PL209997B1 - Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego oraz zastosowanie wybranych mutacji w obrębie genu BRCA1 - Google Patents
Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego oraz zastosowanie wybranych mutacji w obrębie genu BRCA1Info
- Publication number
- PL209997B1 PL209997B1 PL364413A PL36441304A PL209997B1 PL 209997 B1 PL209997 B1 PL 209997B1 PL 364413 A PL364413 A PL 364413A PL 36441304 A PL36441304 A PL 36441304A PL 209997 B1 PL209997 B1 PL 209997B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- brca1
- mutations
- breast
- pcr
- Prior art date
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims description 69
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 title claims description 62
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 title claims description 27
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 title claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 8
- 108700040618 BRCA1 Genes Proteins 0.000 title description 10
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 title description 3
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 title 1
- 201000001705 nipple carcinoma Diseases 0.000 title 1
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 claims description 54
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 claims description 53
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 36
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 36
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 26
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 6
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 102000052609 BRCA2 Human genes 0.000 description 8
- 108700020462 BRCA2 Proteins 0.000 description 8
- 101150008921 Brca2 gene Proteins 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 102200067153 rs28897672 Human genes 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 206010071980 BRCA1 gene mutation Diseases 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000003485 founder effect Effects 0.000 description 2
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010154 BRCA2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101100233116 Escherichia coli insC gene Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 201000011045 hereditary breast ovarian cancer syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 201000010700 sporadic breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Przedmiotami wynalazku są sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi i/lub jajnika u kobiet pochodzenia polskiego oraz zastosowanie wybranych mutacji występujących w obrębie genu BRCA1 do wykrywania takiej predyspozycji. Ogólnie wynalazek dotyczy nowej metody diagnostycznej. Przedmioty wynalazku służą do syntezy DNA oraz identyfikacji anomalii w materiale genetycznym pacjenta, które są skorelowane z dziedziczną predyspozycją do zachorowania na wymienione nowotwory.
Germinalne mutacje genów BRCA1 (MIM# 113-705) i BRCA2 (MIM# 600185) odpowiadają za większość przypadków dziedzicznych predyspozycji do raka piersi i jajnika [Ford D. I wsp., Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer families, The Breast Cancer Linkage Consortium. Am J Human Genet 1998; 62: 676-89; Narod S.A. i wsp., An evaluation of genetic heterogeneity in 145 breast ovarian cancer families, The Breast Cancer Linkage Consortium. Am J Hum Genet 1995; 56; 254-64; Narod S.A. i wsp., Genetic heterogeneity of breast-ovarian cancer revisited. Am J Hum Genet 1995; 57: 957-8.]
Do chwili obecnej opisano ponad 1000 mutacji w obrębie tych genów [BIC database]. Większość z tych mutacji to zmiany wykrywane w pojedynczych rodzinach. Ponadto, istnieją przypadki mutacji powtarzalnych wykazujące efekt założyciela w obrębie tych genów, przykładami mogą być izolowane populacje Żydów Aszkenazyjskich [Tonin P. i wsp. Frequency of recurrent BRCA1 and BRCA2 mutations in Ashkenazi Jewish breast cancer families, Nat Medicine 1996; 2: 1179-1183; Neuhausen S. i wsp., Recurrent BRCA2 6174delT mutations in Ashkenazi Jewish women affected by breast cancer. Nat Genet 1996; 13: 126-8], Islandczyków [Johannesdottir G. i wsp., High prevalence of the 999del5 mutation in Icelandic breast and ovarian cancer patients. Cancer Res. 1996 56:3663-5], Finów [Huusko P. i wsp., Evidence of founder mutations in Finnish BRCA1 and BRCA2 families. Am J Hum Genet. 1998; 62:1544-8] jak również część populacji Holendrów [Peelen T. i wsp., A high proportion of novel mutations in BRCA1 with strong founder effects among Dutch and Belgian hereditary breast and ovarian cancer families. Am J Hum Genet. 1997 60: 1041-9; Petrij-Bosch A. i wsp., BRCA1 genomic deletions are major founder mutations in Dutch breast cancer patients. Nat Genet. 1997; 17:341-5] oraz Francuskich Kanadyjczyków [Tonin P.N. i wsp., Founder BRCA1 and BRCA2 mutations in French Canadian breast and ovarian cancer families. Am J Hum Genet. 1998; 63: 1341-51.]. Przykładem populacji przejawiających powtarzalny charakter mutacji występujących w tych genach są także populacje Słowian, w tym Polaków.
Polskie zgłoszenie patentowe nr P. 335917 sugeruje po raz pierwszy powtarzalny charakter mutacji genu BRCA1 w populacji polskiej, ujawniając listę ośmiu mutacji w obrębie BRCA1 i BRCA2 występujących wśród osób pochodzenia polskiego. Badania te trudno uznać za wyczerpujące. Opierały się one na wynikach dotyczących ograniczonej liczebnie (35 rodzin) grupy pacjentów zamieszkałych głównie w jednym tylko regionie Polski - tj. w okolicach Szczecina. Grupa ta na pewno nie może być uznana za dostatecznie reprezentatywną dla całej populacji Polaków. Badania przeprowadzono z uż yciem poś redniej techniki wykrywania mutacji - SSCP, której zdolność wykrywania mutacji jest znacznie ograniczona [Andrulis I.L. i wsp., Comparison of DNA- and RNA-based methods for the detection of truncating BRCA1 mutations. Hum. Mutat. 2002; 20: 65-73]. Podsumowując, można uznać, że dotychczasowy stan wiedzy o występowaniu mutacji BRCA1 w populacji polskiej nie pozwalał na określenie częstości ich występowania, ani nie sugerował możliwości znacznego ograniczenia liczby mutacji BRCA1, które powinny być badane w celach rutynowej diagnostyki w rodzinach z silną agregacją raków piersi/jajnika.
