znacznie zmniejszał opór naczynia wieńcowego, podczas gdy DS-187, PCAD lub sulfonian sodu Tanshinone II-A (DS-201), inny składnik z Salvia, zwiększał ją. Zwężające działanie morfiny i propranololu na wyizolowany preparat tętnicy wieńcowej było znoszone przez uprzednie podanie DS-182. Wszystkie te fakty sugerują, że Danshensu może stanowić główny składnik aktywny w Salvia miltiorrhiza w leczeniu niedokrwiennych chorób serca, oraz że jego stosowanie razem z propranololem lub morfiną będzie korzystne.

PL 209 402 B1

Li Cheng-zhu i in. (1983 r.) w Chin. J. Integr. Med., opisali przeciwkrzepliwe działanie Radix Salviae Miltiorrhizae. Danshensu jest rozpuszczalnym w wodzie monomerem wyekstrahowanym z Radix Salviae Miltiorrhizae. Jest on także głównym składnikiem dostępnego w handlu preparatu iniekcyjnego Radix Salviae Miltiorrhizae. Obecne badania udowodniły, że Danshensu hamuje powstawanie skrzepów in vitro, agregację płytek krwi (wywołaną przez ADP) oraz wewnątrzpochodne i zewnątrzpochodne szlaki układu krzepnięcia; zmniejsza liczbę płytek krwi i ułatwia rozkład włóknika lub fibrynogenu. Maksymalne działanie u królika wystąpiło po 30 minutach po pojedynczej iniekcji 20 mg/kg, trwało przez 1 godzinę i zmniejszało się stopniowo. Po 4,5 godzinie od iniekcji wszystko powróciło do stanu normalnego oprócz testu tworzenia skrzepu in vitro.

Chen Zhanghua (1987 r.) w Acta Acad. Med. Prim., Shanghai opisał działanie „Danshensu na doświadczalne zaburzenia mikrokrążenia i stężenie kwasu mlekowego w osoczu. Naturalny Danshensu jest rozpuszczalnym w wodzie monomerem wyekstrahowanym z Radix Salviae Miltiorrhizae (RSM). Zaburzenia mikrokrążenia u królików wywołano za pomocą dożylnej iniekcji dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej. Naturalny Danshensu (dawkowanie 4-6 mg/kg) wyraźnie zwiększał ilość naczyń włosowatych w spojówce gałki ocznej i jednocześnie zmniejszał stężenie kwasu mlekowego w osoczu królików. Zaburzenia mikrokrążenia w krezce wywoływano u myszy za pomocą miejscowych kroplówek noradrenaliny (4 g). Naturalny Danshensu rozszerzał tętnice i przyspieszał szybkość przepływu krwi, tym samym, eliminował zastoje krwi w mikrokrążeniu. W naszych doświadczeniach obserwowano podobne działanie syntetycznego Danshensu. Wyniki wykazały, że nie obserwowano znacznych różnic pomiędzy naturalnym i syntetycznym Danshensu w odniesieniu do łagodzenia zaburzeń w mikrokrążeniu.

Sun Xi-ming i in. (1991 r.) przedstawili nowe farmakologiczne działanie ekstraktu Danshen (Salvia miltiorrhiza). W publikacji opisano, że ekstrakt Danshen (Salvia miltiorrhiza), który zawiera sole sodowe kwasu D(+)-(3,4-dihydroksyfenylo)mlekowego, wykazuje nowe farmakologiczne działanie polegające na zmniejszaniu biosyntezy cholesterolu w komórkach i przeciwdziałaniu utlenianiu lipoprotein, co stwierdzono w badaniach na hodowlach komórkowych. W porównaniu z wynikami dla prób kontrolnych, szybkość elektroforetycznej migracji znacznie zmniejszyła się oraz istotnie zmniejszyła się zawartość MDA i cytotoksyczność. Wyniki te wskazują, że sole kwasu D(+)-(3,4-dihydroksyfenylo)mlekowego mogą być skuteczne w zapobieganiu i leczeniu miażdżycy tętnic.

Zheng Ruo-xuan i in. (1992 r.) w Chin. J. Integr. Med. przedstawili działanie ochronne Radix Salviae Miltiorrhizae w przypadkach niedokrwienia mięśnia sercowego wywołanego u myszy podwiązaniem naczyń wieńcowych. Wyraźne działanie ochronne w przypadkach ostrego niedokrwienia mięśnia sercowego u myszy wywołanego podwiązaniem naczyń wieńcowych można było uzyskać po dootrzewnowym podaniu (i.p.) wodnego ekstraktu Radix Salviae Miltiorrhizae (5 g surowego leku/kg). Uniesienie odcinka S-T na wykresie EKG, związane z niedokrwieniem mięśnia sercowego, w leczonej grupie zwierząt było znacznie mniejsze, rozległość niedokrwienia lewej komory była mniejsza, a stopień przeżywalności był wyższy w porównaniu z grupą zwierząt kontrolnych.

Wu Yao-zhong i in. (1995 r.) w Acta Nanjing Univ. Trad. Chin. Mater. Med., przedstawili działania Radix Salviae Miltiorrhizae polegające na pobudzaniu krążenia krwi w wyniku usuwania zastojów krwi. Farmakologiczne badanie Radix Salviae Miltiorrhizae jest popularne. Jednakże, badania reologiczne nad Radix Salviae Miltiorrhizae polegające na oznaczaniu PGI2, ET i TXA2 wytwarzanych przez płytki krwi są rzadkością. Wpływ Radix Salviae Miltiorrhizae na tworzenie się skrzepów, zmiany PT, KPTT, FG, ESR i HCT oraz wpływ na agregację płytek krwi u królików oceniano w niniejszych badaniach. Wynika z nich, że Radix Salviae Miltiorrhizae zmniejsza syntezę TXA2 i zmniejsza działania wzmacniające agregację płytek i zakrzepy.

Shi Lin i in. (1990 r.) w Acta Pharmacol. Sin. przedstawili działanie całości saponin z Panax Notoginseng na zwiększanie PGI2 w tętnicy szyjnej i zmniejszenie TXA2 w płytkach krwi. Całość saponin z Panax Notoginseng (PNS) podawano doustnie królikom po 100 mg/(kg^dzień) przez 8 tygodni. W porównaniu z grupą kontrolną tworzenie płytki miażdżycowej w tętnicy zostało zahamowane.

Próbę radioimmunologiczną zastosowano w celu badania działania PNS na zawartość prostacykliny w tętnicy szyjnej i tromboksanu A2 w płytkach krwi szczura. Podawanie doustne PNS po 25, 50, 100 mg/(kgbzień) przez 10 dni powodowało zwiększenie stężenia prostacykliny w tętnicy szyjnej i zmniejszenie tromboksanu A2 w płytkach krwi w porównaniu z grupą kontrolną. Wyniki te wykazują, że przeciwmiażdżycowe działanie PNS może być wynikiem poprawienia równowagi pomiędzy prostacykliną i tromboksanem A2.

PL 209 402 B1

Li Xing i in. (1990 r.) w Acta Pharmacol. Sin. opisali ochraniające działanie saponin z Panax Notoginseng na doświadczalne uszkodzenie mięśnia sercowego wywołane niedokrwieniem i reperfuzją u szczurów. Działania całości saponin z Panax Notoginseng (PNS) i oczyszczonych ginsenoidów Rb1 i Rg1 z PNS na uszkodzenie mięśnia sercowego wywołane niedokrwieniem serca i reperfuzją badano na sercach szczurów w warunkach in situ i in vitro. U znieczulonych pentobarbitalem szczurów, którym wstępnie podano PNS (100 i 200 mg/kg), obserwowano znaczne zmniejszenie rozległości zawału mięśnia sercowego po podwiązaniu lewej zstępującej tętnicy wieńcowej (40 min.) i reperfuzji (120 min.), w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. PNS w ilości 12,5 i 25 mg/litr, Rb1 w ilości 10 mg/litr i Rg1 w ilości 10 mg/litr znacznie zmniejszały uwalnianie sercowego CPK, łagodziły akumulację Ca²⁺ w mięśniu sercowym, zmniejszały wytwarzanie dialdehydu malonowego (MDA) i zapobiegały zmniejszeniu aktywności dysmutazy nadtlenkowej (SOD) w porównaniu z badaniami kontrolnymi na poddawanych perfuzji wyizolowanych sercach szczurów z ogólnym niedokrwieniem (40 minut) i reperfuzją (15 minut). Wyniki wykazały, że PNS, Rb1 i Rg1 zapobiegały niedokrwieniu serca i uważano, że ich działanie wiązało się z hamowaniem peroksydacji lipidów.

Huang Cong i in. (1991 r.) w Chin. Bull. Pharmacol., przedstawili działanie Panax Notoginseng

Saponin na uszkodzenia wywołane niedokrwieniem mięśnia sercowego i reperfuzją u przytomnych królików. Działanie Panax Notoginseng Saponin (PNGS) na uszkodzenia wywołane niedokrwieniem mięśnia sercowego i reperfuzją u przytomnych królików badano na podstawie obserwacji zmian elektrokardiogramu (EKG), aktywności fosfokinazy kreatynowej (CPK) i dehydrogenazy mleczanowej (LD) oraz rozległości obszaru niedokrwienia. PNGS w dawce 50 mg/kg i 100 mg/kg znacznie zmniejszył rozległość obszaru niedokrwienia mięśnia sercowego. Wyniki te sugerowały, że PNGS wykazuje ochronne działanie wobec uszkodzeń wywołanych niedokrwieniem mięśnia serca i reperfuzją.

₃

Mo Qi-xian i in. (1987 r.) w Propriet. Trad. Chin. Med. Res., opisali dynamikę ³H-borneolu.

W celu wyjaśnienia mechanizmu wywoływania reanimacji przez środek zapachowy borneol, badano ₃ dynamikę ³H-borneolu po dożylnej iniekcji i podaniu doustnym. Wyniki ujawniły, że po pojedynczej ₃ dożylnej iniekcji ³H-borneolu okres połowicznego zaniku wynosił 2,8 minuty. Wynik ten sugeruje, że po podaniu lek ten szybko przechodzi do odpowiednich narządów i tkanek i wywiera szybkie działanie. Badanie rozkładu in vivo koncentrowało się na narządach i tkankach, w których przepływ krwi jest obfity, takich jak serce, płuca, wątroba, nerki, mózg i tym podobne. Badanie to dostarczyło pewne teoretyczne podstawy w odniesieniu do klinicznego zastosowania. Po podaniu doustnym okres połowicznego zaniku leku wynosił 5,3 godziny, co sugerowało, że po podaniu doustnym borneol nie akumulował się lecz charakteryzował się niewielką biodostępnością. Dalsze badania powinny być przeprowadzone w celu wyjaśnienia zależności od dawki leku i postaci dawkowania.

Chen Tie-feng i in. (1990 r.) w Acta Pharmacol. Sin. opisali zwiększenie absorpcji tetrametylopirazyny przy użyciu syntetycznego borneolu. Szczurom rasy Sprague-Dawley podawano dożołądkowo (i.g.) fosforan tetrametylopirazyny (TMP) w dawce 5 mg/kg wraz z lub bez wcześniejszego podawania borneolu w dawce 5 mg/kg. Stężenia TMP w osoczu oznaczano metodą GC i dane przetwarzano za pomocą programu NONLIN. Stężenie maksymalne Cmax wynosiło odpowiednio 931 i 562 ng/ml, (p<0,01); podczas gdy wartość pola pod krzywą stężenia w czasie AUC wynosiło odpowiednio 68849 i 37174 (P<0,05). Wyniki te sugerują, że borneol zwiększa absorpcję TMP lecz nie zwiększa eliminacji.

Xu Wei i in. (1995 r.) w Pharmacol. Chin. Med. Clin. opisali działanie mentolu i borneolu na rozmieszczenie sodowej soli sulfadiazyny i błękitu Evan'a w mózgu myszy i szczurów. Mentol (1,5 g/kg, dożołądkowo, i.g.) i borneol (1,5 g/kg) wydłuża okres połowicznego zaniku t1/2 sodowej soli sulfadiazyny u szczurów. Powyższe dawki mentolu i borneolu podane doustnie także zwiększały stężenie soli sodowej sulfadiazyny w mózgu szczura. Mentol (dożołądkowo 0,5 g/kg przez 3 dni) i borneol (dożołądkowo 0,5 g/kg przez 3 dni) zwiększyły stężenie błękitu Evan'a w mózgu myszy, lecz wartość stężenia była znacznie niższa niż wartość chroniąca mysz przed uszkodzeniami wywołanymi niedokrwieniem i reperfuzją. Wyniki te sugerowały, że mentol i borneol mogą zwiększać przenikanie sodowej soli sulfadiazyny przez barierę mózg-krew nie uszkadzając tej bariery.

W Stanach Zjednoczonych Ameryki miażdżycowe choroby wieńcowe serca są najczęstszym przypadkiem niewydolności sercowo-naczyniowej i śmierci.

Miażdżyca tętnic jest chorobą tętnic charakteryzującą się żółtawymi płytkami cholesterolu, lipidów i pozostałości komórek na wewnętrznych warstwach ścian tętnic o dużych i średnich rozmiarach.

Stan zaczyna się od smugi tłuszczu i stopniowo rozbudowuje się do włóknistej płytki lub zmian miażdżycowych. Ściany naczynia krwionośnego stają się grube, włókniste i zwapnione. Zwęża się światło tętnicy.

PL 209 402 B1

Wiele płytek miażdżycowych w tętnicach utrzymuje się stale lub stopniowo powiększa się. Inne mogą pękać powodując krwotoki, aktywację płytek krwi i tym samym zakrzepy wewnątrz naczyń krwionośnych. Zakrzepica tętnicy wieńcowej powoduje częściowe lub całkowite zamknięcie naczynia, zmniejszenie przepływu krwi, co wywołuje niestabilną dusznicę bolesną lub zawał mięśnia serca. Alternatywnie, oderwane płytki mogą zostać ponownie ustabilizowane i powodować często bardzo poważne zwężenie naczynia.

Wysiłkowe i umysłowe stresy zwiększają zapotrzebowanie mięśnia sercowego na tlen. W normalnych warunkach fizjologicznych, zwiększone zapotrzebowanie mięśnia sercowego na tlen jest wypełniane przez rozszerzanie tętniczek w celu zwiększenia przepływu krwi. W przypadkach występowania miażdżycy tętnic, tętniczki mogą być rozszerzone maksymalnie w celu spełnienia podstawowego zapotrzebowania. Takie rozszerzone tętniczki mogą być niezdolne do sprostania zwiększonemu zapotrzebowaniu mięśnia sercowego na tlen. Jeśli zapotrzebowanie na tlen przewyższa możliwości dostarczenia tlenu, występuje niedokrwienie mięśnia sercowego. Alternatywnie, poważne zamknięcie naczynia może ograniczyć przepływ krwi powodując zatem niedokrwienie mięśnia sercowego. Klinicznymi objawami przejściowego niedokrwienia mięśnia sercowego jest dusznica bolesna, która jest napadowym bólem piersiowym, często rozprzestrzeniającym się na ramiona, zwłaszcza w kierunku lewego ramienia, ewentualnie z towarzyszącym wrażeniem duszenia się i zbliżającej się śmierci.

Dusznica bolesna występuje w dwóch odmianach: stabilnej i niestabilnej. Stabilna dusznica bolesna w większości przypadków jest wywołana zwiększonym zapotrzebowaniem mięśnia sercowego na tlen. Zatem napad stabilnej dusznicy bolesnej następuje z przewidywalną częstotliwością i czasem trwania po prowokacji co zwiększa zapotrzebowanie mięśnia sercowego na tlen, wynikające z wysiłku fizycznego, stresu umysłowego i tym podobnych. Natomiast atak niestabilnej dusznicy bolesnej następuje bez prowokacji i zwykle wywołana ona jest przez zmniejszone dostarczanie tlenu do mięśnia sercowego. Oderwanie płytki, czop z płytek krwi i zakrzepica tętnicy wieńcowej zmniejszają dostarczanie tlenu do mięśnia sercowego.

Dusznicę bolesną leczy się różnymi lekami, procedurami chirurgicznymi, wszczepianiem by-pasów tętnicy wieńcowej, stosowaniem balonowej angioplastyki, umieszczeniem stentu i tym podobnymi sposobami. Leczenie stabilnej dusznicy bolesnej przede wszystkim polega na zmniejszeniu zapotrzebowania mięśnia sercowego na tlen, jak również na zastosowaniu środków zapobiegawczych. Leczenie ostrego zespołu niestabilnej dusznicy bolesnej polega przede wszystkim na hamowaniu aktywacji płytek i rozpuszczaniu skrzepów.

Obecne środki terapeutyczne do leczenia przewlekłej, stabilnej dusznicy bolesnej obejmują nitroglicerynę, inne azotany, blokery kanału wapniowego i blokery receptora beta-adrenergicznego. Takie leki, podawane same lub w połączeniu z innymi lekami, raczej łagodzą lub zapobiegają niż leczą dusznicę bolesną.

W czasie napadu dusznicy bolesnej podjęzykowo podaje się nitroglicerynę w celu złagodzenia objawów. Nitroglicerynę stosuje się również w celu zapobiegania napadom dusznicy bolesnej wywołanym wysiłkiem lub stresem. Azotany stosuje się w celu zapobiegania napadom dusznicy bolesnej. Nitrogliceryna i azotany pośredniczą w działaniu przede wszystkim przez rozkurczanie naczyniowych mięśni gładkich, zmniejszanie aktywności mięśnia sercowego, a tym samym zmniejszanie zapotrzebowania mięśnia sercowego na tlen. Towarzyszą im działania uboczne, takie jak, pulsujący ból głowy, zawroty głowy, osłabienie, podciśnienie ortostatyczne, częstoskurcz i tym podobne.

Blokery receptora beta-adrenergicznego, takie jak, propranolol stosuje się w celu zapobiegania dusznicy bolesnej przez zmniejszenie zapotrzebowania mięśnia sercowego na tlen w czasie wysiłku i stresu. Głównymi przeciwwskazaniami są skurcze oskrzelowe, bradyarytmie oraz jawna niewydolność serca. U osobników z astmą i innymi postaciami niedrożności dróg oddechowych beta-blokery mogą pogarszać ich stan.

Antagonistów wapnia stosuje się w celu zapobiegania dusznicy bolesnej przez zmniejszanie zapotrzebowania mięśnia sercowego na tlen. Mięsień sercowy jest zależny od dopływu wapnia dla prawidłowego działania. Hamując dopływ wapnia, antagoniści wapnia mogą powodować rozkurcz mięśni gładkich naczyń krwionośnych, zmniejszać aktywność mięśnia sercowego, zmniejszać zapotrzebowanie mięśnia sercowego na tlen, a tym samym zapobiegać dusznicy bolesnej. Antagoniści wapnia wykazują niepożądane działania uboczne. Łagodne działania uboczne obejmują rumieńce, obrzęki, zawroty głowy, nudności i tym podobne. Nadmierne zahamowanie dopływu wapnia do mięśnia sercowego może spowodować poważne działania uboczne, takie jak, zatrzymanie akcji serca, rzadkoskurcz sercowy, blok przedsionkowo-komorowy, zastoinowa niewydolność serca i tym podobne. Przy łączeniu z lekami beta-adrenergicznymi, uboczne działania często ulegają nasileniu.

