PL209710B1 - Sposób wykrywania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) - Google Patents

Abstract

Dostarczono test antygen HCV/przeciwciało/antygen. Test wykorzystuje izolowany pierwszy antygen z regionu HCV poliproteiny i antygen fuzyjny złożonego epitopu HCV, który zawiera epitop z tego samego regionu poliproteiny co pierwszy antygen. Zarówno pierwszy antygen jak i antygen fuzyjny złożonego epitopu HCV wiążą przeciwciała obecne w próbce zakażonej HCV.

Description

Dziedzina techniki

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV). Niniejszy wynalazek należy do dziedziny diagnostyki wirusowej, a szczególności, diagnostyki mającej na celu dokładne zdiagnozowanie infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C. Wynalazek omawia testy warstwowe antygen/przeciwciało/antygen, w których stosuje się wyizolowany antygen pochodzący z regionu poliproteiny wirusa zapalenia wątroby typu C i wieloepitopowy antygen fuzyjny, zawierający wiele epitopów poliproteiny HCV, które to epitopy zawierają jeden lub więcej epitopów z tego samego regionu poliproteiny, co pierwszy antygen.

Stan techniki

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest główną przyczyną pozajelitowego nie-A, i nie-B (NANBH) zapalenia wątroby, które jest przenoszone przeważnie przez transfuzję krwi i kontakt seksualny. Wirus jest obecny u 0,4 do 2% dawców krwi. W około 50% infekcji rozwija się w przewlekłe zapalenie wątroby, a z tych, w przybliżeniu u 20% zarażonych osobników rozwija się marskość wątroby, co czasami prowadzi do raka wątrobowo-komórkowego. Zgodnie z powyższym, badanie i kontrolowanie choroby jest ważne z medycznego punktu widzenia.

HCV został zidentyfikowany i scharakteryzowany jako przyczyna NANBH po raz pierwszy przez Houghtona i wsp. Odkąd poznano metody otrzymywania sekwencji znana jest sekwencja genomu wirusa HCV. Patrz, np., Publikacja Międzynarodowa nr WO 89/04669; WO 90/11089; i WO 90/14436. HCV ma pozytywny jednoniciowy-sensowny genom RNA HCV, który ma 9,5 kb i należy do rodziny wirusów Flaviridae. W oparciu o filogenetyczne analizy zidentyfikowano co najmniej sześć odrębnych, lecz spokrewnionych genotypów HCV (Simmonds i wsp., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). Wirus koduje pojedynczą poliproteinę zawierającą więcej niż 3000 reszt aminokwasowych (Choo i wsp., Science (1989) 244:359-362; Choo i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 2451-2455; Han i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88: 1711-1715). Poliproteina jest obrabiana w procesie translacji jak i post-translacyjnie, w białka zarówno strukturalne jak i niestrukturalne (NS).

W szczególności, jak pokazano na Fig. 1, kilka białek jest kodowanych przez genom HCV. Kolejność i nomenklatura produktów cięcia poliproteiny HCV jest następująca: NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Początkowe cięcie poliproteiny jest katalizowane przez proteazy gospodarza, które uwalniają trzy białka strukturalne, białko N-końca nukleokapsydu (zwanego „rdzeniem") i dwie otoczki glikoprotein, AE1" (również znana jako E) i AE2" (również znana jako E2/NS1), jak również niestrukturalne (NS) białka, które zawierają enzymy wirusowe. Regiony NS są nazywane: NS2, NS3, NS4 i NS5. NS2 jest integralnym białkiem błonowym o aktywności proteolitycznej i w kombinacji z NS3 rozcina predysponowane do cięcia wiązanie NS2-NS3, co z kolei tworzy N-koniec NS3 i uwalnia wielką poliproteinę, która zawiera aktywności zarówno proteazy seryny jak i helikazy RNA. Proteaza NS3 służy do obróbki pozostałej poliproteiny. W tych reakcjach NS3 uwalnia kofaktor NS3 (NS4a), dwa białka (NS4b i NS5a) i polimerazę RNA zależną od RNA (NS5b). Ukończenie dojrzewania poliproteiny jest zapoczątkowane autokatalitycznym cięciem połączenia NS3-NS4a, katalizowanym przez proteazę seryny NS3.

Opisano wiele ogólnych i specyficznych polipeptydów użytecznych jako immunologiczne i diagnostyczne odczynniki na HCV, pochodzące z poliproteiny HCV. Patrz np., Houghton i wsp., European Publication nr nr 318,216 i 388,232; Choo i wsp., Science (1989) 244:359-362; Kuo i wsp., Science (1989) 244:362-364; Houghton i wsp., Hepatology (1991) 14:381-388; Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien i wsp., International Publication nr WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publication nr WO 94/01778. Te publikacje dostarczają ogólnie rozległych podstaw o HCV, jak również o wytwarzaniu i stosowaniu polipeptydowych odczynników immunologicznych na HCV.

Czułe, specyficzne metody skriningu i identyfikowania nosicieli HCV i krwi zakażonej HCV czy produktów krwi zakażonych HCV, stanowiłyby ważny postęp w medycynie. Potransfuzyjne zapalenie wątroby (PTH) pojawia się w przybliżeniu u 10% pacjentów po transfuzji krwi i HCV dochodzi do 90% w tych przypadkach. Opieka nad pacjentem, jak również zapobieganie i przekazywanie HCV przez krew i produkty krwi czy bliskie kontakty osobiste wymagają niezawodnych narzędzi do diagnostyki i prognozowania. Zgodnie z powyższym opracowano kilka testów diagnostyki serologicznej infekcji HCV. Patrz np., Choo i wsp., Science (1989) 244:359-362; Kuo i wsp., Science (1989) 244:362:354; Choo i wsp., Br. Med. Bull. (1990) 46:423-441; Ebeling i wsp., Lancet (1990) 335:982-983; van der

PL 209 710 B1

Poel i wsp., Lancet (1990) 335:558-560; van der Poel i wsp., Lancet (1991) 337:317-319; Chien, D. Y., International Publication nr WO 94/01778; Valenzuela i wsp., International Publication nr WO 97/44469; i Kashiwakuma i wsp., U.S. Patent nr 5 871 904.

Istotnym problemem, jaki napotkano w niektórych testach opartych na badaniu surowicy, jest znacząca przerwa pomiędzy zainfekowaniem a wykryciem wirusa, często przekraczająca 80 dni. Ta przerwa stwarza wielkie zagrożenie dla biorców krwi podczas transfuzji. Żeby pokonać ten problem, opracowano testy oparte na kwasie nukleinowym (NAT), które wykrywają bezpośrednio wirusowe RNA i testy antygenu rdzenia HCV, które badają wirusowy antygen zamiast odpowiedzi przeciwciała. Patrz np., Kashiwakuma i wsp., U.S.Patent nr 5 871 904; Beld i wsp., Transfusion (2000) 40:575-579.

Jednakże, ciągle pozostaje potrzeba czułych, dokładnych narzędzi do diagnostyki i prognozowania, w celu zapewnienia właściwej opieki nad pacjentem, jak również, żeby zapobiec przekazaniu HCV poprzez krew, produkty krwi czy przez bliski kontakt osobisty.

Podsumowanie wynalazku

Niniejszy wynalazek jest oparty częściowo na odkryciu, że użycie pierwszego antygenu pochodzącego z poliproteiny HCV, w połączeniu z wieloepitopowym antygenem fuzyjnym, który zawiera epitop pochodzący z tego samego regionu poliproteiny HCV, co pierwszy antygen i może dostarczyć czułej i niezawodnej metody wykrywania HCV.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wykrywania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w biologicznej próbce, który obejmuje następujące etapy:

(a) dostarczenie stałego podłoża immunotestu zawierającego związane z nim antygeny HCV, przy czym te antygeny HCV składają się z jednego lub więcej antygenów NS 3/4a HCV przy czym co najmniej jeden z antygenów NS3/4a zawiera epitop konformacyjny o sekwencji aminokwasów 2-686 z SEQ ID nr 2;

(b) łączenie biologicznej próbki z wymienionym podłożem stałym w warunkach, które pozwalają przeciwciałom HCV, jeśli są obecne w biologicznej próbce, związać się z jednym lub więcej antygenami NS3/4a;

(c) dodanie do podłoża stałego z punktu (b), w warunkach tworzenia kompleksu, wykrywalnego znakowanego wieloepitopowego antygenu fuzyjnego (MEFA), przy czym znakowany MEFA zawiera co najmniej jeden epitop z regionu NS3/4a HCV i sekwencję konsensusową z hiperzmiennego regionu E2 dla aminokwasów 390-410 genomu HCV typu 1 o sekwencji SEQ ID nr 7, przy czym wspomniany MEFA wiąże wspomniane przeciwciało HCV;

(d) wykrycie kompleksów wytworzonych pomiędzy wymienionym przeciwciałem HCV i antygenem NS3/4a i MEFA jeśli jest jakiś, jako wykazanie infekcji HCV w biologicznej próbce.

W korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku co najmniej jeden z NS3/4a składa się z sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 2.

W innej korzystnej postaci wynalazku, MEFA zawiera epitop z regionu proteazy NS3/4a poliproteiny HCV.

W kolejnej korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku MEFA zawiera epitop z regionu helikazy NS3/4a poliproteiny HCV. Jeszcze bardziej w korzystnym wykonaniu, MEFA zawiera aminokwasy 1193-1657, numerowane odpowiednio do sekwencji HCV-1.

W innej korzystnej postaci sposobu według wynalazku MEFA zawiera epitop z regionu c33c poliproteiny HCV. Bardziej korzystnie, MEFA zawiera aminokwasy 1211-1457, numerowane odpowiednio do HCV-1, lub ewentualnie MEFA zawiera aminokwasy 1192-1457, numerowane odpowiednio do HCV-1.

W następnej korzystnej postaci wynalazku MEFA zawiera epitop z regionu 5-1-1 poliproteiny HCV, bardziej korzystnie MEFA zawiera aminokwasy 1689-1735, numerowane odpowiednio do HCV-1.

W kolejnej korzystnej postaci sposobu według wynalazku MEFA zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID nr:4, lub również korzystnie MEFA zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID nr:6.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wykrywania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w biologicznej próbce, polegający na przeprowadzeniu następujących etapów:

(a) dostarczenie stałego podłoża testu immunologicznego zawierającego antygeny HCV z nim związane, przy czym antygeny HCV składają się z jednego lub więcej wieloepitopowych antygenów fuzyjnych (MEFAs), przy czym te MEFAs zawierają co najmniej jeden epitop z regionu NS3/4a i sekwencję konsensusową z hiperzmiennego regionu E2 dla aminokwasów 390-410 genomu HCV typu 1 o sekwencji SEQ ID nr: 7;

PL 209 710 B1 (b) wiązanie biologicznej próbki z wymienionym podłożem stałym w warunkach, które pozwalają przeciwciałom HCV, jeśli są obecne w biologicznej próbce, związać się z jednym lub więcej wymienionym MEFAs;

(c) dodanie do podłoża stałego z punktu (b), w warunkach tworzenia kompleksu, wykrywalnego, znakowanego, izolowanego antygenu NS3/4a HCV zawierającego epitop konformacyjny, przy czym ten wykrywalny znakowany antygen NS3/4a wiąże wspomniane związane przeciwciało HCV i ponadto wspomniany antygen NS3/4a zawiera aminokwasy 2-686 o sekwencji SEQ ID nr 2;

(d) wykrycie kompleksów tworzonych pomiędzy przeciwciałem HCV i wykrywalnym znakowanym antygenem NS3/4a i MEFA, jeśli są obecne, jako wykazanie infekcji HCV w biologicznej próbce.

W korzystnym wykonaniu tego sposobu wykrywalny znakowany antygen NS3/4a skł ada się z wykrywalnego znacznika i sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:2.

W korzystnej postaci wykonania sposobu wedł ug wynalazku MEFA zawiera epitop z regionu proteazy NS3/4a poliproteiny HCV.

W innej korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku MEFA zawiera epitop z regionu helikazy NS3/4a poliproteiny HCV, bardziej korzystnie MEFA zawiera aminokwasy 1193-1657, numerowane odpowiednio do sekwencji HCV-1.

W nastę pnej korzystnej postaci wykonania sposobu wedł ug wynalazku MEFA zawiera epitop z regionu c33c poliproteiny HCV. Bardziej korzystnie MEFA zawiera aminokwasy 1211-1457, numerowane odpowiednio do HCV-1 lub MEFA zawiera aminokwasy 1192-1457, numerowane odpowiednio do HCV-1.

W kolejnej korzystnej postaci wykonania sposobu wedł ug wynalazku MEFA zawiera epitop z regionu 5-1-1 poliproteiny HCV. Bardziej korzystnie, MEFA zawiera aminokwasy 1689-1735, numerowane odpowiednio do HCV-1.

W jeszcze innej korzystnej postaci wykonania sposobu wedł ug wynalazku MEFA zawiera sekwencję aminokwasową opisaną na SEQ ID nr:4.

W nastę pnej korzystnej postaci wykonania sposobu wedł ug wynalazku MEFA zawiera sekwencję aminokwasową opisaną na SEQ ID nr:6.

Według wynalazku w obu powyżej opisanych sposobach, korzystnie MEFA jest MEFA13 lub MEFA 13.1.

Testy opisane w niniejszym opisie i oparte na sposobach według wynalazku mogą wykryć infekcję HCV spowodowaną przez każdy z sześciu znanych genotypów HCV. W jednej reprezentatywnej postaci wynalazku pierwszy antygen zawiera konformacyjny epitop NS3/4a, a drugi antygen jest wieloepitopowym antygenem fuzyjnym, zawierającym jeden bądź więcej epitopów z regionu NS3/4a. Użycie wieloepitopowych białek fuzyjnych zmniejsza problemy maskowania, poprawia czułość i wykrywa przeciwciała przez dostarczanie większej liczby epitopów na jednostkę powierzchni substratu i poprawienie selektywności. Co więcej, testy opisane tutaj mogą być przeprowadzone szybko i może być użyta większa objętość próbek bez efektów tła.

W szczególnych zastosowaniach, MEFA zawiera sekwencję aminokwasów określoną na rysunkach 6A-6F(SEQ ID NOS: 3 i 4) lub sekwencję aminokwasów określoną na rysunkach 8A-8F (SEQ ID NOS:5 i 6).

Wynalazek został zilustrowany na rysunkach na których podane Figury oznaczają odpowiednio:

Krótki opis rysunków

Fig. 1 jest schematycznym przedstawieniem genomu HCV, opisującym różne regiony poliproteiny, z której są otrzymywane odczynniki niniejszego testu (białka i przeciwciała).

Fig. 2 jest schematycznym rysunkiem reprezentatywnego warstwowego testu antygen/przeciwciało/antygen używającego MEFA 12, poniższego wynalazku.

Fig. od 3A do 3D (SEQ ID NOS: 1 i 2) przedstawiają DNA i odpowiadającą sekwencję aminokwasów reprezentatywnego antygenu konformacyjnego NS3/4a używanego w niniejszych testach. Aminokwasy w pozycjach 403 i 404 na rysunkach od 3A do 3D przedstawiają podstawienia Pro na Thr i Ile na Ser natywnych sekwencji aminokwasów HCV-1.

Fig. 4 jest schematem struktury Pd.HCV1a.ns3ns4aPI.

Fig. 5 jest schematycznym przedstawieniem MEFA 12.

Fig. 6A-6F (SEQ ID NOS: 3 i 4) przedstawiają DNA i odpowiadającą sekwencję aminokwasów MEFA 12.

Fig. 7 jest schematycznym przedstawieniem MEFA 7.1.

PL 209 710 B1

Fig. 8A-8F (SEQ ID NOS: 5 i 6) przedstawiają DNA i odpowiadającą sekwencję aminokwasów MEFA 7.1.

Fig. 9A-9C pokazują reprezentatywne MEFAs do stosowania w przedmiotowych testach immunologicznych. Fig. 9A jest schematycznym przedstawieniem MEFA 3. Fig. 9B jest schematycznym przedstawieniem MEFA 5. Fig. 9C jest schematycznym przedstawieniem MEFA 6.

Szczegółowy opis wynalazku

Praktycznie w bieżącym wynalazku będą używane, jeśli nie zaznaczono inaczej, konwencjonalne metody chemiczne, biochemiczne, techniki rekombinacji DNA i immunologii, zgodnie z wiedzą w tej dziedzinie. Takie techniki są w pełni wyjaśnione w piśmiennictwie. Patrz, np. Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields i D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures i Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Edition, 1989); Methods in Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

Należy zauważyć, jak użyto w tym opisie i załączonych zastrzeżeniach, forma pojedyncza obejmuje mnogie odnośniki, chyba, że treść wyraźnie wskazuje inaczej. Dlatego, na przykład odnośnik do „antygen" zawiera mieszaninę lub więcej antygenów i podobnie.

W tekś cie uż ywa się nastę pujących skrótów aminokwasów.

Alanina: Ala(A)

Asparagina: Asn(N)

Cysteina: Cys(C)

Kwas glutaminowy: Glu(E) Histydyna: His(H) Leucyna: Leu(L) Metionina: Met(M)

Prolina: Pro(P)

Treonina: Thr(T)

Tyrozyna: Tyr(Y)

Arginina: Arg(R)

Kwas asparaginowy: Asp(D) Glutamina: Gln(Q)

Glicyna: Gly(G)

Izoleucyna: Ile(I)

Lizyna: Lys(K)

Fenyloalanina: Phe(F)

Seryna: Ser(S)

Tryptofan: Trp(W)

Walina: Val(V)

I. Definicje

W opisie niniejszego wynalazku bę d ą uż ywane nastę pują ce okreś lenia i powinny być definiowane w sposób wskazany poniżej.

Nazwy „polipeptyd" i „białko" odnoszą się do polimeru reszt aminokwasów i nie są ograniczone do minimalnej długości produktu. Tak więc peptydy, oligopeptydy, dimery, multimetry i im podobne, są włączone do definicji. Definicja obejmuje zarówno białka o pełnej długości i ich fragmenty. Nazwy obejmują również postekspresyjne modyfikacje polipeptydów, na przykład glikozylację, acetylację, fosforylację i im podobne. Co więcej, dla celów niniejszego wynalazku, „polipeptyd" odnosi się do białka, które zawiera modyfikacje sekwencji natywnej, takie jak delecje, addycje, i substytucje (generalnie konserwatywne w naturze), tak dalece jak długo białko zachowuje pożądaną aktywność. Te modyfikacje mogą być zamierzone, jak przez punktową mutagenezę ukierunkowaną lub mogą być przypadkowe, tak jak poprzez mutacje gospodarzy, które wytwarzają białka, lub są wynikiem błędów powstałych wskutek amplifikacji PCR.

Polipeptyd HCV jest to polipeptyd, jak zdefiniowano powyżej, pochodny od poliproteiny HCV. Polipeptyd nie musi być fizycznie pochodnym od HCV, lecz może być wytworzony syntetycznie lub przez rekombinację. Co więcej polipeptyd może być pochodnym każdego z różnych szczepów i izolatów HCV, takich jak, choć do nich nie ograniczony, każdych z izolatów ze szczepów HCV 1, 2, 3, 4, 5, czy 6. Pomiędzy tymi szczepami, znanych jest wiele konserwatywnych i zmiennych regionów i na ogół, sekwencje aminokwasów epitopów pochodnych z tych regionów będą miały wysoki stopień homologii sekwencji, np., homologia sekwencji aminokwasu 30%, bardziej pożądana więcej niż 40%, gdy dwie sekwencje są uszeregowane. Dlatego na przykład, nazwa polipeptyd „NS3/4a" odnosi się do natywnego NS3/4a z każdego z różnych szczepów HCV, jak również analogów NS3/4a, mutein i fragmentów immunogenicznych, jak określono poniżej. Są znane kompletne genotypy wielu z tych szczepów. Patrz, np., U.S. Patent nr 6 150 087 i GenBank Accesion nr nr AJ238800 i AJ238799.

Nazwy „analog" i „muteina" odnoszą się do biologicznie aktywnych pochodnych cząsteczek odniesienia, lub fragmentów takich pochodnych, które utrzymują pożądaną aktywność, taką jak immunoreaktywność w testach opisanych tutaj. Ogólnie, tak długo jak długo modyfikacje nie zniszczą aktyw6

PL 209 710 B1 ności immunogenicznej, nazwa „analog" odnosi się do związków zawierających sekwencje natywnego polipeptydu i strukturę, odpowiednio do cząsteczki natywnej, z jedną lub więcej addycją aminokwasu, substytucją (na ogół konserwatywną w naturze) i/lub delecją. Nazwa „muteina" odnosi się do peptydów zawierających jeden lub więcej mimetyków peptydowych („peptoidów"), takich jak opisane w International Publication nr WO 91/04282. Jest pożądane, by analog lub muteina miały przynajmniej tę samą immunoaktywność co cząsteczka natywna. Metody otrzymywania analogów peptydowych i mutein są znane w tej dziedzinie i zostały opisane poniżej.

Szczególnie preferowane analogi zawierają substytucje, które są konserwatywne w naturze, tj., te substytucje, które zachodzą w rodzinie aminokwasów, które są spokrewnione łańcuchami bocznymi. Specyficznie, aminokwasy na ogół są dzielone na cztery rodziny: (1) kwasowe - asparaginian i glutaminian; (2) zasadowe - lizyna, arginina, histydyna; (3) niepolarne - alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan,; i (4) polarne nienaładowane - glicyna asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina, tyrozyna. Fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna są czasami klasyfikowane jako aminokwasy aromatyczne. Na przykład, jest racjonalnie przewidywalne, że izolowane zastąpienie leucyny izoleucyną czy waliną, asparginianu glutaminianem, treoniny seryną, czy podobnym konserwatywnym zastąpieniem aminokwasu strukturalnie pokrewnym aminokwasem, nie będzie miało dużego wpływu na biologiczną aktywność. Na przykład polipeptyd, o którym mowa, może zawierać do około 5-10 konserwatywnych lub niekonserwatywnych substytucji aminokwasów lub nawet do około 15-25 konserwatywnych lub niekonserwatywnych substytucji aminokwasów, czy każdą całkowitą wartość pomiędzy 5-25, tak długo, jak długo pożądana funkcja cząsteczki pozostaje nienaruszona. Biegły w tej dziedzinie może łatwo określić te regiony będącej przedmiotem zainteresowania cząsteczki, które mogą tolerować zmiany, przez odniesienie do wykresów Hopp Woodsa i KyteDoolittle'a, dobrze znanych w tej dziedzinie.

„Fragment" ma oznaczać polipeptyd składający się tylko z części sekwencji i struktury nieuszkodzonego polipeptydu o pełnej długości. Fragment może zawierać delecję C-końca i/lub delecję N-końca natywnego polipeptydu. "Immunogeniczny fragment" poszczególnego białka HCV będzie zawierał, na ogół, co najmniej około 5-10 przylegających reszt aminokwasów cząsteczki pełnej długości, bardziej pożądane, co najmniej około 15-25 przylegających reszt aminokwasów cząsteczki pełnej długości, a najbardziej pożądane, co najmniej około 20-50 lub więcej przylegających reszt aminokwasów cząsteczki pełnej długości, co definiuje epitop, lub każda całkowita wartość pomiędzy 5 aminokwasami a sekwencją pełnej długości, pod warunkiem, że omawiany fragment zachowuje immunoreaktywność w opisywanych tutaj testach. Na przykład, preferowane immunogeniczne fragmenty do stosowania w MEFAs, zawierają, choć nie są do nich ograniczone, fragmenty rdzenia HCV zawierającego, np. aminokwasy 10-45, 10-53, 67-88 i 120-130 poliproteiny, epitop 5-1-1 (w regionie NS3 genomu wirusowego), jak również określone epitopy pochodne z regionów poliproteiny HCV E1, E2, c33c(NS3), c100(NS4), NS3/4a i NS5, jak również każdy z innych różnych zidentyfikowanych epitopów z poliproteiny HCV. Patrz, np., Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:333-39; Chien i wsp., International Publication nr WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publication nr WO 94/01778; U.S. Patent nr, nr 6 150 087 i 6 121 020.

Nazwa "epitop" tak, jak użyto tutaj odnosi się do sekwencji, co najmniej około 3 do 5, bardziej pożądane około 5 do 10 lub 15, a nie więcej niż około 1 000 aminokwasów (lub każda całkowita wartość pośrednia), która określa sekwencję, która sama w sobie lub jako część większej sekwencji wiąże się do przeciwciała wytworzonego w odpowiedzi na taką sekwencję. Nie ma krytycznego górnego ograniczenia długości fragmentu, który może zawierać pełną długość sekwencji białka lub nawet białko fuzyjne zawierające dwa lub więcej epitopy poliproteiny HCV. Epitop stosowany w wynalazku nie jest ograniczony do polipeptydu mającego dokładną sekwencję części białka rodzicielskiego, od którego pochodzi. Faktycznie, genomy wirusowe są w stanie stałej płynności i zawierają kilka zmiennych domen, które wykazują relatywnie wysoki stopień zmienności wśród izolatów. Tak więc nazwa „epitop" obejmuje sekwencje identyczne z natywnymi sekwencjami, jak również modyfikacje natywnej sekwencji, takie jak delecje, addycje i substytucje (ogólnie konserwatywne w naturze).

Regiony omawianego polipeptydu, które zawierają epitop mogą być identyfikowane przy użyciu każdej z wielu dobrze znanych w tej dziedzinie technik mapowania epitopów. Patrz np., Epitope Mapping Protocols In Methods In Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1966) Humana Press, Totowa, New Jersey. Na przykład, liniowe epitopy mogą być determinowane przez np., równoczesne syntetyzowanie dużej liczby peptydów na stałym podłożu, peptydów odpowiadających częściom cząsteczki białka i reagowanie peptydów z przeciwciałami, podczas gdy są one ciągle związane z podłoPL 209 710 B1 żem. Takie techniki są znane i opisane w tej dziedzinie, np., U.S. Patent nr 4 708 871; Geysen i wsp., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen i wsp., (1985) Proc. Natl, Acad. Sci. USA 82:178-182; Geysen i wsp., (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Wiele epitopów HCV zostało zidentyfikowanych przy użyciu takich technik. Patrz np., Chien i wsp., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) pp. 320-324, i następnie poniżej. Podobnie, epitopy konformacyjne są łatwo identyfikowane przez określenie przestrzennej struktury aminokwasów tak jak np., przy użyciu krystalografii rentgenowskiej i dwuwymiarowego jądrowego rezonansu magnetycznego. Patrz np., Epitope Mapping Protocols, powyżej. Antygenowe regiony białek mogą być również zidentyfikowane przy użyciu standardowych wykresów antygenowości i hydropatii, takich jak wyliczone przy użyciu np., programu wersji Omiga 1.0 dostępnego z Oxford Molecular Group. Ten program stosuje metodę Hopp/Wood, Hopp i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 dla określenia profili antygenowości i techniki Kyte-Doolittle, Kyte i wsp., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 dla wykresów hydropatii.

Dla określenia różnych epitopów patrz np., Chien i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien i wsp., International Publication nr WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publication nr WO 94/01778; U.S. Patent nr, nr 6 280 927 i 6 150 087.

