PL209568B1 - Sposób wykrywania endotoksyn i sposób usuwania endotoksyn - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobu wykrywania endotoksyn i usuwania tych endotoksyn z próbki za pomocą białek ogonka bakteriofaga.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania endotoksyn i sposób usuwania endotoksyn z próbki.

Endotoksyna (ET) stanowi rodzinę lipopolisacharydów, które razem z białkami i fosfolipidami tworzą zewnętrzną ścianę komórkową bakterii Gram-ujemnych. Endotoksyny występują wyłącznie w tej grupie bakterii i odgrywają waż n ą rolę w organizacji, stabilnoś ci i dział aniu barierowym bł ony zewnętrznej. Liczne bakteriofagi wykorzystują endotoksynę lub ogólnie lipopolisacharyd dla specyficznego wykrycia ich bakterii gospodarzy.

Wszystkie warianty endotoksyn zawierają heteropolisacharyd, który jest połączony kowalencyjnie z lipidem A (Holst, O., 1999, Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides. W: Endotoxin in health and disease (Brade, H., Morrison, D.C., Opal, S., Vogel, S. red.), Marcel Dekker Inc. New York). Lipid A zakotwicza endotoksynę w zewnętrznej błonie bakterii. Heteropolisacharyd, który zawiera rdzeniowy oligosacharyd i antygen O pojawia się w otaczającym roztworze i określa serologiczną tożsamość bakterii. Antygen O zawiera powtarzające się jednostki oligosacharydowe, których układ jest specyficzny dla szczepu (patrz Holst i in., powyżej). Charakterystyczne bloki strukturalne oligosacharydu rdzenia to kwas 2-keto-3-deoksyoktonowy (KDO) i L-glicero-D-mannoheptoza (Hep).

Najbardziej konserwatywną część endotoksyny różnych gatunków stanowi lipid A. Wewnętrzny region rdzenia jest konserwowany podobnie do lipidu A, zewnętrzny region rdzenia już ma wyższy stopień zmienności. Wewnętrzny region rdzenia, KDO i sam lipid A niosą wiele grup fosforanowych jako podstawniki i są więc odpowiedzialne za ujemny ładunek endotoksyn. Co więcej, grupy fosforanowe na lipidzie A i na regionie rdzenia mogą być różnie podstawione arabinozą, etanoloaminą i fosforanem. Poszczególne sacharydowe bloki strukturalne antygenu O są acetylowane, sialilowane lub glikozylowane. Antygen O ponadto zmienia się pod względem liczby powtarzających się jednostek, wskutek czego populacja endotoksyn każdej bakterii ma pewną heterogenność (Palva E.T., Makela P.H., Lipopolysaccharide heterogeneity in Salmonella typhimurium analysed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Eur J Biochem. 1980; 107(1): 137-43; Goldman R.C., Leive L., Heterogeneity of antigenic-side-chain length in lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2., Eur J Biochem. 1980; 107(1): 145-53).

Endotoksyny są biocząsteczkami, które można znaleźć w prawie wszystkich roztworach wodnych bez odpowiednich środków ostrożności. Endotoksyny u ludzi i zwierząt mogą prowadzić do posocznicy, silnej nieprawidłowej odpowiedzi układu odpornościowego. Tak więc np. przy wytwarzaniu białek farmaceutycznych, skażenie endotoksyną powinno by dokładnie wykryte i następnie powinno być całkowicie usunięte. Endotoksyna stanowi problem w przypadku farmaceutyków wytwarzanych drogą inżynierii genetycznej, terapeutyków genowych lub substancji, które wstrzykuje się ludziom lub zwierzętom (np. leczenie zwierząt lub testy na zwierzętach). Jednak nie tylko w zastosowaniach leczniczych ale także badawczych, takich jak doświadczenia z transfekcją komórek ssaków, można obserwować hamowanie lub zmniejszenie wydajności transfekcji przez endotoksynę.

Aby móc stosować białka w ramach badań klinicznych farmakopea europejska i amerykańska wymagają, by białka były obecne na poziomie poniżej określonych wartości granicznych dla poziomu endotoksyn (np. globulina surowicy odpornościowej 0,91 EU/ml, co odpowiada 5 EU/kg masy ciała i godzinę (dawka = EU/kg*h); EU = jednostka endotoksyny; FDA (Food and Drug Administration): Guideline on Validation of LAL as End Product). Jeśli lek lub zawarte w nim białka mają za wysoki poziom endotoksyn może to prowadzić do śmierci obiektu eksperymentu. Źle skierowana obrona odpornościowa szkodzi pacjentowi ze względu na nadmierną reakcję. Może to prowadzić do zapalenia tkanki, obniżenia ciśnienia krwi, przyspieszenia bicia serca, zakrzepicy, szoku itd. Nawet dłużej trwająca ekspozycja na endotoksynę w ilościach pikogramowych może prowadzić do przewlekłych efektów ubocznych, takich jak np. niedobory odpornościowe, objawy septyczne itd. W ramach wytwarzania substancji, szczególnie w procesach z „dobrą praktyką wytwarzania” (GMP) próbuje się więc w miarę możliwości usuwać endotoksyny. Jednak usuwanie endotoksyn z białek, polisacharydów i DNA stwarza problemy. W przypadku samych białek są duże problemy ze względu na ich właściwości, takie jak stan ładunku lub hydrofobowość, które mogą praktycznie zapobiegać usuwaniu endotoksyn lub mogą prowadzić do dużych strat produktu w procedurze usuwania.

Obecnie opisano tylko trzy sposoby wykrywania endotoksyn w roztworach biologicznych, przy czym tylko dwie pierwsze metody są dopuszczone przez FDA. 1. „Badanie pirogenów u królika”; to metoda, w której żywemu królikowi wstrzykuje się roztwór endotoksyny i w ten sposób wywołuje reakPL 209 568 B1 cję odpornościową. Ta wywołana przez endotoksynę reakcja odpornościowa jest wykrywana jako występowanie gorączki. 2. Test „lizatu amebocytów Limulus (LAL)”, który jest obecnie najczęściej stosowany (Bio Whittacker, Inc., Charles-River, Inc., Associates of Cape Cod, Inc., wszystkie w USA), może być standaryzowany w znacząco polepszony sposób. W tym sposobie mierzy się aglutynacją krwi kraba skrzypłocza (Limulus poliphemus) po kontakcie z endotoksyną. 3. Dalszą możliwością jest stosowanie specjalnego układu hodowli komórek (Sterogene Inc., USA), w którym śledzi się aktywację monocytów przez powstawanie specyficznych cytokin.

Dwa pierwsze wymienione sposoby są jednak bardzo kosztowne (por. porównanie wykrywania endotoksyn) i ze względu na duże wymaganie zwierząt testowych lub krwi kraba Limulus są wątpliwe przynajmniej ze względu na ochronę zwierząt. Test LAL może faktycznie być zminiaturyzowany i zautomatyzowany, ale ze wzglę du na małą trwał o ść skł adników ma duż e wady w stosowaniu. Po otwarciu opakowania roztwór LAL musi być obrabiany i użyty natychmiast, gdyż składniki ulegają agregacji w ciągu kilku godzin. Potrzebny jest biegły personel do wszystkich metod testowych i sposoby te są bardzo podatne na zakłócenia, ponieważ np. układ odpornościowy królików może reagować zupełnie inaczej na tę samą dawkę endotoksyn. Metoda hodowli komórkowych Sterogene Company, jak wszystkie metody hodowli, jest też bardzo złożona i trudno jest ją normalizować.

Można ogólnie stwierdzić, że nie ma łatwej i ekonomicznej metody wykrywania endotoksyn i obecnie stosowane metody mają szereg wad. Istnieje więc zapotrzebowanie na sposób umoż liwiający wyeliminowanie tych wad.

Istnieje ogólnie kilka sposobów usuwania endotoksyn z roztworów biologicznych. Szczególnie w przypadku biał ek nie było dotychczas ogólnie przydatnych standardowych sposobów. Odpowiednio stosowane metody są dostosowane do konkretnych właściwości odpowiedniego białka i do odpowiedniego procesu produkcji białka. Są różne sposoby usuwania endotoksyn, przy czym każdy z tych sposobów ma specyficzne zalety i wady.

Ultrafiltracja (Petsch, D. & Anspach, F.B., 2000, J. Biotechnol. 76, 97-119 i odnośniki tamże) jest stosowana do usuwania endotoksyn z wody i roztworów ze składnikami o niskiej masie cząsteczkowej, takimi jak sole, cukry i antybiotyki, ale nie jest odpowiednia w przypadku białek lub DNA o wysokiej masie cząsteczkowej.

Ekstrakcja 2-fazowa (np. WO 0166718, Merck) ma na celu oddzielenie białek rozpuszczalnych w wodzie i DNA od endotoksyn, ale oczyszczony produkt zawiera pozostał o ś ci detergentu. Sposób ten jest poza tym czasochłonny ze względu na wielokrotne powtarzanie procedury oczyszczania.

Sposób z wymieniaczem anionowym (DEAE) jest również stosowany do usuwania endotoksyn z DNA i białek zasadowych (np. US 5990301, Qiagen; WO 9414837, Enzon), ale wymaga niskiej siły jonowej (< 50 mM NaCl) i prowadzi do współadsorpcji białek w przypadku białek kwaśnych.

Kolejny sposób usuwania endotoksyn z DNA i białek (np. BSA, mioglobiny, γ-globuliny, cytochromu C) stanowi adsorpcja powinowactwa (np. na polimiksynie B, histaminie, histydynie, polilizynie) np. GB 2192633 (Hammersmith Hospital), która jest jednak toksyczna w przypadku polimyksyny B i może prowadzić do współadsorpcji białek w przypadku niskich sił jonowych.

Stosowana jest ponadto chromatografia immunopowinowactwa, z tym że specyficzność dla specyficznych endotoksyn można osiągnąć jedynie z użyciem kosztownych przeciwciał (US 5179018, Centocor; WO 0008463, Bioserv) przeciw oligosacharydowi rdzenia.

Ponadto peptyd S3delta (WO 0127289) czynnika C (składnik testu LAL) (WO 9915676, obie: National University of Singapore) jest stosowany z białkami (np. BSA, chymotrypsynogen), ale sposób ten ma jednak niską wydajność w przypadku wysokich sił jonowych, a poza tym koszty wytwarzania są wysokie (produkcja w hodowli komórek owadów).