W ś wietle zaprezentowanego stanu techniki obiektywnym problemem jest brak ł atwego w wykonaniu, prostego, szybkiego i wiarygodnego testu diagnostycznego pozwalającego na powszechne wykrywanie u Polek i kobiet pochodzenia polskiego wysokiej, genetycznie uwarunkowanej, predyspozycji do raka piersi/jajnika, związanej z mutacjami genu BRCA1.
W związku z powyż szym, celem wynalazku jest dostarczenie sposobu diagnozowania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi i/lub jajnika u kobiety pochodzenia polskiego będącej nosicielką mutacji BRCA1, przy czym pożądany test powinien być tani i łatwy w wykonaniu, a jednocześnie gwarantować wykrycie zdecydowanej większości mutacji BRCA1 występujących w populacji polskiej (wysoka czuł o ść). Jako wysoką czuł ość rozumie się zdolność do wykrywania ponad 80%, korzystnie ponad 85%, mutacji BRCA1 warunkujących wysoką genetyczną predyspozycję
PL 209 997 B1 do raka piersi i/lub jajnika występujących u kobiet pochodzenia polskiego. Nieoczekiwanie, tak określony problem został rozwiązany w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób podstawowego diagnozowania wysokiej, genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi i/lub jajnika u kobiety pochodzenia polskiego będącej nosicielką mutacji BRCA1, charakteryzujący się tym, że wykrywa się co najmniej 80%) mutacji BRCA1 warunkujących wysoką genetyczną predyspozycję do raka piersi i/lub jajnika, przy czym bada się występowanie następujących mutacji: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T >G oraz BRCA1 ex.11 4153 del A.
Korzystnie, obecność mutacji bada się techniką ASO-PCR, przy czym korzystniej obecność wszystkich rodzajów mutacji bada się w jednej mieszaninie reakcyjnej (multiplex-PCR). Równie korzystnie, obecność mutacji bada się techniką PCR-RFLP. Zgodnie z korzystną realizacją sposobu według wynalazku, w reakcji multiplex-PCR używa się zestaw starterów wybrany spośród zestawów przedstawionych w tabeli 4.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie mutacji BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T>G oraz BRCA1 ex.11 4153 del A do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego.
Przedmiotem wynalazku jest także zestaw starterów dla PCR do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego, charakteryzujący się tym, że jest wybrany spośród zestawów przedstawionych w tabeli 4.
P r z y k ł a d 1. Ustalenie częstości występowania mutacji genu BRCA1 w populacji Polek z rodzin z silną dziedziczną predyspozycją do raka piersi/jajnika.
Wybór grupy badanej
Materiał do badań stanowiło 200 rodzin. W tej grupie, u 100 rodzin stwierdzono występowanie raka piersi u co najmniej trzech krewnych pierwszego stopnia (lub drugiego poprzez mężczyznę), natomiast u pozostałych 100 rodzin stwierdzono występowanie raka piersi i jajnika u co najmniej trzech krewnych pierwszego stopnia (lub drugiego poprzez mężczyznę). Grupa badanych rodzin była reprezentatywna dla wszystkich regionów Polski. Liczba rodzin z każdego regionu została skorelowana z wielkością populacji zamieszkującej dany region. W przypadku rodzin rozproszonych o geograficznym zaszeregowaniu danej rodziny decydowało miejsce zamieszkania większości osób z tej rodziny.
Materiał do badań stanowił genomowy DNA uzyskany z leukocytów krwi obwodowej chorych probantów z wybranych rodzin. Z każdej rodziny wybierano jedną pacjentkę.
Izolacja genomowego DNA.
Krew obwodową pobraną w ilości 5 ml mieszano z 100 μl 1M EDTA, a następnie wirowano w 50 ml polipropylenowych probówkach typu „Falcon przez 10 minut przy 3000 g w temperaturze 4°C. Górną warstwę osocza odciągano, zaś dolną mieszano z 45 ml buforu 2X (0,1M NH4Cl, 0,25M KHCO3, 1 mM EDTA) i pozostawiano na 15 minut w temperaturze 4°C. Następnie mieszaninę wirowano przy 3000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Supernatant zawierający zhemolizowane erytrocyty zlewano. Osad leukocytów ponownie zalewano buforem 2X i wirowano przy 3000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Wyżej wymienioną czynność powtarzano 3-krotnie, do uzyskania czystego osadu leukocytarnego. Następnie osad mieszano z 3 ml buforu trawiącego (50 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 1mM EDTA; pH 8.0) z dodatkiem 200 μl 10% SDS i 500 μg Proteinazy K. Trawienie przeprowadzano w cieplarce o temperaturze 37°C przez okres 24 godzin.