Jak tutaj użyto, nazwa "epitop konformacyjny" odnosi się do części białka pełnej długości, lub analogu czy jego muteiny, posiadającej własności strukturalne natywne do sekwencji aminokwasu kodującej epitop w naturalnym białku pełnej długości. Natywne własności strukturalne zawierają, lecz nie są ograniczone do glikozylacji i trójwymiarowej struktury. Długość sekwencji definiującej epitop może podlegać znaczącym wahaniom, ponieważ jak się uważa te epitopy są tworzone przez trójwymiarowy kształt antygenu (np. pofałdowanie). Tak więc, aminokwasy definiujące epitop mogą być relatywnie nieliczne, znacznie rozproszone wzdłuż długości cząsteczki (lub nawet na różnych cząsteczkach w przypadku dimerów, itp.), będąc włączone we właściwą konformację epitopów przez pofałdowanie. Części antygenu pomiędzy resztami definiującymi epitop mogą nie być istotne dla struktury konformacyjnej epitopu. Na przykład delecja lub substytucja tych sekwencji przerywnikowych może nie wpływać na epitop konformacyjny pod warunkiem, że zachowywane są sekwencje krytyczne dla epitopu konformacyjnego (np., cysteiny włączone w wiązanie dwusiarczkowe, miejsca glikozylacji, itp.).

Epitopy konformacyjne obecne w np., regionie NS3/4a są łatwo identyfikowane przy użyciu metod dyskutowanych powyżej. Co więcej, obecność lub brak konformacyjnego epitopu w danym polipeptydzie może być łatwo zdeterminowana przez skrining antygenu będącego przedmiotem zainteresowania, przeciwciałem (poliklonalna surowica lub monoklonalna do konformacyjnego epitopu) i porównanie jego reaktywności do reaktywności denaturowanej wersji antygenu, która zachowuje tylko epitopy liniowe (o ile takie będą). W takim skriningu przy użyciu przeciwciał poliklonalnych, może być korzystne zaabsorbowanie najpierw poliklonalnej surowicy przy użyciu denaturowanego antygenu i stwierdzenie czy przeciwciała są wiązane do omawianego antygenu. Dodatkowo, w przypadku NS3/4a, cząsteczka, która zachowuje natywną konformację, będzie również miała enzymatyczną aktywność proteazy i opcjonalnie helikazy. Takie aktywności można wykryć przy użyciu enzymatycznych testów, jak opisano poniżej.

Jest pożądane, by epitop konformacyjny był wytwarzany w procesie rekombinacji i ulegał ekspresji w komórce, z której może być ekstrahowany w warunkach zachowujących jego pożądane własności strukturalne, np. bez denaturacji epitopu. Takie komórki obejmują komórki bakterii, drożdży, owadów i ssaków. Ekspresja i izolacja rekombinowanych epitopów konformacyjnych z poliproteiny HCV są opisane w np., Publikacji Międzynarodowej nr WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734. Alternatywnie, możliwa jest ekspresja antygenów i następnie renaturacja białka po odzyskaniu. Jest również zrozumiałe, że również chemiczna synteza może dostarczyć mimitopy konformacyjnego antygenu, które reagują krzyżowo z konformacyjnym epitopem natywnego antygenu.

Nazwa „wieloepitopowy antygen fuzyjny" lub „MEFA" jak tutaj użyto ma oznaczać polipeptyd, w którym wielokrotne antygeny HCV są częścią pojedynczego, ciągłego łańcucha aminokwasów. Taki łańcuch nie występuje w naturze. Antygeny HCV mogą być połączone bezpośrednio jeden z drugim wiązaniami peptydowymi, lub mogą być oddzielone przez sekwencje aminokwasów leżące miedzy nimi. Antygeny fuzyjne mogą również zawierać sekwencje egzogenne poliprotein HCV. Co więcej, niniejsze sekwencje HCV mogą pochodzić z genotypów wielokrotnych i/lub izolatów HCV. Przykłady poszczególnych MEFAs dla użycia w niniejszych testach immunologicznych są wyszczególnione w np., Publikacji Międzynarodowej nr WO 01/96875, WO 01/09609, WO 97/44469 i U.S. Patent nr 6 514 731 i 6 428 792.

PL 209 710 B1 „Przeciwciało" ma oznaczać cząsteczkę, która specyficznie wiąże się, chemicznymi bądź fizycznymi sposobami, z omawianym polipeptydem. Tak więc przeciwciało HCV NS3/4a jest cząsteczką, która specyficznie wiąże się do epitopu białka HCV NS3/4a. Nazwa „przeciwciało" jak tutaj użyto obejmuje przeciwciała otrzymane z zarówno poliklonalnych jak i monoklonalnych preparatów, jak również z następujących: cząsteczek hybrydowego (chimerycznego) przeciwciała (patrz, na przykład, Winter i wsp. (1991) Nature 349:293-299; i U.S. Patent nr 4 816 567); fragmentów F(ab') i F(ab); cząsteczki Fv (niekowalentne heterodimery, patrz na przykład Inbar i wsp. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; i Ehrlich i wsp. (1980) Biochem 19:4091-4096); jednołańcuchowych cząsteczek Fv (sFv) (patrz, na przykład, Huston i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883); fragmentów konstruktów przeciwciał dimerycznych i trimerycznych; miniciał (patrz np., Pack i wsp., (1992) Biochem. 31:1579-1584; Cumber i wsp., (1992) J. Immunology 149B:120-126); humanizowanych cząsteczek przeciwciał (patrz, na przykład, Riechmann i wsp., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan i wsp., (1988) Science 239:1534-1536 i U.K. Patent Publication nr GB 2 276 169, opublikowany 21 września 1994) i każdych funkcjonalnych fragmentów otrzymanych z takich cząsteczek, w których takie fragmenty zachowują immunologiczne własności wiążące przeciwciała komórki rodzicielskiej.

Białko „zrekombinowane" jest to białko, które zachowuje pożądaną aktywność i które zostało przygotowane techniką rekombinacji DNA opisaną tutaj. Ogólnie, gen będący przedmiotem zainteresowania jest klonowany, a następnie podlega ekspresji w transformowanych organizmach, jak opisano poniżej. W organizmie gospodarza zachodzi ekspresja obcego genu, żeby wytworzyć białko w warunkach umożliwiających ekspresję.

Przez słowo „izolowany" rozumie się, gdy odnoszone jest do polipeptydu, że wskazana cząsteczka jest oddzielona i odseparowana od całego organizmu, w którym w naturze cząsteczka się znajduje, lub w jego otoczeniu nie znajdują się inne biologiczne makrocząsteczki tego samego typu. Nazwa „izolowany" w odniesieniu do polinukleotydu jest to cząsteczka kwasu nukleinowego pozbawiona w całości lub częściowo sekwencji normalnie z nią w naturze powiązanych lub sekwencja, jaka istnieje w naturze, ale mającą heterologiczne sekwencje z nią połączone; lub cząsteczka oddzielona od chromosomów.

Przez wyrażenie „ekwiwalentna determinanta antygenowa" rozumie się antygenową determinantę z odrębnego podgatunku czy szczepu HCV takiego jak szczepy 1, 2, 3 HCV etc. Bardziej specyficznie, są znane epitopy takie jak 5-1-1 i takie epitopy różnią się pomiędzy szczepami 1, 2, i 3. Tak więc epitopy 5-1-1 z trzech różnych szczepów są ekwiwalentnymi determinantami antygenowymi, a zatem są „kopiami", nawet mimo, że ich sekwencje nie są identyczne. Na ogół, sekwencje aminokwasów ekwiwalentnych determinant antygenowych będą miały wysoki stopień homologii sekwencyjnej, np., gdy dwie sekwencje są uszeregowane, homologia sekwencji aminokwasów będzie większa niż 30%, bardziej pożądana większa niż 40%.

„Homologia" odnosi się do procentu podobieństwa pomiędzy dwoma polinukleotydami lub dwoma połówkami polipeptydu. Dwa DNA, lub dwie sekwencje polipeptydu są „znacząco homologiczne" jedna do drugiej, gdy sekwencje wykazują co najmniej około 50%, pożądane co najmniej około 75%, bardziej pożądane co najmniej około 80%-85%, pożądane co najmniej około 90% i najbardziej pożądane co najmniej około 95%-98% podobieństwa sekwencji na określonej długości cząsteczek. Jak użyto tutaj, znacząco homologiczny odnosi się również do sekwencji wykazujących całkowitą identyczność do wyszczególnionej sekwencji DNA lub polipeptydu.

Ogólnie, „identyczność" odnosi się do dokładnego odpowiadania nukleotydu-do-nukleotydu lub aminokwasu-do-aminokwasu sekwencji dwóch polinukleotydów lub dwóch polipeptydów, odpowiednio. Procent identyczności może być określony przez bezpośrednie porównanie informacji sekwencyjnej pomiędzy dwoma cząsteczkami, przez uszeregowanie sekwencji, policzenie dokładnej liczby dopasowań pomiędzy dwoma uszeregowanymi sekwencjami, podzielenie przez długość krótszej sekwencji i pomnożenie rezultatu przez 100.

Do pomocy w analizie podobieństwa i identyczności mogą być użyte łatwo dostępne programy komputerowe, takie jak ALIGN, Dayhoff, M.O. w Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, który adaptuje algorytm lokalnej homologii dla analizy peptydów Smitha i Watermana Advances In Appl. Math. 2:482-489, 1981. Programy dla określenia podobieństwa i identyczności sekwencji nukleotydów są dostępne w Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (dostępne od Genetics Komputer Group, Madison, WI) na przykład, programy BESTFIT, FASTA i GAP, które również bazują na algorytmie Smitha i Watermana. Te programy użytkuje się łatwo w oparciu o domyślne parametry rekomendowaPL 209 710 B1 ne przez wytwórcę i opisane w Wisconsin Sequence Analysis Package, do którego nawiązywano powyżej. Na przykład procent podobieństwa sekwencji poszczególnych nukleotydów w stosunku do sekwencji referencyjnej może być oznaczony przy użyciu algorytmu homologii Smitha-Watermana z tabelą domyślnej punktacji i karą za przerwę sześciu nukleotydowych pozycji.

Inną metodą ustalenia procentu podobieństwa w kontekście niniejszego wynalazku jest zastosowanie pakietu programów MPSRCH opracowanego przez John F. Collins and Shane S. Sturrok, chronionego prawem autorskim University of Edinburgh i rozprowadzanego przez IntelliGeneties, Inc. (Mountain View, CA). Z tego zestawu pakietów można zastosować algorytm Smitha i Watermana, gdy do tabeli oceny punktowej są używane parametry domyślne (na przykład kara za otwarcie przerwy - 12, za wydłużenie przerwy - jeden i przerwa sześć). Z wygenerowanych danych wartość „Dopasowanie" odzwierciedla „sekwencję podobieństwa". W tej dziedzinie znane są inne odpowiednie programy do wyliczania procentu identyczności lub podobieństwa pomiędzy sekwencjami, na przykład, innym programem szeregującym używanym z domyślnymi parametrami jest BLAST. Na przykład, można używać BLASTN i BLASTP stosując następujące parametry domyślne: kod genetyczny = standard; filtr = żaden; łańcuch = oba; odcięcie = 60; oczekiwanie = 10; Matryca = BLOSUM62; Opisy = 50 sekwencji; sortowane przez = wysoka punktacja wyniku; Bazy danych = niezbędne, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Szczegóły dotyczące tych programów można znaleźć pod następującym adresem internetowym: http://www.ncbi.nlm.gov/cgibin/BLAST.

Alternatywnie, homologia może być określona przez hybrydyzację polinukleotydów w warunkach tworzących stabilne dupleksy pomiędzy homologicznymi regionami, a następnie trawienie nukleazą(ami) specyficzną do pojedynczego łańcucha i określenie rozmiaru pociętych fragmentów. Sekwencje DNA, które są znacząco homologiczne mogą być zidentyfikowane w doświadczeniu hybrydyzacji Southerna w, na przykład: restrykcyjnych warunkach, jak określono dla tego szczególnego systemu. Zdefiniowanie właściwych warunków hybrydyzacji mieści się ramach umiejętności w tej dziedzinie Patrz, np., Sambrook i wsp., powyżej, DNA Cloning, powyżej. Nucleic Acid Hybridization, powyżej.

„Zwykłe podłoże stałe" ma oznaczać pojedynczą matrycę stałą, z którą używane w, będących przedmiotem badania, testach immunologicznych polipeptydy HCV są związane kowalencyjnie lub niekowalencyjnymi metodami takimi jak adsorpcja hydrofobowa.

„Immunologicznie reaktywny" znaczy, że antygen, o którym mowa, będzie reagował specyficznie z przeciwciałami anty-HCV obecnymi w biologicznej próbce od osoby zarażonej HCV.

„Kompleks immunologiczny" ma oznaczać kombinację tworzoną, gdy przeciwciało wiąże się z epitopem na antygenie.

Jak się tutaj używa „próbka biologiczna" odnosi się do próbki, tkanki czy płynu wyizolowanego od, będącego przedmiotem badania, włączając lecz nie ograniczając do, na przykład: krwi, plazmy, surowicy, kału, moczu, szpiku kostnego, żółci, płynu rdzeniowego, płynu limfatycznego, próbek skóry, zewnętrznych wydzielin skóry, dróg oddechowych, jelitowych, moczowopłciowych, łez, śliny, mleka, komórek krwi, narządów, tkanek pochodzących z biopsji, i również próbek składników hodowli komórkowej in vitro, zawierającej, ale nie ograniczonej do kondycjonowanych pożywek uzyskanych podczas wzrostu komórek i tkanek w hodowlanej pożywce, np., zrekombinowanych komórek i składników komórkowych.

Jak tutaj użyto, terminy „znakowanie" i „możliwe do wykrycia znakowanie" odnosi się do cząsteczki, którą można wykryć, włączając w to, ale nie ograniczając do radioaktywnych izotopów, fluorescerów, chemiluminescerów, chromoforów, enzymów, substratów enzymów, kofaktorów enzymów, inhibitorów enzymów, chromoforów, barwników, jonów metali, roztworów koloidalnych metali, ligandów (np., biotyny, strepawidyny lub haptenów) i podobnych. Nazwa „fluorescer" odnosi się do substancji lub jej części, która jest zdolna do wykazywania fluorescencji w wykrywalnym zakresie. Szczególne przykłady znakowania, które mogą być użyte w wynalazku włączają w to, ale nie są ograniczone do peroksydazy chrzanowej (HRP), fluoresceiny, FITC, rodaminy, dansylu, umbeliferonu, estru dimetylo akrydyny (DMAE), Teksas red, luminolu NADPH i α-β-galaktozydazy.

II. Sposoby przeprowadzania wynalazku.

Przed szczegółowym opisaniem niniejszego wynalazku należy zrozumieć, że ten wynalazek nie jest ograniczony do poszczególnych formuł, czy parametrów procesu, gdyż te mogą ulegać zmianom. Należy również zrozumieć, że używana tutaj terminologia ma na celu jedynie opisanie poszczególnych postaci wynalazku, a nie ma go ograniczać.

PL 209 710 B1

Pomimo, że w praktyce niniejszego wynalazku mogą być użyte liczne kompozycje i metody podobne lub ekwiwalentne do opisanych tutaj, opisane tutaj są metody i materiały pożądane.

Jak napisano powyżej, niniejszy wynalazek bazuje na odkryciu nowych diagnostycznych warstwowych metod antygen/przeciwciało/antygen dokładnego wykrywania infekcji HCV. Metody mogą być zastosowane szybko i wydajnie i wyeliminować efekty tła, które mogą się pojawić przy używaniu próbek o dużej objętości. W tych metodach pożądane jest stosowanie wysoce immunogenicznych antygenów HCV, które są obecne podczas wczesnych stadiów serokonwersji HCV, które wskutek tego zwiększają dokładność wykrywania i redukują zakres fałszywych rezultatów.

W szczególności, testy immunologiczne opisane tutaj stosują dwa podstawowe antygeny HCV, jeden obecny w fazie stałej i jeden obecny w fazie płynnej. Oba antygeny są zdolne do wiązania przeciwciał HCV obecnych w biologicznych próbkach od zarażonych osób. Jeden z antygenów używany w testach jest wyizolowanym antygenem z regionu poliproteiny HCV. Drugi uż ywany antygen jest wieloepitopowym antygenem fuzyjnym („MEFA") zawierającym różne polipeptydy HCV, albo z tego samego albo z różnych genotypów HCV i izolatów. MEFA zawiera przynajmniej jeden lub więcej epitopów pochodzących z tego samego regionu poliproteiny HCV, co izolowany antygen HCV.

W szczególnie pożądanych postaciach, jeden z antygenów stosowanych w bę d ą cych przedmiotem badania testach jest wysoce immunogenicznym konformacyjnym epitopem pochodzącym z regionu NS3/4a poliproteiny HCV. W tych postaciach, jak niżej opisano, drugim stosowanym antygenem jest MEFA, który zawiera jeden lub więcej epitopów z regionu NS3/4a (albo liniowy albo konformacyjny). MEFA może zatem zawierać wielokrotne epitopy immunodominacyjne pochodzące z regionu NS3/4a jednego lub więcej izolatów HCV. Jeśli wielokrotne epitopy NS3/4a są stosowane w fuzji wieloepitopów, mogą one być tymi samymi lub różnymi epitopami. Alternatywnie, antygen fuzyjny może zawierać jeden lub więcej epitopów pochodzących z regionu NS3/4a, jak również główne epitopy liniowe z innych regionów HCV takich jak bez ograniczeń rdzeń HCV, sekwencje E1, E2, P7, NS4b, NS5a i NS5b.

Metody mogą być dogodnie stosowane w pojedynczym teście, przy użyciu każdej z kilku form testów opisanych poniżej takich jak, ale do nich nie ograniczonych, form testów użytkujących podłoże stałe, z którym jest związany albo izolowany antygen HCV taki jak konformacyjny epitop NS3/4a albo MEFA. Dlatego MEFA może być dostarczany albo w roztworze, albo w fazie stałej. Jeżeli jest dostarczany w roztworze, izolowany antygen HCV jest obecny w fazie stałej.

Na przykład: w jednej z reprezentatywnych metod wynalazku, test jest przeprowadzany na podłożu stałym, z którym został związany jeden lub więcej polipeptydów zawierających jeden lub więcej konformacyjnych epitopów, pochodzących z regionu NS3/4a poliproteiny HCV. W tej postaci, MEFA jest dostarczany w fazie ciekłej. W alternatywnej postaci, test jest przeprowadzany na podłożu stałym, z którym związany został jeden lub więcej MEFAs. W tej postaci polipeptyd zawierający epitop konformacyjny NS3/4a jest dostarczany w fazie ciekłej. Tak więc, jeśli epitop konformacyjny NS3/4a jest obecny na podłożu stałym, MEFA jest obecny w fazie ciekłej i vice versa.

W celu dalszego zrozumienia wynalazku, poniżej przeprowadzono bardziej szczegółową dyskusję dotyczącą użycia różnych antygenów polipeptydu HCV i MEFAs w, będących przedmiotem badania, metodach jak również wytwarzanie białek i metod stosowania białek.

Antygeny HCV i MEFAs

Genomy szczepów HCV zawierają pojedynczą otwartą ramkę odczytu w przybliżeniu 9 000 do 12 000 nukleotydów, w wyniku transkrypcji której powstaje poliproteina. Jak pokazano na rys. 1 i w tabeli 1 poliproteina HCV, w efekcie cię cia, powstaje co najmniej dziesięć odrę bnych produktów w kolejnoś ci NH2-rdzeń -E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Rdzeń polipeptydu występuje w pozycjach 1-191, numerowanych odpowiednio do HCV-1 (patrz Choo i wsp., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455, dla genomu HCV-1). Ten polipeptyd jest następnie poddawany obróbce, by wytworzyć polipeptyd HCV z w przybliżeniu 1-173 aminokwasami. Otoczka polipeptydów, E1 i E2, występuje w pozycjach odpowiednio: około 192-383 i 384-746. Domena P7 jest znajdowana około pozycji 747-809. NS2 jest integralnym białkiem błonowym o proteolitycznej aktywności i jest znajdowane w około pozycjach poliproteiny 810-1026. NS2 w kombinacji z NS3, (znajdowane około pozycji 1027-1657) tnie predysponowane do cięcia 16/31 wiązanie NS2-NS3, co z kolei wytwarza

N-koniec NS3 i uwalnia wielką poliproteinę, która zawiera aktywności zarówno proteazy seryny jak i helikazy RNA. Proteaza NS3 znajdowana około pozycji 1027-1207, służy do przetwarzania pozostałej poliproteiny. Aktywność helikazy jest znaleziona około pozycji 1193-1657. NS3 uwalnia kofaktor NS3 (NS4a znaleziony około pozycji 1658-1711), dwa białka (NS4b znaleziony około pozycji

PL 209 710 B1

1712-1972 i NS5a znaleziony około pozycji 1973-2420) i polimerazę RNA zależną od RNA (NS5b znaleziony około pozycji 2421-3001). Ukończenie dojrzewania poliprotein jest zapoczątkowane przez autokatalityczne cięcie połączenia NS3-NS4a, katalizowane przez proteazę seryny NS3.

T a b e l a 1

Domena	Przybliżone granice*
C (rdzeń)	1-191
E1	192-383
E2	384-746
P7	747-809
NS2	810-1026
NS3	1027-1657
NS4a	1658-1711
NS4b	1712-1972
NS5a	1973-2420
NS5b	2421-3011

*Numerowane odpowiednio do HCV-1. Patrz Choo i wsp., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451-2455.

Jak opisano powyżej, jednym składnikiem, będących przedmiotem badania, metod jest izolowany antygen z każdego z różnych regionów poliproteiny HCV. Został określony kwas nukleinowy i sekwencje aminokwasów z licznych szczepów i izolatów HCV, włączając kwas nukleinowy i sekwencje aminokwasów z różnych rejonów opisanych powyżej. Na przykład, izolat HCV Jl.1 jest opisany w Kubo i wsp., (1989) Japa. Nucl. Acids. Res. 17:10367-10372; Takeuchi i wsp., (1990) Gene 91:287:291; Takeuchi i wsp., (1990) J. Gen. Virol. 71:3027-3033; i Takeuchi i wsp., Nucl Acids Res. 18:4626. Całkowite sekwencje kodujące dwóch niezależnych izolatów, HCV-J i BK, są opisane przez Kato i wsp., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9524-9528 i Takamizawa i wsp., (1991) J. Virol. 65:1105-1113 odpowiednio.

Publikacje, które izolaty HCV-1 obejmują Choo i wsp., (1990) Brit. Med. Bull. 46:423-441; Choo i wsp., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-245 i Han i wsp., (1991) Proc Natl. Acad. Sci. USA 88: 1711-1715. Izolaty Hcv Hc-J1 i HC-J4 są opisane w Okamoto i wsp., (1991) Japan J. Exp. Med 60:167-177. Izolaty HCV HCT18O, HCT 23, Th, HCT 27, EC1 i EC10 są opisane w Weiner i wsp., (1991) Virol. 180:842-848. Izolaty HCV Pt-1, HCV-K1 i HCV-K2 są opisane w Enomoto i wsp., (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 170:1021-1025. Izolaty HCV A, C, D & E są opisane w TsukiyamaKohara i wsp. (1991) Virus Genes 5:243-254.

Dlatego, na przykład: izolowany antygen HCV może pochodzić z regionu rdzenia każdego z tych izolatów HCV. Ten region znajduje się w pozycjach 1-191 aminokwasów poliproteiny HCV, numerowanych odpowiednio do HCV-1. W metodach będących przedmiotem badania może być stosowane albo białko o pełnej długości, jego fragmenty takie jak aminokwasy 1-150, np., aminokwasy 1-130, 1-120, na przykład aminokwasy 1-121, 1-122, 1-123, itd., albo mniejsze fragmenty zawierające epitopy, białka o pełnej długości, takie jak epitopy znajdowane pomiędzy aminokwasami 10-53, aminokwasami 10-45, aminokwasami 67-88, aminokwasami 120-130, lub każdy z epitopów rdzenia zidentyfikowany w np., Houghton i wsp., U.S. Patent nr 5 350 671; Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1992) 89:10011-10015; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien i wsp., International Publication nr WO93/00365; Chien, D.Y., International Publication nr WO 94/01778; i U.S.Patent nr, nr 6 280 927 i 6 150 087. Co więcej, może być stosowane białko pochodzące z ramki odczytu w regionie rdzenia poliproteiny, takiej jak opisana w International Publication nr WO 99/53941.

Podobnie, mogą być stosowane, w metodach będących przedmiotem niniejszego wynalazku, polipeptydy z regionów HCV E1 i/lub E2, jak izolowany antygen HCV. E2 istnieje jako złożony gatunek (Spaete i wsp., Virol. (1992) 188:819-830; Selby i wsp., J. Virol. (1996) 70:5177-5182; Grakoui i wsp.,

PL 209 710 B1

J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Tomei i wsp., J. Virol. (1993) 67:4017-4026) i obcinanie i proteoliza mogą pojawić się na NB i C-końcu polipeptydu E2. Dlatego, polipeptyd E2 do stosowania tutaj może zawierać aminokwasy 405-661, np. 400, 401, 402 do 661, takie jak 383 lub 384-661, 383 lub 384-715, 383 lub 384-746, 383 lub 384-749 lub 383 lub 384-809, lub 383 lub 384 do każdego C-końca pomiędzy 661-809 poliproteiny HCV, numerowanej odpowiednio do pełnej długości poliproteiny HCV-1. Podobnie polipeptydy E1 do stosowania tutaj mogą zawierać aminokwasy 192-326; 192-330, 192-333, 192-360, 192-363, 192-383, lub 192 do każdego C-końca pomiędzy 326-383 poliproteiny HCV.

Immunogeniczne fragmenty E1 i/lub E2, które zawierają epitopy, mogą być stosowane w, będących przedmiotem badania metodach. Na przykład, fragmenty polipeptydów E1 mogą zawierać od około 5 do prawie całej długości cząsteczki, takiej jak 6, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 185, lub więcej aminokwasów polipeptydu E1, lub każdą wartość całkowitą pomiędzy wymienionymi liczbami. Podobnie, fragmenty polipeptydów E2 mogą zawierać 6, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 lub 350 aminokwasów polipeptydu E2 lub każdą wartość całkowitą pomiędzy podanymi liczbami.

Na przykład, do fuzji mogą być włączone epitopy pochodzące z, np., hiperzmiennego regionu E2, takiego jak region obejmujący aminokwasy 384-410 lub 390-410. Szczególnie efektywnym epitopem E2 do włączenia do sekwencji polipeptydu E2 jest taki, który zawiera konsensusową sekwencję pochodzącą z tego regionu, taką jak konsensusowa sekwencja Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn (SEQ ID NO:7), która przedstawia konsensusową sekwencję dla aminokwasów 390-410 genomu HCV typu 1. Są znane i opisane dodatkowe epitopy E1 i E2 w np., Chien i wsp., International Publication nr WO 93/00365.

Co więcej, w polipeptydach E1 i/lub E2 może brakować całej lub części błonowej domeny obejmującej. W E1, polipeptydy na ogół kończące się około pozycji aminokwasu 370 i wyżej (oparte o numerację HCV-1E1) będą zatrzymane przez ER i dlatego nie są wydzielane do pożywek wzrostowych. W E2 polipeptydy kończące się około pozycji aminokwasu 731 i wyżej (również oparte o numerację sekwencji HCV-1E2) będą zatrzymywane przez ER i nie wydzielane (patrz, np., International Publication nr WO 96/04301, opublikowaną 15 lutego 1996). Należy zauważyć, że te pozycje aminokwasów nie są bezwzględne i mogą się różnić w pewnym stopniu. Dlatego niniejszy wynalazek rozważa stosowanie polipeptydów E1 i/lub E2, które zachowują wiążącą domenę transbłonową, jak również polipeptydów, którym brak całej lub części wiążącej domeny transbłonowej, włączając polipeptydy E1 kończące się na około 369 aminokwasów i niżej i polipeptydy E2 kończące się na około 730 aminokwasów i niżej. Co więcej, miejsce cięcia C-końca może się rozciągać w kierunku N-końca, poza obejmującą domenę transbłonową. Dlatego, na przykład: cięcia E1 znajdujące się w pozycjach niżej niż np. 360 i cięcia E2 znajdujące się w pozycjach niżej niż np. 715 są objęte również niniejszym wynalazkiem. Wszystko, co jest koniecznym jest to, żeby cięte polipeptydy E1 i E2 pozostały funkcjonalne dla przeznaczonych im celów. Jednakże szczególnie pożądanymi ciętymi konstruktami E1 są te, które nie rozciągają się poza około aminokwas 300. Najbardziej pożądanymi są te, które kończą się na pozycji 360. Pożądane cięte konstrukty E2 są te, z cięciami C-końca, które nie rozciągają się poza pozycję aminokwasów, około 715. Szczególnie pożądane cięcia E2 są te, w których cząsteczki są cięte po każdym aminokwasie 715-730, takim jak 725.