W odniesieniu do przemysłu farmaceutycznego, zasadniczo istnieją trzy sposoby dla roztworów białka przystosowane do właściwości białek docelowych:

• chromatografia anionowymienna • chromatografia z odwróconymi fazami; ma tę wadę, że nie jest równie odpowiednia dla wszystkich białek - szczególnie jest problematyczna w przypadku białek hydrofobowych. Ten sposób jest poza tym bardzo czasochłonny.

• Rem Tox (Millipore Company): ten sposób ma tę wadę, że oprócz bardzo długiego czasu trwania inkubacji wysoki jest udział niespecyficznego składnika wiązania, a odzyskiwanie białka często nie jest wystarczające.

Zgrubne usunięcie endotoksyny z białek do wartości do 10 EU/ml jest w wielu przypadkach możliwe za pomocą istniejących sposobów. Endotoksyna w resztkowym stężeniu zawsze ma jednak

PL 209 568 B1 nadal działanie toksyczne. Dalsze usuwanie (= doczyszczenie) jest więc proponowane lub, w zależności od dawki białka w zastosowaniu medycznym, wymagane przez farmakopeę europejską (np. 5 EU/kg masy ciała i godzinę w zastosowaniach dożylnych) i przez FDA. Jednak takie doczyszczanie często nie jest zadawalająco zapewniane przez znane sposoby. Dostępne sposoby mają znaczące wady, a w przypadku konkretnych białek często nie mogą być stosowane, względnie stosowane tylko ze znaczącymi stratami docelowego białka.

Istniała potrzeba opracowania sposobu umożliwiającego wykrywanie endotoksyn w próbkach, a takż e sposobu umoż liwiają cego usuwanie endotoksyn z roztworów wodnych.

Wynalazek dotyczy sposobu wykrywania endotoksyn, obejmującego etapy, w których: a) inkubuje się próbkę z białkiem bakteriofaga wiążącym region rdzeniowy endotoksyny, korzystnie z białkiem p12,

b) wykrywa się endotoksynę związaną z białkami bakteriofaga w obecności dwuwartościowych kationów, przy czym stężenie Ca²+ podczas inkubacji jest w zakresie od 0,1 μΜ do 10 mM i/lub stężenie Mg²+ podczas inkubacji jest w zakresie od 0,1 μM do 10 mM.

Korzystnie sposób ewentualnie obejmuje ponadto po etapie a) i przed etapem b) dodatkowy etap, w którym a') wydziela się kompleks białka bakteriofaga z endotoksyną z próbki.

Korzystnie wykrywanie przeprowadza się metodami spektroskopowymi.

Korzystnie znakowaną endoksynę usuwa się z wiązania z białkiem bakteriofaga, a następnie wykrywa się znakowaną endotoksynę.

Korzystnie białko bakteriofaga ma znacznik Strep-tag lub His-tag.

Korzystnie znacznik ma sekwencję aminokwasów według SEQ ID NO: 5, 6 lub 7.

Korzystnie jako białko bakteriofaga stosuje się białko p12 faga T4.

Wynalazek dotyczy również sposobu usuwania endotoksyn z próbki, obejmującego etapy, w których:

a) inkubuje się próbkę z białkami bakteriofaga wiążącymi region rdzeniowy endotoksyny, korzystnie z białkiem p12, które są immobilizowane na trwałym nośniku, w sposób niespecyficzny lub ukierunkowany, przy czym stężenie Ca²+ podczas inkubacji jest w zakresie od 0,1 μM do 10 mM i/lub stężenie Mg²+ podczas inkubacji jest w zakresie od 0,1 μM do 10 mM,

b) wydziela się kompleks białka bakteriofaga z endotoksyną z próbki.

Korzystnie etapy a) i b) prowadzi się sposobem przepływowym w kolumnie chromatograficznej.

Korzystnie trwały nośnik stanowi ośrodek filtracyjny, cząstki szkła, cząstki magnetyczne, materiały do wirowania, materiały do sedymentacji lub materiały do wypełniania kolumn do chromatografii.

Korzystnie białka bakteriofaga są immobilizowane na trwałym nośniku poprzez grupy sprzęgające.

Korzystnie grupę sprzęgającą stanowi lektyna, receptor lub antykalina.

Korzystnie grupę sprzęgającą stanowi streptawidyna lub awidyna, a białka bakteriofaga są sprzęgnięte z biotyną lub znacznikiem Strep-tag.

Korzystnie białka bakteriofaga są immobilizowane na trwałych nośnikach kowalencyjnie za pomocą wiązań chemicznych.

Korzystnie białko bakteriofaga ma znacznik Strep-tag lub His-tag.

Korzystnie znacznik ma sekwencję aminokwasów według SEQ ID NO: 5, 6 lub 7.

Korzystnie jako białko bakteriofaga stosuje się białko p12 faga T4.

Poniżej podano znaczenia określeń stosowanych w niniejszym opisie.

Określenie „usuwanie endotoksyny” oznacza całkowite lub częściowe usunięcie endotoksyny z materiału próbki.

Określenie „endotoksyna” oznacza lipopolisacharyd bakterii, który jest składnikiem zewnętrznej błony bakterii Gram-ujemnych.

Określenie „białko bakteriofaga, wiążące region rdzeniowy endotoksyny”, w skrócie „białko bakteriofaga” oznacza te białka, które występują u bakteriofagów i mogą wiązać składniki błon komórkowych. Normalnie te białka znajdują się w ogonku bakteriofaga, ale mogą także być zlokalizowane w główce bakteriofaga lub na normalnej otoczce bakterii w przypadku bakteriofagów bez ogonka. Składniki komórki wiązane przez ogonki bakteriofaga w szczególności rozpoznają endotoksyny.

Określenie „niespecyficzna immobilizacja” lub „nieukierunkowana immobilizacja” oznacza, że sprzęganie białka z matrycą następuje przez reszty białka (np. pierwszorzędowe grupy aminowe)

PL 209 568 B1 rozmieszczone na całej powierzchni białka. Wybór grupy stosowanej do połączenia poszczególnej cząsteczki białka jest losowy.

Określenie „ukierunkowana immobilizacja” oznacza, że sprzęganie następuje przez reszty aminokwasów lub inne reszty (np. glikozylacje białka), których pozycja w białku (np. N- lub C-koniec) jest znana. Wybór tych grup do sprzęgania następuje przez wybór odpowiednich partnerów reakcji/łączników, które preferencyjnie reagują z tymi resztami (np. sprzęgnięcie reszt sulfhydrylowych z resztami jodooctanu; jodooctan reaguje tysiąc razy szybciej z resztami sulfhydrylowymi niż z resztami aminowymi).

Jak opisano powyżej wynalazek dotyczy sposobu wykrywania endotoksyn, a korzystnie sposobu, w którym wykrywanie przeprowadza się metodami spektroskopowymi, np. emisji fluorescencji, polaryzacji fluorescencji, absorpcji lub dichroizmu kołowego, lub przez pomiar pojemności, np. sygnałów elektrycznych, albo pośrednio za pomocą wykrywania kompetycji.

Korzystnie skład jonów dwuwartościowych, np. Ca²⁺, Mg²⁺ i/lub wartość pH dopasowuje się przed inkubacją, aby osiągnąć optymalne wiązanie endotoksyna-białko bakteriofaga. Ponadto w czasie inkubacji lub po inkubacji można stosować „odmaskowanie” związanej endotoksyny przez dodanie detergentów i/lub soli, np. Tween, tritonu, NaCl lub siarczanu amonu lub innych substancji, np. chitozanu, cukru lub lipidów, które przyspieszają odłączenie endotoksyn np. od białek lub kwasów nukleinowych.

Białko bakteriofaga wiążące region rdzeniowy endotoksyny może być białkiem występującym naturalnie lub być modyfikowane technikami biologii molekularnej lub biochemii. Białko bakteriofaga może być modyfikowane technikami inżynierii genetycznej i/lub biochemicznie z różnych powodów. Jednak w sposobach według wynalazku mogą być stosowane nie tylko naturalnie występujące białka bakteriofaga ale także ich warianty. W znaczeniu związanym z wynalazkiem warianty oznaczają, że białka bakteriofaga mają zmienioną sekwencję aminokwasów. Można je otrzymać przez skrining naturalnie występujących wariantów lub przez losową mutagenezę albo ukierunkowaną mutagenezę, a także przez modyfikację chemiczną. Białka bakteriofaga stosowane w sposobach według wynalazku mogą być przystosowane przez mutagenezę ukierunkowaną lub losową w swej specyficzności lub zdolności wiązania ze strukturami nośnika. To wiązanie z nośnikami może być przeprowadzone trwale np. kowalencyjnie lub poprzez specyficzną lub niespecyficzną biotynylację, ale także mogą być przeprowadzone odwracalnie, np. poprzez redukowalny mostek disulfidowy. Trwałość można ponadto zwiększyć poprzez modyfikację. Za pomocą mutagenezy technikami biologii molekularnej lub chemicznymi wprowadza się mutacje, którymi mogą być addycje, delecje, podstawienia lub chemiczne modyfikacje aminokwasów. Te mutacje mogą doprowadzić do zmiany w sekwencji aminokwasów w regionie wią zania biał ka bakteriofaga, w celu dopasowania specyficznoś ci i powinowactwa wią zania do wymagań testu, np. zwiększenie wiązania endotoksyn z białkiem bakteriofaga lub doprowadzenia do jego nieodwracalności, aby polepszyć wykrywanie lub usuwanie. Można ponadto przeprowadzić technikami inżynierii genetycznej lub biochemicznymi modyfikację białek faga w celu wyłączenia ewentualnie obecnej aktywności enzymatycznej aby polepszyć wiązanie lub uczynić je nieodwracalnym. Można również przeprowadzić technikami inżynierii genetycznej lub biochemicznymi modyfikację białek faga w celu dopasowania aktualnych właściwości fizycznych białka, takich jak rozpuszczalność, termostabilność itd., w rozumieniu sposobu według wynalazku.

Badania nad wyjaśnieniem trójwymiarowej struktury p12 T4 wykazały, że w podwyższonej temperaturze mogą powstawać fragmenty proteolityczne 33 kDa i 45 kDa, skrócone na N- i C-końcu (33 kDa) lub tylko na N-końcu (45 kDa). W przeciwieństwie do fragmentu 33 kDa, fragment 45 kDa jest nadal zdolny do wiązania się z bakterią. Tak więc C-koniec bierze udział w wiązaniu komórek.