Produkty trawienia mieszano z 3 ml fenolu buforowanego 0,5M Tris HCl (pH 8,4), a następnie do roztworu dodawano 3 ml mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego w stosunku objętości 1:25. Całą mieszaninę wstrząsano przez około 1 minutę aż do uzyskania homogennej emulsji, po czym wirowano przy 8000 g przez 10 minut w temperaturze 20°C. Po odwirowaniu uzyskiwano bezbarwną górną fazę wodną zawierającą DNA, pierścień białka w interfazie oraz dolną organiczną fazę zawierającą chloroform i fenol. Fazę górną przenoszono do odrębnej probówki, mieszano z taką samą ilością chloroformu po czym wirowano przy 8000 g przez 10 minut. Wyżej opisane oczyszczanie chloroformem powtarzano 3-krotnie aż do zaniku pierścienia białkowego w interfazie. Tak oczyszczoną fazę wodną zawierającą DNA mieszano z 5M NaCl (stosunek objętości fazy wodnej do NaCl - 10:1) i 96% alkoholem etylowym (stosunek objętości fazy wodnej z NaCl do etanolu - 1:10). Mieszaninę pozostawiano przez noc w temperaturze 20°C. Uzyskany „kłaczek DNA przenoszono do odrębnej probówki, przemywano zimnym 70% alkoholem etylowym po czym suszono przez 30 minut w otwartej
PL 209 997 B1 probówce w temperaturze 37°C. Oczyszczony DNA po rozpuszczeniu w 400 μΐ buforu TE (25 mM Tris HCl, 1mM EDTA; pH 8.4) przechowywano w 4°C.
Sekwencjonowanie
Cały region kodujący genu BRCA1 włączając tzw. „splice sites został poddany amplifikacji techniką PCR we fragmentach o długości pozwalającej na ustalenie ich pełnej sekwencji.
Amplifikację poszczególnych eksonów genu BRCA1 przeprowadzono z użyciem najbardziej skrajnych par starterów umożliwiających powielenie sekwencji kodującej wraz z przyległymi regionami splice-sites. Stosowano standardowe warunki PCR przy czym temperaturę przyłączania dla stosowanej pary starterów wyliczano ze wzoru: Tm=2(A+T) + 4(C+G)
Oczyszczanie produktów PCR
Produkty amplifikacji przenoszono na kolumienkę Microcon-100 (Amicon) umieszczoną na probówce Eppendorf, dodawano 400 μl wody destylowanej i wirowano przy 1850 g przez 15 minut. Przesącz zawierający startery i pozostałości mieszaniny reakcyjnej PCR wylewano, zaś produkty reakcji pozostałe na filtrze kolumienki zalewano 400 μl H2O i wirowano ponownie przez 15 minut przy 1850 g. Ostatnią czynność powtarzano 3-krotnie. W celu odzyskania oczyszczonych produktów PCR odwróconą o 180° kolumienkę przenoszono na nową probówkę i wirowano przez 3 minuty przy 9000 g. Wszystkie wirowania przeprowadzono w temp 25°C. Uzyskiwano w ten sposób około 5 μl czystego produktu, który rozcieńczano wodą do objętości 20 gl.
PCR sekwencyjny
Asymetryczny PCR sekwencyjny wykonywano w automatycznym termocyklerze Gene Amp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer w 20 gl mieszaninie reakcyjnej zawierającej: 1 pmol odpowiedniego startera dla nici sensownej analizowanego fragmentu, 4 gl oczyszczonego matrycowego produktu PCR, 8 gl BigDye Terminator Ready Reaction Kit v3.0 (Applied Biosystems). W celu potwierdzenia wykrytych mutacji, w każdym przypadku przeprowadzono oddzielną reakcję sekwencjonowania z użyciem odpowiedniego startera dla nici antysensownej analizowanego fragmentu.
Parametry sekwencyjnego PCR: wstępna denaturacja - 96°C 30 sekund 30 cykli, każdy składający się z: denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów (według wzoru podanego wyżej) wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 30 sekund
Całość produktów sekwencjonowania (20 gl) przenoszono do probówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml, zalewano 60 gl 96% etanolu oraz dodawano 1 gl kwaśnego octanu sodu (pH 5,0) w celu wytrącenia produktów PCR. Probówki wirowano w 3000 g przez 20 min w 25°C. Po żwirowaniu etanol wylewano, a osad zawierający produkty PCR-u sekwencyjnego przepłukiwano zalewając go 200 gl 70% etanolu oraz wirowano w 3000 g przez 5 min w 25°C. Następnie cały alkohol ostrożnie wylewano, a pozostały w probówce osad suszono w aparacie próżniowym Eppendorf Concentrator 5301 przez 20 - 30 min, po czym rozpuszczano w 4 gl sekwencyjnego buforu obciążającego (150 gl formamidu dejonizowanego, 50 gl 50mM EDTA, 0.05% Dextran Blue). Rozpuszczone w buforze obciążającym produkty denaturowano przez 4 minuty w 94°C, przenoszono do łaźni z lodem, po czym nanoszono na denaturujący poliakrylamidowy żel sekwencyjny (4% akrylamid - 19:1, 1 x TBE, 6M mocznik). Rozdział elektroforetyczny dokonywano w automatycznym aparacie do sekwencjonowania ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Zbieranie danych w trakcie elektroforezy oraz ich analiza odbywały się za pomocą programów ABI PRISM 377 Collection Software and Sequencing Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems).