PL 209 402 B1

W Chinach, Panax Notoginseng i Radix Salviae Miltiorrhizae stosuje się do leczenia chorób sercowo-naczyniowych od 200 roku naszej ery (Shen-nong's Herbal Pharmacopoeia). Panax Notoginseng stosowano do leczenia dusznicy bolesnej. Radix Salviae Miltiorrhizae stosowano do poprawienia krążenia krwi i rozbijania zastojów krwi. Liczne przedkliniczne i kliniczne badania dowiodły skuteczności i bezpieczeństwa stosowania Panax Notoginseng i Radix Salviae Miltiorrhizae.

Tradycyjne chińskie leki są mieszankami kilku ziół wymagającymi przygotowania naparu. Modyfikowaną postacią chińskiego leku do leczenia choroby wieńcowej serca jest tabletka Dan Shen. Tabletka Dan Shen jest dużą, mazistą kulką często o średnicy aż 1 cm. Tabletki Dan Shen są wytwarzane z ekstraktu Radix Salviae Miltiorrhizae, proszku Panax Notoginseng i syntetycznego borneolu. Zamieszczono je w chińskiej farmakopei z roku 1977 i stosuje się je od dziesiątków lat do leczenia chorób sercowo - naczyniowych.

Ujawnione pigułki Danshen (DSP), zwane pigułkami kardiotonicznymi, są nową generacją chińskich leków do leczenia chorób wieńcowych serca. Chińskie leki zawierają różne zioła, które zmieniają się od przepisu do przepisu w zależności od typu ziół jak również od stosunku ziół. W celu kontroli jakości, DSP wytwarza się z zastosowaniem standaryzowanej receptury. Leczniczymi składnikami DSP są rozpuszczalne w wodzie ekstrakty Radix Salviae Miltiorrhizae 10-30%, a czasami około 20%, rozpuszczalne w wodzie ekstrakty Panax Notoginseng (2-6%) i borneol (1-3%). Ponadto w celu szybkiego łagodzenia dusznicy bolesnej, DSP wytwarza się w postaci małych pigułek, które mogą rozpuszczać się bezpośrednio po podaniu podjęzykowym, szybko docierać do mięśnia sercowego, a tym samym szybko łagodzić objawy dusznicy bolesnej.

W badaniach przedklinicznych i klinicznych DSP okazał się nietoksycznym i skutecznym lekiem do zapobiegania i leczenia choroby sercowo-naczyniowej wywołanej przez niedokrwienie tętnicy wieńcowej. Ponadto, w badaniach przedklinicznych jak i klinicznych DSP wykazał wyższą skuteczność niż tabletki Dan Shen w leczeniu choroby tętnic wieńcowych.

DSP zamieszczono w dodatkowej edycji chińskiej farmakopei z roku 1998, za zgodą chińskiego Ministerstwa Zdrowia, przy czym jako lek sprzedawany był w Chinach od 1993 r. i zastosowany u więcej niż pięciu milionów ludzi.

Zatem, wynalazek dotyczy ziołowej kompozycji do leczenia przewlekłej, stabilnej dusznicy bolesnej, charakteryzującej się tym, że zawiera rozpuszczalne w wodzie ekstrakty Notoginseng, rozpuszczalne w wodzie ekstrakty Salviae i syntetyczny borneol, przy czym kompozycja ta jest wytwarzana sposobem obejmującym etapy, w których:

A. poddaje się ekstrakcji rozpuszczalne w wodzie składniki Panax Notoginseng w etapach, w których:

(a) rozcieńcza się zioła 5- do 7-krotną ilością wody;

(b) poddaje się ekstrakcji rozpuszczalne w wodzie składniki Panax Notoginseng, na drodze ogrzewania we wrzeniu w zbiorniku pod ciśnieniem powietrza 0,04 - 0,06 mPa przez 2 godziny;

(c) powtarza się ekstrakcję w tych samych warunkach przez 1,5 godziny;

(d) przesącza się ekstrakt przez sito o oczkach 150 ąm (100 mesh);

(e) oczyszcza się przesącz z użyciem makroporowatej żywicy adsorpcyjnej, z elucją etanolem;

(f) zatęża się wyeluowane ekstrakty w warunkach dekompresji, przy dopływie powietrza pod ciśnieniem 0,04 - 0,06 mPa i przy ciśnieniu zmniejszonym o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego, do gęstości względnej 1,33 - 1,35;

B. poddaje się ekstrakcji rozpuszczalne w wodzie składniki Radix Salviae Miltiorrhizae w etapach, w których:

(a) rozcieńcza się zioła 5- do 7-krotną ilością wody;

(b) poddaje się ekstrakcji rozpuszczalne w wodzie składniki Radix Salviae Miltiorrhizae, na drodze ogrzewania we wrzeniu w zbiorniku pod ciśnieniem powietrza 0,04 - 0,06 mPa przez 2 godziny;

(c) powtarza się ekstrakcję w tych samych warunkach przez 1,5 godziny;

(d) przesącza się ekstrakt przez sito o oczkach 150 ąm (100 mesh);

(e) zatęża się przesącza w warunkach dekompresji, przy ciśnieniu zmniejszonym o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego, do uzyskania jednego litra z jednego kg wyjściowych ziół;

(f) prowadzi się wytrącanie etanolem z koncentratów;

(g) przesącza się roztwór wytrąconego etanolem osadu przez sito o oczkach 150 ąm (100 mesh);

(h) zatęża się przesącza w warunkach dekompresji, przy dopływie powietrza pod ciśnieniem 0,04 0,06 mPa i przy ciśnieniu zmniejszonym o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego;

(i) oczyszcza się koncentraty metodą chromatografii na poliamidzie z elucją etanolem;

PL 209 402 B1 (j) zatęża się oczyszczone ekstrakty do gęstości względnej 1,33 - 1,35;

C. wytwarza się pigułkę metodą wkraplania (DSP) w etapach, w których:

(a) miesza się ekstrakty Panax Notoginseng, ekstrakty Radix Salviae Miltiorrhizae, syntetyczny borneol i glikol polietylenowy 6000 w stosunku 4,0:20,6:1,9:79,5;

(b) stapia się mieszaninę;

(c) wytwarza się pigułkę metodą wkraplania ze stopionej mieszaniny za pomocą urządzenia do wkraplania o następującej charakterystyce: temperatura kotła do wkraplania stale wynosi 89 - 93°C, roztwór chłodzący stanowi ciekła parafina o temperaturze niższej niż 8°C, wewnętrzna średnica głowicy wkraplającej wynosi 1,8 mm, zewnętrzna średnica głowicy wkraplającej wynosi 2,4 mm, a odległość pomiędzy głowicą wkraplającą a powierzchnią roztworu chłodzącego wynosi 15 cm;

(d) odwirowuje się pigułki przy 800 - 1100 obrotach na minutę przez 15 minut, usuwając oleje.

Korzystnie kompozycja wytwarzana jest sposobem obejmującym etapy, w których:

A. poddaje się ekstrakcji Radix Salviae Miltiorrhizae w następujących etapach, w których:

a) do wielofunkcyjnego zbiornika ekstrakcyjnego wprowadza się Radix Salviae Miltiorrhizae;

dodaje się wodę aż do poziomu 15 - 20 cm powyżej ziół, czyli w ilości około 5- do 7-krotnie większej od ilości ziół; ogrzewa się je do temperatury wrzenia z użyciem pary wodnej, przy czym wewnętrzne ciśnienie powietrza powinno być utrzymywane w granicach 0,04-0,06 mPa; w zbiorniku utrzymuje się wrzenie, dwukrotnie ogrzewając w warunkach wrzenia, najpierw przez 2 godziny, a następnie przez 1,5 godziny, ekstrakt odsącza się w dolnej części zbiornika ekstrakcyjnego przez sito o oczkach 150 ąm (100 mesh) do zbiornika podstawowego, zaś pozostałość odrzuca się;

b) roztwór ze zbiornika podstawowego przenosi się do zbiornika próżniowego, parę wodną utrzymuje się pod ciśnieniem poniżej 0,05 mPa, w międzyczasie ciśnienie doprowadza się do ciśnienia zmniejszonego o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego, utrzymując w zbiorniku wrzenie, roztwór zatęża się do objętości wyrażonej w litrach w przybliżeniu równej ilości roślin wyrażonej w kilogramach, w stosunku 1:1;

c) odsącza się i w trakcie powolnego mieszania do roztworu dodaje się 95% etanol do uzyskania 70% stężenia etanolu w roztworze, mierzonego przez 24 godziny grawimetrem etanolowym;

d) otwiera się zbiornik, supernatant w postaci roztworu znad osadu wytraconego etanolem przepuszcza się przez sito o oczkach 150 ąm (100 mesh) do zbiornika zatężającego pod próżnią, ciśnienie wprowadzonego powietrza doprowadza się do 0,04 - 0,06 mPa, a ciśnienie doprowadza się do ciśnienia zmniejszonego o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego, utrzymując w zbiorniku burzliwe wrzenie i odzyskuje się etanol do osiągnięcia roztworu ziołowego o objętości wyrażonej w litrach w przybliżeniu równej ilości roślin wyrażonej w kilogramach w stosunku 1:1;

e) roztwór z etapu (d) wprowadza się do kolumny chromatograficznej ze wstępnie potraktowanym poliamidem, przy objętości wprowadzania wynoszącej 5 ml na gram poliamidu, przemywa się kolumnę trzykrotną objętością wody, kolumnę poddaje się 5- do 10-krotnej elucji 95% etanolem; oraz

f) etanol odzyskuje się jak w etapie (d) do zatężenia eluatu do gęstości względnej 1,33 - 1,35;

B. poddaje się ekstrakcji Radix Notoginseng w następujących etapach, w których:

a) do wielofunkcyjnego zbiornika ekstrakcyjnego wprowadza się Radix Notoginseng; dodaje się wodę aż do poziomu 15 - 20 cm powyżej ziół, czyli w ilości około 5- do 7-krotnie większej od ilości ziół; ogrzewa się je do temperatury wrzenia z użyciem pary wodnej, przy czym wewnętrzne ciśnienie powietrza powinno być utrzymywane w granicach 0,04 - 0,06 mPa; w zbiorniku utrzymuje się wrzenie, dwukrotnie ogrzewając w warunkach wrzenia, najpierw przez 2 godziny, a następnie przez 1,5 godziny, ekstrakt odsącza się w dolnej części zbiornika ekstrakcyjnego przez sito o oczkach 150 ąm (100 mesh) do zbiornika podstawowego, zaś pozostałość odrzuca się,

b) makroporowata żywica adsorpcyjna:

i. wstępna obróbka makroporowatej żywicy adsorpcyjnej: makroporowatą, niepolarną żywicę adsorpcyjną ZTC-1 o wielkości ziarna 0,3 - 1,2 mm i średniej wielkości porów 130 - 300 x 10^-10 m (130 - 300 A), namacza się w 95% etanolu przez 24 godziny, po czym wypełnia się nią kolumnę, kolumnę przemywa się etanolem i równą objętością wody aż do uzyskania klarownego eluatu; lub po przemyciu kolumny 0,1-1 mol/l NaOH lub HCl, kolumnę przemywa się wodą do pozbycia się zapachu etanolu w eluacie lub do obojętnej wartości pH;

ii. ekstrakt Radix Notoginseng z etapu (a), wprowadza się do kolumny w ilości 1 g/1 g żywicy ₂ przy natężeniu przepływu 0,5 - 5 cm/cm²/minutę, przemywa się kolumnę aż do uzyskania klarownego ₂ eluatu, eluuje się 70% etanolem przy natężeniu przepływu 0,5 - 5 cm/cm²/minutę, zbiera się eluat;

PL 209 402 B1 iii. odzyskiwanie żywicy: kolumnę przemywa się 95% etanolem aż do uzyskania bezbarwnego i klarownego eluatu po dodaniu równej objętości wody, następnie przemywa się kolumnę wodą dla usunięcia zapachu etanolu;

c) eluat o zawartości 75% etanolu przepuszcza się przez sito o oczkach 150 ąm (100 mesh) do zbiornika zatężającego pod próżnią, ciśnienie wprowadzonego powietrza doprowadza się do wartości 0,04 - 0, 06 mPa, a ciśnienie doprowadza się do ciśnienia zmniejszonego o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego, utrzymując w zbiorniku burzliwe wrzenie, odzyskuje się etanol do osiągnięcia gęstości względnej eluatu 1,33 - 1,35 i otrzymuje się ekstrakt saponin z Notoginseng; oraz

C. wytwarza się pigułkę metodą wkraplania (DSP) w etapach, w których:

a) miesza się oleistą mieszaninę zawierającą Radix Salviae Miltiorrhizae i saponiny z Radix Notoginseng, borneol i poli 6000 w stosunku 4,0:20,6:1,9:79,5 w zbiorniku do stapiania, aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny, ogrzewa się ją do temperatury 80 - 85°C z użyciem pary wodnej, utrzymuje się mieszaninę w stanie stopionym przez 30 - 40 minut aż do momentu gdy stopiona mieszanina nie będzie zawierała żadnych grudek;

b) przenosi się stopioną mieszaninę do kotła do wkraplania urządzenia do wkraplania, w której utrzymuje się temperaturę 89 - 93°C; przy czym jako roztwór chłodzący stosuje się ciekłą parafinę o temperaturze niższej niż 8°C; wewnętrzna średnica głowicy wkraplającej wynosi 1,7 mm, zaś zewnętrzna średnica głowicy wkraplającej wynosi 2,4 mm, odległość pomiędzy cieczą z lekiem a głowicą wkraplającą wynosi 5-6 cm; odległość pomiędzy głowicą wkraplającą a roztworem chłodzącym wynosi 26 - 31 cm, głębokość roztworu chłodzącego wynosi około 1 metr; a szybkość wkraplania wynosi 60 - 80 pigułek/minutę;

c) pigułki otrzymane metodą wkraplania wyjmuje się z oleju chłodzącego i odwirowuje w wirówce przy szybkości wynoszącej 800 - 1100 obrotów/minutę przez 15 minut w celu usunięcia oleju, z otrzymaniem pigułki metodą wkraplania.

Korzystnie postać zewnętrzna kompozycji ziołowej ma jednorodny kulisty kształt o jednolitym kolorze czerwono-brązowym lub brązowo-czarnym, o aromatycznym zapachu i gorzkim smaku.

Korzystnie kompozycja ziołowa ma postać pigułki, kapsułki, granulki, tabletki, zawiesiny, postaci do iniekcji, syropu lub nalewki.

Korzystnie kompozycja ziołowa zawiera powyżej 12,12 ąg sanchinozydu R1 na jedną pigułkę i powyżej 56,26 ąg ginsenozydu Rg1 na jedną pigułkę.

Ponadto korzystnie w odniesieniu do kompozycji ziołowej wytworzonej powyżej określonym sposobem kolumny wypełnia się makroporowatą żywicą stosowaną w etapie B.

Ponadto korzystnie w odniesieniu do kompozycji ziołowej wytworzonej powyżej określonym sposobem materiał do chromatografii stosowany w etapie B jest wybrany spośród porowatego polimeru, żelu krzemionkowego, tlenku glinu, poliamidu, aktywowanego węgla drzewnego, celulozy i sephadexu, oprócz makroporowatej żywicy (model D101).

Ponadto korzystnie w odniesieniu do kompozycji ziołowej wytworzonej powyżej określonym sposobem eluat z kolumny chromatograficznej stosowany w etapie B zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 60°C do gęstości względnej wynoszącej 1,33 - 1,35.

Wynalazek dotyczy także zastosowania określonej powyżej kompozycji ziołowej do wytwarzania leków do a) leczenia choroby wieńcowej serca; b) pierwotnego zapobiegania chorobie wieńcowej serca; oraz c) wtórnego zapobiegania chorobie wieńcowej serca.

Korzystnie w odniesieniu do powyższego zastosowania określoną powyżej kompozycję stosuje się do wytwarzania leku do leczenia stabilnej dusznicy bolesnej, do łagodzenia dusznicy bolesnej, do obniżania poziomu cholesterolu i triglicerydów we krwi u pacjentów z nieprawidłowym poziomem lipidów we krwi, do wydłużania czasu trwania wysiłku, okresu pomiędzy początkiem wysiłku i wystąpieniem dusznicy oraz okresu pomiędzy początkiem wysiłku i 1 mm obniżeniem odcinka ST, do leczenia różnych rodzajów i o różnym stopniu zaawansowania dusznicy bolesnej, wywołanej przez choroby wieńcowe serca, do leczenia uszkodzenia mózgu spowodowanego przez peroksydację lipidów wywołaną przez wolne rodniki tlenowe, do leczenia uszkodzenia wątroby spowodowanego przez peroksydację lipidów wywołaną przez wolne rodniki tlenowe, do leczenia przewlekłej choroby serca spowodowanej przez peroksydację lipidów wywołaną przez wolne rodniki tlenowe, do leczenia choroby wieńcowej serca spowodowanej przez peroksydację lipidów wywołaną przez wolne rodniki tlenowe, do leczenia samoistnego nadciśnienia, do leczenia i zapobiegania chorobom układu sercowonaczyniowego, oraz do leczenia choroby wieńcowej serca.

PL 209 402 B1

Ujawnione pigułki Dan Shen Pill (DSP) są chińskim lekiem nowej generacji do leczenia choroby wieńcowej serca, wytwarzanym z zastosowaniem standaryzowanej receptury. DSP zawiera standaryzowane ilości ekstraktów z Panax Notoginseng, ekstraktów z Radix Salviae Miltiorrhizae i borneolu.

Panax Notoginseng wprowadza się w celu złagodzenia i zapobiegania dusznicy bolesnej. Radix Salviae Miltiorrhizae wprowadza się w celu hamowania aktywacji płytek, w celu zapobiegania zakrzepicy tętnicy wieńcowej, a tym samym w celu ułatwiania krążenia krwi. Borneol wprowadza się w celu skutecznego dostarczania leczniczych składników do mięśnia sercowego.

DSP wytwarza się w postaci niewielkich pigułek, o masie około 25 mg, które mogą rozpuszczać się bezpośrednio po podaniu podjęzykowym, a tym samym ich lecznicze działanie występuje szybko. Skuteczność DSP w łagodzeniu i zapobieganiu dusznicy bolesnej potwierdzono w badaniach przedklinicznych i klinicznych.

Na Fig. 1 przedstawiono partię nr 19990806, na fig. 2 przedstawiono partię nr 19990815, zaś na fig. 3 przedstawiono partię nr 19990823.