Celem modyfikacji może być ponadto w szczególności umożliwienie bezpośredniego wykrywania, np. przez pomiar fluorescencji tryptofanu. Przykładowo p12 ma pięć reszt tryptofanowych. Widmo fluorescencyjne natywnego białka wskazuje, że te reszty są w znacznym stopniu niedostępne dla rozpuszczalnika. Wiadomo z wielu prac naukowych, że aminokwasy aromatyczne nieomal zawsze biorą udział w wiązaniu reszt cukru, które także występują w endotoksynie. Wiązanie reszt cukru z białkami można ś ledzić jako tłumienie fluorescencji tryptofanu lub ewentualnie także dodatkowo jako zmianę maksimum fluorescencji. Na podstawie pewnych prac można domyślać się, że niekorzystny rozkład fluoroforów w naturalnym p12 uniemożliwia wykorzystywanie fluorescencyjnych właściwości p12 do pomiaru wiązania. Właściwości fluorescencyjne p12 są zdominowane przez pięć reszt tryptofanu, których fluorescencja zmienia się przez dodanie endotoksyny w niemierzalny sposób. Na podstawie tych danych można oczekiwać, że raczej reszty tyrozyny niż reszty tryptofanu biorą udział

PL 209 568 B1 w wiązaniu, przy czym taka zmiana sygnału nie moż e być uwidoczniona ze względu na silne tło tryptofanu. Na podstawie wyników proteolizy, można użyć sześciu tyrozyn na C-końcu p12 do zestawu do wykrywania endotoksyny, która może być odpowiednio „uwidoczniona”. Za pomocą selektywnej wymiany metodami biologii molekularnej pięciu reszt tryptofanu na tyrozyny, zmieniane są specyficznie właściwości spektroskopowe w pierwszym etapie tak, że mierzalne staje się wiązanie endotoksyn przez zmianę sygnału fluorescencji pojedynczej reszty tryptofanu. Następnie, drogą specyficznej zamiany odpowiednio jednej z sześciu tyrozyn w C-końcowym regionie na resztę tryptofanu, intensywność mierzalnego sygnału znacząco zwiększa się, aby uzyskać atrakcyjne różnice sygnału dla opracowania zestawu do wykrywania endotoksyn.

Stosowane białko bakteriofaga zależy od tego, które endotoksyny mają być wykryte lub usunięte. Obecnie dostępna jest duża liczba znanych bakteriofagów dla znacznej części uprzednio opisanych bakterii i mogą być one stosowane w sposobach według wynalazku. Fagi i odpowiednie bakterie gospodarzy można między innymi otrzymać z następujących kolekcji szczepów: ATCC (USA), DSMZ (Niemcy), UKNCC (Wielka Brytania), NCCB (Holandia) i MAFF (Japonia).

Korzystnie białka bakteriofaga wiążące region rdzeniowy endotoksyny do sposobów według wynalazku pochodzą od bakteriofagów, których bakterie - gospodarze mają znaczenie dla medycyny lub biotechnologii, takie jak np. E. coli, która jest stosowana w produkcji zrekombinowanych białek lub kwasów nukleinowych do terapii genowej. Białka bakteriofaga, które wiążą wysoce konserwatywne regiony endotoksyn, takie jak np. region rdzenia lub lipid A, są szczególnie korzystne. W szczególności korzystne jest p12 i podobne do p12 białka ogonka bakteriofaga. W połączeniu zanieczyszczeń endotoksynami z różnych bakterii gospodarza można stosować kombinację odpowiednich wykrywających endotoksyny białek bakteriofaga.

Wykrywanie lub usuwanie endotoksyn w próbce lub z próbki przeprowadza się przez wiązanie endotoksyn z białkami bakteriofaga. To wiązanie można wykryć np. przez bezpośredni pomiar metodami spektroskopowymi, np. poprzez pomiar emisji fluorescencji, polaryzacji fluorescencji, absorpcji lub dichroizmu kołowy. Wiązanie może być ponadto uwidaczniane za pomocą sygnałów elektrycznych np. przez pomiar pojemności. Wiązanie endotoksyn z białkami bakteriofaga może być także wykrywane pośrednio drogą doświadczeń z podstawianiem.

Do wykrywania zgodnie z wynalazkiem, białka bakteriofaga, jeśli wymagane jest wydzielenie kompleksów białko faga-endotoksyna z próbki, mogą być sprzęgane z odpowiednimi strukturami nośnikowymi, takimi jak cząstki magnetyczne, cząstki agarozy, płytki do mikromianowania, materiały filtracyjne lub komory przepływowe (wykrywanie pośrednie). Struktury nośnikowe może np. stanowić polistyren, polipropylen, poliwęglan, PMMA, octan celulozy, nitroceluloza, szkło, silikon lub agaroza. Sprzęganie można osiągnąć np. przez adsorpcję lub wiązanie kowalencyjne.

Dla sposobu usuwania według wynalazku, białka bakteriofaga są sprzężone z trwałymi nośnikami. Trwałymi nośnikami mogą być materiały do kolumn do chromatografii (np. materiały sefarozowe), ośrodki filtracyjne, cząstki szkła, cząstki magnetyczne, materiałami do wirowania lub sedymentacji (np. cząstki agarozy).

Istotne jest przy tym funkcjonalne połączenie, tak że białka bakteriofaga wiążące region rdzeniowy endotoksyny, mimo wiązania do materiału nośnikowego, mają struktury dostępne dla endotoksyn. Sprzęganie białek bakteriofaga może być przeprowadzone niespecyficznie lub, korzystnie, w sposób ukierunkowany, np. drogą selektywnej biotynylacji lub sprzęgania poprzez odstępnik lub łącznik.

W tym celu biał ka bakteriofaga mogą być usieciowane substancjami o niskiej masie czą steczkowej, np. biotyną, aby wiązać się poprzez te substancje o niskiej masie cząsteczkowej z polipeptydami np. ze streptawidyną, które z kolei są immobilizowane na nośniku. Zamiast biotyny można stosować tak zwany znacznik Strep-tag (Skerra, A. & Schmidt, T. G. M. Biomolecular Engineering 16 (1999), 79-86), będący krótką sekwencją aminokwasów, która wiąże się ze streptawidyną. Można ponadto stosować znacznik His-tag, który poprzez jony dwuwartościowe (cynku lub niklu) lub specyficzne względem niego przeciwciało (Qiagen GmbH, Hilden), może wiązać się z materiałem nośnikowym. Znaczniki Strep-tag i His-tag korzystnie wiąże się z wykorzystaniem technologii rekombinacji DNA z wytworzonymi techniką rekombinacji białkami bakteriofaga. To połączenie może być ukierunkowane, np. na N- lub C-końcu lub może być nieukierunkowane. Ukierunkowane połączenie przeprowadza się poprzez odpowiedni reaktywny aminokwas, taki jak cysteina, który oczywiście nie jest często eksponowany na powierzchni białek faga i został wprowadzony specyficznie w odpowiedniej pozycji. Ponieważ białka faga są syntetyzowane w cytoplazmie, nie musi się uwzględniać mostków disulfiPL 209 568 B1 dowych. Korzystnie połączenie może odbywać się też poprzez inne aminokwasy, bezpośrednio lub, jak też z cysteiną, pośrednio poprzez „odstępnik” lub „środek sieciujący” (monofunkcyjny lub dwufunkcyjny).

W przypadku sprzęgania przez cysteinę moż na stosować wszystkie dwufunkcyjne środki sieciujące z reaktywnymi grupami NH- i SH- z pośrednimi łącznikami lub bez nich, np. sulfo-NHS kwasu 11-maleimidoundekanowego lub 4-[N-maleimidometylo]-cykloheksano-1-karboksy-[6-amido]kapronian sukcynoimidylu. Jeśli nie są obecne odstępniki, można wstawić 8-12 C-atomowe odstępniki z końcową grupą NH. Korzystnie sprzęganie przez cysteinę przeprowadza się poprzez specyficzną biotynylację cysteiny, np. za pomocą biotyny aktywowanej EZ-łącznik-PEO-maleimidem (Pierce).

Jony dwuwartościowe, takie jak np. Ca²⁺ lub Mg²⁺ są istotne dla wiązania endotoksyn do białek fagowych, takich jak p12. Przez dodanie odpowiednich środków chelatujących, takich jak np. EDTA lub EGTA, wiązanie to może jednak zostać rozerwane. Dla wiązania korzystne są stężenia Ca²⁺ w zakresie około 0,1 μΜ do około 100 mM, szczególnie korzystne w zakresie około 0,1 μΜ do około 10 mM, a wyjątkowo korzystne w zakresie około 0,1 μM - 1 mM i jeszcze korzystniej w zakresie około 10 μM - 1 mM. Jeśli stężenie jonów dwuwartościowych zmniejszy się przez dodanie 1 mM EDTA do wartości poniżej 100 nM, wówczas rozrywane jest wiązanie endotoksyny do p12. Stężenia Mg²⁺ powyżej 10 mM pogarszają wiązanie endotoksyn do p12, czego odzwierciedleniem jest zwiększenie stałej dysocjacji. Bez dodatku Mg²⁺ uzyskuje się wartość Kd 50 nM, a w buforze z 10 mM Mg²⁺ zmierzono wartość K_d 1 μM. Cynk wykazał jeszcze silniejsze działanie hamujące. 1 mM Zn zwiększa wartość K do 10 μM. Doprowadzenie zakresu stężeń jonów dwuwartościowych lub innych jonów (np.: Cu²⁺, Al³⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Ca²⁺, Ba²⁺, Mg²⁺, Cd²⁺) do zakresu, który jest optymalny dla wiązania można przeprowadzić za pomocą takich substancji jak HEDTA, NTA lub ogólne środki chelatujące/bufory (ADA: kwas N-[2-acetamido]-2-iminodioctowy; 5-AMP: adenozyno-5'-monofosforan; ADP: adenozyno5'-difosforan; ATP: adenozyno-5'-trifosforan; Bapta: kwas 1,2-bis(2-aminofenoksy)etano-N,N,N',N'-tetraoctowy; cytrynian: kwas cytrynowy; EDTA: kwas etylenodiaminotetraoctowy; EGTA: kwas etylenoglikolo-O,O'-bis(e-aminoetylo)-N,N,N',N'-tetraoctowy; HEDTA: kwas N-hydroksyetyloetylenodiaminotrioctowy; NTA: kwas nitrylotrioctowy; SO4 siarczan), które można stosować jako bufory dla jonów dwuwartościowych.

