PL210158B1 - Oczyszczona peptydowa część prodomeny miostatyny i oczyszczony polinukleotyd kodujący część peptydową prodomeny miostatyny - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest oczyszczona peptydowa część prodomeny miostatyny i oczyszczony polinukleotyd kodujący część peptydowa prodomeny miostatyny.

Wynalazek dotyczy ogólnie peptydu, który jest częścią promiostatyny (czynnika różnicowania wzrostu-8, GDF-8).

Ilość czasu, wysiłku i pieniędzy wydawanych w Stanach Zjednoczonych każdego roku przez osoby zamierzające stracić na wadze jest oszałamiająca. Dla wielu tych osób celem jest nie tylko lepszy wygląd, ale, co ważniejsze, uniknięcie nieuchronnych problemów medycznych związanych z nadwagą.

Uważa się, że ponad połowa populacji osób dorosłych w Stanach Zjednoczonych ma nadwagę. Ponadto, dwadzieścia do trzydziestu procent dorosłych mężczyzn i trzydzieści do czterdziestu procent dorosłych kobiet w Stanach Zjednoczonych uważa się za otyłe, w największym stopniu wśród biednych i mniejszości. Otyłość, która jest określana, jako przekroczenie, o co najmniej dwadzieścia procent średniego poziomu otyłości, wzrosła dramatycznie na przestrzeni ostatnich kilku dziesięcioleci i stał a się gł ównym problemem w populacji dziecię cej. Uważ a się , ż e dwadzieś cia procent wszystkich dzieci ma obecnie nadwagę, przy czym liczba ta podwoiła się w ciągu ostatnich pięciu lat.

Otyłość i problemy medyczne bezpośrednio z nią związane są na całym świecie główną przyczyną zapadalności na choroby i umieralności. Otyłość jest głównym czynnikiem ryzyka rozwoju różnych stanów patologicznych, w tym, miażdżycy tętnic, nadciśnienia, ataków serca, cukrzycy typu II, choroby pęcherzyka żółciowego oraz pewnych nowotworów i przyczynia się do przedwczesnej śmierci. Choroba serca jest wiodącą przyczyną umieralności w Stanach Zjednoczonych, a cukrzyca typu II dotyka powyżej 16 milionów ludzi w Stanach Zjednoczonych i jest jedną z wiodących przyczyn śmierci z powodu choroby.

Ponad osiemdziesiąt procent przypadków cukrzycy typu II występuje u osób otyłych. Chociaż cukrzyca typu II dotyka wszystkie rasy, jest szczególnie rozpowszechniona wśród rdzennych Amerykanów, Afro-Amerykanów i Amerykanów pochodzenia hiszpańskiego. Co znaczące, cukrzyca typu II, która zwykle występowała prawie wyłącznie u dorosłych w wieku powyżej czterdziestu lat, obecnie występuje u dzieci, a ilość przypadków rejestrowanych na przestrzeni ostatnich pięciu lat prawie się potroiła. Cukrzyca typu II, zwana również cukrzycą insulinoniezależną, charakteryzuje się obniżonym poziomem wydzielania insuliny w odpowiedzi na glukozę i odpornością organizmu na działanie insuliny, nawet jeżeli poziomy insuliny w krążeniu są na ogół prawidłowe albo podwyższone. Cukrzyca typu II wpływa na działanie różnorodnych tkanek i narządów i może prowadzić do choroby naczyniowej, upośledzenia nerek, retinopatii i neuropatii.

W przeciwieństwie do problemów medycznych związanych z otyłością, poważna utrata wagi występująca powszechnie u pacjentów z pewnymi przewlekłymi chorobami również stanowi wyzwanie dla interwencji medycznej. Podstawa molekularna tej utraty wagi określana, jako kacheksja, nie jest dobrze zrozumiana. Jednak jest jasne, że kacheksja komplikuje postępowanie przy takich chorobach i wiąże się ze złą prognozą dla pacjentów. Efektem kacheksji jest zespół wyniszczenia, który występuje u pacjentów z nowotworem i AIDS.

Chociaż dokonano wielu wysiłków próbując wyjaśnić procesy biologiczne zaangażowane w regulowanie wagi ciała, wyniki przyniosły więcej hałasu, niż są rzeczywiście warte. Przykładowo, odkrycie leptyny zostało powitane, jako przełom w zrozumieniu podstawy molekularnej nagromadzania tłuszczu u ludzi, a zatem z nadzieją na leczenie otyłości. Badania na zwierzętach wskazały, że leptyna uczestniczy w przekazywaniu wewnętrznych sygnałów regulujących apetyt, a zatem sugerowały, że leptyna mogłaby być przydatna w leczeniu ludzi cierpiących z powodu otyłości. Jednakże postęp w stosowaniu leptyny do leczenia otyłości jest obecnie powolny i jak dotąd leptyna nie sprostała początkowym oczekiwaniom.

Leczenie chorobliwej otyłości jest obecnie ograniczone do chirurgicznego usunięcia części jelita i zmniejszenia w ten sposób iloś ci absorbowanego jedzenia (i kalorii). Przy umiarkowanej oty ł o ś ci, jedynym „leczeniem” jest zdrowa dieta i regularne ćwiczenia, sposób, który w najlepszym razie daje skromne sukcesy. A zatem istnieje potrzeba identyfikacji czynników biologicznych uczestniczących w regulowaniu wagi ciała, w tym rozwoju mięśni i gromadzenia tłuszczu, tak aby można było opracować sposoby leczenia chorób, takich jak otyłość i kacheksja. Niniejszy wynalazek zaspakaja te potrzeby i dostarcza dodatkowych korzyści.

PL 210 158 B1

Niniejszy wynalazek dotyczy oczyszczonej części peptydowej prodomeny miostatyny, która ma aktywność wybraną z grupy składającej się z:

a) aktywności hamującej przekazywanie sygnału przez miostatynę;

b) aktywności wiązania miostatyny;

c) aktywności wiązania promiostatyny; i która składa się z reszt aminokwasowych od 20 do 262 jak przedstawiono w SEK. NR ID: 2. Sek. NR ID: 2 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu-promiostatyny ludzkiej. Sekwencje promiostatyny dla innych zwierząt są przedstawione na Liście Sekwencji, jako następujące: promiostatyna mysia (SEK NR ID: 4); promiostatyna szczurza (SEK NR ID: 6); promiostatyna pawiana (SEK NR ID: 10); promiostatyna bydlęca (SEK NR ID: 12); promiostatyna świńska (SEK NR ID: 14) i promiostatyna owcza (SEK NR ID: 16); promiostatyna ptasia o sekwencji aminokwasowej, takiej jak sekwencja promiostatyny kurzej (SEK NR ID: 8) i promiostatyny indyczej (SEK NR ID: 18) oraz promiostatyna rybia, taka jak polipeptyd promiostatyny danio pręgowanego o sekwencji aminokwasowej jak przedstawiono w SEK NR ID: 20. Ponadto, przykładem polipeptydu promiostatyny jest polipeptyd zawierający ujawnione tu części allelu 1 łososia (SEK NR ID: 27) lub części allelu 2 łososia (SEK NR ID: 29). Niniejszy wynalazek dotyczy również części prodomeny miostatyny określonej powyżej do zastosowania w medycynie.

W zakres wynalazku wchodzi również część prodomeny miostatyny określona, powyżej jako lek do leczenia lub zapobiegania chorobie wyniszczającej mięśnie, w tym zwłaszcza do leczenia dystrofii mięśni, choroby neuromięśniowej, kacheksji lub anoreksji.

Fragmentem proteolitycznym może być prodomena miostatyny, która obejmuje reszty aminokwasowe od 1 do około 262 polipeptydu promiostatyny. Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy oczyszczonego polinukleotydu kodującego część peptydową prodomeny miostatyny jak określona powyżej.

Krótki opis figur

Na fig. 1 pokazano sekwencje aminokwasowe promiostatyny mysiej (SEK NR ID: 4); promiostatyny szczurzej (SEK NR ID: 6); promiostatyny ludzkiej (SEK NR ID: 2); promiostatyny pawianiej (SEK NR ID: 10); promiostatyny bydlęcej (SEK NR ID: 12); promiostatyny świńskiej (SEK NR ID: 14); promiostatyny owczej (SEK NR ID: 16); promiostatyny kurzej (SEK NR ID: 8), promiostatyny indyczej (SEK NR ID: 18) i promiostatyny danio pręgowanego (SEK NR ID: 20). Aminokwasy są numerowane w stosunku do promiostatyny ludzkiej (SEK NR ID: 2). Linie przerywane wskazują na przerwy wprowadzone dla uzyskania maksymalnej homologii. Reszty identyczne w sekwencjach są zaciemnione.

Na fig. 2 pokazano sekwencje aminokwasowe promiostatyny mysiej (SEK NR ID: 4) i promiostatyny danio pręgowanego (SEK NR ID: 20) oraz części sekwencji aminokwasowych allelu 1 promiostatyny łososia (SEK NR ID: 27; „łosoś 1”) i allelu 2 promiostatyny łososia (SEK NR ID: 29; „łosoś 2”). Pozycja sekwencji aminokwasowej w stosunku do ludzkiej promiostatyny jest wskazana po lewej stronie każdego rzędu (porównaj fig. 1; pierwszy aminokwas łososia 1 odpowiada 218 promiostatyny ludzkiej; pierwszy aminokwas łososia 2 odpowiada 239 promiostatyny ludzkiej). Linie przerywane wskazują na przerwy wprowadzone dla uzyskania maksymalnej homologii. Względne pozycje aminokwasowe, w tym przerwy, są wskazane na górze każdego rzędu. Reszty identyczne w sekwencjach są zaciemnione.

Promiostatyna, która była określana wcześniej jako czynnik różnicowania wzrostu-8 (GDF-8) zawiera aminokońcową prodomenę i C-końcowy dojrzały peptyd miostatyny (patrz patent USA nr 5,827,733). Aktywność miostatyny jest wywołana przez dojrzały peptyd miostatyny po jego odcięciu od promiostatyny. A zatem, promiostatyna jest polipeptydem prekursorowym, który jest cięty proteolitycznie z wytworzeniem aktywnej miostatyny. Jak tu ujawniono, prodomena miostatyny może hamować aktywność miostatyny, aktywność GDF-11 albo obydwu.

Pro-GDF-11, który wcześniej określano ogólnie jako GDF-11, zawiera aminokońcową prodomenę i C-końcowy dojrzały peptyd GDF-11 (patrz międzynarodowa publikacja nr WO 98/35019). Aktywność GDF-11 wywołuje dojrzały peptyd GDF-11 po jego odcięciu od pro-GDF-11. A zatem, pro-GDF-11, podobnie jak promiostatyna, jest polipeptydem prekursorowym, który jest cięty proteolitycznie z wytworzeniem aktywnego GDF-11. Jak zostało tu ujawnione, prodomena GDF-11 może hamować aktywność GDF-11, aktywność miostatyny albo obydwu.

Promiostatyna i pro-GDF-11 są członkami nadrodziny transformujących czynników wzrostowych-β (TGF-β), która składa się z multifunkcjonalnych polipeptydów, które kontrolują proliferację, różnicowanie i inne funkcje w różnych typach komórek. Do narodziny TGF-β, która obejmuje grupę spokrewnionych strukturalnie białek, wpływających w szerokim zakresie na rozmaite procesy różnicowania w czasie

PL 210 158 B1 rozwoju płodowego, należy, na przykład, substancja hamująca Mullerian (ang. Mullerian inhibiting substance, MIS), która jest wymagana do prawidłowego rozwoju płci męskiej, (Behringer i wsp., Nature 345: 167, 1990), produkt genu decapentaplegic (DPP) Drosophila, który jest wymagany przy tworzeniu się osi grzbietowo-brzusznej i morfogenezie dysków imaginalnych (Padgett i wsp., Nature 325: 81-84, 1987), produkt genu Vg-1 Xenopus, który jest zlokalizowany na biegunie wegetatywnym jaja (Weeks i wsp., Cell 51: 861-867, 1987), aktywin (Mason i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. 135: 957-964, 1986), które mogą indukować tworzenie się mezodermy i struktur przednich w zarodkach Xenopus (Thomsen i wsp., Cell 63: 485, 1990) oraz morfogenne białka kości (BMP, osteogenina, OP1), które mogą indukować tworzenie się chrząstek i kości de novo (Sampath i wsp., J. Biol. Chem. 265: 13198, 1990). Członkowie rodziny TGF-β mogą wpływać na rozmaite procesy różnicowania, w tym, adipogenezę, miogenezę, chondrogenezę, hemopoezę i różnicowanie komórek nabłonkowych (Massague, Cell 49: 437, 1987; Massague, Ann. Rev. Biochem. 67: 753-791, 1998).

Wielu członków rodziny TGF-β ma wpływ regulacyjny (dodatni albo ujemny) na inne czynniki wzrostowe. Konkretnie, pewni członkowie nadrodziny TGF-β mają wzory ekspresji albo posiadają aktywności, które mają związek z działaniem układu nerwowego. Przykładowo, inhibiny i aktywiny są wyrażane w mózgu (Meunier i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 247, 1988; Sawchenko i wsp.. Nature 334: 615, 1988), a aktywiny mogą działać, jako cząsteczka przeżywania komórek nerwowych (Schubert i wsp., Nature 344: 868,1990). Inny członek rodziny, czynników różnicowania wzrostu-1 (GDF-1), jest specyficzny dla układu nerwowego w swoim wzorze ekspresji (Lee, Proc. Natl. Acad. Sci., MM 88: 4250, 1991), a inni przedstawiciele rodziny, tacy jak Vgr-1 (Lyons i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86 : 4554, 1989; Jones i wsp., Development 111: 531, 1991), OP-1 (Ozkaynak i wsp., J. Biol. Chem. 267: 25220, 1992) i BMP-4 (Jones i wsp., Development 111: 531, 1991), są również wyrażani w układzie nerwowym. Ponieważ mięsień szkieletowy wytwarza czynnik albo czynniki, które promują przeżywanie neuronów ruchowych (Brown, Trends Neurosci. 7: 10,1984), ekspresja miostatyny (GDF-8) i GDF-11 w mięśniu sugeruje, że miostatyna i GDF-11 mogą być czynnikami troficznymi dla neuronów. A zatem, sposoby modulowania aktywności miostatyny, GDF-11 albo obydwu mogą być przydatne do leczenia chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne lub dystrofia mięśniowa albo utrzymywania komórek lub tkanek w hodowli przed transplantacją.

Białka z rodziny TGF-β są syntetyzowane, jako duże białka prekursorowe, które następnie podlegają cięciu proteolitycznemu w zgrupowaniu reszt zasadowych około 110 do 149 aminokwasów od C-końca, co prowadzi do tworzenia się peptydu prodomeny i C-końcowego dojrzałego peptydu. C-końcowe dojrzałe peptydy członków tej rodziny białek są spokrewnione strukturalnie, a różnych członków rodziny można zaklasyfikować do różnych podgrup w oparciu o stopień ich homologii. Chociaż homologie w poszczególnych podgrupach mieszczą się w zakresie od 70% do 90% identyczności sekwencji aminokwasowej, homologie między podgrupami są znacząco niższe, na ogół mieszczą się w zakresie od 20% do 50%. W każdym przypadku, aktywna część wydaje się być połączonym wiązaniami disiarczkowymi dimerem C-końcowych fragmentów peptydowych.

Polipeptydy promiostatyny i pro-GDF-11 zostały zidentyfikowane u ssaków, ptaków i ryb, a miostatyna jest aktywna u różnych innych gatunków, w tym, kręgowców i bezkręgowców. W czasie rozwoju zarodkowego i u dorosłych zwierząt, miostatyna, na przykład, jest wyrażana specyficznie przez komórki w linii miogennej (McPherron i wsp., Nature 387: 83-90, 1997). Podczas wczesnej embriogenezy, miostatyna jest wyrażana przez komórki w przedziale miotomowym rozwijających się somitów. W późniejszych stadiach zarodkowych i u dorosłych zwierząt, miostatyna jest wyrażana szeroko w tkance mięśnia szkieletowego, jakkolwiek poziomy ekspresji mogą różnić się znacznie w zależności od mięśnia. Ekspresja miostatyny jest również wykrywana w tkance tłuszczowej, chociaż na niższych poziomach niż w mięśniu. Podobnie, GDF-11 jest wyrażany w tkance mięśniowej i tłuszczowej, jak również u dorosłych w grasicy, śledzionie i macicy, a także jest wyrażany w mózgu na różnych stadiach rozwojowych.

Polipeptydy promiostatyny z różnych gatunków wykazują zasadniczą identyczność sekwencji, a sekwencje aminokwasowe C-końcowej sekwencji dojrzałej miostatyny ludzkiej, mysiej, szczurzej i kurzej są w 100% identyczne (patrz fig. 1). Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące te polipeptydy promiostatyny są tu ujawnione jako SEK NR ID: 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 7, 17, 19, 26 i 28, odpowiednio (patrz również, McPherron i Lee, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94: 12457, 1997). Przykładem polipeptydu pro-GDF-11 jest tu również ludzki pro-GDF-11 (SEK NR ID: 25), który jest kodowany przez SEK NR ID: 24.

PL 210 158 B1

W świetle dużej konserwacji między polipeptydami promiostatyny, a w szczególności między gatunkami tak różnymi jak ludzie i ryby, byłoby sprawą rutynową otrzymanie polinukleotydów kodujących miostatynę z dowolnego gatunku, obejmując pozostałości sekwencji łososia 1 i łososia 2 w celu zidentyfikowania ekspresji promiostatyny lub miostatyny w dowolnym gatunku. W szczególności, sekwencja dojrzalej miostatyny wykazuje znaczącą homologię z innymi przedstawicielami nadrodzin TGF-β, a miostatyna zawiera większość reszt, które są silnie konserwowane wśród innych członków rodziny oraz w innych gatunkach. Ponadto, miostatyna, podobnie jak TGF^s i inhibina-ps ma dodatkową parę reszt cysteinowych poza siedmioma resztami cysteinowymi obecnymi u wirtualnie wszystkich innych członków rodziny. Miostatyna jest najbardziej homologiczna z Vgr-1 (45% identyczności sekwencji). Podobnie jak inni członkowie nadrodziny TGF-β, miostatyna jest syntetyzowana jako większy prekursorowy polipeptyd promiostatyny, który jest cięty proteolitycznie do aktywnego peptydu miostatyny.

Polinukleotydy kodujące polipeptydy promiostatyny z różnych organizmów można zidentyfikować przy zastosowaniu dobrze znanych procedur i algorytmów w oparciu o identyczność (albo homologię) z ujawnionymi sekwencjami. Homologię albo identyczność często mierzy się przy użyciu oprogramowania do analizy sekwencji, takiego jak pakiet oprogramowania do analizy sekwencji Genetics Computer Group (University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Takie oprogramowanie dopasowuje podobne sekwencje poprzez ustalenie stopnia homologii dla różnych delecji, podstawień i innych modyfikacji. Terminy „homologia” i „identyczność”, gdy są stosowane w kontekście dwóch lub większej liczby sekwencji kwasów nukleinowych albo polipeptydowych, dotyczą dwóch lub większej liczby sekwencji lub podsekwencji, które są takie same albo mają określony procent reszt aminokwasowych lub nukleotydów, które są takie same, gdy porównuje się je i dopasowuje tak, aby maksymalnie sobie odpowiadały w oknie porównania albo wskazanym regionie, co mierzy się przy zastosowaniu dowolnej liczby algorytmów porównywania sekwencji albo przez dopasowanie ręczne i badanie wizualne.

Przy porównywaniu sekwencji typowo jedna sekwencja działa, jako sekwencja odnośnikowa, z którą porównywane są sekwencje badane. Gdy stosuje się algorytm porównywania sekwencji, sekwencje odnośnikowe i badane wprowadza się do komputera, ustala się współrzędne podsekwencji, jeśli to niezbędne i wyznacza się parametry programu dla algotytmu sekwencji. Można zastosować domyślne parametry programu albo alternatywnie, parametry można wyznaczyć. Algorytm porównywania sekwencji oblicza następnie procent identyczności sekwencji dla sekwencji testowanych w stosunku do sekwencji odnośnikowej w oparciu o parametry programu.

Termin „okno porównania” jest tu szeroko stosowany w odniesieniu do odcinka z dowolnej liczby ciągłych pozycji, na przykład, od około 20 do 600 pozycji, na przykład, pozycji aminokwasowych albo nukleotydowych, zwykle od około 50 do około 200 pozycji, częściej od około 100 do 150 pozycji, w obrębie, którego sekwencja może być porównywana z sekwencją odnośnikową o tej samej liczbie ciągłych pozycji po maksymalnym dopasowaniu dwóch sekwencji. Sposoby dopasowywania sekwencji dla porównywania są dobrze znane w stanie techniki. Optymalne dopasowanie sekwencji do porównania można przeprowadzić, na przykład, przy użyciu algorytmu lokalnej homologii według Smith i Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981), algorytmu dopasowania przez homologię według Needleman i Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), metody przeszukiwania pod kątem podobieństwa według Persona i Lipmana (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444, 1988); przez implementatcję komputerową tych algorytmów (GAP, BESTFIT, PASTA i TFASTA w pakiecie oprogramowania Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI); albo przez dopasowanie ręczne i badanie wizualne. Inne algorytmy do ustalania homologii albo identyczności obejmują, na przykład, poza programem BLAST (ang. Basic Local Alignment Search Tool, w National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (ang. Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (ang. Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (ang. Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (ang. Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (ang. BLocks IMProved Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, algorytm Smith-Waterman, DARWIN, algorytm Las Vegas, FNAT (ang. Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (ang. Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (ang. Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (ang. Sensitive Sequence Comparison), LALIGN (ang. Local Sequence Alignment), LCP (ang. Local Content Program), MACAW (ang. Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (ang. Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (ang.

PL 210 158 B1

Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (ang. Sequence Alignment by Genetic Algorithm) oraz WHAT-IF. Takich programów do dopasowywania można również użyć do przeszukiwania genomowych baz danych w celu zidentyfikowania sekwencji polinukleotydowych mających zasadniczo identyczne sekwencje.

Do porównywania dostępnych jest wiele genomowych baz danych, obejmujących, na przykład, zasadniczą część genomu ludzkiego, która jest dostępna, jako część projektu sekwencjonowania genomu ludzkiego Human Genome Sequencing Project (J.Roachhttp://weber.u.Washington.edu/~roach/human_genome_progress2. html). Ponadto, co najmniej dwadzieścia jeden genomów zostało w całości zsekwencjonowanych, w tym, na przykład M. genitalium, M. jannaschii, H. influenzae, E. coli, drożdże (S. cerevisiae) i D. melanogaster. Znaczący postęp poczyniono również w sekwencjonowaniu genomów organizmów modelowych, takich mysz, C. elegans i Arabadopsis sp. Kilka baz danych zawierających informacje genomowe powiązane z pewnymi informacjami funkcjonalnymi jest utrzymywanych przez różne organizacje i dostępnych przez internet, na przykład, http://wwwtigr.org/tdb;

http://www.genetics.wisc.edu;

http://genome-www.stanford.edu/~ball; http://hiv-web.lani.gov;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov;

http://www.ebi.ac.uk;

http://Pasteur.fr/other/biology oraz http://www.genome.wi.mit.edu.

Jednym z przykładów przydatnych algorytmów są algorytmy BLAST i BLAST 2.0, które są opisane przez Altschul i wsp. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1977; J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, każda z nich włączona tu, jako odniesienie). Oprogramowanie do przeprowadzania analiz BLAST jest publicznie dostępne z National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nhn.nih.gov). Algorytm ten obejmuje najpierw identyfikację par sekwencji o wysokim współczynniku podobieństwa (HSP) przez zidentyfikowanie krótkich słów o długości W w sekwencji będącej zapytaniem, które albo pasują albo spełniają warunek odpowiednio wysokiej dodatniej wartości progowej T po dopasowaniu ze słowem tej samej długości w sekwencji z bazy danych. T określa się, jako wartość progową dla słowa z najbliższego sąsiedztwa (Altschul i wsp., jak wyżej, 1977, 1990). To znalezione wyjściowe słowo z najbliższego sąsiedztwa stanowi zaczątek poszukiwań w celu znalezienia zawierających je dłuższych HSP. Znalezione słowa wydłuża się w obu kierunkach wzdłuż każdej sekwencji tak długo, jak można zwiększyć sumaryczny wynik dopasowania. Wyniki łączne oblicza się przy użyciu, dla sekwencji nukleotydowych, parametrów M (nagroda dla pary pasujących zasad, zawsze > 0). Dla sekwencji aminokwasowych, stosuje się macierz podobieństwa w celu obliczenia wyniku sumarycznego. Wydłużanie znalezionych słów w każdą stronę jest zatrzymywane, gdy: sumaryczny wynik dopasowania spada o wartość X w stosunku do maksymalnej uzyskanej wartości; wynik sumaryczny dochodzi do zera albo poniżej na skutek akumulacji jednej albo więcej reszt dających wynik ujemny dopasowania albo osiągnięty jest koniec którejś z sekwencji. Parametry algorytmu BLAST, W, T, i X określają czułość i szybkość dopasowania. Program BLASTN (dla sekwencji nukleotydowych) stosuje jako parametry domyślne długość słowa (W) 11, wartość oczekiwana (E) 10, M=5, N=4 i porównywanie obydwu nici. Dla sekwencji aminokwasowych, program BLASTP stosuje jako parametry domyślne długość słowa 3 i wartość oczekiwaną (E) 10, oraz macierz podobieństwa BLOSUM62 (patrz Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1989) dopasowanie (B) 50, wartość oczekiwaną (E) 10, M=5, N=-4 i porównywanie obydwu nici.

Algortytm BLAST przeprowadza również analizę statystyczną podobieństwa między dwiema sekwencjami (patrz na przykład Karlin i Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci.,USA 90: 5873, 1993). Jedną z miar podobieństwa dostarczonego przez algorytm BLAST jest prawdopodobieństwo najniższej sumy (P(N)), które wskazuje na prawdopodobieństwo przypadkowego pasowania do siebie dwóch sekwencji nukleotydowych albo aminokwasowych. Przykładowo, uważa się że kwasy nukleinowe są podobne do sekwencji odnośnikowej, jeżeli prawdopodobieństwo najniższej sumy przy porównaniu testowanego kwasu nukleinowego z odnośnikowym kwasem nukleinowym jest mniejsze niż około 0,2, korzystniej, mniejsze niż około 0,01, a najkorzystniej mniejsze niż około 0,001.

W jednym z wykonań, homologię sekwencji białkowej i kwasu nukleinowego ocenia się przy zastosowaniu programu Basic Local Alignment Search Tool („BLAST”). Konkretnie, stosuje się pięć odrębnych programów BLAST dla przeprowadzenia następujących zadań:

PL 210 158 B1 (1) BLASTP i BLAST3 porównują zadaną sekwencję aminokwasową z sekwencjami białkowymi z baz danych;

(2) BLASTN porównuje zadaną sekwencję nukleotydową z sekwencjami nukleotydowymi z bazy danych;

(3) BLASTX porównuje produkty wirtualnej translacji w sześciu ramkach zadanej sekwencji nukleotydowej (obydwu nici) z sekwencjami białkowymi z bazy danych;

(4) TBLASTN porównuje zadaną sekwencję białkową z sekwencją nukleotydową z bazy danych poddaną translacji we wszystkich sześciu ramkach odczytu (obydwie nici); i (5) TBLASTX porównuje translację w sześciu ramkach zadanej sekwencji nukleotydowej z sekwencją nukleotydową z bazy danych poddaną translacji w sześciu ramkach odczytu.

Programy BLAST identyfikują sekwencje homologiczne przez identyfikowanie podobnych odcinków, które określa się tutaj jako „pary odcinków o wysokim współczynniku podobieństwa” między badaną sekwencją aminokwasową albo sekwencją kwasu nukleinowego a sekwencją testową, którą korzystnie otrzymuje się z bazy danych sekwencji białkowych albo kwasów nukleinowych. Korzystne jest identyfikowanie (tj. dopasowanie) pary odcinków o wysokim współczynniku podobieństwa przez zastosowanie macierzy podobieństwa, z których wiele znanych jest w tej dziedzinie. Korzystne jest zastosowanie jako macierzy podobieństwa BLOSUM62 (Gonnet i wsp., Science 256: 1443-1445, 1992; Henikoff and Henikoff, Proteins 17: 49-61,1993, z których każda włączona jest tu jako odniesienie). Jako mniej korzystne, można użyć macierze PAM lub PAM250 (Schwartz i Dayhoff, wyd., „Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure' (Washington, National Biomedical Research Foundation 1978)). Programy BLAST są dostępne, na przykład, przez U. S. National Library of Medicine, pod adresem www.ncbi.nlm.nih.gov.

Parametry zastosowane w powyższych algorytmach można zaadaptować w zależności od długości sekwencji i stopnia badanej homologii. W niektórych wykonaniach, parametrami mogą być parametry domyślne stosowane w algorytmach przy braku instrukcji od użytkownika.

Polinukleotyd kodujący promiostatynę może pochodzić z dowolnego organizmu, obejmującego, na przykład, mysz, szczura, krowę, świnię, człowieka, kurę, indyka, danio pręgowane, łososia, rybę, inne organizmy wodne oraz inne gatunki. Przykłady organizmów wodnych obejmują te należące do klasy Piscina, takie jak pstrąg, pstrąg jeziorowy, aju (łac. Plecoglossus altivelis), karp, karaś srebrzysty, karaś złocisty, płoć, ang. whitebait (łac. Allosmerus elongatus (Ayres)), węgorz, konger, sardynka, ptaszor, labraks, kantar, paralabraks, lucjan, makrela, makrela wielka, tuńczyk, pelamida, ostrobok, karmazyn, karmazyn pozłotek, poskarp, sola, flądra, rozdymka, jednorożek zmienny; obejmują te należące do klasy Cephalopoda, takie jak kałamarnica, mątwa, ośmiornica; te należące do grupy Pelecypoda, takie jak małże słonowodne (np. ang. hardshell (Mercenaria mercenaria lub M. campechiensls), Manila (Tapes philippinarum, Quahog (Mercenaria mercenaria), muszla spisula (Spisula solidissima), małgiew piaskołaz (Mya arenaria); sercówki, mule, pobrzeżki; przegrzebki (np. ang. sea (Placopecten magellanicus), ang. bay (Aequipecten irradians concentricus), ang. calloo); skrzydelniki, ślimaki, strzykwy; małże z rodziny Arcidae; ostrygi (np. C. virginica, Zatoka Nowo-Zelandzka, Pacyfik); obejmują te należące do klasy Gastropoda takie jak rogowiec (Batillus cornutus), perło-pławy (np. zielony, różowy, czerwony) oraz obejmują te należące do grupy skorupiaków takie jak homary, włączając v/ to między innymi, Spiny (Panulirus interruptus), Rock (Panulirus interruptus) American (Homarus americanus); krewetka czerwona; krewetki, włączając w to między innymi M. roserabergii,

P. styllrolls, P. indicus, P. jeponious, P. monodon, P. vannemel, M. ensis, S. melantho, N. norvegious, pandelatkę północną; krab, włączając w to między innymi kalinka błękitnego, kraba rozbójnika (palmowego), jeżokraba, krabona królewskiego, ang. queen, snow (Chionoecetes opilio), kieszeńca europejskego (Cancer pagurus), kieszeńca magistra (Cancer magister), Jonah (Cancer borealis), Mangrove (Scylla serrata), krab ang. Soft Shell; ang. squilla (łac. Squilla empusa), kryl, langusty; raki, włączając w to między innymi raka błękitnego, Marron (Cherax tenuimanus), Red Claw (Cherax quadricarinatus), Red Swamp (Procambarus clarkii), ang.Soft-shelled, white (Procambarus zonangulus lub P. acutus) pierścienice; strunowce, włączając w to między innymi gady takie jak aligatory i żółwie; płazy, w tym żaby; i szkarłupnie włączając w to między innymi jeżowce.

Stosowany tutaj termin „pro-GDF”, na przykład, promiostatyna lub pro-GDF-11 oznacza polipeptyd pełnej długości, obejmujący aminokońcową prodomenę i karboksykońcowy aktywny biologicznie peptyd GDF. Dodatkowo, prodomena zawiera peptyd sygnałowy (sekwencję liderową), która obejmuje około 15 do 30 aminokwasów na końcu aminowym prodomeny. Peptyd sygnałowy może być odcinany

PL 210 158 B1 od polipeptydu pro-GDF pełnej długości, który może być dalej cięty w miejscu cięcia proteolitycznego Arg-Xaa-Xaa-Arg (SEK NR ID: 21).

Odniesienie się tu do reszt aminokwasowych dotyczy polipeptydów pro-GDF pełnej długości, jak pokazano na fig. 1 i 2 (patrz również Lista Sekwencji). Powinno być zrozumiałym, że odniesienia dokonuje się tu w stosunku do konkretnych peptydów rozpoczynających się lub kończących „około” określonej reszty aminokwasowej. Termin „około” jest stosowany w tym kontekście, ponieważ wiadomo, że poszczególne proteazy mogą przecinać polipeptyd pro-GDF w obrębie albo w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca rozpoznawania dla cięcia proteolitycznego, albo jeden lub kilka aminokwasów od miejsca rozpoznawania.

Podobnie, peptyd sygnałowy może być odcięty w dowolnej pozycji od reszty aminokwasowej około 15 do 30 polipeptydu pro-GDF, na przykład, przy resztach 15, 20, 25 lub 30, bez wpływu na funkcję, na przykład, pozostałej prodomeny. A zatem dla wygody, na ogół poczynione jest tu odniesienie do części peptydowej polipeptydu pro-GDF, od której został odcięty sygnał peptydowy, jako zaczynający się przy około 20 reszcie aminokwasowej. Jednak będzie oczywiste, że odcięcie peptydu sygnałowego może nastąpić przy dowolnej pozycji aminokwasowej w obrębie pierwszych około 15 do 30 aminokońcowych aminokwasów polipeptydu pro-GDF.

Termin „peptyd” albo „część peptydowa” jest tu szeroko stosowany dla określenia dwóch lub więcej aminokwasów połączonych wiązaniem peptydowym. Termin „fragment” albo „fragment proteolityczny” jest tu również stosowany, aby określić produkt, który można wytworzyć przez reakcję proteolityczną wobec polipeptydu, tj. peptyd wytwarzany po cięciu wiązania peptydowego w polipeptydzie. Chociaż termin „fragment proteolityczny” jest tu stosowany dla określenia peptydu, który można wytworzyć przez reakcję proteolityczną, powinno być oczywiste, że fragment nie musi być koniecznie wytwarzany przez reakcję proteolityczną, ale może być również wytwarzany przy użyciu metod syntezy chemicznej albo metod technologii rekombinowania DNA, w celu wytworzenia peptydu syntetycznego, który jest ekwiwalentem fragmentu proteolitycznego, jak omówiono szczegółowo poniżej. W świetle ujawnionej homologii promiostatyny z innymi członkami nadrodziny TGF-β, będzie oczywiste, że peptyd według wynalazku charakteryzuje się po części tym, że nie jest obecny u ujawnionych tu wcześniej członków tej nadrodziny. To, czy część peptydowa promiostatyny lub polipeptydu proGDF jest obecna u ujawnionego wcześniej przedstawiciela nadrodziny TGF-β można łatwo ustalić przy zastosowaniu powyżej opisanych algorytmów komputerowych.

Stosowany tu termin „zasadniczo oczyszczony” lub „zasadniczo czysty” albo „wyizolowany” oznacza, że omawiana cząsteczka, na przykład peptyd albo polinukleotyd, jest w postaci, która jest zasadniczo wolna od białek, kwasów nukleinowych, lipidów, węglowodanów lub innych materiałów, z którymi jest naturalnie związana. Ogólnie, zasadniczo czysty peptyd, polinukleotyd lub inna cząsteczka stanowi, co najmniej dwadzieścia procent próbki, na ogół stanowi przynajmniej około pięćdziesięciu procent próbki, zwykle stanowi przynajmniej około osiemdziesięciu procent próbki, a w szczególności stanowi, co najmniej około dziewięćdziesiąt procent lub dziewięćdziesiąt pięć procent lub więcej próbki. Ustalenia, że peptyd albo polinukleotyd według wynalazku jest zasadniczo czysty, można dokonać przy użyciu dobrze znanych sposobów, na przykład przeprowadzając elektroforezę i identyfikując konkretną cząsteczkę, jako względnie odrębny prążek. Zasadniczo czysty polinukleotyd można otrzymać, na przykład, przez klonowanie polinukleotydu lub metodą syntezy chemicznej albo enzymatycznej. Zasadniczo czysty peptyd można otrzymać, na przykład, metodą syntezy chemicznej lub stosując metody y oczyszczania białka, a następnie proteolizę i jeśli to pożądane, dalsze oczyszczanie przy użyciu metod elektroforetycznych lub chromatograficznych.

Peptyd według wynalazku można zidentyfikować przez porównanie z sekwencją promiostatyny i ustalenie, że sekwencja aminokwasowa peptydu zawiera się w obrębie sekwencji polipeptydowej promiostatyny. Peptyd według wynalazku może być poddany modyfikacji i wówczas będzie różnił się od sekwencji występującej naturalnie, np. obecnością jednego lub więcej D-aminokwasów w miejsce odpowiadającego L-aminokwasu jeden albo więcej analogów aminokwasów, na przykład, aminokwasy, które zostały przekształcone w pochodne albo w inny sposób zmodyfikowane w łańcuchach bocznych. Podobnie może być zmodyfikowane w peptydzie jedno lub więcej wiązań peptydowych. Ponadto, zmodyfikowane mogą być grupy reaktywne na końcu aminowym lub karboksylowym albo obydwu. Takie peptydy mogą być zmodyfikowane, na przykład w celu zwiększenia stabilności wobec proteazy, czynnika utleniającego albo innego reaktywnego materiału, który peptyd może napotkać w środowisku biologicznym, a zatem mogą być szczególnie przydatne w przeprowadzaniu sposobu identyfikacji.

PL 210 158 B1

Oczywiście, peptydy mogą być tak zmodyfikowane, że mają zmniejszoną stabilność w środowisku biologicznym, a zatem okres, gdy peptyd jest aktywny w środowisku może być mniejszy.

Sekwencja polipeptydu według wynalazku także może być zmodyfikowana w porównaniu z odpowiednią sekwencją w polipeptydzie promiostaty lub pro-GDF-11 przez dokonanie konserwowanych podstawień aminokwasowych w stosunku do jednego albo większej liczby aminokwasów w peptydzie. Podstawienia aminokwasowe obejmują wymianę jednej albo większej liczby reszt aminokwasowych na inną resztę aminokwasową mającą zasadniczo takie same właściwości chemiczne, na przykład, zastąpienie reszty hydrofobowej, takiej jak izoleucyna, walina, leucyna lub metionina inną albo zastąpienie jednej polarnej reszty inną, na przykład, zastąpienie argininy lizyną albo kwasu glutaminowego asparaginowym, albo glutaminy asparaginą lub temu podobne. Przykłady pozycji polipeptydu promiostatyny, które można zmodyfikować są oczywiste z analizy fig. 1, na której pokazano rozmaite różnice aminokwasowe w prodomenie miostatyny i dojrzałym peptydzie miostatyny, które nie wpływają zasadniczo na aktywność promiostatyny lub miostatyny.

Część peptydową prodomeny miostatyny według wynalazku, można też wytworzyć metodą chemiczną albo metodami rekombinowania DNA. Peptyd według wynalazku, który stanowi funkcjonalną część peptydową prodomeny miostatyny może mieć aktywność hamującą przekazywanie sygnału przez miostatynę, aktywność wiązania miostatyny i aktywność wiązania promiostatyny. Oczywiste jest, że na przykład funkcjonalna część peptydową albo dojrzały peptyd miostatyny pełnej długości nie muszą mieć tej samej aktywności, co dojrzała miostatyna, w tym, zdolność do przekazywania sygnału przez miostatynę, ponieważ funkcjonalna część peptydowa dojrzałego peptydu może mieć, na przykład, zdolność do specyficznego oddziaływania z receptorem miostatyny bez posiadania jednocześnie zdolności do aktywowania szlaku przekazywania sygnału. W jednym z wykonań funkcjonalna część peptydowa polipeptydu promiostatyny może oddziaływać specyficznie z receptorem miostatyny i może działać jako antagonista zmniejszając albo hamując przekazywanie sygnału przez miostatynę.

W innym wykonaniu funkcjonalna część peptydowa polipeptydu promiostatyny może oddziaływać specyficznie z polipeptydem promiostatyny albo z dojrzałym peptydem miostatyny tym samym blokując przekazywanie sygnału przez miostatynę. Taka funkcjonalna część peptydowa promiostatyny może działać, na przykład, przez zapobieganie cięciu polipeptydu promiostatyny do dojrzałej miostatyny, przez tworzenie kompleksu z dojrzałym polipeptydem miostatyny albo przez inny mechanizm. Tam, gdzie tworzy się kompleks peptyd-miostatyna, kompleks może blokować przekazywanie sygnału przez miostatynę, na przykład, przez zmniejszenie lub hamowanie zdolności miostatyny do specyficznego oddziaływania z jej receptorem albo przez wiązanie się z receptorem w postaci, której brak zdolności do indukowania przekazywania sygnału przez miostatynę.

Fragmenty proteolityczne polipeptydu pro-GDF można wytworzyć przez cięcie polipeptydu w miejscu cięcia proteolitycznego mającego sekwencję aminokwasową najwyższej zgodności ArgXaa-Xaa-Arg (SEK NR ID: 21). Przykładami takich rozpoznawanych miejsc proteolitycznych są: sekwencja Arg-Ser-Arg-Arg (SEK NR ID: 22) pokazana, jako reszty aminokwasowe 263 do 266 w SEK NR ID: 1 (promiostatyna) lub reszty aminokwasowe 295 do 298 z SEK NR ID: 25 (ludzki pro-GDF-11; patrz również, względne pozycje 267 do 270 z fig. 2) oraz sekwencja Arg-Ile-Arg-Arg (SEK NR ID: 23) pokazana, jako reszty aminokwasowe od 263 do 266 w SEK NR ID: 20.