Charakterystyczne położenie pików na chromatogramach: grupa I obejmuje pik 1 i pik 2 (o czasie retencji w zakresie 7 - 15 minut); grupa II obejmuje pik 3 i 4 (o czasie retencji w zakresie 15 - 20 minut); grupa III obejmuje pik 5, 6, 7 i 8 (o czasie retencji w zakresie 20 - 40 minut). Ogólnie najwięcej pików uzyskano w grupie I, a wysokość piku 1 jest prawie bliska wysokości piku 2. Piki w grupie II występują obok siebie, ich wysokości są prawie takie same i ich wielkości są bardzo małe.

Grupa III obejmuje cztery piki a ich wysokość kolejno wzrasta. Te trzy grupy pików tworzą reprezentatywny chromatogram dla pigułek Danshen Pill uzyskanej przez wkraplanie.

Ujawniona tutaj kompozycja leku Dan Shen Pill (DSP) zawiera:

(a) rozpuszczalne w wodzie ekstrakty Radix Salviae Miltiorrhizae, rozpuszczalne w wodzie ekstrakty Panax Notoginseng i syntetyczny borneol;

(b) Radix Salviae Miltiorrhizae, Notoginseng, borneol i nośniki; oraz (c) Radix Salviae Miltiorrhizae, Panax Notoginseng, borneol i farmaceutyczne nośniki.

W postaci powyższego leku, Radix Salviae Miltiorrhizae i Panax Notoginseng są stosowane tak, jak były stosowane w Chinach do leczenia choroby wieńcowej serca od roku 200 naszej ery. Panax Notoginseng stosowano do leczenia dusznicy bolesnej, zaś Radix Salviae Miltiorrhizae stosowano do ułatwiania krążenia krwi. Borneol stosuje się w celu ułatwienia szybkiego dostarczania składników leczniczych do docelowych narządów. Naturalny borneol stosowano w Chinach od roku 600 naszej ery. Ponieważ naturalny borneol jest całkowicie niedostępny, DSP zawiera syntetyczny borneol.

DSP jest stosowany do (a) leczenia choroby wieńcowej serca;

(b) leczenia choroby wieńcowej serca w połączeniu z innymi lekami;

(c) pierwotnego zapobiegania chorobie wieńcowej serca;

(d) pierwotnego zapobiegania chorobie wieńcowej serca w połączeniu z innymi lekami;

(e) wtórnego zapobiegania chorobie wieńcowej serca;

(f) wtórnego zapobiegania chorobie wieńcowej serca w połączeniu z innymi lekami; i (g) zmniejszania przyjmowania azotanów przez pacjentów z dusznicą bolesną; oraz (h) obniżania stężenia cholesterolu w surowicy.

W postaci DSP, wskazania obejmują chorobę wieńcową związaną z miażdżycą tętnic, taką jak, lecz nie wyłącznie, łagodzenie dusznicy bolesnej, zapobieganie dusznicy bolesnej wywołanej wysiłkiem i stresem, oraz ułatwianie krążenia krwi poprzez hamowanie agregacji płytek krwi, tym samym zapobieganie tworzeniu wieńcowych zakrzepów. DSP można stosować w celu zmniejszenia przyjmowania nitrogliceryny, którą często stosuje się w celu łagodzenia lub zapobiegania dusznicy bolesnej. DSP można także stosować w celu zmniejszenia stężenia cholesterolu w osoczu, tym samym zapobiegając tworzeniu nowych złogów miażdżycowych w tętnicy. Miażdżyca tętnic często jest zapoczątkowana przez cholesterol odkładający się na ściankach naczyń.

Ujawniony tutaj sposób kontrolowania jakości leków poprzez standaryzowanie składu i stężenia substancji leczniczych w leku poprzez analizowanie i identyfikowanie leczniczych składników z zastosowaniem technik analitycznych obejmuje etapy:

a) frakcjonowania leku z zastosowaniem technik analitycznych; oraz

b) identyfikacji i ilościowego określenia leczniczych substancji zawartych w leku poprzez porównanie z analitycznym profilem odpowiednich, oczyszczonych substancji jako wzorzec.

W postaci powyższego wynalazku, przykładami technik analitycznych są chromatografia cienkowarstwowa, wysokosprawna chromatografia cieczowa i inne. Oczyszczone, wzorcowe składniki lecznicze są głównymi identyfikowanymi aktywnymi składnikami leków. Przykładowo oczyszczone

PL 209 402 B1 wzorcowe składniki aktywne DSP obejmują, lecz nie wyłącznie, saponiny, kwas fenolowy, taki jak, Danshensu, borneol i tym podobne. Aktywne składniki DSP identyfikuje się poprzez porównanie położenia frakcji DSP, takiego jak czas retencji w wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub położenia i barwy frakcji DSP w metodzie chromatografii cienkowarstwowej i tym podobnych, z cechami charakterystycznymi dla oczyszczonych wzorców. Aktywne składniki DSP ocenia się ilościowo poprzez porównanie wielkości aktywnych frakcji DSP z wielkością znanych ilości wzorców. Przykładowo ilość saponiny zawartej w DSP oznacza się poprzez porównanie z krzywą wzorcową znanej ilości oczyszczonej saponiny.

W innej postaci DSP zawiera 5 - 40% rozpuszczalnego w wodzie kwasu fenolowego z Radix Salviae Miltiorrhizae, 1 - 10% rozpuszczalnej w wodzie saponiny z Panax Notoginseng i 1 - 5% borneolu.

W innej postaci DSP zawiera 10 - 30% rozpuszczalnego w wodzie kwasu fenolowego z Radix Salviae Miltiorrhizae, 2-6% rozpuszczalnej w wodzie saponiny z Panax Notoginseng i 1 - 3% borneolu.

Ujawnione tutaj urządzenie do wkraplania do wytwarzania leku o niewielkich rozmiarach, który można łatwo rozpuszczać, tym samym łatwo dostarczać do narządów, zawiera części:

a) kocioł do wkraplania (kotły do wkraplania), w których temperatura zmienia się w zakresie 60 - 100°C, korzystniej w zakresie 89 - 93°C;

b) roztwór chłodzący, który stanowi ciekła parafina o temperaturze niższej niż 8°C;

c) głowicę wkraplającą o wewnętrznej średnicy wynoszącej 1,8 mm i zewnętrznej średnicy wynoszącej 2,35 mm;

d) o odległości pomiędzy głowicą wkraplającą a powierzchnią roztworu chłodzącego wynoszącej około 15 m.

Powyższe urządzenie stosuje się do wytwarzania pigułek o niewielkich wymiarach, które mogą rozpuszczać się bezpośrednio po podaniu.

W innej postaci niewielkie pigułki charakteryzują się następującymi wymiarami: (a) średnica 0,33 - 0,34 cm; (b) masa 21,25 - 28,75 mg i (c) gęstość 1,13 - 1,40 mg/mm³.

Szczegółowy opis doświadczeń

Wytwarzanie pigułek Dan Shen Pill (DSP)

DSP są niewielkimi pigułkami, o masie w przybliżeniu 25 mg, których lecznicze składniki obejmują rozpuszczalne w wodzie ekstrakty Notoginseng, rozpuszczalne w wodzie ekstrakty Salviae i syntetyczny borneol.

W celu wytwarzania DSP, Notoginseng i Salviae oddzielnie poddaje się ekstrakcji gorącą wodą w układzie cyrkulacyjnym i przesącza się. Przesącze zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem, przesącza i wytrąca. Koncentraty poddaje się oczyszczaniu przy użyciu kolumn z żywicami i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Tak uzyskane oczyszczone, rozpuszczalne w wodzie ekstrakty miesza się z syntetycznym borneolem i farmaceutycznymi nośnikami. Mieszaninę przygotowuje się w postaci niewielkich pigułek za pomocą specjalnego urządzenia do wkraplania. Jakość DSP kontroluje się za pomocą standaryzowania ilości, jak również, udziału jej głównych składników leczniczych saponiny, kwasu fenolowego, takiego jak Danshensu i borneolu. W celu identyfikacji i oznaczania leczniczych składników DSP stosuje się chromatografię cienkowarstwową, wysokosprawną chromatografię cieczową, porównanie z charakterystycznym widmem wzorcowym i inne techniki analityczne.

Wytwarzanie DSP

1. Ekstrakcja rozpuszczalnych w wodzie składników Panax Notoginseng:

(a) rozcieńczenie ziół 5- do 7-krotną ilością wody;

(b) ekstrakcja rozpuszczalnych w wodzie składników Panax Notoginseng na drodze ogrzewania we wrzeniu w zbiorniku pod ciśnieniem powietrza 0,04 - 0,06 mPa, przez 2 godziny;

(c) powtarzanie ekstrakcji w tych samych warunkach przez 1,5 godziny;

(d) przesączanie ekstraktu przez sito o oczkach 150 μm (100 mesh);

(e) oczyszczanie przesączu z użyciem makroporowatej żywicy adsorpcyjnej, z elucją etanolem;

(g) zatężanie wyeluowanego ekstraktu w warunkach dekompresji, przy dopływie powietrza pod ciśnieniem 0,04 - 0,06 mPa i przy ciśnieniu zmniejszonym o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego, do gęstości względnej 1,33 - 1,35.

2. Ekstrakcja rozpuszczalnych w wodzie składników Radix Salviae Miltiorrhizae;

(a) rozcieńczenie ziół 5- do 7-krotną ilością wody;

(b) ekstrakcja rozpuszczalnych w wodzie składników Radix Salviae Miltiorrhizae, na drodze ogrzewania we wrzeniu w zbiorniku pod ciśnieniem powietrza 0,04 - 0,06 mPa przez 2 godziny;

PL 209 402 B1 (c) powtarzanie ekstrakcji w tych samych warunkach przez 1,5 godziny;

(d) przesączanie ekstraktu przez sito o oczkach 150 μm (100 mesh);

(e) zatężanie przesączu w warunkach dekompresji, przy ciśnieniu zmniejszonym o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego, do uzyskania objętości jednego litra z jednego kg wyjściowych ziół;

(f) wytrącanie etanolem z koncentratów;

(g) przesączanie roztworu wytrąconego etanolem osadu przez sito o oczkach 150 μm (100 mesh);

(h) zatężanie przesączy w warunkach dekompresji, przy dopływie powietrza pod ciśnieniem 0,04 0,06 mPa i przy ciśnieniu zmniejszonym o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego;

(i) oczyszczanie koncentratów metodą chromatografii na poliamidzie, z elucją etanolem;

(j) zatężanie oczyszczonych ekstraktów do gęstości względnej 1,33 - 1,35.

3. Wytwarzanie DSP (a) mieszanie ekstraktów Panax Notoginseng, ekstraktów Radix Salviae Miltiorrhizae, syntetycznego borneolu i glikolu polietylenowego 6000 w stosunku 4,0 : 20,6 : 1,9 : 79,5;

(b) stapianie mieszaniny;

(c) wytwarzanie DSP ze stopionej mieszaniny za pomocą urządzenia do wkraplania o następującej charakterystyce: temperatura kotła do wkraplania stale wynosi 89 - 93°C, roztwór chłodzący stanowi ciekła parafina o temperaturze niższej niż 8°C, wewnętrzna średnica głowicy wkraplającej wynosi 1,8 mm, zewnętrzna średnica głowicy wkraplającej wynosi 2,4 mm, odległość pomiędzy głowicą wkraplającą a powierzchnią roztworu chłodzącego wynosi 15 cm;

(d) odwirowywanie pigułek przy 800 - 1100 obrotów na minutę przez 15 minut, usuwając oleje.

Kontrola jakości DSP

DSP zawiera zidentyfikowane lecznicze składniki aldehyd protokatechusowy i saponinę jak również różne inne składniki. Zawartość tych związków w ziołach zmienia się w zależności od różnych próbek ziół. W celu standaryzacji zawartości leczniczych składników w DSP, a tym samym w celu kontrolowania jakości DSP, opracowano sposoby identyfikacji i oznaczania ilościowego leczniczych środków w lekach.

Przykładowo stosuje się następujące postępowanie:

(a) rozpuszcza się 30 pigułek DSP w 3 ml metanolu i poddaje je działaniu ultradźwięków przez 10 minut;

(b) poddaje się wirowaniu przez 5 minut;

(c) supernatant rozdziela się standardowymi technikami analitycznymi, takimi jak chromatografia cienkowarstwowa, wysokosprawna chromatografia cieczowa i tym podobne;

(d) identyfikuje się lecznicze składniki w DSP, takie jak, sól sodowa Danshensu, aldehyd protokatechusowy, saponina i tym podobne, poprzez porównanie frakcji DSP z odpowiednimi oczyszczonymi wzorcami w odniesieniu do położenia, wielkości i barwy;

(e) identyfikuje się i ilościowo oznacza lecznicze składniki DSP, poprzez porównanie położenia, wielkości i barwy frakcji DSP, z położeniem, wielkością i barwą odpowiednich oczyszczonych wzorców;

(f) identyfikuje się lecznicze składniki w DSP poprzez porównanie względnych czasów retencji i względnych pól pików na chromatogramie, ze względnym czasem retencji i względnymi polami pików na chromatogramie wzorcowym.

Identyfikacja DSP za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Sposób identyfikowania soli sodowej Danshensu i aldehydu protokatechusowego w ziołowej kompozycji zdolnej do leczenia przewlekłej dusznicy bolesnej, za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, obejmuje etapy:

a) przygotowanie próbki obejmujące etapy:

i. umieszczenie 30 pigułek tej kompozycji w 3 ml metanolu i rozpuszczenie ich za pomocą ultradźwięków przez 10 minut do uzyskania roztworu;

ii. odwirowanie roztworu przez 5 minut i zebranie supernatantu;

iii. naniesienie 10 μl roztworu na płytkę z żelem krzemionkowym typu G, zawierającą 0,5% CMC-Na;

iv. rozwijanie płytki w rozwijającym roztworze zawierającym chloroform, aceton i kwas mrówkowy w stosunku 10:4:1,6;

v. suszenie, nasycanie płytki parami amoniaku i pozostawienie na 15 minut;

vi. sprawdzenie płytki w świetle nadfioletowym, plama przedstawiająca tę kompozycję powinna być w odpowiednim położeniu, takim jak, plama wzorca, oraz powinna mieć tę samą barwę.

b) jako wzorce stosuje się sól sodową Danshensu i aldehyd protokatechusowy.

PL 209 402 B1

Sposób identyfikowania gipenozydu z ziołowej kompozycji przeznaczonej do leczenia przewlekłej, stabilnej dusznicy bolesnej, za pomocą chromatografii cienkowarstwowej obejmuje etapy:

a) przygotowanie próbki obejmujące etapy:

i. 30 pigułek tej kompozycji umieszcza się w 5 ml amoniaku jako rozpuszczalniku i rozpuszcza za pomocą ultradźwięków do uzyskania roztworu;

ii. ten roztwór wprowadza się do kolumny wypełnionej makroporowatą żywicą adsorpcyjną; szybkość wynosi 0,5/minutę;

iii. po przemyciu kolumny wypełnionej makroporowatą żywicą adsorpcyjną 20 ml destylowanej wody, kolumnę wypełnioną makroporowatą żywicą adsorpcyjną poddaje się elucji 2 ml roztworu metanolu;

iv. zbiera się eluat;

v. nanosi się 10 ąl tego eluatu na płytkę z żelu krzemionkowego G, zawierającą 0,5% CMC-Na;

vi. płytkę rozwija się 10 ml rozwijającym roztworem, którym jest dolna klarowna warstwa mieszaniny chloroformu, acetonu i wody w stosunku 6:3:1, utrzymywanej przez 2 godziny w temperaturze 10°C;

vii. po wysuszeniu i natryskaniu 10% roztworem siarczanu w etanolu, płytkę praży się w temperaturze 105°C przez kilka minut;

viii. ocenę przeprowadza się w świetle normalnym, plama odpowiadająca tej kompozycji powinna być w odpowiednim położeniu w jakim są plamy wzorców i powinna wykazywać taką samą barwę.

b) jako wzorce stosuje się pełny gipenozyd, saponinę R1 i ginsenozyd Rg1.

Chromatogramy pigułki Cardiotonic Pill

1. Wykonanie chromatogramów (1) Układ chromatograficzny i jego dostosowanie

Jako fazę stacjonarną zastosowano żel krzemionkowy modyfikowany grupami C-18 alkilosilanowymi, zaś jako fazę ruchomą mieszaninę A i B. A stanowił metanol, a B stanowiła mieszanina wody, N,N-dimetyloformamidu i lodowatego kwasu octowego (100:45:4). Stężenie A zmienia się od 5% do 30%, w czasie elucji gradientowej 0-25 minuty. Detekcję prowadzono przy długości fali 281 nm. Liczba teoretycznych półek kolumny obliczona dla piku Danshensu była nie mniejsza niż 2000.

(2) Aparatura i odczynniki

Chromatograf: HP 1100 Liquid Chromatograph

Detektor: detektor ultrafioletu typu HP VWD

Kolumna: kolumna Alltech Company 5u, 250x4,6 mm, ODS

Pre-kolumna: pre-kolumna Alltech Company, Alltima C18 5u

Temperatura kolumny: 30°C (3) Przygotowanie próbki kontrolnej

Kwas szałwiowy B, Danshensu i aldehyd protokatechusowy rozpuszczono w metanolu w celu uzyskania trzech kontrolnych roztworów, które w każdym mililitrze zawierają odpowiednio 50 ąg, 40 ąg i 10 ąg.

(4) Przygotowanie próbki badanej pigułek Cardiotonic Pill umieszcza się w 25 ml w kolbie miarowej, dodaje 20 ml metanolu, poddaje działaniu ultradźwięków przez 20 minut, pozostawia do ochłodzenia, rozcieńcza roztwór metanolem do kreski, odwirowywuje i uzyskuje supernatant, który stosuje się jako roztwór badany.

(5) Sposób postępowania

Na kolumnę wstrzykuje się dokładnie 10 ąl każdego z kontrolnych roztworów i badany roztwór, uzyskuje się wykres chromatogramu i oblicza zawartość.

2. Chromatogramy różnych partii pigułek Cardiotonic Pill

Próbki z dwudziestu partii pigułek Cardiotonic Pill zbadano opisaną powyżej metodą i uzyskane dane statystyczne przedstawiono w tabeli 1, tabeli 2 i tabeli 3. Dane te wskazują, że pigułki Cardiotonic Pill charakteryzuje specyficzny chromatogram obejmujący osiem zwykłych pików, to znaczy, piki te muszą występować jednocześnie w każdej partii DSP. Przyjmując pik aldehydu protokatechusowego jako pik odniesienia, którego czas retencji wynosi 1, średnie wartości względnych czasów retencji dla ośmiu pików wynosiły 0,672, 1,000, 1,417, 1,512, 2,016, 2,235, 2,407, 2,757. Wartości względne czasu retencji i względne pola dla ośmiu pików były bardzo trwałe i wśród ośmiu zwykłych pików, pik nr 1 odpowiadał Danshensu, pik nr 2 aldehydowi protokatechusowemu i pik nr 7 kwasowi szałwiowemu B, zaś stosunek wartości względnych obszarów pola wynosił odpowiednio 0,476-0,668 : 1 : 0,391-0,641.