W oparciu o wyniki sekwencjonowania identyfikowano występujące mutacje. Podsumowanie wyników przedstawiono w Tabeli 1.
T a b e l a 1
Ilość mutacji genu BRCA1 wykrytych w 200 polskich rodzinach z wysoką predyspozycją do raka piersi lub piersi/jajnika.
| Mutacja | Ekson | Tylko rak piersi | Rak piersi/jajnik | Suma |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 5382insC | 20 | 36 | 32 | 68 (34%) |
| C61G(300T >G) | 5 | 16 | 15 | 31 (15.5%) |
PL 209 997 B1 cd. tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 4153delA | 11 | 3 | 9 | 12 (6%) |
| 5370 C/T | 20 | 3 | - | 3 (1.5%) |
| 3819del5 | 11 | 1 | 2 | 3 (1.5%) |
| 794delT | 11 | - | 2 | 2 (1.0%) |
| 185delAG | 2 | - | 1 | 1 (0.5%) |
| 2985del5 | 11 | - | 1 | 1 (0.5%) |
| 5149del4 | 17 | 1 | - | 1 (0.5%) |
| Razem 60 (60%) | 62 (62%) | 122 (61%) |
Mutacje genu BRCA1 zostały wykryte w 61% (122/200) zaś dla BRCA2 jedynie w 3,5% (7/200) rodzin (wyniki nie zaprezentowane). Nieoczekiwanie okazało się, że trzy mutacje założycielskie stanowią około 90% (111/122) wszystkich zmian w obrębie genu BRCA1: 5382insC w 68 rodzinach,
300T >G w 31 rodzinach, zaś 4153 delA w 12 rodzinach. Mutacja 4153 delA występowała trzykrotnie częściej w rodzinach z silną predyspozycją do raka piersi i jajnika w porównaniu z rodzinami, w których występował jedynie rak piersi. W grupie badanych rodzin wykryto ponadto trzy dalsze, powtarzalne mutacje genu BRCA1, są to: 5370C>T wykryta w 3 rodzinach, 3819del5 wykryta w 3 rodzinach oraz 794delT wykryta w 2 rodzinach.
Przedstawione w tym opisie wyniki po raz pierwszy dotyczą reprezentatywnej (dostatecznie licznej i odpowiednio rozproszonej terytorialnie) dla populacji polskiej grupy probantów. Po raz pierwszy również w trakcie selekcji zwrócono szczególną uwagę na restrykcyjny dobór probantów co warunkuje wiarygodność wyników.
Dotychczas badane grupy były grupami niedostatecznie licznymi (patrz tabela 2) niejednorodnymi pod względem historii rodzinnej (mieszanina sporadycznych raków piersi i przypadków rodzinnych o zmiennym stopniu obciążenia ryzykiem raka piersi/jajnika).
T a b e l a 2. Dotychczasowe prace opisujące częstości mutacji BRCA1 obserwowane w Polsce
| Miasto | mutacje BRCA1 | % rodzin z mutacjami (ilość badanych rodzin) | |||||
| 5382insC | C61G | 4153delA | inne | Tylko rak piersi | Rak piersi/jajnika | suma | |
| Bydgoszcz [5] | 4 | 1 | - | NE | 50% (4) | 43% (7) | 45% (11) |
| Gdańsk [2] | 3 | - | 1 | 14% (21) | 66% (3) | 19% (21) | |
| Gdańsk [7] | 4 | 2 | - | 3 | 11% (9) | 72% (11) | 45% (20) |
| Gliwice [3] | 11 | 1 | - | 4 | 38% (13) | 58% (19) | 50% (32) |
| Poznań [4] | 2 | NE | - | 0% (7) | 66% (3) | 20% (10) | |
| Poznań [8] | 5 | - | - | NE | 55% (9) | 0% (2) | 45% (11) |
| Szczecin [1] | 16 | 7 | 2 | 5 | 34% (35) | 66% (27) | 48% (62) |
| Warszawa [6] | 6 | 2 | - | 1 | NG | NG | 40% (22) |
1. Górski B., Byrski T., Huzarski T., Jakubowska A., Menkiszak J., Gronwald J., Pluzanska A., Bebenek M., Fischer-Maliszewska L., Grzybowska E., Narod S.A., Lubiński J. Founder Mutations in the BRCA1 Gene in Polish Families with Breast-Ovarian Cancer. Am J Hum Genet. 2000;
66: 1963-1968.
2. van Der Looij M, Wysocka B, Brozek I, Jassem J, Limon J, Olah E. Founder BRCA1 mutations and two novel germline BRCA2 mutations in breast and/or ovarian cancer families from NorthEastern Poland. Hum Mutat. 2000; 15: 480-1.