W dodatku do miejsc cięcia proteolitycznego dla peptydu sygnałowego, polipeptydy promiostatyny zawierają, na przykład, dwa dodatkowe potencjalne miejsca obróbki proteolitycznej (Lys-Arg i Arg-Arg). Cięcie polipeptydu promiostatyny w albo obok dalszego miejsca obróbki proteolitycznej, które jest zawarte w obrębie miejsca rozpoznawania największej zgodności Arg-Xaa-Xaa-Arg (SEK NR ID: 21) dla cięcia proteolitycznego (patrz, na przykład, reszty aminokwasowe 263 do 266 z SEK NR ID: 2), wytwarza aktywny biologicznie C-końcowy fragment dojrzałej ludzkiej miostatyny. Przykładowe peptydy dojrzałej miostatyny pełnej długości zawierają od około 103 do około 109 aminokwasów i mają przewidywaną masę cząsteczkową około 12400 daltonów (Da). Ponadto, miostatyna może tworzyć dimery o spodziewanej masie cząsteczkowej od około 23 do 30 kilodaltonów (kDa). Dimery miostatyny mogą być homodimerami lub heterodimerami, na przykład, z GDF-11 lub innym GDF albo członkiem rodziny TGF-β.

Część peptydowa prodomeny miostatyny, która obejmuje reszty aminokwasowe od 20 do 262 polipeptydu promiostatyny, pro domena miostatyny może zawierać ponadto peptyd sygnałowy obejmujący aminokwasy od około 1 do 20 odpowiedniego polipeptydu pro-GDF. Funkcjonalna część peptydowa prodomeny miostatyny według wynalazków może oddziaływać specyficznie z miostatyną albo promiostatyną. Prodomena miostatyny lub prodomena GDF-11 może oddziaływać z dojrzałą miostatyną,

PL 210 158 B1 zmniejszając w ten sposób albo hamując zdolność dojrzałego GDF do specyficznego oddziaływania ze swoim receptorem (patrz przykłady 7 i 8). A zatem, funkcjonalna część peptydowa prodomeny miostatyny można, na przykład, otrzymać przez badanie części peptydowych prodomeny miostatyny przy zastosowaniu dostarczonych tu sposobów i identyfikowanie funkcjonalnych części peptydowych prodomeny, które mogą oddziaływać specyficznie z miostatyną albo z promiostatyną i mogą zmniejszać albo hamować zdolność miostatyny do specyficznego oddziaływania z receptorem miostatyny.

Funkcjonalną część peptydową prodomeny miostatyny, która może specyficznie oddziaływać z miostatyną, można również zidentyfikować przy zastosowaniu różnych znanych testów, o których wiadomo, że są przydatne do identyfikowania swoistych oddziaływań białko-białko. Takie testy obejmują, na przykład, metody elektroforezy w żelu, chromatografię powinowactwa, system dwuhybrydowy Fields i Song (Nature 340: 24 5-24 6,198 9; patrz, również opis patentowy USA nr 5283173; Fearon i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7958-7962, 1992; Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9578-9582, 1991; Young, Biol. Reprod. 58: 302-311 (1998) odwrotny test dwuhybrydowy (Leanna i Hannink, Nucl. Acids Res. 24: 3341-334 7,1996, który jest tu włączony, jako odniesienie), system reprymowanego transaktywatora (patent USA nr 5885779,)), system prezentacji na fagach (Lowman, Ann. Rev. Biophvs. Biomol. Struct. 26: 401-424,1997, który jest tu włączony, jako odniesienie), testy ściągania GST/HIS, zmutowane operatory (WO 98/01879, które są tu włączone, jako odniesienie), system rekrutacji białek (opis patentowy USA nr 5776689) i temu podobne (patrz na przykład, Mathis, Clin. Chem. 41: 139-147, 1995; Lam, Anticancer Drug Res. 12: 145-167, 1997; Phizicky i wsp., Microbiol. Rev. 59: 94-123, 1995).

Funkcjonalną część peptydową prodomeny GDF można również zidentyfikować przy zastosowaniu metod modelowania molekularnego. Na przykład, sekwencję aminokwasową dojrzałego peptydu miostatyny można wprowadzić do systemu komputerowego mającego odpowiednie oprogramowanie do modelowania i wytworzyć trójwymiarowy obraz miostatyny („wirtualną miostatynę”). Sekwencję aminokwasową promiostatyny można również wprowadzić do systemu komputerowego tak, że oprogramowanie do modelowania może stymulować części sekwencji promiostatyny, na przykład części prodomeny, i może identyfikować te części peptydowe prodomeny, które mogą oddziaływać specyficznie z wirtualną miostatyną. Można ustalić uprzednio linię graniczną dla oddziaływań specyficznych przez modelowanie wirtualnej miostatyny i prodomeny promiostatyny pełnej długości i identyfikowanie reszt aminokwasowych w miostatynie, które mają „kontakt” z prodomeną, ponieważ wiadomo, że takie oddziaływania hamują aktywność miostatyny.

Metody, takie jak testy dwuhybrydowe, można zastosować do identyfikowania receptora GDF, takiego jak receptor miostatyny, stosując, na przykład, peptyd miostatyny albo jego część peptydową, która oddziałuje specyficznie z receptorem Act RIIA albo Act RIIA, jako jeden ze składników testu, identyfikując receptor GDF, który oddziałuje specyficznie z peptydem miostatyny. Podobnie, metod modelowania molekularnego można użyć do identyfikowania czynnika, który oddziałuje specyficznie z dojrzałym peptydem GDF, takim jak dojrzała miostatyna albo z receptorem GDF, a zatem może być przydatny, jako agonista albo antagonista przy przekazywaniu sygnału za pośrednictwem GDF albo receptora GDF. Takim czynnikiem może być, na przykład, funkcjonalna część peptydowa prodomeny miostatyny, która naśladuje działanie prodomeny GDF.

Systemy modelowania przydatne dla ujawnionych tu potrzeb mogą opierać się na informacji strukturalnej otrzymanej, na przykład, przez analizę krystalograficzną lub analizę rezonansu magnetycznego albo informacje o pierwszorzędowej sekwencji (patrz na przykład Dunbrack i wsp., „Meeting review: the Second meeting on the Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction (CASP2) (Asilomar, California, Grudzień 13-16, 1996). Fold Des. 2 (2): R27-42, (1997); Fischer i Eisenberg, Protein Sci. 5: 947-55, 1996; (patrz również, opis patentowy USA nr 5436850); Havel, Prog. Biophys. Mol. Biol. 56: 43-78, 1991; Lichtarge i wsp., J. Mol. Biol. 274: 325-37, 1997; Matsumoto i wsp., J. Biol. Chem. 270: 19524-31, 1995; Sali i wsp., J. Biol. Chem. 268: 9023-34, 1993; Sali, Molec. Med. Today 1: 270-7, 1995a; Sali, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 437-51, 1995b; Sali i wsp., Proteins 23: 318-26, 1995c; Sali, Nature Struct. Biol. 5: 1029-1032, 1998; opis patentowy USA nr 5933819; opis patentowy USA nr 5265030).

Można zastosować współrzędne struktury krystalicznej polipeptydu promiostatyny albo receptora GDF w celu zaprojektowania związków, które wiążą się z białkiem i zmieniają jego właściwości fizyczne lub fizjologiczne w różny sposób. Współrzędne strukturalne białka mogą być również użyte w celu komputerowego przeszukania baz danych małych cząsteczek pod kątem czynników, które wiążą się z polipeptydem w celu opracowania czynników modulujących albo wiążących, które mogą

PL 210 158 B1 działać, jako agoniści lub antagoniści przekazywania sygnału przez GDF. Takie czynniki można zidentyfikować przez komputerowe dopasowanie danych kinetycznych przy użyciu standardowych równań (patrz na przykład Segel, „Enzyme Kinetics” J. Wiley & Sons 1975).

Sposoby wykorzystania danych o strukturze krystalicznej do projektowania inhibitorów albo czynników wiążących są dobrze znane w tej dziedzinie. Na przykład, współrzędne receptora GDF można nałożyć na inne dostępne współrzędne podobnych receptorów, w tym, receptorów mających związany inhibitor, dla dostarczenia przybliżenia sposobu, w jaki inhibitor oddziałuje z receptorem. Programy komputerowe wykorzystywane w praktyce racjonalnego projektowania leków można również zastosować w celu identyfikowania związków, które dają oddziaływania charakterystyczne, na przykład, między dojrzałą miostatyną i krystalizowaną jednocześnie prodomeną miostatyny. Szczegółowa wiedza o naturze specyficznych oddziaływań umożliwia modyfikowanie związków w celu zmiany lub poprawy rozpuszczalności, farmakokinetyki i temu podobnych bez wpływu na aktywność wiązania.

Programy komputerowe do przeprowadzenia działań niezbędnych dla zaprojektowania czynników przy użyciu informacji o strukturze krystalicznej są dobrze znane. Przykłady takich programów obejmują Catalyst Databases™ - program wyszukujący informacje z dostępem do bazy danych chemicznych, takich jak BioByte Master File, Derwent WDI i ACD; Catalyst/HYPOTM - wytwarza modele związków i hipotezy dla wyjaśnienia zróżnicowania aktywności wraz ze strukturą leków-kandydatów; Ludi™ - dopasowuje cząsteczki do miejsca aktywnego białka przez identyfikowanie i dopasowywanie komplementarnych grup polarnych i hydrofobowych oraz Leapfrog™ - „tworzy” nowe ligandy przy użyciu algorytmu genetycznego z parametrami kontrolowanymi przez użytkownika.

Z takimi programami można używać różnych urządzeń ogólnego zastosowania lub też wygodniejszym może być skonstruowanie aparatury bardziej wyspecjalizowanej do wykonywania tych operacji. Do komunikacji z systemem komputerowym każdy program może być zaimplementowany w dowolnie wybranym języku komputerowym, w tym, na przykład, w języku maszynowym, asemblerze, czy proceduralnych lub zorientowanych obiektowo językach wysokiego poziomu. W każdym przypadku język ten może być językiem interpretowanym lub kompilowanym. Program komputerowy będzie zwykle przechowywany na nośniku lub w urządzeniu przechowywania danych, na przykład w pamięci ROM, na dysku CD-ROM, nośniku magnetycznym czy optycznym, lub podobnym, który może być odczytany w programowalnym komputerze ogólnego lub specjalnego zastosowania w celu skonfigurowania i sterowania tym komputerem tak, by po odczytaniu nośnika lub urządzenia przechowywania danych wykonał opisane tu procedury.

Można również traktować ten system, jako implementację w postaci odczytywalnego komputerowo nośnika danych, skonfigurowanego z programem komputerowym, gdy tak skonfigurowany nośnik danych powoduje, że komputer działa w specyficzny i zawczasu określony sposób by wykonać opisane tu funkcje.

Ujawnione tu systemy są to, na przykład, systemy oparte na internecie, w szczególności systemy komputerowe, które przechowują i manipulują informacjami o współrzędnych uzyskanymi przez analizę krystalograficzną lub NMR, lub informacją o sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej. W użytym tu znaczeniu termin „system komputerowy” odnosi się do elementów sprzętowych, elementów programowych i elementów gromadzenia danych użytych do analizowania współrzędnych lub sekwencji tu opisanych. System komputerowy obejmuje zwykle procesor do przetwarzania, dostępu i manipulacji danymi sekwencyjnymi. Procesorem może być dowolny dobrze znany rodzaj jednostki centralnej, na przykład, procesor Pentium II lub Pentium III firmy Intel Corporation, lub podobny procesor firmy Sun, Motorola, Compaq, Advanced MicroDevices lub International Business Machines.

Typowo system komputerowy jest systemem ogólnego zastosowania obejmującym procesor i jeden lub więcej wewnętrznych elementów przechowywania danych dla przechowywania danych, oraz jedno lub więcej urządzeń odczytu dla odczytywania danych przechowywanych w elementach przechowywania danych. Specjalista w tej dziedzinie z łatwością stwierdzi, że dowolny z dostępnych obecnie systemów komputerowych nadaje się do tego celu.

Tam, gdzie konieczne jest identyfikowanie czynnika chemicznego, który oddziałuje specyficznie z miostatyną albo receptorem GDF można użyć dowolnej z wielu metod dla przeszukiwania czynników chemicznych pod kątem ich zdolności do specyficznego oddziaływania z cząsteczką. Proces ten może rozpocząć się od badania wizualnego, na przykład, miostatyny i prodomen miostatyny przy użyciu przeszukiwania komputerowego. Wybrane części peptydu prodomeny albo czynniki chemiczne, które działają, jako mimetyki, mogą być umieszczane w różnych orientacjach albo zakotwiczone w obrębie danego miejsca wiązania miostatyny. Zakotwiczenia można dokonać przy zastosowaniu

PL 210 158 B1 oprogramowania, takiego jak Quanta i Sybyl, a następnie minimalizacji energii i dynamiki molekularnej z użyciem standardowych pól siłowych mechaniki molekularnej, takich jak CHARMM i AMBER.

Wyspecjalizowane programy komputerowe mogą być szczególnie przydatne przy wyborze części peptydowych prodomeny albo czynników chemicznych przydatnych, na przykład, jako agonista albo antagonista receptora GDF. Takie programy obejmują, na przykład, GRID (Goodford, J. Med. Chem., 28: 849-857, 1985; dostępny z Oxford University, Oxford, UK); MOSS (Miranker i Karplus, Proteins: Structure. Function and Genetics 11: 29-34,1991, dostępny z Molecular Simulations, Burlington MA); AUTODOCK (Goodsell i Olsen, Proteins: Structure. Function, and Genetics 8: 195-202,1990, dostępny z Scripps Research Institute, La Jolla CA); DOCK (Kuntz, i wsp., J. Mol. Biol. 161: 269-288, 1982, dostępny z University of California, San Francisco CA).

Odpowiednie peptydy albo czynniki, które zostały wybrane można złożyć w pojedynczy związek albo czynnik wiążący. Składanie można przeprowadzić przez badanie „na oko” wzajemnych związków fragmentów na trójwymiarowym obrazie otrzymanym na ekranie komputera, a następnie ręczne budowanie modelu przy użyciu oprogramowania, takiego jak Quanta lub Sybyl. Przydatne programy pomocne specjalistom w tej dziedzinie przy łączeniu poszczególnych związków chemicznych lub fragmentów obejmują na przykład CAVEAT (Bartlett i wsp., Special Pub., Royal Chem. Soc. 78: 182-196, 1989, dostępny z University of California, Berkeley CA); systemy bazy danych 3D takie jak MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro CA; dla przeglądu patrz Martin, J. Med. Chem. 35: 2145-2154, 1992); HOOK (dostępny z Molecular Simulations, Burlington, Mass.).

Poza metodami budowania albo identyfikowania takich specyficznie oddziałujących czynników w sposób przemyślany, po jednym fragmencie albo czynniku chemicznym w danym czasie, jak opisano powyżej, czynniki można projektować w całości albo de novo przy zastosowaniu bądź wolnego miejsca aktywnego, albo, ewentualnie, włączając pewne części znanych czynników, które oddziałują specyficznie, na przykład, prodomenę miostatyny pełnej długości, która oddziałuje specyficznie z miostatyną. Takie metody obejmują na przykład LUDI (Bohm, J. Comp. Aid. Molec. Design 6: 6178, 1992, dostępny z Biosym Technologies, San Diego CA); LEGEND (Nishibata i Itai, Tetrahedron 47: 8985, 1991, dostępny z Molecular Simulations, Burlington MA); LeapFrog (dostępny z Tripos Associates, St. Louis MO) i te opisane przez Cohen i wsp. (J. Med. Chem. 33: 883-894, 1990) oraz przez Navia i Murcko, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 202-210,1992).

Specjalne oprogramowanie komputerowe jest dostępne w tej dziedzinie dla oceny energii deformacji związku i oddziaływania elektrostatycznego. Przykłady programów zaprojektowanych do takich zastosowań obejmują Gaussian 92, revision C (Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh PA, 1992); AMBER, wersja 4.0 (Kollman, University of California at San Francisco, 1994); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington MA, 1994) oraz Insight II/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego CA, 1994). Programy te można zastosować przy użyciu, na przykład, stacji roboczej Siłicon Graphics, IRIS 4D/35 lub stacji roboczej IBM RISC/6000 model 550. Inne systemy sprzętu komputerowego i pakiety oprogramowania będą znane specjalistom w tej dziedzinie, a ich szybkość i pojemność są stale modyfikowane.

Podobnie do innych członków nadrodziny TGF-β, aktywne peptydy GDF są wyrażane jako polipeptydy prekursorowe, które są cięte do dojrzałej, aktywnej biologicznie postaci. A zatem, proteolitycznym fragmentem polipeptydu pro-GDF jest dojrzały peptyd GDF albo funkcjonalna część peptydowa dojrzałego peptydu GDF, gdzie, jak omówiono powyżej, funkcjonalna część peptydowa może mieć aktywność agonisty albo antagonisty GDF. Fragmentem proteolitycznym może być dojrzały C-końcowy peptyd miostatyny, który obejmuje reszty aminokwasowe od około 268 do 374 polipeptydu promiostatyny ( patrz fig. 1; patrz również fig. 2) albo dojrzały C-końcowy peptyd GDF-11, który obejmuje reszty aminokwasowe od około 299 do 407 polipeptydu pro-GDF-11. Przykładami peptydów dojrzałej miostatyny pełnej długości są reszty aminokwasowe od około 268 do 375 jak przedstawiono w SEK NR ID: 4 i SEK NR ID: 6; przez reszty aminokwasowe od około 267 do 374 jak przedstawiono w SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 10, SEK NR ID: 12, SEK NR ID: 8, SEK NR ID: 18, SEK NR ID: 14, SEK NR ID: 16 i SEK NR ID: 20 przez reszty aminokwasowe od około 49 do 157 z SEK NR ID: 27 przez reszty aminokwasowe od około 28 do 136 z SEK NR ID: 29. Przykładem dojrzałego peptydu GDF-11 pełnej długości są reszty aminokwasowe od około 299 do 407 z SEK NR ID: 25. Przykładami funkcjonalnych części peptydowych dojrzałych peptydów GDF są części peptydowe dojrzałej miostatyny albo dojrzałego GDF-11, które mają aktywność agonistyczną lub antagonistyczną w odniesieniu do aktywności dojrzałego peptydu GDF. Korzystnie, jeżeli aktywność dojrzałego peptydu GDF powoduje zdolność do specyficznego oddziaływania z jego receptorem.

PL 210 158 B1

Jak tu ujawniono, dojrzały peptyd miostatyny (określany tu ogólnie, jako „miostatyna”) może indukować aktywność przekazywania sygnału przez specyficzne oddziaływanie z receptorem miostatyny wyrażanym na powierzchni komórki (patrz przykład 7). A zatem funkcjonalną część peptydową miostatyny można otrzymać przez badanie części peptydowych peptydu dojrzałej miostatyny stosując opisaną tu metodę (przykład 7) albo inne znane w tej dziedzinie i identyfikację funkcjonalnych części peptydowych miostatyny, które oddziałują specyficznie z receptorem miostatyny, na przykład, receptorem aktywiny typu I (Act RIIA) albo receptorem Act RIIB wyrażanym na komórce.

Prodomena miostatyny może zmniejszać albo hamować aktywność przekazywania sygnału przez miostatynę. W jednym z wykonań, prodomena miostatyny może oddziaływać specyficznie z miostatyną, zmniejszając albo hamując w ten sposób zdolność peptydu miostatyny do specyficznego oddziaływania z jej receptorem. Jak tu ujawniono, prekursorowa promiostatyna również nie ma zdolności do specyficznego oddziaływania z receptorem miostatyny, a zatem mutacje w promiostatynie, które zmniejszają albo hamują podatność promiostatyny na cięcie do dojrzałej miostatyny dostarczają również sposobów zmniejszenia albo hamowania przekazywania sygnału przez miostatynę Zmutowany polipeptyd pro-GDF może zawierać jedną albo więcej mutacji aminokwasowych, które przerywają cięcie proteolityczne zmutowanego pro-GDF do aktywnego dojrzałego peptydu GDF.

Zmutowany polipeptyd pro-GDF może mieć mutację, która wpływa na miejsce cięcia proteolitycznego, takiego jak rozpoznawane miejsce dla cięcia proteolitycznego największej zgodności Arg-Xaa-Xaa-Arg (SEK NR ID: 21), które jest obecne w polipeptydach pro-GDF. A zatem mutacją może być mutacja reszty Arg w SEK NR ID: 21, taką że zmutowana promiostatyna, na przykład, nie może być cięta do prodomeny miostatyny i dojrzałego peptydu miostatyny. Jednakże zmutowane może być również miejsce inne niż miejsce cięcia proteolitycznego i może ono zmieniać zdolność proteazy do wiązania się z polipeptydem pro-GDF, tak, że wpływa na proteolizę w miejscu cięcia. Zmutowany polipeptyd pro-GDF, na przykład, zmutowana pro-miostatyna albo zmutowany pro-GDF-11, może mieć dominującą negatywną aktywność w odniesieniu do miostatyny lub GDF-11, a zatem może być przydatny dla zmniejszania albo hamowania miostatyny albo przekazywania sygnału przez GDF-11 w komórce.

Część peptydowa prodomeny miostatyny według wynalazku może być wykorzystana, jako składnik białka fuzyjnego z innym peptydem. Taki polipeptyd fuzyjny można wytworzyć metodą rekombinacji DNA, w której może on być wyrażany z przyłączonych funkcjonalnie sekwencji kodujących. Wówczas dwa (albo więcej) zakodowanych peptydów podlega translacji do pojedynczego polipeptydu, tj. peptydy są połączone kowalencyjnie przez wiązanie peptydowe albo mogą podlegać translacji, jako dwa odrębne peptydy, które po translacji mogą łączyć się ze sobą funkcjonalnie z wytworzeniem stabilnego kompleksu.

Niniejszy wynalazek dostarcza również zasadniczo oczyszczonego polinukleotydu, który koduje część peptydową prodomeny miostatyny. Termin „polinukleotydy” jest tu szeroko stosowany i oznacza sekwencję dwóch lub więcej deoksyrybonukleotydów lub rybonukleotydów, które są połączone razem wiązaniami fosfodiestrowymi. Jako taki, termin „polinukleotydy” obejmuje RNA i DNA, którym może być gen albo jego część, cDNA, syntetyczna sekwencja kwasu polideoksyrybonukleinowego i temu podobne i może on być jednoniciowy albo dwuniciowy, jak również może to być hybryda DNA/RNA. Ponadto, stosowany tu termin „polinukleotydy” obejmuje naturalnie występujące cząsteczki kwasu nukleinowego, które mogą być wyizolowane z komórki, jak również cząsteczki syntetyczne, które można wytworzyć, na przykład, sposobami syntezy chemicznej albo metodami enzymatycznymi, takimi jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR). W różnych wykonaniach, polinukleotyd według wynalazku może zawierać analog nukleozydu lub nukleotydu albo wiązanie w szkielecie inne niż wiązanie fosfodiestrowe (patrz wyżej).

Na ogół, nukleotydy stanowiące polinukleotyd są naturalnie występującymi deoksyrybonukleotydami, takimi jak adenina, cytozyna, guanina lub tymina połączonymi z 2'-deoksyrybozą, albo rybonukleotydami, takimi jak adenina, cytozyna, guanina lub uracyl połączonymi z rybozą. Jednak polinukleotyd może również zawierać analogi nukleotydów, włączając w to niewystępujące naturalnie nukleotydy syntetyczne albo zmodyfikowane nukleotydy występujące naturalnie. Takie analogi nukleotydów są dobrze znane w tej dziedzinie i są dostępne w handlu, podobnie jak polinukleotydy zawierające takie analogi nukleotydów ((Lin i wsp., Nucl. Acids Res. 22: 5220-5234 (1994); Jellinek i wsp., Biochemistry 34: 11363-11372 (1995); Pagratis i wsp., Nature Biotechnol. 15: 68-73 (1997)).

Wiązaniem kowalencyjnym łączącym nukleotydy polinukleotydu jest na ogół wiązanie fosfodiestrowe. Jednak wiązaniem kowalencyjnym może być również dowolne z wielu innych wiązań, w tym,

PL 210 158 B1 wiązanie tiodiestrowe, wiązanie fosforotionianowe, wiązanie podobne do peptydowego albo dowolne inne wiązanie znane specjalistom w tej dziedzinie, jako przydatne do łączenia nukleotydów w celu wytworzenia polinukleotydów syntetycznych (patrz na przykład Tam i wsp., Nucl. Acids Res. 22: 977-986 (1994); Ecker i Crooke, BioTechnology 13: 351360 (1995)). Włączenie niewystępujących naturalnie analogów nukleotydów albo wiązań łączących nukleotydy albo analogi może być szczególnie przydatne tam, gdzie polinukleotyd ma być wystawiony na działanie środowiska, które zawiera aktywność nukleolityczną, obejmującego, na przykład, pożywkę do kultur tkankowych lub po podaniu żywemu osobnikowi, ponieważ zmodyfikowane polinukleotydy mogą być mniej podatne na degradację.

Polinukleotyd zawierający występujące naturalnie nukleotydy i wiązania fosfodiestrowe może być zsyntetyzowany chemicznie albo może być wytworzony metodami rekombinowania DNA, z użyciem odpowiedniego polinukleotydu, jako matrycy. Natomiast polinukleotyd zawierający analogi nukleotydów lub wiązania kowalencyjne inne niż wiązania fosfodiestrowe na ogół, będzie zsyntetyzowany chemicznie, chociaż enzym, taki jak polimeraza T7 może włączać do polinukleotydu pewne typy analogów nukleotydów, a zatem może być stosowana do wytwarzania takiego polinukleotydu na drodze rekombinowania DNA z odpowiedniej matrycy (Jellinek i wsp., jak wyżej, 1995).

Sekwencja kodująca polinukleotydy jest na ogół zawarta w wektorze i jest połączona funkcjonalnie z odpowiednimi elementami regulacyjnymi, obejmującymi, jeśli to pożądane, specyficzny tkankowo promotor albo wzmacniacz. Zakodowany peptyd może być ponadto połączony funkcjonalnie, na przykład, ze znacznikiem peptydowym, takim jak znacznik His-6 i temu podobne, który może ułatwić identyfikację ekspresji peptydu w komórce docelowej. Polihistydynowy znacznik peptydowy, taki jak His-6, można wykryć przy użyciu kationów dwuwartościowych, takich jak jony niklu, jony kobaltu i temu podobne. Dodatkowe znaczniki peptydowe obejmują, na przykład, epitop FLAG, który można wykryć przy użyciu przeciwciała anty-FLAG (patrz na przykład, Hopp i wsp., BioTechnology 6: 1204 (1988); opis patentowy USA nr 5011912); epitop c-myc, który można wykryć przy użyciu przeciwciała specyficznego dla epitopu; biotynę, którą można wykryć przy użyciu streptawidyny albo awidyny oraz S-transferazę glutationu, którą można wykryć przy użyciu glutationu. Takie znaczniki mają taką dodatkową zaletę, że mogą ułatwiać izolację połączonego funkcjonalnie peptydu, na przykład, tam, gdzie pożądane jest otrzymanie zasadniczo oczyszczonego peptydu odpowiadającego fragmentowi proteolitycznemu polipeptydu miostatyny.

Stosowany tu termin „połączony funkcjonalnie” albo „związany funkcjonalnie” oznacza, że dwie albo więcej cząsteczek jest położonych względem siebie tak, że działają, jako pojedyncza jednostka i wpływają na funkcję, którą można przypisać jednej albo obu cząsteczkom albo ich kombinacji. Na przykład, sekwencja polinukleotydowa kodująca peptyd według wynalazku może być połączona funkcjonalnie z elementem regulacyjnym, który działa regulacyjnie na polinukleotyd podobnie do sposobu, jakim ten element regulacyjny wpływałby na sekwencję polinukleotydowa, z którą jest normalnie związany w komórce.

Polipeptyd fuzyjny na ogół wykazuje niektóre albo wszystkie właściwości każdego ze składników peptydowych. Taki polipeptyd fuzyjny może być szczególnie przydatny na przykład w modulowaniu przekazywania przez miostatynę sygnału w komórce. A zatem tam, gdzie jeden składnik peptydowy fuzyjnego polipeptydu koduje domenę lokalizacji w kompartmencie komórkowym, a drugi składnik peptydowy koduje dominujący negatywny polipeptyd Smad, funkcjonalny fuzyjny polipeptyd może podlegać translokacji do kompartmentu komórkowego wyznaczanego przez domenę lokalizacji w kompartmencie komórkowym i może mieć dominującą negatywną aktywność polipeptydu Smad, modulując w ten sposób przekazywanie sygnału przez miostatynę w komórce.

Domeny kompartmentacji komórkowej są dobrze znane i obejmują, na przykład, domenę lokalizacji w błonie plazma-tycznej, sygnał lokalizacji jądrowej, sygnał lokalizacji w błonie mitochondrialnej, sygnał lokalizacji w retikulum endoplazmatycznym i temu podobne (patrz na przykład Hancock i wsp., EMBO J. 10: 4033-4039, 1991; Buss i wsp., Mol. Cell. Biol. 8: 3960-3963, 1988; opis patentowy USA nr 5,776,689). Taka domena może być przydatna do kierowania czynnika do konkretnego kompartmentu w komórce albo kierowania czynnika do wydzielenia z komórki. Przykładowo, domena kinazowa receptora miostatyny, takiego jak Act RIIB na ogół jest związana z wewnętrzną powierzchnią błony plazmatycznej. A zatem, polipeptyd fuzyjny zawierający dominującą negatywną domenę kinazową receptora miostatyny, na przykład, dominujący negatywny receptor Act RIIB, któremu brak aktywności kinazy, może zawierać dodatkowo domenę lokalizacji w błonie plazmatycznej, umieszczając dominującą negatywną domenę kinazową Act RIIB w błonie wewnętrznej.

PL 210 158 B1

Peptyd sygnałowy pro-GDF ma aktywność lokalizacji komórkowej. Stosowany tu termin „aktywność lokalizacji komórkowej” dotyczy zdolności peptydu sygnałowego do kierowania translokacją peptydu połączonego z nim funkcjonalnie do jednego albo większej liczby ściśle określonych kompartmentów wewnątrzkomórkowych albo kierowania wydzieleniem cząsteczki z komórki. Peptyd sygnałowy pro-GDF może być szczególnie przydatny do kierowania translokacją peptydu albo innego czynnika połączonego funkcjonalnie z peptydem sygnałowym do tych samych kompartmentów wewnątrzkomórkowych, co wyrażany naturalnie GDF mający zasadniczo ten sam peptyd sygnałowy. Ponadto, peptyd sygnałowy, na przykład, peptyd sygnałowy promiostatyny zawierający pierwszych około 15 do 30 aminokwasów promiostatyny może kierować wydzielaniem połączonego funkcjonalnie czynnika z komórki tą samą drogą, co naturalnie występujący pro-GDF zawierający peptyd sygnałowy. A zatem szczególnie przydatne czynniki przy przeprowadzaniu identyfikacji części peptydowej pro domeny miostatyny obejmują prodomenę GDF albo jej funkcjonalną część peptydową połączoną funkcjonalnie z peptydem sygnałowym promiostatyny.

Polinukleotyd według wynalazku, który może kodować część peptydową prodomeny miostatyny może być zawarty w wektorze, co może ułatwić manipulację polinukleotydem, w tym wprowadzanie polinukleotydu do komórki docelowej. Wektorem może być wektor do klonowania, który jest przydatny do utrzymywania polinukleotydu albo może być wektor ekspresyjny, który zawiera, poza polinukleotydem, elementy regulacyjne przydatne do wyrażania polinukleotydu i do wyrażania zakodowanego peptydu w konkretnej komórce. Wektor ekspresyjny może zawierać elementy ekspresyjne niezbędne do uzyskania, na przykład, utrzymującej się transkrypcji zakodowanego polinukleotydu albo elementy regulacyjne mogą być połączone funkcjonalnie z polinukleotydem przed sklonowaniem w wektorze.

Wektor ekspresyjny (albo polinukleotyd), na ogół zawiera albo koduje sekwencję promotorową, która może dostarczać konstytutywnej albo, jeśli to pożądane, indukowalnej albo specyficznej tkankowo albo specyficznej dla stadium rozwojowego ekspresji zakodowanego polinukleotydu, sekwencję rozpoznawaną przez poli A oraz sekwencję rozpoznawaną przez rybosom albo wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu albo inne elementy regulacyjne, takie jak wzmacniacz, który może być specyficzny tkanowo. Wektor może również zawierać, jeśli jest to pożądane, elementy wymagane do replikacji w systemie gospodarza prokariotycznego albo eukariotycznego, albo obu. Takie wektory, które obejmują wektory plazmidowe i wektory wirusowe, takie jak wektory w oparciu o bakteriofaga, bakulowirusa, retrowirusa, lentiwirusa, adenowirusa, wirusa krowianki, wirusa Semliki Forest i wirusy związane z adenowirusem, są dobrze znane i można je nabyć ze źródła handlowego (Promega, Madison WI; Stratagene, La Jolla CA; GIBCO/BRL, Gaithersburg MD) albo specjalista w tej dziedzinie może je skonstruować (patrz, na przykład, z Meth. Enymol., Vol. 185, Goeddel, wyd. (Academic Press, Inc., 1990); Jolly, Canc. Gene Ther. 1: 51-64,1994; Flotte, J. Bioenerg. Biomemb. 25: 37-42, 1993; Kirshenbaum i wsp., J. Clin. Invest. 92: 381-387, 1993).

Promotor indukowalny tetracykliną (tet) może być szczególnie przydatny do kierowania ekspresją polinukleotydu według wynalazku. Po podaniu tetracykliny albo analogu tetracykliny osobnikowi zawierającemu polinukleotyd połączony funkcjonalnie z promotorem indukowanym tetracykliną, indukowana jest ekspresja zakodowanego polipeptydu, dzięki czemu peptyd może wykazać swoją aktywność, na przykład, za pomocą, której czynnik peptydowy może zmniejszyć albo zahamować przekazywanie sygnału przez miostatynę. Taki sposób można zastosować, na przykład, do indukowania rozrostu mięśni u dorosłego organizmu.

Polinukleotyd może być również połączony funkcjonalnie ze specyficznym tkankowo elementem regulacyjnym, na przykład, elementem regulującym specyficznym w stosunku do komórki mięśniowej, takim, aby ekspresja zakodowanego peptydu była ograniczona do komórek mięśniowych osobnika albo do komórek mięśniowych w mieszanej populacji komórek w hodowli, na przykład, hodowli narządu. Elementy regulacyjne specyficzne dla komórek mięśniowych obejmujące, na przykład, promotor mięśniowej kinazy kreatynowej (Sternberg i wsp., Mol. Cell. Biol. 8: 2896-2909,1988)) i wzmacniacz/promotor łańcucha lekkiego miozyny (Donoghue i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 5847-5851, 1991) są dobrze znane w tej dziedzinie.

Wirusowe wektory ekspresyjne mogą być szczególnie przydatne do wprowadzania polinukleotydu do komórki, a w szczególności komórki osobnika. Wektory wirusowe mają tę zaletę, że mogą infekować komórki gospodarza ze stosunkowo wysoką wydajnością i mogą infekować specyficzne typy komórek. Na przykład, polinukleotyd kodujący peptydową część prodomeny miostatyny można sklonować w wektorze bakulowirusowym, który można następnie użyć do infekowania owadzich komórek gospodarza i w ten sposób wytworzyć duże ilości zakodowanej części prodomeny. Wektor

PL 210 158 B1 wirusowy może również pochodzić z wirusa, który infekuje komórki gospodarza będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład, komórki kręgowca, takiego jak komórka gospodarza - ssaka, ptaka czy ryby. Wektory wirusowe mogą być szczególnie przydatne do wprowadzania polinukleotydu do komórki docelowej. Wektory wirusowe opracowano do zastosowania w konkretnych systemach gospodarza, a w szczególności w systemach ssaczych i obejmują, na przykład, wektory retrowirusowe, inne wektory lentiwirusowe, takie jak te oparte na ludzkim wirusie niedoboru odporności (HIV), wektory adenowirusowe, wektory wirusowe związane z adenowirusem, wektory w oparciu o wirusy krowianki i temu podobne (patrz Miller i Kosman, BioTechniques 7: 980-990, 1992; Anderson i wsp., Nature 392: 25-30 Suppl., 1998; Verma i Somia, Nature 389: 239-242, 1997; Wilson, New Engl. J. Med. 334: 1185-1187 (1996).

Gdy retrowirusy są, na przykład, używane do przenoszenia genów, teoretycznie mogą powstać kompetentne pod względem replikacji retrowirusy na skutek rekombinacji wektora retrowirusowego i sekwencji genu wirusowego w pakujących liniach komórkowych wykorzystywanych do wytwarzania wektora retrowirusowego. Pakujące linie komórkowe, w których wytwarzanie kompetentnych pod względem replikacji wirusów przez rekombinację zostało zmniejszone albo wyeliminowane, mogą być użyte do zminimalizowania prawdopodobieństwa, że będą wytwarzane retrowirusy kompetentne pod względem replikacji. Wszystkie supernatanty wirusowe używane do infekowania komórek przeszukuje się pod kątem kompetentnych pod względem replikacji wirusów przy użyciu standardowych testów, takich jak testy z PCR i odwrotną transkryptazą. Wektory retrowirusowe umożliwiają włączenie heterologicznego genu do genomu komórki gospodarza, co umożliwia przekazanie genu do komórki potomnej po podziale komórkowym.

Polinukleotyd, który może być zawarty w wektorze, można wprowadzić do komórki dowolną z wielu metod znanych w tej dziedzinie (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley i Sons, Baltimore, MD (1987, i uzupełnienia do 1995)). Takie metody obejmują na przykład transfekcję, lipofekcję, mikroiniekcję, elektroporację, a przy wektorach wirusowych, zakażanie i mogą obejmować użycie liposomów, mikroemulsji i temu podobnych, co może ułatwić wprowadzenie polinukleotydu do komórki i może chronić polinukleotyd przed rozkładem, zanim zostanie wprowadzony do komórki. Wybór konkretnej metody będzie zależał, na przykład, od komórki, do której polinukleotyd ma być wprowadzony, jak również od tego, czy komórka jest izolowana w hodowli, czy jest w hodowli tkanki czy narządu, czy in situ.

Wprowadzenie polinukleotydu do komórki drogą zakażenia przy użyciu wektora wirusowego jest szczególnie korzystne z tego względu, że może on wydajnie wprowadzać cząsteczkę kwasu nukleinowego do komórki ex vivo lub in vivo (patrz na przykład, opis patentowy USA nr 5,399,346). Ponadto, wirusy są bardzo wyspecjalizowane i można je wybrać jako wektory w oparciu o ich zdolność do zakażania i namnażania się w jednej z kilku specyficznych typów komórek. A zatem, ich naturalną specyficzność można wykorzystać do kierowania cząsteczki kwasu nukleinowego zawartej w wektorze do specyficznych typów komórek. I tak, wektor oparty na HIV może być używany do zakażania komórek T, wektor oparty na adenowirusie może być używany, na przykład, do zakażania komórek nabłonka oddechowego, wektora opartego na wirusie opryszczki można użyć do zakażania komórek neuronowych it. Inne wektory, takie jak związane z adenowirusami, mogą mieć większy zakres gospodarza, a zatem mogą być użyte do zakażania różnych typów komórek, aczkolwiek wirusowe i niewirusowe wektory mogą być zmodyfikowane specyficznymi receptorami albo ligandami, aby zmienić specyficzności wobec celu przez zdarzenia za pośrednictwem receptora.

Miostatyna jest niezbędna dla prawidłowej regulacji masy mięśnia szkieletowego. W porównaniu z myszami typu dzikiego, myszy z nokautem miostatyny, którym brak miostatyny mają dwa do trzech razy więcej mięśni z powodu kombinacji rozrostu i przerostu (ang. hyperplasia and hypertrophy). Jak tu ujawniono, myszy z nokautem mają również dramatyczne zmniejszenie nagromadzenia tłuszczu na skutek, co najmniej po części, zwiększonego stanu anabolicznego tkanki mięśni szkieletowych w całym organizmie. W przeciwieństwie do tego, nadekspresja miostatyny w nagich myszach indukuje zespół wyniszczenia, który przypomina stan kachektyczny obserwowany u pacjentów cierpiących z powodu przewlekłych chorób, takich jak nowotwór lub AIDS. Jak będzie tu dalej ujawnione, w aktywności miostatyny może pośredniczyć przekazywanie sygnału, mające właściwości szlaku przekazywania sygnału Smad. A zatem można modulować wpływ miostatyny na komórkę przez doprowadzenie do kontaktu komórki z czynnikiem, który wpływa na przekazywanie przez miostatynę sygnału w komórce.

PL 210 158 B1

Stosowany tu termin „modulować”, gdy jest używany w odniesieniu do wpływu miostatyny na komórkę, oznacza, że przekazywanie sygnału przez miostatynę w komórce jest albo zwiększone albo zmniejszone lub zahamowane. Termin „zwiększyć” i „zmniejszyć lub hamować” jest użyty w odniesieniu do poziomu podstawowego aktywności przekazywania sygnału przez miostatynę, który może być poziomem aktywności szlaku przekazywania sygnału w nieobecności miostatyny albo poziomem aktywności w prawidłowej komórce w obecności miostatyny. Na przykład, szlak przekazywania sygnału przez miostatynę wykazuje określoną aktywność w komórce mięśniowej, która ma kontakt z miostatyną, a po doprowadzeniu następnie do kontaktu komórki mięśnia z prodomeną miostatyny, aktywność przekazywania sygnału przez miostatynę może być zmniejszona lub zahamowana. A zatem prodomena miostatyny jest czynnikiem przydatnym do zmniejszania lub hamowania przekazywania sygnału przez miostatynę. Podobnie, prodomena innego członka rodziny GDF, taka jak prodomena GDF-11 albo innego członka rodziny TDF-βα, taka jak prodomena aktywiny, prodomena MIS lub temu podobne mogą być przydatne do zmniejszania przekazywania sygnału przez miostatynę. Terminy „zmniejszyć lub hamować” są tu stosowane razem, ponieważ wiadomo, że w niektórych przypadkach poziom przekazywania sygnału przez miostatynę może być zmniejszony poniżej poziomu, który można wykryć w konkretnym teście. A zatem, nie można ustalić przy zastosowaniu takiego testu, czy pozostaje niski poziom przekazywania sygnału przez miostatynę czy też przekazywanie sygnału jest całkowicie zahamowane.