Piki z chromatogramów dla trzech partii pigułek Cardiotonic Pill przedstawiono także na rysunkach fig. 1, fig. 2 i fig. 3.

PL 209 402 B1

Tabela 1. Czas retencji i względny czas retencji pików dla 20 partii DSP

20000726 8,283 0,670 12,356

PL 209 402 B1

19991014 984,660 0,589 1670,700 1,000 353,250 0,211 297,610 0.178 504,860 0,302 504,900 0,302 879,420 0,526 1378,000 0,825

19991026 978,100 0,556 1758,900 1,000 348,520 0,198 282,550 0,161 451,380 0,257 416,600 0,237 800,660 0,455 1303,700 0,741

19991109 974,320 0,603 1617,1001,000 334,350 0,207 275,060 0,170 477,390 0,295 491,810 0,304 836,830 0,517 1302,800 0,806

PL 209 402 B1

T a b e l a 3

Statystyczne dane dla ośmiu pików uzyskane na podstawie chromatogramów dla 20 partii DSP

Numer piku	Czas retencji	Względny czas retencji	Prawdopodobieństwo wystąpienia	Pole	Stosunek pól	Zakres stosunku pól
1	8,289	0,672	100%	1034,276	0,572	0,572 ±0,096
2	12,343	1,000	100%	1817,065	1,000	1,000 ± 0,000
3	17,493	1,417	100%	376,547	0,208	0,208 ± 0,040
4	18,664	1,512	100%	328,011	0,181	0,181 ± 0,059
5	24,883	2,016	100%	486,626	0,267	0,267 ± 0,097
6	27,586	2,235	100%	525,432	0,289	0,289 ± 0,052
7	29,714	2,407	100%	940,963	0,516	0,516 ± 0,125
8	34,030	2,757	100%	1547,495	0,850	0,850 ± 0,163

Ilościowa analiza Danshensu w DSP

Chromatografia i zaadaptowane warunki metody, aparatura i odczynniki:

1. Wykonanie chromatogramów (1) Parametry dla uzyskania chromatogramu i ustawienia układu

Jako materiał wypełniający kolumnę zastosowano żel krzemionkowy modyfikowany grupami C-18 alkilosilanowymi, zaś jako fazę ruchomą mieszaninę wody, acetonitrylu i lodowatego kwasu octowego (87:12:1). Detekcję prowadzono przy długości fali 281 nm. Liczba teoretycznych półek obliczona dla piku Danshensu powinna być nie niższa niż 2500, a stopień rozdziału powinien odpowiadać wymaganiom.

(2) Aparatura i odczynniki

Chromatograf: HP 1100 Liquid Chromatograph

Detektor: detektor w ultrafiolecie typ HP VWD

Kolumna: kolumna Alltech Company 5u, 250 x 4,6 mm, ODS

Pre-kolumna: pre-kolumna Alltech Company, Alltima C18 5u

Temperatura kolumny: 30°C

Acetonitryl: czysty do chromatografii, Tianjin Siyou Biomedical & Technical Co. Ltd.

Lodowaty kwas octowy: czysty do analiz, Tianjin Tianhe Reagent Company.

(3) Przygotowanie próbki kontrolnej

Jako próbki kontrolne stosuje się 25,0 mg soli sodowej kwasu szałwiowego i 5,0 mg aldehydu protokatechusowego: obie próbki odważa się dokładnie i umieszcza je w kolbach miarowych o pojemności 50 ml. W celu rozpuszczenia dodaje się fazę ruchomą, a następnie rozcieńcza się roztwory w kolbach do kreski, dokładnie je wytrząsa się i przechowuje jako podstawowe roztwory. Odważoną dokładnie niewielką ilość kwasu p-aminobenzoesowego rozpuszcza się w takiej ilości fazy ruchomej aby uzyskać stężenie 0,2 mg/ml i stosuje się jako podstawowy roztwór wzorca wewnętrznego. Za pomocą pipety odmierza się właściwe ilości soli sodowej kwasu szałwiowego A, aldehydu protokatechusowego i roztworów wzorca wewnętrznego, dokładnie odczytując objętości, rozcieńcza się je fazą ruchomą w celu uzyskania roztworu zawierającego 50 ąg soli sodowej kwasu szałwiowego A, 10 ąg aldehydu protokatechusowego i 80 ąg kwasu p-aminobenzoesowego. Otrzymany roztwór stosuje się jako roztwór kontrolny.

(4) Przygotowanie próbki badanej pigułek Cardiotonic Pill i 1 ml podstawowego roztworu wzorca wewnętrznego umieszcza się w kolbie miarowej o pojemności 25 ml, rozpuszcza się je w fazie ruchomej i roztwór rozcieńcza do kreski.

Pobiera się 10 ml roztworów, odpowiednio próbki kontrolnej i próbki badanej, wstrzykuje i rejestruje chromatogram.

Przygotowanie kontrolnego roztworu: pobiera się i dokładnie odważa 25,0 mg soli sodowej tanshinolu i umieszcza w kolbie miarowej. Dodaje się fazę ruchomą, rozpuszcza i roztwór rozcieńcza do kreski. Wytrząsa się roztwór i stosuje go jako kontrolny roztwór podstawowy. Dokładnie odważa się kwas p-aminobenzoesowy i rozcieńcza go za pomocą fazy ruchomej do uzyskania roztworu o stężeniu 0,2 mg/ml. Roztwór ten stosuje się jako podstawowy roztwór wzorca wewnętrznego. Pobiera się

PL 209 402 B1 odpowiednie dawki podstawowego roztworu kontrolnego i podstawowego roztworu wzorca wewnętrznego i przygotowuje z nich roztwór kontrolny zawierający w jednym mililitrze 50 pg soli sodowej tanshinolu i 80 pg kwasu p-aminobenzoesowego.

Przygotowanie roztworu badanego: pobiera się 10 pigułek produktu i 1 ml wewnętrznego roztworu podstawowego. Umieszcza się je w kolbie miarowej o pojemności 25 ml, rozpuszcza i uzupełnia do kreski, po czym stosuje jako roztwór badany.

Pobiera się odpowiednio 10 l roztworu kontrolnego i 10 l roztworu badanego, wykonuje się chromatogramy i oblicza wyniki.

Ziołowa kompozycja zawierająca DSP powinna wykazywać zawartość 0,14 - 0,18 mg Danshensu w jednej pigułce.

Ilościowa analiza ginsenozydu Rg1 i sanchinozydu R1 w DSP (1) Układ chromatograficzny i jego dostosowanie

Jako fazę stałą stosuje się żel krzemionkowy modyfikowany grupami C-18 alkilosilanowymi, zaś jako fazę ruchomą mieszaninę wody i acetonitrylu. Stężenie acetonitrylu wynosi 25% w czasie 0-15 minut, oraz 35% po czasie 15 minut. Rozpylacz gazu przepuszcza gaz z szybkością 2,5 litra na minutę, zaś temperatura lampy typu O (ang. „drift tube) wynosi 93,8°C. Liczba teoretycznych półek kolumny obliczona dla piku ginsenozydu Rg1 powinna być nie niższa niż 5000.

(2) Aparatura i odczynniki

Chromatograf: Agilent 1100 Liquid Chromatograph

Detektor: detektor Alltech ELSD 2000 (detektor światła rozproszonego z odparowaniem)

Kolumna: kolumna Alltech Company 5u, 250 x 4,6 mm, ODS-C18

Pre-kolumna: pre-kolumna Alltech Company, Alltima C18, 5u

Temperatura kolumny: 30°C (3) Przygotowanie próbki kontrolnej

Ginsenozyd Rg1 i Sanchinozyd R1 rozpuszcza się w metanolu i wytwarza dwa kontrolne roztwory, każdy w mililitrze zawierający odpowiednio 0,98 mg i 0,25 mg.

(4) Przygotowanie próbki badanej pigułek Cardiotonic Pill umieszcza się w kolbie miarowej o pojemności 5 ml, dodaje 4% roztwór amoniaku do kreski, poddaje działaniu ultradźwięków przez 20 minut i roztwór nanosi na przygotowaną niewielką kolumnę C18 (kolumna STRATA C18-E z Phenomenex Company, 500 mg i rurka ₃ o pojemności 3 cm³), kolumnę poddaje się elucji 10 ml wody, odrzuca eluat, a następnie poddaje elucji 2 ml metanolu, eluat zbiera się w kolbie miarowej i rozcieńcza metanolem do kreski, po czym roztwór stosuje się jako roztwór badany.

(5) Procedura

Na kolumnę wstrzykuje się dokładnie 10 pl każdego z roztworów kontrolnych i roztworu badanego, zapisuje się chromatogramy i oblicza zawartość.

(6) Wynik

Próbki pigułek Cardiotonic Pill z dwudziestu partii zbadano sposobem opisanym powyżej i dane statystyczne przedstawiono w tabeli 4. Na podstawie danych z tej tabeli wynika, że ziołowa kompozycja zawierająca DSP zawiera 0,401%-0,712%, średnio 0,550% sanchinozydu R1 i 2,069%-4,044%, średnio 2,847% ginsenozydu Rg1.

T a b e l a 4

Ilości ginsenozydu Rg1 i sanchinozydu R1 w DSP

Numer partii	Sanchinozyd R1 (pg/pigułkę)	Ginsenozyd Rg1 (pg/pigułkę)
1	2	3
20000106	17,22	80,93
20000216	16,92	80,78
20000323	15,16	70,76
20000406	13,65	62,51
20000422	14,24	68,72
20000513	15,27	71,16
20000606	14,86	68,21

PL 209 402 B1 cd. tabeli 4

1	2	3
20000726	14,59	72,35
20000728	14,25	57,37
20000804	15,30	70,55
Średnia wartość	15,15	70,33
RSD%	7,53	9,67
Nie mniej niż	12,12	56,26

Cechy charakterystyczne DSP wytwarzanego sposobem według wynalazku są następujące:

(a) DSP zawiera kwas b-3,4-dihydroksyfenylomlekowy, sól sodową danshensu, saponinę i borneol;

(b) nie zawiera bakterii: zawiera mniej niż 1000 bakterii;

(c) nie zawiera grzybów: zawiera mniej niż 100 grzybów;

(d) nie zawiera metali ciężkich: zawiera mniejszą ilość niż ilość bezpieczna określona przez rząd chiński;

(e) okres przechowywania DSP wynosi cztery lata w temperaturze pokojowej.

Kliniczne badania DSP

Dusznicę bolesną badano pod kątem przebiegu choroby, określano stężenie lipidów w surowicy, wykonywano elektrokardiografię (EKG), wysiłkową EKG, scyntygraficzną ocenę niedokrwienia, angiografię wieńcową i tym podobne. Oznaczenie leczniczej skuteczności przy użyciu tych punktów końcowych wykazało, że DSP jest skuteczny w leczeniu dusznicy bolesnej.

DSP jest skuteczny w leczeniu dusznicy bolesnej

157 pacjentom z chorobą wieńcową serca podawano doustnie trzy razy w ciągu doby 10 pigułek DSP przez cztery tygodnie. Określono częstotliwość, intensywność i czas trwania dusznicy bolesnej, odczucie ściskania w klatce piersiowej i palpitacji serca. Objawy te zanikły lub uległy remisji u 95,3% pacjentów.

DSP jest bardziej skuteczny niż tabletki Dan Shen w łagodzeniu dusznicy bolesnej

Tabletki Dan Shen są innym chińskim lekiem stosowanym obecnie w Chinach do zwalczania dusznicy bolesnej. Porównywano skuteczności DSP i tabletek Dan Shen. Pacjentów z chorobą wieńcową serca podzielono na dwie grupy w sposób losowy. 107 pacjentów leczono DSP i 50 pacjentów leczono tabletkami Dan Shen. Porównano częstotliwość ataków dusznicy i zużycie azotanów. DSP był bardziej skuteczny niż tabletki Dan Shen w leczeniu dusznicy bolesnej. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 5.

T a b e l a 5

Porównanie DSP i tabletek Dan Shen

Liczba pacjentów
	Całkowita	Reagujących na lek
DSP	107	102 (95,3%)
Tabletka Dan Shen	50	38 (76%)

Po udowodnieniu, że DSP jest lekiem bardziej skutecznym niż tabletki Dan Shen, skuteczność DSP porównano ze skutecznościami różnych leków aktualnie stosowanych w Stanach Zjednoczonych Ameryki do leczenia przewlekłej trwałej dusznicy bolesnej.

Porównanie DSP i nitrogliceryny

Nitroglicerynę często stosuje się do złagodzenia objawów dusznicy bolesnej. Porównano skuteczności DSP i nitrogliceryny w łagodzeniu objawów dusznicy bolesnej. W przypadkach napadów dusznicy, pacjentów leczono DSP lub nitrogliceryną i porównano czas konieczny dla złagodzenia objawów choroby. Zarówno DSP jak i nitrogliceryna łagodziły objawy dusznicy u wszystkich pacjentów w ciągu 15 minut. Skuteczność DSP była nieznacznie niższa niż skuteczność nitrogliceryny. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 6.

PL 209 402 B1

T a b e l a 6

Porównanie DSP i nitrogliceryny

Liczba pacjentów reagujących na lek
w ciągu	1-5 minut	6-10 minut	11-15 minut
DSP	11	14	5
Nitrogliceryna	17	12	1

Łącznie: 30 pacjentów w grupie

DSP nie powoduje zmian częstości akcji serca

Dane wskazują, że DSP skutecznie łagodzi objawy dusznicy bolesnej. Przeprowadzono badania, nad możliwością łagodzenia objawów dusznicy przez DPS w wyniku zwiększania częstości akcji serca. Stwierdzono, że częstość akcji serca po leczeniu DSP była równa częstości akcji serca przed leczeniem, co wskazuje, że DSP łagodzi objawy dusznicy bez wpływu na częstość akcji serca (tabela 7).

T a b e l a 7

DSP nie wpływa na częstość akcji serca

Częstość akcji serca
Przed leczeniem	Po leczeniu
DSP	84,3 ±23,1	82,8 ± 22,8

Porównanie skuteczności DSP ze skutecznością diazotanu izosorbidu

Po stwierdzeniu, że DSP łagodzi objawy dusznicy bolesnej tak skutecznie jak nitrogliceryna, przeprowadzono badania czy DSP może zapobiegać dusznicy bolesnej. Porównano skuteczność działania DSP i jednego z azotanów - diazotanu izosorbidu. Diazotan izosorbidu jest azotanem o długim okresie działania, często stosowanym w celu zapobiegania przewlekłej, stabilnej dusznicy bolesnej w Stanach Zjednoczonych Ameryki. Pacjentów leczono doustnie podając trzy razy w ciągu doby 10 pigułek DSP lub diazotan izosorbidu też doustnie trzy razy w czasie doby w dawce po 10 mg. Badano czynność serca i elektrokardiogram.

Czynność serca

Skuteczność DSP i azotanów względem czynności serca badano za pomocą mierzenia pojemności minutowej serca (CO), objętości wyrzutowej (SV), frakcji wyrzutowej (EF), frakcji skracania lewej komory w osi krótkiej (FS). DSP poprawia czynność serca bardziej skutecznie niż azotany. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 8.

T a b e l a 8

Wpływ DSP i azotanów na czynność serca

DSP	Diazotan izosorbidu
Przed	Po	Przed	Po
SV	75,38 ± 8,32	83,45 ± 9,11	74,96 ± 8,44	79,47 ± 8,72
CO	5,61 ± 1,34	6,94 ± 1,36	6,54 ± 1,36	6,12 ± 1,41
EF	0,57 ± 0,02	0,79 ± 0,02	0,59 ± 0,03	0,70 ± 0,03
FS	17,14 ± 3,4	16,69 ± 3,6	17,32 ± 3,1	18,46 ± 4,2

Przed: przed leczeniem Po : po leczeniu

DSP poprawia EKG

Skuteczną częstość ST-T badano za pomocą zapisywania, częstotliwości zmian w odcinku ST-T. Zarówno DSP jak diazotan izosorbidu znacznie zmniejszały częstotliwość zmian w ST-T. Jednak DSP był bardziej skuteczny. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 9.

T a b e l a 9

Porównanie wpływu DSP i azotanu na EKG

Częstotliwość zmian ST-T
Przed leczeniem	Po leczeniu
DSP	131	35
Diazotan izosorbidu	129	42

PL 209 402 B1

Porównanie DSP i aspiryny w hamowaniu zastojów krwi

Krwotok powstający przy zmianach miażdżycowych wywołuje aktywację płytek, zakrzepicę tętnicy wieńcowej i zastoje krwi powodujące osłabienie przepływu krwi. Tak więc, dla poprawienia przepływu krwi, pacjentom z dusznicą bolesną zaleca się przewlekłe podawanie aspiryny, jako inhibitora aktywacji płytek krwi. Skuteczność DSP i aspiryny w poprawianiu przepływu krwi porównywano za pomocą określania takich parametrów jak, Hb, Lb, P i przepływ powietrza. DSP poprawia przepływ powietrza tak skutecznie jak aspiryna. DSP poprawia przepływ krwi tak skutecznie jak aspiryna. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 10.

T a b e l a 10

DSP i aspiryna poprawiają przepływ krwi

D	SP	Aspiryna
	Przed	Po	Przed	Po
Hb	6,23 ± 1,67	4,35 ± 1,02	6,12 ± 1,56	4,28 ± 1,07
Lb	10,92 ± 2,21	8,30 ± 1,14	10,38 ± 1,96	8,21 ± 0,3
P	1,95 ± 0,08	1,77 ± 0,08	1,89 ± 0,12	1,67 ± 0,7
Przepływ powietrza	1,79 ± 0,13	1,39 ± 0,11	1,82 ± 0,17	1,40 ± 0,10

Łączna liczba pacjentów: 25 otrzymujących DSP i 28 otrzymujących aspirynę

DSP zmniejsza zastoje krwi przez hamowanie aktywacji płytek krwi

Tromboksan B2 aktywuje płytki krwi. Aktywowane płytki uwalniają różne substancje, w tym β mikroglobulinę płytkową, która powoduje zastoje krwi, tym samym osłabiając przepływ krwi. Zbadano skuteczność DSP w hamowaniu aktywacji płytek krwi. DSP obniża stężenie tromboksanu B2 i skutecznie hamuje agregację płytek krwi. Diazotan izosorbidu, który znany jest z braku zdolności do hamowania aktywacji płytek krwi i który stosuje się jako kontrolę, nie zmniejszył stężenia tromboksanu B2 ani nie hamował aktywacji płytek krwi. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 11.