Sposoby według wynalazku mogą więc obejmować kolejne etapy przemywania. W zależności od tego czy bezpośrednie czy pośrednie wykrywanie lub usuwanie wymaga rozdziału próbki i białka ogona bakteriofaga, można wprowadzić etapy przemywania. Ponieważ Ca²⁺ lub inne jony metali (np. Mg²⁺) są niezbędne dla wiązania, wiązanie endotoksyn z np. p12 może zostać rozerwane w odpowiednich etapach przemywania. W zależności od tego, czy endotoksyna ma pozostać związana z białkiem bakteriofaga np. p12, prowadzi się przemywanie buforem wolnym od EDTA, a jeśli wiązanie ma być rozerwane, buforem zawierającym EDTA, przy czym stężenia EDTA są w zakresie od co najmniej 0,05 mM do powyżej 10 mM, korzystnie w zakresie 2 - 5 mM.

Rozdział prowadzi się po inkubacji próbki z materiałem nośnikowym, który odpowiednio sprzęga się z białkiem bakteriofaga wiążącym region rdzeniowy endotoksyny, przez około 5 - 60 min lub około 30 - 180 min lub, a w razie potrzeby także przez noc. W tym celu próbkę eluuje się np. z kolumny do chromatografii lub sączy się albo odpowiednie cząstki odwirowuje się lub osadza albo oddziela magnetycznie pod działaniem pola magnetycznego. Rozdział w opisanej metodzie periodycznej, czyli z preinkubacją próbki i materiałów nośnikowych, które są sprzęgnięte z odpowiednim białkiem bakteriofaga, może być odpowiedni, szczególnie w przypadku bardzo niskich stężeń endotoksyn.

Usunięcie endotoksyn za pomocą kolumn do chromatografii może jednak również osiągnąć metodą czystego przepływu. Można w tym celu wprowadzić próbkę do kolumny, przy czym ta kolumna zawiera materiał nośnikowy z połączonym z nim białkiem bakteriofaga wiążącym region rdzeniowy endotoksyny. Natężenie przepływu zależy od objętości i geometrii kolumny. Natężenie przepływu zależy ponadto od objętości próbki i zawartości endotoksyny, tak aby osiągnąć w wyniku możliwie długiego czasu kontaktu między kolumną i endotoksyną skuteczne usuwanie nawet w przypadku niskich stężeń endotoksyny. Czas kontaktu jest więc czasem, którego wymaga próbka od wprowadzenia do kolumny do wypływu.

Etap rozdziału można np. stosować w sposobie usuwania do regeneracji białek bakteriofaga wiążących region rdzeniowy endotoksyny, które są sprzężone z trwałym nośnikiem. W efekcie trwały nośnik np. matrycę, można zawrócić do kolumny do chromatografii. Regenerację prowadzi się przez usunięcie związanej endotoksyny za pomocą odpowiedniego buforu zawierającego EDTA lub odpo8

PL 209 568 B1 wiedni środek chelatujący. W przypadku EDTA korzystne jest stężenie powyżej 2 mM EDTA, a zwłaszcza powyżej 10 mM EDTA.

Ponieważ na oddziaływania jonowe można zasadniczo zawsze wpływać poprzez zmiany siły jonowej, zwiększenie lub zmniejszenie stężenia innych soli w roztworze, takich jak np. NaCl lub KCl, może też wpływać na wiązanie endotoksyn do białka bakteriofaga.

Aby uczynić wiązanie bezpośrednio lub pośrednio widocznym w sposobie wykrywania, białko można także zmodyfikować metodami biologii molekularnej lub biochemii, aby umożliwić pomiar lub go polepszyć. Aby uczynić wiązanie endotoksyn do np. p12 bezpośrednio widocznym, można metodami biologii molekularnej wymienić reszty tyrozyny na tryptofan. Dla zmniejszenia tła sygnału może więc być konieczna wymiana pierwotnie obecnych tryptofanów na tyrozyny. Aby można było przeprowadzić pomiary także w roztworach zawierających białka, możliwa jest dodatkowa modyfikacja chemiczna p12 po wprowadzeniu tryptofanu. Właściwości spektroskopowe reszt tryptofanu następnie zmienia się za pomocą odczynnika Koshlanda (bromku 2-hydroksy-5-nitrobenzylu). W doświadczeniach z zastępowaniem, znakowaną endotoksynę, np. znakowaną fluorescencyjnie (Sigma) można zastąpić endotoksyną, np. przez p12, które jest obecne w próbce, tak że można oznaczyć stężenie wolnej fluoryzującej endotoksyny.

Sposobem według wynalazku endotoksynę można wykryć i usunąć ze wszelkich roztworów wodnych. Roztwory te mogą zawierać: białka, DNA plazmidowy, DNA genomowy, RNA, kompleksy białko-kwas nukleinowy, takie jak np. fagi lub wirusy, cukry, szczepionki, leki, bufory do dializy (medycyna), sole lub inne substancje skażone przez wiązanie endotoksyn.

Zgodnie z wynalazkiem można stosować białka bakteriofaga, do których są dołączone tzw. znaczniki, np. Strep- lub His-tag, korzystnie do N- lub C-końca białka, szczególnie korzystnie do C-końca. Korzystne jest sprzęgnięcie lub usieciowanie znaczników z białkami bakteriofaga z zastosowaniem technologii rekombinacji DNA. Wytwarzanie kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję białka bakteriofaga i znacznika, a także wytwarzanie produktu ekspresji jest znane ze stanu techniki i nie wymaga oddzielnego wyjaś nienia. Kolejną postać wynalazku stanowi sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje białko bakteriofaga razem ze znacznikiem Strep- lub His-tag. Białko p12 faga T4 jest szczególnie korzystnym białkiem bakteriofaga, które jest modyfikowane znacznikiem Strep- lub His-tag ale inne białka bakteriofaga, które biorą udział w wykrywaniu i wiązaniu bakterii lub są odpowiedzialne za to, są też korzystne.

Zgodnie z wynalazkiem można stosować białko bakteriofaga ze znacznikiem, który ma eksponowaną na powierzchni cysteinę do specyficznej ukierunkowanej biotynylacji, np. znacznikami według SEQ ID NO: 5, 6 i 7. Przykład p12 ze znacznikiem stanowi sekwencja aminokwasów podana w SEQ ID NO: 8. p12 ze znacznikiem jest korzystny, w szczególności ze znacznikiem na eksponowanej na powierzchni cysteinie, w szczególności p12 ze znacznikiem według SEQ ID NO: 6 i 7. Ta ukierunkowana biotynylacja może być dodatkowo nadana przez odpowiedni odstępnik lub łącznik. Wynalazek dotyczy ponadto aminokwasów o sekwencji według SEQ ID NO: 5, 6 i 7.

Sposoby według wynalazku pod względem sposobów wykrywania i usuwania endotoksyn mają zalety w przypadku odpowiednich zastosowań. Co więcej, wytwarzanie przeciwciał przeciw oligosacharydom rdzenia LPS jest trudne, toteż odpowiednie sposoby oparte na przeciwciałach są bardzo kosztowne.

Poniżej opisano figury rysunku powołane w opisie wynalazku.

Fig. 1 przedstawia schematycznie strukturę chemiczną endotoksyny z E. coli O111:B4. Hep = L-glicero-D-mannoheptoza; Gal = galaktoza; Glc = glukoza; KDO = kwas 2-keto-3-deoksyoktonowy; NGa = N-acetylogalaktozamina; NGc = N-acetyloglukozamina.

Fig. 2 przedstawia wyniki testów z kolumnami do chromatografii, które zawierają NStrepS3Cp12 immobilizowany poprzez reszty sulfhydrylowe. (A) Usunięcie endotoksyny z roztworów białka: albuminę surowicy bydlęcej (BSA), anhydrazę węglanową (CA) i lizozym (Lys) inkubowano przez 1 h w kolumnie, a następnie eluowano buforem. Stężenie endotoksyn przed kolumną i za kolumną oznaczano w teś cie LAL i na tej podstawie obliczono procent usunięcia. (B) Odzysk białka: stężenia białka w roztworach wyjściowych i frakcjach za kolumną oznaczano na podstawie pomiaru absorpcji przy 280 nm i na tej podstawie określano procent odzysku białka.

Fig. 3 przedstawia usuwanie endotoksyn z roztworu lizozymu w kolumnach do chromatografii z „nieukierunkowanym” (1) i „ukierunkowanym” (2) immobilizowanym p12. W obu przypadkach p12S3C był połączony z kolumnami aktywowanymi NHS. „Nieukierunkowana” immobilizacja była przeprowadzona przez pierwszorzędowe reszty aminowe p12S3C, które tworzą związki kowalencyjne

PL 209 568 B1 z substancją nośnikową w wyniku reakcji z grupami NHS. „Ukierunkowane” sieciowanie p12S3C poprzez N-końcową cysteinę uzyskuje się poprzez diaminoetan i SIA (jodooctan N-sukcynoimidylu).

(A) Procent usuwania endotoksyn. (B) Odzysk białka.

Fig. 4 przedstawia wyniki testów z biotynylowanym p12, który był związany z kuleczkami magnetycznymi poprzez streptawidynę. (A) Usunięcie endotoksyny z buforu (20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5) i roztworów białka oznaczono w teście LAL. (B) Odzysk białka oznaczono dla roztworów białka przez pomiary absorpcji. Oddzielanie kuleczek od roztworu przeprowadzono za pomocą separatora magnetycznego. BSA: albumina surowicy bydlęcej. CA: anhydraza węglanowa. Lys: lizozym.

Fig. 5 przedstawia wyniki usuwania endotoksyny za pomocą p12, który był immobilizowany na kuleczkach agarozowych poprzez oddziaływanie biotyna-streptawidyna. Oddzielanie immobilizowanego p12 przeprowadzono metodą wirowania. Usuwanie endotoksyn z buforu (20 mM tris, 150 mM NaCl, pH 8,0) i roztworów BSA oznaczono na podstawie stężenia endotoksyn w roztworze wyjściowym i pozostałości.