Stosowany tu termin „przekazywanie sygnału przez miostatynę” dotyczy serii zdarzeń, na ogół, serii oddziaływań białko-białko, które następują w komórce na skutek specyficznych oddziaływań miostatyny z receptorem miostatyny wyrażanym na powierzchni komórki. A zatem przekazywanie sygnału przez miostatynę można wykryć, na przykład, przez wykrywanie specyficznych oddziaływań miostatyny z jej receptorem na powierzchni komórki, przez wykrywanie fosforylacji jednego albo większej liczby polipeptydów uczestniczących w szlaku przekazywania sygnału przez miostatynę w komórce, przez wykrywanie ekspresji jednego albo większej liczby genów, które są specyficznie indukowane na skutek przekazywania sygnału przez miostatynę albo przez wykrywanie zmiany fenotypowej, która następuje w odpowiedzi na przekazywanie sygnału przez miostatynę (patrz przykłady). Przykładem szlaku przekazywania sygnału przez miostatynę jest szlak Smad, który jest inicjowany po specyficznym oddziaływaniu miostatyny z domeną zewnątrzkomórkową receptora aktywiny typu II i rozprzestrzenia się przez oddziaływania wewnątrzkomórkowych polipeptydów, w tym białka Smad w komórce. Na ogół, przekazywanie sygnału przez miostatynę jest związane z fosforylacją lub defosforylacją specyficznych wewnątrzkomórkowych polipeptydów, takich jak polipeptydy Smad. A zatem przekazywanie sygnału przez miostatynę w komórce można wykryć przez wykrywanie zwiększonego poziomu fosforylacji jednego albo większej liczby polipeptydów Smad w obecności miostatyny w porównaniu z poziomem fosforylacji polipeptydów w nieobecności miostatyny. Można przy pomocy różnych środków zwiększać albo zmniejszać przekazywanie sygnału przez miostatynę, a zatem poziom fosforylacji polipeptydu Smad uczestniczącego w szlaku przekazywania sygnału przez miostatynę będzie odpowiednio zwiększony powyżej poziomu normalnego albo zmniejszony poniżej poziomu oczekiwanego w obecności miostatyny.

Na przykład można doprowadzić do kontaktu w odpowiednich warunkach komórkę docelową i czynnik, który dokonuje przekazania sygnału przez miostatynę w komórce. Odpowiednie warunki można uzyskać przez umieszczenie komórki, którą może być komórka wyizolowana albo może być składnik tkanki albo narządu, w odpowiedniej pożywce hodowlanej albo przez doprowadzenie do kontaktu z komórką w organizmie in situ. Na przykład, można doprowadzić do kontaktu pożywki zawierającej komórkę z czynnikiem, który wpływa na zdolność miostatyny do specyficznego oddziaływania z receptorem miostatyny wyrażanym na komórce, albo z czynnikiem, który wpływa na przekazywanie sygnału przez miostatynę w komórce. Jednakże, komórka może również podlegać manipulacjom w hodowli, a następnie może być utrzymywana w hodowli, podawana osobnikowi albo użyta do wytworzenia transgenicznego zwierzęcia innego niż człowiek.

Czynnikiem może być dowolny typ cząsteczki, na przykład, polinukleotyd, peptyd, peptydomimetyk, peptoidy, takie jak peptoidy podstawiane analogami winylowymi, małe cząsteczki organiczne lub temu podobne i może działać w dowolny sposób, aby wpłynąć na przekazanie sygnału przez miostatynę. Czynnik może działać zewnątrzkomórkowo przez wiązanie się z miostatyną albo receptorem miostatyny, takim jak receptor aktywiny, zmieniając w ten sposób zdolność miostatyny do specyficznego oddziaływania z jej receptorem, albo może działać wewnątrzkomórkowo, aby zmienić przekazywanie sygnału przez miostatynę w komórce. Ponadto, czynnikiem może być agonista, który naśladuje albo wzmaga wpływ miostatyny

PL 210 158 B1 na komórkę, na przykład, zdolność miostatyny do specyficznego oddziaływania z jej receptorem, zwiększając w ten sposób przekazywanie sygnału przez miostatynę w komórce; albo może być antagonista, który zmniejsza albo hamuje wpływ miostatyny na komórkę, zmniejszając w ten sposób albo hamując przekazywanie sygnału przez miostatynę w komórce.

Stosowany tu termin „specyficzne oddziaływanie” albo wiąże się specyficznie” lub temu podobne oznacza, że dwie cząsteczki tworzą kompleks, który jest stosunkowo stabilny w warunkach fizjologicznych. Termin jest tu stosowany w odniesieniu do różnych oddziaływań, w tym, na przykład, oddziaływania miostatyny z receptorem miostatyny, oddziaływanie wewnątrzkomórkowych składników szlaku przekazywania sygnału przez miostatynę, oddziaływanie przeciwciała z jego antygenem oraz oddziaływanie prodomeny miostatyny z miostatyną. Specyficzne oddziaływanie może być charakteryzowane przez stałą dysocjacji, co najmniej około 1 x 10^-6 M, na ogół, co najmniej około 1 x 10^-7 M, zwykle co najmniej około 1 x 10^-8 M, a szczególnie co najmniej około 1 x 10^-9 M lub 1 x 10^-10 M lub większą. Specyficzne oddziaływanie jest na ogół stabilne w warunkach fizjologicznych, w tym, na przykład, w warunkach, które występują w żywych osobnikach, takich jak człowiek lub inny kręgowiec lub bezkręgowiec, jak również w warunkach, które występują w hodowli komórkowej, takich jak stosowane do utrzymywania komórek ssaków albo komórek z innego organizmu: kręgowca lub bezkręgowca. Dodatkowo, specyficzne oddziaływanie, takie jak oddziaływanie zewnątrzkomórkowe prodomeny miostatyny i miostatyny na ogół jest stabilne w warunkach takich, jak te stosowane do hodowli wodnej organizmów morskich o wartości handlowej. Sposoby określania, czy dwie cząsteczki oddziałują specyficznie są dobrze znane i obejmują, na przykład, zrównoważoną dializę, powierzchniowy rezonans plazmonowy i temu podobne.

Czynnik, który zmienia specyficzne oddziaływanie miostatyny z jej receptorem może działać, na przykład, przez wiązanie się z miostatyną, tak, że nie może ona oddziaływać specyficznie ze swoim receptorem komórkowym, przez współzawodniczenie z miostatyną o wiązanie się jej z receptorem albo przez ominięcie w inny sposób wymagania, aby miostatyna oddziaływała specyficznie ze swoim receptorem w celu indukowania przekazywania sygnału przez miostatynę. Skrócony receptor miostatyny, taki jak rozpuszczalna domena zewnątrzkomórkowa receptora miostatyny jest przykładem czynnika, który wiąże się z miostatyną, sekwestrując w ten sposób miostatynę i zmniejszając albo hamując jej zdolność do specyficznego oddziaływania z receptorem miostatyny na powierzchni komórki. Prodomena miostatyny lub jej funkcjonalna część peptydowa jest innym przykładem czynnika, który może wiązać miostatynę, w ten sposób redukując lub hamując zdolność miostatyny do specyficznego oddziaływania z receptorem miostatyny na powierzchni komórki. Tacy agoniści miostatyny są przydatni do identyfikacji w szczególności do zmniejszania albo hamowania przekazywania sygnału przez miostatynę w komórce.

Folistatyna jest innym przykładem czynnika, który wiąże się z miostatyną, zmniejszając albo hamując w ten sposób zdolność miostatyny do specyficznego oddziaływania ze swoim receptorem. Folistatyna może wiązać się i hamować aktywność różnych członków rodziny TGF-β, w tym miostatyny GDF-8 (opis patentowy USA nr 6004937) i GDF-11 (Gamer i wsp., Devel. Biol. 208: 222-232, 1999). Jakkolwiek zastosowanie folistatyny do modulowania efektów miostatyny było wcześniej opisane (opis patentowy USA nr 6004937), nie było wiadomo przed niniejszym ujawnieniem, że folistatyna zmniejsza albo hamuje zdolność miostatyny do specyficznego oddziaływania z receptorem miostatyny, takim jak Act RIIB.

Specyficzne oddziaływanie miostatyny z Act RIIB wskazuje, że w przekazywaniu sygnału przez miostatynę mogą uczestniczyć składniki szlaku przekazywania sygnału Smad. A zatem szlak przekazywania sygnału Smad dostarcza celu dla modelowania wpływu miostatyny na komórkę, a czynniki, które wpływają na szlak Smad, mogą być przydatne do modulowania przekazywania sygnału przez miostatynę w komórce.

Czynniki przydatne do modelowania poziomu albo aktywności wewnątrzkomórkowych składników polipeptydowych szlaku przekazywania sygnału GDF obejmują agonistów, którzy mogą zwiększać aktywność przekazywania sygnału i antagonistów, którzy mogą zmniejszać albo hamować aktywność przekazywania sygnału. W odniesieniu do miostatyny, na przykład, czynnikami, które mogą zwiększać aktywność przekazywania sygnału są inhibitory fosfatazy, które mogą zmniejszać albo hamować de-fosforylację polipeptydów Smad, przedłużając ten sposób aktywność przekazywania sygnału Smad. Dominujące negatywne polipeptydy Smad 6 lub Smad 7, które mogą znosić efekt hamujący Smad 6 i Smad 7 na przekazywanie sygnału przez miostatynę są dodatkowymi przykładami

PL 210 158 B1 czynników, które zwiększają aktywność przekazywania sygnału przez zwiększenie przekazywania sygnału przez Smad.

Przykładami czynników antagonistycznych, które mogą zmniejszać albo hamować aktywność przekazywania sygnału miostatyny są dominujące negatywne polipeptydy Smad, takie jak dominujące negatywne Smad 2, Smad 3 lub Smad 4, w których zmutowane zostały C-końcowe miejsca fosforylacji. Inhibitorowe polipeptydy Smad, takie jak Smad 6 i Smad 7, które hamują aktywację Smad 2 i Smad 3, oraz polipeptyd c-ski, który wiąże się z polipeptydami Smad i hamuje przekazywanie sygnału są dodatkowymi przykładami antagonistów przydatnych do zmniejszania albo hamowania aktywności przekazywania sygnału miostatyny przez zmniejszenie przekazywania sygnału przez Smad.

Tam, gdzie czynnikiem, który działa wewnątrzkomórkowo jest peptyd, można doprowadzić do jego bezpośredniego kontaktu z komórką albo, polinukleotyd kodujący peptyd (lub polipeptyd) można wprowadzić do komórki i peptyd może być wyrażony w komórce. Wiadomo, że niektóre peptydy są stosunkowo duże, a zatem nie mogą łatwo przejść przez błonę komórkową. Jednakże, znane są różne sposoby wprowadzania peptydu do komórki. Wybór sposobu wprowadzania takiego peptydu do komórki będzie zależał, po części, od właściwości komórki docelowej, do której polipeptyd ma być wprowadzony. Na przykład, tam gdzie komórki docelowe, albo kilka typów komórek, w tym, komórki docelowe, wyrażają receptor, który, po związaniu konkretnego Uganda jest internalizowany do komórki, czynnik peptydowy może być funkcjonalnie związany z ligandem. Po związaniu się z receptorem, peptyd przemieszcza się do komórki przez endocytozę za pośrednictwem receptora. Czynnik peptydowy może być również zamknięty w liposomie albo wytworzony, jako kompleks lipidowy, który może ułatwić wejście peptydu do komórki i może być ponadto zmodyfikowany w celu wyrażenia receptora (lub Uganda) jak wyżej. Czynnik peptydowy można również wprowadzić do komórki przez poddanie peptydu manipulacjom, tak aby zawierał białkową domenę transdukcji, taką jak ludzka białkowa domena transdukcji TAT wirusa niedoboru odporności, która ułatwia translokację peptydu do komórki (patrz Schwarze i wsp., Science 285: 1569-1572 (1999); patrz także, Derossi i wsp., J. Biol. Chem. 271: 18188 (1996)).

Można również doprowadzić do kontaktu komórki docelowej z polinukleotydem kodującym czynnik peptydowy, który może być wyrażony w komórce. Wyrażonym czynnikiem peptydowym może być zmutowany receptor GDF albo jego peptydowa część. Przykłady zmutowanego receptora GDF obejmują postać receptora miostatyny bez aktywności kinazy, tak jak dominujący negatywny Act RIIA lub Act RIIB, który może, ale nie musi mieć zdolności do specyficznego wiązania liganda (np. miostatyny) oraz skrócony receptor miostatyny albo innego GDF, taki jak rozpuszczalna postać receptora miostatyny, który wiąże się z miostatyną separując ją w ten sposób od specyficznego oddziaływania z komórkowym receptorem miostatyny; dominująca negatywna postać polipeptydu Smad, taka jak dominujący negatywny Smad 3, w którym C-końcowe miejsca fosforylacji zostały zmutowane (Liu i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94: 10669-10674, 1997); polipeptyd Smad 7, który hamuje aktywację Smad 2 i Smad 3 (Heldin i wsp., Nature 390: 465-471, 1997); oraz polipeptyd c-ski, który wiąże się z polipeptydem Smad i hamuje przekazywanie sygnału przez Smad (Sutrave i wsp., Genes Devel. 4: 1462-1472, 1990).

Ekspresja czynnika peptydowego c-ski w komórce może być szczególnie przydatna do modulowania przekazywania sygnału przez miostatynę. Myszy z brakiem c-ski wykazują poważne zmniejszenie masy mięśni szkieletowych (Berk i wsp., Genes Devel. 11: 2029-2039,1997), podczas gdy transgeniczne myszy z nadekspresją c-ski w mięśniach wykazują dramatyczny przerost mięśni (Sutrave i wsp., jak wyżej, 1990). c-ski oddziałuje z i blokuje aktywność pewnych białek Smad, włączając w to Smad 2, Smad 3 i Smad 4, które pośredniczą w przekazywaniu sygnału przez TGF-β i receptory aktywiny typu II (Luo i wsp., Genes Devel. 13: 2196-1106, 1999; Stroschein i wsp.. Science 286: 771-774, 1999; Sun i wsp., Mol. Cell 4: 499-509,1999a; Sun i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 112442-12447, 1999b; Akiyoshi i wsp., J. Biol. Chem. 274: 35269, 1999). A zatem w świetle niniejszego ujawnienia, że w aktywności miostatyny może pośredniczyć wiązanie się z receptorem Act RIIB, będzie wiadomym, że aktywność miostatyny albo dowolnego innego GDF, który wykorzystuje szlak Smad, można modulować przez zwiększenie albo zmniejszenie ekspresji c-ski w komórce docelowej.

Jak tu ujawniono, miostatyna może wykazywać swoją aktywność, co najmniej po części, przez szlak przekazywania sygnałów Smad, a ekspresja miostatyny może być związana z rozmaitymi stanami patologicznymi. Niniejszy wynalazek dostarcza części peptydowej prodomeny miostatyny do łagodzenia ostrości stanów patologicznych u pacjenta, gdzie stan patologiczny charakteryzuje się, co najmniej po części nieprawidłową ilością, rozwojem albo aktywnością metaboliczną tkanki mięśniowej

PL 210 158 B1 lub tłuszczowej, przez modulowanie przekazywania sygnału przez miostatynę w komórce mięśniowej albo komórce tkanki tłuszczowej u osobnika.

Miostatyna działa, jako negatywny regulator wzrostu mięśni (McPherron i wsp., jak wyżej, 1997). Myszy z nokautem ważyły około 25% do 30% więcej niż w miotach typu dzikiego i to zwiększenie wagi u badanych myszy było w całości wynikiem dramatycznego wzrostu wagi tkanki mięśniowej. U myszy bez miostatyny mięśnie szkieletowe ważyły 2 do 3 razy więcej niż odpowiednie mięśnie w miotach typu dzikiego. To zwiększenie wagi mięśni w homozygotycznych myszach z nokautem jest wynikiem kombinacji rozrostu i przerostu.

Jak tu ujawniono, heterozygotyczne myszy z nokautem mają również zwiększoną masę mięśni szkieletowych, jakkolwiek w mniejszym stopniu niż obserwowana u myszy homozygotycznych, co pokazuje, że miostatyna działa in vivo w sposób zależny od dawki (patrz przykład 1). Ponadto, nadekspresja miostatyny u zwierząt ma efekt odwrotny w odniesieniu do wzrostu mięśni. Na przykład, u nagich myszy niosących nowotwory wyrażające miostatynę rozwinął się zespół wyniszczenia charakteryzujący się dramatyczną utratą wagi mięśni i tłuszczu (patrz przykład 8). Zespół ten u nagich myszy przypomina stan kachektyczny, który występuje u pacjentów z przewlekłymi chorobami, takimi jak nowotwór lub AIDS.

Poziomy w surowicy immunoreaktywnego materiału miostatyny skorelowano ze statusem pacjenta w odniesieniu do wyniszczania mięśni (Gonzalez-Kadavid i wsp., Proc. Natl. Acad. Med. USA 95: 14938-14943, 1998). A zatem pacjenci z AIDS, którzy wykazywali również oznaki kacheksji mierzonej jako utratę całkowitej wagi ciała, mieli lekko zwiększone poziomy w surowicy materiału immunoreaktywnego miostatyny w porównaniu bądź z mężczyznami bez AIDS bądź pacjentami z AIDS, którzy nie mieli utraty wagi. Jednakże interpretację tych wyników komplikował fakt, że materiał immunoreaktywny miostatyny wykrywany w próbkach nie miał ruchliwości na żelu SDS, oczekiwanej dla autentycznej podlegającej obróbce miostatyny.

Jak tu ujawniono, miostatyna wpływa nie tylko na masę mięśni, ale wpływa również na ogólny metabolizm organizmu. Na przykład, miostatyna jest wyrażana w tkance tłuszczowej, a myszy z brakiem miostatyny wykazują dramatyczne zmniejszenie akumulacji tłuszczu wraz ze starzeniem się zwierzęcia (patrz przykłady II i III). Jakkolwiek nie zaproponowano żadnego mechanizmu działania miostatyny, wpływ miostatyny może być bezpośrednim wpływem na tkankę tłuszczową albo może być efektem pośrednim powodowanym przez brak aktywności miostatyny w tkance mięśnia szkieletowego. Niezależnie od mechanizmu, ogólny efekt anaboliczny na tkankę mięśniową, którego wynikiem jest odpowiedź na zmniejszoną aktywność miostatyny, może zmieniać całkowity metabolizm organizmu i wpływać na gromadzenie energii w postaci tłuszczu, co pokazano poprzez wprowadzenie mutacji miostatyny do szczepu otyłych myszy (myszy agouti letal yellow (A^y)), co zmniejszyło pięciokrotnie akumulację tłuszczu (patrz przykład 5). Nieprawidłowy metabolizm glukozy był również częściowo znoszony w myszach agouti zawierających mutację miostatyny. Wyniki te pokazują, że sposoby hamowania miostatyny można zastosować do leczenia albo zapobiegania chorobom metabolicznym, takim jak otyłość i cukrzyca typu II.

Stosowany tu termin „stan patologiczny” dotyczy choroby, która charakteryzuje się, co najmniej po części, nieprawidłową ilością, rozwojem lub aktywnością metaboliczną tkanki mięśniowej lub tłuszczowej. Takie stany patologiczne, które obejmują, na przykład, otyłość, stany związane z otyłością, na przykład, stwardnienie tętnic, nadciśnienie i zawał mięśnia sercowego, mięśniowe choroby wyniszczające, takie jak dystrofia mięśniowa, choroby neuromięśniowe, kacheksja i anoreksja, choroby metaboliczne, takie jak cukrzyca typu II, która generalnie, ale niekoniecznie jest związana z otyłością, są szczególnie podatne na leczenie. Stosowany tu termin „nieprawidłowy”, używany w odniesieniu do ilości, rozwoju albo aktywności metabolicznej tkanki mięśniowej albo tłuszczowej, jest używany, jako określenie względne w porównaniu z ilością, rozwojem lub aktywnością metaboliczną, które biegły klinicysta lub inny odpowiedni specjalista w tej dziedzinie uważa za prawidłowe albo idealne. Takie prawidłowe albo idealne wartości są znane klinicystom i opierają się na średnich wartościach ogólnie obserwowanych albo pożądanych u zdrowych osobników w odpowiedniej populacji. Na przykład, klinicysta będzie wiedział, że otyłość jest związana z wagą ciała, która jest około dwadzieścia procent powyżej „idealnego” zakresu wagi dla osoby o danej wysokości i typie budowy. Jednakże klinicysta będzie wiedział, że budowa ciała nie musi być koniecznie otyłością po prostu, dlatego, że ciężar ciała przekracza o dwadzieścia procent wagę oczekiwaną dla osoby o tej samej wysokości i typie budowy w odpowiadającej pod innym względem populacji. Podobnie, specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że pacjent wydający się mieć nieprawidłowo zmniejszoną aktywność mięśniową będzie mógł

PL 210 158 B1 być zidentyfikowany, jako mający nieprawidłowy rozwój mięśni, na przykład, przez poddanie pacjenta różnym testom siłowym i porównanie wyników z oczekiwanymi dla średnio zdrowego osobnika w odpowiedniej populacji.

Czynnik, który ma być podawany osobnikowi, jest podawany w warunkach, które ułatwiają kontakt czynnika z komórką docelową i jeśli trzeba, wchodzenie do komórki. Wchodzenie czynnika polinukleotydowego do komórki, na przykład, może być ułatwione przez włączenie polinukleotydu do wektora wirusowego, który może infekować komórki. Jeżeli wektor wirusowy swoisty wobec typu komórki jest niedostępny, wektor można modyfikować, tak aby wyrażał receptor (albo ligand) specyficzny wobec ligandu (lub receptora) wyrażany na docelowej komórce albo może być zamknięty w liposomie, który również może być tak zmodyfikowany, aby zawierał taki ligand (lub receptor). Czynnik peptydowy można wprowadzić do komórki różnymi sposobami, obejmującymi, na przykład, manipulację peptydem, tak aby zawierał białkową domenę transdukcji, taką jak białkowa domena transdukcji TAT wirusa niedoboru odporności, która ułatwia translokację peptydu do komórki (patrz Schwarze i wsp., jak wyżej, Derossi i wsp., jak wyżej).

Obecność czynnika w komórce docelowej można zidentyfikować bezpośrednio, na przykład, przez funkcjonalne przyłączenie do czynnika wykrywalnego znacznika, przez użycie przeciwciała specyficznego wobec czynnika, a w szczególności czynnika peptydowego albo przez wykrywanie efektu wywoływanego przez czynnik, na przykład, zmniejszonej fosforylacji polipeptydu Smad w komórce. Czynnik może być wyznakowany, tak, że jest wykrywalny przy użyciu metod dobrze znanych w tej dziedzinie (Hermanson, „Bioconjugate Techniques” (Academic Press 1996); patrz również, Harlow i Lane, jak wyżej, 1988). Na przykład, peptyd albo czynnik peptydowy mogą być znakowane różnymi wykrywalnymi cząstkami, włączając w to znacznik radioaktywny, enzym, taki jak alkaliczna fosfataza, biotyna, fluorochrom i temu podobne. Tam, gdzie czynnik zawarty jest w zestawie, odczynniki do znakowania czynnika mogą być również zawarte w zestawie albo czynniki można kupić oddzielnie ze źródła komercyjnego.

Przydatny czynnik można podawać do miejsca stanu patologicznego, albo można podawać dowolnym sposobem, który dostarcza polinukleotyd lub peptyd do komórek docelowych. Stosowany tu termin „komórki docelowe oznacza komórki mięśniowe lub komórki tłuszczowe, które są kontaktowane z czynnikiem. Do podawania żywemu osobnikowi, czynnik na ogół przygotowuje się w postaci kompozycji farmaceutycznej odpowiedniej do podawania osobnikowi. Można stosować kompozycje farmaceutyczne zawierające czynnik, który jest przydatny do modulowania przekazywania sygnału przez miostatynę w komórce w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku. A zatem czynniki są przydatne, jako leki do leczenia osobnika cierpiącego z powodu stanu patologicznego jak tu zdefiniowano.

Dopuszczalne farmaceutycznie nośniki są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują, na przykład, roztwory wodne, takie jak woda lub buforowana sól fizjologiczna albo inne rozcieńczalniki lub nośniki, takie jak glikole, glicerol, oleje, takie jak olej z oliwek albo estry organiczne do iniekcji. Dopuszczalne farmaceutycznie nośniki mogą zawierać fizjologicznie dopuszczalne związki, które działają, na przykład, stabilizująco albo zwiększają absorpcję koniugatu. Takie dopuszczalne fizjologicznie związki obejmują, na przykład, węglowodany, takie jak glukoza, sacharoza lub dekstrany, przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy lub glutation, czynniki chelatujące, białka niskocząsteczkowe i inne stabilizatory lub zaróbki. Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że wybór dopuszczalnego farmaceutycznie nośnika, w tym dopuszczalnych fizjologicznie związków, zależy, na przykład, od fizykochemicznych właściwości związku leczniczego i od drogi podawania kompozycji, która może być, na przykład, doustna lub pozajelitowa, taka jak dożylna, przez iniekcję, intubację lub inne metody znane w tej dziedzinie. Kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać drugi odczynnik, taki jak odczynnik diagnostyczny, substancję odżywczą, toksynę albo czynnik terapeutyczny, na przykład nowotworowy czynnik chemioterapeutyczny.

Czynnik może być zawarty w materiale kapsułkującym, takim jak emulsja oleju w wodzie, mikroemulsja, micela, micela mieszana, liposom, mikrokulka lub inne podłoża polimerowe (patrz na przykład, Gregoriadis, Liposom Technology, Tom 1 (CRC Press, Boca Raton, FL 1984); Fraley, i wsp., Trends Biochem. Sci., 6: 77 (1981)). Liposomy, na przykład, które składają się z fosfolipidów lub innych lipidów, są nietoksycznymi, dopuszczalnymi fizjologicznie i metabolizowanymi nośnikami, które są stosunkowo proste do wytworzenia i podawania. Liposomy „stealth” (patrz, na przykład opisy patentowe, USA, 5882679, 5395619 i 5225212) są przykładem takich kapsułkujących materiałów szczególnie przydatnych do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych. Można też użyć innych „maskowanych liposomów, takich jak liposomy wydłużające czas pozostawania czynnika terapeutycznego

PL 210 158 B1 w obiegu. Liposomy kationowe, na przykład, mogą być modyfikowane specyficznymi receptorami lub ligandami (Morishita i wsp., J. Clin. Invest., 91: 2580-2585 (1993)). Dodatkowo, czynnik polinukleotydowy można wprowadzić do komórki, przy użyciu, na przykład, kompleksów DNA adenowirus-polilizyna (patrz, na przykład, Michael i wsp., J. Biol. Chem. 268: 6866-6869 (1993)).

Droga podawania kompozycji farmaceutycznej zawierającej czynnik, który zmienia przekazywanie sygnału przez miostatynę, będzie zależała po części od struktury chemicznej cząsteczki. Polipeptydy i polinukleotydy, na przykład, nie są szczególnie przydatne, gdy są podawane doustnie, ponieważ mogą być rozkładane w przewodzie trawiennym. Jednakże dobrze znane są sposoby modyfikacji chemicznej polipeptydów, na przykład, w celu zmniejszenia ich podatności na rozkład przez endogenne proteazy albo zwiększenia ich wchłanialności przez układ pokarmowy (patrz na przykład Blondelle i wsp., jak wyżej, 1995; Ecker i Crook, jak wyżej, 1995). Dodatkowo, czynnik peptydowy można wytworzyć przy użyciu D-aminokwasów, albo może on zawierać jedną lub więcej domen w oparciu o peptydomimetyki, które są cząsteczkami organicznymi, naśladującymi strukturę domeny peptydowej; albo w oparciu o peptoid, taki jak peptoid z grupami winylowymi.

Kompozycje farmaceutyczne można podawać osobnikowi różnymi drogami obejmującymi, na przykład, podawanie doustne i pozajelitowe, takie jak dożylne, domięśniowe, podskórne, dooczodołowe, dotorebkowe, dootrzewnowe, doodbytnicze, dojamowe, albo przez bierną albo wspomaganą absorpcję przez skórę przy użyciu, na przykład, odpowiednio, plastrów skórnych albo jontoforezy przezskórnej. Ponadto, kompozycje farmaceutyczne można podawać przez wstrzykiwanie, intubację, doustnie lub stosować zewnętrznie, na przykład, biernie przez bezpośrednie stosowanie maści albo czynnie, na przykład, przy użyciu rozpylacza do nosa albo inhalatora, w którym to przypadku, składnikiem kompozycji jest odpowiedni propelent. Kompozycję farmaceutyczną można również podawać do miejsca stanu patologicznego, na przykład dożylnie lub dotętniczo do naczynia krwionośnego zasilającego nowotwór.

Całkowita ilość czynnika, może być podawana osobnikowi, jako pojedyncza dawka, jednokrotnie bąd ź przez wlew w stosunkowo krótkim czasie, albo mo ż e być podawana przy u ż yciu protoko łu leczenia podzielonego, w którym wiele dawek podaje się przez dłuższy czas. Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że ilość kompozycji farmaceutycznej do leczenia stanu patologicznego u osobnika zależy od wielu czynników, w tym, od wieku i ogólnego zdrowia osobnika, jak również drogi podawania i liczby dawek, które mają być podane. Biorąc pod uwagę te czynniki, specjalista będzie mógł dopasować potrzebną konkretną dawkę. Generalnie, skład kompozycji farmaceutycznej i drogę oraz częstość podawania ustala się wyjściowo w Fazie I i Fazie II testów klinicznych.

Kompozycję farmaceutyczną można wytworzyć, jako kompozycję doustną, taką jak tabletka, albo w postaci płynu lub zawiesiny albo kompozycja może zawierać domieszkę nośnika organicznego lub nieorganicznego albo zaróbkę odpowiednią do zastosowań jelitowych albo pozajelitowych. Kompozycja może składać się, na przykład, ze zwykłych nietoksycznych, farmaceutycznie akceptowalnych nośników dla tabletek, granulek, kapsułek, czopków, emulsji, zawiesin lub innych postaci odpowiednich do użycia. Nośniki, poza tymi opisanymi powyżej, mogą obejmować glukozę, laktozę, mannozę, gumę akacjową, żelatynę, mannitol, pastę skrobiową, trikrzemian magnezu, talk, skrobię kukurydzianą, keratynę, krzemionkę koloidalną, skrobię ziemniaczaną, mocznik, triglicerydy o łańcuchach średniej długości, dekstrany i inne nośniki przydatne do zastosowania przy wytwarzaniu preparatów w postaci stałej, półpłynnej lub płynnej. Ponadto, można zastosować czynniki dodatkowe, stabilizujące, zagęszczające lub barwiące i środki zapachowe, na przykład suchy czynnik stabilizujący, taki jak triuloza (patrz na przykład, opis patentowy USA nr 5314695).

Receptory GDF, takie jak Act RIIA i Act RIIB, uczestniczą w przekazywaniu efektów GDF, takiego jak miostatyna, który uczestniczy w tworzeniu się tkanki mięśniowej i tkanki tłuszczowej. A zatem, można modulować wzrost tkanki mięśniowej lub tkanki tłuszczowej przez wpływ na przekazywanie sygnału od receptora GDF, takiego jak receptor aktywiny, np. Act RIIA lub Act RIIB. Takie modulowanie można przeprowadzić przez doprowadzenie do kontaktu komórek tkanki albo wyrażanie w komórkach zmutowanego receptora GDF, który ma aktywność dominującą negatywną, aktywność konstytutywną lub temu podobne.

Modulowanie wzrostu tkanki mięśniowej albo tkanki tłuszczowej w organizmie można też uzyskać przez podawanie osobnikowi czynnika, który wpływa na przekazywanie sygnału przez miostatynę. Korzystnie, jest to czynnik, który koduje peptyd prodomeny miostatyny. Używany tu termin „wzrost” jest stosowany w znaczeniu względnym w odniesieniu do masy tkanki mięśniowej albo tkanki tłuszczowej w organizmie. Gdy sygnał przekazywany przez miostatynę został zmniejszony lub zahamowany, następuje

PL 210 158 B1 wzrost masy tkanki mięśniowej w organizmie w porównaniu z odpowiednim organizmem (albo populacją organizmów), w których na przekazywanie sygnału przez miostatynę taki wpływ nie został wywarty.

Powyższa modulacja może być przydatna do zwiększania masy mięśniowej albo zmniejszania zawartości tłuszczu w organizmie albo jednego i drugiego. Na przykład, tam gdzie modulację przeprowadza się wobec organizmu, który jest przydatny, jako źródło pożywienia, zawartość białka w pożywieniu może być zwiększona, a poziom cholesterolu zmniejszony i jakość pożywienia może być polepszona. Modulowanie masy mięśniowej można zastosować do obniżania wzrostu tkanki mięśniowej w organizmie, na przykład w organizmie, który jest szkodliwy dla środowiska, wtedy organizm jest mniej zdolny do współzawodnictwa w środowisku. Modulowanie można zastosować wobec dowolnego organizmu eukariotycznego, który wyraża miostatynę, w tym wobec organizmu kręgowca, na przykład, organizmu ssaka, ptaka lub ryby, ale może to być też organizm bezkręgowca, na przykład, mięczaka, szkarłupnia, ślimaka lub głowonoga.

Peptyd według wynalazku, który zmienia przekazywanie sygnału przez miostatynę, jak tu ujawniono można podawać organizmowi w dowolny dogodny sposób. Na przykład, tam gdzie organizmem, który ma być traktowany, jest ryba, krewetka, przegrzebki lub temu podobne, które rosną w hodowli wodnej, peptyd można dodać do wody, w której organizm jest trzymany albo może być zawarty w ich pokarmie, a w szczególności, tam gdzie czynnikiem jest rozpuszczalny peptyd albo mała cząsteczka organiczna.

Gdy czynnikiem modulującym jest polinukleotyd, który koduje peptyd, komórki płciowe organizmu oprócz człowieka zawierające polinukleotyd można wyselekcjonować i można wytworzyć transgeniczne organizmy wyrażające czynnik. Korzystnie polinukleotyd jest pod kontrolą indukowalnego elementu regulacyjnego, tak, że peptyd kodowany przez polinukleotyd może być wyrażany w pożądanym czasie. Regulacja członków rodziny TGF-β, w tym promiostatynyi ich swoistych oddziaływań z komórkowymi receptorami powierzchniowymi zaczyna być wyjaśniana. A zatem koekspresja prodomeny przedstawiciela rodziny TGF-β z dojrzałym regionem innego przedstawiciela rodziny TGF-β jest związana z wewnątrzkomórkową dimeryzacją i następuje wydzielanie biologicznie aktywnych homodimerów (Gray i wsp., Science 247: 1328, 1990). Na przykład, użycie prodomeny BMP-2 z dojrzałym regionem BMP-4 prowadzi do dramatycznie zwiększonej ekspresji dojrzałego BMP-4 (Hammonds i wsp., (Mol. Endocrinol. 5: 149,1991). Dla większości badanych przedstawicieli rodziny, homodimery są aktywne biologicznie, podczas gdy dla innych członków rodziny, takich jak inhibiny (Ling i wsp.. Nature 321: 779, 1986) i TGF-β (Cheifetz i wsp., Cell 48: 409, 1987), wykryto również heterodimery, które i wydaje się jednak, że mają odmienne właściwości biologiczne niż odpowiednie homodimery.

Badania nad oddziaływaniami receptor-ligand przyniosły dużą ilość informacji pokazującej, w jaki sposób komórka odpowiada na bodźce zewnętrzne i doprowadziły do rozwoju ważnych terapeutycznie związków, takich jak erytropoetyna, czynniki stymulujące kolonie i PDGF. A zatem, podejmuje się stale wysiłki dla zidentyfikowania receptorów, które pośredniczą w działaniu przedstawicieli rodziny TGF-β. Jak tu ujawniono, miostatyna oddziałuje specyficznie z receptorem aktywiny typu II. Identyfikacja tego oddziaływania dostarcza celu dla zidentyfikowania antagonistów i agonistów przydatnych do celów rolniczych i leczenia ludzi, na przykład, do leczenia różnych stanów patologicznych, takich jak otyłość, cukrzyca typu II i kacheksja. Identyfikacja tych swoistych oddziaływań dostarcza również sposobu identyfikowania innych receptorów miostatyny, jak również specyficznych receptorów innych czynników różnicowania wzrostu.

Z częścią peptydową polipeptydu promiostatyny, a w szczególności prodomeny miostatyny albo jej funkcjonalną częścią mogą wiązać się przeciwciała, które w ten sposób zmniejszają albo hamują cięcie proteolityczne promiostatyny do miostatyny.

Stosowany tu termin „przeciwciało” jest używany w najszerszym znaczeniu obejmując przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, jak również ich fragmenty wiążące antygen. Termin „wiąże się swoiście” albo „swoista aktywność wiązania”, kiedy jest stosowany w odniesieniu do przeciwciała, oznacza, że oddziaływanie przeciwciała i konkretnego epitopu ma stałą dysocjacji co najmniej około 1 x 10^-6, na ogół co najmniej około 1 x 10^-7, zwykłe co najmniej około 1 x 10^-8, a w szczegółności co najmniej około 1 x 10^-9 lub 1 x 10^-10 albo mniej. A zatem fragmenty Fab, F(ab')2, Fd i Fv przeciwciała, które zachowują swoistą aktywność wiązania dla epitopu ,są objęte definicją przeciwciała. Stosowany tu termin „przeciwciało” obejmuje przeciwciała występujące naturalnie, jak również przeciwciała niewystępujące naturalnie, w tym, na przykład, przeciwciała jednołańcuchowe, przeciwciała chimerowe, bifunkcjonalne i humanizowane, jak również ich fragmenty wiążące antygen. Takie nienaturalnie występujące przeciwciała można skonstruować przy zastosowaniu syntezy peptydów w fazie stałej, można wy24

PL 210 158 B1 tworzyć przez rekombinowanie DNA albo można otrzymać na przykład poprzez przeszukiwanie bibliotek kombinatorycznych składających się za zmiennych łańcuchów ciężkich i zmiennych łańcuchów lekkich (patrz Huse i wsp., Science 246: 1275-1281 (1989)). Te i inne sposoby wytwarzania, na przykład, przeciwciał chimerowych, humanizowanych, z wszczepionymi CDR, jedno-łańcuchowych i bifunkcjonalnych są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie (Winter i Harris, Immunol. Today 14: 243-246, 1993; Ward i wsp., Nature 341: 544-546, 1989; Harlow i Lane, Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hilyard i wsp., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrabeck, Antibody Engineering, wyd. 2. (Oxford University Press 1995).

Przeciwciało, które wiąże się swoiście z prodomeną miostatyny można uzyskać przy użyciu prodomeny albo jej funkcjonalnej części, jako immunogenu. Gdy taki peptyd jest nieimmunogenny, można go uczynić immunogennym przez połączenie haptenu z cząsteczką nośnikową, taką jak bydlęca albumina surowicza (BSA) lub hemocjanina ze skałoczepa (KLH) albo przez wyrażenie części peptydowej jako fuzji białkowej. Różne inne cząsteczki nośnikowe i sposoby łączenia haptenu z cząsteczką nośnikową są dobrze znane w tej dziedzinie (patrz na przykład, Harlow i Lane, jak wyżej, 1988).

Jeśli to konieczne, można wytworzyć zestaw zawierający przeciwciało. Taki zestaw może zawierać, poza czynnikiem, kompozycję farmaceutyczną, w której czynnik może być przygotowany do podania osobnikowi. Zestaw może również zawierać, na przykład, odczynniki do wykrywania przeciwciała albo do wykrywania specyficznego wiązania się przeciwciała z prodomeną miostatyny lub jej funkcjonalną częścią. Takie wykrywalne odczynniki przydatne do znakowania lub w inny sposób identyfikujące przeciwciało są tu opisane i znane w tej dziedzinie.

Sposoby uzyskiwania przeciwciał poliklonalnych, na przykład, w króliku, kozie, myszy lub innym ssaku są dobrze znane w tej dziedzinie (patrz na przykład Green i wsp., „Production of Polyclonal Antisera”, w Immunochemical Protocols (Manson, wyd., Humana Press 1992), strony 1-5; Coligan i wsp., „Production of Polyclonal Antisera InRabbits, Rats, Mice and Hamsters”, w Curr. Protocols Immunol. (1992), część 2.4.1). Dodatkowo, przeciwciała monoklonalne można otrzymać przy zastosowaniu sposobów, które są dobrze znane i rutynowe w tej dziedzinie (Harlow i Lane, jak wyżej, 1988). Przykładowo, komórki śledziony od myszy immunizowanej prodomeną miostatyny albo jej epitopowym fragmentem, można łączyć z odpowiednią linią komórkową szpiczaka, taką jak komórki szpiczaka SP/02, w celu wytworzenia komórek hybrydoma. Sklonowane linie komórek hybrydoma można przeszukiwać przy użyciu wyznakowanego antygenu w celu zidentyfikowania klonów, które wydzielają mo-noklonalne przeciwciała mające pożądaną swoistość i hybrydoma wyrażające przeciwciała mające żądaną swoistość i powinowactwo można izolować i stosować, jako stałe źródło przeciwciał. Sposoby wytwarzania przeciwciał monoklonalnych są dobrze znane (patrz na przykład Kohler i Milstein, Nature 256: 495, 1975; patrz również Coligan i wsp., jak wyżej, 1992, patrz części 2.5.1-2.6.7; Harlow i Lane, jak wyżej, 1988). Pokrótce, przeciwciała monoklonalne można otrzymać przez wstrzyknięcie myszy kompozycji zawierającej antygen, sprawdzenie faktu wytwarzania przeciwciała przez pobranie próbki surowicy, pobranie śledziony w celu otrzymania limfocytów B, połączenie limfocytów B z komórkami szpiczaka w celu wytworzenia hybrydoma, klonowanie hybrydoma, selekcję klonów dodatnich, które wytwarzają przeciwciała wobec antygenu i izolowanie przeciwciał z hodowli hybrydoma.