T a b e l a 11

DSP hamuje aktywację płytek

Przed leczeniem	Po leczeniu
β PM	DSP	62,44 ± 14,37	45,65 ± 12,25
	azotany	59,89 ± 15,42	54,36 ± 13,18
Txβ2	DSP	1312± 535	738 ± 384
	azotany	1315± 507	1218±445

DSP obniża stężenie cholesterolu w osoczu

Zwiększone stężenie cholesterolu w osoczu może pociągać za sobą zapoczątkowanie miażdżycy. W celu zapobiegania tworzeniu nowych zmian miażdżycowych, zaleca się obniżenie stężenia cholesterolu w osoczu, zarówno przez modyfikację diety jak i przez podawanie leków. Zbadano czy DSP obniża stężenie cholesterolu w osoczu. DSP obniża poziom cholesterolu o 0,3 mmola/litr, co jest wynikiem statystycznie znamiennym, przy wartości P wynoszącej 0,05. Wyniki zamieszczono poniżej w tabeli 12.

T a b e l a 12

DSP zmniejsza stężenie cholesterolu w osoczu

Stężenie cholesterolu w osoczu (mmol/l)
Przed leczeniem	Po leczeniu
DSP	5,15 ± 0,16	4,84 ± 0,2

Liczba pacjentów: 80

Wpływ pigułek Cardiotonic Pill na LPO i SOD w surowicy krwi u pacjentów cierpiących na chorobę wieńcową serca.

Metoda: leczonej grupie pacjentów liczącej 24 osoby, zgodnie z China Reference Diagnosis

Standards for Coronary Heart Disease, zmienionymi w 1979 r. podaje się pigułki Cardiotonic Pill

PL 209 402 B1 w dawce po 10 pigułek trzy razy na dobę. W grupie zdrowej, 20 zdrowym osobom nie podaje się żadnych leków.

Wyniki: Stężenie LPO u pacjentów cierpiących na chorobę wieńcową serca jest wyraźnie wyższe niż u zdrowych osób, podczas gdy zawartość SOD jest wyraźnie niższa (p<0,01). Po leczeniu pigułkami Cardiotonic Pill, wartość LPO wyraźnie zmniejsza się (p<0,01), zaś wartość SOD wyraźnie zwiększa się (p<0,01). Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 13.

T a b e l a 13

Porównanie zawartości SOD i LPO w grupie osób zdrowych i leczonych pacjentów (x±s)

Grupy	Pacjenci	SOD (ng/ml)	LPO (nmol/ml)
Grupa zdrowa	20	348 ±106	4,64 ± 1,52
Grupa leczona	24	Przed leczeniem	267 ± 76*	7,16 ± 1,48*
Po leczeniu	309 ± 87#	4,68 ± 1,72##

Uwaga: W porównaniu z grupą zdrowych osób, * p<0,05. W porównaniu z tymi przed leczeniem, # p<0,05, ## p<0,01.

Wniosek: Przewlekłe niedokrwienie mięśnia sercowego u pacjentów cierpiących na chorobę wieńcową serca i niedotlenienie tkanki, powoduje zmniejszenie aktywności SOD, zwłaszcza pozakomórkowej SOD, zwiększa stężenie wolnych rodników tlenowych, co powoduje podwyższenie stężenia LPO i dalsze zużycie SOD. Po podaniu pacjentom pigułek Cardiotonic Pill, stężenie LPO wyraźnie zmniejsza się, podczas gdy stężenie SOD wzrasta. To powoduje, że pigułki Cardiotonic Pill charakteryzuje silne działanie oczyszczające w odniesieniu do wolnych rodników tlenowych, które jest również jednym z mechanizmów leczenia choroby wieńcowej serca.

Wpływ pigułek Cardiotonic Pill na aktywności LPO i antyoksydaz w leczeniu zespołu płucno-sercowego

Metoda: Pacjenci: 48 pacjentów cierpiących na zespół płucno-sercowy losowo podzielono na trzy grupy. W grupie normalnej, 16 pacjentów leczono za pomocą kompleksowej terapii, takiej jak leczenie przeciwzapalne, leczenie przeciwastmatyczne, inhalacje tlenem i tym podobne. W grupie drugiej, 14 pacjentom podawano po 10 pigułek Cardiotonic Pill trzy razy na dobę. W grupie trzeciej, 18 pacjentom dożylnie podawano w kroplówce 200 mg Gantangzhi rozpuszczone w 250 ml 5% roztworu glikozy, raz na dobę przez 10 dni.

Wyniki: Po leczeniu pigułkami Cardiotonic Pill, wartość GSH-Px zwiększyła się, zaś wartość LPO obniżyła się, tym samym stosunek GSH-Px/LPO zwiększył się. W porównaniu z normalnie leczoną grupą zaobserwowano znaczne różnice. Wyniki zamieszczono w poniższej tabeli 14.

T a b e l a 14

Wskaźniki uzyskane przed i po leczeniu

	GSH-Px (U/mgHb)	CAT (U/gHb)	SOD (U/gHb)	LPO (nmol/ml)	GSH-Px/LPO
Grupa zdrowych osób	140,6 ± 35,2	312,7 ± 58,1	5799,8 ± 948	4,2 ± 1,2	34,2 ± 8,7
Grupa normalna	Przed leczeniem	101,3 ± 23,6	300,4 ± 107,7	5740,5 ± 939,0	5,6 ± 1,9	20,4 ± 8,8
Po leczeniu	120,6 ± 20,6#	390 ± 184,3#	6076,8 ± 1091	4,3 ± 1,2##	31,3 ± 15,1##
Grupa leczona Cardiotonic Pill	Przed leczeniem	108,8 ± 28,3	233,1 ± 70,2	5863,3 ± 1072,7	5,9 ± 2,0	18,5 ± 7,6
Po leczeniu	158,2 ± 40,7##**	328,4 ± 78,5##*	5582,8 ± 1094,7#*	4,1 ± 1,6##**	36,4 ± 6,7##**

Uwaga: Porównanie tych przed leczeniem z tymi po leczeniu, #p>0,05, ##p<0,05, *p>0,05, **p<0,05.

Wniosek: pigułki Cardiotonic Pill wykazują działanie antyutleniające i mogą zmniejszać reakcję peroksydacji lipidów i zwiększać zdolność do przeciwdziałania utlenianiu w ludzkim organizmie.

Pigułki Cardiotonic Pill w leczeniu samoistnego nadciśnienia

Metoda: (1) Dobór pacjentów: wybiera się pacjentów cierpiących na samoistne nadciśnienie w fazie I lub II, lecz bez wtórnego nadciśnienia lub niewydolności serca, wątroby i nerek.

(2) Podawanie: pacjentom odstawia się jakiekolwiek leki zachodniej lub chińskiej medycyny (poza lekami obniżającymi ciśnienie) na dwa tygodnie, w trzecim tygodniu, pacjentom mierzy się ciśnienie krwi i reologiczne wskaźniki krwi i określa ich kliniczne objawy. Stosuje się podwójnie ślepą

PL 209 402 B1 próbę. W grupie otrzymującej pigułki Cardiotonic Pill, pacjentom doustnie podaje się Cardiotonic Pill, po 10 pigułek jednocześnie, 3 razy na dobę. W grupie otrzymującej tabletki Compound Danshen Tablet, pacjentom doustnie podaje się po 5 tabletek jednocześnie Compound Danshen Tablet, 3 razy na dobę. Pacjentom z grupy kontrolnej podaje się placebo. Okres leczenia wynosił sześć tygodni.

Wyniki: (1) Wpływ na lepkość pełnej krwi. Po przeprowadzeniu leczenia, lepkości pełnej krwi pacjentów w grupie otrzymującej pigułki Cardiotonic Pill i w grupie otrzymującej tabletki Compound Danshen Tablet wyraźnie spadały, lecz krzywa lepkości pełnej krwi w grupie Cardiotonic Pill przy dowolnych naprężeniach opadała bardziej ostro niż uzyskana dla grupy otrzymującej Compound Danshen Tablet. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 15.

T a b e l a 15

Wpływ pigułek Cardiotonic Pill na lepkość pełnej krwi (mPa, x±s)

Grupy	3,83 s^-1	28,3 s^-1	192 s^-1
Grupa Cardiotonic Pill (30 pacjentów)	Przed leczeniem	18,27 ± 2,85	5,82 ± 0,93	4,54 ± 0,78
	Po leczeniu	11,79 ± 3,75**## &&	4,78 ± 0,84**## &&	3,98 ± 0,65**## &&
Grupy	3,83 s^-1	28,3 s^-1	192 s^-1
Grupa Compound Danshen Tablet (30 pacjentów)	Przed leczeniem	17,69 ± 1,96	5,86 ± 0,79	4,69 ± 0,54
Po leczeniu	14,68 ± 3,4**&&	5,69 ± 0,8*&	4,42 ± 0,59**&&
Grupa kontrolna (15 pacjentów)	Przed leczeniem	17,65 ± 2,07	5,69 ± 0,79	4,75 ± 0,58
Po leczeniu	18,02 ± 2,32	5,71 ± 2,76	4,86 ± 0,65

Uwaga: W porównaniu z tymi z tej samej grupy przed leczeniem, *p<0,05, **P<0,01.

W porównaniu z tymi z grupy otrzymującej pigułki Cardiotonic Pill po leczeniu, #p<0,05, ##p<0,01. W porównaniu z tymi z grupy kontrolnej po leczeniu, &p<0,05, &&p<0,01.

(2) Wpływ na deformację i agregację erytrocytów. Po leczeniu, deformacja erytrocytów w grupie otrzymującej pigułki Cardiotonic Pill była wyraźnie większa niż przed leczeniem, oraz pole i wskaźnik agregacji były wyraźnie mniejsze niż przed leczeniem. W porównaniu z grupą leczoną tabletkami Compound Danshen Tablet, w grupie leczonej pigułkami Cardiotonic Pill spadki zachodziły znacznie szybciej (p<0,01). Wyniki zestawiono w tabeli 16.

T a b e l a 16

Wpływ pigułek Cardiotonic Pill na deformację i agregację erytrocytów (x±s)

Grupy	Wskaźnik deformacji	Wskaźnik agregacji	Pole agregacji (scałkowane)
Grupa Cardiotonic	Przed leczeniem	0,4115 ± 0,0360	4,06 ± 0,39	841,12 ± 67,68
Pill (30 pacjentów)	Po leczeniu	0,4274 ± 0,034*&	3,41 ± 0,36**#&&	683,52 ± 69,09**#&&
Grupa Compound Danshen Tablet (30 pacjentów)	Przed leczeniem Po leczeniu	0,4066 ± 0,0290	3,98 ± 0,34	806,90 ± 66,30
0,4180 ± 0,0281*&	3,64 ± 0,39**&&	716,12 ± 84,29**&
Grupa kontrolna (15 pacjentów)	Przed leczeniem	0,4091 ± 0,0376	4,02 ± 0,41	812,52 ± 65,64
Po leczeniu	0,4001 ± 0,0381	4,01 ± 0,39	804,44 ± 68,06

Uwaga: W porównaniu z tymi z tej samej grupy przed leczeniem, *p<0,05, **P<0,01. Porównanie z tymi z grupy Cardiotonic Pill po leczeniu, #p<0,05, ##p<0,01. W porównaniu z tymi z grupy kontrolnej po leczeniu, &p<0,05, &&p<0,01.

(3) Wpływ na ciśnienie krwi. Po leczeniu, skurczowe ciśnienie i rozkurczowe ciśnienie pacjentów z grupy leczonych Cardiotonic Pill jak i z grupy leczonych Compound Danshen Tablet wyraźnie spadało (p<0,01), przy czym nie zaobserwowano wyraźnej różnicy pomiędzy obu grupami pacjentów.

Wyniki zamieszczono w tabeli 17.

(4) Wpływ na objawy nadciśnienia. U pacjentów w obydwu leczonych grupach, zarówno z grupy otrzymującej pigułki Cardiotonic Pill, jak i z grupy otrzymującej tabletki Compound Danshen Tablet, zaobserwowano złagodzenie takich objawów jak, ból głowy, zawroty głowy i drętwienie kończyn (p<0,01), lecz nie zaobserwowano złagodzenia bezsenności. Wyniki zestawiono w tabeli 18.

PL 209 402 B1

T a b e l a 17

Wpływ pigułek Cardiotonic Pill na ciśnienie krwi (mmHg, x±s)

Grupy	Ciśnienie skurczowe	Ciśnienie rozkurczowe
Grupa Cardiotonic Pill (30 pacjentów)	Przed leczeniem	155,00 ± 8,08	90,70 ± 7,93
Po leczeniu	149,20 ± 8,89**&&	86,59 ± 8,30**&&
Grupa Compound Danshen Tablet (30 pacjentów)	Przed leczeniem	152,93 ± 9,59	92,59 ± 8,30
Po leczeniu	146,02 ± 10,20**&&	88,55 ± 7,22**&&
Grupa kontrolna (15 pacjentów)	Przed leczeniem	154,06 ± 7,05	90,90 ± 9,10
Po leczeniu	152,08 ± 9,25	91,10 ± 8,70

Uwaga : W porównaniu z tymi z tej samej grupy przed leczeniem, **P<0,01. Porównanie z grupą kontrolną po leczeniu, &&p<0,01.

T a b e l a 18

Wpływ pigułek Cardiotonic Pill na kliniczne objawy nadciśnienia (pacjenci)

Grupy	Ból głowy	Zawroty głowy	Drętwienie kończyn	Bezsenność
Tak	Nie	Tak	Nie	Tak	Nie	Tak	Nie
Grupa Cardiotonic (30 pacjentów)	Przed leczeniem	20	10	16	14	12	18	8	22
Po leczeniu	7	23*	2	28*	3	27*	4	26
Grupa Compound Danshen Tablet (30 pacjentów)	Przed leczeniem	22	8	17	13	10	20	6	24
Po leczeniu	15	15*	8	22*	3	27*	6	248
Grupa kontrolna (15 pacjentów)	Przed leczeniem	8	7	6	9	4	11	4	11
Po leczeniu	7	8	5	10	3	12	2	13

Uwaga: W porównaniu z tymi z tej samej grupy przed leczeniem, *P<0,01.

Wniosek: Reologiczne właściwości erytrocytów u pacjentów cierpiących na samoistne nadciśnienie wyraźnie odbiegają od normalnych. Deformacja erytrocytów wyraźnie spada, podczas gdy wyraźnie wzrasta zdolność do agregacji. Doświadczenie wykazało, że pigułki Cardiotonic Pill posiadają zdolność wyraźnego zmniejszania lepkości pełnej krwi oraz wskaźnika i pola agregacji erytrocytów, oraz znacznie zwiększają zdolność erytrocytów do deformacji. Pigułki Cardiotonic Pill mogą także obniżać ciśnienie krwi i poprawiać objawy kliniczne u pacjentów. Tym samym, pigułki Cardiotonic Pill stanowią wielkie dobrodziejstwo dla zapobiegania lub odraczania w czasie wystąpienia samoistnego nadciśnienia i zespołu sercowo-mózgowego.

Toksyczność

DSP jest bezpieczny i nietoksyczny. W Chinach ponad 5 milionów pacjentów leczono DSP bez poważnych działań ubocznych. Łagodne działania uboczne, ból głowy lub zawroty głowy, obserwowano u niewielkiej liczby pacjentów.

Podsumowanie badań klinicznych

DSP jest chińskim lekiem nowej generacji do leczenia choroby wieńcowej serca. Badania kliniczne wykazały, że DSP łagodzi objawy, jak również, zapobiega dusznicy bolesnej przez poprawienie czynności serca, zmniejszenie niedokrwienia mięśnia sercowego, hamowanie aktywacji płytek krwi, tym samym powodując zmniejszanie zastojów krwi oraz przez zmniejszanie stężenia cholesterolu w osoczu. Lecznicza skuteczność DSP przewyższa inną postać chińskiego leku Dan Shen w postaci tabletek. DSP jest lekiem o skuteczności podobnej do skuteczności leków stosowanych w Stanach Zjednoczonych Ameryki. DSP łagodzi objawy dusznicy bolesnej tak skutecznie jak nitrogliceryna, zapobiega dusznicy bolesnej tak skutecznie jak diazotan izosorbidu, będący azotanem o długim okresie działania, oraz hamuje agregację płytek krwi tak skutecznie jak aspiryna. DSP jest nietoksyczny: leczono nim ponad 5 milionów osób bez zaobserwowania ubocznych działań w większości przypadków.

Badania przedkliniczne

Badania przedkliniczne ujawniły mechanizm, zgodnie z którym DSP zapobiega jak również łagodzi objawy dusznicy bolesnej.

DSP łagodzi objawy dusznicy bolesnej przez zwiększenie przepływu krwi.

PL 209 402 B1

Szczury rasy Wistar, o masie około 260 g, znieczulono uretanem, otworzono klatki piersiowe, wycięto serca i poddawano perfuzji metodą Langendorffa w temperaturze 37°C. Stałe ciśnienie wieńcowej perfuzji utrzymywano przy 65 cm H2O.

Po ustabilizowaniu częstości akcji serca, podano różne ilości DSP lub tabletek Danshen, za każdym razem przez kaniulę dołączoną do bocznej gałęzi tętnicy. Następnie, zmierzono przepływ wieńcowy i częstość akcji serca. DSP zwiększył przepływ wieńcowy w szerokim zakresie dawkowania. Tabletki Danshen przeciwnie zwiększają przepływ wieńcowy w wąskim zakresie dawkowania. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 19.

T a b e l a 19

DSP zwiększa przepływ wieńcowy

Przepływ wieńcowy
Dawka (mg/ml)	Przed leczeniem	Po leczeniu
Bez leku	7,0 ± 1,1	7,1 ± 0,97
DSP	5,8	7,2 ± 1,1	7,0 ± 1,4
	290	6,7 ± 1,6	8,7 ± 1,4
	580	6,7 ± 1,5	9,3 ± 2,9
Tabletki DS	5,8	6,7 ± 1,4	7,1 ± 1,5
	290	7,3 ± 1,7	9,1 ± 2,1
	580	6,8 ± 1,4	7,1 ± 1,5

Badano wpływ DSP i tabletek Danshen na częstość akcji serca. Ani DSP ani tabletki Danshen nie zmieniły częstości akcji serca. Wyniki zamieszczono w poniższej tabeli 20.

T a b e l a 20

DSP nie zwiększa częstości akcji serca

Częstość akcji serca
Dawka (mg/ml)	Przed leczeniem	Po leczeniu
Bez leku	194 ± 17	193 ± 12
DSP	5,8	180 ± 11	189 ± 9
	290	188 ± 7	184 ± 8
	580	173 ± 14	167 ± 13
Tabletki DS	5,8	180 ± 11	189 ± 9
	290	189 ± 16	183 ± 14
	580	186 ± 23	171 ± 8

DSP zwiększa przepływ wieńcowy poprzez rozkurczanie mięśni gładkich naczyń, tym samym rozszerzając naczynia.

Badano wpływ DSP na wywołane potasem skurczenie naczyń skrawka tętnicy królika. DSP powoduje rozkurcz mięśni gładkich, tym samym znacznie rozszerzając naczynia. Podobne działania obserwowano w doświadczeniach na pierścieniach z wieńcowej tętnicy świni.

DSP hamuje agregację płytek

Badano wpływ DSP na agregację płytek. Płytki krwi królika poddano działaniu DSP i badano agregację. DSP znacznie hamuje agregacje płytek. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 21.