Fig. 6 przedstawia wyniki pomiarów powierzchniowego rezonansu plazmonowego. (A) Krzywe rezonansu, które mierzono jako odpowiedź na wstrzyknięcie p12 w różnych stężeniach (odpowiednio w μg/ml: 100; 25; 6,25; 4; 1,56; 0,4) (_). Wiązanie przeprowadzono na endotoksynie z E. coli D21fl, którą immobilizowano na hydrofobowym czipie HPA. Iniekcję p12 i EDTA (5 mM) zaznaczono jako kreski nad krzywymi. Bufor: 20 mM tris, 150 mM NaCl, pH 8,0. (B) Wartości równowagi rezonansu dla wiązania p12 do immobilizowanej endotoksyny mierzono około 600 s po początku iniekcji p12 i wykreślano w funkcji łącznego stężenia p12. Linia ciągła przedstawia dopasowanie izoterm absorpcji Langmuira (RU = RUmax* [p12] / [p12]+Kd) do danych. (C) Wiązanie E. coli z biotynylowanym p12, który był immobilizowany na czipach ze streptawidyną. E. coli D21e8 (_), którego wewnętrzny region rdzenia jest kompletny, do p12. Natomiast E. coli D21f2 (----), który ma znacznie skrócony region rdzenia, nie wiąże p12. Pomiary przeprowadzono w PBS.

Fig. 7 przedstawia schematycznie strukturę regionu rdzenia endotoksyny różnych mutantów E. coli.

Fig. 8 przedstawia schematycznie wynik usuwania endotoksyny metodami chromatografii przepływowej w kolumnie, E oznacza bufor do równoważenia (20 mM hepes, 150 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2, pH 7,5), A oznacza bufor A do przemywania (20 mM hepes, 150 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2, pH 7,5), B oznacza bufor B do elucji (20 mM hepes, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7,5), C oznacza bufor C do regeneracji (20 mM hepes, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,005% NaDOC, pH 7,5), S oznacza stężenie białka i endotoksyny w roztworze wyjściowym. BSA oznacza albuminę surowicy bydlęcej. Po wstrzyknięciu (I) 4 ml roztworu wyjściowego (S), prowadzono przemywanie z użyciem 15 ml buforu do przemywania i przepływ frakcjonowano (po 2,5 ml w czasie nanoszenia i 2 ml w czasie przemywania, odpowiednio). Następnie kolumnę regenerowano buforami B i C i wyciek zbierano także we frakcjach (po 2 ml). Jak widać na figurze, BSA można było znaleźć w pierwszych 3 - 5 frakcjach po iniekcji. Zawartość endotoksyn w tych frakcjach była niższa o 100 rzędów wielkości niż w przypadku roztworu wyjściowego. Endotoksyna związana z kolumną była następnie wypłukiwana z kolumny buforami B i C.

Fig. 9 przedstawia schematycznie wyniki usuwania endotoksyn ze słabo zanieczyszczonego roztworu buforu (5 EU/ml) w metodzie przepływowej. p12 immobilizowano (8 mg p12/1 ml sepharose), nieukierunkowane w stosunku do aktywowanej NHS sepharose 4 FastFlow (Amersham Biosciences, Uppsala, Szwecja) i 3 kolumny napełniono odpowiednio 2 ml objętości kolumny. Eksperyment prowadzono równocześnie w 3 kolumnach. Przed wprowadzeniem próbki zbierano odpowiednio 1 ml buforu do równoważenia (20 mM hepes, 150 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2, pH 7,5), a następnie wstrzyknięto próbkę (S: endotoksyna z E. coli O55:B5 w buforze do równoważenia, 4,6 EU/ml) (I) i zbierano frakcje po 5 ml i 2 ml. Regenerację kolumny przeprowadzono przez dodanie 4 ml buforu do regeneracji (B: 20 mM hepes, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,005% NaDOC, pH 7,5). Stężenie endotoksyny mierzono w teście LAL (kinetycznie chromogeniczny test LAL, Charles-River Inc.). We wszystkich trzech eksperymentach można było całkowicie usunąć zanieczyszczenia endotoksyną, czyli stężenie endotoksyn w przepływie było poniżej poziomu wykrywalności (< 0,005 EU/ml).

Wynalazek objaśniają poniższe przykłady. Jeśli nie wskazano inaczej, stosowano standardowe metody biologii molekularnej, takie jak np. opisane w Sambrook i in., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

1. Naczynia szklane, naczynia z tworzyw sztucznych i bufory

Do usuwania endotoksyn, wszystkie naczynia szklane pozbawiano pirogenów przez ogrzewanie w 200°C (4 h) i stosowano wyłącznie wolne od pirogenów materiały z tworzyw sztucznych (np.

PL 209 568 B1 końcówki do pipet, płytki do mikromianowania). Inne urządzenia lub naczynia nieodporne na temperaturę traktowano 3% nadtlenkiem wodoru lub przemywano 1% deoksycholanem sodu, a następnie przemywano je wodą wolną od endotoksyn. Bufory sporządzano z zasadniczo wolnych od endotoksyn substancji buforowych (Sigma) i mieszano z wodą wolną od endotoksyn. Sole, takie jak np. NaCl, które mogą być ogrzewane do 200°C, ogrzewano (200°C, 4 h). Bufory stosowane do oczyszczania chromatograficznego odgazowywano i przesączano.

2. Wykrywanie endotoksyn za pomocą testu LAL

Testy kontrolne dla endotoksyny przeprowadzono jako chromogenny test LAL (test lizatu amebocytów Limulus, Limulus-Amoebocyte-Lysate test, Charles-River Endosafe, Charleston, USA) według instrukcji producenta. Aby oznaczyć stężenia stosowano wzorce endotoksyn (Charles-River Endosafe, Charleston, USA) w zakresie 0,005 - 50 lub 0,02 - 50 EU/ml. Pomiar absorpcji przy 405 nm wykonywano w czytniku płytek do mikromianowania z regulowaną temperaturą (Genios, Tecan GmbH).

3. Western-Blot do wykrywania p12

Wykrywanie p12 w supernatancie próbek traktowanych perełkami lub we frakcjach z chromatografii powinowactwa przeprowadzono metodą Western Blot. Białka częściowo wstępnie zatężano uprzednio przez strącanie NaDOC/TCA (deoksycholan sodu/tetrachlorooctan). W tym celu próbki rozdzielono elektroforetycznie na 12% żelach z SDS i przenoszono na membrany PVDF (Immobilon, Millipore). Membrany przemywano PBS przez 30 min, blokowano 5% mlekiem w proszku (1 h), a następnie inkubowano z poliklonalnym przeciwciałem anty-p12 (1 h, rozcieńczenie: 1:1000). Po inkubacji z drugorzędowym przeciwciałem (kozim przeciw IgG królika), koniugowanym z fosfatazą alkaliczną, próbki wywoływano za pomocą BCIP/NBT (fosforan 5-bromo-4-chloroindolilu/sól tetrazoliowa nitroblue).

4. Oczyszczanie endotoksyn

Oczyszczanie endotoksyn prowadzono jak podano w Galanos, C, Lϋderitz, O. & Westphal, O. 1969, Europ. J. Biochem. 9, 245-249.

P r z y k ł a d 5. Specyficzne sprzęganie p12 z immobilizowanymi grupami jodooctanowymi

Aby uzyskać ukierunkowane wiązanie p12 z powierzchnią, aminokwas serynę w pozycji 3 znacznika Strep-tag według SEQ ID NO:5 zastąpiono cysteiną jak w przykładzie 12 i białko immobilizowano za pomocą reszt jodooctanowych, które preferencyjnie wiążą wolne reszty sulfydrylowe. Otrzymany p12 nazwano p12S3C.

Wylano 1 ml Sulfolink Coupling Gel (Pierce), przemyto 6 ml 1% deoksycholanu sodu i równoważono 6 ml buforu do sprzęgania (50 mM tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,5). Następnie wstrzyknięto 1 ml p12S3C (=N-strepS3Cp12) (1 - 1,5 mg/ml w buforze do sprzęgania), kolumnę łagodnie wytrząsano przez 15 min, inkubowano przez kolejne 30 min bez wytrząsania w temperaturze pokojowej, ponownie wstrzyknięto 1 ml p12S3C i powtórzono etapy inkubacji. Takie przyłączanie pl2S3C powtórzono łącznie 4 razy, po czym kolumnę przemyto 6 ml buforu do sprzęgania. Odcieki zebrano i oznaczono stężenie p12S3C przez pomiar absorpcji przy 280 nm. Związało się 2,2 - 2,8 mg p12S3C na ml żelu. Następnie nadmiarowe reszty jodooctanu zablokowano przez inkubację (45 min) z 1 ml cysteiny (50 mM w 50 mM tris, 5 mM EDTA, pH 8,5). Po przemyciu kolumny 16 ml 1M NaCl i 16 ml 20 mM hepes, 150 mM NaCl pH 7,5, kolumna była gotowa do użycia.

Zdolność żelu do usuwania endotoksyn z roztworów białek zbadano za pomocą BSA (2 - 4 mg/ml), anhydrazy węglanowej (1 - 2 mg/ml) i lizozymu (3 - 4 mg/ml). Do roztworów BSA i lizozymu dodawano endotoksyny z E. coli O55:B5 (Charles-River Endosafe, Charleston, USA) lub E. coli HMS 174 (100 1000 EU/ml), podczas gdy anhydrazy węglanowej nie mieszano z dodatkową endotoksyną. Odpowiednio wprowadzano 0,5 ml roztworu białka do kolumny, inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i następnie kolumnę przemywano buforem. Białka zbierano we frakcjach i określano zawartość endotoksyn przed kolumną i po kolumnie za pomocą chromogennego testu LAL (CharlesRiver Endosafe, Charleston, USA). Dodatkowo określano odzysk białka przez pomiar absorpcji przy 280 nm. Możliwe było niemal całkowite usunięcie endotoksyn (93 - 99%) ze wszystkich trzech roztworów białka jak przedstawiono na fig. 2A. Dodatkowo możliwe było wyeluowanie w znacznym stopniu białek z kolumny (80 - 99%, fig. 2B). Na końcu kolumnę regenerowano 5 mM EDTA, 20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5. Aby wykluczyć zanieczyszczenia frakcji białka po przejściu przez kolumnę ze względu na oddzielający się p12, we frakcjach badano obecność p12 z użyciem techniki Western Blot. We frakcjach nie wykryto p12.