Dodatkowo, epitopy z regionów NS3, NS4, NS5a lub NS5b mogą być stosowane jako izolowany antygen HCV. Szczególnie pożądane jest stosowanie epitopu z regionu NS3/4a. Region NS3/4a poliproteiny HCV został opisany i sekwencja aminokwasu i całkowita struktura białka są ujawnione w np., Yao i wsp., Structure (listopad 1999) 7:1353-1363; Sali i wsp., Biochem. (1998) 37:3392-3401; i Bartenschlager, R, J.Viral Hepat. (1999) 6:165-181. Patrz również Dasmahapatra i wsp., U.S. Patent nr 5 843 752. Będące przedmiotem badania testy immunologiczne mogą używać co najmniej jeden epitop konformacyjny pochodzący z regionu NS3/4a, który istnieje w konformacji jaka znajduje się w naturalnie występującej cząsteczce HCV lub jej zakaźnym produkcie, co jest udokumentowane przez zachowanie aktywności enzymatycznej proteazy i opcjonalnie helikazy normalnie wykazywanej przez produkt genu NS3/4a i/lub immunoreaktywność antygenu z przeciwciałami w biologicznej próbce od osobnika zarażonego HCV oraz utratą immunoreaktywności epitopu po denaturacji antygenu. Na przykład, epitop konformacyjny może być zniszczony przez podgrzewanie, zmianę pH do ekstremalnie kwasowego lub zasadowego lub przez dodanie znanych organicznych środków denaturujących, takich jak ditiotreitol (DTT) lub stosowny detergent. Patrz, np., Protein Purification Methods, a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal eds., IRL Press) oraz denaturowany produkt porównany do produktu, który nie został potraktowany jak wyżej.

PL 209 710 B1

Aktywność proteazy i helikazy może być określona przy użyciu standardowych testów enzymatycznych, dobrze znanych w tej dziedzinie. Na przykład, aktywność proteazy może być określona przy użyciu testów dobrze znanych w tej dziedzinie. Patrz, np., Takeshitai wsp., Anal. Biochem. (1997) 247:242-246; Kakiuchi i wsp., J. Biochem. (1997) 122:749-755; Sali i wsp., Biochemistry (1998) 37:3392-3401; Cho i wsp., J. Virol. Meth. (1998) 72:109-115; Cerretani wsp., Anal. Biochem. (1999) 266:192-197; Zhang i wsp., Anal. Biochem. (1999) 270:268-275; Kakiuchi i wsp., J. Virol. Meth. (1999) 80:771-84; Fowler i wsp., J. Biomol. Screen. (2000) 5:153-158; i Kim i wsp., Anal. Biochem (2000) 284:42-48. Szczególnie dogodny test do badania aktywności proteazy jest przedstawiony w przykładach poniżej.

Podobnie testy aktywności helikazy są dobrze znane w tej dziedzinie i aktywność helikazy epitopu NS3/4a może być określona przy użyciu, na przykład, testu ELISA, jak opisano w, np., Hsu i wsp., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 253:594-599; zbliżeniowego scyntylacyjnego systemu testowego, jak opisano w Kyonoi wsp., Anal. Biochem (1998) 257:120-126; wysokowydajnych skriningów, jak opisano w, np., Hitcham i wsp., Antiviral Res. (2000) 46:181-193 i Kwong i wsp., Methods Mol. Med. (2000) 24:97-116; jak również innymi metodami testowymi znanymi w tej dziedzinie. Patrz, np., Khu i wsp., J. Virol. (2001) 75:205-214; Utama i wsp., Virology (2000) 273:316-324; Paolini i wsp., J. Gen. Virol. (2000) 81:1335-1345; Preugschat i wsp., Biochemistry (2000) 39:5174-5183; Preugschat i wsp., Methods Mol. Med. (1998) 19:353-364; i Hesson i wsp., Biochemistry (2000) 39:2619-2625.

Jeśli używany jest konformacyjny epitop NS3/4a, długość antygenu jest wystarczająca by utrzymać immunoreaktywny epitop konformacyjny. Często, stosowany polipeptyd zawierający antygen, będzie miał prawie pełną długość, jednakże, polipeptyd może być również cięty w celu, na przykład, zwiększenia rozpuszczalności lub polepszenia wydzielania. Na ogół, konformacyjny epitop znajdowany w NS3/4a ulega ekspresji w komórce jako polipeptyd zrekombinowany i ten polipeptyd dostarcza epitopu w pożądanej postaci, jak szczegółowo opisano poniżej.

Reprezentatywna sekwencja aminokwasów dla polipeptydu NS3/4a jest pokazana na rysunkach 3A do 3D (SEQ ID NOS: 1 i 2). Sekwencja aminokwasu pokazana w pozycjach 2-686 rysunków 3A do 3D odpowiada pozycjom aminokwasu HCV-1 1027-1711. Kodon inicjacji (ATG) kodujący Met jest pokazany jako pozycja 1. Dodatkowo, Thr normalnie występujący w pozycji 1428 HCV-1 (pozycja aminokwasu 403 na rysunku 3) jest zmutowany do Pro, a Ser normalnie występująca w pozycji 1429 HCV-1 (pozycja aminokwasu 404 na rysunku 3) jest zmutowana do Ile. Jednakże albo natywna sekwencja, z lub bez Met N-końca, zobrazowany analog z lub bez Met N-końca albo inne analogi i fragmenty mogą być stosowane w, będących przedmiotem badania, testach tak długo jak długo jest wytwarzany epitop przy użyciu metody, która utrzymuje lub przywraca jego natywną konformację taką, że jest utrzymana aktywność proteazy i opcjonalnie helikazy. Dasmahapatra i wsp., U.S. Patent nr 5 843 752 i Zhang i wsp., U.S. Patent nr 5 990 276, obaj opisują analogi NS3/4a.

Proteaza NS3 z Ns3/4a jest znajdowana w pozycjach około 1027-1207, numerowanych odpowiednio do HCV-1, pozycjach 2-182 z rysunku 3. Struktura i miejsce aktywne proteazy NS3/4a są znane. Patrz, np., De Francesco i wsp., Antivir. Ther. (1998) 3:99-109; Koch i wsp., Biochemistry (2001) 40:631-640. Zmianami w natywnej sekwencji, które normalnie będą tolerowane, będą takie zmiany, które znajdują się na zewnątrz aktywnego miejsca cząsteczki. Szczególnie jest pożądane utrzymanie aminokwasów 1- lub 2-155 z rysunku 3 z małymi lub tylko konserwatywnymi podstawieniami. Aminokwasy znajdujące się poza pozycją 155 będą tolerowały większe zmiany. Dodatkowo, jeśli są stosowane fragmenty sekwencji NS3/4a, fragmenty te ogólnie będą zawierały przynajmniej aminokwasy 1- lub 2-155, pożądane aminokwasy 1- lub 2-175 i bardziej pożądane aminokwasy 1- lub 2-182, z lub bez Met N-końca. Domena helikazy jest znajdowana w pozycjach około 1193-1657 HCV-1 (pozycje 207-632 na rysunku 3). Dlatego, jeśli pożądana jest aktywność helikazy, ta część cząsteczki będzie utrzymywana z małymi lub tylko konserwatywnymi zmianami. Doświadczony w tej dziedzinie może łatwo określić inne regiony, w oparciu o znaną strukturę NS3/4a, w których zmiany będą tolerowane.

Znane są liczne antygeny, włączając w to epitopy pochodzące z NS3/4a, włączając, lecz nie ograniczając do antygenów pochodzących z regionów c33c, c200, c100 i 5-1-1, jak również białka fuzyjne zawierające epitop NS3, taki; jak c25.

Opis tych i różnych innych epitopów HCV z innych regionów HCV patrz, np., Houghton i wsp., U.S. Patent nr 5 350 671; Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1992) 89:10011-10015; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien i wsp., International Publication nr WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publication nr WO 94/01778; i U.S. Patent nr, nr 6 280 927 i 6 150 087.

PL 209 710 B1

Do testów immunologicznych opisanych tutaj również używa się wieloepitopowych antygenów fuzyjnych (zwanych MEFAs): jak opisano w International Publication nr, nr WO 01/96875, WO 01/09609, WO 97/44469 i U.S. Patent nr, nr 6 514 731 i 6 428 792. MEFAs używane w będących przedmiotem badania testach zawierają wiele epitopów pochodzących z każdego z różnych regionów wirusowych pokazanych na rysunku 1 i w tabeli 1 i jak opisano powyżej.

Wielokrotne antygeny HCV są częścią pojedynczego, ciągłego łańcucha aminokwasów, łańcucha, jaki nie występuje w naturze. Dlatego, uporządkowanie liniowe epitopów różni się od liniowego uporządkowania w genomie, w którym się znajduje. Liniowe uporządkowanie sekwencji MEFAs stosowanych tutaj jest ułożone w pożądany sposób dla osiągnięcia optymalnej antygenowości. Pożądane jest, by epitopy były z więcej niż z jednego szczepu HCV, dostarczając w ten sposób dodatkowej zdolności do wykrywania wielu szczepów HCV w pojedynczym teście. Dlatego MEFAs stosowane tutaj mogą obejmować różne regiony immunogeniczne pochodzące z opisanej powyżej poliproteiny.

Jak wyjaśniono powyżej, w szczególnie pożądanej postaci, epitop NS3/4a jest stosowany jako izolowany antygen HCV. W tej postaci MEFA zawiera co najmniej jeden lub więcej epitopów pochodzących z regionu NS3/4a (albo liniowy albo konformacyjny). Tak więc MEFA może zawierać wiele immunodominujących epitopów pochodzących z regionu NS3/4a z jednego lub więcej izolatów HCV. Jeśli stosuje się wiele epitopów NS3/4a w fuzji wieloepitopowej, mogą być to te same lub różne epitopy. Alternatywnie, antygen fuzyjny może zawierać jeden lub więcej epitopów pochodzących z regionu NS3/4a, jak również główne liniowe epitopy z innych regionów HCV, takich jak, bez ograniczeń, sekwencje rdzenia HCV, E1, E2, P7, NS4b, NS5a i NS5b.

Polipeptydy zawierające epitopy pochodzące z regionu NS3/4a obejmują, bez ograniczeń, polipeptydy zawierające całe lub część regionów NS3, NS4a i NS3/4a. Znane są liczne epitopy z tych regionów, obejmując, ale nie ograniczając, do antygenów pochodzących z regionów c33c, c200 i c100, jak również białek fuzyjnych zawierających epitop NS3, taki jak c25. Te i inne epitopy NS3 s ą użyteczne w niniejszych testach i są znane w tej dziedzinie i opisane, np., Houghton i wsp., U.S. Patent nr 5 350 671; Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1992) 89:10011-10015; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien i wsp., International Publication nr WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publication nr WO 94/01778; i U.S. Patent nr, nr 6 346 375 i 6 150 087.

Co więcej, determinanta antygenowa znana jako 5-1-1 jest częściowo w regionie NS4a (patrz rysunek 1) i jest szczególnie użyteczna w MEFAs używanych w będących przedmiotem badań testach. Ta antygenowa determinanta pojawia się w trzech różnych formach, w trzech różnych szczepach wirusowych HCV. Odpowiednio, w pożądanej postaci wynalazku wszystkie trzy formy 5-1-1 pojawiają się w wieloepitopowym antygenie fuzyjnym używanym w będących przedmiotem badań testach immunologicznych.

Dodatkowe epitopy HCV do użycia w MEFAs obejmują każdy z różnych epitopów opisanych powyżej, takich jak epitopy pochodzące z hiperzmiennego regionu E2, takiego jak region obejmujący aminokwasy 384-410 lub 390-410 lub sekwencję konsensusową z tego regionu, jak opisano powyżej (Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn (SEQ ID NO:7), która reprezentuje sekwencję konsensusową dla aminokwasów 390-410 genomu HCV typu 1. Reprezentatywny epitop E2 obecny w MEFA tego wynalazku może zawierać hybrydowy epitop obejmujący aminokwasy 390-444. Taki hybrydowy epitop E2 może obejmować sekwencję konsensusową przedstawiającą aminokwasy 390-410 zfuzjowane z natywną sekwencją aminokwasów dla aminokwasów HCV E2 411-444.

Jak wyjaśniono powyżej, antygeny mogą pochodzić z różnych szczepów HCV. Znanych jest wiele wirusowych szczepów HCV i epitopy pochodzące z każdego z tych szczepów mogą być użyte w białku fuzyjnym. Jest dobrze znane, że w każdym danym rodzaju organizmu jeden indywidualny organizm różni się od drugiego, a następnie, że dany organizm, taki jak wirus może mieć wiele różnych szczepów. Na przykład, jak wyjaśniono powyżej, HCV obejmuje co najmniej sześć genotypów. Każdy z tych genotypów obejmuje ekwiwalentne determinanty antygenowe. Bardziej specyficznie, każdy szczep obejmuje wiele antygenowych determinant, które są obecne we wszystkich szczepach wirusa, ale są niewielkie różnice pomiędzy jednym a drugim szczepem wirusowym. Podobnie, mogą również być obecne ekwiwalentne determinanty antygenowe z regionu rdzenia różnych szczepów HCV. Na ogół, ekwiwalentne determinanty antygenowe mają wysoki stopień homologii w znaczeniu sekwencji aminokwasów, których stopień homologii, gdy są uporządkowane ogólnie wynosi 30% lub więcej, pożądane 40% lub więcej. Epitop o wielu kopiach niniejszego wynalazku może również obejmować wiele kopii, które są dokładnymi kopiami tego samego epitopu.

PL 209 710 B1

Reprezentatywne MEFAs do stosowania z niniejszymi testami są pokazane na rysunkach 5, 7 i 9A-9C i są opisane w International Publication nr, nr WO 01/96875, WO 01/09609, WO 97/44469 i U.S. Patent nr, nr 6 514 731 i 6 428 792. Reprezentatywne MEFAs do stosowania tutaj obejmuj ą te nazwane MEFA 3, MEFA 5, MEFA 6, MEFA 7.1, MEFA 12, MEFA 13 i MEFA 13.1. Należy zrozumieć, że te MEFAs są jedynie reprezentatywne i inne epitopy pochodzące z genomu HCV również znajdą zastosowanie w niniejszych testach i mogą być włączone w te lub inne MEFAs.

Sekwencja DNA i odpowiadająca sekwencja aminokwasów MEFA 12 jest pokazana na rysunkach 6A do 6F (SEQ ID NOS: 3 i 4). Ogólny wzór strukturalny dla MEFA 12 jest pokazany na rysunku 5 i jest jak nastę puje: hSOD-E1(typ 1)-E2 HVR konsensus (typ 1)-E2 HVR konsensus(typy 1 i 2)-c33c krótki(typ 1)-5-1-1(typ 1)-5-1-1(typ 3)-5-1-1(typ 2)-c100(typ 1)-NS5(typ 1)-NS5(typ 1)-rdzeń(typy 1+2)-rdzeń(typy 1+2). Ten epitop o wielu kopiach obejmuje następującą sekwencję aminokwasów numerowaną odpowiednio do HCV-1 (numeracja aminokwasów przytoczona poniżej wynika z opisu dostarczonego w Choo i wsp., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455, w którym aminokwas #1 jest pierwszą metionina zakodowaną przez sekwencję kodującą regionu rdzenia): aminokwasy 1-69 dysmutazy ponadtlenkowej (cięty SOD, używany do zwiększenia ekspresji rekombinacji białka); aminokwasy 303-320 poliproteiny z regionu E1; aminokwasy 390 do 410 poliproteiny reprezentującej sekwencje zgodne dla hiperzmiennych regionów HCV-1a E2; aminokwasy 384 do 414 poliproteiny z regionu E2, reprezentującej sekwencje zgodne dla hiperzmiennych regionów E2 HCV-1 i HCV-2; aminokwasy 1211-1457 poliproteiny HCV-1, która definiuje helikazę; trzy kopie epitopu z 5-1-1, aminokwasy 1689-1735, jeden z HCV-1, jeden z HCV-3 i jeden z HCV-2, które to kopie są ekwiwalentnymi determinantami antygenowymi z trzech różnych wirusowych szczepów HCV; polipeptyd HCV c100 z HCV-1, aminokwasy 1901-1936 poliproteiny; dwie dokładne kopie epitopu z regionu NS5 z HCV-1, każdy z aminokwasami 2278 do 2313 poliproteiny HCV; i dwie kopie z trzech epitopów z regionu rdzenia, dwie z HCV-1 i jednej z HCV-2, które to kopie są ekwiwalentnymi determinantami antygenowymi reprezentowanymi przez aminokwasy 9 do 53 i 64-88 z HCV-1 i 67-84 z HCV-2.

Tabela 2 pokazuje tutaj pozycje aminokwasów różnych epitopów w MEFA 12 w odniesieniu do rysunków 6A do 6F (SEQ ID NOS: 3 i 4). Numeracja w tabelach jest odpowiednia do HCV-1. Patrz, Choo i wsp., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 451-2455. MEFAs 13 i 13.1 dzielą również ogólny wzór wyszczególniony powyżej dla MEFA 12, z modyfikacjami wykazanymi odpowiednio w tabelach 3 i 4.

T a b e l a 2. MEFA 12

Mefa aa#	Miejsce końca 5'	Epitop	hcv aa#	Szczep
1-69	Ncol	Cięty hSOD
72-89	Mlul	E1	303-320	1
92-112	Hindlll	E2 HVR1a konsensus	390-410	1
113-143		E2 HVR1+2 konsensus	384-414	1,2
146-392	Spel	C33C krótki	1211-1457	1
395-441	SphI	5-1-1	1689-1735	1
444-490	Nrul	5-1-1	1689-1735	3
493-539	Clal	5-1-1	1689-1735	2
542-577	Aval	C100	1901-1936	1
580-615	Xbal	NS5	2278-2313	1
618-653	Bglll	NS5	2278-2313	1
654-741	Ncol	epitopy rdzenia	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
742-829	Ball	epitopy rdzenia	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2

PL 209 710 B1

T a b e l a 3. MEFA 13

mefa aa#	Miejsce końca 5'	Epitop	hcv aa#	Szczep
1-156	Ncol	Zmutowany hSOD(aa7072,ALA)
161-178	Mlul	E1	303-320	1
181-201	Hindlll	E2 HVR1a konsensus	390-410	1
202-232		E2 HVR1+2 konsensus	384-414	1, 2
235-451		C33C krótki	1211-1457	1
454-500	Hindlll	5-1-1 Plmut*	1689-1735	1
503-549	Nrul	5-1-1 Plmut*	1689-1735	3
552-598	Clal	5-1-1 Plmut*	1689-1735	2
601-636	Aval	C100	1901-1936	1
639-674	Xbal	NS5	2278-2313	1
677-712	Bglll	NS5	2278-2313	1
713-800		Epitopy rdzenia	9-53, R47L 64-88,67-84	1 1, 2
801-888		Epitopy rdzenia	9-53, R47L 64-88, 67-84	1 1, 2

* Epitopy 5-1-1 są modyfikowane przez eliminację możliwych miejsc cięcia (CS lub CA) atakowane przez białko rekombinacyjne NS3/4a. Zamiast CS lub CA, sekwencja została zmieniona na PI.

T a b e l a 4. MEFA 13.1

mefa aa#	Miejsce końca 5'	Epitop	hcv aa#	Szczep
1-86	Ncol	Zmutowany hSOD(aa7072,ALA)
89-106	Mlul	E1	303-320	1
109-129	Hindlll	E2 HVR1a konsensus	390-410	1
130-160		E2 HVR1+2 konsensus	384-414	1, 2
163-379		C33C krótki	1211-1457	1
382-428	Hindlll	5-1-1 Plmut*	1689-1735	1
431-477	Nrul	5-1-1 Plmut*	1689-1735	3
480-526	Clal	5-1-1 Plmut*	1689-1735	2
529-564	Aval	C100	1901-1936	1
567-602	Xbal	NS5	2278-2313	1
605-640	Bglll	NS5	2278-2313	1
641-728		Epitopy rdzenia	9-53,R47L 64-88,67-84	1 1, 2
729-816		Epitopy rdzenia	9-53,R47L 64-88,67-84	1 1, 2

Epitopy 5-1-1 są modyfikowane przez eliminację możliwych miejsc cięcia (CS lub CA) atakowane przez białko rekombinacyjne NS3/4a. Zamiast CS lub CA, sekwencja została zmieniona na PI.

PL 209 710 B1

Sekwencja DNA i odpowiadająca sekwencja aminokwasów innego reprezentatywnego wieloepitopowego antygenu fuzyjnego MEFA 7.1 jest pokazana na rysunkach 8A do 8F (SEQ ID NOS: 5 i 6). Ogólny wzór strukturalny dla MEFA 7.1 jest pokazany na rysunku 7 i jest jak następuje: hSOD-E1(typ 1)E2 HVR konsensus(typ 1a)-E2 HVR konsensus(typy 1 i 2)-helikaza(typ 1)-5-1-1(typ 1)-5-1-1(typ 3)-5-1-1(typ 2)-c100(typ 1)-NS5(typ 1)-NS5(typ 1)-rdzeń(typy 1+2)-rdzeń(typy 1+2). Ten epitop o wielu kopiach obejmuje następującą sekwencję aminokwasów numerowaną odpowiednio do HCV-1 (numeracja aminokwasów przytoczona poniżej wynika z opisu dostarczonego w Choo i wsp., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455, w którym aminokwas #1 jest pierwszą metioniną zakodowaną przez sekwencję kodującą regionu rdzenia): aminokwasy 1-156 dysmutazy ponadtlenkowej (SOD, używany do zwiększenia ekspresji zrekombinowanego białka); aminokwasy 303-320 poliproteiny z regionu E1; aminokwasy 390 do 410 poliproteiny reprezentującej sekwencje konsensusowe dla hiperzmiennego regionu HCV-1a E2; aminokwasy 384 do 414 poliproteiny z regionu E2, reprezentującej sekwencję konsensusową dla hiperzmiennych regionów E2 HCV-1 i HCV-2; aminokwasów 1193-1658 poliproteiny HCV-1, która definiuje helikazę; trzy kopie epitopu z 5-1-1, aminokwasy 1689-1735, jeden z HCV-1, jeden z HCV-3 i jeden z HCV-2, które to kopie są ekwiwalentnymi determinantami antygenowymi z trzech różnych wirusowych szczepów HCV; polipeptyd HCV c100 HCV-1, aminokwasy 1901-1936 poliproteiny; dwie dokładne kopie epitopu z regionu NS5 HCV-1, każda z aminokwasami 2278 do 2313 poliproteiny HCV; i dwie kopie epitopu z regionu rdzenia jedna z HCV-1 i jedna z HCV-2, które to kopie są ekwiwalentnymi antygenowymi determinantami reprezentowanymi przez aminokwasy 9 do 32, 39-42 i 64-88 z HCV-1 i 67-84 z HCV-2.

Tabela 5 pokazuje pozycje aminokwasów różnych epitopów w odniesieniu do rysunków 8A do 8F (SEQ ID NOS: 5 i 6).

T a b e l a 5. MEFA 7.1

mefa aa#	Miejsce końca 5'	Epitop	hcv aa#	Szczep
1-156	Ncol	hSOD
159-176	EcoRl	E1	303-320	1
179-199	Hindlll	E2 HVR1a konsensus	390-410	1
200-230		E2 HVR1+2 konsensus	384-414	1 + 2
231-696	Sall	Helikaza	1193-1658	1
699-745	Sphl	5-1-1	1689-1735	1
748-794	Nrul	5-1-1	1689-1735	3
797-843	Clal	5-1-1	1689-1735	2
846-881	Aval	C100	1901-1936	1
884-919	Xbal	NS5	2278-2313	1
922-957	Bglll	NS5	2278-2313	1
958-1028	Ncol	epitopy rdzenia	9-32, 39-42 64-88, 67-84	1 1,2
1029-1099	Ball	epitopy rdzenia	9-32, 39-42 64-88, 67-84	1 1,2

W jednej z postaci testu, próbka jest łączona z podłożem stałym, jak opisano poniżej. Podłoże stałe obejmuje albo wyizolowany antygen HCV, taki jak jeden lub więcej konformacyjnych epitopów NS3/4a, lub MEFA opisany powyżej, MEFA obejmujący jeden lub więcej epitopów pochodzących z tego samego regionu poliproteiny co antygen HCV, taki jak z regionu NS3/4a. Jak wyjaśniono powyżej, znanych jest wiele antygenów obejmujących takie epitopy, obejmując, ale nie ograniczając do, antygeny pochodzące z regionów c33c i c100, jak również białka fuzyjne zawierające epitop NS3, taki jak c25 i antygenową determinantę znaną jako 5-1-1, która jest częściowo w obrębie regionu NS4a

PL 209 710 B1 (patrz rysunek 1). Te i inne epitopy NS3/4a są użyteczne w niniejszych testach i są znane w tej dziedzinie i opisane w np., Houghton i wsp., U.S. Patent nr 5 350 671; Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien i wsp., Publikacja Międzynarodowa nr WO 93/00365; Chien, D.Y., Publikacja Międzynarodowa nr WO 94/01778; i U.S. Patent nr. 6 346 375 i 6 150 087. Jeśli próbka jest zainfekowana HCV, przeciwciała HCV przeciw epitopowi obecnemu na podłożu stałym zwiążą się ze składnikami podłoża stałego. Dający się wykryć znakowany antygen, który również reaguje z wychwyconym przeciwciałem HCV z biologicznej próbki, jest również dodawany w fazie ciekłej. Na przykład, jeśli antygenem związanym z podłożem stałym jest konformacyjny epitop NS3/4a, dającym się wykryć, znakowanym antygenem użytym w fazie ciekłej jest MEFA, który zawiera epitop NS3/4a. Jeśli antygenem związanym z podłożem stałym jest MEFA, który zawiera epitop NS3/4a, dający się wykryć, znakowany antygen użyty w fazie ciekłej zawiera konformacyjny epitop NS3/4a.

Reprezentatywny test, przeprowadzany sposobem według wynalazku, jest przedstawiony na rysunku 2. Jak pokazano na rysunku, podłoże stałe zawiera epitop konformacyjny NS3/4a. Biologiczna próbka jest dodawana do stałego podłoża. Przeciwciała HCV skierowane przeciwko epitopowi NS3/4a, obecnemu w próbce, zwiążą konformacyjny epitop na podłożu stałym. Następnie jest dodawany znakowany peroksydazą chrzanową (HRP) MEFA 12 zawierający epitop, do którego wiąże się przeciwciało próbki. MEFA 12 wiąże przeciwciało, które jest również związane przez konformacyjny epitop NS3/4a. Niezwiązane składniki zostają wymyte i detekcja znakowania wykazuje obecność infekcji HCV.

Powyżej opisane testy warstwowe antygen/przeciwciało/antygen, są szczególnie korzystne, ponieważ użycie dwóch antygenów, które wiążą przeciwciało próbki, pozwala na stosowanie większych objętości próbki. Dodatkowo, test może być przeprowadzony szybko.

Wytwarzanie antygenów do stosowania ich w testach immunologicznych HCV.