3. Grzybowska E, Zientek H, Jasinska A, Rusin M, Kozłowski P, Sobczak K, Sikorska A, Kwiatkowska E, Górniak L, Kalinowska E, Utracka-Hutka B, Wloch J, Chmielik E,Krzyzosiak WJ. High fre6
PL 209 997 B1 quency of recurrent mutations in BRCA1 and BRCA2 genes in Polish families with breast and ovarian cancer. Hum Mutat. 2000; 16: 482-90
4. Jasińska A, Krzyzosiak WJ. Prevalence of BRCA1 founder mutations in western Poland., Hum Mutat. 2001; 17:75.
5. H.Janiszewska, O.Haus, A.Lauda-Świeciak, M.Pasińska, R.Laskowski, W.Szymański, B.Górski, J.Lubiński, Frequency of three BRCA1 gene founder mutations in breast/ovarian cancer families from the Pomerania - Kujawy region of Poland. Clin. Genet. 2003 (In Press)
6. Paszko Z, Skasko E, Wisniewska A, Konopka B, Kluska A, Jagielska A, Wieczorek E, Janiec-Jankowska A, Niwinska A, Pienkowski T, Mazur S. Changes inBRCA1 Gene in patients with familial breast cancer in Warsaw region of Poland. Nowotwory Journal of Oncology 2002; 52:97-103
7. Perkowska M, Brozek I, Wysocka B, Haraldsson K, Sandberg T, Johansson U, Sellberg G, Borg A, Limon J.BRCA1 and BRCA2 mutation analysis in breast-ovarian cancer families from northeastern Poland. Hum Mutat. 2003; 21: 553-4.
8. Stawicka M, praca doktorska.
Wcześniejsze opracowania dotyczące występowania mutacji genu BRCA1 w populacji polskiej były uzyskiwane różnymi pośrednimi metodami wykrywania mutacji (SSCP, heteroduplex, PTT), których czułość jest niedostateczna [Andrulis I.L. i wsp., Comparison of DNA- and RNA-based methods for the detection of truncating BRCA1 mutations. Hum Mutat. 2002; 20: 65-73]. Opisane ograniczenia wcześniejszych badań prowadziły do mylnych wniosków, kwestionujących nawet możliwość istnienia efektu dominacji mutacji założycielskich genu BRCA1 w populacji polskiej i sugerujących rozproszony charakter mutacji genu BRCA1 w tej populacji [Perkowska M., Brozek I, Wysocka B, Haraldsson K, Sandberg T, Johansson U, Sellberg G, Borg A, Limon J.BRCA1 and BRCA2 mutation analysis in breast-ovarian cancer families from northeastern Poland. Hum Mutat. 2003; 21: 553-4.].
Dopiero wynik przedstawiony w tym opisie, uzyskany na dostatecznie licznej, jednorodnie zdiagnozowanej i reprezentatywnej dla całego kraju grupie probantów, oparty każdoroazowo na bezpośredniej analizie sekwencji całego genu BRCA1 może stanowić podstawę do stawiania wniosków o rodzaju i czę stoś ci wystę powania mutacji BRCA1 w populacji polskiej oraz prowadzić do nieoczekiwanego odkrycia dominującej roli zaledwie trzech mutacji.
Odkrycie to pozwala na zaproponowanie nadającego się do powszechnego stosowania sposobu diagnozowania wysokiej predyspozycji do raka piersi/jajnika u kobiet pochodzenia polskiego według wynalazku. Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje sposobu według wynalazku i zestawu do jego przeprowadzenia.
P r z y k ł a d 2. Zestaw do podstawowego diagnozowania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka piersi i/lub jajnika u kobiety pochodzenia polskiego będącej nosicielką mutacji BRCA1 techniką ASO-PCR i PCR-RFLP.
Pary starterów służące do wykrywania obecności mutacji BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T >G oraz BRCA1 ex.11 4153 delA przedstawiono w Tabeli 3.
T a b e l a 3
| Para starterów | Nazwa starterów | Funkcja | starter dla nici sensownej [F] 5'>3' | starter dla nici antysensownej [R] 5>3' |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| para 1 dla BRCA1 ex.20 5382 insC | B1-5382INSCI1 | Identyfikacja | CAC TTC CAT TGA AGG AAG CTT C | TAC CTT TCT GTC CTG GGG AT |
| para 2 dla BRCA1 ex.20 5382 ins C | B1-5382INSCI2 | Identyfikacja | TGA CGT GTC TGC TCC ACT TC | ACC TTT CTG TCC TGG GGA TT |
| para 3 dla BRCA1 ex.20 5382 ins C | B1-53821NSCK1 | Kontrola | CAC TTC CAT TGA AGG AAG CTT C | CAA AGG GGA GTG GAA TAC AG |
PL 209 997 B1 cd. tabeli 3
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| para 4 dla BRCA1 ex.20 5382 ins C | B1-53821NSCK2 | Kontrola | ATA TGA CGT GTC TGC TCC AC | CAA AGG GGA GTG GAA TAC AG |
| para 1 dla BRCA1 ex.5 300T>G | B1EX5IK1 | Identyfikacja/ Kontrola | CTC TTA AGG GCA GTT GTG AG | TTC CTA CTG TGG TTG CTT CC |
| para 2 dla BRCA1 ex.5 300T>G | B1EX51K2 | Identyfikacja/ Kontrola | ATG GCT CTT AAG GGC AGT TG | TGT GGT TGC TTC CAA CCT AG |
| para 1 dla BRCA1ex. 11 4153 delA | B1_4154DELAI1 | Identyfikacja | CAA AGG CAT CTC AGG AAC ATC | CAA GCC CGT TCC TCT TTC TCA |
| para 2 dla BRCA1 ex. 11 4153 delA | B1_4154DELAI2 | Identyfikacja | TTG GCT CAG GGT TAC CGA AG | AAG CCC GTT CCT CTT TGT CA |
| para 3 dla BRCA1 ex.11 4154 delA | B1_4154DELAK1 | Kontrola | TTG GCT CAG GGT TAC CGA AG | GTG CTC CCC AAA AGC ATA AAC |
| para 4 dla BRCA1 ex. 11 4153 delA | B1_4154DELAK2 | Kontrola | TCC TAG CCC TTT CAC CCA TAC A | GTG CTC CCC AAA AGC ATA AAC |
Wykrywanie mutacji można prowadzić oddzielnie dla każdej mutacji lub łącznie. W przypadku osobnego wykrywania mutacji zestaw starterów obejmuje parę identyfikującą i parę kontrolną dla badanej mutacji.