P r z y k ł a d 6. Niespecyficzne sprzęganie p12 z materiałem nośnikowym aktywowanym NHS

N-hydroksysukcynoimid (NHS) jest podstawiany w związkach przez reszty amin pierwszorzędowych, toteż jest stosowany do sprzęgania białek z powierzchniami. Aktywowane NHS kolumny sePL 209 568 B1 pharose (HiTrap aktywowana NHS HP, 1 ml, Amersham-Pharmacia-Biotech) przemywano najpierw 6 ml lodowatego 1 mM kwasu chlorowodorowego. Nastę pnie pompowano w obiegu 10 - 15 ml p12S3C (1,0 - 3,5 mg/ml) w 0,2 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3 przez kolumnę w temperaturze pokojowej (natężenie przepływu 0,8 ml/min). Po 60 minutach zbierano odciek we frakcjach i kolumnę przemyto 6 ml buforu. Z tych frakcji oddzielano NHS przez odsolenie roztworu w odsalającej kolumnie HiTrap (5 ml, Amersham-Pharmacia-Biotech), a następnie oznaczano zawartość p12 przez pomiar absorpcji przy 280 nm. 20 - 25 mg p12S3C związało się z kolumną. Po sprzęganiu kolumnę wielokrotnie przemyto zgodnie z instrukcją producenta, odpowiednio 6 ml buforu do blokowania (0,5 M etanoloamina, 0,5 M NaCl, pH 8,3) i buforu do przemywania (0,1 M octan, 0,5 M NaCl, pH 4,0). Następnie kolumnę równoważono 6 ml buforu roboczego (20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5 lub 20 mM tris, 150 mM NaCl, pH 8,5).

Usuwanie endotoksyn przez tę kolumnę badano z użyciem roztworu lizozymu (3 - 4 mg/ml w 20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5 lub 20 mM tris, 150 mM NaCl, pH 8,5). Do roztworów lizozymu dodawano endotoksyny z E. coli HMS 174 (~500 EU/ml). Wprowadzano 0,5 ml roztworu białka do kolumny, inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i następnie kolumnę przemywano buforem. Lizozym zbierano we frakcjach i zawartość endotoksyn oznaczano przed kolumną i po kolumnie za pomocą chromogennego testu LAL (Charles-River Endosafe, Charleston, USA). Dodatkowo oznaczano odzyskanie białka na podstawie pomiarów absorpcji przy 280 nm. Endotoksyny były usuwane z roztworu w stopniu do 85 - 90%, jak przedstawiono na fig. 3A, a 85 - 90% lizozymu eluowano ponownie z kolumny za pomocą buforu roboczego (fig. 3B). Kolumnę następnie przemywano 6 ml 5 mM EDTA, 20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5 i 6 ml 1 M NaCl. Aby wykluczyć zanieczyszczenia frakcji białka po przepuszczeniu przez kolumnę ze względu na oddzielanie się p12, frakcje badano z uż yciem techniki Western Blot na obecność p12. We frakcjach nie wykryto p12.

P r z y k ł a d 7. Ukierunkowane sprzęganie p12 z kolumną z aktywowanym NHS materiałem nośnikowym poprzez diaminoetan i jodooctan N-sukcynoimidylu (SIA) jako odstępnik

Aby osiągnąć ukierunkowane wiązanie z materiałem nośnikowym do chromatografii, dwufunkcyjny łącznik związano z powierzchnią aktywowaną NHS; ten łącznik umożliwił przyłączenie p12S3C poprzez jego wolne reszty cysteiny i reszty jodoacetylowe dwufunkcyjnego łącznika.

Aktywowane NHS kolumny sepharose (HiTrap aktywowana NHS HP, 1 ml AmershamPharmacia-Biotech) przemywano najpierw 6 ml lodowatego 1 mM kwasu chlorowodorowego, następnie wstrzyknięto 1 ml etylenodiaminy (10 mg/ml w 0,2 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3) i kolumnę inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu nadmiarowych grup NHS etanoloaminą (0,5 M etanoloaminą, 0,5 M NaCl, pH 8,3) i przemyciu kolumny (0,1 M octan, 0,5 M NaCl, pH 4,0), kolumnę równoważono 6 ml buforu boranowego (50 mM boran sodu, 150 mM NaCl, 5 mM

EDTA, pH 8,3). Następnie kolumnę przemywano obiegowo 10 ml jodooctanem N-sukcynoimidylu (SIA, Pierce, 200 μΐ SIA roztwór wyjściowy w 10 ml buforu boranowego; roztwór wyjściowy SIA: 1,4 mg SIA w 1 ml DMSO) przez 30 min. Kolumnę następnie przemyto 6 ml buforu boranowego i przez kolumnę przepuszczono p12S3C (1 mg/ml, 50 ml w buforze boranowym) przez 1 godzinę. Nadmiarowe reszty jodoacetylu zobojętniono 1 ml roztworu cysteiny (5 mM cysteiny w buforze boranowym, inkubacja w temperaturze pokojowej przez 15 min), przed równoważeniem kolumny buforem roboczym (20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5 lub 50 mM tris, 150 mM NaCl, pH 8,5). Reakcje sprzęgania z SIA przeprowadzono w ciemności.

Usuwanie endotoksyn w przypadku tej kolumny testowano za pomocą roztworów lizozymu (3 4 mg/ml w 20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5 lub 20 mM tris, 150 mM NaCl, pH 8,5). Do roztworów lizozymu dodawano endotoksyny z E. coli HMS 174 (~500 EU/ml). 0,5 ml roztworu białka wprowadzano do kolumny, inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i następnie kolumnę przemywano buforem. Lizozym zebrano we frakcjach i oznaczano zawartość endotoksyn przed kolumną i po kolumnie za pomocą chromogennego testu LAL (Charles-River Endosafe, Charleston, USA). Dodatkowo oznaczano odzyskanie białka przez pomiar absorpcji przy 280 nm. Do 90% endotoksyny było usuwane z roztworu, jak przedstawiono na fig. 3A, a 75 - 85% lizozymu eluowano ponownie z kolumny za pomocą buforu użytkowego (fig. 3B). Kolumnę następnie przemywano 6 ml 5 mM EDTA, 20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5 i 6 ml 1 M NaCl. Aby wykluczyć zanieczyszczenia frakcji białka po przepuszczeniu przez kolumnę ze względu na oddzielanie się p12, frakcje testowano metodą Western Blot na obecność p12. We frakcjach nie wykryto p12.

P r z y k ł a d 8. Usuwanie endotoksyn z roztworu BSA w metodzie przepływowej

PL 209 568 B1

Aktywowaną NHS HiTrap sepharose (Amersham Biosciences, Uppsala Szwecja) sprzęgano według zaleceń producenta niespecyficznie poprzez pierwszorzędowe grupy aminowe z p12. W ten sposób kowalencyjnie unieruchomiono 8 mg p12/ml materiału żelu. Tak przygotowaną 1 ml kolumnę chromatograficzną równoważono z natężeniem przepływu 1 ml/min 10 ml buforu A (20 mM hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2). Następnie wprowadzano 4 ml roztworu BSA (11,5 mg BSA (Carl Roth GmbH, Niemcy)/ml buforu A (iniekcja: I) i zebrano odciek (E) we frakcjach 2,5 ml. Kolumnę następnie przemywano 15 ml buforu A i endotoksynę związaną z kolumną eluowano 7 ml buforu B (20 mM hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA). W czasie przemywania i elucji zbierano odpowiednio frakcje po 2 ml. Po każdym eksperymencie kolumnę regenerowano 20 ml buforu C (20 mM hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,1% deoksycholan sodu). Mierzono stężenie endotoksyn przez oznaczania chromogennego lizatu amebocytów Limulus (LAL) (Charles-River Endosafe, Charleston, USA) według specyfikacji producenta. Stężenie białka oznaczano przez pomiar absorpcji w UV. Wydajność usuwania endotoksyny wynosiła mię dzy 95 - 99%, a straty białka wynosiły około 6 - 10%.

P r z y k ł a d 9. Usuwanie mał ych iloś ci endotoksyny z buforu za pomocą niespecyficznie przyłączonego p12 ml NHS-aktywowanej sepharose 4 FastFlow (Amersham Biosciences) przemywano najpierw lodowatym kwasem chlorowodorowym, a następnie inkubowano z 292 mg p12 (7 mg/ml w 25 mM cytrynianie pH 7,0) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej w trakcie mieszania. Następnie sepharose przepłukano 7 x 80 ml 5 mM cytrynianem pH 2,0 i odpowiednio 1 ml frakcje z przemywania dializowano wobec 5 mM cytrynianu pH 2,0. Te dializaty stosowano do oznaczenia ilości nadmiarowego p12 we frakcjach z przemywania przez pomiar absorpcji przy 280 nm. Stwierdzono gęstość obciążenia 8,7 mg p12 na 1 ml sepharose. Nieprzereagowane reszty NHS zobojętniono przez 12 godzinną inkubację sepharose z 1M tris pH 8,0. Kolumny o objętości 2 ml napełniono tym materiałem i to przechowywano aż do użycia w 4°C w 20% etanolu.

W 3 równoległ ych testach odpowiednio 4 ml roztworu endotoksyny (S) wprowadzano do kolumny (patrz fig. 9). Roztwór endotoksyny zawierał endotoksynę z E. coli O55:B5 (Charles-River Endosafe, Charleston, USA) w buforze do równoważenia (20 mM hepes, 150 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2, pH 7,5). Stężenie endotoksyny w tym roztworze wynosiło 4,6 EU/ml.

Kolumnę przemywano najpierw 12 ml buforu do regeneracji (20 mM hepes, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7,5) i nastę pnie 12 ml buforu do równoważ enia. Nastę pnie ponownie do kolumny wprowadzono bufor do równoważenia i zbierano frakcje 1 ml.

Roztwór endotoksyny wprowadzano do kolumny (I) i zbierano frakcje po 5 ml i 2 ml. Następnie kolumnę regenerowano 4 ml buforu do regeneracji (B). We frakcjach z odcieku nie wykryto endotoksyn, czyli możliwe było całkowite usunięcie zanieczyszczeń endotoksyną we wszystkich trzech doświadczeniach.