Jak wyjaśniono powyżej, cząsteczki opisane w niniejszym wynalazku na ogół są wytwarzane przez rekombinację. Dlatego polinukleotydy kodujące antygeny HCV dla stosowania w niniejszym wynalazku mogą być wytworzone przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Na przykład, sekwencje polinukleotydów kodujące dla powyżej opisanych cząsteczek, mogą być otrzymane przy użyciu metod rekombinacji takich, jak: skrining bibliotek cDNA i genomowych pochodzących z komórek, w których zachodzi ekspresja genu, lub przez otrzymywanie genu z wektora, o którym wiadomo, że go zawiera. Co więcej, pożądany gen może być wyizolowany bezpośrednio z wirusowych cząsteczek kwasów nukleinowych, przy użyciu technik opisanych w tej dziedzinie, tak jak Houghton i wsp., U.S. Patent nr 5 350 671. Gen będący przedmiotem zainteresowania może być raczej także wytworzony syntetycznie, niż przez klonowanie. Dla poszczególnej sekwencji, cząsteczki mogą być zaprojektowane z właściwymi kodonami. Kompletna sekwencja jest następnie składana z zachodzących nukleotydów przygotowanych standardowymi metodami i złożona w kompletną sekwencję kodującą. Patrz, np., Edge (1981) Nature 292:756; Nambair i wsp., (1984) Science 223:1299; i Jay i wsp., (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Dlatego poszczególne sekwencje nukleotydów mogą być otrzymane z wektorów posiadających pożądaną sekwencję, lub syntetyzowane, tam gdzie to właściwe, całkowicie lub częściowo, przy użyciu różnorodnych technik syntezy nukleotydów znanych w tej dziedzinie, takich jak punktowa mutageneza ukierunkowana i techniki łańcuchowej reakcji z polimerazą (PCR). Patrz, np., Sambrook, powyżej. W szczególności, jedną z metod otrzymywania sekwencji nukleotydów kodujących pożądane sekwencje jest przyłączanie komplementarnych zestawów zachodzących na siebie syntetycznych oligonukleotydów wytworzonych w konwencjonalnym, zautomatyzowanym syntetyzerze polinukleotydów, a następnie ligacja z odpowiednią ligazą DNA i amplifikacja zligowanej sekwencji nukleotydów przez via PCR. Patrz, np., Jayaraman i wsp., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4084-4088. Dodatkowo, bezpośrednia synteza oligonukleotydów (Jones i wsp., (1986) Nature 54:75-82), oligonukleotydowa mutageneza ukierunkowana regionów nukleotydów poprzednio istniejących (Reichmann i wsp., (1988) Nature 332:323-327 i Verhoyen i wsp., (1988) Science 239:1534-1536), i używając polimerazy T₄DNA enzymatyczne wypełnienie przerwanych oligonukleotydów (Qeen i wsp., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033) może być użyte w wynalazku w celu dostarczenia cząsteczek o zmienionych lub wzmocnionych zdolnościach wiązania antygenu i/lub zredukowanej immunogenowości.

Gdy raz sekwencje kodujące zostały przygotowane lub wyizolowane, takie sekwencje mogą być klonowane w każdy odpowiedni wektor lub replikon. Doświadczonym w tej dziedzinie znane są liczne wektory do klonowania i selekcja właściwego wektora do klonowania jest kwestią wyboru. Właściwe

PL 209 710 B1 wektory obejmują, ale nie są do nich ograniczone, plazmidy, fagi, transpozony, kosmidy, chromosomy lub wirusy które są zdolne do replikacji, jeśli się połączą z właściwymi elementami kontrolnymi.

Sekwencja kodująca jest następnie umieszczana pod kontrolą odpowiednich elementów kontrolujących, zależnie od systemu używanego do ekspresji. Tak więc sekwencja kodująca może być umieszczona pod kontrolą promotora, miejsca wiązania rybosomów (dla ekspresji bakteryjnej) i opcjonalnie, operatora, tak że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania jest transkrybowana na RNA przez właściwy transformant. Sekwencja kodująca może zawierać, lub może nie zawierać peptydu sygnałowego lub sekwencji wiodącej, która później może być usunięta przez gospodarza w procesie posttranslacyjnej obróbki. Patrz, np., U.S. Patent nr, nr 4 431 739; 4 425 437; 4 338 397.

W dodatku może być pożądane dodania do sekwencji kontrolnych sekwencji regulatorowych, które pozwalają na regulowanie ekspresji sekwencji odpowiednio do wzrostu komórki gospodarza. Doświadczonym w tej dziedzinie znane są sekwencje regulatorowe i przykłady obejmują te, które powodują, że ekspresja genu jest włączana i wyłączana w odpowiedzi na chemiczny lub fizyczny bodziec, włączając w to obecność składnika regulatorowego. Inne typy elementów regulatorowych również mogą być obecne w wektorze. Na przykład, elementy enhanserowe mogą być używane tutaj do zwiększenia poziomów ekspresji konstruktów. Przykłady obejmują enhanser wczesnego genu SV40 (Dijkema i wsp., (1985) EMBO J. 4:761), enhanser/promotor pochodzący z długiego końcowego powtórzenia (LTR) wirusa mięsaka Rousa (Gorman i wsp., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777) i elementy pochodzące z ludzkiego CMV (Boshart i wsp., (1985) Cell 42:521), takie jak elementy obejmujące sekwencję CMV intronu A (U.S. Patent nr 5 688 688). Ekspresja kasetowa może dalej obejmować początek replikacji dla autonomicznej replikacji we właściwej komórce gospodarza, jeden lub więcej markerów pozwalających na selekcję, jedno lub więcej miejsc restrykcyjnych, potencjał dla dużej liczby kopii i silny promotor.

Wektor ekspresyjny jest tak skonstruowany, że określona sekwencja kodująca jest umieszczona w wektorze z odpowiednimi sekwencjami regulatorowymi, o takim umiejscowieniu i orientacji sekwencji kodującej w odniesieniu do sekwencji kontrolnej, że kodująca sekwencja jest transkrybowana pod „kontrolą" sekwencji kontrolnej (tj. polimerazą RNA powoduje transkrypcję sekwencji kodującej, wiążąc się z cząsteczką DNA w sekwencji kontrolnej). Modyfikacja sekwencji kodującej cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania może być pożądana, by doprowadzić to do celu. Na przykład, w niektórych przypadkach może być konieczne zmodyfikowanie sekwencji tak, że będzie mogła być przyłączona do sekwencji kontrolnej z odpowiednią orientacją; tj., żeby zachować ramkę odczytu. Sekwencje kontrolne i inne sekwencje regulatorowe mogą być zligowane z sekwencjami kodującymi przed wstawieniem do wektora. Alternatywnie, sekwencja kodująca może być klonowana bezpośrednio do wektora ekspresyjnego, który już zawiera sekwencje kontrolne i właściwe miejsce restrykcyjne.

Jak wyjaśniono powyżej, może być również pożądane wytworzenie mutantów lub analogów antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Jest to szczególnie prawdziwe dla NS3/4a. Metody takiego wytwarzania są opisane w Dasmahapatra i wsp., U.S. Patent nr 5 843 752 i Zhang i wsp., U.S. Patent nr 5 990 276. Mutanty lub analogi tego i innych białek HCV do stosowania w będących przedmiotem badania testach mogą być przygotowane przez delecję części sekwencji kodującej polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania, przez wstawienie sekwencji i/lub podstawienie jednego lub więcej nukleotydów w obrębie sekwencji. Techniki modyfikacji sekwencji nukleotydów, takie jak punktowa mutageneza ukierunkowana i jej podobne są dobrze znane biegłym w tej dziedzinie. Patrz, np., Sambrook i wsp., powyżej; Kundel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselorder i wsp., (1987) Bio Techniques Zoller i Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarland i wsp., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409.

Ekspresja cząsteczek może zachodzić w szerokim zakresie różnych systemów, obejmując systemy ekspresji owadów, ssaków, bakterii, wirusów i drożdży, wszystkie dobrze znane w tej dziedzinie.

Na przykład, systemy ekspresji komórek owadów, takie jak systemy baculowirus, są znane biegłym w tej dziedzinie i opisane w, np., Summers i Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin nr 1555 (1987). Materiały i metody dla systemów ekspresji komórkowej baculowirus/owad są komercyjnie dostępne w postaci zestawu od między innymi, Invitrogen, San Diego CA (zestaw „MaxBac"). Podobnie, systemy ekspresji komórkowej bakterii i ssaków są również znane w tej dziedzinie i opisane w, np., Sambrook i wsp., powyżej. Systemy ekspresji drożdży również są znane w tej dziedzinie i opisane w, np., Yeast Genetic Engineering (Barr i wsp., eds., 1989) Butterworths, London.

Są również znane liczne właściwe komórki gospodarza do stosowania z powyższymi systemami. Na przykład, linie komórkowe ssaków są znane w tej dziedzinie i obejmują unieśmiertelnione linie

PL 209 710 B1 komórkowe dostępne w American Type Culture Collection (ATCC), takie jak, ale nie ograniczone do, komórek jajników chomika chińskiego (CHO), komórek Hela, komórek nerek niemowląt chomiczych (BHK), komórek nerek małpy (COS), ludzkich embrionalnych komórek nerek, ludzkich komórek raka wątrobowe komórkowego (np., Hep G2), komórek nerek wołowych Madin-Darby, („MDBK"), jak również innych. Podobnie, bakteryjni gospodarze tacy jak E.coli, Bacillus subtilis i Streptococcus spp, znajdą zastosowanie w niniejszych konstruktach ekspresyjnych. Do drożdży, które jako gospodarze znajdą zastosowanie w niniejszym wynalazku zalicza się, między innymi: Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans.

Candida maltoza, Hansenula, polymorpha, Kluyveromyces fragilis Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe i Yarrovia lipolytica. Komórki owadów stosowane z wektorami ekspresyjnymi baculowirusa obejmują, między innymi: Aedes Aegypti, Autographa californica, Bombyx Mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda i Trichoplusiani.

Cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające sekwencje nukleotydów będące przedmiotem zainteresowania mogą być trwale włączone do genomu komórki gospodarza lub utrzymywane w stabilnym elemencie episomalnym w odpowiedniej komórce gospodarza przy użyciu różnych technik dostarczania genu dobrze znanych w tej dziedzinie. Patrz, np., U.S. Patent nr 5 399 346.

Zależnie od systemu ekspresji i wybranego gospodarza, cząsteczki są wytwarzane przez wzrastające komórki gospodarza transformowane przez wektor ekspresyjny opisany powyżej, w warunkach, w których białko ulega ekspresji. Powstałe w drodze ekspresji białko jest następnie izolowane z komórek gospodarza i oczyszczane. Jeśli system ekspresji wydziela białko do pożywek wzrostu, produkt może być oczyszczony bezpośrednio z pożywek. Jeśli nie jest wydzielony, może być wyizolowany z lizatów komórki. Wybór odpowiednich warunków wzrostu i metod pozyskiwania mieści się w ramach umiejętności w tej dziedzinie.

Produkcja rekombinantów różnych antygenów HCV została opisana. Patrz, np., Houghton i wsp., U.S. Patent nr 5 350 671; Chien i wsp., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien i wsp., International Publication nr WO 93/00365; Chien, D.Y., International Publication nr WO 94/01778.

Testy immunodiagnostyczne

Po wytworzeniu, powyższe antygeny HCV są umieszczane na odpowiednim podłożu stałym do zastosowania w będących przedmiotem badania testach immunologicznych. Podłożem stałym, dla celu niniejszego wynalazku, może być każdy materiał, który jest nierozpuszczalną matrycą i może mieć sztywną lub półsztywną powierzchnię. Przykładowe podłoże stałe obejmuje, ale nie jest do niego ograniczone, substraty takie jak nitroceluloza (np., w formie membrany lub studzienki mikrotitracyjnej) polichlorek winylu (np., arkusze lub studzienka mikrotitracyjna); lateks polistyrenowy (np., perełki lub płytki mikrotitracyjne); fluorek poliwinylidynowy; bibuła diazowana; membrany nylonowe; perełki aktywowane; perełki reagujące magnetycznie i tym podobne. Szczególne podłoże obejmuje płytki, pastylki, krążki, kapilary, włókna dmuchane, igły, szpilki, włókna pełne, perełki celulozowe, szkło porowate, żele krzemionkowe, perełki polistyrenowe opcjonalnie usieciowane dwuwinylobenzenem, perełki szczepione kopolimerem, perełki poliakrylamidowe, perełki lateksowe, perełki dimetyloakrylamidowe, opcjonalnie usieciowane N-N'-bis-akryloetylenodiaminą i cząstki szkła pokryte polimerem hydrofobowym.

Jeśli jest to pożądane, cząsteczki, które mają być dodane do podłoża stałego mogą łatwo zostać utworzone grupy funkcyjne w celu tworzenia fragmentu cząsteczki styrenu lub akrylanu, umożliwiając w ten sposób włączenie cząsteczek do polistyrenu, poliakrylanu lub innego polimeru takiego jak poliimid, poliakrylamid, polietylen, poliwinyl, polidiacetylen, polifenylen-vinylen, polipeptyd, polisacharyd, polisulfon, polipyrrol, poliimidazol, politiofen, polieter, epoksydy, szkło krzemionkowe, żel krzemionkowy, siloksan, polifosforan, hydrożel, agaroza, celuloza i podobne.

W jednym kontekście, podłoże stałe na początku reaguje albo z wyizolowanym antygenem HCV, albo z MEFA (zwanym tutaj „składnikiem podłoża stałego"), w warunkach odpowiednich dla wiązania, takich, że cząsteczki są wystarczająco unieruchomione przez podłoże. Czasami unieruchomienie przez podłoże może być wzmocnione przez sprzęganie najpierw antygenu z białkiem o lepszych własnościach wiązania z podłożem stałym. Odpowiednie białka sprzęgające obejmują, ale nie są do nich ograniczone, makrocząsteczki takie jak albuminy surowicy, obejmując albuminę surowicy wołowej (BSA), hemocjaninę skałoczepu morskiego, cząsteczki immunoglobuliny, tyroglobulinę, albuminę jaja kurzego i inne białka dobrze znane biegłym w tej dziedzinie. Inne odczynniki, które mogą być stosowane do wiązania cząsteczek z podłożem obejmują polisacharydy, kwasy polimlekowe, kwasy poliglikolowe, polimery aminokwasów, kopolimery aminokwasów i im podobne. Takie cząsteczPL 209 710 B1 ki i metody sprzęgania tych cząsteczek z antygenami są dobrze znane posiadającym podstawowe umiejętności w tej dziedzinie. Patrz, np., Brinkley, M.A. (1992) Bioconjugate Chem. 3:2-13; Hashida i wsp., (1984) J. Appl. Biochem. 6:56-63; i Anjaneyulu i Staros (1987) International J, of Peptide and Protein Res. 30:117-124.

Po reakcji podłoża stałego ze składnikami fazy stałej, wszystkie nie unieruchomione składniki stałej fazy są usuwane z podłoża przez wymywanie i związane z podłożem składniki są następnie kontaktowane z biologiczną próbką podejrzaną o to, że zawiera przeciwciała HCV (zwane tutaj „cząsteczkami ligandów") w warunkach odpowiednich dla wiązania. Po przemyciu w celu usunięcia wszystkich niezwiązanych cząsteczek ligandów, w warunkach odpowiednich dla wiązania, dodawany jest drugi antygen HCV (albo wyizolowany antygen HCV, albo MEFA, zależnie, który antygen jest związany z podłożem stałym). Ten drugi antygen jest nazywany tutaj „składnikiem fazy ciekłej". Dodany antygen zawiera dający się wykryć znacznik, jak opisano powyżej, i wiąże cząsteczki ligandu, które przereagowały z antygenem związanym z podłożem. Tak więc, cząsteczki ligandu wiążą zarówno składnik podłoża stałego, jak również składnik fazy ciekłej. Niezwiązane cząsteczki ligandu i składniki fazy ciekłej są usuwane przez wymywanie. Zatem obecność znakowania wskazuje na obecność przeciwciał HCV w biologicznej próbce.

Bardziej szczegółowo można zastosować metodę ELISA, w której studzienki w płytce mikrotitracyjnej są pokryte składnikami fazy stałej. Następnie do pokrytych dołków jest dodawana próbka biologiczna zawierająca lub podejrzana o zawieranie cząsteczki ligandu. Po czasie inkubacji wystarczającym do związania cząsteczki ligandu do unieruchomionego podłoża fazy stałej, płytka (i) może być przemyta, żeby usunąć niezwiązane cząsteczki i dodawany jest dający się wykryć, znakowany składnik fazy ciekłej. Tym cząsteczkom zezwala się na reagowanie z każdą wychwyconą próbką przeciwciała. Płytkę przemywano i obecność znakowania wykrywano metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie.

Powyżej opisane odczynniki testu, zawierające podłoże stałe immunologicznego testu ze związanymi antygenami, jak również antygeny do reagowania z wychwyconą próbką, mogą być dostarczane w zestawach z odpowiednimi instrukcjami i innymi niezbędnymi odczynnikami, w celu przeprowadzenia immunologicznego testu, jaki opisano powyżej. Zestaw może także zawierać, zależnie od tego, który szczególny test immunologiczny jest stosowany, odpowiednie znaczniki i inne włączone odczynniki i materiały (bufory do przemywania i podobne). Przy użyciu tych zestawów mogą być wykonywane standardowe testy immunologiczne, takie jak te opisane powyżej.

III. Część doświadczalna

Poniżej są przykłady specyficznych postaci dla przeprowadzenia niniejszego wynalazku. Przykłady są podane tylko w celach objaśniających i nie jest zamierzone jakiekolwiek ograniczanie zakresu niniejszego wynalazku.

Dołożono starań, by zapewnić dokładność w odniesieniu do stosowanych wartości (np., ilości, temperatury itd.), lecz oczywiście należy dopuścić istnienie pewnych błędów doświadczalnych i odchyleń.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie konformacyjnego epitopu NS3/4a z podstawieniem Thr do Pro i Ser do Ile

Epitop konformacyjny NS3/4a został otrzymany jak następuje. Epitop ten posiada sekwencję wyszczególnioną na rysunkach 3A do 3D (SEQ ID NOS:1 i 2) i różni się od natywnej sekwencji w pozycjach 403 (aminokwas 1428 pełnej długości sekwencji HCV-1) i 404 (aminokwas 1429 pełnej długości sekwencji HCV-1). Specyficznie, Thr normalnie występując w pozycji 1428 natywnej sekwencji została zmutowana do Pro, a Ser, która występuje na pozycji 1429 natywnej sekwencji została zmutowana do Ile.

W szczególności, stosowanym drożdżowym wektorem ekspresyjnym drożdży był pBS24.1. Ten wektor ekspresyjny drożdży zawiera sekwencje 2 μ i odwrócone powtórzenia (IR) dla autonomicznej replikacji w drożdżach, α-czynnikowy terminator do zapewnienia zakończenia transkrypcji i drożdżowe leu2-d i URA3 do selekcji. Początek replikacji Co1E1 i gen β-laktamazy również są obecne do propagacji i selekcji w E. coli (Pichuantes i wsp., (1996) „Expression of Heterologous Gene Products in Yeast". In: Protein Engineering: A Guide to Design and Production, Chapter 5. J.L. Cleland 1 C. Craik, eds., Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. pp. 129-161.

Plazmid pd.hcv1a.ns3ns4aPI, który koduje reprezentatywny epitop NS3/4a używany w będących przedmiotem badań testach immunologicznych, został wytworzony jak następuje. Stosowano dwustopniową procedurę. Najpierw następujące kawałki DNA zostały zligowane razem: (a) syntetycz22

PL 209 710 B1 ne oligonukleotydy, które dostarczałyby miejsca klonowania 5'HindIII, za którym następuje sekwencja ACAAAACAAA (SEQ ID NO:8), inicjator ATG i kodony dla HCV1a, rozpoczynając od aminokwasu 1027 i kontynuując do miejsca Bgll przy aminokwasie 1046; (b) fragment restrykcyjny Bgll-Clal wielkości 683 bp (kodujący aminokwasy 1046-1274) z pAcHLTns3ns4aPI; i (c) wektor pSP72 (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Accesion Number X65332), który był trawiony Hindlll i Clal, defosforylowany i oczyszczany na żelu. Plazmid pAcHLTns3ns4aPI pochodził z pAcHLT, wektor ekspresyjny bakulowirusa dostępny komercyjnie z BD Pharmingen (San Diego, CA). W szczególności, wektor pAcHLT EcoRI-Pstl został przygotowany, jak również następujące fragmenty: EcoRI-Alwnl, wielkości 935 bp, odpowiadające aminokwasom 1027-1336 genomu HCV-1; Alwnl-SacII, wielkości 247 bp, odpowiadający aminokwasom 1336-1419 genomu HCV-1; Hinfl-Bgll, wielkości 175 bp odpowiadający aminokwasom 1449-1509 genomu HCV-1; Bgll-Pstl, wielkości 619 bp, odpowiadający aminokwasom 1510-1711 genomu HCV-1, plus kodon terminacji transkrypcji. Syntetycznie otrzymywany fragment SacII-Hinfl wielkości 91 bp, odpowiadający aminokwasom 1420-1448 genomu HCV-1 i zawierający mutacje PI (Thr-1428 zmutowana do Pro, Ser-1429 zmutowana do Ile), był ligowany z fragmentem Hinfl-Bgll wielkości 175 bp i fragment Bgll-Pstl wielkości 619 bp, opisany powyżej i subklonowany w wektor pGEM-5Zf(+) trawiony SacII i Pstl. pGEM-5Zf(+) jest komercyjnie dostępnym wektorem E. coli (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Accesion Number X65308). Po transformacji kompetentnych komórek HB 101, miniskriningu poszczególnych klonów i weryfikacji sekwencji, fragment SacII-Pstl wielkości 885 bp z klonu 2 pGEM5.PI był oczyszczony na żelu. Ten fragment był ligowany z fragmentem EcoRI-Alwnl, wielkości 935 bp, fragmentem Alwnl-SacII, wielkości 247 bp i wektorem pAcHLT EcoRI-Pstl, opisanymi powyżej. Powstały konstrukt został nazwany pAcHLTns3ns4aPI.

Powyższa mieszanina ligacyjna była transformowana do kompetentnych komórek HB 101 i umieszczona na agarowych płytkach Luria zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Analizy miniprep poszczególnych klonów prowadzą do identyfikacji przypuszczalnie pozytywnych klonów, z których dwa były amplifikowane. DNA plazmidowe dla pSP721aHC, klony#1 i #2 były przygotowane przy użyciu zestawu Qiagen Maxiprep i były sekwencjonowane.

Następnie, następujące fragmenty były ligowane razem:

(a) fragment Hindlll-Clal, wielkości 761 bp z pSP721aHC#1(pSP72.1aHC był wytworzony przez ligowanie razem następujących: pSP72, który był trawiony Hindlll i Clal, syntetycznych oligonukleotydów, które dostarczałyby miejsca klonowania dla 5'Hindlll, po czym następuje sekwencja ACAAAACAAA (SEQ ID NO:8), kodon inicjacji ATG i kodony dla HCV1a, rozpoczynając od aminokwasu 1027 i kontynuując do miejsca Bglll w aminokwasie 1046 i fragment restrykcyjny Bglll-Clal wielkości 683 bp (kodujący aminokwasy 1046-1274) z pAcHLTns3ns4aPI); (b) fragment BamHI-HlndlII wielkości 1353 bp dla hybrydowego promotora drożdży ADH2/GAPDH; (c) fragment Clal-Sall, wielkości 1320 bp (kodujący aminokwasy 1046-1711 HCV1a z Thr 1428 zmutowaną do Pro i Ser 1429 zmutowaną do Ile) z pAcHLTns3ns4aPI; i (d) wektor ekspresyjny drożdży pBS24.1, który był trawiony BamHI i Sall, defosforylowany i oczyszczony na żelu. Mieszanina ligacyjna była transformowana do kompetentnego HB100, umieszczona na płytkach z agarem Luria zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Analizy minipreparacyjne poszczególnych kolonii prowadzą do identyfikacji klonów z oczekiwaną wstawką BamHISall wielkości 3446 bp, która zawiera promotor ADH2/GAPDH, kodon inicjacji ATG i HCV1aNS3/4a z aminokwasów 1027-1711 (pokazane jako aminokwasy 1-686 na rysunkach 3A-3D), z Thr 1428 (pozycja aminokwasu 403 na rysunkach 3A-3D) zmutowaną do Pro i Ser 1429 (pozycja aminokwasu 404 na rysunkach 3A-3D) zmutowaną do Ile. Konstrukt został nazwany pd.HCV1a.ns3ns4aPI (patrz rysunek 4).

Szczep AD3 S. cerevisiae został transformowany z pd.HCV1a.ns3ns4aPI i pojedyncze transformanty zostały sprawdzone, czy wykazują ekspresję po wyczerpaniu glukozy w pożywce. Białko rekombinacyjne ulegało ekspresji na wysokim poziomie w drożdżach, jak wykryto barwieniem Coomassie blue i potwierdzono analizą immunoblot stosując przeciwciało poliklonalne dla domeny helikazy NS3.

P r z y k ł a d 2

Oczyszczanie konformacyjnego epitopu NS3/4a

Konformacyjny epitop NS3/4a był oczyszczany jak następuje. Komórki S. cerevisiae otrzymane powyżej, wykazujące ekspresję epitopu NS3/4a były zbierane jak opisano powyżej. Komórki były zawieszane w buforze lizującym (50 mM Tris PH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mJM PMSF, 0,1 μM pepstatyny, 0,1 μM leupeptyny) i lizowane w Dyno-Mlll (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Switzerland) lub w ekwiwalentnym przyrządzie używając perełek szklanych, w stosunku 1:1:1 komórki:bufor:

PL 209 710 B1

0,5 mm perełki szklane. Lizat był odwirowywany przy 30100 x g przez 30 min w 4°C i do buforu płuczącego został dodany osad zawierający nierozpuszczalną frakcję białka (6 ml/g wyjściowego osadu komórek) i wytrząsany w temperaturze pokojowej przez 15 min. Bufor płuczący składał się z 50 mM NaPO₄ pH 8,0, 0,3 M NaCl, 5 mM β-merkaptoetanolu, 10% glicerolu, 0,05% oktylo glukozydu, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μM pepstatyny, 1 μM leupeptyny. Resztki komórkowe były usuwane przez wirowanie przy 30100 x g przez 30 min w 4°C. Supernatant został odrzucony, a osad zachowany.

Białko zostało wyekstrahowane z osadu jak następuje. Dodano 6 ml/g buforu ekstrakcyjnego i wytrząsano w temperaturze pokojowej przez 15 min. Bufor ekstrakcyjny składał się z 50 mM Tris pH 8,0, 1 M NaCl, 5 mM β-merkaptoetanolu, 10% glicerolu, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μM pepstatyny, 1 μM leupeptyny. To odwirowano przy 30100 x g przez 30 min w 4°C. Supernatant został zachowany i dodano siarczanu amonu do uzyskania roztworu 17,5% stosując następujące równanie: objętość supernatantu (ml) pomnożona przez x% siarczanu amonu/(1-x%siarczanu amonu)=ml 4/1 M nasyconego siarczanu amonu do dodania do supernatantu. Siarczan amonu dodawano po kropli w trakcie mieszania na lodzie i roztwór był mieszany na lodzie przez 10 min. Roztwór odwirowano przy 17700 x g przez 30 min w 4°C i osad przechowano i magazynowano w 2°C do 8°C do 48 godz.

Osad został ponownie zawieszony i puszczany na kolumnie Poly U (Poly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) przy 4°C jak następuje. Osad został ponownie zawieszony w 6 ml buforu równoważącego Poly U na gram osadu. Bufor równoważący składał się z 25 mM HEPES pH 8,0, 200 mM NaCl, 5 mM DTT (świeżo dodawanego), 10% glicerolu, 1,2 oktylo glukozydu. Roztwór wytrząsano w 4°C przez 15 min i odwirowano przy 31000 x g przez 30 min w 4°C.