Przeciwciała monoklonalne można izolować i oczyszczać z hodowli hybrydoma rozmaitymi dobrze znanymi technikami, w tym, na przykład, chromatografię powinowactwa z użyciem Protein-A SEPHAROSE, chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek i chromatografię jonowymienną (Coligan i wsp., jak wyżej, 1992, patrz części 2.7.1-2.7.12 i części 2.9.1-2.9.3; patrz również Barnes i wsp., „Purification of Immunoglobulin G (IgG)”, w Meth.: Molec. Biol. 10: 79-104 (Humana Press 1992)). Sposoby namnażania in vitro i in vivo przeciwciał monoklonalnych są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Namnażanie in vitro można prowadzić w odpowiedniej pożywce hodowlanej, takiej jak Dulbecco's Modified Eagle Medium lub pożywka RPMI 1640, ewentualne uzupełnionej surowicą ssaczą, taką jak płodowa surowica cielęca albo elementami śladowymi i dodatkami podtrzymującymi wzrost, takimi jak komórki wysięku otrzewnowego ze zdrowych myszy, komórki śledziony, makrofagi szpiku kostnego. Namnażanie in vitro dostarcza stosunkowo czystych preparatów przeciwciał i umożliwia skalowanie w górę w celu uzyskiwania dużych ilości pożądanych przeciwciał. Hodowanie hybrydoma na dużą skalę można prowadzić przez homogenną hodowlę zawiesinową w reaktorze z napowietrzeniem, w reaktorze ze stałym mieszaniem albo w hodowli komórek unieruchomionych albo pułapkowanych. Namnażanie in vivo można przeprowadzić przez wstrzykniecie klonów komórek ssakowi o odpowiedniej zgodności tkankowej z komórkami rodzicielskimi, na przykład syngenicznej myszy w celu spowodowania wzrostu nowotworów wytwarzających przeciwciało. Ewentualnie, zwierzęta

PL 210 158 B1 piętnuje się iniekcją węglowodorem, a w szczególności olejem, takim ja pristane (tetrametylopentadekan). Po jednym do trzech tygodni, pożądane przeciwciało odzyskuje się z płynu ciała zwierzęcia.

Ogólne techniki wytwarzania przydatnych terapeutycznie przeciwciał w pawianach można znaleźć, na przykład, w Goldenberg i wsp., International Patent Publication WO 91/11465 (1991); oraz Losman i wsp., Int. J. Cancer 46: 310, 1990.

Terapeutycznie przydatne przeciwciało przeciw części peptydowej prodomeny miostatyny może również pochodzić z „humanizowanego” przeciwciała monoklonalnego. Humanizowane przeciwciała monoklonalne są wytwarzane przez przeniesienie mysich regionów determinujących dopasowanie z ciężkich i lekkich łańcuchów zmiennych mysiej immunoglobuliny do ludzkiej domeny zmiennej, a następnie zastąpienie reszt ludzkich w regionach zrębowych mysimi odpowiednikami. Zastosowanie składników przeciwciała pochodzących z humanizowanych monoklonalnych przeciwciał omija potencjalne problemy związane z immunogennością mysich regionów stałych. Ogólne techniki klonowania domen zmiennych mysiej immunoglobuliny są znane (patrz na przykład Orlandi i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 3833, 1989). Techniki wytwarzania humanizowanych przeciwciał są również znane (patrz na przykład, Jones i wsp., Nature 321: 522, 1986; Riechmann i wsp., Nature 332: 323, 1988; Verhoeyen i wsp., Science 239: 1534, 1988; Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotechnol. 12: 437, 1992 oraz Singer i wsp., J. Immunol. 150: 2844, 1993).

Przeciwciała mogą pochodzić z fragmentów ludzkich przeciwciał wyizolowanych z kombinatorycznej biblioteki immunoglobulinowej (patrz na przykład, Barbas i wsp., METHODS: A Companion to Methods in Immunology 2: 119, 1991; Winter i wsp., Ann. Rev. Immunol. 12: 433, 1994). Wektory do klonowania i ekspresyjne, które są przydatne do wytwarzania ludzkiej biblioteki immunoglobulinowej można otrzymać, na przykład, ze STRATAGENE Cloning Systems (La Jolla, CA).

Przeciwciało może również pochodzić z ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Takie przeciwciała można otrzymać z myszy transgenicznych, które poddano „zabiegom inżynierii genetycznej” w celu wytworzenia swoistych ludzkich przeciwciał w odpowiedzi na prowokację antygenem. W tej technice, elementy loci łańcuchów ciężkich i lekkich wprowadza się do szczepów myszy pochodzących z embrionalnych linii komórek macierzystych, które mają w sposób ukierunkowany unieczynnione loci endogennych łańcuchów ciężkich i lekkich. Transgeniczne myszy mogą syntetyzować ludzkie przeciwciała swoiste wobec ludzkich antygenów i myszy można używać do wytwarzania hybrydoma wydzielających ludzkie przeciwciała. Sposoby otrzymywania ludzkich przeciwciał z transgenicznych myszy są opisane na przykład przez Green i wsp., Nature Genet. 7: 13, 1994/ Lonberg i wsp., Nature 368: 856, 1994 oraz Taylor i wsp., Int. Immunol. 6: 579,1994.

Fragmenty przeciwciał można otrzymać przez hydrolizę proteolityczną przeciwciała albo przez ekspresję w E. coli DNA kodującego fragment. Fragmenty przeciwciał można otrzymać konwencjonalnymi metodami przez trawienie pepsyną albo papainą całych przeciwciał. Przykładowo, fragmenty przeciwciał można wytworzyć przez cięcie enzymatyczne przeciwciał pepsyną w celu dostarczenia fragmentu 5S nazwanego F(ab')2- Fragment ten można dalej przecinać przy użyciu tiolowego odczynnika redukującego i ewentualnie grupę blokującą dla grup sulfohydrylowych pochodzących z cięcia mostków disiarczkowych, z wytworzeniem jednowartościowych fragmentów Fab' 3,5S. Alternatywnie, enzymatyczne cięcie przy użyciu pepsyny daje bezpośrednio dwa jednowartościowe fragmenty Fab' i fragment Fc (patrz na przykład, Goldenberg, opis patentowy USA nr 4036945 i nr 4331647, Nisonhoff i wsp., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230.1960; Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959; Edelman i wsp., Meth. Enzymol., 1: 422 (Academic Press 1967), patrz również, Goligan i wsp., jak wyżej, 1992, patrz części 2.8.1-2.8.10 i 2.10.1-2.10.4).

Można również zastosować inne sposoby cięcia przeciwciał, takie jak rozdzielanie łańcuchów ciężkich na jednowartościowe fragmenty łańcucha lekkiego/ciężkiego, dalsze cięcie fragmentów albo inne techniki enzymatyczne, chemiczne lub genetyczne, przy założeniu, że fragmenty wiążą się z antygenem, który jest rozpoznawany przez nienaruszone przeciwciało. Przykładowo, fragmenty Fv zawierają połączenie łańcuchów V_H i V_L. To połączenie może być niekowalencyjne (Inbar i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69: 2659, 1972). Alternatywnie, łańcuchy zmienne mogą być połączone wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem disiarczkowym albo połączone krzyżowo przez związki chemiczne, takie jak glutaraldehyd (Sandhu, jak wyżej, 1992). Korzystne jest, jeżeli fragmenty Fv zawierają łańcuchy VH i VL połączone łącznikiem peptydowym. Te jednołańcuchowe białka wiążące antygen (sFv) wytwarza się przez konstruowanie genu strukturalnego zawierającego sekwencje DNA kodujące domeny VH i VL połączone oligonukleotydem. Gen strukturalny jest wstawiany do wektora ekspresyjnego, który wprowadza się następnie do komórki gospodarza, takiej jak E. coli. Zrekombinowane komórki

PL 210 158 B1 gospodarza syntetyzują pojedynczy łańcuch peptydowy z łącznikiem peptydowym spajającym dwie domeny V. Sposoby wytwarzania sFv są opisane, na przykład, przez Whitlow i wsp., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97, 1991; Bird i wsp., Science 242: 423-426, 1988; Ladner i wsp., opis patentowy USA nr 4946778; Pack i wsp., Bio/Technology 11: 1271-1277, 1993; patrz również Sandhu, jak wyżej, 1992.

Inną postacią fragmentu przeciwciała jest peptyd kodujący pojedynczy region determinujący dopasowanie (ang. complementarity-determining region, CDR). Peptydy CDR („minimalne jednostki rozpoznania”) można otrzymać przez konstruowanie genów kodujących CDR przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. Takie geny wytwarza się, na przykład, przez użycie reakcji łańcuchowej polimerazy w celu zsyntetyzowania regionu zmiennego z RNA komórek wytwarzających przeciwciało (patrz na przykład, Larrick i wsp., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991.

Następujące przykłady mają ilustrować, ale nie ograniczać wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Miostatyna działa w sposób zależny od dawki

Przykład ten pokazuje, że aktywność miostatyny w hamowaniu wzrostu mięśni jest zależna od poziomu ekspresji miostatyny in vivo.

Miostatyna jest negatywnym regulatorem masy mięśni szkieletowych (McPherron i wsp., jak wyżej, 1997; McPherron i Lee, jak wyżej, 1997). Myszy z nokautem miostatyny, które były homozygotyczne pod względem delecji genu miostatyny, wykazywały 25-30% wzrost całkowitej masy ciała. Badanie homozygotycznych myszy z nokautem pokazało, że zwiększona masa mięśni była skutkiem 100-200% wzrostu masy mięśni szkieletowych w całym ciele.

Myszy, które były heterozygotyczne pod względem mutacji miostatyny, miały również zwiększoną całkowitą masę ciała. Jednakże wzrost masy heterozygot był mniejszy niż homozygot i był statystycznie znaczący pośród wielu badanych tylko w grupie o jednakowym wieku i płci. W celu ustalenia, czy myszy heterozygotyczne mają pośredni fenotyp pomiędzy myszami typu dzikiego i myszami homozygotycznymi pod względem nokautu miostatyny, analizę wagi mięśni rozciągnięto na myszy heterozygotyczne. Poszczególne próbki mięśni z myszy heterozygotycznych ważyły około 25-50% więcej niż te z myszy typu dzikiego. Wyniki te pokazują, że myszy heterozygotyczne pod względem delecji genu miostatyny mają fenotyp, który jest pośredni między myszami typu dzikiego i homozygotycznymi myszami z nokautem miostatyny i pokazują, że miostatyna ma efekt zależny od dawki in vivo.

Wyniki te wskazują, że manipulacja aktywnością miostatyny może być przydatna do leczenia wyniszczających chorób mięśni i innych chorób metabolicznych związanych z aktywnością miostatyny. Ponadto, efekt zależny od dawki miostatyny wskazuje, że efekt terapeutyczny można otrzymać bez uzyskiwania całkowitego hamowania aktywności miostatyny, umożliwiając w ten sposób ustalenie aktywności miostatyny na pewnym poziomie, jeżeli na przykład pewien poziom aktywności daje niepożądane efekty u pacjenta.

P r z y k ł a d 2

Efekt miostatyny u myszy z nokautem zmniejsza się z wiekiem

Przykład ten pokazuje, że zmniejszona różnica w wadze ciała pomiędzy myszami typu dzikiego i homozygotycznymi myszami z nokautem miostatyny jest związany ze zmniejszeniem masy mięśniowej zmutowanych myszy.

Myszy z nokautem miostatyny ważyły około 25-30% więcej niż myszy typu dzikiego w wieku pięciu miesięcy (McPherron i wsp., jak wyżej, 1997). Jednakże ta różnica w całkowitej wadze ciała stawała się znacząco mniejsza lub zanikała wraz ze starzeniem się zwierzęcia. W celu ustalenia, czy ten efekt był na skutek względnej utraty wagi myszy z nokautem, na przykład degeneracji mięśni, czy relatywnie większego przyrostu u myszy typu dzikiego, dokonano szczegółowej analizy wagi mięśni, jako funkcji wieku.

W każdym badanym wieku od 2 miesięcy do 17 miesięcy, mięśnie piersiowe ważyły znacząco więcej u mutantów myszy homozygotycznych niż w miotach typu dzikiego. Najbardziej dramatyczną różnicę obserwowano w wieku 5 miesięcy, w którym to czasie waga mięśnia piersiowego była około 200% większa niż u myszy zmutowanej. Jakkolwiek waga mięśnia piersiowego zmniejszała się nieco w starszym wieku, masa tego mięśnia u zmutowanej myszy pozostawała ponad dwa razy większa niż u myszy typu dzikiego. Ten sam podstawowy trend obserwowano we wszystkich badanych mięśniach, włączając w to mięsień trój-głowy ramienia, mięsień czworogłowy, mięsień brzuchaty łydki i podeszwowy oraz mięsień piszczelowy przedni. Podobne tendencje obserwowano zarówno u samców, jak i samic myszy. Wyniki te pokazują, że mniejsza różnica w całkowitej wadze ciała pomiędzy myszami

PL 210 158 B1 zmutowanymi i typu dzikiego obserwowana wraz ze starzeniem wynika z niewielkiego zmniejszenia wagi mięśni u zmutowanych myszy.

P r z y k ł a d 3

Miostatyna wpływa na akumulację tłuszczu w sposób zależny od dawki

Przykład ten pokazuje, że myszy z nokautem miostatyny wykazują brak akumulacji tłuszczu i zmniejszenie akumulacji tłuszczu jest związane z poziomem ekspresji miostatyny in vivo.

Ponieważ zmniejszenie wagi mięśni u mutantów miostatyny, jak pokazano w przykładzie 2, nie odpowiada w pełni za obserwację, że zwierzęta typu dzikiego w rezultacie ważyły mniej więcej tak samo jak myszy zmutowane, badano ilość gromadzonego tłuszczu u zwierząt typu dzikiego i myszy zmutowanych. Nie było różnicy wagi w wadze poduszeczek łapy między myszami typu dzikiego i myszami zmutowanymi w wieku dwóch miesięcy. Przed osiągnięciem wielu 5 lub 6 miesięcy myszy typu dzikiego i homozygotyczne myszy z nokautem miostatyny wykazywały dużą rozpiętość wagi poduszeczek łap i średnio, waga poduszeczek łap zwiększała się około 3 do 5-krotnie zanim zwierzę osiągnęło wiek 9 do 10 miesięcy. Na skutek dużej rozpiętości wagi poduszeczek łap obserwowanej u tych zwierząt, niektóre zwierzęta wykazywały znacznie większy wzrost (do 10 razy) niż inne.

W przeciwieństwie do myszy typu dzikiego i heterozygotycznych myszy z nokautem, waga poduszeczek homozygotycznych myszy z nokautem miostatyny mieściła się w stosunkowo mniejszym zakresie i była w zasadzie identyczna u myszy w wieku 2 miesięcy i u myszy w wieku 9 do 10 miesięcy. A zatem zwiększenie akumulacji tłuszczu, które następowało z wiekiem u myszy typu dzikiego nie było obserwowane u myszy homozygotycznych z nokautem miostatyny. Ta różnica w akumulacji tłuszczu, łącznie z niewielkim zmniejszeniem się wagi mięśni, jako funkcja wieku u homozygotycznych zmutowanych myszy w pełni dopowiadała obserwacji, że zwierzęta typu dzikiego w rezultacie miały taką samą wagę ciała jak mutanty.

Średnia waga poduszeczek tłuszczowych u heterozygotycznych myszy z nokautem w wieku 9 do 10 miesięcy była pośrednia między myszami typu dzikiego a zmutowanymi myszami homozygotycznymi. Jakkolwiek ta różnica nie była statystycznie znacząca, na skutek szerokiego zakresu wagi poduszeczek tłuszczowych u tych myszy i myszy typu dzikiego, wyniki te pomimo wszystko wskazują, że miostatyna ma wpływ zależny od dawki na akumulację tłuszczu, podobnie jak wpływ na wzrost mięśni.

P r z y k ł a d 4

Wpływ miostatyny na metabolizm

Przykład ten pokazuje, że poziom ekspresji miostatyny ma wpływ na poziomy insuliny i glukozy w surowicy, jak również na aktywność metaboliczną.

W celu ustalenia, czy przerost mięśnia szkieletowego i brak akumulacji tłuszczu u myszy ze zmutowaną miostatyną jest skutkiem wpływu na ogólny metabolizm, badano profil metaboliczny zmutowanych myszy. Poziomy trój glicerydów i cholesterolu w surowicy były znacząco niższe u myszy ze zmutowaną miostatyną w porównaniu z myszami kontrolnymi typu dzikiego (tabela 1). Poziomy insuliny w surowicy również wydawały się być niższe u myszy zmutowanych pod względem miostatyny. Jednakże poziom glukozy na czczo i po jedzeniu były nierozróżnialne pomiędzy homozygotycznymi myszami zmutowanymi i myszami typu dzikiego (tabela 1). Wyniki te pokazują, że homozygotyczne myszy z nokautem miostatyny mogą utrzymywać normalne poziomy glukozy w surowicy, chociaż poziom insuliny w ich surowicy jest niższy niż u zwierząt typu dzikiego.

T a b e l a 1. Parametry surowicy

	+ / +	-/-
trójglicerydy (mg/dl)	131,5+/-16,5	66,8+/-11,4	p = 0,012
cholesterol (mg/dl)	138,3+/-8,1	94,5+/-6,8	p = 0,0034
glukoza po jedzeniu (mg/dl)	114,0+/-4,8	119,3+/-5,2	n.s. (p = 0,43)
glukoza na czczo (mg/dl)	86,5+/-3,8	103,3+/-9,3	n.s. (p = 0,13)

+/+ oznacza myszy typu dzikiego; -/- oznacza homozygotyczne myszy z nokautem

W celu ustalenia, czy różnice w szybkości metabolizmu można wyjaśnić brakiem akumulacji tłuszczu w zmutowanych myszach, porównywano przy użyciu kalorymetru szybkość zużywania tlenu

PL 210 158 B1 przez myszy typu dzikiego i zmutowane. Myszy zmutowane miały niższą podstawową szybkość metabolizmu i niższe ogólne tempo metabolizmu niż myszy kontrolne typu dzikiego. Wyniki te wskazują, że brak akumulacji tłuszczu w myszach zmutowanych pod względem miostatyny nie jest skutkiem wyższego tempa aktywności metabolicznej.

P r z y k ł a d 5

Miostatyna wpływa na akumulację tłuszczu u genetycznie otyłych myszy

Przykład ten pokazuje, że brak ekspresji miostatyny znosi akumulację tłuszczu u myszy, które są modelem genetycznym dla otyłości.

W celu ustalenia, czy utrata aktywności miostatyny może znosić akumulację nie tylko u zdrowych myszy, ale również u myszy otyłych, badano efekt mutacji miostatyny u myszy agouti lethal yellow (A^y), która reprezentuje model genetyczny otyłości (Yen i wsp., FASEB J. 8: 479-488, 1994). Wytworzono myszy, które były podwójnymi heterozygotami dla mutacji agouti lethal yellow i miostatyny i badano potomstwo z krzyżówek tych podwójnie heterozygotycznych myszy.

Całkowity ciężar ciała podwójnego mutanta myszy A^y/a, miostatyna -/- był dramatycznie zmniejszony (około 9 gramów) w porównaniu do myszy A^y/a, miostatyna +/+. To zmniejszenie całkowitej wagi ciała było nawet bardziej dramatyczne biorąc pod uwagę, że podwójny mutant A^y/a, miostatyna -/- miał około 2 do 3 razy więcej mięśni szkieletowych niż myszy A^y/a, miostatyna +/+. Podwójny mutant miał około 10 gramów więcej mięśni niż myszy A^y/a, miostatyna +/+, a zatem całkowite zmniejszenie reszty tkanki wynosiło około 19 gramów.

Zmniejszenie całkowitej wagi ciała było wynikiem zmniejszenia całkowitej zawartości tłuszczu. Jak pokazano w Tabeli 2, waga przymacicznych i pozaotrzewnowych podściółek tłuszczowych była zmniejszona 5- do 6-krotnie w podwójnym mutancie A^y/a, miostatyna -/- w porównaniu do myszy A^y/a, miostatyna +/+. Wyniki te wskazują, że obecność mutacji miostatyny dramatycznie hamuje akumulację tłuszczu przy otyłości.

Obecność mutacji miostatyny ma również dramatyczny wpływ na metabolizm glukozy. Myszy agouti lethal bez mutacji miostatyny mają w dużej mierze nieprawidłowe wyniki testów na tolerancję glukozy, z poziomami glukozy w surowicy często osiągającymi 450 do 600 mg/dl i jedynie powoli powracającymi do poziomu podstawowego w ciągu 4 godzin. Samice myszy agouti lethal były bardziej dotknięte niż samce myszy, a niektóre samice odpowiadały prawie normalnie w tym teście, jak wcześniej opisano (patrz Yen i wsp., jak wyżej, 1994). W przeciwieństwie do tego, jakkolwiek myszy A^y/a, miostatyna -/- miały trochę nieprawidłowe testy tolerancji glukozy, ale żadne z tych zwierząt nie miało większych nieprawidłowości obserwowanych u myszy A^y/a, miostatyna +/+.

Wyniki te wskazują, że mutacja miostatyny, co najmniej częściowo znosi rozwój nieprawidłowego metabolizmu glukozy w myszach agouti lethal. Co jest znaczące, myszy, które były heterozygotyczne pod względem mutacji miostatyny miały pośrednią odpowiedź w porównaniu z myszami miostatyna +/+ i miostatyna -/-, potwierdzając zależny od dawki efekt miostatyny.

P r z y k ł a d 6

Oczyszczanie zrekombinowanej miostatyny

Przykład ten dostarcza sposobu wytwarzania i izolowania zrekombinowanej miostatyny

W celu wyjaśnienia roli biologicznej aktywności miostatyny, duże ilości białka miostatyny oczyszczono w celu przeprowadzenia testów biologicznych. Wytworzono stabilne linie komórek jajnika chomika chińskiego (ang. Chinese hamster ovary, CHO) produkujące wysokie poziomy białka miostatyny poprzez jednoczesną amplifikację kasety ekspresyjnej dla miostatyny z kasetą reduktazy dihydrofolianowej przy użyciu schematu selekcji na metotreksat (McPherron i wsp., jak wyżej, 1997). Miostatynę oczyszczono z kondycjonowanej pożywki linii o najwyższym poziomie produkcji poprzez kolejne frakcjonowanie na hydroksyapatycie, lentilolektynie SEPHAROSE, agarozie DEAE i heparynie SEPHAROSE. Analiza poprzez barwienie srebrem wykazała, że oczyszczone białko otrzymane po tych czterech etapach chromatografii kolumnowej (określane, jako eluat heparyny) składało się z dwóch białek o masach cząsteczkowych około 35 kilodaltonów (kDa) i 12 kDa.

Dla oczyszczonego preparatu białkowego ustalono przy zastosowaniu różnych kryteriów, że reprezentuje kompleks dwóch peptydów prodomeny miostatyny i połączony mostkiem dwu-siarczkowym dimer dojrzałych C-końcowych peptydów miostatyny. Po pierwsze, analiza Western przy użyciu przeciwciał wytworzonych wobec konkretnych części sekwencji promiostatyny, zidentyfikowała prążek o wielkości 35 kDa, jako prodomenę i 12 kDa prążek, jako dojrzały peptyd C-końcowy. Po drugie, w warunkach redukujących, białka reagujące z przeciwciałami skierowanymi przeciw dojrzałemu, C-końcowemu peptydowi miały ruchliwość elektroforetyczną zgodną z dimerem połączonym mostkami

PL 210 158 B1 dwusiarczkowymi. Po trzecie, stosunek molowy prodomeny do dojrzałego C-końcowego peptydu był około 1:1. Po czwarte, prodomena i dojrzały C-końcowy peptyd współoczyszcza się w czterech etapach chromatografii kolumnowej. Wreszcie, dojrzały C-końcowy peptyd wiąże się z kolumną lentilolektynową pomimo tego, że C-końcowy region nie zawiera sekwencji najwyższej zgodności dla sygnałów glikozylacji, poprzez N, co wskazuje, że dojrzały C-końcowy peptyd wiąże się z kolumną na skutek oddziaływań z peptydem, prodomeny która zawiera potencjalne miejsce glikozylacji poprzez N.

Wyniki te wskazują, że miostatyna wytwarzana przez zmodyfikowane genetycznie komórki CHO jest wydzielana w postaci poddanej obróbce proteolitycznej i że powstała w rezultacie, prodomena i dojrzały region C-końcowy łączą się niekowalencyjne, tworząc kompleks zawierający dwa peptydy prodomeny i połączony mostkami dwusiarczkowymi dimer C-końcowych fragmentów proteolitycznych, podobnych do tych opisanych dla TGF-β. W kompleksie TGF-β, C-terminalny dimer istnieje w nieaktywnej postaci latentnej (Miyazono i wsp., J. Biol. Chem. 263: 6407-6415, 1988), a gatunki aktywne mogą być uwolnione z tego latentnego kompleksu poprzez traktowanie kwasem, czynnikami chaotropowymi, reaktywnymi formami tlenu lub plazminą albo poprzez oddziaływania z innymi białkami, włączając w to trombospondynę i integrynę Iv|'6 (Lawrence i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. 133: 1026-1034, 1985; Lyons i wsp., J. Cell Biol. 106: 1659-1665, 1988; Schultz-Cherry i Murphy-Ullrich, J. Cell Biol. 122: 923-932, 1993; Barcellos-Hoff i Dix, Mol. Endocrinol. 10: 1077-1083, 1996; Munger i wsp., Cell 96: 319-328, 1999). Ponadto, dodanie oczyszczonej prodomeny peptydowej (znanej również, jako peptyd związany z latencją lub LAP od ang. latency associated peptide) do kompleksu TGF-β hamuje aktywność biologiczną oczyszczonego C-końcowego dimeru in vitro i in vivo (Gentry i Nash, Biochemistry 29: 6851-6857, 1990; Bottinger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93: 5877-5882, 1996).

Eluat z heparyny, który składa się z kompleksu prodomeny i dojrzałego C-końcowego peptydu, oczyszczano dalej przy zastosowaniu kolumny HPLC C4 z odwróconymi fazami. C-końcowy dimer wymywał się z kolumny HPLC wcześniej niż prodomena, umożliwiając izolowanie C-końcowego dimeru wolnego od prodomeny. Otrzymano frakcje, które zawierały głównie prodomenę, jakkolwiek frakcje te zawierały niewielkie ilości C-końcowego dimeru. Niektóre z tych białek były również obecne, jako kompleksy o wyższej masie molekularnej. Natura kompleksów o wyższej masie molekularnej jest nieznana, ale w oparciu o analizę Western w obecności i nieobecności czynnika regulującego, kompleksy te zawierają, co najmniej jeden peptyd prodomenty i jeden peptyd C-końcowej dojrzałej miostatyny, połączone jednym albo większą liczbą wiązań dwusiarczkowych. Faktycznie, większość dojrzałego C-końcowego peptydu obecnego we frakcjach HPLC wzbogaconych w propeptyd (frakcje HPLC 35-37) była obecna w tych wysokocząsteczkowych kompleksach. Te wysokocząsteczkowe kompleksy prawdopodobnie reprezentują nieprawidłowo sfałdowane białka, które są wydzielanie przez zmodyfikowane genetycznie komórki CHO.

P r z y k ł a d 7

Miostatyna oddziałuje specyficznie z receptorem aktywiny

Przykład ten pokazuje, że miostatyna wiąże się specyficznie z receptorem aktywiny typu II wyrażanym na komórkach w hodowli i że to specyficzne wiązanie jest hamowane przez prodomenę miostatyny.

Receptory dla niektórych członków rodziny TGF-β zostały zidentyfikowane i większość z nich to pojedyncze znajdujące się w błonie kinazy serynowo/treoninowe (Massague i Weis-Garcia, Cancer Surveys 27: 41-64,1996). Wiadomo na przykład, że receptory aktywiny typu II (Act RIIA i/lub Act RIIB), wiążą się z przedstawicielami nadrodziny TGF-β. Fenotyp myszy, którym brak Act receptor RIIB wykazywał defekty przedniego/tylnego wzoru osiowego, które były bardzo podobne do obserwowanych u myszy z nokautem GDF-11 (McPherron i wsp., Nat. Genet. 22: 2 60-2 64,1999; Oh i Li, Genes Devel. 11: 1812-1826, 1997). Ponieważ sekwencje aminokwasowe GDF-11 i miostatyny (GDF-8) są w 90% identyczne w regionie C-końcowym, badano zdolność miostatyny do specyficznego oddziaływania z receptorem aktywiny typu II.

Miostatyna została wyznakowana radioaktywnym jodem i badania wiązania przeprowadzono przy użyciu komórek COS transfekowanych konstruktem ekspresyjnym Act RIIB. Przeprowadzono wiązanie miostatyny przy współzawodnictwie w sposób zależny od dawki z nadmiarem niewyznakowanej miostatyny i było znacząco niższe niż w kontrolnych komórkach COS, które były transfekowane pustym wektorem. Znaczące wiązanie nie następowało do komórek transfekowanych konstruktami ekspresyjnymi BMP RII lub TGF-β RII- Wiązanie miostatyny z komórkami transfekowanymi Act RIIB podlegało wysyceniu, a powinowactwo wiązania wynosiło 5 nM jak ustalono poprzez analizę Scatchard.

PL 210 158 B1

Testy wiązania się z receptorem zastosowano również do badania zdolności prodomeny miostatyny do hamowania zdolności dojrzałego C-końcowego dimeru do specyficznego oddziaływania z Act RIIB w tym systemie. Dodanie oczyszczonego peptydu pro-domeny blokowało zdolność C-końcowego dimeru do wiązania się z komórkami COS transfekowanymi Act RIIB w sposób zależny od dawki. Wyniki te wskazują, że prodomena miostatyny jest naturalnym inhibitorem miostatyny.

P r z y k ł a d 8

Zwiększone poziomy miostatyny indukują utratę wagi

Przykład ten pokazuje, że zwiększone poziomy miostatyny mogą prowadzić do znaczącej utraty wagi in vivo.

W tej serii doświadczeń, komórki CHO, które wyrażały miostatynę wstrzyknięto do nagich myszy. Nagie myszy, które miały nowotwory z komórek CHO wyrażające miostatynę wykazywały znaczące wyniszczenie w okresie od 12 do 16 dni po wstrzyknięciu do komórek. Zespół wyniszczenia nie był też obserwowany u nagich myszy po wstrzyknięciu dowolnej z różnych linii kontrolnych CHO, które podlegały podobnemu procesowi selekcji, ale nie wyrażały miostatyny. Ponadto, sekwencja kodująca miostatynę w konstrukcie, użyta do transfekowania komórek CHO była pod kontrolą promotora metalotioneiny, a zespół wyniszczenia zaostrzał się, kiedy myszy niosące nowotwory wyrażające miostatynę utrzymywano na wodzie zawierającej siarczan cynku. Analiza Western wykazała wysokie poziomy białka miostatyny w surowicy nagich myszy, które niosą komórki CHO wyrażające miostatynę. Wyniki te wskazują, że zespół wyniszczenia został zaindukowany w odpowiedzi na podwyższony poziom miostatyny u nagich myszy i, jak omówiono powyżej, wynik ten potwierdzono przez obserwację podobnych efektów u myszy, którym wstrzyknięto oczyszczoną miostatynę.

Dramatyczna utrata wagi obserwowana u nagich myszy niosących komórki CHO wyrażające miostatynę była głównie na skutek nieproporcjonalnej utraty zarówno wagi tłuszczu jak i mięśni. Waga białej podściółki tłuszczowej (biały tłuszcz wewnątrzłopatkowy, maciczny i pozaotrzewnowy) był zmniejszony ponad 90% w porównaniu z myszami niosącymi kontrolne nowotwory komórek CHO. Waga mięśni była również znacząco zmniejszona, gdzie poszczególne mięśnie u myszy wyrażających miostatynę ważyły około połową tego, co u myszy kontrolnych przed upływem 16 dni. Ta utrata wagi mięśni odzwierciedlała odpowiednie zmniejszenie rozmiaru włókien i zawartości białka.

Myszy niosące nowotwory CHO wyrażające miostatynę stawały się również poważnie hipoglikemiczne. Jednakże utrata wagi i hipoglikemia nie następowały na skutek różnicy w konsumpcji pożywienia, ponieważ wszystkie myszy spożywały równoważne ilości pokarmu w każdym z przedziałów czasowych badanych w trakcie 16 dniowego okresu badań. Wyniki te wskazują, że nadekspresja miostatyny indukuje dramatyczną utratę wagi, co powoduje kachektyczny zespół wyniszczenia, który występuje u pacjentów cierpiących z powodu przewlekłych chorób, takich jak nowotwór lub AIDS.

W przypadku bardziej przewlekłego podawania z zastosowaniem niższych dawek miostatyny, obserwowano zmiany w wadze tłuszczu. Przykładowo, wstrzykiwanie dwa razy dziennie 1 μg białka miostatyny przez 7 dni prowadziło do około 50% zmniejszenia wagi wielu różnych podściółek białego tłuszczu (biały tłuszcz wewnątrzłopatkowy, maciczny i pozaotrzewnowy) bez znaczącego wpływu na tłuszcz brązowy (brązowy tłuszcz wewnątrzłopatkowy). Wyniki te potwierdzają, że miostatyna może indukować utratę wagi i w skrajnych przypadkach zespół wyniszczenia in vivo.

P r z y k ł a d 9

Charakteryzacja wiązania miostatyny z receptorem aktywiny

Przykład ten opisuje sposób charakteryzowania zależności między wiązaniem się miostatyny z receptorem aktywiny i efektami biologicznymi wywoływanymi przez miostatynę in vivo.

Dla potwierdzenia tego, że Act RIIA lub Act RIIB jest in vivo receptorem miostatyny, można użyć myszy z nokautem genu Act RIIA lub Act RIIB. Dzięki szczegółowej analizie mięśni tych myszy można stwierdzić, czy nokaut receptorów aktywiny wiąże się ze zmianą liczby lub wielkości włókien mieśniowych. Ponieważ podwójnie homozygotyczne mutanty Act RIIA/Act RIIB giną wcześnie podczas embriogenezy (Song i wsp., Devel. Biol. 213:157-169, 1999), możliwe jest badanie wyłącznie różnych kombinacji homozygotycznych i heterozygotycznych. Można jednak wytworzyć mysie nokauty specyficzne tkankowo lub warunkowe tak, że oba geny mogą być usunięte jedynie w tkance mięśniowej, pozwalając tym samym na badanie podwójnie homozygotycznych myszy nokautowych po urodzeniu.

Wpływ na tkankę tłuszczową można zbadać podczas starzenia się myszy stwierdzając, czy liczba komórek tłuszczowych lub akumulacja w nich lipidów jest zmieniona u myszy z nokautem. Liczbę i rozmiar komórek tłuszczowych wyznacza się przygotowując zawiesinę komórek z tkanki poddanej

PL 210 158 B1 działaniu kolagenazy (Rodbell, J. Biol. Chem. 239: 375-380, 1964; Hirsch i Gallian, J. Lipid Res. 9:110-119, 1968). Całkowita zawartość lipidów w zwierzętach jest wyznaczana przez pomiar suchej masy ciała a następnie resztkowej masy ciała po ekstrakcji lipidów (Folch i wsp., J. Biol. Chem. 226: 497-509, 1957).

Można również badać szereg różnych parametrów surowicy, w tym poziom glukozy i insuliny po karmieniu i na czczo, trójglicerydy, cholesterol i leptynę. Jak ujawniono to powyżej, poziom trój glicerydów oraz insuliny w surowicy jest obniżony u zwierząt z mutacją genu miostatyny. Zdolność myszy z nokautem receptora aktywiny do odpowiedzi na obciążenie zewnętrzną glukozą można zbadać przy użyciu testów tolerancji na glukozę. Jak ujawniono powyżej, odpowiedź na obciążenie glukozą była zasadniczo identyczna u myszy dzikich i z mutacją w genie miostatyny w wieku 5 miesięcy. Obserwację tę można poszerzyć mierząc te parametry u starzejących się myszy. Poziom insuliny w surowicy można też mierzyć w różnych punktach czasowych podczas testów tolerancji na glukozę.

Podstawową przemianę materii można również śledzić przy użyciu kalorymetru (Columbus Instruments). Jak ujawniono powyżej, myszy z mutacją w genie miostatyny mają obniżoną przemianę materii w wieku 3 miesięcy w porównaniu z odpowiednikami dzikimi. Analizę tę można poszerzyć na starsze myszy, można również u tych zwierząt zmierzyć wskaźnik oddechowy. Zdolność do utrzymania prawidłowej termogenezy można wyznaczyć mierząc podstawową temperaturę ciała oraz zdolność utrzymania temperatury ciała po umieszczeniu w temperaturze 4°C. Można również zbadać masę brunatnej tkanki tłuszczowej oraz poziomy ekspresji genów UCP1, UCP2 i UCP3 w brunatnej tkance tłuszczowej, tłuszczu kropelkowym, mięśniach oraz w innych tkankach (Schrauwen i wsp., 1999).

Można śledzić stosunek przyjmowanego pokarmu do przyrostu wagi i obliczyć wydajność pokarmową. Ponadto można śledzić przyrost wagi u zwierząt karmionych dietą bogatą w tłuszcze. Dzikie myszy utrzymywane na diecie bogatej w tłuszcze szybko akumulują tłuszcz, podczas gdy ujawnione tu wyniki wykazują, że zwierzęta z mutacją w genie receptora aktywiny pozostają względnie chude.

Wyniki tych badań mogą dostarczyć pełniejszego profilu działania miostatyny u myszy, zwłaszcza w stosunku do ich ogólnego stanu metabolicznego, dostarczając tym samym danych do odpowiedzi na pytanie, czy zdolność do zahamowania akumulacji tłuszczu u myszy z nokautem miostatyny jest efektem anabolicznym mutacji w genie miostatyny w mięśniu, prowadzącym do zmiany wykorzystywania energii w taki sposób, że niewielka energia dostępna jest do gromadzenia się w postaci tłuszczu. Przykładowo, zmniejszona akumulacja tłuszczu może być spowodowana zwiększeniem tempa termogenezy. Wyniki te dostarczą również podstawy do porównywania efektów działania miostatyny w kontekście różnych genetycznych modeli otyłości i cukrzycy typu II.

P r z y k ł a d 10

Charakteryzacja efektu działania miostatyny w genetycznych modelach otyłości i cukrzycy typu II

Przykład ten opisuje metody wyznaczania działania miostatyny w leczeniu otyłości lub cukrzycy typu II.

Dramatyczne obniżenie ogólnej akumulacji tłuszczu u myszy z mutacją genu miostatyny w porównaniu z myszami dzikimi wskazuje na to, że możliwe jest manipulowanie aktywnością miostatyny w celu leczenia lub zapobiegania otyłości lub cukrzycy typu II. Efekt mutacji w genie miostatyny można badać w kontekście kilku dobrze scharakteryzowanych mysich modeli tych chorób metabolicznych w tym, na przykład, otyłych myszy (ob/ob), myszy z cukrzycą (db/db) oraz szczepów z mutacją agouti lethal yellow (A^y). Każdy z tych szczepów wykazuje nieprawidłowości w praktycznie każdym spośród opisanych powyżej parametrów i testów (patrz, na przykład, Yen i wsp., jak wyżej, 1994, Friedman i Halaas, Nature 395: 763-770, 1998). Zdolność mutacji w genie miostatyny do spowolnienia lub zahamowania rozwoju tych nieprawidłowości u myszy niosących opisane inne mutacje można zbadać konstruując odpowiednie podwójne mutanty, a następnie poddając zwierzęta z podwójną mutacją, wraz z odpowiednimi kontrolami z tego samego miotu niosącymi jedynie mutacje ob/ob, db/db lub agouti lethal yellow odpowiednim testom.

Jak ujawniono powyżej, mutacja genu miostatyny u myszy A^y wiązała się z około pięciokrotnym zahamowaniem akumulacji tłuszczu u myszy z A^y z mutacją w genie miostatyny oraz z częściowym zahamowaniem rozwoju nieprawidłowego metabolizmu glukozy oznaczanego testami tolerancji na glukozę. Wyniki te można rozszerzyć o dodatkowe zwierzęta w różnym wieku i przeprowadzić podobne badania z mutantami ob/ob i db/db. Ponieważ obie te mutacje są recesywne, można otrzymać myszy podwójnie homozygotyczne pod względem mutacji w genie miostatyny oraz albo mutacji ob albo db. W celu zbadania efektów częściowej utraty funkcji miostatyny w tych modelowych układach genetycznych, bada się również myszy homozygotyczne pod względem mutacji ob lub db oraz heterozygo32

PL 210 158 B1 tyczne pod względem mutacji w genie miostatyny. Wytworzono myszy podwójnie heterozygotyczne pod względem mutacji w genie miostatyny oraz ob, można więc zbadać potomstwo z krzyżówek tych podwójnie heterozygotycznych myszy, zwłaszcza pod kątem akumulacji tłuszczu i metabolizmu glukozy. Częściowe zahamowanie którejkolwiek, lub obu nieprawidłowości u mutantów otyłych może wskazywać na to, że miostatyna jest celem terapii otyłości i cukrzycy typu II.

P r z y k ł a d 11

Charakteryzacja myszy transgenicznych wyrażających dominujące negatywne polipeptydy, które mogą wpływać na aktywność miostatyny

Przykład ten opisuje metody charakteryzacji działania miostatyny po urodzeniu przez wyrażanie dominujących negatywnych polipeptydów, które mogą blokować ekspresję miostatyny lub przekazywanie sygnału miostatyny.