T a b e l a 21

DSP hamuje agregację płytek

DSP (mg/ml)	Liczba zwierząt	Stopień agregacji (%)	Hamowanie (%)
0	6	6,7 ± 4,4	0
1,8	6	42,7 ± 2,5	8,3 ± 4,5
3,5	6	33,4 ± 3,4	23,6 ± 6,7*
7	6	25,3 ± 2,1	37,6 ± 5,9*
14	6	15,8 ± 3,0	69,0 ± 6,9*

PL 209 402 B1

W tabeli 22 przedstawiono wskaźniki mikrojądrowe u myszy w różnych okresach czasu po podaniu ziołowej kompozycji według wynalazku (8400 mg/kg).

T a b e l a 22

Czas (godziny)	Polichromatyczne RBC	Komórki mikrojądrowe	Wskaźnik mikrojądrowy (%) (x±SD)
12	6000	9	1,5 ± 0,8
24	6000	11	1,8 ± 0,7
36	6000	11	1,8 ± 1,2
48	6000	11	1,8 ± 1,5
72	6000	13	2,2 ± 0,7
Rozpuszczalnik 24	6000	9	1,5 ± 1,4

W tabeli 23 przedstawiono wskaźnik mikrojądrowy u myszy 24 godziny po podaniu DSP i CP.

T a b e l a 23

Dawka (mg/kg)	Polichromatyczne RBC	Komórki mikrojądrowe	Wskaźnik mikrojądrowy (%) (x±SD)
8400	6000	12	2,0 ± 0,6
840	6000	9	1,5 ± 1,0
84	6000	11	1,8 ± 1,0
Rozpuszczalnik	6000	9	1,5 ± 1,4
CP (80 mg/kg)	6000	138	23,0 ± 4,0*

*W porównaniu z rozpuszczalnikiem P<0,01

W tabeli 24 przedstawiono kryteria oceny dla określenia skuteczności badanych leków.

T a b e l a 24

Parametry/Działanie	Bardzo silne działanie	Silne działanie	Działanie	Brak działania
Stan agregacji RBC	Brak	Słaby	Umiarkowany	Silny
Czas rozpoczęcia	< 90	90-180	180-300	> 300
Stan mikroprzepływu krwi	Lepszy niż normalny	Powrót do normalnego	Poprawiony	Pogorszony
Czas trwania (minuty)	> 15	15-10	10-5	< 5

DSP poprawia mikrokrążenie

Wpływ DSP na mikrokrążenie badano na chińskich chomikach. DSP poprawia mikrokrążenie na 23 minuty, po czasie 111 minut po podpoliczkowym podaniu, u wszystkich zwierząt. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 25.

T a b e l a 25

DSP poprawia mikrokrążenie

	Czas rozpoczęcia (min)	Czas trwania (min)	Stopień skuteczności (%)
DSP	111	23	100

W tabeli 26 przedstawiono ochronne działanie DSP na mięsień serca szczurów pobudzony pituitryną (drugi okres).

PL 209 402 B1

T a b e l a 26. (n=8)

Grupa	Dawkowanie (g/kg)	Przed leczeniem	Po leczeniu
Przed pituitryną	Po pituitrynie (40 s - 15 minut). Liczba szczurów z nieprawidłowym EKG
Kontrolna		Prawidłowe	Prawidłowe	7
DSP	0,4	Prawidłowe	Prawidłowe	3*
	0,8	Prawidłowe	Prawidłowe	1 **
1,2	Prawidłowe	Prawidłowe	>j **
DST	0,4	Prawidłowe	Prawidłowe	4
0,8	Prawidłowe	Prawidłowe	1 **

W porównaniu z grupą kontrolną. *p<0,05; **p<0,01

W tabeli 27 przedstawiono hamujące działanie DSP na niedokrwienie mięśnia sercowego wywołane pituitryną u szczurów.

T a b e l a 27

Grupa	Dawkowanie (g/kg)	Hamowanie (%)
DSP	0,4	71,4*
0,8	85,7*
1,2	71,4*
DST	0,4	42,8*
0,8	85,7*

W porównaniu z grupą kontrolną *p<0,05.

W tabeli 28 przedstawiono ochronne działanie DSP na niedokrwienie mięśnia sercowego wywołane pituitryną u szczurów (pierwszy okres).

T a b e l a 28. (n=8)

Grupa	Dawkowanie (g/kg)	Zmiany w T-ST na EKG (odprowadzenie II) w pierwszym okresie
Przed leczeniem	Po leczeniu
Przed pituitryną	Po pituitrynie (0-40s.). Liczba szczurów z nieprawidłowym EKG
zwiększony T	odwrócony T	ogółem
Kontrolna	-	Prawidłowe	Prawidłowe	4	3	7
DSP	0,4	Prawidłowe	Prawidłowe	3	0	3*
0,8	Prawidłowe	Prawidłowe	1	1	2*
1,2	Prawidłowe	Prawidłowe	2	1	3*
DST	0,4	Prawidłowe	Prawidłowe	3	2	5
0,8	Prawidłowe	Prawidłowe	1	1	2*

W porównaniu z grupą kontrolną *p<0,05.

Działanie pigułek Cardiotonic Pill oczyszczające w odniesieniu do wolnych rodników tlenowych

Badania nad działaniem pigułek Cardiotonic Pill oczyszczającym w odniesieniu do wolnych rodników tlenowych prowadzono przy użyciu elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) i pułapkowania spinowego, stosując aniony nadtlenkowe i rodniki hydroksylowe wytwarzane za pomocą odpowiednio układu ksantyny-oksydazy ksantynowej i układu H2O2-Fe²⁺.

Metoda: (1) Wytwarzanie rodników hydroksylowych. Przygotowuje się model badawczy zgodnie z metodą Fentona. Miesza się H2O2, siarczan żelaza i DMPO (1-tlenek 5,5-dimetylopiroliny), po czym oznacza za pomocą EPR. Otrzymane sygnały stosuje się jako kontrolne. Grupie leczonej podaje się dodatkowo pigułki Cardiotonic Pill.

(2) Wytwarzanie anionów nadtlenkowych. Stosuje się model oparty na reakcji ksantynyoksydazy ksantynowej. Miesza się ksantynę, kwas dietylenotriaminopentaoctowy, DMPO i oksydazę

PL 209 402 B1 ksantynową, po czym oznacza za pomocą EPR. Otrzymane sygnały stosuje się jako kontrolne. Grupie leczonej podaje się dodatkowo pigułki Cardiotonic Pill.

Dla każdej z czterech grup bada się po dziesięć próbek i wyniki podaje się jako wartości średnie. W analizie statystycznej stosuje się test t-studenta.

Wyniki: (1) Pigułki Cardiotonic Pill wykazują działanie oczyszczające w odniesieniu do rodników hydroksylowych wytwarzanych przez układ H2O2-Fe²⁺. Addukt DMPO-OH może powstawać gdy rodnik hydroksylowy jest wychwytywany przez DMPO. Wartość szczytowa dla adduktów w grupie kontrolnej wynosiła 11,8 ± 0,6 jednostek względnych, podczas gdy w grupie otrzymującej pigułki Cardiotonic Pill wynosiła 4,1 ± 0,5 jednostek względnych. Stanowi to znaczącą różnicę pomiędzy tymi wartościami (p<0,01), przy czym wielkość klirensu dla pigułek Cardiotonic Pill jest wyższa niż 65%.

(2) Oczyszczające działanie pigułek Cardiotonic Pill w odniesieniu do anionów nadtlenkowych wytworzonych przez układ ksantyny-oksydazy ksantynowej. Addukt DMPO-OOH może powstawać wówczas gdy anion nadtlenkowy jest wychwytywany przez DMPO. Wartość szczytowa dla adduktów w grupie kontrolnej wynosiła 10,6±0,67 jednostek względnych, podczas gdy w grupie otrzymującej pigułki Cardiotonic Pill sygnały widmowe zanikały całkowicie. W porównaniu z grupą kontrolną stanowi to znaczącą różnicę (p<0,01), zaś wielkość klirensu dla pigułek Cardiotonic Pill wynosi 100%.

Powyższe doświadczenia wykazują, że pigułki Cardiotonic Pill skutecznie oddziaływują na działanie oczyszczające w odniesieniu do anionów nadtlenkowych wytworzonych przez układ ksantynyoksydazy ksantynowej i do rodników hydroksylowych wytwarzanych przez układ H2O2-Fe²⁺.

Wpływ pigułek Cardiotonic Pill na wolne rodniki w tkance uszkodzonej w wyniku reinfuzyjnego niedokrwienia mózgu u szczurów

Metoda: 30 szczurów SD, losowo podzielono na 3 grupy, jedna z nich to grupa pozorowanej operacji, (przeprowadza się operację, lecz naczynia krwionośne i nerwy nie są podwiązane), modelowa grupa z reinfuzyjnym niedokrwieniem mózgu oraz grupa otrzymująca pigułki Cardiotonic Pill (4 g/kg). Po 3 dniach ciągłego dootrzewnowego podawania (Ip) i dwóch godzinach po podaniu w dniu trzecim, szczury znieczulono za pomocą 20% etylouretanu i ich prowadzące tętnice po obu stronach ich szyi oraz błędne nerwy oddzielono i podwiązano. W czasie 30 minut prowadzono reinfuzję, po czym odcięto głowy i pobrano mózgi. Pobrano około 500 mg tkanki korowej z lewej połowy mózgu i tkanki hipokampu z obu stron, umieszczono je w ciekłym azocie po czym homogenizowano. Po czym przygotowano homogenat z zamrożonym roztworem fizjologicznym soli i odwirowano. Zebrano supernatant i określono w nim aktywności CAT i SOD oraz oznaczono zawartość MAD i GSH.

Wyniki: Wyniki zestawiono w tabeli 29. (1) Wpływ pigułek Cardiotonic Pill na aktywność CAT i na zawartość GSH w tkance mózgu. Aktywności CAT w korze mózgowej i w tkance hipokampu oraz zawartość GSH w korze mózgowej w grupie modelowej z reinfuzyjnym niedokrwieniem mózgu były o wiele niższe niż w grupie pozorowanej operacji. Aktywność CAT w tkance hipokampu jak i zawartość GSH w korze mózgowej dla grupy otrzymującej pigułki Cardiotonic Pill były znacznie wyższe niż w grupie modelowej.

T a b e l a 29

Aktywność CAT i SOD i zawartość MDA i GSH w tkance mózgu szczurów (mPas, x±s) (n = 10)

Grupa	Aktywność CAT (U/mg białka)	GSH (pmol/mg białka)	Aktywność SOD (U/mg białka)	MDA (nmol/mg białka)
Kora mózgowa	Hipo- kamp	Kora mózgowa	Hipo- kamp	Kora mózgowa	Hipo- kamp	Kora mózgowa	Hipo- kamp
Grupa pozoro-	2,94 ±	2,78 ±	18,49 ±	16,87 ±	14,24 ±	20,34 ±	0,502 ±	1,084 ±
wanej operacji	0,17	0,14	0,70	0,92	0,90	0,74	0,054	0,117
Grupa mode-	2,17 ±	1,97 ±	14,76 ±	13,80 ±	10,44 ±	18,18 ±	0,718 ±	1,449 ±
lowa	0,24*	0,23*	1,12#	0,74	0,79*	0,62*	0,070*	0,140*
Grupa Cardio-	2,55±0,35	2,791±	17,14 ±	15,76 ±	13,31 ±	20,59 ±	0,483 ±	1,069 ±
tonic Pill		0,21#	0,76	1,18#	0,77#	0,59#	0,065#	0,131#

Uwaga : W porównaniu z grupą pozorowanej operacji *p<0,05; w porównaniu z modelową grupą #p<0,05.

(2) Wpływ pigułek Cardiotonic Pill na aktywność SOD i zawartość MDA w tkankach mózgu. Aktywność SOD w tkankach mózgu zwierząt z grupy modelowej była znacznie niższa niż zwierząt z gruPL 209 402 B1 py pozorowanej operacji, podczas gdy zawartość MDA była znacznie wyższa. Aktywności SOD w korze mózgowej i tkance hipokampu u zwierząt z grupy otrzymującej pigułki Cardiotonic Pill znacznie wzrosła, podczas gdy zawartość MDA znacznie zmniejszyła się.

Wniosek: po reinfuzyjnym niedokrwieniu mózgu, zawartość MDA w tkankach mózgu wzrasta, podczas gdy zawartość GSH zmniejsza się. Aktywności CAT i SOD, dwóch ważnych enzymów oczyszczających tkanki z wolnych rodników tlenowych znacznie spadają, co wykazano w czasie badania reinfuzyjnego niedokrwienia mózgu, znaczna ilość wolnych rodników tlenowych występuje przy uszkodzeniu działania układu usuwającego wolne rodniki tlenowe. Prowadzi to do peroksydacji lipidów, a tym samym pociąga za sobą uszkodzenie mózgu. Pigułki Cardiotonic Pill mogą zmniejszać zawartości MDA w korze mózgowej i w tkance hipokampu szczurów poddanych reinfuzji i zwiększać zawartość GSH i aktywności CAT i SOD, co dowodzi, że pigułki Cardiotonic Pill posiadają działanie znacznie ograniczające reakcje wolnych rodników tlenowych, kontrolujące peroksydację lipidów i ochraniające komórki mózgu uszkodzone w wyniku reinfuzyjnego niedokrwienia.

Przeciwutleniające działanie Cardiotonic Pill w przypadkach przewlekłych uszkodzeń wątroby

Metoda: Przyjęto model łagodnego przewlekłego uszkodzenia wątroby wywołanego u szczurów rasy Wistar przez CCL4 w połączeniu z dietą wysokotłuszczową i niskobiałkową. W grupie otrzymującej Cardiotonic Pill, perfundowano Cardiotonic Pill do żołądków szczurów w dawce 4 g/kg, podczas gdy w grupie zdrowej i grupie modelowej tym samym sposobem podawano fizjologiczny roztwór soli. Aktywność SOD określono przy użyciu metody z oksydazą ksantynową, podczas gdy zawartość MDA określono za pomocą poprawionej metody z kwasem tiobarbiturowym.

Wyniki: Wyniki zestawiono w tabeli 30. Porównując wyniki uzyskane w grupie modelowej z wynikami w grupie zdrowej, aktywności SOD spadły, podczas gdy MDA wzrosły. Jednak w grupie otrzymującej Cardiotonic Pill, aktywność SOD wzrosła, podczas gdy MDA spadła, co przywraca stan prawidłowy u zwierząt w grupie otrzymującej Cardiotonic Pill.

T a b e l a 30

Aktywność SOD i zawartość MDA w przewlekłych uszkodzeniach wątroby

Grupy	Szczury	SOD (NU/mg.pr)	MDA (nM/mg.pr)
Grupa zdrowa	12	1,717 ± 0,521	15,21 ± 4,35
Grupa modelowa	12	1,326 ± 0,3218	19,39 ± 4,62*
Grupa Cardiotonic Pill	11	1,710 ± 0,415#	15,16 ± 4,29#

Uwaga: W porównaniu z grupą normalną, *p<0,05. W porównaniu z grupą modelową, #p<0,05.

Wniosek: MDA jest głównym produktem rozkładu w reakcji peroksydacji lipidów. MDA może znacznie uszkodzić budowę błony komórkowej i następnie komórki wątroby. SOD jest czynnikiem zmiatającym nadtlenkowe aniony wolnych rodników i może osłabić peroksydację lipidów powodowane wolnymi rodnikami. Pigułki Cardiotonic Pill mogą znacznie zwiększyć aktywność SOD i zmniejszyć zawartość MDA, co wyraźnie będzie zmniejszało przebieg reakcji peroksydacji lipidów i zmniejszy uszkodzenie wątroby.

DSP nie jest mutagenny

W próbie Amesa badano czy DSP jest mutagenny. DSP okazał się niemutagenny. Wyniki zestawiono w poniższej tabeli 31.

T a b e l a 31

Mutagenność DSP (próba Amesa)

		Liczba kolonii/płytkę
	S9	TA97	Ta98	TA100	TA102
DSP	-
0,0	-	141 ± 13	36 ± 3	161 ± 21	303 ± 44
0,5	-	140 ± 17	35 ± 2	148 ± 21	288 ± 15
5	-	136 ± 14	34 ± 4	154 ± 26	280 ± 16
50	-	133 ± 20	33 ± 5	142 ± 25	292 ± 37

PL 209 402 B1 cd. tabeli 31

500	-	109 ± 15	34 ± 3	154 ± 16	311 ± 32
5000	-	67 ± 8*	30 ± 4	149 ± 27	298 ± 32
0,0	+	141 ± 13	44 ± 6	176 ± 19	296 ± 39
		Liczba kolonii/płytkę
	S9	TA97	Ta98	TA100	TA 102
0,5	+	148 ± 13	42 ± 9	161 ± 27	296 ± 37
5,0	+	152 ± 11	44 ± 7	161 ± 16	292 ± 38
50,0	+	140 ± 18	37 ± 6	166 ± 9	307 ± 55
500,0	+	135 ± 21	42 ± 7	152 ± 22	287 ± 16
5000,0	+	119 ± 17	38 ± 7	162 ± 17	363 ± 57
Dekson
50	-	2155 ± 814	952±187	831±114	1510±211
2-AF
40	-	125 ± 18	38 ± 3*	161 ± 16
	+	1404±644*	1598±124	1222± 309
DAN
100	-	364 ± 50
	+	943 ±102*

Wytwarzanie surowców leków

1. Dan shen (1) Kontrola jakości

Próbki surowego leku Dan Shen pobierano z roślin uprawianych w całych Chinach. Próbki poddano chemicznej analizie w celu określenia zawartości głównych składników. Wyniki wykazują, że jakość Dan Shen z pola nazwanego Shangluo była najlepsza ze wszystkich i dowiodły, że klimat Shangluo jest najbardziej odpowiedni dla upraw Dan Shen. Aktywne składniki Dan Shen, takie jak, tanshinon i kwas szałwiowy A występowały w najlepszych ilościach.

(2) Topografia

Shangluo jest zlokalizowane przy długości geograficznej wschodniej wynoszącej 108°34'20''~111°1'25'' oraz szerokości geograficznej północnej wnoszącej 33°2'30''~34°24'40'' oraz przy średniej wysokości nad poziomem morza wynoszącej 900 metrów. Region ten jest obszarem z niskimi i o średniej wysokości górami oraz wolny jest od zanieczyszczeń. Nieskażone czyste powietrze czyni to miejsce idealnym dla upraw roślin leczniczych.

(3) Klimat

Obszar ten charakteryzuje gorący i pół-wilgotny klimat, typowy dla górskich obszarów strefy przejściowej od podtropikalnej do umiarkowanej. Obszar nawiedzany jest przez południowowschodnie monsuny, co stanowi wyraźny podział na sezony i daje dużą ilość opadów deszczu. Roczny opad deszczu na tym terenie szacuje się w przybliżeniu na 733,9 - 899 mm. Czas nasłonecznienia trwa około 1874,1 - 2185 godzin w roku, roczne naświetlenie słońcem wynosi 119,57 - 124,36 kiloka₂ lorii/cm². Temperatury wahają się w granicach od 18°C do 40,8°C. Okresy wolne od temperatur niższych od zera wynoszą 198 - 218 dni w ciągu roku.