Została przygotowana kolumna Poly U (1 ml żywicy na 1 g wyjściowego osadu). Liniowa prędkość przepływu wynosiła 60 cm/godz., a pakująca prędkość przepływu wynosiła 133% szybkości 60 cm/godz. Kolumna została zrównoważona buforem równoważącym i supernatant ponownie zawieszonego w siarczanie amonu osadu został nakładany na zrównoważoną kolumnę. Kolumnę przemywano do uzyskania linii odniesienia buforem równoważącym i białko wymywano stopniowo w następującym buforze wymywającym Poly U: 25 mM HEPES pH 8,0, 1M NaCl, 5 mM DTT (dodawanego świeżo), 10% glicerolu, 1,2 oktylo glukozydu. Eluat z kolumny był puszczany na SDS-PAGE (barwiony Coomassie) i podwielokrotności zamrażano i przechowywano w -80°C. Obecność epitopu NS3/4a została potwierdzona przez analizę Western blot stosując poliklonalne przeciwciało skierowane przeciwko domenie proteazy NS3 i monoklonalne przeciwciało przeciwko epitopowi 5-1-1 (HCV 4a).

Dodatkowo, aktywność enzymu proteazy była monitorowana podczas oczyszczania jak następuje. Peptyd NS4A (KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK) (SEQ ID NO: 9) i próbka zawierająca konformacyjny epitop NS3/4a zostały rozcieńczone w 90 μl buforu reakcyjnego (25 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 10% glicerolu, 0,05 n-Dodecylo B-D-Maltozyd, 5 mM DTT) pozostawiono do mieszania w temperaturze pokojowej przez 30 min. 90 μl mieszaniny dodano do płytki mikrotitracyjnej (Costar, Inc., Corning, NY) i 10 μl substratu HCV (AnaSpec, Inc., San Jose CA). Płytkę mieszano i odczytano w czytniku płytek Fluostar. Wyniki wyrażono w względnych jednostkach fluorescencji (RFU) na minutę.

Przy zastosowaniu tych metod produkt ekstrakcji 1 M NaCl zawiera aktywność 3,7 RFU na minutę, strat siarczanu amonu ma aktywność 7,5 RFU/min a produkt oczyszczania Poly U ma aktywność 18,5 RFU/min.

P r z y k ł a d 3

Immunoreaktywność epitopu konformacyjnego NS3/4a versus denaturowany NS3/4a

Immunoreaktywność epitopu konformacyjnego NS3/4a, wytwarzanego jak opisano powyżej, porównano do NS3/4a, który był denaturowany przez dodanie SDS do osiągnięcia końcowego stężenia 2% do preparatu epitopu konformacyjnego NS3/4a. Płytki mikrotitracyjne zostały pokryte denaturowanym NS3/4a i konformacyjnym NS3/4a, jak opisano powyżej. Płytki mikrotitracyjne zostały również pokryte antygenem c200 (Hepatology (1992) 15:19-25, dostępnym w ORTHO HCV Version 3.0. ELISA TEST SYSTEM, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey). Antygen C200 zastosowano jako porównanie, zakłada się, że jest on niekonformacyjny z powodu obecności czynnika redukującego (DTT) i detergentu (SDS) w jego składzie.

Immunoreaktywność była badana przeciw dwóm panelom wczesnej serokonwersji HCV: PHV 904 i PHV 914 (dostępne komercyjnie próbki ludzkiej krwi z Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA). Wyniki pokazano tabeli 6. Na podstawie danych można sugerować, że serokonwersyjne panele nie wykrywają denaturowanej lub linearyzowanej postaci NS3/4a (jak również c200), nie wykrywają paneli wczesnej serokonwersji tak wczesnej jak konformacyjny epitop NS3/4a.

PL 209 710 B1

T a b e l a 6

	NS3/4 v3 denaturowany NS3/4a
	*dodano 2% SDS do roztworu podstawowego NS3/4a
		NS3/4a	dN33/4a	C200	NS3/4a	dNS3/4a	C200
		OD	OD	OD	s/co	s/co	s/co
HCV	PHV 904-1	0,012	0,012	0,009	0,02	0,02	0,01
Serokonwersje	PHV 904-2	0,011	0,009	0,008	0,02	0,01	0,01
	PHV 904-3	1,124	0,071	0,045	1,80	0,11	0,07
	PHV 904-4	2,401	0,273	0,129	3,85	0,44	0,21
	PHV 904-5	3,022	0,793	0,347	4,85	1,28	0,57
	PHV 904-6	2,711	1,472	0,774	4,35	2,37	1,28
	PHV 904-7	3,294	1,860	0,943	5,28	2,99	1,55
	PVH 914-1	0,006	0,004	0,001	0,01	0,01	0,00
	PVH 914-2	0,005	0,004	0,002	0,01	0,01	0,00
	PVH 914-3	0,098	0,003	0,001	0,16	0,00	0,00
	PVH 914-4	1,118	0,006	0,004	1,79	0,01	0,01
	PVH 914-5	2,035	0,044	0,022	3,26	0,07	0,04
	PVH 914-6	2,092	0,074	0,025	3,35	0,12	0,04
	PVH 914-7	2,519	0,281	0,132	4,04	0,45	0,22
	PVH 914-8	2,746	0,907	0,500	4,40	1,46	0,82
	PVH 914-9	3,084	1,730	0,931	4,94	2,78	1,53
HCV 3.0	Neg.Kontr.	0,023	0,024	0,008
Kontrole	Neg.Kontr.	0,027	0,024	0,007
	Neg.Kontr	0,21	0,017	0,005
	średnia	0,024	0,022	0,007
	Odcięcie	0,624	0,622	0,607
	Poz. Kontr.	1,239	0,903	0,575	1,99	1,45	0,95
	Poz. Kontr.	1,445	0,916	0,614	2,32	1,47	1,01

Immunoreaktywność epitopu konformacyjnego była również badana przy użyciu monoklonalnych przeciwciał dla NS3/4a otrzymanych przy użyciu standardowych procedur. Te monoklonalne przeciwciała były następnie badane w systemie ELISA przeciw NS3/4a i denaturowanemu NS3/4a i antygenowi c200. Dane pokazują, że te monoklonalne przeciwciała NS3/4a reagują z NS3/4a i denaPL 209 710 B1 turowanym NS3/4a w sposób podobny do paneli serokonwersyjnych pokazanych w tabeli 7. Ten wynik podaje również dalsze dowody przemawiające za tym, że NS3/4 jest z natury swojej konformacyjny tak jak mogą być monoklonalne przeciwciała, których reaktywność jest podobna do paneli wczesnej serokonwersji c33c.

T a b e l a 7

	Płytka
NS3/4a	dNS3/4a	C200
Monoklonalny		OD	OD	OD
4B9/E3	1:100	1,820	0,616	0,369
	1:1000	1,397	0,380	0,246
	1:10000	0,864	0,173	0,070
	1:20000	0,607	0,116	0,085
5B7/D7	1: 100	2,885	0,893	0,436
	1:1000	2,866	0,541	0,267
	1:10000	1,672	0,215	0,086
	1:20000	1,053	0,124	0,059
1A8/K2	1:100	1,020	0,169	0,080
	1:1000	0,921	0,101	0,043
	1:10000	0,653	0,037	0,013
	1:20000	0,337	0,027	0,011

P r z y k ł a d 4

Pokrywanie podłoża stałego antygenami HCV

Płytki są pokrywane epitopem konformacyjnym HCV NS3/4a lub antygenem MEFA, jak następuje. Bufor pokrywający HCV: (50 mM NaPO4 pH 7,0, 2 mM EDTA i 0,1% chloroacetamidu) jest sączony przez filtry 0,22 μ. Następnie są dodawane kolejno następujące odczynniki do buforu pokrywającego HCV i mieszane po każdorazowym dodaniu: 2 μg/ml BSA-modyfikowane grupą sulfhydrylową, z 10 mg/ml roztworu (Bayer Corp. Pentex, Kankakee, Illinois); 5 mM DTT z 1 M roztworu (Sigma, ST. Louis, MO); 0,45 μg/ml NS3/4a (stężenie białka 0,3 mg/ml); lub 0,375 μg/ml MEFA 7.1 (stężenie białka 1 mg/ml). Końcowy roztwór jest mieszany 15 min w temperaturze pokojowej. 200 μl powyższego roztworu jest dodawane do każdej studzienki płaskodennej, wysoko wiążącej płytki Costar (Corning Inc., Corning, New York) i płytki są inkubowane przez noc w wilgotnej komorze. Następnie płytki są przemywane buforem myjącym (1 x PBS, 0,1% Tween-20), płukane pod kranem i suszone i dodawane jest 285 μl Buforu Ortho Post-Coat (1xPBS, pH 7,4, 1% BSA, 3% sacharoza). Płytki są inkubowane przez przynajmniej 1 godzinę, płukane pod kranem i suszone przez noc w 2 - 8°C. Płytki są chowane do torebek z osuszaczem, w celu przyszłego użycia.

P r z y k ł a d 5

Testy immunologiczne

W celu sprawdzenia zdolności będących przedmiotem badania testów immunologicznych do wykrywania infekcji HCV, stosuje się handlowo dostępne panele z próbkami ludzkiej krwi, które zostały zainfekowane HCV. Takie panele są dostępne komercyjnie od Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA (BBI); Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP); i North American Biologics, Inc., BocoRatan, F1 (NABI).

Test przeprowadzano jak następuje. Do powleczonych płytek dodawano 200 μl rozcieńczonego wzorcowego buforu (1 g/l kazeiny, 100 mg/l zrekombinowanego ludzkiego SOD, 1 g/l chloroacetami26

PL 209 710 B1 du, 10 g/l BSA, 500 mg/l wyciągu drożdżowego, 0,366 g/l EDTA, 1,162 g/l KPO4, 5 ml/l Tween-20, 29, 22 g/l NaCl, 1,627 g/l NaPO₄, 1% SDS). Następnie dodano 20 μl próbki i inkubowano w 37°C przez 30-60 minut. Płytki przemywano buforem zmywającym (1xPBS, pH 7.4, 0,1% Tween-20). Dodawano 200 μl znakowanego składnika fazy ciekłej (albo MEFA znakowany HRP albo znakowany HRP epitop konformacyjny NS3/4a, zależnie od antygenu związanego z podłożem stałym), rozcieńczonej 1:22,000 w ORTHO HCV 3.0 ELISA Test System with Enhanced SAVe bulk conjugate diluent (Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) i inkubowano przez 30-60 minut w 37°C. Następnie przemywano jak powyżej i dodano 200 μl roztworu substratu (1 tabletka OPD/10 ml). Tabletka OPD zawiera o-fenylenodiaminy dichlorowodorek i nadtlenek wodoru dla wywołania koloru barwnej reakcji peroksydazy chrzanowej. Następnie płytki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Reakcja zatrzymywano przez dodanie 50 μl 4N H₂SO₄ i płytki są odczytywane przy 492 nm, względem wartości absorbancji 690 nm jako kontroli.

PL 209 710 B1

LISTA SEKWENCJI <iio> Chiron Corporation <120>

<130> 2300-19199.40 <150> 60/409,515 <151> 2002-09-09 <160> 9 <17O> Patent In wersja 3,2 <210> 1 <211> 2058 <212> DNA <213 > Sztuczny <220>

<223 > sekwencja CUA epitopu konfornacyjnego NS3/41 <400> 1

atg gcg

ccc Pro

atc acg gcg Ile Thr Ala 5

tac Tyr

gcc Ala

cag Gin

cag Gin 10

aca Thr

agg Arg

ggc Gly

ctc Leu

eta Leu 15

ggg Gly

48

Met 1

Ala

tgc

ata

atc

acc

agc

eta

act

ggc

cgg

gac

aaa

aac

caa

gtg

gag

ggt

96

Cys

Ile

Ile

Thr

Ser

Leu

Thr

Gly

Arg

Asp

Lys

Asn

Gin

Val

Glu

Gly

20

25

30

gag

gtc

cag

att

gtg

tca

act

gct

gcc

caa

acc

ttc

ctg

gca

acg

tgc

144

Glu

Val

Gin

Ile

Val

Ser

Thr

Ala

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

Ala

Thr

Cys

35

40

45

atc

aat

ggg

gtg

tgc

tgg

act

gtc

tac

cac

ggg

gcc

gga

acg

agg

acc

192

Ile

Asn

Gly

Val

Cys

Trp

Thr

Val

Tyr

His

Gly

Ala

Gly

Thr

Arg

Thr

50

55

60

atc

gcg

tca

ccc

aag

ggt

cct

gtc

atc

cag

atg

tat

acc

aat

gta

gac

240

Ile

Ala

Ser

Pro

Lys

Gly

Pro

Val

Ile

Gin

Met

Tyr

Thr

Asn

Val

Asp

65

70

75

80

caa

gac

ctt

gtg

ggc

tgg

ccc

gct

ccg

caa

ggt

agc

ega

tca

ttg

aca

288

Gin

Asp

Leu

Val

Gly

Trp

Pro

Ala

Pro

Gin

Gly

Ser

Arg

Ser

Leu

Thr

85

90

95

ccc

tgc

act

tgc

ggc

tcc

tcg

gac

ctt

tac

ctg

gtc

acg

agg

cac

gcc

336

Pro

Cys

Thr

Cys

Gly

Ser

Ser

Asp

Leu

Tyr

Leu

Val

Thr

Arg

His

Ala

100

105

110

gat

gtc

att

ccc

gtg

cgc

cgg

cgg

ggt

gat

agc

agg

ggc

agc

ctg

ctg

384

Asp

Val

Ile

Pro

Val

Arg

Arg

Arg

Gly

Asp

Ser

Arg

Gly

Ser

Leu

Leu

115

120

125

tcg

ccc

cgg

ccc

att

tcc

tac

ttg

aaa

ggc

tcc

tcg

ggg

ggt

ccg

ctg

432

Ser

Pro

Arg

Pro

Ile

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gly

Ser

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

130 135 140

PL 209 710 B1 ttg tgc ccc gcg ggg cac gcc gtg ggc ata ttt agg gcc gcg gtg tgc 430

Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys

145 150 155 160 acc cgt gga gtg get aag gcg gtg gac ttt atc cct gtg gag aac eta 523

Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu

165 170 175 gag aca acc atg agg tcc ccg gtg ttc acg gat aac tcc tet cca cca 576

Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro

180 185 190 gta gtg ccc cag agc ttc cag gtg get cac ctc cat get ccc aca ggc 624

Val Val Pro Gin Ser Phe Gin. Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly

195 200 205 agc ggc aaa agc acc aag gtc ccg get gca tat gca get cag ggc tat 672

Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gin Gly Tyr

210 215 220 aag gtg eta gta ctc aac ccc tet gtt get gca aca ctg ggc ttt ggt 720

Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly

225 230 235 240 get tac atg tcc aag get cat ggg atc gat cct aac atc agg acc ggg 763

Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly

245 250 255 gtg aga aca att acc act ggc agc ccc atc acg tac tcc acc tac ggc 816

Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly

260 265 270 aag ttc ctt gcc gac ggc ggg tgc teg ggg ggc get tat gac ata ata 864

Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile

275 2Θ0 285 att tgt gac gag tgc cac tcc acg gat gcc aca tcc atc ttg ggc att 912

Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile

290 295 300 ggc act gtc ctt gac caa gca gag act gcg ggg gcg aga ctg gtt gtg 960

Gly Thr Val Leu Asp Gin Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val

305 310 315 320 ctc gcc acc gcc acc cct ccg ggc tcc gtc act gtg ccc cat ccc aac 1008

Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn

325 330 335 atc gag gag gtt get ctg tcc acc acc gga gag atc cct ttt tac ggc 1056

Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly

340 345 350 aag get atc ccc ctc gaa gta atc aag ggg ggg aga cat ctc atc ttc 1104

Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe

355 360 365 tgt cat tea aag aag aag tgc gac gaa ctc gcc gca aag ctg gtc gca 1152

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala

370 375 380

PL 209 710 B1

ttg Leu 385

ggc Gly

atc Ile

aat Asn

gcc Ala

gtg Val 390

gcc Ala

tac Tyr

tac Tyr

cgc Arg

ggt Gly 395

ctt Leu

gac Asp

gtg Val

tcc Ser

gtc Val 400

1200

atc

ccg

ccc

atc

ggc

gat

gt t

gtc

gtc

gtg

gca

acc

gat

gcc

ctc

atg

1248

Ile

Pro

Pro

Ile

Gly 405

Asp

Val

Val

Val

Val 410

Ala

Thr

Asp

Ala

Leu 415

Met

acc

ggc

tat

acc

ggc

gac

ttc

gac

tcg

gtg

ata

gac

tgc

aat

acg

tgt

1296

Thr

Gly

Tyr

Thr 420

Gly

Asp

Phe

Asp

Ser 425

Val

Ile

Asp

Cys

Asn 430

Thr

Cys

gtc

acc

cag

aca

gtc

gat

ttc

agc

ctt

gac

cct

acc

ttc

acc

att

gag

1344

Val

Thr

Gin 435

Thr

Val

Asp

Phe

Ser 440

Leu

Asp

Pro

Thr

Phe 445

Thr

Ile

Glu

aca

atc

acg

ctc

ccc

caa

gat

gct

gtc

tcc

cgc

act

caa

cgt

cgg

ggc

1392

Thr

Ile 450

Thr

Leu

Pro

Gin

Asp 455

Ala

Val

Ser

Arg

Thr 460

Gin

Arg

Arg

Gly

agg

act

ggc

agg

ggg

aag

cca

ggc

atc.

tac

aga

ttt

gtg

gca

ccg

ggg

1440

Arg 465

Thr

Gly

Arg

Gly

Lys 470

Pro

Gly

Ile

Tyr

Arg 475

Phe

Val

Ala

Pro

Gly 480

gag

cgc

ccc

tcc

ggc

atg

ttc

gac

tcg

tcc

gtc

ctc

tgt

gag

tgc

tat

1483

Glu

Arg

Pro

Ser

Gly 485

Met

Phe

Asp

Ser

Ser 490

Val

Leu

Cys

Glu

Cys 495

Tyr

gac

gca

ggc

tgt

gct

tgg

tat

gag

ctc

acg

ccc

gcc

gag

act

aca

gtt

1536

Asp

Ala

Gly

Cys 500

Ala

Trp

Tyr

Glu

Leu 505

Thr

Pro

Ala

Glu

Thr 510

Thr

Val

agg

eta

ega

gcg

tac

atg

aac

acc

ccg

ggg

ctt

ccc

gtg

tgc

cag

gac

1584

Arg

Leu

Arg 515

Ala

Tyr

Met

Asn

Thr 520

Pro

Gly

Leu

Pro

Val 525

Cys

Gin

Asp

cat

ctt

gaa

ttt

tgg

gag

ggc

gtc

ttt

aca

ggc

ctc

act

cat

ata

gat

1632

His

Leu 530

Glu

Phe

Trp

Glu

Gly 535

Val

Phe

Thr

Gly

Leu 540

Thr

His

Ile

Asp

gcc

cac

ttt

eta

tcc

cag

aca

aag

cag

agt

ggg

gag

aac

ctt

cct

tac

1680

Ala 545

His

Phe

Leu

Ser

Gin 550

Thr

Lys

Gin

Ser

Gly 555

Glu

Asn

Leu

Pro

Tyr 560

ctg

gta

gcg

tac

caa

gcc

acc

gtg

tgc

gct

agg

gct

caa

gcc

cct

ccc

1728

Leu

Val

Ala

Tyr

Gin 565

Ala

Thr

Val

Cys

Ala 570

Arg

Ala

Gin

Ala

Pro 575

Pro

cca

tcg

tgg

gac

cag

atg

tgg

aag

tgt

ttg

att

cgc

ctc

aag

ccc

acc

1776

Pro

Ser

Trp

Asp 580

Gin

Met

Trp

Lys

Cys 585

Leu

Ile

Arg

Leu

Lys 590

Pro

Thr

ctc

cat

ggg

pca

aca

ccc

ctg

eta

tac

aga

ctg

ggc

gct

gtt

cag

aat

1824

Leu

His

Gly 595

Pro

Thr

Pro

Leu

Leu 600

Tyr

Arg

Leu

Gly

Ala 605

Val

Gin

Asn

gaa

atc

acc

ctg

acg

cac

cca

gtc

acc

aaa

tac

atc

atg

aca

tgc

atg

1872

Glu

Ile 610

Thr

Leu

Thr

His

Pro 615

Val

Thr

Lys

Tyr

Ile 620

Met

Thr

Cys

Met

tcg

gcc

gac

ctg

gag

gtc

gtc

acg

agc

acc

tgg

gtg

ctc

gtt

ggc

ggc

1920

PL 209 710 B1

Ser Ala 625

Asp Leu Glu

Val Val 630

Thr

Ser Thr Trp Val Leu Val -Gly Gly

635

640

gtc

ctg

get

get

ttg

gee

gcg

tat

tge

ctg

tea

aca

ggc

tgc

gtg

gtc

1968

Val

Leu

Ala

Ala

Leu

Ala

Ala

Tyr

Cys

Leu

Ser

Thr

Gly

Cys

Val

Val

645

650

655

ata

gtg

ggc

agg

gtc

gtc

ttg

tcc

ggg

aag

ccg

gca

atc

ata

cct

gac

2016

Ile

Val

Gly

Arg

Val

Val

Leu

Ser

Gly

Lys

Pro

Ala

Ile

Ile

Pro

Asp

660

665

670

agg

gaa

gtc

ctc

tac

ega

gag

ttc

gat

gag

atg

gaa

gag

tgc

2058

Arg

Glu

Val

Leu

Tyr

Arg

Glu

Phe

Asp

Glu

Met

Glu

Glu

Cys

675 680 685 <210> 2 <211> 686 <212> PRT <213 > Sztuczny <220>

<223> sekwencja aminokwasu epitcpu kaniormacyjnego NS3/41 <400i 2

Met 1

Ala

Pro

Ile

Thr 5

Ala

Tyr

Ala

Gin

Gin 10

Thr

Arg

Gly

Leu

Leu 15

Gly

Cys

Ile

Ile

Thr 20

Ser

Leu

Thr

Gly

Arg 25

Asp

Lys

Asn

Gin

Val 30

Glu

Gly

Glu

Val

Gin 35

Ile

Val

Ser

Thr

Ala 40

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu 45

Ala

Thr

Cys

Ile

Asn 50

Gly

Val

Cys

Trp

Thr 55

Val

Tyr

His

Gly

Ala 60

Gly

Thr

Arg

Thr

Ile 65

Ala

Ser

Pro

Lys

Gly 70

Pro

Val

Ile

Gin

Met 75

Tyr

Thr

Asn

Val

Asp 80

Gin

Asp

Leu

Val

Gly 85

Trp

Prp

Ala

Pro

Gin 90

Gly

Ser

Arg

Ser

Leu 95

Thr

Pro

Cys

Thr

Cys 100

Gly

Ser

Ser

Asp

Leu 105

Tyr

Leu

Val

Thr

Arg 110

His

Ala

Asp

Val

Ile 115

Pro

Val

Arg

Arg

Arg 120

Gly

Asp

Ser

Arg

Gly 125

Ser

Leu

Leu

Ser

Pro 130

Arg

Pro

Ile

Ser

Tyr 135

Leu

Lys

Gly

Ser

Ser 140

Gly

Gly

Pro

Leu

Leu 145

Cys

Pro

Ala

Gly

His 150

Ala

Val

dy

Ile

Phe 155

Arg

Ala

Ala

Val

Cys 160

Thr

Arg

Gly

Val

Ala 165

Lys

Ala

Val

Asp

Phe 170

Ile

Pro

Val

Glu

Asn 175

Leu

Glu

Thr

Thr

Met

Arg

Ser

Pro

Val

Phe

Thr

Asp

Asn

Ser

Ser

Pro

Pro

PL 209 710 B1

180

185

190

Val

Val

Pro

Gin

Ser

Phe

Gin

Val Ala

His

Leu

His

Ala

Pro

Thr

Gly

195

200

205

Ser

Gly

Lys

Ser

Thr

Lys

Val

Pro Ala

Ala

Tyr

Ala

Ala

Gin

Gly

Tyr

210

215

220

Lys

Val

Leu

Val

Leu

Asn

Pro

Ser Val

Ala

Ala

Thr

Leu

Gly

Phe

Gly

225

230

235

24 0

Ala

Tyr

Met

Ser

Lys

Ala

His

Gly Ile

Asp

Pro

Asn

Ile

Arg

Thr

Gly

245

250

255

Val

Arg

Thr

Ile

Thr

Thr

Gly

Ser Pro

Ile

Thr

Tyr

Ser

Thr

Tyr

Gly

260

265

270

Lys

Phe

Leu

Ala

Asp

Gly

Gly

Cys Ser

Gly

Gly

Ala

Tyr

Asp

Ile

Ile

275

280

285

Ile

Cys

Asp

Glu

Cys

His

Ser

Thr Asp

Ala

Thr

Ser

Ile

Leu

Gly

Ile

290

295

300

Gly

Thr

Val

Leu

Asp

Gin

Ala

Glu Thr

Ala

Gly

Ala

Arg

Leu

Val

Val

3 05

310

315

320

Leu

Ala

Thr

Ala

Thr

Pro

Pro

Gly Ser

Val

Thr

Val

Pro

His

Pro

Asn

325

330

335

Ile

Glu

Glu

Val

Ala

Leu

Ser

Thr Thr

Gly

Glu

Ile

Pro

Phe

Tyr

Gly

340

345

350

Lys

Ala

Ile

Pro

Leu

Glu

Val

Ile Lys

Gly

Gly

Arg

His

Leu

Ile

Phe

355

360

365

Cys

His

Ser

Lys

Lys

Lys

Cys

Asp Glu

Leu

Ala

Ala

Lys

Leu

Val

Ala

370

375

380

Leu

Gly

Ile

Asn

Ala

Val

Ala

Tyr Tyr

Arg

Gly

Leu

Asp

Val

Ser

Val

385 390 395 400

Ile Pro Pro Ile Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 405 410 415

Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430

Val Thr Gin Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445

Thr Ile Thr Leu Pro Gin Asp Ala Val Ser Arg Thr Gin Arg Arg Gly 450 455 460

Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly

465 470 475 4go

Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr

485 490 495

Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val

PL 209 710 B1

500

505

SIO

Arg

Leu

Arg

Ala

Tyr

Met

Asn

Thr

Pro

Gly

Leu

Pro

’/al

Cys

Gin

Asp

515

52 0

525

His

Leu

Glu

Phe

Trp

Glu

Gly

Val

Phe

Thr

Gly

Leu

Thr

His

Ile

Asp

530

535

540

Ala

His

Phe

Leu

Ser

Gin

Thr

Lys

Gin

Ser

Gly

Glu

Asn

Leu

Pro

Tyr

545

550

S55

560

Leu

Val

Ala

Tyr

Gin

Ala

Thr

Val

Cys

Ala

Arg

Ala

Gin

Alei

Pro

Pro

565

570

575

Pro

Ser

Trp

Asp

Gin

Met

Trp

Lys

Cys

Leu

Ile

Arg

Leu

Lys

Pro

Thr

580

505

590

Leu

His

Gly

Pro

Thr

Pro

Leu

Leu

Tyr

Arg

Leu

Gly

Ala

Val

Gin

Asn

595

600

605

Glu

Ile

Thr

Leu

Thr

His

Pro

Val

Thr

Lys

Tyr

Ile

Met

Thr

Cys

Met

610

615

620

Ser

Ala

Asp

Leu

Glu

Val

Val

Thr

Ser

Thr

Trp

Val

Leu

Val

Gly

Gly

625

630

635

640

Val

Leu

Ala

Ala

Leu

Ala

Ala

Tyr

Cyg

Leu

Ser

Thr

C-ly

Cys

Val

val

645

650

655

Ile

Val

Gly

Arg

Val

Val

Leu

Ser

Gly

Lys

Pro

Ala

Ile

Ile

Pro

Asp

660

665

670

Arg

Glu

Val

Leu

Tyr

Arg

Glu

Phe

Asp

Glu

Met

Glu

Glu

Cys

675 6Θ0 695 <210> 3 <211> 2499 <212> DNA <213 > Sztuczny <220>

<22 3 > sekwencja ΜΕΕΆ 12 <400> 3

atg gct

aca Thr

aag gct

gtt Val

tgt Cys

gtt Val

ttg Leu

aag Lys 10

ggt Gly

gac Asp

ggc Gly

cca Pro

gtt Val 15

caa Gin

49

Met 1

Ala

Lys

Ala 5

ggt

att

att

aac

ttc

gag

cag

aag

gaa

agt

aat

gga

cca

gtg

aag

gtg

96

Gly

Ile

Ile

Asn

Phe

Glu

Gin

Lys

Glu

Ser

Asn

Gly

Pro

Val

Lys

Val

20

25

30

tgg

gga

agc

att

aaa

gga

ctg

act

gaa

ggc

ctg

cat

gga

ttc

cat

gtt

144

Trp

Gly

Ser

Ile

Lys

Gly

Leu

Thr

Glu

Gly

Leu

His

Gly

Phe

His

Val

35

40

45

cat

gag

ttt

gga

gat

aat

aca

gca

ggc

tgt

acc

agt

gca

ggt

cct

cac

192

His

Glu

Phe

Gly

Asp

Asn

Thr

Ala

Gly

Cyg

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

His

50

55

60

PL 209 710 B1 ttt aat cct eta tcc acg cgt ggt tgc aat tgc tct atc tat ccc ggc 240