Inhibitory miostatyny

Modulację aktywności miostatyny po urodzeniu można wykorzystać do wyznaczenia efektu działania miostatyny na liczbę włókien mięśniowych (rozrost) i rozmiar włókien mięśniowych (przerost). Do badań tych można wykorzystać myszy z warunkowym nokautem miostatyny, w których gen miostatyny jest usuwany w określonym momencie życia zwierzęcia. Regulator tet w połączeniu z rekombinazą cre dostarczają systemu dla wytwarzania takich myszy. W systemie tym ekspresja cre jest indukowana przez podanie doksycykliny.

Można również wytworzyć myszy wyrażające inhibitor miostatyny z indukowalnego promotora tak, że aktywność miostatyny może być obniżona lub zahamowana w określonym momencie życia zwierzęcia. Regulatory tetracyklinowe przydatne są do wytwarzania takich myszy transgenicznych, w których ekspresja cre jest indukowana przez doksycyklinę.

Szczególnie przydatna w wytwarzaniu myszy transgenicznych może być modyfikacja systemu tet, która wykorzystuje koekspresję odwrotnego transaktywatora tet (fuzji białkowej domeny aktywującej VP16 ze zmutowanym odwrotnym represorem tet) oraz hybrydowego transrepresora tet (fuzji białkowej domeny represorowej KRAB ssaczego Kox1 z natywnym represorem tet) (Rossi i wsp., Nat. Genet. 20: 389-393, 1998; Forster i wsp., Nucl. Acids Res. 27:708-710, 1999). W systemie tym hybrydowy odwrotny transaktywator tet wiąże się z sekwencjami operatorowymi tet i aktywuje transkrypcję jedynie w obecności tetracykliny, hybrydowy transrepresor tet wiąże się z sekwencjami operatorowymi tet w nieobecności tetracykliny i hamuje transkrypcję jedynie w nieobecności tetracykliny. Przy koekspresji tych dwóch fuzji białkowych podstawowa aktywność docelowego promotora jest hamowana przez transrepresor tet w nieobecności tetracykliny, jest natomiast aktywowana przez odwrotny transaktywator tet po podaniu tetracykliny.

Można wytworzyć dwa typy linii transgenicznych. W pierwszym typie transgen koduje polipeptydowy inhibitor miostatyny pod kontrolą promotora specyficznego dla mięśni, na przykład promotora mięśniowej kinazy kreatynowej (Sternberg i wsp., powyżej, 1988) lub promotora/wzmacniacza lekkiego łańcucha miozyny (Donoghue i wsp., powyżej, 1991). Indywidualne linie transgeniczne są badane pod kątem specyficznej ekspresji regulatorów tet w mięśniu szkieletowym, dla każdego z dwóch promotorów wybiera się kilka niezależnych linii i bada dla potwierdzenia, że obserwowane efekty nie są związane z, na przykład, zjawiskami specyficznymi dla miejsca integracji. Stworzono konstrukt zawierający oba regulatory tet pod kontrolą promotora/wzmacniacza lekkiego łańcucha miozyny, który może być użyty do wstrzyknięcia do przedjądrza. W drugim typie linii transgen zawiera polipeptydowy inhibitor miostatyny pod kontrolą minimalnego promotora CMV, który zawiera ponadto sekwencje operatora tet.

Inhibitor miostatyny może być dominującą negatywną postacią miostatyny lub prodomeną miostatyny, która, jak to tu ujawniono, może hamować aktywność miostatyny. Dominujące negatywne postaci przedstawicieli rodziny TGF-β były już opisywane (patrz, na przykład, Lopez i wsp., Mol. Cell Biol. 12: 1674-1679, 1992; Wittbrodt i Rosa, Genes Devel. 8:1448-1462, 1994) i zawierają one, na przykład, zmutowane miejsce cięcia proteolitycznego, co uniemożliwia przetworzenie białka do formy aktywnej biologicznie. Przy koekspresji w komórce z endogennym dzikim genem zmutowane białko tworzy niefunkcjonalne heterodimery z białkiem dzikim, wykazując tym samym działanie dominujące negatywne. Skonstruowano zmutowany polipeptyd miostatyny zawierający mutację w miejscu cięcia pro-miostatyny, który można zbadać pod kątem efektu dominującego negatywnego przez koekspresję mutanta z dziką miostatyną w różnych stosunkach ilościowych w komórkach linii 293. Kondycjonowane podłoże z komórek linii 293 przejściowo transfekowanych konstruktami może być zbadane przez analizę typu western, pozwalając na stwierdzenie zdolności mutanta do blokowania tworzenia dojrzałych C-końcowych dimerów.

PL 210 158 B1

Można również wykorzystać konstrukt ekspresyjny kodujący jedynie prodomenę miostatyny. Jak ujawniono powyżej, prodomena tworzy silnie związany kompleks z dojrzałym C-końcowym dimerem i blokuje zdolność dojrzałego C-końcowego dimeru miostatyny do wiązania Act RIIB w komórkach wyrażających receptor w hodowli. Przez analogię z TGF-β, prodomena miostatyny może również utrzymać dojrzały C-końcowy dimer w nieaktywnym utajonym kompleksie in vivo.

Takie zwierzęta transgeniczne można skrzyżować z wyrażającymi regulatory tet by otrzymać podwójnie transgeniczne linie, zawierające zarówno regulatory tet, jak i docelowy konstrukt inhibitorowy. Wśród takich podwójnie transgenicznych linii można wyszukać te, w których odpowiednio wyrażane są wszystkie składniki. Do zidentyfikowania takich linii transgenicznych można użyć analizy metodą Northern z użyciem RNA uzyskanego z różnych mięśni i tkanek kontrolnych myszy reprezentujących każdą z linii, przed i po podaniu doksycykliny w wodzie pitnej. Wybrane będą takie linie transgeniczne, które nie wyrażają transgenu w jakiejkolwiek tkance przy braku doksycykliny, i które wyrażają transgen jedynie w mięśniach w obecności doksycykliny.

Wybranym zwierzętom transgenicznym podaje się doksycyklinę, po czym bada się efekt dla masy mięśni. Doksycyklinę można podawać ciężarnym matkom dla zaindukowania ekspresji inhibitora podczas embriogenezy. Efekt zablokowania aktywności miostatyny podczas rozwoju zwierząt transgenicznych można porównać z efektami obserwowanymi w myszach z nokautem miostatyny. Ponieważ promotory kierujące ekspresją regulatorów tet można zaindukować na etapie rozwoju późniejszym niż ten, kiedy po raz pierwszy wyrażana jest miostatyna, efekt na masę mięśni u myszy transgenicznych można porównać z efektem występującym u myszy z nokautem miostatyny.

Efekt zahamowania aktywności miostatyny po urodzeniu można zbadać podając doksycyklinę podwójnie transgenicznym myszom po różnym czasie od urodzenia. Podawanie doksycykliny można rozpocząć, na przykład, w wieku 3 tygodni, zaś zwierzęta poddać analizie w wieku 5 miesięcy, gdy to różnice masy mięśni pomiędzy myszami z nokautem miostatyny a myszami dzikimi są największe. Zwierzęta bada się pod kątem wpływów działania inhibitora na masę mięśni. Mięśnie można również badać histologicznie, by określić wpływ na liczbę i rozmiar włókien. Ponadto, można przeprowadzić analizę typu włókien różnych mięśni myszy transgenicznych w celu stwierdzenia, czy istnieje wybiórczy wpływ na włókna typu I lub II.

Dla scharakteryzowania wpływu inhibitorów miostatyny można podawać doksycyklinę w różnych dawkach i w różnym czasie. Można także utrzymywać myszy podwójnie transgeniczne przewlekle na doksycyklinie, a następnie zbadać pod kątem efektów na wagę poduszeczki tłuszczowej i inne istotne parametry metaboliczne, zgodnie z opisem powyżej. Wyniki tych badań mogą potwierdzić, że modulowanie aktywności miostatyny po urodzeniu może zwiększyć wagę mięśni lub zmniejszyć akumulację tłuszczu, sugerując tym samym, że działanie na miostatynę może być przydatne w klinicznym leczeniu szeregu różnych chorób wyniszczających mięśnie i metabolicznych.

Miostatyna

Można również zbadać myszy transgeniczne zawierające transgen miostatyny i porównać efekty wywołane ekspresją miostatyny z tymi, które obserwuje się u nagich myszy zawierających wyrażające miostatynę komórki CHO. Podobnie, jak opisano powyżej, miostatynę można umieścić pod kontrolą warunkowych (tet) i tkankowo specyficznych elementów regulatorowych i zbadać, czy ekspresja miostatyny w myszach transgenicznych może powodować zespół wyniszczania podobny do tego, który obserwuje się u nagich myszy. Transgen miostatyny może zawierać, na przykład, sygnały obróbki otrzymane z SV40 tak, by transgen mógł być odróżniony od endogennego genu miostatyny.

Próbki surowicy można izolować z myszy transgenicznych pod względem miostatyny w różnym czasie po podaniu doksycykliny i wyznaczać poziom produktu transgenu miostatyny w surowicy. Całkowitą wagę ciała zwierząt śledzi się w czasie dla stwierdzenia, czy u zwierząt tych następuje znacząca utrata wagi. Ponadto izoluje się i waży indywidualne mięśnie i poduszeczki tłuszczowe, a w wybranych próbkach mięśni oznacza się liczbę, rozmiar i typ włókien mięśniowych.

Poziom ekspresji transgenu miostatyny można zmieniać zmieniając dawkę podawanej zwierzętom doksycykliny. Ekspresję transgenu można śledzić wykorzystując, na przykład, analizę typu Northern poziomów RNA transgenu w mięśniu lub poziom białka miostatyny w surowicy. Określenie specyficznego poziomu ekspresji transgenu miostatyny pozwala na skorelowanie go z zakresem wyniszczenia spowodowanego przez miostatynę. Linie transgeniczne można również skrzyżować z myszami z nokautem miostatyny, by wytworzyć zwierzęta, u których jedynym źródłem miostatyny jest ekspresja z transgenu. Można zbadać ekspresję miostatyny w różnych punktach czasowych podczas rozwoju i określić wpływ miostatyny na liczbę, rozmiar i typ włókien. Dostępność myszy, u których ekspresja miostatyny

PL 210 158 B1 może być precyzyjnie i szybko kontrolowana, dostarcza potężnego narzędzia dla dalszej charakteryzacji szlaku przekazywania sygnału przez miostatynę i dla badania efektu działania różnych czynników, które mogą potencjalnie być przydatne do modulowania przekazywania sygnału przez miostatynę.

Efektory przekazywania sygnału przez miostatynę

Można wytworzyć myszy transgeniczne zawierające dominujące negatywne postaci szlaku przekazywania sygnału przez miostatynę, które mogą zawierać elementy szlaku przekazywania sygnału przez TGF-β, wyrażane specyficznie w mięśniach szkieletowych. Jak tu ujawniono, białka Smad, które pośredniczą w przekazywaniu sygnału szlakiem indukowanym przez receptory aktywiny typu II, mogą brać udział w przekazywaniu sygnału przez miostatynę.

Act RIIB może wiązać GDF-11, który jest wysoce podobny do miostatyny (McPherron i wsp., jak wyżej, 1997; Gamer i wsp., jak wyżej, 1999; Nakashima i wsp., Mech Devel. 80:185-189, 1999), a ekspresja c-ski, który może wiązać i hamować Smad 2, Smad 3 i Smad 4, dramatycznie wpływa na przyrost mięśni (Sutrave i wsp., jak wyżej, 1990; Berk i wsp., powyżej, 1997; patrz też Luo i wsp., jak wyżej, 1999; Stroschein i wsp., jak wyżej, 1999; Sun i wsp., jak wyżej, 1999a i b; Akiyoshi i wsp., jak wyżej, 1999). Jak tu ujawniono, miostatyna oddziałuje specyficznie z Act RIIB, może zatem wywoływać swój efekt biologiczny, przynajmniej częściowo, przez wiązanie się z receptorami aktywiny typu II in vivo i aktywację szlaku przekazywania sygnału przez Smad.

Rolę szlaku przekazywania sygnału przez Smad w regulacji wzrostu mięśnia można zbadać używając linii myszy transgenicznych zablokowanych lub zdolnych do zablokowania konkretnych etapów szlaku przekazywania sygnału przez Act RIIB/Smad. Do kierowania ekspresją różnych inhibitorów szlaku przekazywania sygnału przez Smad można wykorzystać promotor mięśniowej kinazy kreatynowej lub promotor/wzmacniacz lekkiego łańcucha miozyny.

Do użytecznych w tym systemie inhibitorów należą, przykładowo, folistatyna, dominujący negatywny receptor Act RIIB, dominujący negatywny polipeptyd Smad, taki jak Smad 3, c-ski lub hamujący polipeptyd Smad taki, jak Smad 7. Folistatyna może wiązać i hamować aktywność niektórych przedstawicieli rodziny TGF-β, w tym GDF-11 (Gamer i wsp., jak wyżej, 1999). Dominujące negatywne postaci receptora aktywiny typu II można uzyskać, na przykład, przez wyrażanie domeny zewnątrzkomórkowej, zwłaszcza rozpuszczalnej postaci zewnątrzkomórkowej domeny Act RIIB, lub też przez wyrażanie skróconego receptora Act RIIB pozbawionego domeny kinazowej lub zawierającego mutację taką, że receptor pozbawiony jest aktywności kinazowej. Smad 7 działa, jako Smad hamujący, który może blokować szlak przekazywania sygnału indukowany przez aktywinę, TGF-β i BMP. Dominująca negatywna postać Smad 3 może, przykładowo, być skonstruowana przez mutację C-końcowych miejsc fosforylacji Smad 3, blokując tym samym funkcję Smad 3 (Liu i wsp., powyżej, 1997).

Można wytworzyć myszy transgeniczne i zbadać każdą linię założycielską pod kątem prawidłowej, specyficznej dla mięśni ekspresji transgenu. U wybranych myszy bada się całkowitą wagę ciała, wagę poszczególnych mięśni oraz rozmiar, liczbę i typ włókien mięśniowych. Te linie, u których występuje wyraźny wpływ na wagę mięśni, można dalej zbadać pod kątem akumulacji tłuszczu i innych istotnych parametrów metabolicznych tak, jak opisano powyżej. Wykorzystanie tych różnych czynników dla zablokowania konkretnych etapów szlaku przekazywania sygnału przez receptor aktywiny/Smad jest szczególnie pouczające, gdyż szlaki przekazywania sygnału dla rożnych czynników nakładają się na siebie na różnych etapach. Przykładowo, folistatyna wiąże i hamuje aktywność aktywiny i GDF-11, lecz nie TGF-β, podczas gdy dominujący negatywny Smad 3 może zablokować przekazywanie zarówno przez receptory aktywiny, jak i TGF-β. Smad 7 może mieć nawet bardziej plejotropowy efekt, gdyż blokuje on również przekazywanie sygnału przez receptory BMP. Takie badania mogą pozwolić na identyfikację specyficznych docelowych punktów dla modulowania aktywności miostatyny, dostarczając tym samym różnych strategii opracowywania leków lub innych czynników, które modulują przekazywanie sygnału miostatyny, a tym samym aktywność miostatyny.

W szczególności, opisane tu linie transgeniczne mogą być wykorzystane do stwierdzenia efektu zablokowania funkcji miostatyny lub szlaku przekazywania sygnału przez Smad po urodzeniu na rozwój otyłości lub cukrzycy typu II. Przykładowo, transgeny inhibitorowe można skrzyżować ze zmutowanymi myszami ob/ob, db/db lub A^y. W nieobecności doksycykliny transgen inhibitorowy nie jest wyrażany, a zatem zwierzęta są nieodróżnialne od rodzicielskich myszy zmutowanych. W obecności doksycykliny inhibitor jest wyrażany i może zablokować aktywność miostatyny. Można więc zbadać efekt zablokowania aktywności miostatyny na rozwój nieprawidłowości metabolicznych u tych zmutowanych zwierząt.

PL 210 158 B1

Ekspresję inhibitora można zaindukować we wczesnym wieku, na przykład w wieku trzech tygodni, dla uzyskania maksymalnego efektu. Dodatkowo, aktywność miostatyny można zablokować przed momentem, po którym nieprawidłowości metaboliczne stają się tak ciężkie, że są nieodwracalne. Zwierzęta można utrzymywać na doksycyklinie i badać w różnym wieku przy użyciu opisanych powyżej testów, również tych, które dotyczą akumulacji tłuszczu i metabolizmu glukozy. Można zidentyfikować jakiekolwiek opóźnienie wieku, w którym jeden lub więcej testów zaczyna dawać nieprawidłowy wynik u zwierząt z mutacjami ob/ob, db/db i A^y. Podobne badania można przeprowadzić przy użyciu starszych zwierząt, u których rozwinęły się niektóre oznaki otyłości lub cukrzycy typu II i wyznaczyć wpływ zablokowania aktywności miostatyny na różne parametry, w tym masę tłuszczu i metabolizm glukozy. Wyniki tych badań mogą zidentyfikować dalsze specyficzne punkty docelowe, którymi można manipulować w celu zapobieżenia lub leczenia otyłości lub cukrzycy typu II.

P r z y k ł a d 12

Charakteryzacja efektu działania miostatyny w indukcji kacheksji

Przykład ten opisuje metody wyznaczania roli przekazywania sygnału miostatyny w rozwoju i postępie kacheksji.

Receptor aktywiny i szlak Smad mogą stanowić przynajmniej część szlaku przekazywania sygnału pośredniczącego w regulacji aktywności miostatyny u normalnych osobników, mogą zatem pośredniczyć w wywoływaniu efektów pojawiających się u osobnika na skutek nadmiaru miostatyny. Jak tu ujawniono, przykładowo kacheksja może być wywołana, przynajmniej częściowo, za pośrednictwem nieprawidłowo wysokiego poziomu miostatyny. W związku z tym, metody manipulowania przekazywaniem sygnału przez szlak Smad mogą dostarczyć nowej strategii opracowywania leków służących do leczenia ogólnie wyniszczenia mięśni, a w szczególności kacheksji.

Rolę szlaku przekazywania sygnału Smad w kacheksji można zbadać przez badanie podatności różnych opisanych powyżej linii transgenicznych na kacheksję, którą można zaindukować, przykładowo, interleukiną-6 (IL-6; Black i wsp., Endocrinology 128: 2657-2659, 1991), czynnikiem martwicy nowotworów-I (TNF-I; Oliff i wsp., Cell 50:555-563, 1987, włączone tu jako odniesienie) lub pewnymi komórkami nowotworowymi. W przypadku IL-6 i TNF-I transgeny inhibitorowe można wprowadzić przez krzyżówki w tło genetyczne nagich myszy, po czym sprowokować zwierzęta komórkami CHO, które wytwarzają IL-6 lub TNF-I, co przy takiej nadekspresji powoduje wyniszczanie u nagich myszy. Komórki CHO nadprodukujące IL-6 lub TNF-I można przygotować przy użyciu opisanych powyżej metod służących do wytwarzania komórek nadprodukujących miostatynę. Przykładowo, cDNA TNF-I można sklonować w wektorze ekspresyjnym pMSXND (Lee i Nathans, J. Biol. Chem. 263: 3521-3527, 1988), następnie komórki niosące zamplifikowane kopie konstruktu ekspresyjnego można selekcjonować stopniowo na rosnących stężeniach metotreksatu.

Do badań tych można również wykorzystać komórki rakowe takie, jak komórki raka płuc Lewisa (Matthys i wsp., Eur. J. Cancer 27: 182-187,1991) lub komórki gruczolakoraka okrężnicy 26 (Tanaka i wsp., J. Cancer Res. 50: 2290-2295, 1990), które mogą indukować kacheksję u myszy. Te linie komórkowe powodują ciężkie wyniszczenie, gdy rozwijają się, jako guzy u myszy. Można zatem zbadać wpływ tych nowotworów u różnych opisanych tu myszy transgenicznych. Wiadomo, że różne komórki nowotworowe będą się rozwijały jedynie w niektórych tłach genetycznych. Przykładowo, komórki raka płuc Lewisa rutynowo hoduje się w myszach C57 BL/6, zaś komórki raka okrężnicy 26 zwykle hoduje się w myszach BALB/c. Transgeny można zatem wprowadzić przez krzyżówki wsteczne do tego lub innego tła genetycznego, by umożliwić rozwój komórek nowotworowych.

Można śledzić różne parametry, w tym całkowitą wagę ciała, wagę poszczególnych mięśni, rozmiar i liczbę włókien mięśniowych, przyjmowany pokarm i parametry surowicy, w tym poziom glukozy. Dodatkowo można też badać poziom miostatyny w surowicy i poziom RNA miostatyny w mięśniu dla potwierdzenia korelacji zwiększonej ekspresji miostatyny z kacheksją. Wyniki tych badań mogą potwierdzić, że działanie miostatyny odbywa się w następstwie działania czynników wywołujących kacheksję w tych modelach doświadczalnych. Wyniki te mogą również potwierdzić, że szlak przekazywania sygnału Smad jest niezbędny dla rozwoju kacheksji w tych modelach, oraz mogą wykazać, że można uzyskać korzyść terapeutyczną w leczeniu kacheksji przez modulację przekazywania sygnału przez Smad.

P r z y k ł a d 13

Identyfikacja i charakteryzacja receptorów czynnika różnicowania wzrostu-8 (GDF-8) i GDF-11

Przykład ten opisuje metody identyfikacji i charakteryzacji receptorów GDF-8 (miostatyny) i GDF-11 na powierzchni komórki.

PL 210 158 B1

Oczyszczone białka GDF-8 i GDF-11 będą użyte głównie do oznaczania aktywności biologicznej. W celi zidentyfikowania potencjalnych komórek docelowych działania GDF-8 i GDF-11 przeszukane zostaną komórki wyrażające ich receptory. W tym celu oczyszczone białko będzie wyznakowane radioaktywnym jodem metodą z wykorzystaniem chloraminy T, którą z sukcesem zastosowano do wyznakowania innych przedstawicieli tej nadrodziny takich, jak TGF-β (Cheifetz i wsp., powyżej,

1987) , aktywin (Sugino i wsp., J. Biol. Chem. 263: 15249-15252, 1988) i BMP (Paralkar i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 3397-3401, 1991) w badaniach wiązania receptorów. Dojrzałe obrobione postaci GDF-8 i GDF-11 zawierają wiele reszt tyrozyny. Dla zidentyfikowania receptorów tych białek zastosowane będą dwie różne drogi.

W jednej ze strategii wyznaczy się liczbę, powinowactwo i rozmieszczenie receptorów. Całe komórki z hodowli, zamrożone skrawki zarodków lub tkanek dorosłych lub całkowite frakcje błonowe przygotowane z tkanek lub hodowanych komórek będą inkubowane z wyznakowanym białkiem, po czym oznaczy się ilość i rozmieszczenie związanego białka. W doświadczeniach wykorzystujących linie komórkowe lub błony stopień wiązania wyznaczy się przez pomiar ilości radioaktywności związanej z komórkami w naczyniu po kilku płukaniach lub, w przypadku błon, ilości radioaktywności osiadającej z błonami po wirowaniu lub zatrzymanej z błonami na filtrze. W doświadczeniach wykorzystujących pierwotne linie komórkowe, gdzie liczba komórek może być bardziej ograniczona, miejsca wiązania będą wizualizowane bezpośrednio przez nałożenie emulsji fotograficznej. W doświadczeniach wykorzystujących zamrożone skrawki miejsca wiązania ligandu będą wizualizowane przez ekspozycję tych skrawków z błoną typu Beta-max hyperfilm o wysokiej rozdzielczości, a jeżeli wymagana będzie dokładniejsza lokalizacja skrawki będą zanurzane w emulsji fotograficznej. Dla wszystkich tych doświadczeń specyficzność wiązania będzie wyznaczana przez dodatek nadmiaru niewyznakowanego białka, jako czynnika współzawodniczącego (przykładowo, patrz Lee i Nathans, powyżej, 1988).

Druga strategia polegać będzie na biochemicznej charakteryzacji receptora. Preparaty błon lub potencjalne komórki docelowe w hodowli będą inkubowane z wyznakowanym ligandem, zaś kompleksy receptor/ligand będą kowalencyjnie sieciowane przy użyciu suberynianu disukcynimidylowego, który był powszechnie stosowany do identyfikacji receptorów dla różnych ligandów, w tym dla przedstawicieli nadrodziny TGF-β (Massague i Like, J. Biol. Chem. 260: 2636-2645, 1985). Usieciowane kompleksy rozdzielane są przez elektroforezę w żelach poliakrylamidowych z SDS w poszukiwaniu prążków wyznakowanych w nieobecności, lecz nie w obecności nadmiaru niewyznakowanego białka. Masę cząsteczkową hipotetycznego receptora oszacuje się odejmując masę cząsteczkową ligandu. Istotnym pytaniem, na które doświadczenia te udzielą odpowiedzi, jest to, czy GDF-8 i GDF-11 przekazują sygnał za pośrednictwem receptorów typu I i typu II, podobnie jak wielu innych przedstawicieli nadrodziny TGF-β (Massague i Weis-Garcia, jak wyżej, 1996).

Gdy uzyska się już metodę wykrywania receptorów tych cząsteczek, przeprowadzona zostanie bardziej szczegółowa analiza mająca na celu wyznaczenie powinowactwa wiązania i specyficzności. Do wyznaczenia liczby miejsc wiązania i stałych dysocjacji użyta zostanie analiza Scatcharda. Przeprowadzając analizę wzajemnego współzawodnictwa pomiędzy GDF-8 a GDF-11 będzie można stwierdzić, czy są one zdolne do wiązania tego samego receptora i określić względne powinowactwa. Badania te dostarczą wskazówek, czy cząsteczki te przekazują sygnał przez ten sam, czy przez różne receptory. Doświadczenia współzawodnictwa z użyciem innych przedstawicieli rodziny TGF-β zostaną przeprowadzone dla określenia specyficzności. Niektóre spośród tych ligandów dostępne są w handlu, inne można otrzymać z Genetics Institute, Inc.

W doświadczeniach tych przebadane zostanie wiele różnych tkanek zarodkowych i dorosłych oraz linii komórkowych. Na podstawie specyficznej ekspresji GDF-8 w mięśniu szkieletowym oraz fenotypu myszy z nokautem GDF-8, wstępne badania skupiają się na użyciu do preparatyki błon i badań receptorów w zamrożonych skrawkach zarodkowej i dorosłej tkanki mięśniowej. Ponadto z zarodków po różnej liczbie dni od początku ciąży lub z komórek satelitarnych z dorosłych mięśni będą izolowane i hodowane mioblasty, zgodnie z opisem (Vivarelli i Cossu, Devel. Biol. 117: 319-325, 1986; Cossu i wsp., Cell Diff. 9: 357-368, 1980). Na tych pierwotnych liniach komórkowych po różnej liczbie dni hodowli przeprowadzone będą badania wiązania, zaś miejsca wiązania zostaną zlokalizowane przez autoradiografię tak, że można będzie stwierdzić kolokalizację miejsc wiązania z różnymi markerami miogenezy takimi, jak miozyna mięśniowa (Vivarelli i wsp., J. Cell Biol. 107: 2191-2197,

1988) oraz skorelować wiązanie ze stanem różnicowania komórki takim, jak tworzenie wielojądrzastych miotubul. Poza komórkami pierwotnymi, do poszukiwania receptorów użyje się linii komórkowych. W szczególności, na wstępie uwagę skupi się na trzech liniach komórkowych: C2C12, L6 i P19.

PL 210 158 B1

Mioblasty C2C12 i L6 różnicują się spontanicznie w hodowli i tworzą, w zależności od konkretnych warunków wzrostu, miotubule (Yaffe i Saxel, powyżej, 1977; Yaffe, powyżej, 1968). Komórki raka zarodkowego P19 można zaindukować do różnicowania w kierunku różnych typów komórek, w tym komórek mięśnia szkieletowego w obecności DMSO (Rudnicki i McBurney, Tertocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A practical approach (E.J. Robertson, IRL Press, Cambridge, 1987). Badania wiązania receptorów będą przeprowadzone w tych liniach komórkowych w różnych warunkach wzrostu i w różnych etapach różnicowania. Mimo iż wstępne badania skupią się na komórkach mięśniowych, inne tkanki i typy komórek zostaną również zbadane pod kątem obecności receptorów GDF-8 i GDF-11.

W tych badaniach wiązania użyty zostanie homodimer zrekombinowanego ludzkiego GDF-8 (rhGDF-8). RhGDF-8 wyrażano przy użyciu komórek CHO i oczyszczono do około 90% czystości. RhGDF-8 wykazywał oczekiwaną masę cząsteczkową 25 kDa do 27 kDa, a po redukcji redukowany był do monomeru 12 kDa. Przy użyciu wyznakowanego I-125 GDF-8 w oznaczeniu wiązania receptor-ligand, GDF-8 był wiązany przez dwie mioblastowe linie komórkowe L6 i G-8. Wiązanie to było specyficzne, gdyż niewyznakowany GDF-8 skutecznie współzawodniczył z wiązaniem wyznakowanego ligandu. Stała dysocjacji (Kd) wynosiła 370 pM, mioblasty L6 posiadają znaczną ilość (5000 receptorów/komórkę) białek wiążących powierzchnię komórki. GDF-11 (BMP-11) jest wysoce homologiczny (>90%) do GDF-8. Badania wiązania receptorów ujawniły, że GDF-8 i GDF-11 wiązały się z tym samym białkiem na powierzchni mioblastów L6. Istotne jest stwierdzenie, czy GDF-8 wiąże się ze znanym receptorem TGF-β. TGF-β nie współzawodniczył z wiązaniem GDF-8, co wskazuje na to, że receptor GDF-8 jest inny niż receptor TGF-β. Receptor GDF-8 nie był wyrażany przez wszystkie mioblastowe linie komórkowe, w tym przez cztery linie mioblastowe: C2C12, G7, MLB13MYC cl4 i BC3H1, które nie wiązały GDF-8.

Można uzyskać gen lub geny kodujące receptory GDF-8 i GDF-11. W pierwszym etapie na drodze do zrozumienia mechanizmu wywierania działań biologicznych przez GDF-8 i GDF-11 ważne jest sklonowanie genów kodujących ich receptory. Z powyższych doświadczeń jaśniej będzie wynikać, czy GDF-8 i GDF-11 wiążą się z tym samym receptorem, czy z różnymi receptorami. Uzyskanych też będzie wiele informacji dotyczących rozmieszczenia tych receptorów w różnych tkankach i typach komórek. Wykorzystując te informację do sklonowania genów receptorów wykorzysta się dwa różne podejścia.

W pierwszym podejściu wykorzystana zostanie strategia klonowania przez ekspresję. W istocie była to strategia użyta oryginalnie przez Mathews i Vale (Cell 65: 973-982, 1991) i Lin i wsp., (Cell 68:775-785, 1992) do sklonowania pierwszych receptorów aktywiny i TGF-β. Uzyskany zostanie wyselekcjonowany poli-A RNA z tkanki lub typu komórek, które wyrażają względnie najwięcej miejsc wiązania o wysokim powinowactwie, którego następnie użyje się do przygotowania biblioteki cDNA w ssaczym wektorze ekspresyjnym pcDNA-1, który zawiera promotor CMV i miejsce startu replikacji SV40. Bibliotekę wysieje się na szalki, zaś komórki z każdej szalki zbierze się razem w pożywce i zamrozi. Porcje każdej puli namnoży się w hodowli do izolacji DNA. Każdą osobną pulę wprowadzi się transfekcją przejściową do komórek COS w szkiełkach z komorami, a stransfekowane komórki będą inkubowane z wyznakowanym jodem GDF-8 lub GDF-11. Po odpłukaniu niezwiązanego białka miejsca wiązania ligandu będą uwidocznione przez autoradiografię. Po zidentyfikowaniu puli dającej pozytywny sygnał komórki z tej puli zostaną ponownie wysiane z mniejszą gęstością i procedura zostanie powtórzona. Pule dające pozytywny sygnał będą wysiane, a pojedyncze kolonie zostaną przereplikowane w uporządkowaną matrycę i ponownie przeanalizowane tak, jak to już opisywano (Wong i wsp., Science 228: 810-815, 1985).

Wstępnie do przeszukiwania użyte będą pule o wielkości 1500 kolonii. Dla upewnienia się, że w mieszaninie o takiej złożoności można zidentyfikować pozytywny klon, przeprowadzone zostanie doświadczenie kontrolne przy użyciu TGF-β i sklonowanego receptora typu II. Sekwencję kodującą receptor typu II TGF-β sklonuje się w wektorze pcDNA-1 i zmiesza transformowane tym konstruktem bakterie z bakteriami z naszego banku w różnych proporcjach, w tym 1:1500. DNA przygotowanym z takiej mieszaniny będą następnie transfekowane komórki COS, które będą inkubowane z wyznakowanym jodem TGF-β i uwidaczniane przez autoradiografię. Jeżeli przy stosunku 1:1500 zaobserwuje się pozytywny sygnał, przeszukiwane będą pule po 1500 klonów. W przeciwnym razie użyte zostaną pule mniejszych rozmiarów, odpowiadające proporcjom, dla których procedura jest dostatecznie czuła by zidentyfikować pozytywny sygnał w doświadczeniach kontrolnych.

PL 210 158 B1

Dla sklonowania receptorów GDF-8 i GDF-11 użyje się również drugiej, równoległej strategii, wykorzystując fakt, że większość zidentyfikowanych receptorów przedstawicieli nadrodziny TGF-β należy do rodziny przechodzących przez błonę kinaz serynowo-treoninowych (Massague i Weis-Garcia, jak wyżej, 1996). Ponieważ domeny cytoplazmatyczne tych receptorów wykazują pokrewieństwo sekwencji, zdegenerowane sondy PCR zostaną użyte do sklonowania wyrażanych w tkankach zawierających miejsca wiązania GDF-8 i GDF-11 przedstawicieli tej rodziny receptorów. W istocie takiego właśnie podejścia użyto do sklonowania większości przedstawicieli tej rodziny receptorów. Ogólna strategia polegać będzie na zaprojektowaniu zdegenerowanych starterów odpowiadających zachowywanym obszarom znanych receptorów, użyciu tych starterów w reakcji PCR na matrycy cDNA przygotowanego z odpowiednich próbek RNA (najprawdopodobniej z mięśnia szkieletowego), subklonowaniu produktów PCR i, ostatecznie, sekwencjonowaniu pojedynczych subklonów.

W miarę identyfikowania sekwencji, będą one wykorzystywane, jako sondy hybrydyzacyjne dla wyeliminowania powtarzających się klonów z dalszej analizy. Zidentyfikowane receptory zostaną następnie zbadane pod kątem zdolności do wiązania oczyszczonego GDF-8 i GDF-11. Ponieważ w takim przeszukiwaniu uzyskane zostaną wyłącznie krótkie produkty PCR, z bibliotek cDNA przygotowanych z odpowiedniej tkanki będą uzyskane klony cDNA pełnej długości dla każdego z receptorów, włączane do wektora pcDNA-1, transfekowane do komórek COS, zaś stransfekowane komórki badane pod kątem zdolności do wiązania wyznakowanego jodem GDF-8 lub GDF-11. Idealnie, każdy zidentyfikowany w tym przeszukiwaniu receptor będzie badany pod kątem zdolności wiązania tych ligandów. Liczba zidentyfikowanych receptorów może być jednak duża, zaś izolacja wszystkich cDNA pełnej długości i ich badanie może wymagać znacznego wysiłku. Niemal z pewnością niektóre ze zidentyfikowanych receprorów będą odpowiadać znanym receptorom, w ich przypadku uzyskanie klonów cDNA pełnej długości od innych badaczy lub namnażanie sekwencji kodującej przez PCR na podstawie opublikowanych sekwencji powinno być łatwe. Dla nowych sekwencji wyznaczy się na podstawie analizy typu Northern rozmieszczenie ich w tkankach, w pierwszej kolejności uwagę poświęci się tym receptorom, których wzór ekspresji najbardziej przypomina rozmieszczenie miejsc wiązania GDF-8 i/lub GDF-11 wyznaczone jak powyżej.

W szczególności wiadomo, że receptory te dzielą się na dwie klasy: typ I i typ II, które można rozróżnić na podstawie sekwencji, zaś dla pełnej aktywności niezbędne są oba typy. Niektóre ligandy nie mogą wiązać receptorów typu I w nieobecności receptorów typu II, podczas gdy inne są w stanie wiązać oba typy receptorów (Massague i Weis-Garcia, jak wyżej, 1996). Zarysowane powyżej doświadczenia z sieciowaniem powinny dać wskazówki, czy zarówno receptory typu I jak i typu II są zaangażowane w przekazywaniu sygnału GDF-8 i GDF-11. Jeżeli tak jest, istotnym będzie sklonowanie obu tych podtypów receptorów w celu pełnego zrozumienia, jak GDF-8 i GDF-11 przekazują swe sygnały. Ponieważ nie da się przewidzieć, czy receptor typu I jest zdolny do oddziaływania z GDF-8 i GDF-11 w nieobecności receptora typu II, receptor(y) typu II zostaną sklonowane w pierwszej kolejności. Dopiero po zidentyfikowaniu przynajmniej jednego receptora typu II dla tych ligandów podejmie się próbę zidentyfikowania receptorów typu I GDF-8 i GDF-11. Ogólna strategia polegać będzie na kotransfekcji receptora typu II z każdym spośród zidentyfikowanych w przeszukiwaniu przez PCR receptorów typu I, a następnie zbadaniu stransfekowanych komórek przez sieciowanie. Jeżeli receptor typu I jest częścią kompleksu receptorowego GDF-8 lub GDF-11, w stransfekowanych komórkach powinno się wykryć dwie zsieciowane cząsteczki receptora, jedną odpowiadającą receptorowi typu I, drugą zaś receptorowi typu II.

Poszukiwania receptorów GDF-8 i GDF-11 są dodatkowo utrudnione przez fakt, że przynajmniej jeden przedstawiciel nadrodziny TGF-β, mianowicie GDNF, zdolny jest do przekazywania sygnału za pośrednictwem zupełnie innego typu kompleksu receptorowego obejmującego składnik związany z GPI (GDNFR-alpha) oraz receptorową kinazę tyrozynową (c-ret; Trupp i wsp., Nature 381: 785-789, 1996; Durbec i wsp., Nature 381: 789-793, 1996; Treanor i wsp., Nature 382: 80-83, 1996; Jing i wsp.. Cell 85: 1113-1124, 1996). Mimo, że GDNF jest najodleglejszym przedstawicielem nadrodziny TGF-β, z pewnością jest możliwe, że inni przedstawiciele rodziny TGF-β mogą również przekazywać sygnał za pośrednictwem analogicznego systemu receptora. Jeżeli GDF-8 i GDF-11 rzeczywiście przekazują sygnał za pośrednictwem podobnego kompleksu receptora, wówczas podejście klonowania przez ekspresję powinno pozwolić na zidentyfikowanie przynajmniej składnika tego kompleksu związanego z GPI (w istocie GDNFR-alfa zidentyfikowano przy użyciu podejścia klonowania przez ekspresję). W przypadku GDNF podobieństwo fenotypów braku GDNF i c-ret u myszy zasugerowało, że c-ret jest potencjalnym receptorem GDNF.

PL 210 158 B1

P r z y k ł a d 14

Wytworzenie i charakteryzacja myszy z nokautem GDF-11

Fenotyp myszy z nokautem GDF-11 w kilku aspektach przypomina fenotyp myszy niosących delecję receptora niektórych przedstawicieli nadrodziny TGF-β, w tym receptora typu IIB aktywiny (Act RIIB). W celu określenia funkcji biologicznej GDF-11, gen GDF-11 rozbito przez homologiczną rekombinację w zarodkowych komórkach pnia.

Bibliotekę genomową myszy 129 SvJ przygotowano w wektorze lambda FIXII zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez Stratagene (La Jolla, CA). Strukturę genu GDF-11 wydedukowano na podstawię mapowania restrykcyjnego i częściowego sekwencjonowania klonów fagowych wyizolowanych z biblioteki. Wektory do przygotowania konstruktu do nokautu uzyskano dzięki uprzejmości Philipa Soriano i Kirka Thomasa. Dla zapewnienia, że uzyskane myszy będą całkowicie pozbawione funkcji GDF-11 usunięto cały dojrzały obszar C-końcowy i zastąpiono go kasetą neo. Komórki R1 ES transfekowano konstruktem do nokautu, poddano selekcji przy użyciu gancyklowiru (2 TM) i G418 (250 Tg/ml) i przeanalizowano przy użyciu metody Southerna.

Homologiczną rekombinację w genie GDF-11 zaobserwowano w 8/155 klonów ES podwójnie opornych na gancyklowir i G418. Po wstrzyknięciu kilku klonów z nokautem do blastocyst C57BL/6J uzyskano z jednego klonu ES chimery, które po skrzyżowaniu z samicami zarówno C57BL/6J jak i 129/SvJ dawały heterozygotyczne potomstwo. Krzyżówki hybrydowych heterozygot F1 C57BL/6J/129/SvJ dawały 49 dzikich (34%), 94 heterozygotycznych (66%) i zero homozygotycznych zmutowanych dorosłych zwierząt w potomstwie. Podobnie, w tle 129/SvJ nie stwierdzono homozygotycznych zwierząt z nokautem (32 zwierzęta dzikie (36%) i 56 zwierząt heterozygotycznych zmutowanych (64%)).