(4) Gleba

80% gleby w Shangluo jest glebą piaszczystą, większość pól uprawnych jest glebami obojętnymi i słabo alkalicznymi o wartości pH 6,5 - 8. W warstwie uprawnej o grubości 0 - 20 cm występują następujące składniki odżywcze: 1,36% substancja organiczna; 0,085% azot; 18 ppm szybko działający fosfor; 136 ppm szybko działający potas; oraz 60 ppm azot w związkach hydrolizowanych alkalicznie. W glebie nie występują metale ciężkie i inne toksyczne substancje w dawkach przekraczająPL 209 402 B1 cych poziomy dopuszczalne przez normy krajowe. Obszar jest bogaty w rośliny i zwierzęta. Miejscowi rolnicy stosują nawozy organiczne.

(5) Metale ciężkie

Osiem metali, w tym ołów, kadm, rtęć, arsen i inne, pozostałości pestycydów, powietrze i woda, wszystkie spełniają wymagania stawiane przez krajowe normy ochrony środowiska.

(6) Normalizacja

Sadzenie i oranie dla upraw Dan Shen prowadzi się zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Rolniczej (GAP). Technologiczna wiedza związana z uprawą Dan Shen ujęta jest w broszurach i rozprowadzona wśród rolników uprawiających Dan Shen. W czasie sezonu uprawnego, technicy odwiedzają pola, urządzają szkolenia na miejscu i oferują pomoc techniczną, w celu znormalizowania upraw Dan Shen na skalę dużych plantacji.

(7) W obszarze produkcyjnym Shangluo uprawiano i zebrano 20 różnych odmian Dan Shen. Obserwowano różne odmiany Dan Shen i porównano sytuacje hodowlane, wydajność, wygląd i chemiczne składniki w czasie trzech lat. Odmiany o najwyższej jakości przeznaczono do upraw w dużej skali.

(8) Hodowlę tkankową i technikę klonowania adaptuje się w uprawach Dan Shen w celu przyspieszenia procesu i skrócenia cyklu rozwojowego.

(9) Po 30-dniowym okresie hodowli w probówkach, procedurę rozmnażania przeprowadza się w większej skali. Ma to miejsce 40 dni przed okresem ukorzeniania. Okres ukorzeniania trwa kolejne 10 dni i w tym czasie rośliny wytwarzają i rozwijają swój system korzeniowy. Stopień ukorzenienia zwykle wynosi 90% lub więcej. Następnie rośliny przenosi się do szkółki, w której zraszające urządzenie nawadniające i inne warunki kontroluje się za pomocą technologii komputerowej. Rośliny przesadza się na zewnętrzne pole po miesięcznej hodowli w szkółce.

(10) Zgodnie z opinią ekspertów, uprawa Dan Shen w naszej bazie produkcyjnej zapewnia nie tylko wysoką jakość lecz pozwala na uzyskanie większej wydajności korzeni (50% wyższa waga korzeni w porównaniu z uzyskiwanymi na innych polach), oraz zapewnia wyższy skład chemicznej kompozycji (70% wyższa zawartość aktywnych składników leku w porównaniu z próbkami z innych miejsc).

2. Naturalny borneol (1) Warunki hodowli

Obszary na których uprawia się naturalny borneol znajdują się w powiecie Xinhuang w prowincji Hunan, w Chinach, w regionie wzgórz o średniej wysokości, sięgających 300 - 600 m nad poziomem morza. 60% obszaru jest porośnięte lasem. Gleba jest glebą piaszczystą o barwie żółtej lub czerwonej o wartości pH 5 - 6. W obszarze tym nie stwierdzono zanieczyszczeń powietrza lub wody.

(2) Biologiczna charakterystyka drzewa

Ekstremalnie silna zdolność wzrostu, rośnie w postaci zarośli krzewów, 300-400 drzew na jed₂ nostkę chińską mu (odpowiadającą 666,7 m²). Zbiera się liście z górnych części gałęzi; wydajność około 1000 kg z jednostki chińskiej mu.

(3) Rozmnażanie i rozsadzanie

Rozmnażanie prowadzi się przy użyciu szczepienia i cięcia. Rośliny hoduje się w pierwszym roku w szkółce, a następnie na wiosnę w drugim roku przesadza się na pole. Pole wymaga okresowego nawożenia i włókowania.

(4) Rośliny mogą rosnąć do wysokości 30 cm i średnicy szerokości 80 - 100 cm. Zawierają one naturalną kamforę w różnych częściach: liściach, gałęziach, pniu i w korzeniach. Spośród nich liście zawierają najwięcej kamfory.

(5) Drzewa kamforowe typu borneol z Xinhuang są jedną z naturalnych odmian Cirnamonium glandullferm (wall) Noes. Drzewa kamforowe różnią się pod względem zawartości kamfory i borneolu, jedne z nich wykazują niższą zawartość borneolu i wyższą kamfory, podczas gdy inne wykazują wyższą zawartość borneolu i niższą kamfory. Na podstawie oznaczania dużej ilości próbek i wielu analiz HPLC, wybraliśmy odmianę drzewa kamforowego, która zawiera powyżej 80% borneolu z niewielkimi zanieczyszczeniami.

3. Radix Notoginseng

a. Nasiona rośliny (1) Oznaczanie Radix Notoginseng

W reakcji PCR dla oznaczenia masy cząsteczkowej, można obserwować wybarwiony Radix Notoginseng, Radix Notoginseng ma charakterystyczny „genetyczny odcisk palca DNA.

PL 209 402 B1 (2) Kształt i właściwości

Nasiona Radix Notoginseng charakteryzuje okrągły, kulisty kształt. Nasiona cechuje różny okres wzrostu, Radix Notoginseng ma nasiona dwuletnie lub trzyletnie. Dwuletnie nasiona mają średnicę 0,45 - 0, 55 cm i ważą 95 - 103 gramów, dla nasion wysuszonych. Nasiona trzyletnie mają średnicę 0,54 - 0,65 cm i ważą 98 - 109 gramów po wysuszeniu.

(3) Temperatura odpowiednia dla kiełkowania nasion

Temperatura odpowiednia dla kiełkowania nasion wynosi 10-30°C, idealna temperatura wynosi 15-20°C.

(4) Zawartość wody

Zawartość wody powinna wynosić 60-70%, jeśli zawartość wody jest poniżej 20% przez dłuższy okres czasu, to nasiona mogą stracić żywotność.

(5) Stan uśpienia

Nasiona wykazują tendencję przejścia w stan uśpienia w okresie 45 - 60 dni po zebraniu.

(6) Okres życia

Nasiona wykazują okres życia wynoszący 15 dni w stanie naturalnym po zebraniu.

(7) Wymagania dla przechowywania nasion

Nasiona można zbierać z roślin, które rosły dłużej niż dwa lata, części nadziemne drzew powinny wzrastać prawidłowo oraz powinny być wolne od szkodników. Zaleca się zbieranie nasion z roślin trzyletnich.

(8) Opieka nad polem zarezerwowanym dla nasion

Pole przeznaczone pod uprawę wymaga otoczenia większą opieką niż normalne pola uprawne, należy usuwać z niego zakażone rośliny we wszystkich okresach rozwoju, w żadnym przypadku szkodniki nie powinny mieć kontaktu z pączkami. W okresie wypuszczania pączków i liści, dwukrotnie należy opryskać 3000 ppm YunDa-120 i roztworem uzyskanym przez 400-krotne rozcieńczenie Yang Kang, będącego biologicznym nawozem. Ponadto, w okresie kwitnienia i w okresie owocowania rośliny opryskuje się fitokininą.

(9) Okres zbierania nasion

Okres zbierania nasion Radix Notoginseng trwa od końca października do początku grudnia.

(10) Metody zbierania nasion

O zbieraniu nasion decyduje się na podstawie ich dojrzałości. Nasiona z drzew, których wzrost był silniejszy zbiera się i przechowuje oddzielnie. Procedura postępowania ściśle zakazuje zbierania nasion niedojrzałych.

(11) Postępowanie

Rośliny myje się bezpośrednio po zbieraniu, przy czym wybiera się miazgę i zarażone nasiona. Po myciu rośliny suszy się na słońcu.

(12) Przechowywanie

W czasie 30 minut nasiona Radix Notoginseng poddaje się działaniu roztworu uzyskanego przez 300-krotne rozcieńczenie 58% metalaksyl-mangan-cynk. Po wysuszeniu, gdy powierzchnia nasion stanie się sucha, nasiona przechowuje się z wilgotnym piaskiem o zawartości 20% wody. Jest to krytyczny etap procesu.

(13) Pakowanie

Końcowe produkty pakuje się w czyste pojemniki. Powinny one być zaopatrzone w napisy podające datę zbioru, sposób obróbki i numer partii produktu.

(14) Transportowanie

Czyste, zabezpieczone przed dostępem wody i wietrzone środki transportu można stosować do przewożenia, przy jednoczesnym zabezpieczeniu przed zanieczyszczeniem toksycznymi substancjami. Jeśli czas transportu będzie większy niż 8 godzin, nasiona muszą być przewożone razem z wilgotnym piaskiem.

(15) Badanie na żywotność nasion

Stosuje się metodę TTC: odważa się dokładnie 1 g proszku tetrazolinowego i rozpuszcza w 1000 ml destylowanej wody uzyskując roztwór o stężeniu 0,1% TTC. W roztworze zanurza się próbkę i utrzymuje w czasie 24 godzin, następnie wyjmuje się i dzieli na połowę, po czym jedną połowę umieszcza na płytce hodowlanej. Otrzymany 0,1% roztwór TTC stosuje się do zabarwienia próbki w czasie 30 minut. Żywotność nasion określa się na podstawie ich barwy.

PL 209 402 B1 (16) Zwalczanie szkodników

i. Obserwuje się nasiona gołym okiem po umieszczeniu ich w ilości 500 - 1000 na kartce papieru lub kawałku szkła o barwie białej. Jeśli na powierzchni próbki zaobserwuje się nienormalne plamy lub szkodniki, można podjąć decyzję o uznaniu próbki za zakażoną. Zakażone próbki powinny być przechowywane osobno i powinien być określony poziom ich zakażenia.

ii. Cięcie i kontrola: do rozcięcia owoców i otwarcia gniazd nasiennych, używa się skalpela. Pobiera się dwie próbki po 100 nasion każda. Oblicza się liczbę zakażonych nasion w celu określenia stopnia zakażenia.

iii. Zapach jako kontrola próbki: umieszcza się próbkę na dłoni i za pomocą węchu bada czy próbka wydziela jakikolwiek zapach. Ewentualnie, próbkę umieszcza się w naczyniu zawierającym gorącą wodę (60 - 70°C), przetrzymuje się pod przykryciem przez 2-3 minut, wylewa wodę i wącha nasiona. Nasiona powinny wydzielać delikatny zapach, jeśli nie, to nasiona są prawdopodobnie zakażone.

(17) Kontrola barwy

Nie-zakażone nasiona powinny mieć barwę jasnożółtą i białą.

(18) Kontrola mikroskopowa

Wybiera się przypadkowo 5 próbek testowych (każda z próbek zawiera nie mniej niż 50 nasion), próbki umieszcza się na płytce hodowlanej i utrzymuje w czasie 24 godzin. Następnie obserwuje się nasiona pod mikroskopem w celu wykrycia na nich jakichkolwiek patogennych bakterii i jeśli takie występują oblicza się poziom zakażenia.

b. Sadzenie roślin (1) Temperatura dla kiełkowania

Temperatura dla kiełkowania Radix Notoginseng waha się w granicach 1 - 20°C, idealna temperatura wynosi 15°C.

(2) Zawartość wody

Zawartość wody w glebie stosowanej dla rozsady roślin wynosi 20-25%.

(3) Przechowywanie

Rozwój Radix Notoginseng od pączka w stanie spoczynku do kiełkowania wymaga 90 dni jako okresu uśpienia. 100 ppm gibereliny może pomóc skrócić okres uśpienia.

(4) Ukorzenianie

Okres ukorzeniania dla Radix Notoginseng rozciąga się od początku grudnia do końca stycznia. W czasie ukorzeniania, korzenie należy traktować z ostrożnością. Rozsadzać należy bezpośrednio po ukorzenieniu.

(5) Transportowanie

Radix Notoginseng nie można transportować na długich odcinkach, gdyż mogą ulegać uszkodzeniu. Jeśli jest to konieczne, Radix Notoginseng powinny być umieszczone w wietrzonych zbiornikach z glebą, bez bezpośredniej ekspozycji na działanie słońca.

(6) Kontrola jakości

i. W celu określenia wagi każdej rośliny, wybiera się 300 - 500 sadzonek jako próbkę, umieszcza każde 100 sadzonek w grupie, waży na wadze i oblicza wagę jednej sadzonki.

ii. W celu przeprowadzenia kontroli szkodników: pobiera się cztery grupy próbek, każda zawierająca 100 sadzonek. Próbki umieszcza się na szklanych płytkach i obserwuje gołym okiem lub za pomocą lupy o powiększeniu 5-10 razy w celu wykrycia na nich szkodników.

iii. Z próbki w czterech grupach, z których każda zawiera 100 roślin, pobiera się wycinki w celu przeprowadzenia obserwacji pod mikroskopem.

c. Hodowla sadzonek (1) Warunki polowe

Sadzonki Radix Notoginseng hoduje się na najlepiej przygotowanych polach. Sposób postępowania obejmuje scentralizowaną hodowlę i metodę hodowlaną na dużą skalę.

(2) Środowisko

Obszar jest całkowicie wolny od zanieczyszczeń. Jakość powietrza jest powyżej poziomu 2 według norm GB 3059-96.

(3) Źródła wody

Źródła wody obejmują wodę deszczową, wodę podziemną i naturalne powierzchniowe cieki wodne. Jakość wody w tym obszarze jest monitorowana według norm GB 5084-92.

(4) Gleba

PL 209 402 B1

Radix Notoginseng nie można uprawiać na glebie mulistej, ilość metali ciężkich w glebie wybranej do uprawy Radix Notoginseng powinna być zgodna z normami krajowymi.

(5) Idealna gleba

W celu uzyskania dobrych wyników, wybieraliśmy glebę kwaśną (pH 5,5 - 7,0) o nachyleniu stoku nie większym niż 15°. Przy wysokości nie większej niż 1600 m nad poziomem morza naświetlenie słoneczne powinno wynosić 8 - 12%, oraz przy wysokości wyższej niż 1600 m nad poziomem morza naświetlenie słoneczne powinno wynosić 10 - 20%.

(6) Temperatura

W okresie kiełkowania temperatura powietrza powinna wynosić 20 - 25°C, oraz temperatura gleby powinna wynosić 10 - 15°C. W okresie zbioru najlepsza temperatura powietrza powinna wynosić 20 - 25°C, oraz najlepsza temperatura gleby powinna wynosić 15 - 20°C.

(7) Zawartość wody

Zawartość wody w glebie powinna wynosić 25 - 30%.

(8) Przygotowanie gleby

Glebę należy trzykrotnie zaorać przed wysadzeniem sadzonek i glebę wystawić na działanie słońca, co pomoże w zniszczeniu bakteryjnych substancji w glebie.

(9) Postępowanie z glebą

W celu zapobiegania uszkodzeniu korzeni, 75 - 100 g wapna palonego stosuje się na każdy metr kwadratowy przed przesadzeniem.

(10) Budowa i wykorzystanie zacienienia

Zacienienie umieszcza się 1,8 m ponad powierzchnią gruntu z rowem o głębokości 2 m poniżej gruntu. Najlepiej gdy słońce dociera na 8 - 10% gdy pole położone jest na wysokości nie wyższej niż

1600 m ponad poziomem morza oraz 10 - 15% gdy pole położone jest powyżej 1600 m. Pole powinno być płaskie; głęboka warstwa gleby powinna być luźna; podczas gdy wierzchnia warstwa gleby powinna być zwięzła. Wysadzanie najlepiej prowadzi się od końca grudnia do końca stycznia. Przed wysadzaniem, nasiona zanurza się w 58% metalaksyl-cynk (500 - 800 x) lub w 1,5% roztworze antymycyny (200 ppm) na 30 - 50 minut i wyjmuje w celu wysuszenia. Zabieg ten wykonuje się w celu ochrony roślin przed chorobami (powleczone nasiona nie muszą być poddane powyższemu postępowaniu). Gęstość sadzenia wynosi 4 x 5 cm lub 5 x 5 cm, co daje 100 - 200 tysięcy nasion na jednostkę chińską mu powierzchni pola. Stosuje się specjalne narzędzia do wytworzenia płytkiego rowka i przy użyciu mechanicznego urządzenia lub ręcznie rozmieszcza się nasiona i sadzonki. Nasiona całkowicie przykrywa się drobną glebą.

Następnie przeprowadza się nawożenie, nawadnianie i pielenie. Chwasty należy usuwać w czasie całego procesu uprawy. Jeśli nastąpi przerwanie zacienienia, powinno ono być natychmiast naprawione i ustawione tak by zapewniało prawidłowe docieranie światła słonecznego. Naturalne nawozy obejmują nawóz drobiowy, popiół z pieca i mączkę kostną (nie należy stosować nawozu ludzkiego).

d. Hodowla Radix Notoginseng (1) Topologia

Najkorzystniejszym jest pole o umiarkowanym nachyleniu do 15° z dobrą ekspozycją na słońce.

(2) Rodzaj gleby

Najkorzystniej ziemia jest luźna na większej głębokości i gleba piaszczysta.

(3) Wartość pH powinna wynosić 5,5 - 7.

(4) Rośliny wstępnie uprawiane

Aby unikać destrukcji gleby na nowych polach wstępnie prowadzi się uprawy kukurydzy, pszenicy i fasoli.

(5) Wysokość nad poziomem morza

Najkorzystniejszą lokalizacją pola dla upraw Radix Notoginseng jest pole na wysokości 1400 - 1800 m nad poziomem morza w pobliżu wysokości 23,5°.

(6) Nasłonecznienie

Radix Notoginseng jest rośliną wymagającą tylko 8 - 20% nasłonecznienia. Ilość słońca powinna się zmieniać w zależności od różnych okresów wzrostu. Jednak zbyt duża ekspozycja na słońce powoduje zatrzymanie rozwoju roślin.

(7) Zawartość wody

Zawartość wody w glebie powinna wynosić 25 - 30%.

PL 209 402 B1 (8) Nawożenie

Stosuje się nawozy organiczne razem z nawozami złożonymi, nawozami mikroskładnikowymi lub nawozami z pierwiastkami śladowymi.

(9) Temperatura

Na polach Radix Notoginseng średnie temperatury roczne utrzymują się w granicach 15 - 18°C. W okresie kiełkowania najbardziej odpowiednia temperatura powietrza wynosi 20 - 25°C, zaś temperatura gleby wynosi 15°C. W czasie przyswajania pożywki i w okresie kwitnienia najkorzystniejszą temperaturą jest 25°C. Jeśli temperatura jest niższa niż 15°C, kwitnienie będzie zakłócone.