Korzystne jest prowadzenie testu w postaci jednej reakcji PCR. Przykładowe zestawy starterów dla takiego multiplex-PCR wymieniono w Tabeli 4.
T a b e l a 4
| zestaw | startery |
| 1 | B1EX5IK1F, B1EX5IK1R, B1_4154DELAI2F, B1_4154DELAI1R, B1-5382INSCI1F, B1-5382INSCI1R |
| 2 | B1EX5IK2F, B1EX5IK2R, B1_4154DELAK2F, B1_4154DELAI2R, B1-5382INSCK2F, B1-5382INSCI2R |
| 3 | B1EX5IK1F, B1EX5IK2R, B1_4154DELAI2F, B1_4154DELAI2R, B1-5382INSCI2F, B1-5382INSCI1R |
W niektórych przypadkach, w celu uzyskania optymalnej, porównywalnej ilości produktów amplifikacji należy zoptymalizować proporcje ilościowe stosowanych starterów. Zależą one od wielu czynników, m.in. takich jak rodzaj i aktywność zastosowanej polimerazy, długość i skład nukleotydowy produktów amplifikowanych. W oparciu o powszechnie dostępną wiedzę laboratoryjną specjalista będzie w stanie każdorazowo zoptymalizować proporcje starterów.
Korzystnie, w skład zestawu diagnostycznego wchodzą również pozostałe składniki mieszaniny dla reakcji PCR (nukleotydy, termostabilna polimeraza, bufor reakcyjny optymalny dla stosowanej polimerazy).
P r z y k ł a d 3. Sposób podstawowego diagnozowania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi i/lub jajnika u kobiety pochodzenia polskiego będącej nosicielką mutacji BRCA1 techniką ASO-PCR i PCR-RFLP.
Izolację DNA z leukocytów krwi obwodowej prowadzono techniką opisaną powyżej. Uzyskane DNA wykorzystywano jako matrycę w testowej reakcji PCR. Przykładowy test diagnostyczny na obecność charakterystycznych dla populacji polskiej mutacji genu BRCA1 opiera się na zastosowaniu multipleksowej reakcji ASO-PCR (dla mutacji 4153delA i 5382insC) w połączeniu z techniką RFLP (dla mutacji (C61G). Mieszanina reakcyjna opisywanego testu diagnostycznego zawiera mieszaninę starterów (patrz też przykład 2) będących syntetycznymi fragmentami genu BRCA1 umożliwiającymi:
1. Amplifikacje fragmentu eksonu 5 zawierającego w sobie miejsce występowania mutacji C61G. Powyższy produkt PCR powstaje w każdym przypadku prawidłowo przeprowadzonej reak8
PL 209 997 B1 cji PCR stanowiąc wewnętrzną kontrolę. W celu wykrycia mutacji C61G uzyskany produkt dla eksonu 5 poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym AvaII. Przecięcie produktu na dwa krótsze fragmenty następuje jedynie w przypadku obecności mutacji C61G.
2. Amplifikacje fragmentu ekson 11 jedynie w przypadku obecności w badanym DNA mutacji 4153delA.
3. Amplifikacje fragmentu ekson 20 jedynie w przypadku obecności w badanym DNA mutacji 5382insC.
Długość produktów reakcji multiplex PCR dla eksonów 5,11,20 genu BRCA1 została dobrana w sposób umożliwiający łatwy rozdział techniką elektroforezy na żelu agarozowym.
Reakcję ASO-PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler
9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μΐ zawierała: 1 μΐ (50 ng-200 ng) genomowego DNA, 2.5 μl buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCL, 15mM MgCl2, 1 mg/ml żelatyny; pH 8.6), 2-14 pM każdego ze starterów 200 μM każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U Taq polimerazy DNA. W każdej reakcji stosowano 3 kontrole dodatnie (kontrole z DNA od nosicieli mutacji gen BRCA1-5382insC, 300T/G i 4153 delA) oraz 2 kontrole ujemne (kontrola z DNA od pacjenta bez mutacji genu BRCA1 oraz kontrola, która nie zawierała DNA).
Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:
a) wstępna denaturacja - 95°C 5 minut
b) wstępnych 10 cykli składających się z: denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 68 do 58°C 30 sekund * wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 35 sekund
c) kolejnych 30 cykli, każdy składający się z: denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 57°C 30 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 30 sekund * - podczas pierwszych 10 cykli temperatura przyłączania starterów była obniżana o 1,2°C w każdym kolejnym cyklu (w pierwszym cyklu wynosiła 68°C, w drugim 66,8°C, w trzecim 65,6°C, w czwartym 64,4°C, w piątym 63,2°C, w szóstym 62°C, siódmym 60,8°C, w ósmym 59,6°C, w dziewiątym 58,4°C, w dziesiątym 57,2°C.)
Produkty reakcji PCR w ilości 5 μl mieszano z 10 μl buforu „Stop (roztwór sacharozy zabarwiony barwnikiem bromophenol blue) i poddawano elektroforezie w żelu agarozowym (1.5% agaroza (SeaKem FMC), 1X bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) w warunkach 6V/cm przez 30 min. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV.
PL 209 997 B1
SEQUENCE LISTING <110> Pomorska Akademia Medyczna Górski, Bohdan Lubiński, Jan Jakubowska, Anna Huzarski, Tomasz Byrski, Tomasz <120> Sposób i zestaw do wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego oraz zastosowanie wybranych mutacji w obrębie genu BRCA1 <130> PZ/080/RW <140> P 364 413 <141> 2004-01-15 <160> 13 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> starter B1EX5IK1F <400> 1 ctcttaaggg cagttgtgag <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220>
<223> starter B1EX5IK1R <400> 2 ttcctactgt ggttgcttcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial seguence
PL 209 997 B1 <220>
<223> starter Bl_4154DELAI2F <400> 3 ttggctcagg gttaccgaag <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> artificial seguence <220>
<223> starter B1_4154DELAI1R <400> 4 caagcccgtt cctctttctc a 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> artificial seguence <220>
<223> starter B1-5382INSCI1F <400> 5 cacttccatt gaaggaagct tc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> artificial seguence <220>
<223> starter B1-5382INSCI1R <400> 6 tacctttctg tcctggggat <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial seguence
PL 209 997 B1 <220>
<223> starter BlEX5IK2F <400> 7 atggctctta agggcagttg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> starter B1EX5IK2R <400> 8 tgtggttgct tccaacctag 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> starter B1_4154DELAK2F <400> 9 tcctagccct ttcacccata ca 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> starter Bl_4154DELAI2R <400> 10 aagcccgttc ctctttgtca
| <210> | 11 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | artificial seąuence |
| <220> |
PL 209 997 B1 <223> starter B1-5382INSCK2F <400> 11 atatgacgtg tctgctccac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> starter Bl-5382INSCI2R <400> 12 acctttctgt cctggggatt <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>
<223> starter Bl-5382INSCI2F <400> 13 tgacgtgtct gctccacttc
Claims (11)
1. Sposób diagnozowania wysokiej, genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi i/lub jajnika u kobiety pochodzenia polskiego będącej nosicielką mutacji BRCA1, znamienny tym, że wykrywa się co najmniej 85%, korzystnie co najmniej 90%, mutacji BRCA1, warunkujących wysoką genetyczną predyspozycję do raka piersi i/lub jajnika, przy czym bada się występowanie następujących mutacji: BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T>G oraz BRCA1 ex. 11 4153 delA.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obecność mutacji bada się techniką ASO-PCR, przy czym korzystnie obecność wszystkich rodzajów mutacji bada się w jednej mieszaninie reakcyjnej (multiplex-PCR).
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że obecność mutacji bada się techniką PCR-RFLP.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w reakcji multiplex-PCR używa się zestaw starterów wybrany spośród następujących zestawów:
PL 209 997 B1
a) B1EX5IK1F przedstawiony jako SEQ Nr 1, B1EX5IK1R przedstawiony jako SEQ Nr 2, B1_4154DELAI2F przedstawiony jako SEQ Nr 3, B1_4154DELAI1R przedstawiony jako SEQ Nr 4, B1-5382INSCI1F przedstawiony jako SEQ Nr 5, B1-5382INSCI1R przedstawiony jako SEQ Nr 6
b) B1EX5IK2F przedstawiony jako SEQ Nr 7, B1EX5IK2R przedstawiony jako SEQ Nr 8, B1_4154DELAK2F przedstawiony jako SEQ Nr 9, B1_4154DELAI2R przedstawiony jako SEQ Nr 10, B1-5382INSCK2F przedstawiony jako SEQ Nr 11, B1-5382INSCI2R przedstawiony jako SEQ Nr 12
c) B1_EX5IK1F przedstawiony jako SEQ Nr 1, B1EX5IK2R przedstawiony jako SEQ Nr 8, B1_4154DELAI2F przedstawiony jako SEQ Nr 3, B1_4154DELAI2R przedstawiony jako SEQ Nr 10, B1-5382INSCI2F przedstawiony jako SEQ Nr 13, B1-5382INSCI1R przedstawiony jako SEQ Nr 6.
5. Zastosowanie mutacji BRCA1 ex.20 5382 ins C, BRCA1 ex.5 300T >G oraz BRCA1 ex. 11 4153 del A do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego, przy czym wykrywa się co najmniej 85%, korzystnie co najmniej 90% mutacji BRCA1.