W celu wyznaczenia wieku, w którym ginęły mutanty homozygotyczne, mioty zarodków wyizolowanych z różnych etapów ciąży z heterozygotycznych samic, które skrzyżowano z heterozygotycznymi samcami, poddano analizie genotypu. We wszystkich zbadanych stadiach zarodkowych obecne były zarodki homozygotycznych mutantów z częstością w przybliżeniu odpowiadającą przewidywanej częstości 25%. Wśród nowonarodzonych myszy hybrydowych różne genotypy były również obecne w oczekiwanych Mendlowskich proporcjach 1:2:1 (24 +/+ (28%), 61 +/- (50%), i 28 -/- (23%)). Myszy z homozygotyczną mutacją rodziły się żywe i były zdolne do oddychania i przyjmowania pokarmu. Wszystkie mutanty homozygotyczne ginęły jednak w ciągu pierwszych 24 godzin po urodzeniu. Dokładna przyczyna śmierci była nieznana, letalność mogła być jednak związana z faktem, że nerki u mutantów homozygotycznych były albo silnie niedorozwinięte albo całkowicie nieobecne.

Zwierzęta z mutacją homozygotyczną były łatwo odróżnialne na podstawie silnie skróconych lub nieobecnych ogonów. W celu dalszego scharakteryzowania defektów ogona u tych zwierząt z mutacją homozygotyczną zbadano ich szkielety dla stwierdzenia stopnia zakłócenia kręgów ogonowych. Porównanie preparatów szkieletów dzikich i mutantów zarodków z późnych faz rozwoju i noworodków ujawniło jednak różnice nie tylko w obszarze ogonowym, ale także w wielu innych obszarach zwierzęcia. W nieomal wszystkich przypadkach, w których zaobserwowano różnice, nieprawidłowości wydawały się stanowić przemiany homeotyczne segmentów kręgowych, w których pewne segmenty zdawały się wykazywać morfologię typową dla segmentów poprzedzających. Przemiany te były wyraźne na całej długości szkieletu osiowego od obszaru szyjnego do ogonowego. Poza defektami widocznymi w szkielecie osiowym, pozostałe części szkieletu takie, jak czaszka i kości kończyn, wyglądały prawidłowo.

Przemiany kręgów w kręgi poprzedzające u zmutowanych nowonarodzonych zwierząt były najbardziej widoczne w obszarze piersiowym, w którym dramatycznie zwiększyła się liczba segmentów piersiowych (T). U wszystkich zbadanych dzikich myszy występował typowy wzór 13 kręgów piersiowych, z których każdy wiązał się z parą żeber. Myszy z mutacją homozygotyczną wykazywały natomiast uderzający przyrost liczby kręgów piersiowych. Wszystkie zbadane homozygotyczne mutanty miały 4 do 5 dodatkowych par żeber, dając w sumie 17 do 18, chociaż u ponad 1/3 tych zwierząt 18 żebro wyglądało na szczątkowe. Stąd segmenty, które normalnie odpowiadałyby segmentom lędźwiowym (L) L1 do L4 lub L5 wyglądały u zmutowanych zwierząt na zmienione w segmenty piersiowe.

Ponadto wyraźne były również przemiany w obszarze piersiowym, w których jedne kręgi piersiowe miały charakterystykę morfologiczną innych kręgów piersiowych. Przykładowo, u dzikich myszy pierwszych 7 par żeber łączy się z mostkiem, zaś pozostałych 6 pozostaje niepołączone, czyli wolne. U mutantów homozygotycznych wystąpiło zwiększenie liczby zarówno par żeber połączonych, jak i par żeber wolnych do odpowiednio 10-11 i 7-8. Tym samym, segmenty piersiowe T8, T9, T10, a w niektórych przypadkach nawet T11, które u dzikich zwierząt mają żebra wolne, zmieniły się u zwierząt zmutowanych tak, że nabrały charakterystyki typowej dla poprzedzających je segmentów piersiowych - obecności żeber połą40

PL 210 158 B1 czonych z mostkiem. Zgodnie z tym odkryciem, przejściowy wyrostek kolczysty i przejściowe wyrostki stawowe, które u dzikich zwierząt normalnie znajdują się na T10, u mutantów homozygotycznych zostały znalezione na T13. U niektórych zmutowanych zwierząt stwierdzono też dodatkowe przemiany. Przykładowo, u dzikich myszy żebra pochodzące z T1 normalnie dotykają górnej części mostka. U 2/23 zbadanych homozygotycznych mutantów hybrydowych i 2/3 homozygotycznych mutantów 129/SvJ, T2 był zmieniony dając w efekcie morfologię przypominającą T1; to znaczy, u tych zwierząt żebra pochodzące z T2 były wydłużone i dotykały górnej części mostka. W takich przypadkach, żebra pochodzące z T1 zdawały się zlewać z drugą parą żeber. Wreszcie, u 82% mutantów homozygotycznych, długi wyrostek kolczysty normalnie obecny na T2 przesunął się do pozycji T3. U niektórych innych mutantów homozygotycznych w innych pozycjach piersiowych widoczna była asymetryczna fuzja par żeber kręgowomostkowych.

Przemiany do odcinków poprzedzających nie ograniczały się do obszaru piersiowego. Najbardziej wysunięta do przodu z zaobserwowanych przemian zaszła na poziomie szóstego kręgu szyjnego (C6). U dzikich myszy C6 jest łatwo rozpoznawalny dzięki obecności dwóch guzków przednich po stronie brzusznej. U kilku myszy z homozygotyczną mutacją, mimo że jeden z tych dwóch guzków przednich znajdował się na C6, drugi znajdował się zamiast tego w pozycji C7. U tych myszy, zatem C7 zdaje się ulegać częściowej przemianie do morfologii przypominającej C6. Inny mutant homozygotyczny posiadał dwa guzki przednie na C7, lecz zachował jeden na C6, co odpowiada pełnej przemianie C7 w C6, lecz częściowej przemianie C6 do C5.

Przemiany w szkielecie osiowym sięgają również obszaru lędźwiowego. Podczas gdy dzikie zwierzęta normalnie mają jedynie 6 kręgów lędźwiowych, mutanty homozygotyczne miały od 8 do 9. Co najmniej 6 kręgów lędźwiowych u mutantów musiało pochodzić z segmentów, które normalnie wytworzyłyby kręgi krzyżowe i ogonowe, gdyż opisane powyżej dane sugerują, że 4 do 5 segmentów lędźwiowych przemieniło się w segmenty piersiowe. Myszy z mutacją homozygotyczną miały zatem w sumie 33-34 kręgów przedkrzyżowych, w porównaniu z 26 kręgami przedkrzyżowymi normalnie obecnymi u myszy dzikich. Najczęstszymi wzorami kręgów przedszyjnych były C7/T18/L8 i C7/T18/L9 u muszy zmutowanych w porównaniu z C7/T13/L6 u myszy dzikich. Obecność dodatkowych kręgów przedkrzyżowych u zmutowanych zwierząt była oczywista nawet bez szczegółowego badania szkieletu, gdyż pozycja tylnich kończyn względem przednich była przesunięta do tyłu o 7 do 8 segmentów.

Mimo, że kręgi krzyżowe i ogonowe u myszy z mutacją homozygotyczną były również zmienione, dokładna natura tych zmian nie była łatwa do zidentyfikowania. U dzikich myszy segmenty krzyżowe S1 i S2 typowo posiadają, w porównaniu z S3 i S4, szerokie wyrostki poprzeczne. U mutantów nie dawało się zidentyfikować kręgów S1 i S2. zamiast tego zwierzęta zmutowane posiadały kilka kręgów, które zdawały się mieć morfologię przypominającą S3. Ponadto, wyrostki poprzeczne wszystkich 4 kręgów krzyżowych są normalnie zlane ze sobą, chociaż u noworodków często obserwuje się jedynie fuzję pierwszych trzech kręgów. Jednakże u mutantów homozygotycznych wyrostki poprzeczne kręgów krzyżowych były zwykle niepołączone. W końcowym obszarze ogonowym wszystkie zmutowane zwierzęta miały również poważnie zniekształcone kręgi ze znaczącą fuzją chrząstki. Mimo, iż zasięg fuzji utrudniał policzenie całkowitej liczby kręgów w obszarze ogonowym, u kilku zwierząt naliczono do 15 wyrostków poprzecznych. Nie dało się stwierdzić, czy odpowiadały one u mutantów kręgom krzyżowym, czy ogonowym, gdyż kryteriów morfologicznych rozróżniania S4 od kręgów ogonowych nie dało się ustalić u noworodków nawet dla zwierząt dzikich. Niezależnie od ich tożsamości, całkowita liczba kręgów w tym obszarze była znacząco zredukowana w porównaniu z prawidłową liczbą około 30. Tak więc, mimo ze mutanty posiadały znacząco więcej kręgów piersiowych i lędźwiowych niż zwierzęta dzikie, całkowita liczba segmentów była u mutantów zredukowana ze względu na skrócenie ogonów.

Myszy heterozygotyczne również wykazywały nieprawidłowości w szkielecie osiowym, chociaż ich fenotyp był znacznie łagodniejszy niż u myszy homozygotycznych. Najbardziej oczywistą nieprawidłowością u myszy heterozygotycznych była obecność dodatkowego segmentu piersiowego ze związaną z nim parą żeber. Przemiana ta była obecna u każdego zbadanego zwierzęcia heterozygotycznego, w każdym przypadku dodatkowa para żeber była połączona z mostkiem. Tak więc T8, którego żebro normalnie nie dotyka mostka wydaje się ulegać przemianie w kierunku charakterystyki morfologicznej poprzedzających go kręgów piersiowych, zaś L1 wydaje się ulegać przemianie w kierunku charakterystyki morfologicznej tylnich kręgów piersiowych. U myszy heterozygotycznych objawiały się też w różnym stopniu inne nieprawidłowości wskazujące na przemiany w kierunku segmentów poprzedzających. Należały do nich przesunięcie długiego wyrostka kolczystego charakterystycznego dla T2 o jeden segment

PL 210 158 B1 do T3, przesunięcie wyrostków stawowych i kolczystych z T10 do T11, przesunięcie guzka przedniego z C6 do C7 oraz przemiana T2 w T1, gdzie żebro związane z T2 dotykało górnej części mostka.

Dla zrozumienia podstawy nieprawidłowości tworzenia wzoru osiowego widocznych w myszach z mutacją GDF-11 badaniom poddano zmutowane zarodki wyizolowane na różnych etapach rozwoju i porównano je z zarodkami dzikimi. Na podstawie ogólnej obserwacji morfologii, zarodki mutantów homozygotycznych wyizolowane przed 9,5 dniem ciąży nie były łatwo odróżnialne od odpowiednich zarodków dzikich. W szczególności, liczba somitów obecnych w którymkolwiek momencie rozwoju była identyczna u zarodków zmutowanych i dzikich, co sugeruje, że tempo powstawania somitów nie było zmienione u mutantów. Do dnia 10,5-11,5 po zapłodnieniu zarodki mutantów mogły był łatwo odróżnione od zarodków dzikich na podstawie przesunięcia do tyłu tylniej kończyny o 7-8 somitów. Na tym etapie łatwo zauważalne były też nieprawidłowości w rozwoju ogona. Zebrane razem, dane te sugerują, że nieprawidłowości obserwowane w zmutowanych szkieletach przedstawiają właściwe przemiany tożsamości segmentów, nie zaś wstawienie dodatkowych segmentów ze względu na, przykładowo, zwiększone tempo powstawania somitów.

Wiadomo, że zmiany ekspresji genów zawierających blok homeo powodują zmiany rozwojowe u Drosophila i u kręgowców. W celu sprawdzenia, czy wzór ekspresji genów Hox (genów zawierających blok homeo u kręgowców) uległ zmianie u mutantów pozbawionych GDF-11 zbadano wzór ekspresji trzech typowych genów Hox: Hoxc-6, Hoxc-8 i Hoxc-11 w dniu 12,5 po zapłodnieniu w zarodkach dzikich, heterozygotycznych i zmutowanych homozygotycznych metodą hybrydyzacji in situ całego skrawka. Wzór ekspresji Hoxc-6 w dzikich zarodkach obejmował zawiązki kręgów 8-15, odpowiadające segmentom piersiowym T1-T8. Jednakże u mutantów homozygotycznych wzór ekspresji Hoxc-6 był przesunięty do tyłu i rozszerzony do zawiązków kręgów 9-18 (T2-T11). Podobne przesunięcie zaobserwowano dla sondy Hoxc-8. W dzikich zarodkach Hoxc-8 ulegał ekspresji w zawiązkach kręgów 13-18 (T6-T11), lecz w zarodkach mutantów homozygotycznych Hoxc-8 ulegał ekspresji w zawiązkach kręgów 14-22 (T7-T15). Ekspresja Hoxc-11 była również przesunięta do tyłu w taki sposób, że tylnia granica ekspresji zmieniła się od zawiązku kręgu 28 w zarodkach dzikich do zawiązka kręgu 36 z zmutowanych zarodkach. (Zauważmy, że ze względu na to, że pozycja tylniej kończyny również jest przesunięta do tyłu, wzór ekspresji Hoxc-11 względem kończyn tylnich w zarodkach dzikich i zmutowanych wydaje się podobny). Dane te dostarczają kolejnych dowodów na to, że nieprawidłowości szkieletowe obserwowane u zwierząt zmutowanych stanowią zmiany homeotyczne.

Fenotyp myszy z mutacją GDF-11 sugeruje, że GDF-11 funkcjonuje wcześnie podczas rozwoju zarodkowego, jako globalny regulator tworzenia osi podłużnej. Dla wstępnego zbadania mechanizmu funkcjonowania GDF-11 zbadano wzór ekspresji GDF-11 we wczesnych zarodkach myszy metodą hybrydyzacji in situ całego skrawka. W tych etapach rozwoju główne obszary ekspresji GDF-11 odpowiadały dokładnie znanym obszarom, w których wytwarzane są komórki mezodermy. Ekspresja GDF-11 była najwcześniej wykrywana w dniu 8,25-8,5 po zapłodnieniu (8-10 somitów) w obszarze smugi pierwotnej, w którym to obszarze wpuklające się komórki tworzą mezodermę rozwijającego się zarodka. Ekspresja w smudze pierwotnej utrzymywała się w dniu 8,75, lecz do dnia 9,5 po zapłodnieniu, kiedy to ogonowa część zarodka zastępuje smugę pierwotną w charakterze źródła nowych komórek mezodermalnych, ekspresja GDF-11 przeniosła się do ogonowej części zarodka. Tak więc w tych wczesnych etapach GDF-11 wydaje się być syntetyzowany w tym obszarze rozwijającego się zarodka, w którym nowe komórki mezodermalne powstają i, przypuszczalnie, uzyskują swą tożsamość pozycyjną.

Fenotyp myszy z nokautem GDF-11 w niektórych aspektach przypominał fenotyp myszy niosących delecję receptora niektórych przedstawicieli nadrodziny TGF-β - receptora aktywiny typu IIB (Act RIIB). Tak, jak w przypadku myszy z nokautem GDF-11, myszy z nokautem Act RIIB posiadają dodatkową parę żeber i wykazują szereg defektów związanych z nerkami od niedorozwoju aż do kompletnego braku nerek. Podobieństwo fenotypów tych myszy nasuwa możliwość, że Act RIIB może być receptorem GDF-11. Act RIIB nie może jednak być jedynym receptorem GDF-11, gdyż fenotyp myszy z nokautem GDF-11 jest bardziej poważny, niż fenotyp myszy z nokautem Act RIIB. Przykładowo, gdy zwierzęta z nokautem GDF-11 posiadają 4-5 dodatkowych par żeber i wykazują zmiany homeotyczne wzdłuż całego szkieletu osiowego, zwierzęta z nokautem Act RIIB posiadają tylko 3 dodatkowe pary żeber i nie wykazują zmian na innych odcinkach osiowych. Dodatkowo, dane wykazują, że defekty nerek w myszach z nokautem GDF-11 są również poważniejsze niż w myszach z nokautem Act RIIB. Myszy z nokautem Act RIIB wykazują defekty w tworzeniu osi poprzecznej takie, jak izomeria płuc oraz szereg defektów serca, których nie zaobserwowaliśmy dotąd u myszy z nokautem GDF-11. Act

PL 210 158 B1

RIIB może wiązać aktywiny i niektóre BMP, jednak żadna z myszy z nokautem tych ligandów nie wykazywała defektów w tworzeniu osi poprzecznej.

Jeżeli GDF-11 rzeczywiście działa bezpośrednio na komórki mezodermy nadając im tożsamość pozycyjną, wówczas przedstawione tu dane zgodne są z krótkozasięgowym lub morfogenowym modelem działania GDF-11. To znaczy, że GDF-11 może działać na prekursory mezodermalne dla wyznaczenia wzorów ekspresji genów Hox, gdy komórki te tworzą się w obszarze ekspresji GDF-11 lub też GDF-11 wytwarzany na przednim końcu zarodka dyfunduje tworząc gradient morfogenowy. Niezależnie od mechanizmu działania GDF-11, fakt że ogólne tworzenie wzoru różnicowania przód-tył wciąż zachodzi u zwierząt z nokautem GDF-11 sugeruje, że GDF-11 nie musi być jedynym regulatorem różnicowania przód-tył. Tym niemniej jasne jest, że GDF-11 odgrywa istotną rolę jako globalny regulator różnicowania osi podłużnej i że dalsze badanie tej cząsteczki doprowadzi do uzyskania nowych ważnych informacji na temat tego, jak ustanawiana jest tożsamość pozycyjna wzdłuż osi przód-tył w zarodku kręgowca.

Podobnych fenotypów oczekuje się w zwierzętach z nokautem GDF-8. Przykładowo, oczekuje się, że zwierzęta z nokautem GDF-8 będą miały zwiększoną liczbę żeber, defekty nerek i różnice anatomiczne w porównaniu z dzikimi.

PL 210 158 B1

LISTA SEKWENCJI <110> TKE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE Lee, Se-Jin

McPherron, Alexandra C.

<120> PEPTYDY Z PROMIOSTATYNY I SPOSOBY ICH ZASTOSOWANIA <130> JHU112O-11MX <150> PCT/US 01/23510 <151> 2001-07-26 <150> 09/628,112 <151> 2000-07-27 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1

<211> 2743 <212> DNA <213> Homo i	sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (59) .	.. (1183)
<400> 1
aagaaaagta aaaggaagaa acaagaacaa gaaaaaagat tatattgatt ttaaaatc
atg caa aaa	ctg caa ctc tgt gtt tat att tac ctg ttt atg ctg att
106
Met Gin Lys	Leu Gin Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile
1	5 10 15
gtt gct ggt	cca gtg gat eta aat gag aac agt gag caa aaa gaa aat
154
Val Ala Gly	Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn
	20 25 30
gtg gaa aaa	gag ggg ctg tgt aat gca tgt act tgg aga caa aac act
2C2
Val Glu Lys	Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gin Asn Thr
35	40 45
aaa tet tca	aga ata gaa gcc att aag ata caa atc ctc agt aaa ctt
250
Lys Ser Ser	Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gin Ile Leu Ser Lys Leu
50	55 60
cgt ctg gaa	aca gct cct aac atc agc aaa gat gtt ata aga caa ctt
298
Arg Leu Glu	Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gin Leu
65	70 75 80
tta ccc aaa	gct cct cca ctc cgg gaa ctg att gat cag tat gat gtc
346
Leu Pro Lys	Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gin Tyr Asp Val
	85 90 95
cag agg gat	gac agc agc gat ggc tet ttg gaa gat gac gat tat cac
394
Gin Arg Asp	Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

PL 210 158 B1

Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 atg caa gtg gat gga aaa ccc aaa tgt tgc ttc ttt aaa ttt agc tct 490

Met Gin Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser

130 135 140 aaa ata caa tac aat aaa gta gta aag gcc caa eta tgg ata tat ttg 538

Lys Ile Gin Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gin Leu Trp Ile Tyr Leu

145 150 155 160 aga ccc gtc gag act cct aca aca gtg ttt gtg caa atc ctg aga ctc 586

Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gin Ile Leu Arg Leu

165 170 175 atc aaa cct atg aaa gac ggt aca agg tat act gga atc ega tct ctg 634

Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu

180 185 190 aaa ctt gac atg aac cca ggc act ggt att tgg cag agc att gat gtg 682

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gin Ser Ile Asp Val

195 200 205 aag aca gtg ttg caa aat tgg ctc aaa caa cct gaa tcc aac tta ggc 730

Lys Thr Val Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly

210 215 220 att gaa ata aaa gct tta gat gag aat ggt cat gat ctt gct gta acc 778

Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr

225 230 235 240 ttc cca gga cca gga gaa gat ggg ctg aat ccg ttt tta gag gtc aag 826

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys

245 250 255 gta aca gac aca cca aaa aga tcc aga agg gat ttt ggt ctt gac tgt 874

Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys

260 265 270 gat gag cac tea aca gaa tea ega tgc tgt cgt tac cct eta act gtg 922

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val

275 280 285 gat ttt gaa gct ttt gga tgg gat tgg att atc gct cct aaa aga tat 970

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr

290 295 300 aag gcc aat tac tgc tct gga gag tgt gaa ttt gta ttt tta caa aaa 1018

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gin Lys ³⁰⁵ 310 315 320 tat cct cat act cat ctg gta cac caa gca aac ccc aga ggt tea gca 1066

Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala

325 330 335 ggc cct tgc tgt act ccc aca aag atg tct cca att aat atg eta tat 1114

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr

340 345 350 ttt aat ggc aaa gaa caa ata ata tat ggg aaa att cca gcg atg gta 1162

Phe Asn Gly Lys Glu Gin Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val

PL 210 158 B1

355 360 365 gta gac cgc tgt ggg tgc tca tgagatttat attaagcgtt cataacttcc 1213

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

370 375 taaaacatgg aaggttttcc cctcaacaat tttgaagctg tgaaattaag taccacaggc 1273 tataggccta gagtatgcta cagtcactta agcataagct acagtatgta aactaaaagg 1333 gggaatatat gcaatggttg gcatttaacc atccaaacaa atcatacaag aaagttttat 1393 gatttccaga gtttttgagc tagaaggaga tcaaattaca tttatgttcc tatatattac 1453 aacatcggcg aggaaatgaa agcgattctc cttgagttct gatgaattaa aggagtatgc 1513 tttaaagtct atttctttaa agttttgttt aatatttaca gaaaaatcca catacagtat 1573 tggtaaaatg caggattgtt atataccatc attcgaatca tccttaaaca cttgaattta 1633 tattgtatgg tagtatactt ggtaagataa aattccacaa aaatagggat ggtgcagcat 1693 atgcaatttc cattcctatt ataattgaca cagtacatta acaatccatg ccaacggtgc 1753 taatacgata ggctgaatgt ctgaggctac caggtttatc acataaaaaa cattcagtaa 1813 aatagtaagt ttctcttttc ttcaggtgca ttttcctaca cctccaaatg aggaatggat 1873 tttctttaat gtaagaagaa tcatttttct agaggttggc tttcaattct gtagcatact 1933 tggagaaact gcattatctt aaaaggcagt caaatggtgt ttgtttttat caaaatgtca 1993 aaataacata cttggagaag tatgtaattt tgtctttgga aaattacaac actgcctttg 2053 caacactgca gtttttatgg taaaataata gaaatgatcg actctatcaa tattgtataa 2113 aaagactgaa acaatgcatt tatataatat gtatacaata ttgttttgta aataagtgtc 2173 tcctttttta tttactttgg tatattttta cactaaggac atttcaaatt aagtactaag 2233 gcacaaagac atgtcatgca tcacagaaaa gcaactactt atatttcaga gcaaattagc 2293 agattaaata gtggtcttaa aactccatat gttaatgatt agatggttat attacaatca 2353 ttttatattt ttttacatga ttaacattca cttatggatt catgatggct gtataaagtg 2413 aatttgaaat ttcaatggtt tactgtcatt gtgtttaaat ctcaacgttc cattatttta 2473 atacttgcaa aaacattact aagtatacca aaataattga ctctattatc tgaaatgaag 2533 aataaactga tgctatctca acaataactg ttacttttat tttataattt gataatgaat 2593 atatttctgc atttatttac ttctgttttg taaattggga ttttgttaat caaatttatt 2653 gtactatgac taaatgaaat tatttcttac atctaatttg tagaaacagt ataagttata 2713 ttaaagtgtt ttcacatttt tttgaaagac 2743 <210> 2 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met

Gin

Lys

Leu

Gin

Leu

Cys

Val

Tyr

Ile

Tyr

Leu

Phe

Met

Leu

Ile

1

5

10

15

Val

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Asn

Ser

Glu

Gin

Lys

Glu

Asn

20

25

30

Val

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Thr

Trp

Arg

Gin

Asn

Thr

35

40

45

Lys

Ser

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

50

55

60

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Lys

Asp

Val

Ile

Arg

Gin

Leu

65

70

75

80

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val

85

90

95

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Ile

Ile

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Phe

Leu

115

120

125

Met

Gin

Val

Asp

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

Lys

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys

val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Pro

Val

Glu

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

Ile

Leu

Arg

Leu

165

170

175

PL 210 158 B1

Ile

Lys

Pro

Met 180

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg 185

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg 190

Ser

Leu

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Val

195

200

205

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly

210

215

220

Ile

Glu

Ile

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225

230

235

240

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Lys

245

250

255

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

325

330

335

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

Val

355

360

365

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 375 <210> 3 <211> 2676 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (104)...(1231) <400> 3 gtctctcgga cggtacatgc actaatattt cacttggcat tactcaaaag caaaaagaag 60 aaataagaac aagggaaaaa aaaagattgt gctgattttt aaa atg atg caa aaa 115

Met Met Gin Lys 1

ctg Leu 5

caa Gin

atg Met

tat Tyr

gtt Val

tat Tyr 10

att Ile

tac Tyr

ctg Leu

ttc Phe

atg Met 15

ctg Leu

att Ile

get Ala

get Ala

ggc Gly 20

163

cca

gtg

gat

eta

aat

gag

ggc

agt

gag

aga

gaa

gaa

aat

gtg

gaa

aaa

211

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Gly

Ser

Glu

Arg

Glu

Glu

Asn

Val

Glu

Lys

25

30

35

gag

ggg

ctg

tgt

aat

gca

tgt

gcg

tgg

aga

caa

aac

acg

agg

tac

tcc

259

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Ala

Trp

Arg

Gin

Asn

Thr

Arg

Tyr

Ser

40

45

50

aga

ata

gaa

gee

ata

aaa

att

caa

atc

ctc

agt

aag

ctg

ege

ctg

gaa

307

Arg

Ile

Glu

Ala

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

Leu

Glu

55

60

65

aca

get

cct

aac

atc

age

aaa

gat

get

ata

aga

caa

ctt

ctg

cca

aga

355

Thr

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Lys

Asp

Ala

Ile

Arg

Gin

Leu

Leu

Pro

Arg

70

75

80

PL 210 158 B1 aca ccc aag agg tcc cgg aga gac ttt ggg ctt gac tgc gat gag cac

Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His

265 270 275 tcc acg gaa tcc cgg tgc tgc cgc tac ccc ctc acg gtc gat ttt gaa

Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu

280 285 290 gcc ttt gga tgg gac tgg att atc gca ccc aaa aga tat aag gcc aat

Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn

295 300 305 tac tgc tca gga gag tgt gaa ttt gtg ttt tta caa aaa tat ccg cat

Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His

310 315 320 act cat ctt gtg cac caa gca aac ccc aga ggc tca gca ggc cct tgc

Thr His Leu Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys

325 330 335 340 tgc act ccg aca aaa atg tet ccc att aat atg eta tat ttt aat ggc

Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly

345 350 355 aaa gaa caa ata ata tat ggg aaa att cca gcc atg gta gta gac cgc

Lys Glu Gin Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg

360 365 370 tgt ggg tgc tca tgagctttgc attaggttag aaacttccca agtcatggaa Cys Gly Cys Ser

375 ggtcttcccc tcaatttcga aactgtgaat tcaagcacca caggctgtag geettgagta tgctctagta acgtaagcac aagctacagt gtatgaacta aaagagagaa tagatgcaat ggttggcatt caaccaccaa aataaaccat actataggat gttgtatgat ttccagagtt tttgaaatag atggagatca aattacattt atgtccatat atgtatatta caactacaat ctaggcaagg aagtgagagc acatcttgtg gtctgctgag ttaggagggt atgattaaaa ggtaaagtct tatttcctaa cagtttcact taatatttac agaagaatct atatgtagcc tttgtaaagt gtaggattgt tatcatttaa aaacatcatg tacacttata tttgtattgt atacttggta agataaaatt ccacaaagta ggaatggggc ctcacataca cattgccatt cctattataa ttggacaatc caccacggtg ctaatgcagt gctgaatggc tcctactgga cctctcgata gaacactcta caaagtacga gtctctctct cccttccagg tgcatctcca cacacacagc actaagtgtt caatgcattt tctttaagga aagaagaatc tttttttcta gaggtcaact ttcagtcaac tctagcacag cgggagtgac tgctgcatct taaaaggcag ccaaacagta ttcatttttt aatctaaatt tcaaaatcac tgtctgcctt tatcacatgg caattttgtg gtaaaataat ggaaatgact ggttctatca atattgtata aaagactctg aaacaattac atttatataa tatgtataca atattgtttt gtaaataagt gtctcctttt atatttaett tggtatattt ttacactaat gaaatttcaa atcattaaag tacaaagaca tgtcatgtat cacaaaaaag gtgactgctt etattteaga gtgaattagc agatteaata gtggtcttaa aactctgtat gttaagatta gaaggttata ttacaatcaa tttatgtatt ttttacatta tcaacttatg gtttcatggt ggctgtatct atgaatgtgg ctcccagtca aatttcaatg ccccaccatt ttaaaaatta caagcattac taaacatacc aacatgtatc taaagaaata caaatatggt atctcaataa cagctacttt tttattttat aatttgacaa tgaatacatt tcttttattt acttcagttt tataaattgg aactttgttt atcaaatgta ttgtactcat agctaaatga aattatttct tacataaaaa tgtgtagaaa ctataaatta aagtgttttc acatttttga aaggc <210> 4 <211> 376

931

979

1027

1075

1123

1171

1219

1271

1331

1391

1451

1511

1571

1631

1691

1751

1811

1871

1931

1991

2051

2111

2171

2231

2291

2351

2411

2471

2531

2591

2651

2676

PL 210 158 B1

gcg Ala 85

cct Pro

cca Pro

ctc Leu

cgg Arg

gaa Glu 90

ctg Leu

atc Ile

gat Asp

cag Gin

tac Tyr 95

gac Asp

gtc Val

cag Gin

agg Arg

gat Asp 100

403

gac

age

agt

gat

ggc

tct

ttg

gaa

gat

gac

gat

tat

cac

gct

acc

acg

451

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly 105

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp 110

Asp

Tyr

His

Ala

Thr 115

Thr

gaa

aca

atc

att

acc

atg

cct

aca

gag

tct

gac

ttt

eta

atg

caa

gcg

499

Glu

Thr

Ile

Ile 120

Thr

Met

Pro

Thr

Glu 125

Ser

Asp

Phe

Leu

Met 130

Gin

Ala

gat

ggc

aag

ccc

aaa

tgt

tgc

ttt

ttt

aaa

ttt

age

tct

aaa

ata

cag

547

Asp

Gly

Lys 135

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe 140

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser 145

Lys

Ile

Gin

tac

aac

aaa

gta

gta

aaa

gcc

caa

ctg

tgg

ata

tat

ctc

aga

ccc

gtc

595

Tyr

Asn 150

Lys

Val

Val

Lys

Ala 155

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr 160

Leu

Arg

Pro

Val

aag

act

cct

aca

aca

gtg

ttt

gtg

caa

atc

ctg

aga

ctc

atc

aaa

ccc

643

Lys 165

Thr

Pro

Thr

Thr

Val 170

Phe

Val

Gin

Ile

Leu 175

Arg

Leu

Ile

Lys

Pro 180

atg

aaa

gac

ggt

aca

agg

tat

act

gga

atc

ega

tct

ctg

aaa

ctt

gac

691

Met

Lys

Asp

Gly

Thr 185

Arg

Tyr

Thr

Gly

Ile 190

Arg

Ser

Leu

Lys

Leu 195

Asp

atg

age

cca

ggc

act

ggt

att

tgg

cag

agt

att

gat

gtg

aag

aca

gtg

739

Met

Ser

Pro

Gly 200

Thr

Gly

Ile

Trp

Gin 205

Ser

Ile

Asp

Val

Lys 210

Thr

Val

ttg

caa

aat

tgg

ctc

aaa

cag

cct

gaa

tcc

aac

tta

ggc

att

gaa

atc

787

Leu

Gin

Asn 215

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro 220

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly 225

Ile

Glu

Ile

aaa

gct

ttg

gat

gag

aat

ggc

cat

gat

ctt

gct

gta

acc

ttc

cca

gga

835

Lys

Ala 230

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly 235

His

Asp

Leu

Ala

Val 240

Thr

Phe

Pro

Gly

cca

gga

gaa

gat

ggg

ctg

aat

ccc

ttt

tta

gaa

gtc

aag

gtg

aca

gac

883

Pro 245

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu 250

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu 255

Val

Lys

Val

Thr

Asp 260

aca

ccc

aag

agg

tcc

cgg

aga

gac

ttt

ggg

ctt

gac

tgc

gat

gag

cac

931

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser 265

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly 270

Leu

Asp

Cys

Asp

Glu 275

His

tcc

acg

gaa

tcc

cgg

tgc

tgc

cgc

tac

ccc

ctc

acg

gtc

gat

ttt

gaa

979

Ser

Thr

Glu

Ser 280

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr 285

Pro

Leu

Thr

Val

Asp 290

Phe

Glu

gcc

ttt

gga

tgg

gac

tgg

att

atc

gca

ccc

aaa

aga

tat

aag

gcc

aat

1027

Ala

Phe

Gly 295

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile 300

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr 305

Lys

Ala

Asn

tac

tgc

tea

gga

gag

tgt

gaa

ttt

gtg

ttt

tta

caa

aaa

tat

ccg

cat

1075

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

310 315 320

PL 210 158 B1

His

Ala

Thr 115

Thr

Glu

Thr

Ile

Ile 12 0

Thr

Met

Pro

Thr

Glu 125

Ser

Asp

Phe

Leu

Met

Gin

Ala

Asp

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

130

135

140

Ser

Lys

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

145

150

155

160

Leu

Arg

Pro

Val

Lys

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

Ile

Leu

Arg

165

170

175

Leu

Ile

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg

Ser

180

185

190

Leu

Lys

Leu

Asp

Met

Ser

Pro

Gly

Thr

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

195

200

205

Val

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

210

215

220

Gly

Ile

Glu

Ile

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

225

230

235

240

Thr

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

245

250

255

Lys

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

260

265

270

Cys

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

275

280

285

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

290

295

300

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

305

310

315

320

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

325

330

335

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

340

345

350

Tyr

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

355

360

365

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 375 <210> 5 <211> 1131 <212> DNA <213> Rattus norvegicus

<220> <221> CDS <222> (1) . . .

.(1128)

<400> 5 atg att

caa

aaa

ccg

caa

atg

tat

gtt

tat

att

tac

ctg

ttt

gtg

ctg

Met Ile

Gin

Lys

Pro

Gin

Met

Tyr

Val

Tyr

Ile

Tyr

Leu

Phe

Val

Leu

1

5

10

15

att gct

gct

ggc

cca

gtg

gat

eta

aat

gag

gac

agt

gag

aga

gag

gcg

Ile Ala

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Asp

Ser

Glu

Arg

Glu

Ala

20

25

30

aat gtg

gaa

aaa

gag

ggg

ctg

tgt

aat

gcg

tgt

gcg

tgg

aga

caa

aac

Asn Val

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Ala

Trp

Arg

Gin

Asn

35

40

45

aca agg

tac

tcc

aga

ata

gaa

gcc

ata

aaa

att

caa

atc

ctc

agt

aaa

Thr Arg

Tyr

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

55 60

PL 210 158 B1

ctc Leu 65

cgc Arg

ctg Leu

gaa Glu

aca Thr

gcg Ala 70

cct Pro

aac Asn

atc Ile

agc Ser

aaa Lys 75

gat Asp

gct Ala

ata Ile

aga Arg

caa Gin 80

240

ctt

ctg

ccc

aga

gcg

cct

cca

ctc

cgg

gaa

ctg

atc

gat

cag

tac

gac

288

Leu

Leu

Pro

Arg

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp

90 95 gtc cag agg gat gac agc agt gac ggc tet ttg gaa gat gac gat tat 336

Val Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr

100 105 110 cac gct acc acg gaa aca atc att acc atg cct acc gag tet gac ttt 384

His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe

115 120 125

eta Leu

atg Met 130

caa Gin

gcg Ala

gat Asp

gga Gly

aag Lys 135

ccc Pro

aaa Lys

tgt Cys

tgc Cys

ttt Phe 140

ttt Phe

aaa Lys

ttt Phe

agc Ser

432

tet

aaa

ata

cag

tac

aac

aaa

gtg

gta

aag

gcc

cag

ctg

tgg

ata

tat

480

Ser

Lys

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

145

150

155

160

ctg

aga

gcc

gtc

aag

act

cct

aca

aca

gtg

ttt

gtg

caa

atc

ctg

aga

528

Leu

Arg

Ala

Val

Lys

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

Ile

Leu

Arg

165

170

175

ctc

atc

aaa

ccc

atg

aaa

gac

ggt

aca

agg

tat

acc

gga

atc

ega

tet

576

Leu

Ile

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg

Ser

180

185

190

ctg

aaa

ctt

gac

atg

agc

cca

ggc

act

ggt

att

tgg

cag

agt

att

gat

624

Leu

Lys

Leu

Asp

Met

Ser

Pro

Gly

Thr

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

195

200

205

gtg

aag

aca

gtg

ttg

caa

aat

tgg

ctc

aaa

cag

cct

gaa

tcc

aac

tta

672

Val

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

210

215

220

ggc

att

gaa

atc

aaa

gct

ttg

gat

gag

aat

ggg

cat

gat

ctt

gct

gta

720

Gly

Ile

Glu

Ile

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

225

230

235

240

acc

ttc

cca

gga

cca

gga

gaa

gat

ggg

ctg

aat

ccc

ttt

tta

gaa

gtc

768

Thr

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

245

250

255

aaa

gta

aca

gac

aca

ccc

aag

agg

tcc

cgg

aga

gac

ttt

ggg

ctt

gac

816

Lys

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

260

265

270

tgc

gat

gaa

cac

tcc

acg

gaa

tcg

cgg

tgc

tgt

cgc

tac

CCC

ctc

acg

864

Cys

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

275

280

285

gtc

gat

ttc

gaa

gcc

ttt

gga

tgg

gac

tgg

att

att

gca

ccc

aaa

aga

912

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

290

295

300

tat

aag

gct

aat

tac

tgc

tet

gga

gag

tgt

gaa

ttt

gtg

ttc

tta

caa

960

PL 210 158 B1

Tyr 305

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys 310

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu 315

Phe

Val

Phe

Leu

Gin 320

aaa

tat

ccg

cat

act

cat

ctt

gtg

cac

caa

gca

aac

ccc

aga

ggc

tcg

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

325

330

335

gca

ggc

cct

tgc

tgc

acg

cca

aca

aaa

atg

tct

ccc

att

aat

atg

eta

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

340

345

350

tat

ttt

aat

ggc

aaa

gaa

caa

ata

ata

tat

ggg

aaa

att

cca

gcc

atg

Tyr

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

355

360

365

gta

gta

gac

cgg

tgt

ggg

tgc

tcg

tga

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370

375

c210> 6 <211> 376 <212> PRT <213> Rattus

; norvegicus

<400> 6

Met

Ile

Gin

Lys

Pro

Gin

Met

Tyr

Val

Tyr

Ile

Tyr

Leu

Phe

Val

Leu

1

5

10

15

Ile

Ala

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Asp

Ser

Glu

Arg

Glu

Ala

20

25

30

Asn

Val

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Ala

Trp

Arg

Gin

Asn

35

40

45

Thr

Arg

Tyr

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

50

55

60

Leu

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Lys

Asp

Ala

Ile

Arg

Gin

65

70

75

80

Leu

Leu

Pro

Arg

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp

85

90

95

Val

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

100

105

110

His

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Ile

Ile

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Phe

115

120

125

Leu

Met

Gin

Ala

Asp

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

130

135

140

Ser

Lys

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

145

150

155

160

Leu

Arg

Ala

Val

Lys

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

Ile

Leu

Arg

165

170

175

Leu

Ile

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg

Ser

180

185

190

Leu

Lys

Leu

Asp

Met

Ser

Pro

Gly

Thr

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

195

200

205

Val

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

210

215

220

Gly

Ile

Glu

Ile

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

225

230

235

240

Thr

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

245

250

255

Lys

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

260

265

270

Cys

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

PL 210 158 B1

275

280

285

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

290

295

300

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

305

310

315

320

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

325

330

335

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

340

345

350

Tyr

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

355

360

365

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 375 <210> 7 <211> 1128 <212> DNA <213> Gallus gallus

<220>

<221> CDS <222> (1)...