P r z y k ł a d 10. Niespecyficzne przyłączenie biotynylowanego p12 do magnetycznych pereł ek ze streptawidyną p12 (3 mg/ml w PBS, 0,05% Tween 20) inkubowano z sulfo-NHS-LC-LC-biotyną (Pierce) w stosunku 1:10 do 1:20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie dializowano wobec buforu (np. PBS lub 20 mM hepes, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,5). W ten sposób aktywowana NHS biotyna wiąże się do pierwszorzędowych grup aminowych w p12. Następnie dodawano 50 μΐ biotynylowanego p12 (1 mg/ml) do 1 ml perełek streptawidyny (perełki streptawidyny MagPrep, Merck), mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godz., po czym nadmiarowy p12 usuwano przez przemywanie cztery razy 1,5 ml 20 mM tris, 10 mM EDTA, pH 7,5.

Usuwanie endotoksyn badano z użyciem buforu (20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5) i roztworów białka (0,1 mg/ml BSA, 0,1 mg/ml lizozym, 0,1 mg/ml anhydrazy węglanowej w 20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5). Do buforu i roztworu BSA i lizozymu dodawano 5 EU/ml (endotoksyny z E. coli O55:B5, Charles-River Endosafe, Charleston, USA). Roztwór anhydrazy węglanowej zawierał około 1 EU/ml. 25 μl perełek magnetycznych z immobilizowanym p12 dodawano do 200 μl buforu lub roztworu białka, mieszano przez zasysanie i wypuszczanie z pipety, po czym inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Perełki usuwano z roztworu za pomocą magnesu, pozostałość odpipetowywano. Zawartość endotoksyny w próbkach nietraktowanych i próbkach inkubowanych z perełkami oznaczano następnie w teście LAL, a odzyskiwanie białka oznaczano przez pomiar absorpcji przy 280 nm. Endotoksyna była nieomal całkowicie usunięta z buforu (usunięcie 99,9% endotoksyny,

PL 209 568 B1 fig. 4A), a ponadto endotoksyna była także usuwana z roztworu białka w 70 - 92% (fig. 4B). Odzysk białka wynosił 57 - 99% (BSA: 87%, anhydraza węglanowa: 99%, lizozym: 57%; fig. 4B).

P r z y k ł a d 11. Niespecyficzne przyłączanie biotynylowanego p12 do immobilizowanej streptawidyny p12 (3 mg/ml w PBS, 0,05% Tween20) inkubowano z sulfo-NHS-LC-LC-biotyną (Pierce), w stosunku 1:10 do 1:20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie dializowano wobec buforu (np. PBS lub 20 mM hepes, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,5). Aktywowana NHS biotyna wiąże się z pierwszorzędowymi grupami aminowymi w p12. Biotynylowany p12 następnie inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej z materiałem chromatograficznym obciążonym streptawidyną (ImmunoPure immobilizowana streptawidyna: 6% usieciowane perełki z agarozy) i nadmiar p12 usuwano przez przemywanie PBS.

Usuwanie endotoksyny testowano z użyciem buforu (20 mM tris, 150 mM NaCl, pH 8,0) i BSA (0,5 mg/ml w 20 mM tris, 150 mM NaCl, pH 8,0). Odpowiednio do 1 ml buforu lub roztworu BSA dodawano 10 EU/ml, dodawano 50 μΐ p12 agarozy, i wytrząsano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie p12-agarozę odwirowywano i mierzono stężenie endotoksyn i białka w pozostałości. Możliwe było usunięcie 99% z buforu i 86% z roztworu BSA (fig. 5). Odzyskiwano do 90% BSA.

P r z y k ł a d 12. Badanie wiązania p12-endotoksyny przez pomiary metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Wiązanie p12 do endotoksyn lub do bakterii poprzez liposacharydy w zewnętrznej błonie komórkowej badano przez pomiar metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (Biacore J). Aby oznaczyć stałą dysocjacji (Kd), endotoksynę z E. coli O55:B5 (Sigma) immobilizowano na hydrofobowym czipie HPA według zaleceń producenta i wstrzykiwano p12 w różnych stężeniach (fig. 6A). Wiązanie mierzono we względnych „jednostkach odpowiedzi” (RU), wartości równowagi wykreślono w funkcji stężenia związanego p12 (fig. 6B). Przez przystosowanie izoterm adsorpcji Langmuira do tych danych (RU = (RUmax* [p12])/([p12]+Kd) określono wartość Kd (tabela 1). Do pomiarów stosowano bufory wolne od endotoksyny. Wartości Kd w zakresie 10^-7 - 10^-9 M oznaczono dla wartości pH między 6 i 10 (tabela 1). Wiązanie ponownie rozrywano przez wstrzyknięcie 1 lub 5 mM EDTA i czip regenerowano.

T a b e l a 1. Stałe dysocjacji endotoksyny na p12 w zależności od wartości pH roztworu

pH	Kd
6,00	3,09E-07
7,50	6,85E-08
8,00	5,86E-08
8,50	7,86E-08
9,00	3,29E-08
10,00	1,55E-07

Aby zbadać wiązanie bakterii z p12, biotynylowany p12 immobilizowano na czipach ze streptawidyną i wstrzykiwano różne szczepy E. coli. Do pomiarów bakterie stosowano w zawiesinie w PBS. Stosowano szczepy E. coli mające lipopolisacharydy z różnymi składnikami polisacharydowymi. Część polisacharydowa zawiera region „rdzenia”, który jest usieciowany z lipidem A i z tak zwanym antygenem O. Antygen O zmienia się bardzo znacznie wśród różnych typów bakterii, a także szczepów bakterii, podczas gdy region „rdzenia” jest wysoce konserwatywny. Szczepy, które mają region „rdzenia” i antygen O (np. E. coli), i szczepy, które mają kompletny region „rdzenia” (E. coli D21), były wiązane przez p12, podczas gdy szczepy ze znacznie skróconym regionem „rdzenia” (np. E. coli D21f2) nie były już wykrywane przez p12 (fig. 6C). Wiązanie można było ponownie rozrywać za pomocą EDTA (5 mM) i można było zregenerować czip.

P r z y k ł a d 13. Zrekombinowane konstrukty p12

1. Konstrukcja p12 z N-końcowym znacznikiem Strep-tag (N-strep-p12): metodą PCR wprowadzono sekwencję nukleotydów znacznika Strep-tag (US 5506121) na koniec 5' genu T4p12. Skonstruowano starter w tym celu dla końca 5' genu p12 (5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-31

PL 209 568 B1 (SEQ ID NO: 1), który zawiera sekwencję nukleotydów znacznika Strep-tag na swoim końcu 5' (kursywa w sekwencji) i ma miejsce cięcia dla enzymu restrykcyjnego (Ndel, podkreślone w sekwencji) tak, że gen w prawej ramce odczytu może być wstawiony do plazmidu ekspresyjnego. Dla końca 3' genu p12, skonstruowano starter, który wprowadza, za genem p12 miejsce restrykcyjne BamH I (kursywą w sekwencji) (5'-ACG CGC AAA GCT TGT CGA CGG ATC CTA TCA TTC TTT TAC CTT AAT TAT GTA GTT-3'), (SEQ ID NO: 2). PCR prowadzono z 40 cyklami (1 min 95°C, 1 min 45°C i 1 min 72°C). Produkt PCR trawiono endonukleazami restrykcyjnymi Ndel i BamHI i pożądany fragment wstawiono po rozdziale pod względem wielkości na żelu agarozowym i elucji z żelu w miejsce Ndel i BamHI plazmidu ekspresyjnego pET21a. Sekwencję genu N-strep-p12 sprawdzono pod względem poprawności przez sekwencjonowanie DNA. Dalsze etapy dla plazmidu pNS-T4p12p57 przeprowadzono jak opisano w Burda, M.R. & Miller, S. (Eur J Biochem. 1999 265 (2), 771-778) dla T4p12p57. Plazmid pNS-T4p12p57 następnie transformowano do szczepu ekspresyjnego BL21(DE3).

2. Wstawianie reszty N-końcowej cysteiny w N-strep-p12 (N-strep-S3C-p12 i N-strep-S14Cp12): wystawienie reszty N-końcowej cysteiny przeprowadzono jak opisano w 1, w tym celu skonstruowano dwa nowe startery dla końca 5'. Stosowano do N-strep-S3C-p12, starter 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT TGT TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEQ ID NO: 3), stosowano do N-strep-S14C-p12, starter 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC TGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEQ ID NO: 4).

3. Oczyszczanie białka N-strep-p12: szczep E. coli BL21(DE3) z plazmidem pNS-T4p12p57 hodowano w hodowlach w 2 litrowej wytrząsarce (podłoże LB z ampicyliną 100 μg/ml) do OD600 0,5 0,7 w 37°C i indukowano ekspresję białka N-strep-p12 przez dodatek 1 mM IPTG (izopropylo-βtiogalaktopiranozyd). Po inkubacji w 37°C przez 4 h komórki zebrano. Zebrane komórki z 10 litrowych hodowli przeprowadzono w stan zawiesiny w 50 ml fosforanu sodu, 20 mM pH 7,2, 2 mM MgSO4, 0,1 M NaCl, rozbijano w prasie Frencha (138 MPa, 20000 funtów/cal²) trzy razy i następnie odwirowano przez 30 min przy 15000 obr/min (SS34). Po przemywaniu dwukrotnie tym samym buforem, białko N-strep-p12 ekstrahowano z osadu przez wytrząsanie trzy razy przez 30 min w 40 mM tris^HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, partię wirowano przez 30 min przy 15000 obr/min (SS34) i rozpuszczony NS-p12 w supernatancie przechowywano w 4°C. Ekstrakcję powtarzano dwukrotnie i połączone pozostałości wprowadzono (IBA GmbH Gottingen) do kolumny powinowactwa Streptactin (15 ml) równoważonej buforem „W” (100 mM tris HCl pH 8, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl). Po przemywaniu 5 objętościami kolumny buforu „W”, przeprowadzano elucję trzema objętościami buforu „W” z 2,5 mM detiobiotyną w buforze „W”. Po wielokrotnej dializie wobec buforu „W” i zatężeniu, oznaczono stężenie i czystość N-strep-T4p12 metodami SDS-PAGE i spektroskopii UV (Burda i in., 1999). Z 10 litrów hodowli oczyszczono w ten sposób około 100 mg N-strep-T4p12.