Phe Asn Pro Leu Ser Thr Arg Gly Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly

70 75 30 cat ata acg ggt cac cgc atg gca tgg aag ctt ggt tcc gcc gcc aga 283

His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Lys Leu Gly Ser Ala Ala Arg

90 95 act acc tcg ggc ttt gtc tcc ttg ttc gcc cca ggt gcc aaa caa aac 336

Thr

Thr

Ser

Gly 100

Phe

Val

Ser

Leu

Phe 105

Ala

Pro

Gly

Ala

Lys 110

Gin

Asn

gaa

act

cac

gtc

acg

gga

ggc

gca

gcc

gcc

ega

act

acg

tct

ggg

ttg

384

Glu

Thr

His 115

Val

Thr

Gly

Gly

Ala 120

Ala

Ala

Arg

Thr

Thr 125

Ser

Gly

Leu

acc

tct

ttg

ttc

tcc

cca

ggt

gcc

agc

caa

aac

att

caa

ttg

att

act

432

Thr

Ser 130

Leu

Phe

Ser

Pro

Gly 135

Ala

Ser

Gin

Asn

Ile 140

Gin

Leu

Ile

Thr

agt

acg

gat

aac

tcc

tct

cca

cca

gta

gtg

ccc

cag

agc

ttc

cag

gtg

480

Ser 145

Thr

Asp

Asn

Ser

Ser 150

Pro

Pro

Val

Val

Pro 155

Gin

Ser

Phe

Gin

Val 160

gct

cac

ctc

cat

gct

ccc

aca

ggc

agc

ggc

aaa

agc

acc

aag

gtc

ccg

528

Ala

His

Leu

His

Ala 165

Pro

Thr

Gly

Ser

Gly 170

Lys

Ser

Thr

Lys

Val 175

Pro

gct

gca

tat

gca

gct

cag

ggc

tat

aag

gtg

eta

gta

ctc

aac

ccc

tct

576

Ala

Ala

Tyr

Ala 180

Ala

Gin

Gly

Tyr

Lys 185

Val

Leu

Val

Leu

Asn. 190

Pro

Ser

gtt

gct

gca

aca

ctg

ggc

ttt

ggt

gct

tac

atg

tcc

aag

gct

cat

ggg

624

Val

Ala

Ala 195

Thr

Leu

Gly

Phe

Gly 200

Ala

Tyr

Met

Ser

Lys 205

Ala

His

Gly

atc

gat

cct

aac

atc

agg

acc

ggg

gtg

aga

aca

att

acc

act

ggc

agc

672

Ile

Asp 210

Pro

Asn

Ile

Arg

Thr 215

Gly

Val

Arg

Thr

Ile 220

Thr

Thr

Gly

Ser

ccc

atc

acg

tac

tcc

acc

tac

ggc

aag

ttc

ctt

gcc

gac

ggc

ggg

tgc

720

Pro. 225

Ile

Thr

Tyr

Ser

Thr 230

Tyr

Gly

Lys

Phe

Leu 235

Ala

Asp

Gly

Gly

Cys 240

tcg

ggg

ggc

gct

tat

gac

ata

ata

att

tgt

gac

gag

tgc

cac

tcc

acg

768

Ser

Gly

Gly

Ala

Tyr 245

Asp

Ile

Ile

Ile

Cys 250

Asp

Glu

Cys

His

Ser 255

Thr

gat

gcc

aca

tcc

atc

ttg

ggc

atc

ggc

act

gtc

ctt

gac

caa

gca

gag

816

Asp

Ala

Thr

Ser 260

Ile

Leu

Gly

Ile

Gly 265

Thr

Val

Leu

Asp

Gin 270

Ala

Glu

act

gtg

ggg

gcg

aga

ctg

gtt

gtg

ctc

gcc

acc

gcc

acc

cct

ccg

ggc

864

Thr

Ala

Gly 275

Ala

Arg

Leu

Val

Val 280

Leu

Ala

Thr

Ala

Thr 285

Pro

Pro

Gly

tcc

gtc

act

gtg

ccc

cat

ccc

aac

atc

gag

gag

gtt

gct

ctg

tcc

acc

912

Ser

Val 290

Thr

Val

Pro

His

Pro 295

Asn

Ile

Glu

Glu

Val 300

Ala

Leu

Ser

Thr

PL 209 710 B1

3. CC Thr 305

gga Gly

gag Glu

atc Ile

cct Pro

ttt Phe 310

tac Tyr

ggc Gly

aag Lys

get Ala

atc Ile 315

ccc Pro

ctc Leu

gaa Glu

gta Val

atc Ile 320

96 0

aag

ggg

ggg

aga

cat

ctc

atc

ttc

tgt

cat

tea

aag

aag

aag

tgc

gac

10 03

Lys

Gly

Gly

Arg

His 325

Leu

Ile

Phe

Cys

His 330

Ser

Lys

Lys

Lys

Cys 335

Asp

gaa

ctc

gcc

gca

aag

ctg

gtc

gca

ttg

ggc

atc

aat

gcc

gtg

gcc

tac

1055

Glu

Leu

Ala

Ala 340

Lys

Leu

Val

Ala

Leu 345

Gly

Ile

Asn

Ala

Val 350

Ala

Tyr

tac

cgc

ggt

ctt

gac

gtg

tcc

gtc

atc

ccg

acc

agc

ggc

gat

gtt

gtc

1104

Tyr

Arg

Gly 355

Leu

Asp

Val

Ser

Val 360

Ile

Pro

Thr

Ser

Gly 365

Asp

Val

Val

gtc

gtg

gca

acc

gat

gcc

ctc

atg

acc

ggc

tat

acc

ggc

gac

ttc

gac

1152

Val

Val 370

Ala

Thr

Asp

Ala

Leu 375

Met

Thr

Gly

Tyr

Thr 380

Gly

Asp

Phe

Asp

teg

gtg

ata

gac

tgc

aat

acg

tgt

gca

tgc

tcc

ggg

aag

ccg

gca

atc

1200

Ser 385

Val

Ile

Asp

Cys

Asn 390

Thr

Cys

Ala

Cys

Ser 395

Gly

Lys

Pro

Ala

Ile 400

ata

cct

gac

agg

gaa

gtc

ctc

tac

ega

gag

ttc

gat

gag

atg

gaa

gag

1248

Ile

Pro

Asp

Arg

Glu 405

Val

Leu

Tyr

Arg

Glu 410

Phe

Asp

Glu

Met

Glu 415

Glu

tgc

tet

cag

cac

tta

ccg

tac

atc

gag

caa

ggg

atg

atg

ctc

gcc

gag

1236

Cys

Ser

Gin

His 420

Leu

Pro

Tyr

Ile

Glu 425

Gin

Gly

Met

Met

Leu 430

Ala

Glu

cag

ttc

aag

cag

aag

gcc

ctc

99=

ctc

teg

ega

ggg

ggc

aag

ccg

gca

1344

Gin

Phe

Lys 435

Gin

Lys

Ala

Leu

Gly 440

Leu

Ser

Arg

Gly

Gly 445

Lys

Pro

Ala

atc

gtt

cca

gac

aaa

gag

gtg

ttg

tat

caa

caa

tac

gat

gag

atg

gaa

1392

Ile

Val 450

Pro

Asp

Lys

Glu

Val 455

Leu

Tyr

Gin

Gin

Tyr 460

Asp

Glu

Met

Glu

9ag

tgc

tea

caa

get

gcc

cca

tat

atc

gaa

caa

get

cag

gta

ata

get

1440

Glu 465

Cys

Ser

Gin

Ala

Ala 470

Pro

Tyr

Ile

Glu

Gin 475

Ala

Gin

Val

Ile

Ala 480

cac

cag

ttc

aag

gaa

aaa

gtc

ctt

gga

ttg

atc

gat

aat

gat

caa

gtg

1488

His

Gin

Phe

Lys

Glu 485

Lys

Val

Leu

Gly

Leu 490

Ile

Asp

Asn

Asp

Gin 495

Val

gtt

gtg

act

cct

gac

aaa

gaa

atc

tta

tat

gag

gcc

ttt

gat

gag

atg

1536

Val

Val

Thr

Pro 500

Asp

Lys

•Glu

Ile

Leu 505

Tyr

Glu

Ala

Phe

Asp 510

Glu

Met

gaa

gaa

tgc

gcc

tcc

aaa

gcc

gcc

ctc

att

gag

gaa

ggg

cag

cgg

atg

1584

Glu

Glu

Cys 515

Ala

Ser

Lys

Ala

Ala 520

Leu

Ile

Glu

Glu

Gly 525

Gin

Arg

Met

gcg

gag

atg

ctc

aag

tet

aag

ata

caa

ggc

ctc

ctc

ggg

ata

ctg

cgc

1632

Ala

Glu

Met

Leu

Lys

Ser

Lys

Ile

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Ile

Leu

Arg

530 535 540

PL 209 710 B1

cgg

cac

gtt

ggt

cct

ggc

gag

ggg

gca

gtg

cag

tgg

atg

aac

cgg

ctg

Arg 545

His

Val

Gly

Pro

Gly 550

Glu

Gly

Ala

Val

Gin 555

Trp

Met

Asn

Arg

Leu 560

ata

gcc

ttc

gcc

tcc

aga

ggg

aac

cat

gtt

tcc

ccc

acg

cac

tac

gtt

Ile

Ala

Phe

Ala

Ser 565

Arg

Gly

Asn

His

Val 570

Ser

Pro

Thr

His

Tyr 575

Val

ccg

tct

aga

tcc

cgg

aga

ttc

gcc

cag

gcc

ctg

ccc

gtt

tgg

gcg

cgg

Pro

Ser

Arg

Ser 580

Arg

Arg

Phe

Ala

Gin 585

Ala

Leu

Pro

Val

Trp 590

Ala

Arg

ccg

gac

tat

aac

ccc

ccg

eta

gtg

gag

acg

tgg

aaa

aag

ccc

gac

tac

Pro

Asp

Tyr 595

Asn

Pro

Pro

Leu

Val 600

Glu

Thr

Trp

Lys

Lys 605

Pro

Asp

Tyr

gaa

cca

cct

gtg

gtc

cac

ggc

aga

tct

tct

cgg

aga

ttc

gcc

cag

gcc

Glu

Pro 610

Pro

Val

Val

His

Gly 615

Arg

Ser

Ser

Arg

Arg 620

Phe

Ala

Gin

Ala

ctg

ccc

gtt

tgg

gcg

cgg

ccg

gac

tat

aac

ccc

ccg

eta

gtg

gag

acg

Leu 625

Pro

Val

Trp

Ala

Arg 630

Pro

Asp

Tyr

Asn

Pro 635

Pro

Leu

Val

Glu

Thr 640

tgg

aaa

aag

ccc

gac

tac

gaa

cca

cct

gtg

gtc

cat

ggc

aga

aag

acc

Trp

Lys

Lys

Pro

Asp 645

Tyr

Glu

Pro

Pro

Val 650

Val

His

Gly

Arg

Lys 655

Thr

aaa

cgt

aac

acc

aac

cgg

cgg

ccg

cag

gac

gtc

aag

ttc

ccg

ggt

ggc

Lys

Arg

Asn

Thr 660

Asn

Arg

Arg

Pro

Gin 665

Asp

Val

Lys

Phe

Pro 670

Gly

Gly

ggt

cag

atc

gtt

ggt

gga

gtt

tac

ttg

ttg

ccg

cgc

agg

ggc

cct

aga

Gly

Gin

Ile 675

Val

Gly

Gly

Val

Tyr 680

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg 685

Gly

Pro

Arg

ttg

ggt

gtg

ctc

gcg

acg

aga

aag

act

tcc

cct

atc

ccc

aag

gct

cgt

Leu

Gly 690

Val

Leu

Ala

Thr

Arg 695

Lys

Thr

Ser

Pro

Ile 700

Pro

Lys

Ala

Arg

cgg

ccc

gag

ggc

agg

acc

tgg

gct

cag

ccc

ggt

tac

cct

tgg

ccc

ctc

Arg 705

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr 710

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly 715

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu 720

tat

ggc

aat

aag

gac

aga

cgg

tct

aca

ggt

aag

tcc·

tgg

ggt

aag

cca

Tyr

Gly

Asn

Lys

Asp 725

Arg

Arg

Ser

Thr

Gly 730

Lys

Ser

Trp

Gly

Lys 735

Pro

ggg

tac

cct

tgg

cca

aga

aag

acc

aaa

cgt

aac

acc

aac

cgg

cgg

ccg

Gly

Tyr

Pro

Trp 74 0

Pro

Arg

Lys

Thr

Lys 745

Arg

Asn

Thr

Asn

Arg 750

Arg

Pro

cag

gac

gtc

aag

ttc

ccg

ggt

ggc

ggt

cag

atc

gtt

ggt

gga

gtt

tac

Gin

Asp

Val 755

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly 760

Gly

Gin

Ile

Val

Gly 765

Gly

Val

Tyr

ttg

ttg

ccg

cgc

agg

ggc

cct

aga

ttg

ggt

gtg

ctc

gcg

acg

aga

aag

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Val

Leu

Ala

Thr

Arg

Lys

ΊΤΟ 775 780

158 0

1776

1824

1872

1920

1968

2016

2054

2160

2208

2256

2304

2352

1728

2112

PL 209 710 B1 act tcc cct atc ccc aag gct cgt cgg ccc gag ggc agg acc tgg gct 2400

Thr Ser Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala

785 790 795 ₈00 cag ccc ggt tac cct tgg ccc ctc tat ggc aat aag gac aga cgg tct 2448

Gin Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Lys Asp Arg Arg Ser

805 Θ10 815 aca ggt aag tcc tgg ggt aag cca ggg tac cct tgg ccc taatgagtcg ac 2499 Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly Tyr Pro Trp Pro

820 825 <210> 4 <211> 829 <212> PRT <213> Sztuczny <220>

<223> sekwencja aminokwasu MEFA 12 <400> 4

Met Ala Thr Lys Ala Val 1 5

Gly Ile Ile Asn Phe Glu 20

Trp Gly Ser Ile Lys Gly 35

His Glu Phe Gly Asp Asn 50

Phe Asn Pro Leu Ser Thr 65 70

His Ile Thr Gly His Arg 85

Thr Thr Ser Gly Phe Val 100

Glu Thr His Val Thr Gly 115

Thr Ser Leu Phe Ser Pro 130

Ser Thr Asp Asn Ser Ser 145 150

Ala His Leu His Ala Pro 165

Ala Ala Tyr Ala Ala Gin 180

Val Ala Ala Thr Leu Gly 195

Cys Val Leu Lys Gly Asp 10

Gin Lys Glu Ser Asn Gly 25

Leu Thr Glu Gly Leu His 40

Thr Ala Gly Cys Thr Ser S5 60

Arg Gly Cys Asn Cys Ser 75

Met Ala Trp Lys Leu Gly 90

Ser Leu Phe Ala Pro Gly 105

Gly Ala Ala Ala Arg Thr 120

Gly Ala Ser Gin Asn Ile 135 140

Pro Pro Val Val Pro Gin 155

Thr Gly Ser Gly Lys Ser 170

Gly Tyr Lys Val Leu Val 185

Phe Gly Ala Tyr Met Ser 200

Gly Pro Val 15

Pro Val Lys 30

Gly Phe His 45

Ala Gly Pro

Ile Tyr Pro

Ser Ala Ala 95

Ala Lys Gin 110

Thr Ser Gly 125

Gin Leu Ile

Ser Phe Gin

Thr Lys Val 175

Leu Asn Pro 190

Lys Ala His 205

Gin

Val

Val

His

Gly

Arg

Asn

Leu

Thr

Val

160

Pro

Ser

Gly

PL 209 710 B1

Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser 210 215 220

Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys

225 230 235 240

Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys Kis Ser Thr

245 250 255

Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gin Ala Glu 260 265 270

Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly 275 280 285

Ser Val Thr Val Pro Kis Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr 290 295 300

Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val Ile

305 310 315 320

Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp

325 330 335

Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr '340 345 350

Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val 355 360 365

Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Anp 370 375 380

Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Ala Cys Ser Gly Lys Pro Ala Ile

385 390 395 400

Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu

405 410 415

Cys Ser Gin His Leu Pro Tyr Ile Glu Gin Gly Met Met Leu Ala Glu 420 425 430

Gin Phe Lys Gin Lys Ala Leu Gly Leu Ser Arg Gly Gly Lys Pro Ala 435 440 445

Ile Val Pro Asp Lys Glu Val Leu Tyr Gin Gin Tyr Asp Glu Met Glu 450 455 460

Glu Cys Ser Gin Ala Ala Pro Tyr Ile Glu Gin Ala Gin Val Ile Ala

455 470 475 480

His Gin Phe Lys Glu Lys Val Leu Gly Leu Ile Asp Asn Asp Gin Val

485 490 495

Val Val Thr Pro Asp Lys Glu Ile Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met 500 505 510

Glu Glu Cys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Ile Glu Glu Gly Gin Arg Met 515 520 525

PL 209 710 B1

Ala

Glu 530

Met

Leu Lys

Ser

Lys 535

Ile Gin Gly

Leu

Leu 54C

Gly

Ile

Leu

Arg

Arg

His

Val

Gly

Pro

Gly

Glu

Gly

Ala

Val

Gin

Trp

Met

Asn

Arg

Leu

545

550

555

560

Ile

Ala

Phe

Ala

Ser

Arg

Gly

Asn

His

Val

Ser

Pro

Thr

His

Tyr

Val

565

570

575

Pro

Ser

Arg

Ser

Arg

Arg

Phe

Ala

Gin

Ala

Leu

Pro

Val

Trp

Ala

Arg

580

585

590

Pro

Asp

Tyr

Asn

Pro

Pro

Leu

Val

Glu

Thr

Trp

Lys

Lys

Pro

Asp

Tyr

595

600

605

Glu

Pro

Pro

Val

Val

His

Gly

Arg

Ser

Ser

Arg

Arg

Phe

Ala

Gin

Ala

610

615

620

Leu

Pro

Val

Trp

Ala

Arg

Pro

Asp

Tyr

Asn

Pro

Pro

Leu

Val

Glu

Thr

625

630

635

640

Trp

Lys

Lys

Pro

Asp

Tyr

Glu

Pro

Pro

Val

Val

His

Gly

Arg

Lys

Thr

645

650

655

Lys

Arg

Asn

Thr

Asn

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Val

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

660

665

670

Gly

Gin

Ile

Val

Gly

Gly

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

675

680

685

Leu

Gly

Val

Leu

Ala

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Pro

Ile

Pp.o

Lys

Ala

Arg

690

695

700

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

705

710

715

720

Tyr

Gly

Asn

Lys

Asp

Arg

Arg

Ser

Thr

Gly

Lys

Ser

Trp

Gly

Lys

Pro

725

730

735

Gly

Tyr

Pro

Trp

Pro

Arg

Lys

Thr

Lys

Arg

Asn

Thr

Asn

Arg

Arg

Pro

740

745

750

Gin

Asp

Val

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Val

Gly

Gly

Val

Tyr

755

760

765

Leu

Leu

Pro

Arg

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Val

Leu

Ala

Thr

Arg

Lys

770

775

780

Thr

Ser

Pro

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

7Θ5

790

795

800

Gin

Pro

Gly

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Lys

Asp

Arg

Arg

Ser

805

810

815

Thr

Gly

Lys

Ser

Trp

Gly

Lys

Pro

Gly

Tyr

Pro

Trp

Pro

820

825

<210> 5 <211> 3297

PL 209 710 B1

<212> :

DMA

<213>

Sztuczny

<220>

<223> sekwencja CNA ΜΕΕΆ 7

.1

<400>

5

atg

gct

aca

aag

gct

gtt

tgt

gtt

ttg

aag

ggt

gac

ggc

cca

gtt

caa

43

Met

Ala

Thr

Lys

Ala

Val

Cvs

Val

Leu

Lys

Gly

Asp

Gly

Pro

Val

Gin

1

5

10

15

ggt

att

att

aac

ttc

gag

cag

aag

gaa

agt

aat

gga

cca

gtg

aag

gtg

9 6

Gly

Ile

Ile

Asn

Phe

Glu

Gin

Lys

Glu

Ser

Asn

Gly

Pro

Val

Lys

Val

20

25

30

tgg

gga

agc

att

aaa

gga

ctg

act

gaa

ggc

ctg

ca t

gga

ttc

cat

gtt

14 4

Trp

Gly

Ser

Ile

Lys

Gly

Leu

Thr

Glu

Gly

Leu

His

Gly

Phe

His

Val

35

40

45

cat

gag

ttt

gga

gat

aat

aca

gca

ggc

tgt

acc

agt

gca

ggt

cct

cac

192

His

Glu

Phe

Gly

Asp

Asn

Thr

Ala

Gly

Cys

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Hi s

50

55

60

ttt

aat

cct

eta

tcc

aga

aaa

cac

ggt

ggg

cca

aag

gat

gaa

gag

agg

240

Phe

Asn

Pro

Leu

Ser

Arg

Lys

His

Gly

Gly

Pro

Lys

Asp

Glu

Glu

Arg

65

70

75

80

cat

gtt

gga

gac

ttg

ggt

aat

gtg

act

gct

gac

aaa

gat

ggt

gtg

gcc

288

His

Val

Gly

Asp

Leu

Gly

Asn

Val

Thr

Ala

Asp

Lys

Asp

Gly

Val

Ala

85

90

95

gat

gtg

tct

att

gaa

gat

tct

gtg

atc

tca

ctc

tca

gga

gac

cat

tgc

335

Asp

Val

Ser

Ile

Glu

Asp

Ser

Val

Ile

Ser

Leu

Ser

Gly

Asp

His

Cys

100

105

110

atc

att

ggc

cgc

aca

ctg

gtg

gtc

cat

gaa

aaa

gca

gat

gac

ttg

ggc

384

Ile

Ile

Gly

Arg

Thr

Leu

Val

Val

His

Glu

Lys

Ala

Asp

Asp

Leu

Gly

115

120

125

aaa

ggt

gga

aat

gaa

gaa

agt

aca

aag

aca

gga

aac

gct

gga

agt

cgt

432

Lys

Gly

Gly

Asn

Glu

Glu

Ser

Thr

Lys

Thr

Gly

Asn

Ala

Gly

Ser

Arg

130

135

140

ttg

gct

tgt

ggt

gta

att

ggg

atc

gcc

cag

aat

ttg

aat

tct

ggt

tgc

480

Leu

Ala

Cys

Gly

Val

Ile

Gly

Ile

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Ser

Gly

Cys

145 ł

150

155

160

aat

tgc

tct

atc

tat

ccc

ggc

cat

ata

acg

ggt

cac

cgc

atg

gca

tgg

528

Asn

Cys

Ser

Ile

Tyr

Pro

Gly

His

Ile

Thr

Gly

His

Arg

Met

Ala

Trp

165

170

175

aag

ctt

ggt

tcc

gcc

gcc

aga

act

acc

tcg

ggc

ttt

gtc

tcc

ttg

ttc

576

Lys

Leu

Gly

Ser'