(112

:5)

<400> 7

atg

caa

aag

ctg

gca

gtc

tat

gtt

tat

att

tac

ctg

ttc

atg

cag

atc

Met

Gin

Lys

Leu

Ala

Val

Tyr

Val

Tyr

Ile

Tyr

Leu

Phe

Met

Gin

Ile

1

5

10

15

gcg

gtt

gat

ccg

gtg

gct

ctg

gat

ggc

agt

agt

cag

ccc

aca

gag

aac

Ala

Val

Asp

Pro

Val

Ala

Leu

Asp

Gly

Ser

Ser

Gin

Pro

Thr

Glu

Asn

20

25

30

gct

gaa

aaa

gac

gga

ctg

tgc

aat

gct

tgt

acg

tgg

aga

cag

aat

aca

Ala

Glu

Lys

Asp

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Thr

Trp

Arg

Gin

Asn

Thr

35

40

45

aaa

tcc

tcc

aga

ata

gaa

gcc

ata

aaa

att

caa

atc

ctc

agc

aaa

ctg

Lys

Ser

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

50

55

60

cgc

ctg

gaa

caa

gca

cct

aac

att

agc

agg

gac

gtt

att

aag

cag

ctt

Arg

Leu

Glu

Gin

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Arg

Asp

Val

Ile

Lys

Gin

Leu

65

70

75

80

tta

ccc

aaa

gct

cct

cca

ctg

cag

gaa

ctg

att

gat

cag

tat

gat

gtc

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Gin

Glu

Leu

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val

85

90

95

cag

agg

gac

gac

agt

agc

gat

ggc

tet

ttg

gaa

gac

gat

gac

tat

cat

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

gcc

aca

acc

gag

acg

att

atc

aca

atg

cct

acg

gag

tet

gat

ttt

ctt

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Ile

Ile

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Phe

Leu

115

120

125

gta

caa

atg

gag

gga

aaa

cca

aaa

tgt

tgc

ttc

ttt

aag

ttt

agc

tet

Val

Gin

Met

Glu

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

aaa

ata

caa

tat

aac

aaa

gta

gta

aag

gca

caa

tta

tgg

ata

tac

ttg

PL 210 158 B1

528

Lys Ile Gin Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gin Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 agg caa gtc caa aaa cct aca acg gtg ttt gtg cag atc ctg aga ctc

Arg Gin Val Gin Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gin Ile Leu Arg Leu

165 170 175 att aag ccc atg aaa gac ggt aca aga tat act gga att ega tet ttg

Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu

180 185 190

576 aaa ctt gac atg aac cca ggc act ggt atc tgg cag agt att gat gtg Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gin Ser Ile Asp Val

195 200 205

624 aag aca gtg ctg caa aat tgg ctc aaa cag cct gaa tcc aat tta ggc Lys Thr Val Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly

210 215 220

672 atc gaa ata aaa get ttt gat gag act gga ega gat ctt get gtc aca Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Thr Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240

720 ttc cca gga cca gga gaa gat gga ttg aac cca ttt tta gag gtc aga Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg

245 250 255

768 gtt aca gac aca ccg aaa cgg tcc cgc aga gat ttt ggc ctt gac tgt Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys

260 265 270

816 gat gag cac tca acg gaa tcc ega tgt tgt cgc tac ccg ctg aca gtg Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val

275 280 285

864 gat ttc gaa get ttt gga tgg gac tgg att ata gca cct aaa aga tac Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr

290 295 300

912

aaa	gcc	aat	tac	tgc	tcc	gga	gaa	tgc	gaa	ttt
Lys	Ala	Asn	Tyr	Cys	Ser	Gly	Glu	Cys	Glu	Phe
305					310					315
tac	ccg	cac	act	cac	ctg	gta	cac	caa	gca	aat
Tyr	Pro	His	Thr	His	Leu	Val	His	Gin	Ala	Asn

325

330 aaa

Lys

320

960

1008

340

ttc	aat	gga	aaa	gaa	caa	ata	ata
Phe	Asn	Gly	Lys	Glu	Gin	Ile	Ile
		355					360
gta	gat	cgt	tgc	ggg	tgc	tca	tga
Val	Asp	Arg	Cys	Gly	Cys	Ser
	370					375

335

atg	tcc	cct	ata	aac	atg	ctg	tat	1056
Met	Ser	Pro	Ile	Asn	Met	Leu	Tyr
345					350
tat	gga	aag	ata	cca	gcc	atg	gtt	1104
Tyr	Gly	Lys	Ile	Pro	Ala	Met	Val
				365

1128 <210> 8

PL 210 158 B1 <211> 374 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 8

Gin

Lys

Leu

Ala

Val

Tyr

Val

Tyr

Ile

Tyr

Leu

Phe

Met

Gin

Ile

Ala

1

5

10

15

Val

Asp

Pro

Val

Ala

Leu

Asp

Gly

Ser

Ser

Gin

Pro

Thr

Glu

Asn

Ala

20

25

30

Glu

Lys

Asp

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Thr

Trp

Arg

Gin

Asn

Thr

Lys

35

40

45

Ser

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

50

55

60

Leu

Glu

Gin

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Arg

Asp

Val

Ile

Lys

Gin

Leu

Leu

65

70

75

80

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Gin

Glu

Leu

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val

Gin

85

90

95

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

Ala

100

105

110

Thr

Thr

Glu

Thr

Ile

Ile

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Phe

Leu

Val

115

120

125

Gin

Met

Glu

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

Lys

130

135

140

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu

Arg

145

150

155

160

Gin

Val

Gin

Lys

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

Ile

Leu

Arg

Leu

Ile

165

170

175

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys

180

185

190

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Val

Lys

195

200

205

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly

Ile

210

215

220

Glu

Ile

Lys

Ala

Phe

Asp

Glu

Thr

Gly

Arg

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

Phe

225

230

235

240

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Arg

Val

245

250

255

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

260

265

270

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

275

280

285

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

290

295

300

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

305

310

315

320

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

325

330

335

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

340

345

350

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

Val

Val

355

360

365

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370

<210>	9
<211>	1128
<212>	DNA
<213>	pawiani
<220>
<221>	CDS

PL 210 158 B1 <222> (1)...(1125) <400> 9

atg Met 1

caa Gin

aaa Lys

ctg Leu

caa Gin 5

ctc Leu

tgt Cys

gtt Val

tat Tyr

att Ile 10

tac Tyr

ctg Leu

ttt Phe

atg Met

ctg Leu 15

att Ile

48

gtt

gct

ggt

cca

gtg

gat

eta

aat

gag

aac

agt

gag

caa

aaa

gaa

aat

96

Val

Ala

Gly

Pro 20

Val

Asp

Leu

Asn

Glu 25

Asn

Ser

Glu

Gin

Lys 30

Glu

Asn

gtg

gaa

aaa

gag

ggg

ctg

tgt

aat

gca

tgt

act

tgg

aga

caa

aac

act

144

Val

Glu

Lys 35

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn 40

Ala

Cys

Thr

Trp

Arg 45

Gin

Asn

Thr

aaa

tet

tca

aga

ata

gaa

gcc

att

aaa

ata

caa

atc

ctc

agt

aaa

ctt

192

Lys

Ser 50

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala 55

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile 60

Leu

Ser

Lys

Leu

cgt

ctg

gaa

aca

gct

cct

aac

atc

agc

aaa

gat

gct

ata

aga

caa

ctt

240

Arg 65

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro 70

Asn

Ile

Ser

Lys

Asp 75

Ala

Ile

Arg

Gin

Leu 80

tta

ccc

aaa

gcg

cct

cca

ctc

cgg

gaa

ctg

att

gat

cag

tat

gat

gtc

288

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro 85

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu 90

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp 95

Val

cag

agg

gat

gac

agc

agc

gat

ggc

tet

ttg

gaa

gat

gac

gat

tat

cac

336

Gin

Arg

Asp

Asp 100

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser 105

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp 110

Tyr

His

gct

aca

acg

gaa

aca

atc

att

acc

atg

cct

aca

gag

tet

gat

ttt

tta

384

Ala

Thr

Thr 115

Glu

Thr

Ile

Ile

Thr 120

Met

Pro

Thr

Glu

Ser 125

Asp

Phe

Leu

atg

caa

gtg

gat

gga

aaa

ccc

aaa

tgt

tgc

ttc

ttt

aaa

ttt

agc

tet

432

Met

Gin 130

val

Asp

Gly

Lys

Pro 135

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe 140

Lys

Phe

Ser

Ser

aaa

ata

caa

tac

aat

aaa

gtg

gta

aag

gcc

caa

eta

tgg

ata

tat

ttg

480

Lys 145

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys 150

val

Val

Lys

Ala

Gin 155

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu 160

aga

ccc

gtc

gag

act

cct

aca

aca

gtg

ttt

gtg

caa

atc

ctg

aga

ctc

528

Arg

Pro

Val

Glu

Thr 165

Pro

Thr

Thr

Val

Phe 170

Val

Gin

Ile

Leu

Arg 175

Leu

atc

aaa

cct

atg

aaa

gac

ggt

aca

agg

tat

act

gga

atc

ega

tet

ctg

576

Ile

Lys

Pro

Met 180

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg 185

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg 190

Ser

Leu

aaa

ctt

gac

atg

aac

cca

ggc

act

ggt

att

tgg

cag

agc

att

gat

gtg

624

Lys

Leu

Asp 195

Met

Asn

Pro

Gly

Thr 200

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser 205

Ile

Asp

val

aag

aca

gtg

ttg

caa

aat

tgg

ctc

aaa

caa

cct

gaa

tcc

aac

tta

ggc

672

Lys

Thr 210

Val

Leu

Gin

Asn

Trp 215

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu 220

Ser

Asn

Leu

Gly

att

gaa

ata

aaa

gct

tta

gat

gag

aat

ggt

cat

gat

ctt

gct

gta

acc

720

Ile

Glu

Ile

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

PL 210 158 B1

225

230

235

240

ttc

cca

gga

cca

gga

gaa

gat

ggg

ctg

aat

ccc

ttt

tta

gag

gtc

aag

768

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Lys

245

250

255

gta

aca

gac

aca

ccc

aaa

aga

tcc

aga

agg

gat

ttt

ggt

ctt

gac

tgt

816

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

gat

gag

cac

tca

aca

gaa

teg

ega

tgc

tgt

cgt

tac

cct

eta

act

gtg

864

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

gat

ttt

gaa

get

ctt

gga

tgg

gat

tgg

att

atc

get

cct

aaa

aga

tat

912

Asp

Phe

Glu

Ala

Leu

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Ty ir

290

295

300

aag

gcc

aat

tac

tgc

tet

gga

gag

tgt

gaa

ttt

gta

ttt

tta

caa

aaa

960

Lys

Al a

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

tat

cct

cat

act

cat

ctg

gta

cac

caa

gca

aac

ccc

aga

ggt

tca

gca

1008

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

325

330

335

ggc

cct

tgc

tgt

act

ccc

aca

aag

atg

tet

cca

att

aat

atg

eta

tat

1056

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

ttt

aat

ggc

aaa

gaa

caa

ata

ata

tat

ggg

aaa

att

cca

gcc

atg

gta

1104

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

val

355

360

365

gta

gac

cgc

tgc

ggg

tgc

tca

tga

1128

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370

375

<210> 10

<211> 375 <212> PRT <213> pawiani <400> 10

Met 1

Gin

Lys

Leu

Gin 5

Leu

Cys

Val

Tyr

Ile 10

Tyr

Leu

Phe

Met

Leu 15

Ile

Val

Ala

Gly

Pro 20

Val

Asp

Leu

Asn

Glu 25

Asn

Ser

Glu

Gin

Lys 30

Glu

Asn

Val

Glu

Lys 35

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn 40

Ala

Cys

Thr

Trp

Arg 45

Gin

Asn

Thr

Lys

Ser 50

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala 55

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile 60

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg 65

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro 70

Asn

Ile

Ser

Lys

Asp 75

Ala

Ile

Arg

Gin

Leu 80

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro 85

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu 90

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp 95

Val

Gin

Arg

Asp

Asp 100

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser 105

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp 110

Tyr

His

Ala

Thr

Thr 115

Glu

Thr

Ile

Ile

Thr 120

Met

Pro

Thr

Glu

Ser 125

Asp

Phe

Leu

PL 210 158 B1

Met

Gin 130

Val

Asp

Gly

Lys

Pro 135

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe 140

Lys

Phe

Ser

Ser

Lys

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Pro

Val

Glu

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

Ile

Leu

Arg

Leu

165

170

175

Ile

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg

Ser

Leu

180

185

190

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Val

195

200

205

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly

210

215

220

Ile

Glu

Ile

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225

230

235

240

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Lys

245

250

255

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

Asp

Phe

Glu

Ala

Leu

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

325

330

335

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

Val

355

360

365

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 375 <210> 11 <211> 1128 <212> DNA <213> bydlęcy <220>

<221> CDS

<22;

?> (

1) ·

. (1125)

<400> 11

atg

caa

aaa

ctg

caa

atc

tet

gtt

tat

att

tac

eta

ttt

atg

ctg

att

Met

Gin

Lys

Leu

Gin

Ile

Ser

Val

Tyr

Ile

Tyr

Leu

Phe

Met

Leu

Ile

1

5

10

15

gtt

gct

ggc

cca

gtg

gat

ctg

aat

gag

aac

agc

gag

cag

aag

gaa

aat

Val

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Asn

Ser

Glu

Gin

Lys

Glu

Asn

20

25

30

gtg

gaa

aaa

gag

ggg

ctg

tgt

aat

gca

tgt

ttg

tgg

agg

gaa

aac

act

Val

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Leu

Trp

Arg

Glu

Asn

Thr

35

40

45

aca

tcg

tca

aga

eta

gaa

gcc

ata

aaa

atc

caa

atc

ctc

agt

aaa

ctt

Thr

Ser

Ser

Arg

Leu

Glu

Ala

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

50

55

60

cgc

ctg

gaa

aca

gct

cct

aac

atc

agc

aaa

gat

gct

atc

aga

caa

ctt

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Lys

Asp

Ala

Ile

Arg

Gin

Leu

144

192

240

PL 210 158 B1

65

70

75

80

ttg

ccc

aag

get

cct

cca

ctc

ctg

gaa

ctg

att

gat

cag

ttc

gat

gtc

288

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro 85

Pro

Leu

Leu

Glu

Leu 90

Ile

Asp

Gin

Phe

Asp 95

Val

cag

aga

gat

gcc

agc

agt

gac

ggc

tcc

ttg

gaa

gac

gat

gac

tac

cac

336

Gin

Arg

Asp

Ala 100

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser 105

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp 110

Tyr

His

gcc

agg

acg

gaa

acg

gtc

att

acc

atg

ccc

acg

gag

tet

gat

ctt

eta

384

Ala

Arg

Thr 115

Glu

Thr

Val

Ile

Thr 120

Met

Pro

Thr

Glu

Ser 125

Asp

Leu

Leu

acg

caa

gtg

gaa

gga

aaa

ccc

aaa

tgt

tgc

ttc

ttt

aaa

ttt

agc

tet

432

Thr

Gin 130

Val

Glu

Gly

Lys

Pro 135

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe 140

Lys

Phe

Ser

Ser

aag

ata

caa

tac

aat

aaa

eta

gta

aag

gcc

caa

ctg

tgg

ata

tat

ctg

480

Lys 145

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys 150

Leu

Val

Lys

Ala

Gin 155

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu 160

agg

cct

gtc

aag

act

cct

gcg

aca

gtg

ttt

gtg

caa

atc

ctg

aga

ctc

528

Arg

Pro

Val

Lys

Thr 165

Pro

Ala

Thr

Val

Phe 170

Val

Gin

Ile

Leu

Arg 175

Leu

atc

aaa

ccc

atg

aaa

gac

ggt

aca

agg

tat

act

gga

atc

ega

tet

ctg

576

Ile

Lys

Pro

Met 180

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg 185

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg 190

Ser

Leu

aaa

ctt

gac

atg

aac

cca

ggc

act

ggt

att

tgg

cag

agc

att

gat

gtg

624

Lys

Leu

Asp 195

Met

Asn

Pro

Gly

Thr 200

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser 205

Ile

Asp

Val

aag

aca

gtg

ttg

cag

aac

tgg

ctc

aaa

caa

cct

gaa

tcc

aac

tta

ggc

672

Lys

Thr 210

Val

Leu

Gin

Asn

Trp 215

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu 220

Ser

Asn

Leu

Gly

att

gaa

atc

aaa

get

tta

gat

gag

aat

ggc

cat

gat

ctt

get

gta

acc

720

Ile 225

Glu

Ile

Lys

Ala

Leu 230

Asp

Glu

Asn

Gly

His 235

Asp

Leu

Ala

Val

Thr 240

ttc

cca

gaa

cca

gga

gaa

gat

gga

ctg

act

ccc

ttt

tta

gaa

gtc

aag

768

Phe

Pro

Glu

Pro

Gly 245

Glu

Asp

Gly

Leu

Thr 250

Pro

Phe

Leu

Glu

Val 255

Lys

gta

aca

gac

aca

cca

aaa

aga

tet

agg

aga

gat

ttt

ggg

ctt

gat

tgt

816

Val

Thr

Asp

Thr 260

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg 265

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu 270

Asp

Cys

gat

gaa

cac

tcc

aca

gaa

tet

ega

tgc

tgt

cgt

tac

cct

eta

act

gtg

864

Asp

Glu

His 275

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg 280

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro 285

Leu

Thr

Val

gat

ttt

gaa

get

ttt

gga

tgg

gat

tgg

att

att

gca

cct

aaa

aga

tat

912

Asp

Phe 290

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp 295

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala 300

Pro

Lys

Arg

Tyr

aag

gcc

aat

tac

tgc

tet

gga

gaa

tgt

gaa

ttt

gta

ttt

ttg

caa

aag

960

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

310 315

PL 210 158 B1

tat	cct	cat	acc	cat	ctt	gtg	cac
Tyr	Pro	His	Thr	His 325	Leu	Val	His
ggc	ccc	tgc	tgt	act	cct	aca	aag
Gly	Pro	Cys	Cys 340	Thr	Pro	Thr	Lys
ttt	aat	ggc	gaa	gga	caa	ata	ata
Phe	Asn	Gly 355	Glu	Gly	Gin	Ile	Ile 360
gta	gat	cgc	tgt	ggg	tgt	tca	tga
Val	Asp 370	Arg	Cys	Gly	Cys	Ser 375

caa Gin	gca Ala 330	aac Asn	ccc Pro	aga Arg	ggt Gly	tca Ser 335	gcc Ala	1008
atg	tet	cca	att	aat	atg	eta	tat	1056
Met 345	Ser	Pro	Ile	Asn	Met 350	Leu	Tyr
tac	ggg	aag	att	cca	gcc	atg	gta	1104
Tyr	Gly	Lys	Ile	Pro 365	Ala	Met	Val

1128

<210> 12 <211> 375 <212> PRT <213> bydlęcy
<400> 12 Met Gin	Lys	Leu	Gin	Ile	Ser	Val
1 Val	Ala	Gly	Pro	5 Val	Asp	Leu	Asn
Val	Glu	Lys	20 Glu	Gly	Leu	Cys	Asn
Thr	Ser	35 Ser	Arg	Leu	Glu	Ala	40 Ile
Arg	50 Leu	Glu	Thr	Ala	Pro	55 Asn	Ile
65 Leu	Pro	Lys	Ala	Pro	70 Pro	Leu	Leu
Gin	Arg	Asp	Ala	85 Ser	Ser	Asp	Gly
Ala	Arg	Thr	100 Glu	Thr	Val	Ile	Thr
Thr	Gin	115 Val	Glu	Gly	Lys	Pro	120 Lys
Lys	130 Ile	Gin	Tyr	Asn	Lys	135 Leu	Val
145 Arg	Pro	Val	Lys	Thr	150 Pro	Ala	Thr
Ile	Lys	Pro	Met	165 Lys	Asp	Gly	Thr
Lys	Leu	Asp	180 Met	Asn	Pro	Gly	Thr
Lys	Thr	195 Val	Leu	Gin	Asn	Trp	200 Leu
Ile	210 Glu	Ile	Lys	Ala	Leu	215 Asp	Glu
225 Phe	Pro	Glu	Pro	Gly	230 Glu	Asp	Gly
Val	Thr	Asp	Thr	245 Pro	Lys	Arg	Ser
Asp	Glu	His	260 Ser	Thr	Glu	Ser	Arg
Asp	Phe	275 Glu	Ala	Phe	Gly	Trp	280 Asp

Tyr	Ile 10	Tyr	Leu	Phe	Met	Leu 15	Ile
Glu 25	Asn	Ser	Glu	Gin	Lys 30	Glu	Asn
Ala	Cys	Leu	Trp	Arg 45	Glu	Asn	Thr
Lys	Ile	Gin	Ile 60	Leu	Ser	Lys	Leu
Ser	Lys	Asp 75	Ala	Ile	Arg	Gin	Leu 80
Glu	Leu 90	Ile	Asp	Gin	Phe	Asp 95	Val
Ser 105	Leu	Glu	Asp	Asp	Asp 110	Tyr	His
Met	Pro	Thr	Glu	Ser 125	Asp	Leu	Leu
Cys	Cys	Phe	Phe 140	Lys	Phe	Ser	Ser
Lys	Ala	Gin 155	Leu	Trp	Ile	Tyr	Leu 160
Val	Phe 170	Val	Gin	Ile	Leu	Arg 175	Leu
Arg 185	Tyr	Thr	Gly	Ile	Arg 190	Ser	Leu
Gly	Ile	Trp	Gin	Ser 205	Ile	Asp	Val
Lys	Gin	Pro	Glu 220	Ser	Asn	Leu	Gly
Asn	Gly	His 235	Asp	Leu	Ala	Val	Thr 240
Leu	Thr 250	Pro	Phe	Leu	Glu	Val 255	Lys
Arg 265	Arg	Asp	Phe	Gly	Leu 270	Asp	Cys
Cys	Cys	Arg	Tyr	Pro 285	Leu	Thr	Val
Trp	Ile	Ile	Ala	Pro	Lys	Arg	Tyr

PL 210 158 B1

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

325

330

335

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

Phe

Asn

Gly

Glu

Gly

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

Val

355

360

365

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 375 <210> 13 <211> 1128 <212> DNA <213> świński <220>

<221> CDS <222> (1)...(1125) <400> 13

atg

caa

aaa

ctg

caa

atc

tat

gtt

tat

att

tac

ctg

ttt

atg

ctg

att

48

Met

Gin

Lys

Leu

Gin

Ile

Tyr

Val

Tyr

Ile

Tyr

Leu

Phe

Met

Leu

Ile

10 15 gtt get ggt ccc gtg gat ctg aat gag aac age gag caa aag gaa aat 95

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn

25 30 gtg gaa aaa gag ggg ctg tgt aat gca tgt atg tgg aga caa aac act 144

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Met Trp Arg Gin Asn Thr

40 45 aaa tet tea aga eta gaa gee ata aaa att caa atc etc agt aaa ctt 192

Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gin Ile Leu Ser Lys Leu

55 60

ege Arg 65

ctg Leu

gaa Glu

aca Thr

get Ala

cct Pro 70

aac Asn

att Ile

age Ser

aaa Lys

gat Asp 75

get Ala

ata Ile

aga Arg

caa Gin

ctt Leu 80

240

ttg

ccc

aaa

get

cct

cca

ctc

cgg

gaa

ctg

att

gat

cag

tac

gat

gtc

288

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val

90 95 cag aga gat gac age agt gat ggc tcc ttg gaa gat gat gat tat cac 336

Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

100 105 110

get Ala

acg Thr

acg Thr 115

gaa Glu

acg Thr

atc Ile

att Ile

acc Thr 120

atg Met

cct Pro

aca Thr

gag Glu

tet Ser 125

gat Asp

Ctt Leu

eta Leu

384

atg

caa

gtg

gaa

gga

aaa

ccc

aaa

tgc

tgc

ttc

ttt

aaa

ttt

age

tet

432

Met

Gin

Val

Glu

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130 135 140

aaa

ata

caa

tac

aat

aaa

gta

gta

aag

gee

caa

ctg

tgg

ata

tat

ctg

480

Lys

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu

145

150

155

160

PL 210 158 B1

aga Arg

ccc Pro

gtc Val

aag Lys

act Thr 165

cct Pro

aca Thr

aca Thr

gtg Val

ttt Phe 170

gtg Val

caa Gin

atc Ile

ctg Leu

aga Arg 175

ctc Leu

528

atc

aaa

CCC

atg

aaa

gac

ggt

aca

agg

tat

act

gga

atc

ega

tet

ctg

576

Ile

Lys

Pro

Met 180

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg 185

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg 190

Ser

Leu

aaa

ctt

gac

atg

aac

cca

ggc

act

ggt

att

tgg

cag

agc

att

gat

gtg

624

Lys

Leu

Asp 195

Met

Asn

Pro

Gly

Thr 200

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser 205

Ile

Asp

Val

aag

aca

gtg

ttg

caa

aat

tgg

ctc

aaa

caa

cct

gaa

tcc

aac

tta

ggc

672

Lys

Thr 210

Val

Leu

Gin

Asn

Trp 215

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu 220

Ser

Asn

Leu

Gly

att

gaa

atc

aaa

get

tta

gat

gag

aat

ggt

cat

gat

ctt

get

gta

acc

720

Ile 225

Glu

Ile

Lys

Ala

Leu 230

Asp

Glu

Asn

Gly

His 235

Asp

Leu

Ala

Val

Thr 240

ttc

cca

gga

cca

gga

gaa

gat

ggg

ctg

aat

ccc

ttt

tta

gaa

gtc

aag

768

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly 245

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn 250

Pro

Phe

Leu

Glu

Val 255

Lys

gta

aca

gac

aca

cca

aaa

aga

tcc

agg

aga

gat

ttt

gga

ctc

gac

tgt

815

Val

Thr

Asp

Thr 260

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg 265

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu 270

Asp

Cys

gat

gag

cac

tca

aca

gaa

tet

ega

tgc

tgt

egt

tac

cct

eta

act

gtg

864

Asp

Glu

His 275

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg 280

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro 285

Leu

Thr

Val

gat

ttt

gaa

get

ttt

gga

tgg

gac

tgg

att

att

gca

ccc

aaa

aga

tat

912

Asp

Phe 290

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp 295

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala 300

Pro

Lys

Arg

Tyr

aag

gcc

aat

tac

tgc

tet

gga

gag

tgt

gaa

ttt

gta

ttt

tta

caa

aaa

960

Lys 305

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser 310

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe 315

Val

Phe

Leu

Gin

Lys 320

tac

cct

cac

act

cat

ctt

gtg

cac

caa

gca

aac

ccc

aga

ggt

tca

gca

1008

Tyr

Pro

His

Thr

His 325

Leu

Val

His

Gin

Ala 330

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser 335

Ala

ggc

ccc

tgc

tgt

act

ccc

aca

aag

atg

tet

cca

atc

aat

atg

eta

tat

1056

Gly

Pro

Cys

Cys 340

Thr

Pro

Thr

Lys

Met 345

Ser

Pro

Ile

Asn

Met 350

Leu

Tyr

ttt

aat

ggc

93S

gaa

caa

ata

ata

tat

ggg

aaa

att

cca

gcc

atg

gta

1104

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

Val

355 360 365 gta gat cgc tgt ggg tgc tca tga 1128

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

370 375 <210> 14 <211> 375 <212> PRT

PL 210 158 B1 <213> świński <400> 14

Met 1

Gin

Lys

Leu

Gin 5

Ile

Tyr

Val

Tyr

Ile 10

Tyr

Leu

Phe

Met

Leu 15

Ile

Val

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Asn

Ser

Glu

Gin

Lys

Glu

Asn

20

25

30

Val

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Met

Trp

Arg

Gin

Asn

Thr

35

40

45

Lys

Ser

Ser

Arg

Leu

Glu

Ala

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

50

55

60

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Lys

Asp

Ala

Ile

Arg

Gin

Leu

65

70

75

80

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val

85

90

95

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Ile

Ile

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Leu

Leu

115

120

125

Met

Gin

Val

Glu

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

Lys

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Pro

Val

Lys

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

Ile

Leu

Arg

Leu

165

170

175

Ile

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg

Ser

Leu

180

185

190

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Val

195

200

205

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly

210

215

220

Ile

Glu

Ile

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225

230

235

240

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Lys

245

250

255

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

325

330

335

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

Val

355

360

365

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370

375

<210>	15
<211>	1128
<212>	DNA
<213>	owczy
<220>
<221>	CDS
<222>	(1) . .

PL 210 158 B1 <400> 15

atg Met 1

caa Gin

aaa Lys

ctg Leu

caa Gin 5

atc Ile

ttt Phe

gtt Val

tat Tyr

att Ile 10

tac Tyr

eta Leu

ttt Phe

atg Met

ctg Leu 15

ctt Leu

48

gtt

gct

ggc

cca

gtg

gat

ctg

aat

gag

aac

agc

gag

cag

aag

gaa

aat

96

Val

Ala

Gly

Pro 20

Val

Asp

Leu

Asn

Glu 25

Asn

Ser

Glu

Gin

Lys 30

Glu

Asn

gtg

gaa

aaa

aag

ggg

ctg

tgt

aat

gca

tgc

ttg

tgg

aga

caa

aac

aat

144

Val

Glu

Lys 35

Lys

Gly

Leu

Cys

Asn 40

Ala

Cys

Leu

Trp

Arg 45

Gin

Asn

Asn

aaa

tcc

tca

aga

eta

gaa

gcc

ata

aaa

atc

caa

atc

ctc

agt

aag

ctt

192

Lys

Ser 50

Ser

Arg

Leu

Glu

Ala 55

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile 60

Leu

Ser

Lys

Leu

cgc

ctg

gaa

aca

gct

cct

aac

atc

agc

aaa

gat

gct

ata

aga

caa

ctt

240

Arg 65

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro 70

Asn

Ile

Ser

Lys

Asp 75

Ala

Ile

Arg

Gin

Leu 80

ttg

ccc

aag

gct

cct

cca

ctc

cgg

gaa

ctg

att

gat

cag

tac

gat

gtc

288

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro 85

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu 90

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp 95

Val

cag

aga

gat

gac

agc

agc

gac

ggc

tcc

ttg

gaa

gac

gat

gac

tac

cac

336

Gin

Arg

Asp

Asp 100

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser 105

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp 110

Tyr

His

gtt

acg

acg

gaa

acg

gtc

att

acc

atg

ccc

acg

gag

tet

gat

ctt

eta

384

Val

Thr

Thr 115

Glu

Thr

Val

Ile

Thr 120

Met

Pro

Thr

Glu

Ser 125

Asp

Leu

Leu

gca

gaa

gtg

caa

gaa

aaa

ccc

aaa

tgt

tgc

ttc

ttt

aaa

ttt

agc

tet

432

Ala

Glu 130

Val

Gin

Glu

Lys

Pro 135

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe 140

Lys

Phe

Ser

Ser

aag

ata

caa

cac

aat

aaa

gta

gta

aag

gcc

caa

ctg

tgg

ata

tat

ctg

480

Lys 145

Ile

Gin

His

Asn

Lys 150

Val

Val

Lys

Ala

Gin 155

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu 160

aga

cct

gtc

aag

act

cct

aca

aca

gtg

ttt

gtg

caa

atc

ctg

aga

ctc

528

Arg

Pro

Val

Lys

Thr 165

Pro

Thr

Thr

Val

Phe 170

Val

Gin

Ile

Leu

Arg 175

Leu

atc

aaa

ccc

atg

aaa

gac

ggt

aca

agg

tat

act

gga

atc

ega

tet

ctg

576

Ile

Lys

Pro

Met 180

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg 185

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg 190

Ser

Leu

aaa

ctt

gac

atg

aac

cca

ggc

act

ggt

att

tgg

cag

agc

att

gat

gtg

624

Lys

Leu

Asp 195

Met

Asn

Pro

Gly

Thr 200

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser 205

Ile

Asp

Val

aag

aca

gtg

ttg

caa

aac

tgg

ctc

aaa

caa

cct

gaa

tcc

aac

tta

ggc

672

Lys

Thr 210

Val

Leu

Gin

Asn

Trp 215

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu 220

Ser

Asn

Leu

Gly

att

gaa

atc

aaa

gct

tta

gat

gag

aat

ggt

cat

gat

ctt

gct

gta

acc

720

Ile 225

Glu

Ile

Lys

Ala

Leu 230

Asp

Glu

Asn

Gly

His 235

Asp

Leu

Ala

Val

Thr 240

PL 210 158 B1 ttc cca gaa cca gga gaa gaa gga Phe Pro Glu Pro Gly Glu Glu Gly

245 gta aca gac aca cca aaa aga tet

Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser

260 gat gag cac tcc aca gaa tet ega

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg

275 280 gat ttt gaa get ttt gga tgg gat

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp

290 295 aag gcc aat tac tgc tet gga gaa

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu

305 310 tat cct cat acc cat ctt gtg cac

Tyr Pro His Thr His Leu Val His

325 ctg aat cct ttt tta gaa gtc aag 768

Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys

250 255 agg aga gat ttt ggg ctt gat tgt 816

Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys

265 270 tgc tgt cgt tac cct eta act gtg 864

Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val

285 tgg att att gca cct aaa aga tat 912

Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr

300 tgt gaa ttt tta ttt ttg caa aag 960

Cys Glu Phe Leu Phe Leu Gin Lys

315 320 caa gca aac ccc aaa ggt tca gcc 1008

Gin Ala Asn Pro Lys Gly Ser Ala

330 335 ggc cct tgc tgt act cct aca aag Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys

340

atg Met 345	tet Ser	cca Pro	att Ile	aat Asn	atg Met 350	eta Leu	tat Tyr	1056
tat	ggg	aag	att	cca	ggc	atg	gta	1104
Tyr	Gly	Lys	Ile	Pro 365	Gly	Met	Val

1128

ttt	aat	ggc	aaa	gaa	caa	ata	ata
Phe	Asn	Gly 355	Lys	Glu	Gin	Ile	Ile 360
gta	gat	cgc	tgt	ggg	tgc	tca	tga
Val	Asp 370	Arg	Cys	Gly	Cys	Ser 375

<210> 16 <211> 375 <212> PRT <213> owczy <400> 16

Met

Gin

Lys

Leu

Gin

Ile

Phe

Val

Tyr

Ile

Tyr

Leu

Phe

Met

Leu

Leu

1

5

10

15

Val

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Asn

Ser

Glu

Gin

Lys

Glu

Asn

20

25

30

Val

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Leu

Trp

Arg

Gin

Asn

Asn

35

40

45

Lys

Ser

Ser

Arg

Leu

Glu

Ala

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

50

55

60

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Lys

Asp

Ala

Ile

Arg

Gin

Leu

65

70

75

80

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp

val

85

90

95

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

Val

Thr

Thr

Glu

Thr

Val

Ile

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Leu

Leu

115

120

125

Ala

Glu

Val

Gin

Glu

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

PL 210 158 B1

Lys

Ile

Gin

His

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Pro

Val

Lys

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

Ile

Leu

Arg

Leu

165

170

175

Ile

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg

Ser

Leu

180

185

190

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Val

195

200

205

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly

210

215

220

Ile

Glu

Ile

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225

230

235

240

Phe

Pro

Glu

Pro

Gly

Glu

Glu

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Lys

245

250

255

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Leu

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Lys

Gly

Ser

Ala

325

330

335

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Gly

Met

Val

355

360

365

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 375 <210> 17 <211> 1128 <212> DNA

<213> Meleagris

gallopavo

<22C

)>

<221> CDS

<222

!> (

1) . .

. (1125)

<400> 17

atg

caa

aag

eta

gca

gtc

tat

gtt

tat

att

tac

ctg

ttc

atg

cag

att

Met

Gin

Lys

Leu

Ala

Val

Tyr

Val

Tyr

Ile

Tyr

Leu

Phe

Met

Gin

Ile

1

5

10

15

tta

gtt

cat

ccg

gtg

gct

ctt

gat

ggc

agt

agt

cag

ccc

aca

gag

aac

Leu

Val

His

Pro

Val

Ala

Leu

Asp

Gly

Ser

Ser

Gin

Pro

Thr

Glu

Asn

20

25

30

gct

gaa

aaa

gac

gga

ctg

tgc

aat

gct

tgc

acg

tgg

aga

cag

aat

act

Ala

Glu

Lys

Asp

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Thr

Trp

Arg

Gin

Asn

Thr

35

40

45

aaa

tcc

tcc

aga

ata

gaa

gcc

ata

aaa

att

caa

atc

ctc

agc

aaa

ctg

Lys

Ser

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

50

55

60

cgc

ctg

gaa

caa

gca

cct

aac

att

agc

agg

gac

gtt

att

aaa

caa

ctt

Arg

Leu

Glu

Gin

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Arg

Asp

Val

Ile

Lys

Gin

Leu

70 75 80

144

192

240

PL 210 158 B1

tta Leu

ccc Pro

aaa Lys

gct Ala

cct Pro 85

ccg Pro

ctg Leu

cag Gin

gaa Glu

ctg Leu 90

att Ile

gat Asp

cag Gin

tat Tyr

gac Asp 95

gtc Val

288

cag

aga

gac

gac

agt

agc

gat

ggc

tct

ttg

gaa

gac

gat

gac

tat

cat

336

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

gcc

aca

acc

gaa

acg

att

atc

aca

atg

cct

acg

gag

tct

gat

ttt

ctt

384

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Ile

Ile

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Phe

Leu

115

120

125

gta

caa

atg

gag

gga

aaa

cca

aaa

tgt

tgc

ttc

ttt

aag

ttt

agc

tct

432

Val

Gin

Met

Glu

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

aaa

ata

caa

tat

aac

aaa

gta

gta

aag

gca

caa

tta

tgg

ata

tac

ttg

480

Lys

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu

145

150

155

160

agg

caa

gtc

caa

aaa

cct

aca

acg

gtg

ttt

gtg

cag

atc

ctg

aga

ctc

528

Arg

Gin

Val

Gin

Lys

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

val

Gin

Ile

Leu

Arg

Leu

165

170

175

att

aaa

ccc

atg

aaa

gac

ggt

aca

aga

tat

act

gga

att

ega

tct

ttg

576

Ile

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg

Ser

Leu

180

185

190

aaa

ctt

gac

atg

aac

cca

ggc

act

ggt

atc

tgg

cag

agt

att

gat

gtg

624

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Val

195

200

205

aag

aca

gtg

ttg

caa

aat

tgg

ctc

aaa

cag

cct

gaa

tcc

aat

tta

ggc

672

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly

210

215

220

atc

gaa

ata

aaa

gct

ttt

gat

gag

aat

gga

ega

gat

ctt

gct

gta

aca

720

Ile

Glu

Ile

Lys

Al a

Phe

Asp

Glu

Asn

Gly

Arg

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225

230

235

240

ttc

cca

gga

cca

ggt

gaa

gat

gga

ctg

aac

cca

ttt

tta

gag

gtc

aga

768

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

val

Arg

245

250

255

gtt

aca

gac

aca

cca

aaa

cgg

tcc

ege

aga

gat

ttt

ggc

ctt

gac

tgc

816

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

gac

gag

cac

tca

acg

gaa

tct

ega

tgt

tgt

ege

tac

ccg

ctg

aca

gtg

864

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

gat

ttt

gaa

gct

ttt

gga

tgg

gac

tgg

att

ata

gca

cct

aaa

aga

tac

912

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

aaa

gcc

aat

tac

tgc

tct

gga

gaa

tgt

gaa

ttc

gta

ttt

eta

cag

aaa

960

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

tac

ccg

cac

act

cac

ctg

gta

cac

caa

gca

aat

cca

aga

ggc

tca

gca

1008

PL 210 158 B1

Tyr

Pro

His

Thr

His 325

Leu Val

His

Gin Ala Asn 330

Pro

Arg

Gly

Ser 335

Ala

ggc

cct

tgc

tgc

aca

ccc

acc

aag

atg

tcc

cct

ata

aac

atg

ctg

tat

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

ttc

aat

gga

aaa

gaa

caa

ata

ata

tat

gga

aag

ata

cca

gcc

atg

gtt

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu.