Nazwa	Sekwencja znacznika
Nstrep-p12	MASWSHPQFEKGAS	SEQ ID NO: 5
Nstrep-p12-S3C	MACWSHPQFEKGAS	SEQ ID NO: 6
Nstrep-p12-S14C	MASWSHPQFEKGAC	SEQ ID NO: 7

PL 209 568 B1

WYKAZ SEKWENCJI <110? PROPOS AG <12 0> Sposób wykrywania endotoksyn i sposób usuwania endotoksyn <130 PRO-008PCT <140? nieznane <141? 2003-06-24 <150? 102 28 133.5 <151? 2002-06-24 <150? 103 07 793.6 <151? 2003-02-24 <160? 8 <170> patentln wersja 3.1 <210? 1 <211? 78 <212? DNA.

<213? Sekwencja sztuczna <400? 1 gaaggaacta gtcatatggc tagctggagc cacccgcagt tegaaaaagg cgccagtaat 60 aatacatatc aacacgtt 78 <210? 2 <211? 54 <212? DNA <213? Sekwencja sztuczna <400? 2 acgcgcaaag cttgtcgacg gatcctatca ttcttttacc ttaattatgt agtt 54 <210? 3 <211? 78 <212? DNA <213? Sekwencja sztuczna <400? 3 gaaggaacta gtcatatggc ttgttggagc cacccgcagt tegaaaaagg cgccagtaat aatacatatc aacacgtt <210? 4 <211? 78 <212? DNA <213? Sekwencja sztuczna <400? 4 gaaggaacta gtcatatggc tagctggagc cacccgcagt tegaaaaagg cgcctgtaat 60 aatacatatc aacacgtt ⁷⁸

PL 209 568 B1 <210> 5 <21Ϊ> 19 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <400> 5

Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gin Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn 15 10 15

Thr Tyr Gin <2l0> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <400> 6

Met Ala Cys Trp Ser His Pro Gin Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn 15 10 15

Thr Tyr Gin <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <400> 7

Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gin Phe Glu Lys Gly Ala Cys Asn Asn 15 10 15

Thr Tyr Gin <210> 8 <211> 539 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <400> 8

Met 1

Ala

Ser

Trp

Ser 5

His

Pro

Gin

Phe

Glu 10

Lys

Gly

Ala

Ser

Asn 15

Asn

Thr

Tyr

Gin

His 20

Val

Ser

Asn

Glu

Ser 25

Arg

Tyr

Val

Lys

Phe 30

Asp

Pro

Thr

Asp

Thr 35

Asn

Phe

Pro

Pro

Glu 40

Ile

Thr

Asp

Val

Gin 45

Ala

Ala

Ile

Ala

Ala 50

Ile

Ser

Pro

Ala

Gly 55

Val

Asn

Gly

Val

Pro SO

Asp

Ala

Ser

Ser

Thr 65

Thr

Lys

Gly

Ile

Leu 70

Phe

Leu

Ala

Thr

Glu 75

Gin

Glu

Val

Ile

Asp 80

Gly

Thr

Asn

Asn

Thr 85

Lys

Ala

Val

Thr

Pro 90

Ala

Thr

Leu

Ala

Thr 95

Arg

PL 209 568 B1

Leu Ser Tyr Pro Asn Ala Thr Glu Ala Val Tyr Gly Leu Thr Arg Tyr

	100	105	110
Ser Thr	Asp Asp Glu Ala 115	Ile Ala Gly Val 120	Asn Asn Glu Ser Ser Ile 125
Thr Pro 13 0	Ala Lys Phe Thr	Val Ala Leu Asn 135	Asn Val Phe Glu Thr Arg 140
Val Ser 145	Thr Glu Ser Ser 150	Asn Gly Val Ile	Lys Ile Ser Ser Leu Pro 155 160
Gin Ala	Leu'Ala Gly Ala 165	Asp Asp Thr Thr 170	Ala Met Thr Pro Leu Lys 175
Thr Gin	Gin Leu Ala Val ISO	Lys Leu Ile Ala 185	Gin Ile Ala Pro ser Lys 190
Asn Ala	Ala Thr Glu Ser 195	Glu Gin Gly Val 200	Ile Gin Leu Ala Thr Val 205
Ala Gin 210	Ala Arg Gin Gly	Thr Leu Arg Glu 215	Gly Tyr Ala Ile Ser Pro 220
Tyr Thr 225	Phe Met Asn Ser 230	Thr Ala Thr Glu	Glu Tyr Lys Gly Val Ile 235 240
Lys Leu	Gly Thr Gin Ser 245	Glu Val Asn Ser 250	Asn Asn Ala Ser Val Ala 255
Val Thr	Gly Ala Thr Leu 260	Asn Gly Arg Gly 265	Ser Thr Thr Ser Met Arg 270 '
Gly Val	Val Lys Leu Thr 275	Thr Thr Ala Gly 280	Ser Gin Ser Gly Gly Asp 285
Ala Ser 290	Ser Ala Leu Ala	Trp Asn Ala Asp 295 '	Val Ile His Gin Arg Gly 300
Gly Gin 305	Thr Ile Asn Gly 310	Thr Leu Arg Ile	Asn Asn Thr Leu Thr Ile 315 320
Ala Ser	Gly Gly Ala Asn 325	Ile Thr Gly Thr 330	Val Asn Met Thr Gly Gly 335
Tyr Ile	Gin Gly Lys Arg 340	Val Val Thr Gin 345	Asn Glu Ile Asp Arg Thr 350
Ile Pro	Val Gly Ala Ile 355	Met Met Trp Ala 360	Ala Asp Ser Leu Pro Ser 365
Asp Ala 370	Trp Arg Phe Cys	His Gly Gly Thr 375	Val Ser Ala Ser Asp Cys 380
Pro Leu 385	Tyr Ala Ser Arg 390	Ile Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Ser Ser Ser 395 ' 400
Asn Pro	Gly Leu Pro Asp 405	Met Arg Gly Leu 410	Phe Val Arg Gly Ser Gly 415
Arg Gly	Ser His Leu Thr 420	Asn Pro Asn Val • 425	Asn Gly Asn Asp Gin Phe 430
Gly Lys	Pro Arg Leu Gly	Val Gly Cys Thr	Gly Gly Tyr Val Gly Glu

PL 209 568 B1

	435	440	445
Val	Gin Lys Gin Gin Met	Ser Tyr His	Lys His Ala Gly Gly Phe Gly
	450	455	460
Glu	Tyr Asp Asp Ser Gly	Ala Phe Gly	Asn Thr Arg Arg Ser Asn Phe
465	470		475 480
Val	Gly Thr Arg Lys Gly	Leu Asp Trp	Asp Asn Arg Ser Tyr Phe Thr
	485		490 495
Asn	Asp Gly Tyr Glu Ile	Asp Pro Ala	Ser Gin Arg Asn Ser Arg Tyr
	500	505	510
Thr	Leu Asn Arg Pro Glu	Leu Ile Gly	Asn Glu Thr Arg Pro Trp Asn
	515	520	525
Ile	Ser Leu Asn Tyr Ile	Ile Lys Val	Lys Glu
	530	535

Zastrzeżenia patentowe

Claims (17)

1. Sposób wykrywania endotoksyn, znamienny tym, ż e obejmuje etapy, w których:

a) inkubuje się próbkę z białkiem bakteriofaga wiążącym region rdzeniowy endotoksyny, korzystnie z białkiem p12,

b) wykrywa się endotoksynę związaną z białkami bakteriofaga w obecności dwuwartościowych kationów, przy czym stężenie Ca²+ podczas inkubacji jest w zakresie od 0,1 pM do 10 mM i/lub stężenie Mg²+ podczas inkubacji jest w zakresie od 0,1 pM do 10 mM.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ewentualnie obejmuje ponadto po etapie a) i przed etapem b) dodatkowy etap, w którym a') wydziela się kompleks białka bakteriofaga z endotoksyną z próbki.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wykrywanie przeprowadza się metodami spektroskopowymi.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że znakowaną endoksynę usuwa się z wiązania z białkiem bakteriofaga, a następnie wykrywa się znakowaną endotoksynę.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że białko bakteriofaga ma znacznik Strep-tag lub His-tag.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że znacznik ma sekwencję aminokwasów według SEQ ID NO: 5, 6 lub 7.

7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że jako białko bakteriofaga stosuje się białko p12 faga T4.

8. Sposób usuwania endotoksyn z próbki, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:

a) inkubuje się próbkę z białkami bakteriofaga wiążącymi region rdzeniowy endotoksyny, korzystnie z białkiem p12, które są immobilizowane na trwałym nośniku, w sposób niespecyficzny lub ukierunkowany, przy czym stężenie Ca²+ podczas inkubacji jest w zakresie od 0,1 pM do 10 mM i/lub stężenie Mg²+ podczas inkubacji jest w zakresie od 0,1 pM do 10 mM,

b) wydziela się kompleks białka bakteriofaga z endotoksyną z próbki.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że etapy a) i b) prowadzi się sposobem przepływowym w kolumnie chromatograficznej.

10. Sposób według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że trwały nośnik stanowi ośrodek filtracyjny, cząstki szkła, cząstki magnetyczne, materiały do wirowania, materiały do sedymentacji lub materiały do wypełniania kolumn do chromatografii.

11. Sposób według zastrz. 8 albo 9, albo 10, znamienny tym, że białka bakteriofaga są immobilizowane na trwałym nośniku poprzez grupy sprzęgające.

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że grupę sprzęgającą stanowi lektyna, receptor lub antykalina.

PL 209 568 B1

13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że grupę sprzęgającą stanowi streptawidyna lub awidyna, a białka bakteriofaga są sprzęgnięte z biotyną lub znacznikiem Strep-tag.

14. Sposób według zastrz. 8 albo 9, albo 10, znamienny tym, że białka bakteriofaga są immobilizowane na trwałych nośnikach kowalencyjnie za pomocą wiązań chemicznych.

15. Sposób według zastrz. 8 albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, znamienny tym, że białko bakteriofaga ma znacznik Strep-tag lub His-tag.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że znacznik ma sekwencję aminokwasów według SEQ ID NO: 5, 6 lub 7.

17. Sposób według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że jako białko bakteriofaga stosuje się białko p12 faga T4.