Ala

Ala

Arg

Thr

Thr

Ser

Gly

Phe

Val

Ser

Leu

Phe

180

185

190

gcc

cca

ggt

gcc

aaa

caa

aac

gaa

act

cac

gtc

acg

gga

ggc

gca

gcc

624

Ala

Pro

Gly

Ala

Lys

Gin

Asn

Glu

Thr

His

Val

Thr

Gly

Gly

Ala

Ala

195

200

205

gcc

ega

act

acg

tct

ggg

ttg

acc

tct

ttg

ttc

tcc

cca

ggt

gcc

agc

672

PL 209 710 B1

Ala

Arg 210

Thr

Thr

Ser

Gly

Leu 215

Thr

Ser

Leu

Phe

Ser 220

Pro

Gly

Ala

Ser

caa

aac

att

caa

ttg

att

gtc

gac

ttt

atc

cct

gtg

gag

aac

eta

gag

720

Gin 225

Asn

Ile

Gin

Leu

Ile 230

Val

Asp

Phe

Ile

Pro 235

Val

Glu

Asn

Leu

Glu 2 4 0

aca

acc

atg

ega

tct

ccg

gtg

ttc

acg

gat

aac

tcc

tct

cca

cca

gta

768

Thr

Thr

Met

Arg

Ser 245

Pro

Val

Phe

Thr

Asp 250

Asn

Ser

Ser

Pro

Pro 255

Val

gtg

ccc

cag

agc

ttc

cag

gtg

gct

cac

ctc

cat

gct

ccc

aca

ggc

agc

816

Val

Pro

Gin

Ser 2S0

Phe

Gin

Val

Ala

His 265

Leu

His

Ala

Pro

Thr 270

Gly

Ser

ggc

aaa

agc

acc

aag

gtc

ccg

gct

gca

tat

gca

gct

cag

ggc

tat

aag

864

Gly

Lys

Ser 275

Thr

Lys

Val

Pro

Ala 280

Ala

Tyr

Ala

Ala

Gin 285

Gly

Tyr

Lys

gtg

eta

gta

ctc

aac

ccc

tct

gtt

gct

gca

aca

ctg

ggc

ttt

ggt

gct

912

Val

Leu 290

Val

Leu

Asn

Pro

Ser 295

Val

Ala

Ala

Thr

Leu 300

Gly

Phe

Gly

Ala

tac

atg

tcc

aag

gct

cat

ggg

atc

gat

cct

aac

atc

agg

acc

ggg

gtg

960

Tyr 305

Met

Ser

Lys

Ala

His 310

Gly

Ile

Asp

Pro

Asn 315

Ile

Arg

Thr

Gly

Val 320

aga

aca

att

acc

act

ggc

agc

ccc

atc

1 acg

tac

tcc

acc

tac

ggc

aag

1008

Arg

Thr

Ile

Thr

Thr 325

Gly

Ser

Pro

Ile

Thr 330

Tyr

Ser

Thr

Tyr

Gly 335

Lys

ttc

ctt

gcc

gac

ggc

ggg

tgc

tcg

ggg

ggc

gct

tat

gac

ata

ata

att

1056

Phe

Leu

Ala

Asp 340

Gly

Gly

Cys

Ser

Gly 345

Gly

Ala

Tyr

Asp

Ile 350

Ile

Ile

tgt

gac

gag

tgc

cac

tcc

acg

gat

gcc

aca

tcc

atc

ttg

ggc

att

ggc

1104

Cys

Asp

Glu 355

Cys

His

Ser

Thr

Asp 360

Ala

Thr

Ser

Ile

Leu 365

Gly

Ile

Gly

act

gtc

ctt

gac

caa

gca

gag

act

gcg

ggg

gcg

aga

ctg

gtt

gtg

ctc

1152

Thr

Val 370

Leu

Asp

Gin

Ala

Glu 375

Thr

Ala

Gly

Ala

Arg 380

Leu

Val

Val

Leu

gcc

acc

gcc

acc

cct

ccg

ggc

tcc

gtc

act

gtg

ccc

cat

ccc

aac

atc

1200

Ala 385

Thr

Ala

Thr

Pro

Pro 390

Gly

Ser

Val

Thr

Val 395

Pro

His

Pro

Asn

Ile 400

gag

gag

gtt

gct

ctg

tcc

acc

acc

gga

gag

atc

cct

ttt

tac

ggc

aag

1248

Glu

Glu

Val

Ala

Leu 405

Ser

Thr

Thr

Gly

Glu 410

Ile

Pro

Phe

Tyr

Gly 415

Lys

gct

atc

ccc

ctc

gaa

gta

atc

aag

ggg

ggg

aga

cat

ctc

atc

ttc

tgt

1296

Ala

Ile

Pro

Leu 420

Glu

Val

Ile

Lys

Gly 425

Gly

Arg

His

Leu

Ile 430

Phe

Cys

cat

tca

aag

aag

aag

tgc

gac

gaa

ctc

gcc

gca

aag

ctg

gtc

gca

ttg

1344

His

Ser

Lys 435

Lys

Lys

Cys

Asp

Glu 440

Leu

Ala

Ala

Lys

Leu 445

Val

Ala

Leu

ggc

atc

aat

gcc

gtg

gcc

tac

tac

cgc

ggt

ctt

gac

gtg

tcc

gtc

atc

1392

PL 209 710 B1

Gly

Ile 450

Asn

Ala

Val

Ala

Tyr 455

Tyr

Arg

Gly

Leu

Asp 460

Val

Ser

Val

Ile

ccg

acc

age

ggc

gat

gtt

gtc

gtc

gtg

gca

acc

gat

gcc

ctc

atg

acc

1440

Pro

Thr

Ser

Gly

Asp

Val

Val

Val

Val

Ala

Thr

Asp

Ala

Leu

Met

Thr

455

470

475

480

ggc

tat

acc

ggc

gac

ttc

gac

tcg

gtg

ata

gac

tgc

aat

acg

tgt

gtc

14 8 8

Gly

Tyr

Thr

Gly

Asp

Phe

Asp

Ser

Val

Ile

Asp

Cys

Asn

Thr

Cys

Val

485

490

495

acc

cag

aca

gtc

gat

ttc

age

ctt

gac

cct

acc

ttc

acc

att

gag

aca

1536

Thr

Gin

Thr

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Asp

Pro

Thr

Phe

Thr

Ile

Glu

Thr

500

505

510

atc

acg

ctc

ccc

caa

gat

get

gtc

tcc

cgc

act

caa

cgt

cgg

ggc

agg

1584

Ile

Thr

Leu

Pro

Gin

Asp

Ala

Val

Ser

Arg

Thr

Gin

Arg

Arg

Gly

Arg

515

520

525

act

ggc

agg

ggg

aag

cca

ggc

atc

tac

aga

ttt

gtg

gca

ccg

ggg

gag

1632

Thr

Gly

Arg

Gly

Lys

Pro

Gly

Ile

Tyr

Arg

Phe

Val

Ala

Pro

Gly

Glu

530

535

540

cgc

ccc

tcc

ggc

atg

ttc

gac

tcg

tcc

gtc

ctc

tgt

gag

tgc

tat

gac

1680

Arg

Pro

Ser

Gly

Met

Phe

Asp

Ser

Ser

Val

Leu

Cys

Glu

Cys

Tyr

Asp

545

550

555

560

gca

ggc

tgt

get

tgg

tat

gag

ctc

acg

ccc

gcc

gag

act

aca

gt t

agg

1728

Ala

Gly

Cys

Ala

Trp

Tyr

Glu

Leu

Thr

Pro

Ala

Glu

Thr

Thr

Val

Arg

565

570

575

eta

ega

gcg

tac

atg

aac

acc

ccg

ggg

ctt

ccc

gtg

tgc

cag

gac

cat

1776

Leu

Arg

Ala

Tyr

Met

Asn

Thr

Pro

Gly

Leu

Pro

Val

Cys

Gin

Asp

His

580

585

590

ctt

gaa

ttt

tgg

gag

ggc

gtc

ttt

aca

ggc

ctc

act

cat

ata

gat

gcc

1824

Leu

Glu

Phe

Trp

Glu

Gly

Val

Phe

Thr

Gly

Leu

Thr

His

Ile

Asp

Ala

595

600

605

cac

ttt

eta

tcc

cag

aca

aag

cag

agt

ggg

gag

aac

ctt

cct

tac

ctg

1872

His

Phe

Leu

Ser

Gin

Thr

Lys

Gin

Ser

Gly

Glu

Asn

Leu

Pro

Tyr

Leu

610

615

620

gta

gcg

tac

caa

gcc

acc

gtg

tgc

get

agg

get

caa

gcc

cct

ccc

cca

1920

Val

Ala

Tyr

Gin

Ala

Thr

Val

Cys

Ala

Arg

Ala

Gin

Ala

Pro

Pro

Pro

625

630

635

640

tcg

tgg

gac

cag

atg

tgg

aag

tgt

ttg

att

cgc

ctc

aag

ccc

acc

ctc

1968

Ser

Trp

Asp

Gin

Met

Trp

Lys

Cys

Leu

Ile

Arg

Leu

Lys

Pro

Thr

Leu

645

650

655

cat

ggg

cca

aca

ccc

ctg

eta

tac

aga

ctg

ggc

get

gtt

cag

aat

gaa

2016

His

Gly

Pro

Thr

Pro

Leu

Leu

Tyr

Arg

Leu

Gly

Ala

Val

Gin

Asn

Glu

660

665

670

atc

acc

ctg

acg

cac

cca

gtc

acc

aaa

tac

atc

atg

aca

tgc

atg

tcg

2064

Ile

Thr

Leu

Thr

His

Pro

Val

Thr

Lys

Tyr

Ile

Met

Thr

Cys

Met

Ser

675

680

685

gcc

gac

ctg

gag

gtc

gtc

acg

age

gca

tgc

tcc

ggg

aag

ccg

gca

atc

2112

PL 209 710 B1

2150

Ala

Asp 690

Leu

Glu

Val

Val

Thr 695

Ser

Ala

Cys

Ser

Gly 700

Lys

Pro

Ala

Ile

ata

cct

gac

agg

gaa

gtc

ctc

tac

ega

gag

ttc

gat

gag

atg

gaa

gag

Ile 705

Pro

Asp

Arg

Glu

Val 710

Leu

Tyr

Arg

Glu

Phe 715

Asp

Glu

Met

Glu

Glu 720

tgc

tet

cag

cac

tta

ccg

tac

atc

gag

caa

ggg

atg

atg

ctc

gcc

gag

Cys

Ser

Gin

His

Leu 725

Pro

Tyr

Ile

Glu

Gin 730

Gly

Met

Met

Leu

Ala 735

Glu

cag

ttc

aag

cag

aag

gcc

ctc

ggc

ctc

teg

ega

ggg

ggc

aag

ccg

gca

Gin

Phe

Lys

Gin 740

Lys

Ala

Leu

Gly

Leu 745

Ser

Arg

Gly

Gly

Lys 750

Pro

Ala

atc

gtt

cca

gac

aaa

gag

gtg

ttg

tat

caa

caa

tac

gat

gag

atg

gaa

Ile

Val

Pro 755

Asp

Lys

Glu

Val

Leu 760

Tyr

Gin

Gin

Tyr

Asp 765

Glu

Met

Glu

gag

tgc

tea

caa

get

gcc

cca

tat

atc

gaa

caa

get

cag

gta

ata

get

Glu

Cys 770

Ser

Gin

Ala

Ala

Pro 775

Tyr

Ile

Glu

Gin

Ala 730

Gin

Val

Ile

Ala

cac

cag

ttc

aag

gaa

aaa

gtc

ctt

gga

ttg

atc

gat

aat

gat

caa

gtg

His 785

Gin

Phe

Lys

Glu

Lys 790

Val

Leu

Gly

Leu

Ile 795

Asp

Asn

Asp

Gin

Val 800

gtt

gtg

act

cct

gac

aaa

gaa

atc

tta

tat

gag

gcc

ttt

gat

gag

atg

Val

Val

Thr

Pro

Asp 805

Lys

Glu

Ile

Leu

Tyr 810

Glu

Ala

Phe

Asp

Glu 815

Met

gaa

gaa

tgc

gcc

tcc

aaa

gcc

gcc

ctc

att

gag

gaa

ggg

cag

cgg

atg

Glu

Glu

Cys

Ala 820

Ser

Lys

Ala

Ala

Leu 825

Ile

Glu

Glu

Gly

Gin 830

Arg

Met

gcg

gag

atg

ctc

aag

tet

aag

ata

caa

ggc

ctc

ctc

ggg

ata

ctg

cgc

Ala

Glu

Met 835

Leu

Lys

Ser

Lys

Ile 840

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly 845

Ile

Leu

Arg

cgg

cac

gtt

ggt

cct

ggc

gag

ggg

gca

gtg

cag

tgg

atg

aac

cgg

ctg

Arg

His 850

Val

Gly

Pro

Gly

Glu 855

Gly

Ala

Val

Gin

Trp 860

Met

Asn

Arg

Leu

ata

gcc

ttc

gcc

tcc

aga

ggg

aac

cat

gtt

tcc

ccc

acg

cac

tac

gtt

Ile 865

Ala

Phe

Ala

Ser

Arg 870

Gly

Asn

His

Val

Ser 875

Pro

Thr

His

Tyr

Val 880

ccg

tet

aga

tcc

cgg

aga

ttc

gcc

cag

gcc

ctg

ccc

gtt

tgg

gcg

cgg

Pro

Ser

Arg

Ser

Arg 885

Arg

Phe

Ala

Gin

Ala 890

Leu

Pro

Val

Trp

Ala 895

Arg

ccg

gac

tat

aac

ccc

ccg

eta

gtg

gag

acg

tgg

aaa

aag

ccc

gac

tac

Pro

Aep

Tyr

Asn 900

Pro

Pro

Leu

Val

Glu 905

Thr

Trp

Lys

Lys

Pro 910

Asp

Tyr

gaa

cca

cct

gtg

gtc

cac

ggc

aga

tet

tet

cgg

aga

ttc

gcc

cag

gcc

Glu

Pro

Pro 915

Val

Val

His

Gly

Arg 920

Ser

Ser

Arg

Arg

Phe 925

Ala

Gin

Ala

ctg

ccc

gtt

tgg

gcg

cgg

ccg

gac

tat

aac

ccc

ccg

eta

gtg

gag

acg

2208

2256

04

2352

2400

2448

2496

2544

2592

2640

2688

2736

2784

2832

PL 209 710 B1

Leu

Pro 930

Val

Ala

Arg

Pro 335

Asp

Tyr

Asn

Pro

Pro 940

Leu

Val

Glu

Thr

tgg

aaa

aag

CCC

gac

tac

gaa

cca

cct

gtg

gtc

cat

ggc

aga

aag

acc

2880

Trp

Lys

Lys

Pro

Asp

Tyr

Glu

Pro

Pro

Val

Val

His

Gly

Arg

Lys

Thr

945

950

955

950

aaa

cgt

aac

acc

aac

cgg

cgg

ccg

cag

ga c

gtc

aag

ttc

ccg

ggt

ggc

2 9 28

Lys

Arg

Asn

Thr

Asn

Arg

Arg

Pro

Gin

Asp

Val

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

965

970

975

ggt

cag

atc

gc.L

ggt

cgc

agg

ggc

cct

cct

atc

ccc

aag

gct

cgt

cgg

2976

Gly

Gin

Ile

Val

Gly

Arg

Arg

Gly

Pro

Pro

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

990

985

990

ccc

gag

ggt

agg

acc

tgg

gct

cag

ccc

ggt

tac

cct

tgg

ccc

ctc

tat

3 024

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

995

1000

1005

ggc

aat

aag

gac

aga

cgg

tct

aca

ggt

aag

tcc

tgg

ggt

aag

cca

ggg

3 07 2

Gly

Asn

Lys

Asp

Arg

Arg

Ser

Thr

Gly

Lys

Ser

Trp

Gly

Lys

Pro

Gly

1010

1015

1020

tac

cct

tgg

cca

aga

aag

acc

aaa

cgt

aac

acc

aac

ega

cgg

ccg

cag

3120

Tyr

Pro

Trp

Pro

Arg

Lys

Thr

Lys

Arg

Asn

Thr

Asn

Arg

Arg

Pro

Gin

1025

1030

1035

1040

gac

gtc

aag

ttc

ccg

ggt

ggc

ggt

cag

atc

gtt

ggt

cgc

agg

ggc

cct

3168

Asp

Val

Lys

Phe

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

Ile

Val

Gly

Arg

Arg

Gly

Pro

1045

1050

1055

cct

atc

ccc

aag

gct

cgt

cgg

ccc

gag

ggc

agg

acc

tgg

gct

cag

ccc

3216

Pro

Ile

Pro

Lys

Ala

Arg

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

1050

10S5

1070

ggt

tac

cct

tgg

ccc

ctc

tat

ggc

aat

aag

gac

aga

cgg

tct

acc

ggt

3264

Gly

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Ijys

Asp

Arg

Arg

Ser

Thr

Gly

1075

1080

1085

aag

tcc

tgg

ggt

aag

cca

ggg

tat

cct

tgg

ccc

3297

Lys

Ser

Trp

Gly

Lys

Pro

Gly

Tyr

Pro

Trp

Pro

1090

1095

<210> 6 <211> 1099 <212> PRT <213> „ .

Sztuczny <220>

<223> sekwencja aminokwasu ΜΕΤΆ 7.1 <400> δ

Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin 15 10 15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gin Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 20 25 30

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val

PL 209 710 B1

35

40

45

His

Glu 50

Phe

Gly

Asp

Asn

Thr 55

Ala

Gly

Cys

Thr

Ser 60

Ala

Gly

Pro

His

Phe 65

Asn

Pro

Leu

Ser

Arg 70

Lys

His

Gly

Gly

Pro 75

Lys

Asp

Glu

Glu

Arg 80

His

Val

Gly

Asp

Leu 85

Gly

Asn

Val

Thr

Ala 90

Asp

Lys

Asp

Gly

Val 95

Ala

Asp

Val

Ser

Ile 100

Glu

Asp

Ser

Val

Ile 105

Ser

Leu

Ser

Gly

Asp 110

His

Cys

Ile

Ile

Gly 115

Arg

Thr

Leu

Val

Val 120

His

Glu

Lys

Ala

Asp 125

Asp

Leu

Gly

Lys

Gly 130

Gly

Asn

Glu

Glu

Ser 135

Thr

Lys

Thr

Gly

Asn 140

Ala

Gly

Ser

Arg

Leu 145

Ala

Cys

Gly

Val

Ile 150

Gly

Ile

Ala

Gin

Asn 155

Leu

Asn

Ser

Gly

Cys 160

Asn

Cys

Ser

Ile

Tyr 165

Pro

Gly

His

Ile

Thr 170

Gly

His

Arg

Met

Ala 175

Trp

Lys

Leu

Gly

Ser 180

Ala

Ala

Arg

Thr

Thr 185

Ser

Gly

Phe

Val

Ser 190

Leu

Phe

Ala

Pro

Gly

Ala

Lys

Gin

Asn

Glu

Thr

His

Val

Thr

Gly

Gly

Ala

Ala

195 200 205

Ala Arg Thr Thr Ser Gly Leu Thr Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ala Ser 210 215 220

Gin Asn Ile Gin Leu Ile Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Glu ²²⁵ 230 235 240

Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Val

245 250 ₂₅₅

Val Pro Gin Ser Phe Gin Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser 260 265 270

Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gin Gly Tyr Lys 275 280 285

Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala 290 295 300

PL 209 710 B1

Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val

305 310 315 320

Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys

325 330 335

Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile 340 345 350

Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly 355 360 365

Thr Val Leu Asp Gin Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu 370 375 380

Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile

385 390 395 400

Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys

405 410 415

Ala Ile Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys 420 425 430

His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu 435 440 445

Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile 450 455 460

Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr

465 470 475 480

Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val

485 490 495

Thr Gin Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr 500 505 510

Ile Thr Leu Pro Gin Asp Ala Val Ser Arg Thr Gin Arg Arg Gly Arg 515 520 525

Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly Glu 530 535 540

Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp

545 550 555 560

Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg

565 570 575

Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gin Asp His 580 585 590

Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala 595 600 605

PL 209 710 B1

Hia

Phe 610

Leu

Ser

Gin

Thr

Lys 615

Gin

Ser

Gly

Glu

Asn 620

Leu

Pro

Tyr

Leu

Val 625

Ala

Tyr

Gin

Ala

Thr 630

Val

Cys

Ala

Arg

Ala 635

Gin

Ala

Pro

Pro

Pro 640

Ser

Trp

Asp

Gin

Met 645

Trp

Lys

Cys

Leu

Ile 650

Arg

Leu

Lys

Pro

Thr 655

Leu

His

Gly

Pro

Thr 660

Pro

Leu

Leu

Tyr

Arg 665

Leu

Gly

Ala

Val

Gin 670

Asn

Glu

Ile

Thr

Leu 675

Thr

His

Pro

Val

Thr 680

Lys

Tyr

Ile

Met

Thr 685

Cys

Met

Ser

Ala

Asp 690

Leu

Glu

Val

Val

Thr 695

Ser

Ala

Cys

Ser

Gly 700

Lys

Pro

Ala

Ile

Ile 705

Pro

Asp

Arg

Glu

Val 710

Leu

Tyr

Arg

Glu

Phe 715

Asp

Glu

Met

Glu

Glu 720

Cys

Ser

Gin

His

Leu 725

Pro

Tyr

Ile

Glu

Gin 730

Gly

Met

Met

Leu

Ala 735

Glu

Gin

Phe

Lys

Gin 740

Lys

Ala

Leu

Gly

Leu 745

Ser

Arg

Gly

Gly

Lys 750

Pro

Ala

Ile

Val

Pro 755

Asp

Lys

Glu

Val

Leu 760

Tyr

Gin

Gin

Tyr

Asp 765

Glu

Met

Glu

Glu Cys Ser Gin Ala Ala Pro Tyr Ile Glu Gin Ala Gin Val Ile Ala 770 775 780

His Gin Phe Lys Glu Lys Val Leu Gly Leu Ile Asp Asn Asp Gin Val

785 790 795 800

Val Val Thr Pro Asp Lys Glu Ile Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met

805 810 815

Glu Glu Cys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Ile Glu Glu Gly Gin Arg Met 820 825 830

Ala

Glu

Met 835

Leu

Lys

Ser

Lys

Ile 840

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly 845

Ile

Leu

Arg

Arg

His

Val

Gly

Pro

Gly

Glu

Gly

Ala

Val

Gin

Trp

Met

Asn

Arg

Leu

850 855 860

Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val

865 870 875 880

Pro Ser Arg Ser Arg Arg Phe Ala Gin Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg

885 890 895

Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr 900 905 910

PL 209 710 B1

Glu	Pro Pro Val Val His Gly Arg	Ser Ser Arg Arg	Phe 925	Ala	Gin	Ala
915	920
Leu	Pro Val Trp 930	Ala Arg Pro Asp 935	Tyr Asn Pro Pro 940	Leu	Val	Glu	Thr
Trp 945	Lys Lys Pro	Asp Tyr Glu Pro 950	Pro Val Val His 955	Gly	Arg	Lys	Thr 960
Lys	Arg Asn Thr	Asn Arg Arg Pro 965	Gin Asp Val Lys 970	Phe	Pro	Gly 975	Gly
Gly	Gin Ile Val 980	Gly Arg Arg Gly	Pro Pro Ile Pro 985	Lys	Ala 990	Arg	Arg
Pro	Glu Gly Arg 995	Thr Trp Ala Gin 1000	Pro Gly Tyr Pro Trp 1005	Pro	Leu	Tyr
Gly Asn Lys Asp 1010	Arg Arg Ser Thr 1015	Gly Lys Ser Trp 1020	Gly	Lys	Pro	Gly
Tyr Pro Trp Pro 1025	Arg Lys Thr Lys 1030	Arg Asn. Thr Asn 1035	Arg	Arg	Pro Gin 1040
Asp	Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly 1045	Gin Ile Val Gly 1050	Arg	Arg Gly 1055	Pro
Pro	Ile Pro Lys 1060	Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr 1065	Trp Ala 1070	Gin	Pro
Gly	Tyr Pro Trp	Pro Leu Tyr Gly	Asn Lys Asp Arg	Arg	Ser	Thr	Gly

1075 1080 1085

Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly Tyr Pro Trp Pro 1090 1095

<210>	7
<211>	21
<212>	PRT
<213>	Sztuczny
<220>
<223 >	'Sekwencja konsensusowa
<400>	7
Gly Ser Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gly Phe Val Ser Leu Phe Ala Pro

10 15

Gly Ala Lys Gin Asn 20 <210> 8 <211> 10 <212> DNA

PL 209 710 B1

<213>	Sztuczny
<220>
<223>	sekwencja następująca po miejscu Hindlll
<400>	8
acaaaac	:aaa	10
<210>	9
<211>	23
<212>	PRT
e213>	Sztuczny
<220>
<223?	Peptyd NS4A
<400?	9
Lys Lys	Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys

10 15

Pro Ala Ile Ile Pro Lys Lys 20

Claims (1)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykrywania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w biologicznej próbce, znamienny tym, że obejmuje:

   (a) dostarczenie stałego podłoża immunotestu zawierającego związane z nim antygeny HCV, przy czym te antygeny HCV składają się z jednego lub więcej antygenów NS 3/4a HCV przy czym co najmniej jeden z antygenów NS3/4a zawiera epitop konformacyjny o sekwencji aminokwasów 2-686 z SEQ ID nr 2;

   (b) łączenie biologicznej próbki z wymienionym podłożem stałym w warunkach, które pozwalają przeciwciałom HCV, jeśli są obecne w biologicznej próbce, związać się z jednym lub więcej antygenami NS3/4a;

   (c) dodanie do podłoża stałego z punktu (b), w warunkach tworzenia kompleksu, wykrywalnego znakowanego wieloepitopowego antygenu fuzyjnego (MEFA), przy czym znakowany MEFA zawiera co najmniej jeden epitop z regionu NS3/4a HCV i sekwencję konsensusową z hiperzmiennego regionu E2 dla aminokwasów 390-410 genomu HCV typu 1 o sekwencji SEQ ID nr 7, przy czym wspomniany MEFA wi ąże wspomniane przeciwcia ło HCV;

   (d) wykrycie kompleksów wytworzonych pomiędzy wymienionym przeciwciałem HCV i antygenem NS3/4a i MEFA jeśli są obecne jako wykazanie infekcji HCV w biologicznej próbce.

   2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jeden z NS3/4a składa się z sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 2.

   3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że MEFA zawiera epitop z regionu proteazy NS3/4a poliproteiny HCV.

   4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że MEFA zawiera epitop z regionu helikazy NS3/4a poliproteiny HCV.

   5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że MEFA zawiera aminokwasy 1193-1657, numerowane odpowiednio do sekwencji HCV-1.

   6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że MEFA zawiera epitop z regionu c33c poliproteiny HCV.

   7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że MEFA zawiera aminokwasy 1211-1457, numerowane odpowiednio do HCV-1.

   8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że MEFA zawiera aminokwasy 1192-1457, numerowane odpowiednio do HCV-1.

   PL 209 710 B1

   9. Sposób według z zastrz. 1, znamienny tym, że MEFA zawiera epitop z regionu 5-1-1 poliproteiny HCV.

   10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że MEFA zawiera aminokwasy 1689-1735, numerowane odpowiednio do HCV-1.

   11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że MEFA zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID nr:4.

   12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że MEFA zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID nr:6.

   13. Sposób wykrywania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w biologicznej próbce, znamienny tym, że obejmuje:

   (a) dostarczenie stałego podłoża testu immunologicznego zawierającego antygeny HCV z nim związane, przy czym te antygeny HCV składają się z jednego lub więcej wieloepitopowych antygenów fuzyjnych (MEFAs); przy czym te MEFAs zawierają co najmniej jeden epitop z regionu NS3/4a i sekwencję konsensusową z hiperzmiennego regionu E2 dla aminokwasów 390-410 genomu HCV typu 1 o sekwencji SEQ ID nr: 7;

   (b) wiązanie biologicznej próbki z wymienionym podłożem stałym w warunkach, które pozwalają przeciwciałom HCV, jeśli są obecne w biologicznej próbce, związać się z jednym lub więcej wymienionym MEFAs;

   (c) dodanie do podłoża stałego z punktu (b), w warunkach tworzenia kompleksu, wykrywalnego, znakowanego, izolowanego antygenu NS3/4a HCV zawierającego epitop konformacyjny, przy czym ten wykrywalny znakowany antygen NS3/4a wiąże wspomniane związane przeciwciało HCV i ponadto wspomniany antygen NS3/4a zawiera aminokwasy 2-686 o sekwencji SEQ ID nr 2;

   (d) wykrycie kompleksów tworzonych pomiędzy przeciwciałem HCV i wykrywalnym znakowanym antygenem NS3/4a i MEFA, jeśli są obecne, jako wykazanie infekcji HCV w biologicznej próbce.

   14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że wykrywalny znakowany antygen NS3/4a składa się z wykrywalnego znacznika i sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:2.

   15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że MEFA zawiera epitop z regionu proteazy NS3/4a poliproteiny HCV.

   16. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że MEFA zawiera epitop z regionu helikazy NS3/4a poliproteiny HCV.

   17. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że MEFA zawiera aminokwasy 1193-1657, numerowane odpowiednio do sekwencji HCV-1.

   18. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że MEFA zawiera epitop z regionu c33c poliproteiny HCV.

   19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że MEFA zawiera aminokwasy 1211-1457, numerowane odpowiednio do HCV-1.

   20. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że MEFA zawiera aminokwasy 1192-1457, numerowane odpowiednio do HCV-1.

   21. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że MEFA zawiera epitop z regionu 5-1-1 poliproteiny HCV.

   22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że MEFA zawiera aminokwasy 1689-1735, numerowane odpowiednio do HCV-1.

   23. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że MEFA zawiera sekwencję aminokwasową opisaną na SEQ ID nr:4.