6. Zestaw starterów dla PCR do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego, znamienny tym, że jest wybrany spośród następujących zestawów:
a) B1EX51KIF przedstawiony jako SEQ Nr 1, B1EX5IK1R przedstawiony jako SEQ Nr 2, B1_4154DELAI2F przedstawiony jako SEQ Nr 3, B1_4154DELAI1R przedstawiony jako SEQ Nr 4, B1-53821NSCI1F przedstawiony jako SEQ Nr 5, B1_5382INSCI1R przedstawiony jako SEQ Nr 6
b) B1EX5IK2F przedstawiony jako SEQ Nr
7, B1EX5IK2R przedstawiony jako SEQ Nr
8, B1_4154DELAK2F przedstawiony jako SEQ Nr
9, B1_4154DELAI2R przedstawiony jako SEQ Nr
10, B1-5382INSCK2F przedstawiony jako SEQ Nr
11, B1-5382INSCI2R przedstawiony jako SEQ Nr 12
c) B1EX5IK1F przedstawiony jako SEQ Nr 1, B1EX5IK2R przedstawiony jako SEQ Nr 8, B1_4154DELAI2F przedstawiony jako SEQ Nr 3, B1_4154DELAI2R przedstawiony jako SEQ Nr 10, B1-5382INSC12F przedstawiony jako SEQ Nr 13, B1-5382INSCI1R przedstawiony jako SEQ Nr 6.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL364413A PL209997B1 (pl) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego oraz zastosowanie wybranych mutacji w obrębie genu BRCA1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL364413A PL209997B1 (pl) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego oraz zastosowanie wybranych mutacji w obrębie genu BRCA1 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL364413A1 PL364413A1 (pl) | 2005-07-25 |
| PL209997B1 true PL209997B1 (pl) | 2011-11-30 |
Family
ID=35784481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL364413A PL209997B1 (pl) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego oraz zastosowanie wybranych mutacji w obrębie genu BRCA1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL209997B1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL217731B1 (pl) | 2006-06-01 | 2014-08-29 | Tomasz Byrski | Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej obniżonej odpowiedzi na chemioterapię cytostatykiem taksanowym, zastosowanie mutacji założycielskiej oraz zestawu do wykrywania takiej odpowiedzi |
-
2004
- 2004-01-15 PL PL364413A patent/PL209997B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL364413A1 (pl) | 2005-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Myers et al. | Detection of single base substitutions in total genomic DNA | |
| US6020124A (en) | Detection of soluble gene sequences in biological fluids | |
| US8143000B2 (en) | Mutation within the connexin 26 gene responsible for prelingual non-syndromic deafness and method of detection | |
| EP0760002B1 (en) | Detection of mutation by resolvase cleavage | |
| JPS63139194A (ja) | ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラ−ゼ遺伝子の変異を同定するための特異的プロ−ブ | |
| JP2000500346A (ja) | Ｋｉ−ｒａｓ突然変異の検出方法および該検出方法を実施するためのキット | |
| CA1299506C (en) | Diagnostic probe for diabetes type i predisposition | |
| EP0584145B1 (en) | Process for the in vitro diagnosis of chromosomal anomalies correlated with cmt1a disease | |
| Dobbie et al. | Mutational analysis of the first 14 exons of the adenomatous polyposis coli (APC) gene | |
| US6063567A (en) | Method, reagents and kit for diagnosis and targeted screening for retinoblastoma | |
| Soubeyran et al. | Analysis of the expression of the hybrid gene bcl-2/IgH in follicular lymphomas | |
| Grebe et al. | Mutation analysis of the cystic fibrosis transmembrane regulator gene in Native American populations of the Southwest | |
| PL209997B1 (pl) | Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka sutka i/lub jajnika u osoby pochodzenia polskiego oraz zastosowanie wybranych mutacji w obrębie genu BRCA1 | |
| Zotz et al. | Mutation in the gene coding for coagulation factor V and resistance to activated protein C: detection of the genetic mutation by oligonucleotide ligation assay using a semi-automated system | |
| Martínez-Mir et al. | Putative association of a mutant ROM1 allele with retinitis pigmentosa | |
| WO1998059078A1 (en) | Methods of disease detection | |
| Dey et al. | Butyrylcholinesterase genes in individuals with abnormal inhibition numbers and with trace activity: one common mutation and two novel silent genes | |
| Ahmed | An approach for the prevention of thalassaemia in Pakistan | |
| US20070117095A1 (en) | Diagnostic method for neonatal or infantile epilepsy syndromes | |
| Ravisé et al. | Rapid detection of 17p11. 2 rearrangements by FISH without cell culture (direct FISH, DFISH): a prospective study of 130 patients with inherited peripheral neuropathies | |
| UYGUNER et al. | Establishment of a Nonradioactive molecular diagnosis of fragile-X syndrome | |
| PL226331B1 (pl) | Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka piersi oraz zastosowanie mutacji skracających białko CHEK2 | |
| Wiggs | Molecular genetics and ocular disease | |
| PL236138B1 (pl) | Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka prostaty | |
| AU2004279897A1 (en) | A diagnostic method for neonatal or infantile epilepsy syndromes |