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

Val

355

360

365

gta

gat

cgt

tgc

ggg

tgc

tca

tga

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 375 <210> 18 <211> 375 <212> PRT <213> Meleagris gallopavo <400> 18

Met

Gin

Lys

Leu Ala Val

Tyr

Val

Tyr

Ile Tyr

Leu

Phe

Met

Gin

Ile

1

5

10

15

Leu

Val

His

Pro

Val

Ala

Leu

Asp

Gly

Ser

Ser

Gin

Pro

Thr

Glu

Asn

20

25

30

Al a

Glu

Lys

Asp

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Thr

Trp

Arg

Gin

Asn

Thr

35

40

45

Lys

Ser

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

50

55

60

Arg

Leu

Glu

Gin

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Arg

Asp

Val

Ile

Lys

Gin

Leu

65

70

75

80

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Gin

Glu

Leu

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val

85

90

95

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Ile

Ile

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Phe

Leu

115

120

125

Val

Gin

Met

Glu

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

Lys

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Gin

Val

Gin

Lys

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

Ile

Leu

Arg

Leu

165

170

175

Ile

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

Ile

Arg

Ser

Leu

180

185

190

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

Ile

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Val

195

200

205

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly

210

215

220

Ile

Glu

Ile

Lys

Ala

Phe

Asp

Glu

Asn

Gly

Arg

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225

230

235

240

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Arg

245

250

255

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

PL 210 158 B1

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

325

330

335

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ala

Met

Val

355

360

365

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 375 <210> 19 <211> 1125 <212> DNA <213> Danio rerio <220>

<221> CDS <222> (1)...(1122) <400> 19

atg Met 1

cat His

ttt Phe

aca Thr

cag Gin 5

gtt Val

tta Leu

att Ile

tct Ser

eta Leu 10

agt Ser

gta Val

tta Leu

att Ile

gca Ala 15

tgt Cys

48

ggt

cca

gtg

ggt

tat

gga

gat

ata

acg

gcg

cac

cag

cag

cct

tcc

aca

95

Gly

Pro

Val

Gly

Tyr

Gly

Asp

Ile

Thr

Ala

His

Gin

Gin

Pro

Ser

Thr

20

25

30

gcc

acg

gag

gaa

age

gag

ctg

tgt

tcc

aca

tgt

gag

ttc

aga

caa

cac

144

Ala

Thr

Glu

Glu

Ser

Glu

Leu

Cys

Ser

Thr

Cys

Glu

Phe

Arg

Gin

His

35

40

45

age

aag

ctg

atg

aga

ctg

cat

gcc

atc

aag

tcc

caa

att

ctt

age

aaa

192

Ser

Lys

Leu

Met

Arg

Leu

His

Ala

Ile

Lys

Ser

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

50

55

60

ctc

ega

ctc

aag

cag

gct

cca

aac

atc

age

cgg

gac

gtg

gtc

aag

cag

240

Leu

Arg

Leu

Lys

Gin

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Arg

Asp

Val

Val

Lys

Gin

55

70

75

80

ctg

tta

ccc

aaa

gca

ccg

cct

ttg

caa

caa

ctt

ctg

gat

cag

tac

gat

288

Leu

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Asp

Gin

Tyr

Asp

85

90

95

gtt

tta

gga

gat

gac

agt

aag

gat

gga

gct

gtg

gaa

gag

gac

gat

gaa

336

Val

Leu

Gly

Asp

Asp

Ser

Lys

Asp

Gly

Ala

Val

Glu

Glu

Asp

Asp

Glu

100

105

110

cat

gcc

acc

aca

gag

acc

atc

atg

acc

atg

gcc

aca

gaa

cct

gac

ccc

384

His

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Ile

Met

Thr

Met

Ala

Thr

Glu

Pro

Asp

Pro

115

120

125

att

gtt

caa

gta

gat

cgg

aaa

ccg

aag

tgt

tgc

ttt

ttc

tcc

ttc

agt

432

Ile

Val

Gin

Val

Asp

Arg

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Ser

Phe

Ser

130

135

140

ccg

aag

atc

caa

gcg

aac

cgg

atc

gta

aga

gcg

cag

ctc

tgg

gtt

cat

480

Pro

Lys

Ile

Gin

Ala

Asn

Arg

Ile

Val

Arg

Ala

Gin

Leu

Trp

Val

His

145

150

155

160

ctg

aga

ccg

gcg

gag

gag

gcg

acc

acc

gtc

ttc

tta

cag

ata

tct

cgg

528

PL 210 158 B1

Leu

Arg

Pro

Ala

Glu 165

Glu

Ala

Thr

Thr

Val 170

Phe

Leu

Gin

Ile

Ser 175

Arg

ctg

atg

ccc

gtt

aag

gac

gga

gga

aga

cac

ega

ata

ega

tcc

ctg

aaa

576

Leu

Met

Pro

Val

Lys

Asp

Gly

Gly

Arg

His

Arg

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys

180

185

190

atc

gac

gtg

aac

gca

gga

gtc

acg

tet

tgg

cag

agt

ata

gac

gta

aag

624

Ile

Asp

Val

Asn

Ala

Gly

Val

Thr

Ser

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Val

Lys

195

200

205

cag

gtg

ctc

acg

gtg

tgg

tta

aaa

caa

ccg

gag

acc

aac

ega

ggc

atc

672

Gin

val

Leu

Thr

Val

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Thr

Asn

Arg

Gly

Ile

210

215

220

gag

att

aac

gca

tat

gac

gcg

aag

gga

aac

gac

ttg

gcc

gtc

act

tca

720

Glu

Ile

Asn

Ala

Tyr

Asp

Ala

Lys

Gly

Asn

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

Ser

225

230

235

240

acc

gag

act

ggg

gag

gat

gga

ctg

ctc

ccc

ttt

atg

gag

gtg

aaa

ata

768

Thr

Glu

Thr

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Leu

Pro

Phe

Met

Glu

Val

Lys

Ile

245

250

255

tca

gag

ggc

cca

aaa

ega

atc

cgg

agg

gac

tcc

gga

ctg

gac

tgc

gat

816

Ser

Glu

Gly

Pro

Lys

Arg

Ile

Arg

Arg

Asp

Ser

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

260

265

270

gag

aat

tcc

tca

gag

tet

cgc

tgc

tgc

agg

tac

cct

ctc

act

gtg

gac

864

Glu

Asn

Ser

Ser

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

275

280

285

ttc

gag

gac

ttt

ggc

tgg

gac

tgg

att

att

gct

cca

aaa

cgc

tat

aag

912

Phe

Glu

Asp

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

290

295

300

gcg

aat

tac

tgt

tca

gga

gaa

tgc

gac

tac

atg

tac

ctg

cag

aag

tat

960

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Asp

Tyr

Met

Tyr

Leu

Gin

Lys

Tyr

305

310

315

320

ccc

cac

acc

cat

ctg

gtg

aac

aag

gcc

agt

ccg

aga

gga

acg

gct

ggg

1008

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

Asn

Lys

Ala

Ser

Pro

Arg

Gly

Thr

Ala

Gly

325

330

335

ccc

tgc

tgc

act

ccc

acc

aag

atg

tet

ccc

atc

aac

atg

ctt

tac

ttt

1056

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

340

345

350

aac

ggc

aaa

gag

cag

atc

atc

tac

ggc

aag

atc

cct

tcg

atg

gta

gta

1104

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ser

Met

Val

Val

355

360

365

gac

cgc

tgt

ggc

tgc

tca

tga

1125

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 <210> 20 <211> 374 <212> PRT <213> Danio rerio

PL 210 158 B1 <400> 20

Met

His

Phe

Thr

Gin

Val

Leu

Ile

Ser

Leu

Ser

Val

Leu

Ile

Ala

Cys

1

5

10

15

Gly

Pro

Val

Gly

Tyr

Gly

Asp

Ile

Thr

Ala

His

Gin

Gin

Pro

Ser

Thr

20

25

30

Ala

Thr

Glu

Glu

Ser

Glu

Leu

Cys

Ser

Thr

Cys

Glu

Phe

Arg

Gin

His

35

40

45

Ser

Lys

Leu

Met

Arg

Leu

His

Ala

Ile

Lys

Ser

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

50

55

60

Leu

Arg

Leu

Lys

Gin

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Arg

Asp

Val

Val

Lys

Gin

65

70

75

80

Leu

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Asp

Gin

Tyr

Asp

85

90

95

Val

Leu

Gly

Asp

Asp

Ser

Lys

Asp

Gly

Ala

Val

Glu

Glu

Asp

Asp

Glu

100

105

110

His

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Ile

Met

Thr

Met

Ala

Thr

Glu

Pro

Asp

Pro

115

120

125

Ile

Val

Gin

Val

Asp

Arg

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Ser

Phe

Ser

130

135

14 0

Pro

Lys

Ile

Gin

Ala

Asn

Arg

Ile

Val

Arg

Ala

Gin

Leu

Trp

Val

His

145

150

155

160

Leu

Arg

Pro

Ala

Glu

Glu

Ala

Thr

Thr

Val

Phe

Leu

Gin

Ile

Ser

Arg

165

170

175

Leu

Met

Pro

Val

Lys

Asp

Gly

Gly

Arg

His

Arg

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys

180

185

190

Ile

Asp

Val

Asn

Ala

Gly

Val

Thr

Ser

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Val

Lys

195

200

205

Gin

Val

Leu

Thr

Val

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Thr

Asn

Arg

Gly

Ile

210

215

220

Glu

Ile

Asn

Ala

Tyr

Asp

Ala

Lys

Gly

Asn

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

Ser

225

230

235

240

Thr

Glu

Thr

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Leu

Pro

Phe

Met

Glu

Val

Lys

Ile

245

250

255

Ser

Glu

Gly

Pro

Lys

Arg

Ile

Arg

Arg

Asp

Ser

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

260

265

270

Glu

Asn

Ser

Ser

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

275

280

285

Phe

Glu

Asp

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

290

295

300

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Asp

Tyr

Met

Tyr

Leu

Gin

Lys

Tyr

305

310

315

320

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

Asn

Lys

Ala

Ser

Pro

Arg

Gly

Thr

Ala

Gly

325

330

335

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

340

345

350

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ser

Met

Val

Val

355

360

365

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> miejsce cięcia proteolitycznego <221> WARIANT <222> (0)...(0) <223> Xaa = dowolny aminokwas

PL 210 158 B1 <400> 21

Arg Xaa Xaa Arg 1 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Eukarionty <220>

<22l> miejsce <222> (0) . . .(0) <223> miejsce obróbki proteolitycznej <400> 22

Arg Ser Arg Arg 1 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Eukarionty <220>

<221> miejsce <222> (0)...(0) <223> miejsce obróbki proteolitycznej <400> 23

Arg Ile Arg Arg 1 <210> 24 <211> 1393 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (54) ... (1274) <223> GDF-11 <400> 24 ccgcgggact ccggcgtccc cgccccccag tcctccctcc cctcccctcc age atg 56

Met

gtg Val

ctc Leu

gcg Ala

gee Ala 5

ccg Pro

ctg Leu

ctg Leu

ctg Leu

ggc Gly 10

ttc Phe

ctg Leu

ctc Leu

ctc Leu

gee Ala 15

ctg Leu

gag Glu

104

ctg

cgg

ccc

cgg

ggg

gag

gcg

gee

gag

ggc

ccc

gcg

gcg

gcg

gcg

gcg

152

Leu

Arg

Pro 20

Arg

Gly

Glu

Ala

Ala 25

Glu

Gly

Pro

Ala

Ala 30

Ala

Ala

Ala

gcg

gcg

gcg

gcg

gcg

gca

gcg

gcg

ggg

gtc

ggg

ggg

gag

ege

tcc

age

200

Ala

Ala 35

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala 40

Ala

Gly

Val

Gly

Gly 45

Glu

Arg

Ser

Ser

cgg

cca

gee

ccg

tcc

gtg

gcg

ccc

gag

ccg

gac

ggc

tgc

ccc

gtg

tgc

248

PL 210 158 B1

50

55

60

65

gtt

tgg

cgg

cag

cac

age

ege

gag

ctg

ege

eta

gag

age

atc

aag

teg

296

Val

Trp

Arg

Gin

His 70

Ser

Arg

Glu

Leu

Arg 75

Leu

Glu

Ser

Ile

Lys 80

Ser

cag

atc

ttg

age

aaa

ctg

cgg

ctc

aag

gag

gcg

ccc

aac

atc

age

ege

344

Gin

Ile

Leu

Ser 85

Lys

Leu

Arg

Leu

Lys 90

Glu

Ala

Pro

Asn

Ile 95

Ser

Arg

gag

gtg

gtg

aag

cag

ctg

ctg

ccc

aag

gcg

ccg

ccg

ctg

cag

cag

atc

392

Glu

Val

val 100

Lys

Gin

Leu

Leu

Pro 105

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu 110

Gin

Gin

Ile

ctg

gac

eta

cac

gac

ttc

cag

ggc

gac

gcg

ctg

cag

ccc

gag

gac

ttc

440

Leu

Asp 115

Leu

His

Asp

Phe

Gin 120

Gly

Asp

Ala

Leu

Gin 125

Pro

Glu

Asp

Phe

ctg

gag

gag

gac

gag

tac

cac

gcc

acc

acc

gag

acc

gtc

att

age

atg

488

Leu 130

Glu

Glu

Asp

Glu

Tyr 135

His

Ala

Thr

Thr

Glu 140

Thr

Val

Ile

Ser

Met 145

gcc

cag

gag

acg

gac

cca

gca

gta

cag

aca

gat

ggc

age

cct

ctc

tgc

536

Ala

Gin

Glu

Thr

Asp 150

Pro

Ala

Val

Gin

Thr 155

Asp

Gly

Ser

Pro

Leu 160

Cys

tgc

cat

ttt

cac

ttc

age

ccc

aag

gtg

atg

ttc

aca

aag

gta

ctg

aag

584

Cys

His

Phe

His 165

Phe

Ser

Pro

Lys

Val 170

Met

Phe

Thr

Lys

Val 175

Leu

Lys

gcc

cag

ctg

tgg

gtg

tac

eta

cgg

cct

gta

ccc

ege

cca

gcc

aca

gtc

632

Ala

Gin

Leu 180

Trp

val

Tyr

Leu

Arg 185

Pro

Val

Pro

Arg

Pro 190

Ala

Thr

Val

tac

ctg

cag

atc

ttg

ega

eta

aaa

ccc

eta

act

ggg

gaa

ggg

acc

gca

680

Tyr

Leu 195

Gin

Ile

Leu

Arg

Leu 200

Lys

Pro

Leu

Thr

Gly 205

Glu

Gly

Thr

Ala

ggg

gga

ggg

ggc

gga

ggc

cgg

cgt

cac

atc

cgt

atc

ege

tea

ctg

aag

728

Gly 210

Gly

Gly

dy

Gly

Gly 215

Arg

Arg

His

Ile

Arg 220

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys 225

att

gag

ctg

cac

tea

ege

tea

ggc

cat

tgg

cag

age

atc

gac

ttc

aag

776

Ile

Glu

Leu

His

Ser 230

Arg

Ser

Gly

His

Trp 235

Gin

Ser

Ile

Asp

Phe 240

Lys

caa

gtg

eta

cac

age

tgg

ttc

ege

cag

cca

cag

age

aac

tgg

ggc

atc

824

Gin

Val

Leu

His 245

Ser

Trp

Phe

Arg

Gin 250

Pro

Gin

Ser

Asn

Trp 255

Gly

Ile

gag

atc

aac

gcc

ttt

gat

ccc

agt

ggc

aca

gac

ctg

get

gtc

acc

tcc

872

Glu

Ile

Asn 260

Ala

Phe

Asp

Pro

Ser 265

Gly

Thr

Asp

Leu

Ala 270

Val

Thr

Ser

ctg

ggg

ccg

gga

gcc

gag

ggg

ctg

cat

cca

ttc

atg

gag

ctt

ega

gtc

920

Leu

Gly 275

Pro

Gly

Ala

Glu

Gly 280

Leu

His

Pro

Phe

Met 285

Glu

Leu

Arg

Val

eta

gag

aac

aca

aaa

cgt

tcc

cgg

cgg

aac

ctg

ggt

ctg

gac

tgc

gac

968

Leu

Glu

Asn

Thr

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

290 295 300 305

PL 210 158 B1 gag cac tca agc gag tcc cgc tgc tgc ega tat ccc ctc aca gtg gac 1016

Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp

310 315 320 ttt gag gct ttc ggc tgg gac tgg atc atc gca cct aag cgc tac aag 1064

Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys

325 330 335 gcc aac tac tgc tcc ggc cag tgc gag tac atg ttc atg caa aaa tat 1112

Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gin Cys Glu Tyr Met Phe Met Gin Lys Tyr

340 345 350 ccg cat acc cat ttg gtg cag cag gcc aat cca aga ggc tet gct ggg 1160

Pro His Thr His Leu Val Gin Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly

355 360 365

ccc Pro 370

tgt Cys

tgt Cys

acc Thr

ccc Pro

acc Thr 375

aag Lys

atg Met

tcc Ser

cca Pro

atc Ile 380

aac Asn

atg Met

ctc Leu

tac Tyr

ttc Phe 385

1208

aat

gac

aag

cag

cag

att

atc

tac

ggc

aag

atc

cct

ggc

atg

gtg

gtg

1256

Asn

Asp

Lys

Gin

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Gly

Met

Val

Val

390

395

400

gat cgc tgt ggc tgc tet taagtgggtc actacaagct gctggagcaa 1304

Asp Arg Cys Gly Cys Ser

405 agacttggtg ggtgggtaac ttaacctctt cacagaggat aaaaaatgct tgtgagtatg 1364 acagaaggga ataaacaggc ttaaagggt 1393 <210> 25 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Met 1

Val

Leu

Ala

Ala 5

Pro

Leu

Leu Leu

Gly 10

Phe

Leu

Leu

Leu

Ala 15

Leu

Glu

Leu

Arg

Pro

Arg

Gly

Glu

Ala

Ala

Glu

Gly

Pro

Ala

Ala

Ala

Ala

20

25

30

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Gly

Val

Gly

Gly

Glu

Arg

Ser

35

40

45

Ser

Arg

Pro

Ala

Pro

Ser

Val

Ala

Pro

Glu

Pro

Asp

Gly

Cys

Pro

Val

50

55

60

Cys

Val

Trp

Arg

Gin

His

Ser

Arg

Glu

Leu

Arg

Leu

Glu

Ser

Ile

Lys

65

70

75

80

Ser

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

Leu

Lys

Glu

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

85

90

95

Arg

Glu

Val

Val

Lys

Gin

Leu

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Gin

Gin

100

105

110

Ile

Leu

Asp

Leu

Hi s

Asp

Phe

Gin

Gly

Asp

Ala

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

115

120

125

Phe

Leu

Glu

Glu

Asp

Glu

Tyr

His

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Val

Ile

Ser

130

135

140

Met

Ala

Gin

Glu

Thr

Asp

Pro

Ala

Val

Gin

Thr

Asp

Gly

Ser

Pro

Leu

145

150

155

160

Cys

Cys

His

Phe

His

Phe

Ser

Pro

Lys

Val

Met

Phe

Thr

Lys

val

Leu

165

170

175

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Val

Tyr

Leu

Arg

Pro

Val

Pro

Arg

Pro

Ala

Thr

PL 210 158 B1

180

185

190

Val

Tyr

Leu

Gin

I le

Leu

Arg

Leu

Lys

Pro

Leu

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

195

200

205

Ala

Gly

Gly

Gly

Gly

Gly

Gly

Arg

Arg

His

Ile

Arg

Ile

Arg

Ser

Leu

210

215

220

Lys

Ile

Glu

Leu

His

Ser

Arg

Ser

Gly

His

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Phe

225

230

235

240

Lys

Gin

Val

Leu

His

Ser

Trp

Phe

Arg

Gin

Pro

Gin

Ser

Asn

Trp

Gly

245

250

255

Ile

Glu

Ile

Asn

Ala

Phe

Asp

Pro

Ser

Gly

Thr

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

260

265

270

Ser

Leu

Gly

Pro

Gly

Ala

Glu

Gly

Leu

His

Pro

Phe

Met

Glu

Leu

Arg

275

280

285

Val

Leu

Glu

Asn

Thr

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

Leu

Asp

Cys

290

295

300

Asp

Glu

His

Ser

Ser

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

305

310

315

320

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

325

330

335

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Gin

Cys

Glu

Tyr

Met

Phe

Met

Gin

Lys

340

345

350

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

Gin

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

355

360

365

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

370

375

380

Phe

Asn

Asp

Lys

Gin

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Gly

Met

Val

385

390

395

400

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

405

<210> 26 <211> 476 <212> DNA <213> łososi-1 <220>

<221> CDS <222> (3)...(473) <400> 26 gg cag ccg gag acg aat tgg ggg atc gag att aat gcg ttc gac tcg Gin Pro Glu Thr Asn Trp Gly Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Ser aag gga aat gat Lys Gly Asn Asp caa ccc ttc atg Gin Pro Phe Met aga gac tcg ggc Arg Asp Ser Gly tgc cgc tac ccc Cys Arg Tyr Pro att att gcc ccc ctg gcc gtt acc Leu Ala Val Thr gag gtg acg att Glu Val Thr Ile ctg gac tgt gac Leu Asp Cys Asp ctc acg gta gac Leu Thr Val Asp aag cgc tac aag tca gca gaa gcg Ser Ala Glu Ala tca gag ggc ccg Ser Glu Gly Pro gag aac tcc ccc Glu Asn Ser Pro ttt gaa gac ttt Phe Glu Asp Phe gcc aac tac tgc gga gaa gga ctg Gly Glu Gly Leu aag cgc tcc agg Lys Arg Ser Arg gag tcc cgc tgt Glu Ser Arg Cys ggc tgg gac tgg Gly Trp Asp Trp tet ggt gag tgt

143

191

239

287

PL 210 158 B1

Leu

Arg

Pro

Ala

Glu 165

Glu

Ala

Thr

Thr

Val 170

Phe

Leu

Gin

Ile

Ser 175

Arg

ctg

atg

ccc

gtt

aag

gac

gga

gga

aga

cac

ega

ata

ega

tcc

ctg

aaa

576

Leu

Met

Pro

Val

Lys

Asp

Gly

Gly

Arg

His

Arg

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys

180

185

190

atc

gac

gtg

aac

gca

gga

gtc

acg

tct

tgg

cag

agt

ata

gac

gta

aag

624

Ile

Asp

Val

Asn

Ala

Gly

Val

Thr

Ser

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Val

Lys

195

200

205

cag

gtg

ctc

acg

gtg

tgg

tta

aaa

caa

ccg

gag

acc

aac

ega

ggc

atc

672

Gin

val

Leu

Thr

Val

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Thr

Asn

Arg

Gly

Ile

210

215

220

gag

att

aac

gca

tat

gac

gcg

aag

gga

aac

gac

ttg

gcc

gtc

act

tea

720

Glu

Ile

Asn

Ala

Tyr

Asp

Ala

Lys

Gly

Asn

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

Ser

225

230

235

240

acc

gag

act

ggg

gag

gat

gga

ctg

ctc

ccc

ttt

atg

gag

gtg

aaa

ata

768

Thr

Glu

Thr

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Leu

Pro

Phe

Met

Glu

Val

Lys

Ile

245

250

255

tea

gag

ggc

cca

aaa

ega

atc

cgg

agg

gac

tcc

gga

ctg

gac

tgc

gat

816

Ser

Glu

Gly

Pro

Lys

Arg

Ile

Arg

Arg

Asp

Ser

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

260

265

270

gag

aat

tcc

tea

gag

tct

ege

tgc

tgc

agg

tac

cct

ctc

act

gtg

gac

864

Glu

Asn

Ser

Ser

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

275

280

285

ttc

gag

gac

ttt

ggc

tgg

gac

tgg

att

att

gct

cca

aaa

ege

tat

aag

912

Phe

Glu

Asp

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

290

295

300

gcg

aat

tac

tgt

tea

gga

gaa

tgc

gac

tac

atg

tac

ctg

cag

aag

tat

960

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Asp

Tyr

Met

Tyr

Leu

Gin

Lys

Tyr

305

310

315

320

ccc

cac

acc

cat

ctg

gtg

aac

aag

gcc

agt

ccg

aga

gga

acg

gct

ggg

1008

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

Asn

Lys

Ala

Ser

Pro

Arg

Gly

Thr

Ala

Gly

325

330

335

ccc

tgc

tgc

act

ccc

acc

aag

atg

tct

ccc

atc

aac

atg

ctt

tac

ttt

1056

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

340

345

350

aac

ggc

aaa

gag

cag

atc

atc

tac

ggc

aag

atc

cct

teg

atg

gta

gta

1104

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ser

Met

Val

Val

355

360

365

gac

ege

tgt

ggc

tgc

tea

tga

1125

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 <210> 20 <211> 374 <212> PRT <213> Danio rerio

PL 210 158 B1 <400> 20

Met

His

Phe

Thr

Gin

Val

Leu

Ile

Ser

Leu

Ser

Val

Leu

Ile

Ala

Cys

1

5

10

15

Gly

Pro

Val

Gly

Tyr

Gly

Asp

Ile

Thr

Ala

His

Gin

Gin

Pro

Ser

Thr

20

25

30

Ala

Thr

Glu

Glu

Ser

Glu

Leu

Cys

Ser

Thr

Cys

Glu

Phe

Arg

Gin

His

35

40

45

Ser

Lys

Leu

Met

Arg

Leu

His

Ala

Ile

Lys

Ser

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

50

55

60

Leu

Arg

Leu

Lys

Gin

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Arg

Asp

Val

Val

Lys

Gin

65

70

75

80

Leu

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Asp

Gin

Tyr

Asp

85

90

95

Val

Leu

Gly

Asp

Asp

Ser

Lys

Asp

Gly

Ala

Val

Glu

Glu

Asp

Asp

Glu

100

105

110

His

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Ile

Met

Thr

Met

Ala

Thr

Glu

Pro

Asp

Pro

115

120

125

Ile

Val

Gin

Val

Asp

Arg

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Ser

Phe

Ser

130

135

14 0

Pro

Lys

Ile

Gin

Ala

Asn

Arg

Ile

Val

Arg

Ala

Gin

Leu

Trp

Val

His

145

150

155

160

Leu

Arg

Pro

Ala

Glu

Glu

Ala

Thr

Thr

Val

Phe

Leu

Gin

Ile

Ser

Arg

165

170

175

Leu

Met

Pro

Val

Lys

Asp

Gly

Gly

Arg

His

Arg

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys

180

185

190

Ile

Asp

Val

Asn

Ala

Gly

Val

Thr

Ser

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Val

Lys

195

200

205

Gin

Val

Leu

Thr

Val

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Thr

Asn

Arg

Gly

Ile

210

215

220

Glu

Ile

Asn

Ala

Tyr

Asp

Ala

Lys

Gly

Asn

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

Ser

225

230

235

240

Thr

Glu

Thr

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Leu

Pro

Phe

Met

Glu

Val

Lys

Ile

245

250

255

Ser

Glu

Gly

Pro

Lys

Arg

Ile

Arg

Arg

Asp

Ser

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

260

265

270

Glu

Asn

Ser

Ser

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

275

280

285

Phe

Glu

Asp

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

290

295

300

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Asp

Tyr

Met

Tyr

Leu

Gin

Lys

Tyr

305

310

315

320

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

Asn

Lys

Ala

Ser

Pro

Arg

Gly

Thr

Ala

Gly

325

330

335

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

340

345

350

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ser

Met

Val

Val

355

360

365

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> miejsce cięcia proteolitycznego <221> WARIANT <222> (0)...(0) <223> Xaa = dowolny aminokwas

PL 210 158 B1 <400> 21

Arg Xaa Xaa Arg 1 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Eukarionty <220>

<22l> miejsce <222> (0) . . .(0) <223> miejsce obróbki proteolitycznej <400> 22

Arg Ser Arg Arg 1 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Eukarionty <220>

<221> miejsce <222> (0)...(0) <223> miejsce obróbki proteolitycznej <400> 23

Arg Ile Arg Arg 1 <210> 24 <211> 1393 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (54) ... (1274) <223> GDF-11 <400> 24 ccgcgggact ccggcgtccc cgccccccag tcctccctcc cctcccctcc agc atg 56

Met

gtg Val

ctc Leu

gcg Ala

gcc Ala 5

ccg Pro

ctg Leu

ctg Leu

ctg Leu

ggc Gly 10

ttc Phe

ctg Leu

ctc Leu

ctc Leu

gcc Ala 15

ctg Leu

gag Glu

104

ctg

cgg

ccc

cgg

ggg

gag

gcg

gcc

gag

ggc

ccc

gcg

gcg

gcg

gcg

gcg

152

Leu

Arg

Pro 20

Arg

Gly

Glu

Ala

Ala 25

Glu

Gly

Pro

Ala

Ala 30

Ala

Ala

Ala

gcg

gcg

gcg

gcg

gcg

gca

gcg

gcg

ggg

gtc

ggg

ggg

gag

cgc

tcc

agc

200

Ala

Ala 35

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala 40

Ala

Gly

Val

Gly

Gly 45

Glu

Arg

Ser

Ser

cgg

cca

gcc

ccg

tcc

gtg

gcg

ccc

gag

ccg

gac

ggc

tgc

ccc

gtg

tgc

248

PL 210 158 B1

50

55

SO

65

gtt

tgg

cgg

cag

cac

agc

cgc

gag

ctg

cgc

eta

gag

agc

atc

aag

tcg

296

Val

Trp

Arg

Gin

His 70

Ser

Arg

Glu

Leu

Arg 75

Leu

Glu

Ser

Ile

Lys 80

Ser

cag

atc

ttg

agc

aaa

ctg

cgg

ctc

aag

gag

gcg

ccc

aac

atc

agc

cgc

344

Gin

Ile

Leu

Ser 85

Lys

Leu

Arg

Leu

Lys 90

Glu

Ala

Pro

Asn

Ile 95

Ser

Arg

gag

gtg

gtg

aag

cag

ctg

ctg

ccc

aag

gcg

ccg

ccg

ctg

cag

cag

atc

392

Glu

Val

val 100

Lys

Gin

Leu

Leu

Pro 105

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu 110

Gin

Gin

Ile

ctg

gac

eta

cac

gac

ttc

cag

ggc

gac

gcg

ctg

cag

ccc

gag

gac

ttc

440

Leu

Asp 115

Leu

His

Asp

Phe

Gin 120

Gly

Asp

Ala

Leu

Gin 125

Pro

Glu

Asp

Phe

ctg

gag

gag

gac

gag

tac

cac

gcc

acc

acc

gag

acc

gtc

att

agc

atg

488

Leu 130

Glu

Glu

Asp

Glu

Tyr 135

His

Ala

Thr

Thr

Glu 140

Thr

Val

Ile

Ser

Met 145

gcc

cag

gag

acg

gac

cca

gca

gta

cag

aca

gat

ggc

agc

cct

ctc

tgc

536

Ala

Gin

Glu

Thr

Asp 150

Pro

Ala

Val

Gin

Thr 155

Asp

Gly

Ser

Pro

Leu 160

Cys

tgc

cat

ttt

cac

ttc

agc

ccc

aag

gtg

atg

ttc

aca

aag

gta

ctg

aag

584

Cys

His

Phe

His 165

Phe

Ser

Pro

Lys

Val 170

Met

Phe

Thr

Lys

Val 175

Leu

Lys

gcc

cag

ctg

tgg

gtg

tac

eta

cgg

cct

gta

ccc

cgc

cca

gcc

aca

gtc

632

Ala

Gin

Leu 180

Trp

val

Tyr

Leu

Arg 185

Pro

Val

Pro

Arg

Pro 190

Ala

Thr

Val

tac

ctg

cag

atc

ttg

ega

eta

aaa

ccc

eta

act

ggg

gaa

ggg

acc

gca

680

Tyr

Leu 195

Gin

Ile

Leu

Arg

Leu 200

Lys

Pro

Leu

Thr

Gly 205

Glu

Gly

Thr

Ala

ggg

gga

ggg

ggc

gga

ggc

cgg

cgt

cac

atc

cgt

atc

cgc

tca

ctg

aag

728

Gly 210

Gly

Gly

dy

Gly

Gly 215

Arg

Arg

His

Ile

Arg 220

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys 225

att

gag

ctg

cac

tca

cgc

tca

ggc

cat

tgg

cag

agc

atc

gac

ttc

aag

776

Ile

Gin

Leu

His

Ser 230

Arg

Ser

Gly

His

Trp 235

Gin

Ser

Ile

Asp

Phe 240

Lys

caa

gtg

eta

cac

agc

tgg

ttc

cgc

cag

cca

cag

agc

aac

tgg

ggc

atc

824

Gin

Val

Leu

His 245

Ser

Trp

Phe

Arg

Gin 250

Pro

Gin

Ser

Asn

Trp 255

Gly

Ile

gag

atc

aac

gcc

ttt

gat

ccc

agt

ggc

aca

gac

ctg

gct

gtc

acc

tcc

872

Glu

Ile

Asn 260

Ala

Phe

Asp

Pro

Ser 265

Gly

Thr

Asp

Leu

Ala 270

Val

Thr

Ser

ctg

ggg

ccg

gga

gcc

gag

ggg

ctg

cat

cca

ttc

atg

gag

ctt

ega

gtc

920

Leu

Gly 275

Pro

Gly

Ala

Glu

Gly 280

Leu

His

Pro

Phe

Met 285

Glu

Leu

Arg

Val

eta

gag

aac

aca

aaa

cgt

tcc

cgg

cgg

aac

ctg

ggt

ctg

gac

tgc

gac

968

Leu

Glu

Asn

Thr

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

290 295 300 305

PL 210 158 B1 gag cac tea age gag tcc ege tgc tgc ega tat ccc ctc aca gtg gac 1016

Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp

310 315 320 ttt gag get ttc ggc tgg gac tgg atc atc gca cct aag ege tac aag 1064

Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys

325 330 335 gee aac tac tgc tcc ggc cag tgc gag tac atg ttc atg caa aaa tat 1112

Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gin Cys Glu Tyr Met Phe Met Gin Lys Tyr

340 345 350 ccg cat acc cat ttg gtg cag cag gee aat cca aga ggc tet get ggg 1160

Pro His Thr His Leu Val Gin Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly

355 360 365

ccc Pro 370

tgt Cys

tgt Cys

acc Thr

ccc Pro

acc Thr 375

aag Lys

atg Met

tcc Ser

cca Pro

atc Ile 380

aac Asn

atg Met

ctc Leu

tac Tyr

ttc Phe 385

1208

aat

gac

aag

cag

cag

att

atc

tac

ggc

aag

atc

cct

ggc

atg

gtg

gtg

1256

Asn

Asp

Lys

Gin

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Gly

Met

Val

Val

390

395

400

gat ege tgt ggc tgc tet taagtgggtc actacaagct gctggagcaa 1304

Asp Arg Cys Gly Cys Ser

405 agacttggtg ggtgggtaac ttaacctctt cacagaggat aaaaaatgct tgtgagtatg 1364 acagaaggga ataaacaggc ttaaagggt 1393 <210> 25 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Met 1

Val

Leu

Ala

Ala 5

Pro

Leu

Leu Leu

Gly 10

Phe

Leu

Leu

Leu

Ala 15

Leu

Glu

Leu

Arg

Pro

Arg

Gly

Glu

Ala

Ala

Glu

Gly

Pro

Ala

Ala

Ala

Ala

20

25

30

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Gly

Val

Gly

Gly

Glu

Arg

Ser

35

40

45

Ser

Arg

Pro

Ala

Pro

Ser

Val

Ala

Pro

Glu

Pro

Asp

Gly

Cys

Pro

Val

50

55

60

Cys

Val

Trp

Arg

Gin

His

Ser

Arg

Glu

Leu

Arg

Leu

Glu

Ser

Ile

Lys

65

70

75

80

Ser

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

Leu

Lys

Glu

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

85

90

95

Arg

Glu

Val

Val

Lys

Gin

Leu

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Gin

Gin

100

105

110

Ile

Leu

Asp

Leu

Hi s

Asp

Phe

Gin

Gly

Asp

Ala

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

115

120

125

Phe

Leu

Glu

Glu

Asp

Glu

Tyr

His

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Val

Ile

Ser

130

135

140

Met

Ala

Gin

Glu

Thr

Asp

Pro

Ala

Val

Gin

Thr

Asp

Gly

Ser

Pro

Leu

145

150

155

160

Cys

Cys

His

Phe

His

Phe

Ser

Pro

Lys

Val

Met

Phe

Thr

Lys

val

Leu

165

170

175

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Val

Tyr

Leu

Arg

Pro

Val

Pro

Arg

Pro

Ala

Thr

PL 210 158 B1

180

185

190

Val

Tyr

Leu

Gin

I le

Leu

Arg

Leu

Lys

Pro

Leu

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

195

200

205

Ala

Gly

Gly

Gly

Gly

Gly

Gly

Arg

Arg

His

Ile

Arg

Ile

Arg

Ser

Leu

210

215

220

Lys

Ile

Glu

Leu

His

Ser

Arg

Ser

Gly

His

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Phe

225

230

235

240

Lys

Gin

Val

Leu

His

Ser

Trp

Phe

Arg

Gin

Pro

Gin

Ser

Asn

Trp

Gly

245

250

255

Ile

Glu

Ile

Asn

Ala

Phe

Asp

Pro

Ser

Gly

Thr

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

260

265

270

Ser

Leu

Gly

Pro

Gly

Ala

Glu

Gly

Leu

His

Pro

Phe

Met

Glu

Leu

Arg

275

280

285

Val

Leu

Glu

Asn

Thr

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asn

Leu

Gly

Leu

Asp

Cys

290

295

300

Asp

Glu

His

Ser

Ser

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

305

310

315

320

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

325

330

335

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Gin

Cys

Glu

Tyr

Met

Phe

Met

Gin

Lys

340

345

350

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

Gin

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

355

360

365

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

370

375

380

Phe

Asn

Asp

Lys

Gin

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Gly

Met

Val

385

390

395

400

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

405

<210> 26 <211> 476 <212> DNA <213> łososi-1 <220>

<221> CDS <222> (3)...(473) <400> 26 gg cag ccg gag acg aat tgg ggg atc gag att aat gcg ttc gac tcg Gin Pro Glu Thr Asn Trp Gly Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Ser aag gga aat gat Lys Gly Asn Asp caa ccc ttc atg Gin Pro Phe Met aga gac tcg ggc Arg Asp Ser Gly tgc cgc tac ccc Cys Arg Tyr Pro att att gcc ccc ctg gcc gtt acc Leu Ala Val Thr gag gtg acg att Glu Val Thr Ile ctg gac tgt gac Leu Asp Cys Asp ctc acg gta gac Leu Thr Val Asp aag cgc tac aag tca gca gaa gcg Ser Ala Glu Ala tca gag ggc ccg Ser Glu Gly Pro gag aac tcc ccc Glu Asn Ser Pro ttt gaa gac ttt Phe Glu Asp Phe gcc aac tac tgc gga gaa gga ctg Gly Glu Gly Leu aag cgc tcc agg Lys Arg Ser Arg gag tcc cgc tgt Glu Ser Arg Cys ggc tgg gac tgg Gly Trp Asp Trp tet ggt gag tgt

143

191

239

287

PL 210 158 B1

335

Ile 80

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg 85

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr 90

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys 95

gag

tac

atg

cac

ctg

cag

aag

tac

ccc

cac

acc

cac

ctg

gtg

aac

aag

Glu

Tyr

Met

His

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

Asn

Lys

100

105

110

gct

aac

cct

cgc

ggc

acc

gca

ggg

ccc

tgc

tgc

acc

ccc

acc

aag

atg

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Thr

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

115

120

125

tcc

ccc

atc

aac

atg

ctc

tac

ttc

aac

cgc

aaa

gag

cag

atc

atc

tac

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

Asn

Arg

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

130

135

140

ggc

aag

atc

ccc

tcc

atg

gtg

gtg

gac

cgt

tgc

gga

tgc

tcg

Gly

Lys

Ile

Pro

Ser

Met

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

145 150 155

383

431

473 tga <210> 27 <211> 157 <212> PRT <213> łososi-1 <400> 27

476

Gin

Pro

Glu

Thr

Asn Trp

Gly

Ile

Glu

Ile

Asn

Ala

Phe

Asp

Ser

Lys

1

5

10

15

Gly

Asn

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

Ser

Ala

Glu

Ala

Gly

Glu

Gly

Leu

Gin

20

25

30

Pro

Phe

Met

Glu

Val

Thr

Ile

Ser

Glu

Gly

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

35

40

45

Asp

Ser

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

Glu

Asn

Ser

Pro

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

50

55

60

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Asp

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

65

70

75

80

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

85

90

95

Tyr

Met

His

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

Asn

Lys

Ala

100

105

110

Asn

Pro

Arg

Gly

Thr

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

115

120

125

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

Asn

Arg

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

130

135

140

Lys

Ile

Pro

Ser

Met

Val

val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

145 150 155 <210> 28 <211» 412 <212» DNA <213» łososi-2 <220» <221> CDS <222> (2) . . .(409) <400» 28 g gtt acc tca act gaa gcc gga gaa gga ctg caa ccc ttc atg gag gtg 49

Val Thr Ser Thr Glu Ala Gly Glu Gly Leu Gin Pro Phe Met Glu Val

10 15

PL 210 158 B1

aag	att	tcg	gag	ggc	ccg	aag	cgc
Lys	Ile	Ser	Glu 20	Gly	Pro	Lys	Arg
tgt	gat	gag	aac	tcc	ccc	gag	tcc
Cys	Asp	Glu 35	Asn	Ser	Pro	Glu	Ser 40
gtg	gac	ttt	gaa	gac	ttt	ggc	tgg
Val	Asp 50	Phe	Glu	Asp	Phe	Gly 55	Trp
tac	aag	gcc	aac	tac	tgc	tct	ggt
Tyr 65	Lys	Ala	Asn	Tyr	Cys 70	Ser	Gly
aag	tac	ccc	cac	acc	cac	ctg	gtg
Lys	Tyr	Pro	His	Thr 85	His	Leu	Val
gcg	ggg	ccc	tgc	tgc	acc	ccc	acc
Ala	Gly	Pro	Cys 100	Cys	Thr	Pro	Thr
tac	ttc	aac	cgc	aaa	gag	cag	atc
Tyr	Phe	Asn 115	Arg	Lys	Glu	Gin	Ile 120
gtg	gtg	gac	cgc	tgc	ggc	tgc	tcg
Val	Val 130	Asp	Arg	Cys	Gly	Cys 135	Ser

tcc Ser 25	agg aga Arg Arg	gat Asp	tcg Ser	ggc Gly 30	ctg Leu	gac Asp	97
cgc	tgc	tgc	cgg	tac	ccc	ctc	acg	145
Arg	Cys	Cys	Arg	Tyr	Pro	Leu	Thr

gac tgg att att gcc ccc aag cgc 193

Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg gag tgc gag tac atg cac ctg cag 241

Glu Cys Glu Tyr Met His Leu Gin

80 aac aag gct aac cct cgc ggc acc 289

Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr

95

aag Lys 105	atg Met	tcc Ser	CCC Pro	atc Ile	aac Asn 110	atg Met	ctc Leu	337
atc	tac	ggc	aag	atc	ccc	tcc	atg	385
Ile	Tyr	Gly	Lys	Ile 125	Pro	Ser	Met

tga 4i2

<210>	29
<211>	136
<212>	PRT
<213>	łososi-2
<400>	29

Val

Thr

Ser

Thr

Glu

Ala

Gly

Glu

Gly

Leu

Gin

Pro

Phe

Met

Glu

Val

1

5

10

15

Lys

Ile

Ser

Glu

Gly

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Ser

Gly

Leu

Asp

20

25

30

Cys

Asp

Glu

Asn

Ser

Pro

Glu

Ser

Arg

Cys

Ćys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

35

40

45

Val

Asp

Phe

Glu

Asp

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

50

55

60

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Tyr

Met

His

Leu

Gin

65

70

75

80

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

Asn

Lys

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Thr

85

90

95

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

100

105

110

Tyr

Phe

Asn

Arg

Lys

Glu

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

Lys

Ile

Pro

Ser

Met

115

120

125

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

130

135

PL 210 158 B1

Claims (5)

1. Oczyszczona część peptydowa prodomeny miostatyny, która ma aktywność wybraną z grupy składającej się z:

a) aktywności hamującej przekazywanie sygnału przez miostatynę;

b) aktywności wiązania miostatyny;

c) aktywności wiązania promiostatyny; i która składa się z reszt aminokwasowych od 20 do 262 jak przedstawiono w SEK. NR ID: 2.

2. Część prodomeny miostatyny określona w zastrz. 1 do zastosowania w medycynie.

3. Część prodomeny miostatyny określona w zastrz. 1 jako lek do leczenia lub zapobiegania chorobie wyniszczającej mięśnie.

4. Część prodomeny miostatyny według zastrz. 3, znamienna tym, że chorobą wyniszczającą mięśnie jest dystrofia mięśni, choroba neuromięśniowa, kacheksja lub anoreksja.

5. Oczyszczony polinukleotyd kodujący część peptydową prodomeny miostatyny jako określona