   24. Sposób według z zastrz. 13, znamienny tym, że MEFA zawiera sekwencję aminokwasową opisaną na SEQ ID nr:6.

   25. Sposób według z zastrz. 1, znamienny tym, że MEFA jest MEFA 13 lub MEFA 13.1.

   26. Sposób według z zastrz. 13, znamienny tym, że MEFA jest MEFA 13 lub MEFA 13,1.

   PL 209 710 B1

   Rysunki

   2421-3011

   PL 209 710 B1

   PL 209 710 B1

   Μ A Ρ I Τ A ΑΤΟ GCG CCC ATC ACG GCG

   TRGLLGCIITS ACA AGG GGC CTC CTA GGG TGC ATA ATC ACC AGC

   DKNQVEGEVQI GAC AAA AAC CAA GTG GAG GGT GAG GTC CAG ATT

   AQTFLATCING GCC CAA ACC TTC CTG GCA ACG TGC ATC AAT GGG

   VYHGAGTRTIA GTC TAC CAC GGG GCC GGA ACG AGG ACC ATC GCG

   PVIQMYTNVDQ CCT GTC ATC CAG ATG TAT ACC AAT GTA GAC CAA

   WPAPQGSRSLT TOG CCC GCT CCG CAA GGT AGC CGA TCA TTG ACA

   110

   GSSDLYLVTRE GGC TCC TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG AGG CAC

   120

   PVRRRGDSRG£ CCC GTG CGC CGG CGG GGT GAT AGC AGG GGC AGC

   140

   RPISYLKGSEG CGG CCC ATT TCC TAC TTG AAA GGC TCC TCG GGG

   150

   CPAGHAVGIPR TGC CCC GCG GGG CAC GCC GTG GGC ATA TTT AGG

   170

   TRGVAKAVDPI ACC CGT GGA GTG GCT AAG GCG GTG GAC TTT ATC

   180

   LETTMRSPVFT CTA GAG ACA ACC ATG AGG TCC CCG GTG TTC ACG

   FI6.3A

   Y A Q Q TAC GCC CAG CAG

   L T G R CTA ACT GOC CGG

   V S T A GTG TCA ACT GCT

   V C W T GTG TGC TGG ACT

   S Ρ K G TCA CCC AAG GOT

   D L V G GAC CTT GTG GOC

   100

   P C T C CCC TGC ACT TGC

   A D V I GCC GAT GTC ATT

   130

   L L S P CTG CTG TCG CCC

   G P L L GGT CCG CTG TTG

   160

   A A V C GCC GCG GTG TGC

   Ρ V Ε N CCT GTG GAG AAC

   190

   D N S S GAT AAC TCC TCT

   PL 209 710 B1

   P P V V P Q S F CCA CCA GTA GTG CCC 210 CAG AGC TTC P T G S G K S T CCC ACA GGC AGC GGC AAA AGC ACC A Q G Y K V ,L V GCT CAG GGC TAT AAG 240 GTG ĆTA GTA T Ł G F G A Y M ACA CTG GGC TTT GGT GCT TAC ATG P N X R T G V R CCT AAC ATC AGG ACC 270 GGG GTG AGA X T Y S Γ Y G K ATC ACG TAC TCC ACC TAC GGC AAG s G G A Y D I I TCG GGG GOC GCT TAT 300 GAC ATA ATA T D A T S I L G ACG GAT GCC ACA TCC ATC TTG GGC A E T A a A R Ł GCA GAG ACT GCG GGG 330 GCG AGA CTG P P G S V T V P CCT CCG GGC TCC GTC ACT GTG CCC A Ł S T T G E I GCT CTG TCC ACC ACC 360 GGA GAG ATC P L E V r K G G CCC CTC GAA GTA ATC AAG GGG GGG G K K K C D E L TCA AAG AAG AAG TGC GAC GAA CTC

   200

   Q V A H L Η A CAG GTG GCT CAC CTC CAT GCT

   220

   K V P A A Y A AAG GTC CCG GCT GCA TAT GCA

   230

   L N P S V A A CTC AAC CCC TCT GTT GCT GCA

   250

   S K A H G I D TCC AAG GCT CAT GGG ATC GAT

   260

   T I T T G S P ACA ATT ACC ACT GGC AGC CCC

   280

   F L A D G G C TTC CTT GCC GAC GGC GGG TGC

   290

   I C D E C H S ATT TGT GAC GAG TGC CAC TCC

   310

   I G T V L D Q ATT GGC ACT GTC CTT GAC CAA

   320

   V V Ł A T A T GTT GTG CTC GCC ACC GCC ACC

   340

   Η P Η I E E V CAT CCC AAC ATC GAG GAG GTT

   350

   P F Y G K A I CCT TTT TAC GGC AAG GCT ATC

   370

   R H L· I F C H AGA CAT CTC ATC TTC TGT CAT

   380

   A A K L V A L GCC GCA AAG CTG GTC GCA TTG

   FtG.3B

   PL 209 710 B1

   390 400

   G I N A V A Y Y R G L D V S V GGC ATC AAT GCC GTG GCC TAC TAC CGC GGT CTT GAC GTG TCC : gtc 410 I P P I G D V V V V A Ί D A L ATC CCG CCC ATC GGC GAT GTT GTC GTC GTG GCA ACC GAT GCC CTC 420 430 M T G Y T 0 D F D S V I D c N ATG ACC GGC TAT ACC GGC GAC TTC GAC TCG GTG ATA, . GAC TGC AAT 440 T C V T Q T V D' F S L D P T F ACG TGT GTC ACC CAG ACA GTC GAT TTC AGC CTT GAC CCT ACC TTC 450 460 T I E T I T L P Q D A V s R T ACC ATT GAG ACA ATC ACG CTC CCC CAA GAT GCT GTC TCC CGC ACT 4 70 C R R G R T G R G K P G I Y R CAA CGT CGG GGC AGG ACT GGC AGG GGG AAG CCA GGC ATC TAC AGA 480 490 F V A P G E R P S G M F D S e TTT GTG GCA CCG GGG GAG CGC CCC TCC GGC ATG TTC GAC TCG TCC 500 V b C S C Y D A G C A w Y E L GTC CTC TGT GAG TGC TAT GAC GCA GGC TGT GCT TGG TAT GAG CTC 510 52 0 T P A E T T V R L R A Y M N T ACG CCC GCC GAG ACT ACA GTT AGG CTA CGA GCG TAC ATG AAC ACC 530 P G L P V C Q D H L E F W E G CCG GGG CTT CCC GTG TGC CAG GAC CAT CTT GAA TTT TGG GAG GGC 540 550 V F T G L T H I D A H F L S Q GTC TTT ACA GGC CTC ACT CAT ATA GAT GCC CAC TTT CTA TCC CAG 560 T K Q S G E N L P Y L V A Y Q ACA AAG CAG AGT GGG GAG AAC CTT CCT TAC CTG GTA GCG TAC CAA 570 580 A T V C A R A Q A P P P S W D GCC ACC GTG TGC GCT AGG GCT CAA GCC CCT CCC CCA TCG TGG GAC

   FI&3C

   PL 209 710 B1

   590

   OMWK CLIRLKPTLHG CAG ATG TOG AAG TGT TTG ATT CGC CTC AAG CCC ACC CTC CAT GGG

   600 610 P TPLLYRLGA VQNBI

   CCA ACA CCC CTG CTA TAC AGA CTG GGC GCT GTT CAG AAT GAA ATC

   620

   TLTHPVTKYIMTCMS ACC CTG ACG CAC CCA GTC ACC AAA TAC ATC ATG ACA TGC ATG TCG

   630 640

   KDLEVVTS T W V L V G G

   GCC GAC CTG GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG GTG CTC GTT GOC GOC

   650

   V LAALAAY C L S T G C V GTC CTG GCT GCT TTG GCC GCG TAT TGC CTG TCA ACA GGC TGC GTG

   660 670

   VlVGRVVLSGKPAII GTC ATA GTG GGC AGG GTC GTC TTG TCC GGG AAG CCG GCA ATC ATA

   680

   PDREVLYREFDEMEE CCT GAC AGG GAA GTC CTC TAC CGA GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG

   686

   C

   TGC

   FIG.3D

   PL 209 710 B1 pAcHLT ns3ns4aPI p<ŁHCVlŁns3ns4aPI

   PL 209 710 B1

   Konstrukt antygenu MEFA12

   FI 6.5

   PL 209 710 B1

   PL 209 710 B1

   140 150 asqniqlitstdnss

   GCC AGC CAA AAC ATT CAA TTG ATT ACT AGT ACG GAT AAC TCC TCT

   450

   160

   PPVVPQSFQVAHLHA CCA CCA GTA GTG CCC CAG AGC TTC CAG GTG GCT CAC CTC CAT GCT 495

   I⁷⁰ 180

   P T. GSGKS TKVPAAYA

   CCC ACA GGC AGC GGC AAA AGC ACC AAG GTC CCG GCT. GCA TAT GCA 540

   190

   AQGYKVLVLNPSVAA GCT CAG GGC TAT AAG GTG CTA GTA CTC AAC CCC TCT GTT GCT GCA 585

   200 210 TLGFGAYMSKAHGID

   ACA CTG GGC TTT GGT GCT TAC ATG TCC AAG GCT CAT GGG ATC GAT 630

   220

   PNIRTGVRTITTGSP CCT AAC ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT GGC AGC CCC 675

   230 240

   I TYSTYGKFLADGGC

   ATC ACG TAC TCC ACC TAC GGC AAG TTC CTT GCC GAC GGC GGG TGC 720

   250

   SGGAY. DIIICDECHS TCG GGG GGC GCT TAT GAC ATA ATA ATT TGT GAC GAG TGC CAC TCC 765

   260 270 TDATSILGIGTVLDQ

   ACG GAT GCC ACA TCC ATC TTG GGC ATC GGC ACT GTC CTT GAC CAA 810

   280

   AE TAGARLV VLATAT GCA GAG ACT GCG GGG GCG-AGA CTG GTT GTG CTC GCC ACC GCC ACC 855

   290 300 ppgsvtvphpnieev

   CCT CCG GGC TCC GTC ACT GTG CCC CAT CCC AAC ATC GAG GAG GTT 900

   F 16. 6B

   PL 209 710 B1

   310

   A GCT L CTG S TCC T ACC T ACC G GGA E GAG I ATC P CCT F TTT Y TAC G GGC K AAG A GCT I ATC 945 P L E V 320 r K G G R H L I F C 330 H CCC CTC GAA GTA ATC AAG GGG GGG AGA CAT CTC ATC TTC TGT CAT 990 S K K K C D E L A 340 A K L V A L TCA AAG AAG AAG TGC GAC GAA CTC GCC GCA AAG CTG GTC GCA TTG 1035 G I N A 350 V A Y Y R G L - D V S 3 60 V GGC ATC AAT GCC GTG GCC TAC TAC CGC GGT CTT GAC GTG TCC GTC 1080 I P T S G D V V V 370 V A T D A L ATC CCG acc AGC GGC GAT GTT GTC GTC GTG GCA ACC GAT GCC CTC 1125 N T G Y 380 T G D F D S V I D. c 390 N ATG ACC GGC TAT ACC GGC GAC TTC GAC TCG GTG ATA GAC TGC AAT 1170 T C A C S G K P A 400 I I P D R E ACG TGT GCA TGC TCC GGG AAG CCG GCA ATC ATA CCT GAC AGG GAA 1215 V . ,L Y R 410 E F D E M E E c S Q 420 H GTC CTC TAC CGA GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC TCT CAG CAC 1260 L P Y I E Q G M M 430 L A E Q F K TTA CCG TAC ATC GAG CAA GGG ATG ATG CTC GCC GAG CAG TTC AAG 1305 Q K A L 440 G L S R G G K P A I 450 V CAG AAG GCC CTC GGC CTC TCG CGA GGG GGC AAG CCG GCA ATC GTT 1350 P D K E V L Y Q Q 460 Y D E M E Ξ CCA GAC AAA GAG GTG TTG TAT CAA CAA TAC GAT GAG ATG GAA GAG 1395

   FIG.6C

   PL 209 710 B1

   c S Q A 470 A P Y I E Q A Q V I 480 A TGC TCA CAA GCT GCC CCA TAT ATC GAA CAA. GCT CAG GTA ATA GCT 1440 H Q F K E K V L G 490 L I D N D Q CAC CAG TTC AAG GAA AAA GTC CTT GGA TTG ATC GAT AAT GAT CAA 1485 V V V T 500 P D K E I L Y E A F SIO D GTG GTT GTG ACT CCT GAC AAA GAA ATC TTA TAT GAG GCC TTT GAT 1530 E M E E C A S K A 520 A L I E E G GAG ATG GAA GAA TGC GCC TCC AAA GCC GCC CTC ATT GAG GAA GGG 1575 Q R. M A 53 0 E •M L K S K I Q G L 540 L CAG CGG ATG GCG GAG ATG CTC AAG TCT AAG ATA CAA GGC CTC CTC 1620 G I L R R H V G P 550 G E G A V GGG ATA CTG CGC CGG CAC GTT GGT CCT GGC GAG GGG GCA GTG CAG 1665 W M N R 550 L I A F A S R G N H 570 V TGG ATG AAC CGG CTG ATA GCC TTC GCC TCC AGA GGG AAC CAT GTT 1710 S P T H Y V P s R 580 s R R. F A Q TCC CCC ACG CAC TAC GTT CCG TCT AGA TCC CGG AGA TTC GCC CAG 1755 A L· P V 590 W A R P D Y N P P L 600 V GCC CTG CCC GTT TGG GCG CGG CCG GAC TAT AAC CCC CCG CTA GTG 1800 E T W K K P D Y E 610 P P V V H G GAG ACG TGG AAA AAG CCC GAC TAC GAA CCA CCT GTG GTC CAC GGC 1845 R S S R 620 R F A Q A L P V W A 630 R AGA TCT TCT CGG AGA TTC GCC CAG GCC CTG CCC GTT TGG GCG CGG 1890

   FIG.6D

   PL 209 710 B1

   Ρ CCG D GAC Y TAT N AAC P CCC P CCG L CTA V GTG E GAG 640 T ACG W TGG K AAA K AAG P CCC D GAC 1935 Υ E P P 650 V V H G R K T K R N 660 T TAC GAA CCA CCT GTG GTC CAT GGC AGA AAG ACC AAA CGT AAC ACC 1980 Ν R R P Q D V K F 670 P G G G Q I AAC CGG CGG CCG CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGT GGC GGT CAG ATC 2025 V G G V 680 Y L L P R R G P R L 690 G GTT GGT GGA GTT TAC TTG TTG CCG CGC AGG GGC CCT AGA TTG GGT •2070 V L A T R K T S P 700 I P K A R R GTG CTC GCG ACG AGA AAG ACT TCC CCT ATC CCC AAG GCT CGT CGG 2115 P E G R 710 T V! A Q P G Y P W P 720 L CCC GAG GGC AGG ACC TGG GCT CAG CCC GGT TAC CCT TGG CCC CTC 2160 Y G N K D R R S T 730 G K S W G K TAT GGC AAT AAG GAC AGA CGG TCT ACA GGT AAG TCC TGG GGT AAG 2205 P G Y P 740 W P R K T K R N T N 750 R CCA GGG TAC CCT TGG CCA AGA AAG ACC AAA CGT AAC ACC AAC CGG 2250 R P Q D V K F P G 760 G G Q I V G CGG CCG CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGT GGC GGT CAG ATC GTT GGT 2295 G V Y L 770 L P R R G P R L G V 780 L GGA GTT TAC TTG TTG CCG CGC AGG GGC CCT AGA TTG GGT GTG CTC 2340 A T R K T S P I P 790 K A R R P E GCG ACG AGA AAG ACT TCC CCT ATC CCC AAG GCT CGT CGG CCC GAG 2385

   FIG.6E

   PL 209 710 B1

   800 810 GRTWAQPGYPWPLYG

   GGC AGG ACC TGG GCT CAG CCC GGT TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC

   820

   NKDRRSTGKSWGKPG AAT AAG GAC AGA CGG TCT ACA GGT -AAG TCC TGG GGT AAG CCA GGG

   2430

   2475

   829

   Y P W P OC TAC CCT TGG CCC TAA TGAGTCGAC

   FIG.6F

   PL 209 710 B1

   PL 209 710 B1

   MATKA ATG GCT ACA AAG GCT

   Q G I I N CAA GGT ATT ATT AAC

   Κ V W G S AAG GTG TGG GGA AGC

   F Η V Η E TTC ĆAT GTT CAT GAG

   A G P H F GCA GGT CCT CAC TTT

   BO

   D Ε E R AAG GAT GAA GAG AGG

   D K D G V GAC AAA GAT GGT GTG

   110 s n s a v TCA CTC TCA GGA GAC

   Η Ε K A T> CAT GAA'AAA GCA GAT

   140

   Τ· Κ T G N ACA AAG ACA GGA AAC

   O X A Q H GGG ATC GCC CAG AAT

   170

   P G Η I T CCC GGC CAT ATA ACG

   A A R Τ T GCC GCC AGA ACT ACC

   VCVLKGDGPV GTT TGT GTT TTG AAG GGT GAC GGC CCA GTT

   PEQKESNGPV TTC GAG CAG AAG GAA AGT AAT GGA CCA GTG

   IKGLTEGLHG ATT AAA GGA CTG ACT GAA GGC CTG CAT GGA

   FGDKTAGCTS TTT GGA GAT AAT ACA GCA GGG TGT ACC AGT

   NPLSRKHGGP AAT CCT CTA TCC AGA AAA CAC GGT GGG CCA

   HVGDLGNVTA CAT GTT GGA GAC TTG GGC AAT GTG ACT GCT

   100

   ADVSIEDSVI GCC GAT GTG TCT ATT GAA GAT TCT GTG ATC

   120

   HCIIGRTLVV CAT TGC ATC ATT GGC GGC ACA CTG'GTG GTC

   130

   DLGKGGNEES GAC TTG GGC AAA GGT GGA AAT GAA GAA AGT

   150

   ĄGSRLACGVI GCT GGA AGT CGT TTG GCT TGT GGT GTA ATT

   160

   LH&GCNCSIY TTG AAT TCT GGT TGC AAT TGC TCT ATC TAT

   ISO

   GHRMAWKLGS GGT CAC CGC ATG GCA TOG AAG CTT GGT TCC

   190

   SGFVSLFAPQ TCG GGC TTT GTC TCC TTG TTC GCC CCA GGT

   F16.8A

   PL 209 710 B1

   200 210

   A K Q N B T H V T a G A A A R GCC AAA CAA AAC GAA ACT CAC GTC ACG GGA GOC GCA GCC GCC CGA T ACT T ACG S TCT G GGG L TTG ,T ACC S TCT L TTG F TTC 220 S TCC P CCA a GGT A GCC S AGC Q CAA N I Q L 230 I V D F I P V E N L 240 E

   AAC ATT CAA TTG ATT GTC GAC TTT ATC CCT GTG GAG AAC CTA GAG

   250

   TTMRSPVFTDNrSSPP ACA ACC ATG CGA TCT CCG GTG TTC ACG GAT AAC TCC'TCT. CCA CCA

   250 270

   V V P Q S FQVAHLHAPT

   GTA GTG CCC CAG AGC TTC CAG GTG GCT CAC CTC CAT GCT CCC ACA

   230

   GSGKSTKVPAAYAAQ GGC AGC GGC AAA AGC ACC AAG GTC CCG GCT GCA TAT GCA GCT CAG

   290 300

   GYKVLVLNPSVAATL

   GGC TAT AAG GTG CTA GTA CTC AAC CCC TCT GTT GCT GCA ACA CTG

   310

   GFGAYMSKAHGIDPN GGC TTT GGT GCT TAC ATG TCC AAG GCT' CAT GGG ATC GAT CCT AAC

   320 330

   XRTGV RTITTGSPIT

   ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT GGC AGC CCC ATC ACG

   340

   YS TYGKFLADGGCSG TAC TCC ACC TAC GGC AAG TTC CTT GCC GAC GGC GGG TGC TCG GGG

   350 360 aAYDIIICDECHSTD

   GGC GCT TAT GAC ATA ATA ATT TGT GAC GAG TGC CAC TCC ACG GAT

   370

   ATSILGIGTVLDQAB GCC ACA TCC ATC TTG GGC ATT GGC ACT GTC CTT GAC CAA GCA.GAG

   380 390

   TAGARLVVLATATPP

   ACT GCG GGG GCG AGA CTG GTT GTG CTC GCC ACC GCC ACC CCT CCG

   400

   a S V T V P H P N I B E V A L GGC TCC GTC ACT GTG CCC CAT CCC AAC ATC GAG GAG GTT GCT CTG

   410 420

   FIG.8B

   PL 209 710 B1

   STTGElpFYGKAIPL TCC ACC ACC GGA GAG ATC CCT TTT TAC GGC AAG GCT ATC CCC CTC

   430

   E V I K. GGRHDI F CHSK GAA GTA ATC AAG GGG GGG AGA CAT CTC ATC TTC TGT CAT TCA AAG

   440 450

   KKCDELAAKDVADGI

   AAG AAG TGC GAC GAA CTC. GCC GCA AAG CTG GTC GCA TTG GGC ATC

   460

   HAVAYYRG DDV S V I P AAT GCC GTG GCC TAC TAC CGC GOT CTT GAC GTG TCC GTC ATC CCG

   470 480

   TSGDVVVVATDADMT

   ACC AGG· GGC GAT GTT GTC GTC GTG GCA· AJCC GAT GCC CTC ATG ACC

   490

   OY. TGD‘FDSVI D CNTC GGC TAT ACC GOC GAC TTC GAC TCG GTG ATA GAC TGC AAT ACG TGT

   500 510

   VTQTVDFSŁD P TFTI

   GTC ACC CAG ACA GTC GAT TTC AGC CTT GAC CCT ACC TTC ACC ATT

   520 •ETXTLPQDAVS RTQR GAG ACA ATC ACG CTC CCC CAA GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT

   530 540

   H.GRTGRGKPG I Y R F V·

   CGG GOC AGG ACT GGC AGG GGG AAG CCA GGC ATC TAC AGA TTT GTG

   550

   APGERPSGMFD S S V L GCA CCG GGG GAG CGC CCC TCC GGC ATG TTC GAC TCG TCC GTC CTC

   560 570

   CBCYDAGCAWY E Ii T P

   TGT GAG TGC TAT GAC GCA GGC TGT GCT TOG TAT GAG CTC ACG CCC

   580

   AETTVRLRAYM HTPG GCC GAG ACT ACA GTT AGG CTA CGA GCG TAC ATG AAC ACC CCG GGG

   590 600 łpv cqdhle f w egvp

   CTT CCC GTG TGC CAG GAC CAT CTT GAA TTT TGG GAG GGC GTC TTT

   610

   TGLTHIDAHFL SQTK ACA GGC CTC ACT CAT ΑΤΑ OAT GCC CAC TTT CTA TCC CAG ACA AAG

   620 630

   OSGENLPYLVAYQAT

   FI<$8C

   PL 209 710 B1

   CAG AGT GGG GAG AAC CTT CCT TAC CTG GTA GCG TAC CAA GCC ACC V c A R A Q A P P 640 P S W D Q M GTG TGC GCT AGG GCT CAA GCC CCT CCC CCA TCG TGG GAC CAG ATG W K c L 650 I R L X P T L H G P 660 T TGG AAG TGT TTG ATT CGC CTC AAG CCC ACC CTC CAT GGG CCA ACA P L Ł Y R L G A V 670 Q N E I T L ćcc CTG CTA TAC AGA CTG GGC GCT GTT CAG AAT GAA ATC ACC CTG T H P V 6Θ0 T K Y I M T C M s A 690 D

   ACG CAC CCA GTC ACC AAA TAC ATC ATG ACA TGC ATG TCG GCC GAC

   700

   LEVVTSACSGKPAI I CTG GAG GTC GTC ACG AGC GCA TGC TCC GGG AAG CCG GCA ATC ATA

   710 720 pdrevlyrefdemee

   CCT GAC AGG GAA GTC CTC TAC CGA GAG TTC' GAT GAG ATG GAA GAG

   730

   C s Q E L P Y I E Q G M M b A TGC TCT CAG CAC TTA CCG TAC ATC GAG CAA GGG ATG ATG CTC GCC 740 750 E F K Q K A b G b S R G G K GAG CAG TTC AAG CAG AAG GCC CTC GGC CTC TCG CGA GGG GGC AAG 760 P A I V P D K E V b Y Q Q Y D CCG GCA ATC GTT CCA GAC AAA GAG GTG TTG TAT CAA CAA TAC GAT 770 780 E M E B C S <2 A A P Y X E Q A GAG ATG GAA GAG TGC TCA CAA GCT GCC CCA TAT ATC GAA CAA GCT 790 Q V I A . H Q F K E K V L G b I CAG GTA ATA GCT CAC CAG TTC AAG GAA AAA GTC CTT GGA TTG ATC 800 810 D H D Q V V V T P D K E I b Y GAT AAT GAT CAA GTG GTT GTG ACT CCT GAC AAA GAA ATC TTA TAT 820 E A F D E M E B C A S K A A L GAG GCC TTT GAT GAG ATG GAA GAA TGC GCC TCC AAA GCC GCC CTC 830 840 1 E B G Q R M A B M b K S K I ATT GAG GAA GGG CAG CGG ATG GCG GAG ATG CTC AAG TCT AAG ATA

   FIG.8D

   PL 209 710 B1 q α r l α i CAA GCC CTC CTC GGC ATA

   860

   O A V Q W M GGG GCA GTG CAG TGG ATG

   850

   L R R H V G P Q E CTG CGC CGG CAC GTT GGT CCT GOC GAG N R L 1 A F A S 870 R

   G N H V S P GGG AAC CAT GTT TCC CCC

   090

   R F A Q A L AGA TTC GCC CAG GCC CTG

   P P L V Ε T CCC CCG CTA GTG GAG ACG

   920

   V V H G R S GTG GTC CAC GGC AGA TCT

   V W A R P D GTT TGG GCG CGG CCG.GAC

   950

   K X P D Y B AAA AAG CCC GAC TAC GAA

   K R Ν Τ N R AAA CGT AAC ACC AAC CGG

   980

   G G Q I V G GGC GGT CAG ATC GTT GOT

   R R Ρ E G R CGT CGG CCC GAG GGC AGG

   1010

   P L Y G Η K CCC CTC TAT GGC AAT AAG

   G K P G Y P GGT AAG CCA GGG TAC CCT

   1040

   K R R P Q D AAC CGA CGG CCG CAG GAC

   AAC CGG CTG ATA GCC TTC GCC TCC AGA

   880

   THYV’PSRSR ACG CAC TAC GTT CCG TCT AGA TCC'CGG

   900

   PVWARPDYN CCC GTT TGG GCG CGG CCG GAC TAT AAC

   910

   HKKPDYEPP TGG AAA AAG CCC GAC TAC GAA CCA CCT

   930

   SRRFAOALP TCT CGG AGA TTC GCC CAG GCC CTG CCC

   940

   YNPPLVETW TAT AAC CCC CCG CTA GTG GAG ACG TGG

   960

   P PVVHGRKT CCA CCT GTG GTC CAT GGC AGA AAG ACC

   970

   RPQD VKFPG CGG CCG CAG GAC GTC AAG TTC CCG GOT

   990

   RRGPPIPKA CGC AGG GGC CCT CCT ATC CCC AAG GCT

   1000

   THAQ PGYPH ACC TGG GCT CAG CCC GGT TAC CCT TOG

   1020

   DRRST GKEK GAC AGA CGG TCT ACA GGT AAG TCC TGG

   1030

   WPRKTKRNT TGG CCA AGA AAG ACC AAA CGT AAC ACC

   1050

   V K F P G G G Q I GTC AAG TTC CCG GGT GGC GGT CAG ATC

   FIG.8E

   PL 209 710 B1

   1050

   V G R R G P P I P K A R R P B GTT GGT CGC AGG GGC CCT CCT .ATC CCC AAG'GCT CGT CGG CCC GAG 1070 1080 G R T W A Q P G Y P W P L Y <? GGC AGG ACC TGG GCT CAG CCC GGT TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC 1090 N K D R R S T G K S W G K P G AAT AAG GAC AGA CGG TCT ACC GGT AAG TCC TGG GGT AAG CCA GGG

   1099

   Y P K P TAT CCT TGG CCC

   FIG.8F

   PL 209 710 B1

   ANTYGEN MEFA 3 σ>

   θ'

   Ul

   PL 209 710 B1

   Departament Wydawnictw UP RP

   Cena 7,38 zł (w tym 23% VAT)