(10) Uprawa pola

Przed założeniem hodowli, pole powinno być zaorane i trzykrotnie rozluźnione aż jego struktura stanie się proszkowa.

(11) Przygotowanie gleby

Przed zasiewem i przesadzeniem, do gleby stosuje się 75 - 100 g wapna palonego w celu jej wyjałowienia.

(12) Wymagania co do podłoża

Głębokość warstwy gleby poletka przy płaskiej powierzchni powinna wynosić 20 - 25 cm, a przy nachylonej powierzchni 15 - 20 cm. Szerokość poletka waha się pomiędzy 120 i 140 cm i poletko jest w kształcie dachówki. Gleba na spodzie poletka powinna być luźna, zaś na wierzchołku zwięzła, w celu lepszego przenikania.

(13) Namoczenie ziarna

W czasie przesadzania, ziarna moczy się na 30 - 50 minut w 58% metalaksylu (500 - 800 x) i następnie pozostawia do wysuszenia, w celu zapobiegania przed chorobami roślin oraz w celu eliminowania szkodników.

(14) Gęstość sadzenia

Pomiędzy roślinami utrzymuje się odstęp 10 x 12,5 cm - 10 x 15 cm. Uzyskuje się tym samym 26 - 32 tysięcy roślin na każdą chińską jednostkę mu.

(15) Metody przesadzania

Sadzonki wysadza się w tym samym kierunku ze względu na organizację uprawy. W przypadku pola położonego na pochyłości sadzonki sadzi się od końca dolnego do górnego. Pierwszy rząd sadzonek kieruje się do góry, podczas gdy drugi rząd kieruje się do dołu. Pączki są także skierowane do góry, zaś części dolne do wewnątrz.

(16) Przykrywanie glebą

Stosuje się sproszkowaną, luźną i wilgotną glebę do całkowitego przykrycia sadzonek, bez wystawiania korzeni lub pączków.

(17) Nawożenie

Jako specjalny nawóz stosuje się nawóz drobiowy, popiół z pieca, popiół kostny, fosforan wapniowo-magnezowy i tym podobne.

Odnośniki literaturowe:

1. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5288485 „vasodilating agent;

2. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5433957 „vasodilating agent;

3. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5776463, „Method of reducing stress and circulatory heart disease with freeze-dried borage petal extracts;

4. Yang G. Y. i in., „Clinical studies on the treatment of coronary heart disease with Valeriana officinalis varlatifolia, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 14(9): 540-2, 1994;

5. Wu Y., „Clinical study on Xintongkang capsule in treating angina pectoris of coronary heart disease, Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 10(7): 395-8, 1990;

6. Liu K. Y. i in., „Clinical obcervation on treatment of 45 angina pectoris patients of coronary heart disease with taponin, Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 15(11): 649-51, 1995;

7. Hu J. X. i in., „Clinical and experimental study of shenshao tongguan pian in treating angina pectoris of coronary heart disease, Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 10 (10): 596-9, 1990;

8. Li Y. i in., „Effects of Kuo-guan granule on plasma zinc, copper and erythrocyte GSH-Px (glutathione peroxidase) in patients with angina pectoris, Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 10(6): 348-50, 1990;

9. Wang B. i in., „406 cases of angina pectoris in coronary heart disease treated with saponin of Tribulus terrestris, Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 10(2): 85-7, 1990;

10. Jin C. i in., „Effect of Astragalus membranaceus on erythrocyte sodium content and sodium transport in the coronary heart disease, Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 11 (11): 651-3, 1991;

PL 209 402 B1

11. Jiang H. W. i in., „Clinical study in treating qi-deficiency and blood-stasis syndrome of angina pectoris with qi xue granule, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 12(11): 663-5, 1992;

12. Wang X. F. i in., „Clinical observation of wenxin decoction in treating 82 patients with spontaneous angina pectoris, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 16 (4) : 201-3, 1996;

13. Lei Z. Y. i in., „Action of Astragalus membranaceus on left ventricular function of angina pectoris, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 14(4): 199-202, 1994;

14. He W. i in., „Effects of Kuo guan powder on immunologic functions in patients with ben-xu biao shi syndrome in ischemic heart disease, Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 9(4): 213-5, 1989;

15. Chen K. i in., „Clinical study on the effect of shuxuening tablet in treatment of coronary heart disease, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 16(1): 24-6, 1996;

16. Zhang H. i in., „Clinical study on effects of buyang huanwu decoction on coronary heart disease, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 15(4): 213-5, 1995;

17. Zhang X. L. i in., „Preliminary study of rose shu-xin oral liquid in the treatment of angina pectoris in coronary heart disease, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 12(7): 414-6, 1992;

18. Hu J. X. i in., „Clinical and experimental study of ehenshao tongguan pian in treating angina pectoris of coronary heart disease, Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih;

19. Zhu W. i in., „Protective effect of danshen during myocardial ischemia and reperfusion; an isolated rat heart study, American Journal of Clinical Medicine, 18(1-2): 19-24, 1990;

20. Li Y. Y., „Clinical and experimental study on the effect of xue mai tong on coronary heart disease, Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 9(2): 79-81, 1989;

21. Cai P. Y. i in., „A clinical study of hehuantang in treating coronary heart disease, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 16(4): 204-6, 1996;

22. Lin Q. C., „A clinical study of guan mai le in the treatment of coronary heart disease, Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 9 (5) : 280-2, 1989.

23. Li S. Q. i in., „Clinical observation on the treatment of ischemic heart disease with

Astragalus membranaceus, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 15 (2): 77-80, 1995;

24. Lu B. J. i in., „Effect of sheng mai san on lipid peroxidation in acute myocardial infarction patients, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 14(12): 712-4, 1994;

25. Wang S. i in., „Effects of Codonopsis pilosulae on the synthesis of thromboxane A2 and prostacyclin, Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 10(7): 391-4, 1990;

26. Guan M. i in., „Observation on the treatment of coronary heart disease by kuo guan qu yu ling, Journal of Traditional Chinese Medicine, 10(1): 49-53, 1990;

27. „Fufang Danshen Pian „Pharmacopeia of the People's Republic of China, wydanie angielskie 1997, tom 1, 280;

28. Zhu H. G., „Clinical study on xinkening in treating asymptomatic myocardial ischemia in coronary heart disease, Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih, 14(4): 213-5, 1994;

29. Chiang W. T. i in., „Effects of „Danshensu and other two water-soluble components of salvia miltiorrhiza on dog ischemic myocardium and isolated pig coronary artery, Acta Acad. Med. Prim. Shanghai, 1982; 9: 13-19;

30. Sun Xi. ming i in., „Studies on a new pharmacological action of anextract of Danshen (Salvia miltiorrhiza), Chin. Med. Herb., 1991; 22; 20-23;

31. Chen Z. H. i in., „Studies on effects of „Danshensu on experimental microcirculatory disturbances and plasm lactic acid concentrations, Acta Acad. Med. Prim., Shanghai, 1987, 14: 25-29;

32. Huang C. i in., „Effects of Panax Notoginseng Saponins on myocardial ischemia and reperfusion injury in conscious rabbit, Chin. Bull. Pharmacol., 1991; 7: 190-3;

33. Shi L. i in., „Effects of total saponins of Panax Notoginseng on increasing PGI2 in carotid artery and decreasing TXA2 in blood platelets. Acta Pharmacol. Sin., 1990; 11: 29-32;

34. Xu W. i in., „Effect of menthol and borneol on the distribution of sulfadiazine sodium and Evan's blue in the rat and mouse brain, Pharmacol. Chin. Med. Clin., 1995; (6): 31-33;

35. Chen T. F. i in., „Enhancement of absorption of tetramethylpyrazine by synthetic borneol, Acta Pharmacol. Sin., 1990; 11: 42-44;

36. Li X. i in., „Protective effects of Panax notoginseng saponins on experimental myocardial injury induced by ischemia and reperfusion in rat, Acta Pharmacol. Sin., 1990; 11: 26-29;

37. Pan J. G. i in., „Chemical Studies on Essential oils from six Artemisia Species, Chin.

J. Chin. Mater. Med., 1992; 17: 741-6;

PL 209 402 B1

38. Wu Y. Z. i in., „An assessment of Radix Salviae Miltiorrhizae in promoting blood circulation by removing blood stasis, Acta Nanjing Univ. Trad. Chin. Mater. Med. 1995; 11: 35-6;

39. Wang N. S. i in., „Experimental studies of „Benifits of Borneol as an Assistant or a guide,

J. Trad. Chin. Med., 1994; 35: 46-7;

40. Li C. Z. i in., „Anti-coagulation effect of Radix Salviae Miltiorrhizae, Chin. J. Integr. Med. 1983; 3: 297-9;

41. Li C. Z. i in., „An experimental study on thrombotic inhibition effect of Radix Salviae Miltiorrhizae, Acta Acad. Med. Prim., Shanghai, 1979, 6: 145-9;

42. Mo Q. X. i in., „Dynamics of 3H-Borneol, Propriet. Trad. Chin. Med. Res., 1982; 8: 5-7;

43. Zheng R. X. i in., „Preservation effect of Radix Salviae Miltiorrhizae on myocardial ischemia induced by coronary ligation in mice, Chin. J. Integr. Med. 1992; 12: 424-6.

Claims

1. Ziołowa kompozycja do leczenia przewlekłej, stabilnej dusznicy bolesnej, znamienna tym, że zawiera rozpuszczalne w wodzie ekstrakty Notoginseng, rozpuszczalne w wodzie ekstrakty Salviae i syntetyczny borneol, przy czym kompozycja ta jest wytwarzana sposobem obejmującym etapy, w których:

(a) rozcieńcza się zioła 5- do 7-krotną ilością wody;

(c) powtarza się ekstrakcję w tych samych warunkach przez 1,5 godziny;

(d) przesącza się ekstrakt przez sito o oczkach 150 μm (100 mesh);

(a) rozcieńcza się zioła 5- do 7-krotną ilością wody;

(c) powtarza się ekstrakcję w tych samych warunkach przez 1,5 godziny;

(d) przesącza się ekstrakt przez sito o oczkach 150 μm (100 mesh);

(f) prowadzi się wytrącanie etanolem z koncentratów;

(g) przesącza się roztwór wytrąconego etanolem osadu przez sito o oczkach 150 μm (100 mesh);

(h) zatęża się przesącza w warunkach dekompresji, przy dopływie powietrza pod ciśnieniem 0,04 - 0,06 mPa i przy ciśnieniu zmniejszonym o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego;

(j) zatęża się oczyszczone ekstrakty do gęstości względnej 1,33 - 1,35;

C. wytwarza się pigułkę metodą wkraplania w etapach, w których:

(b) stapia się mieszaninę;

PL 209 402 B1 (d) odwirowuje się pigułki przy 800 - 1100 obrotach na minutę przez 15 minut, usuwając oleje.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wytwarzana jest sposobem obejmującym etapy, w których:

a) do wielofunkcyjnego zbiornika ekstrakcyjnego wprowadza się Radix Salviae Miltiorrhizae; dodaje się wodę aż do poziomu 15 - 20 cm powyżej ziół, czyli w ilości około 5- do 7-krotnie większej od ilości ziół; ogrzewa się je do temperatury wrzenia z użyciem pary wodnej, przy czym wewnętrzne ciśnienie powietrza powinno być utrzymywane w granicach 0,04 - 0,06 mPa; w zbiorniku utrzymuje się wrzenie, dwukrotnie ogrzewając w warunkach wrzenia, najpierw przez 2 godziny, a następnie przez 1,5 godziny, ekstrakt odsącza się w dolnej części zbiornika ekstrakcyjnego przez sito o oczkach 150 μm (100 mesh) do zbiornika podstawowego, zaś pozostałość odrzuca się;

c) odsącza się i w trakcie powolnego mieszania do roztworu dodaje się 95% etanol do uzyskania 70% stężenia etanolu w roztworze, mierzonego przez 24 godziny grawimetrem etanolowym,

d) otwiera się zbiornik, supernatant w postaci roztworu znad osadu wytrąconego etanolem przepuszcza się przez sito o oczkach 150 μm (100 mesh) do zbiornika zatężającego pod próżnią, ciśnienie wprowadzonego powietrza doprowadza się do 0,04 - 0,06 mPa, a ciśnienie doprowadza się do ciśnienia zmniejszonego o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego, utrzymując w zbiorniku burzliwe wrzenie i odzyskuje się etanol do osiągnięcia roztworu ziołowego o objętości wyrażonej w litrach w przybliżeniu równej ilości roślin wyrażonej w kilogramach w stosunku 1:1;

a) do wielofunkcyjnego zbiornika ekstrakcyjnego wprowadza się Radix Notoginseng; dodaje się wodę aż do poziomu 15 - 20 cm powyżej ziół, czyli w ilości około 5- do 7-krotnie większej od ilości ziół; ogrzewa się je do temperatury wrzenia z użyciem pary wodnej, przy czym wewnętrzne ciśnienie powietrza powinno być utrzymywane w granicach 0,04 - 0,06 mPa; w zbiorniku utrzymuje się wrzenie, dwukrotnie ogrzewając w warunkach wrzenia, najpierw przez 2 godziny, a następnie przez 1,5 godziny, ekstrakt odsącza się w dolnej części zbiornika ekstrakcyjnego przez sito o oczkach 150 μm (100 mesh) do zbiornika podstawowego, zaś pozostałość odrzuca się,

b) makroporowata żywica adsorpcyjna:

i. wstępna obróbka makroporowatej żywicy adsorpcyjnej: makroporowatą, niepolarną żywicę adsorpcyjną ZTC-1 o wielkości ziarna 0,3 - 1,2 mm i średniej wielkości porów 130 - 300 x 10^-10 m (130 - 300 A), namacza się w 95% etanolu przez 24 godziny, po czym wypełnia się nią kolumnę, kolumnę przemywa się etanolem i równą objętością wody aż do uzyskania klarownego eluatu; lub po przemyciu kolumny 0,1 - 1 mol/l NaOH lub HCl, kolumnę przemywa się wodą do pozbycia się zapachu etanolu w eluacie lub do obojętnej wartości pH;

ii. ekstrakt Radix Notoginseng z etapu (a), wprowadza się do kolumny w ilości 1 g/1 g żywicy ₂ przy natężeniu przepływu 0,5-5 cm/cm²/minutę, przemywa się kolumnę aż do uzyskania klarownego ₂ eluatu, eluuje się 70% etanolem przy natężeniu przepływu 0,5-5 cm/cm²/minutę, zbiera się eluat;

iii. odzyskiwanie żywicy: kolumnę przemywa się 95% etanolem aż do uzyskania bezbarwnego i klarownego eluatu po dodaniu równej objętości wody, następnie przemywa się kolumnę wodą dla usunięcia zapachu etanolu;

c) eluat o zawartości 75% etanolu przepuszcza się przez sito o oczkach 150 μm (100 mesh) do zbiornika zatężającego pod próżnią, ciśnienie wprowadzonego powietrza doprowadza się do wartości

0,04 - 0,06 mPa, a ciśnienie doprowadza się do ciśnienia zmniejszonego o 0,076 - 0,088 mPa w stosunku do ciśnienia atmosferycznego, utrzymując w zbiorniku burzliwe wrzenie, odzyskuje się etanol do osiągnięcia gęstości względnej eluatu 1,33 - 1,35 i otrzymuje się ekstrakt saponin z Notoginseng; oraz

PL 209 402 B1

C. wytwarza się pigułkę metodą wkraplania w etapach, w których:

b) przenosi się stopioną mieszaninę do kotła do wkraplania urządzenia do wkraplania, w której utrzymuje się temperaturę 89 - 93°C; przy czym jako roztwór chłodzący stosuje się ciekłą parafinę o temperaturze niższej niż 8°C; wewnętrzna średnica głowicy wkraplającej wynosi 1,7 mm, zaś zewnętrzna średnica głowicy wkraplającej wynosi 2,4 mm, odległość pomiędzy cieczą z lekiem a głowicą wkraplającą wynosi 5 - 6 cm; odległość pomiędzy głowicą wkraplającą a roztworem chłodzącym wynosi 26 - 31 cm, głębokość roztworu chłodzącego wynosi około 1 metr; a szybkość wkraplania wynosi 60 - 80 pigułek/minutę;

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jej postać zewnętrzna ma jednorodny kulisty kształt o jednolitym kolorze czerwono-brązowym lub brązowo-czarnym, o aromatycznym zapachu i gorzkim smaku.

4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ma postać pigułki, kapsułki, granulki, tabletki, zawiesiny, postaci do iniekcji, syropu lub nalewki.

5. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera powyżej 12,12 pg sanchinozydu R1 na jedną pigułkę i powyżej 56,26 pg ginsenozydu Rg1 na jedną pigułkę.

6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że kolumny wypełnia się makroporowatą żywicą stosowaną w etapie B.

7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że materiał do chromatografii stosowany w etapie B jest wybrany spośród porowatego polimeru, żelu krzemionkowego, tlenku glinu, poliamidu, aktywowanego węgla drzewnego, celulozy i sephadexu, oprócz makroporowatej żywicy (model D101).

8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że eluat z kolumny chromatograficznej stosowany w etapie B zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 60°C do gęstości względnej wynoszącej 1,33 - 1,35.

9. Zastosowanie kompozycji ziołowej określonej w zastrz. 1 do wytwarzania leków do a) leczenia choroby wieńcowej serca; b) pierwotnego zapobiegania chorobie wieńcowej serca; oraz c) wtórnego zapobiegania chorobie wieńcowej serca.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, w którym kompozycję stosuje się do wytwarzania leku do leczenia stabilnej dusznicy bolesnej, do łagodzenia dusznicy bolesnej, do obniżania poziomu cholesterolu i triglicerydów we krwi u pacjentów z nieprawidłowym poziomem lipidów we krwi, do wydłużania czasu trwania wysiłku, okresu pomiędzy początkiem wysiłku i wystąpieniem dusznicy oraz okresu pomiędzy początkiem wysiłku i 1 mm obniżeniem odcinka ST, do leczenia różnych rodzajów i o różnym stopniu zaawansowania dusznicy bolesnej, wywołanej przez choroby wieńcowe serca, do leczenia uszkodzenia mózgu spowodowanego przez peroksydację lipidów wywołaną przez wolne rodniki tlenowe, do leczenia uszkodzenia wątroby spowodowanego przez peroksydację lipidów wywołaną przez wolne rodniki tlenowe, do leczenia przewlekłej choroby serca spowodowanej przez peroksydację lipidów wywołaną przez wolne rodniki tlenowe, do leczenia choroby wieńcowej serca spowodowanej przez peroksydację lipidów wywołaną przez wolne rodniki tlenowe, do leczenia samoistnego nadciśnienia, do leczenia i zapobiegania chorobom układu sercowo-naczyniowego, oraz do leczenia choroby wieńcowej serca.