PL210219B1

PL210219B1 - Sposób biodegradacji N-fosfonometyloglicyny

Info

Publication number: PL210219B1
Application number: PL373634A
Authority: PL
Inventors: Paweł Kafarski; Piotr Młynarz; Piotr Wieczorek; Jacek Lipok; Joanna Trzebiatowska
Original assignee: Politechnika Wroclawska; Univ Opolski
Priority date: 2005-03-14
Filing date: 2005-03-14
Publication date: 2011-12-30
Also published as: PL373634A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób biodegradacji N-fosfonometyloglicyny, herbicydu fosforoorganicznego powszechnie stosowanego w rolnictwie.

Związek występujący pod nazwą N-fosfonometyloglicyna jest substancją aktywną powszechnie stosowanych herbicydów. Jest to nieselektywny herbicyd o szerokim spektrum działania na rośliny jednoliścienne i dwuliścienne. Uważany jest za związek przyjazny środowisku, aczkolwiek nie pozostaje obojętnym dla zdrowia ludzi i zwierząt, nie wykazując jednak efektów neurotoksycznych, czy kancerogennych lub mutagennych. Występowanie tego związku w środowisku przyrodniczym wiąże się z jego powszechnym używaniem w rolnictwie, ogrodnictwie, utrzymaniu infrastruktury komunikacyjnej i komunalnej, jak i występowaniem pozostałości tej substancji w ściekach przemysłowych zakładów produkujących ten globalnie stosowany herbicyd.

Glifosat wprowadzony do środowiska jest tam degradowany przez mikroorganizmy do wody, dwutlenku węgla oraz nieorganicznych fosforanów. Znana jest między innymi z literatury np. opisana w The Herbicide Glyphosate, Grossbard, E., Atkinson, D., Eds.: Butterworth, London 1985; Sprankle, P., Meggitt W.F.; Penner, D. Weed Sci. 1975, 23, 229-234; Cheah, U.-B., Kirkwood, R. C; Lum, K.-Y. J. Agric. Food Chem., 1998, 46, 1217-1223; Torstensson N. T. L., Aamisepp, A. Weed Res. 1977, 17, 209-211, biodegradacja glifosatu zachodząca dzięki aerobowym jak i anaerobowym mikroorganizmom. W większości znanych sposobów biodegradacja glifosatu zachodzi dzięki działaniu konsorcjum szczepów, tak jak to opisano w amerykańskim patencie Nr US 5288635. W sposobie według patentu do biodegradacji stosuje się mieszaninę kultury bakteryjnej wyizolowanej z basenu ściekowego firmy Monsanto i zdeponowanej w American Type Culture Collections (ATCC 55050). Opisana w patencie metoda polega na wykorzystaniu immobilizowanych na odpowiednich nośnikach mieszanin kultur bakterii, które w odpowiednim czasie przeprowadzają biodegradację glifosatu. Jeden z mikroorganizmów występujących w opatentowanym konsorcjum kultur, został zidentyfikowany jako Moraxella anatipestifer (ATCC 55051).

Znane są jedynie dwa przypadki, kiedy proces biodegradacji glifosatu prowadzony był w obecności czystych kultur szczepów bakterii. Opisany przez Barry, G. F.; Kishore, G. M.; Padgette, S.; Taylor, S.; Kolacz, K.; Welon, M.; Re, D. B.; Eicholtz, D. E.; Fischer, K.; Halla, L. in Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids In Plants, Singh, B. K.; Flores, H. E. Shannon, J. C. Eds.: American Chemical society of Plant Phisology, Rockville, 1992, pp.139-1451 sposób biodegradacji glifostu przez bakterie z jednego szczepu Achromobacter wyizolowanego ze ścieków. Drugi sposób opisany przez Obojska A.; Lejczak, B.; Kubrak, M..; Appl. Microbiol. Biotechnology. 1999, 51, 872-876 polega na wykorzystaniu bakterii ze szczepu Streptomyces species, wyizolowanego ze ścieków miejskich do biodegradacji glifosatu.

Sposób według wynalazku polega na biodegradacji N-fosfonometyloglicyny, przez grupę cyjanobakterii z rodzaju Spirulina species w środowisku o pH 7-10, korzystnie w czasie od 3 do 12 dni. Korzystnie biodegradację N-fosfonometyloglicyny przez cyjanobakterie prowadzi się przy stężeniach 0,2-2 mmol/ dm³ herbicydu.

Biodegradację prowadzi się również w środowisku zawierającym dodatkowe źródła fosforu, np. w postaci K2HPO4.

Zastosowanie sposobu według wynalazku do biodegradacji herbicydu glifosat (N-fosfonometyloglicyna), z wykorzystaniem cyjanobakterii z rodzaju Spirulina species zapewnia detoksyfikację środowiska, jak również umożliwia wyhodowanie roślin transgenicznych, odpornych na działanie glifosatu. Sposób według wynalazku ma tę zaletę, że cyjanobakterie z rodzaju Spirulina species są naturalnie jak i komercyjnie dostępne, a mikroorganizmy te zapewniają skuteczną biodegradację glifosatu w środowisku o pH 7-10, przy stężeniach herbicydu zbliż onych do dawek polowych stosowanych w rolnictwie, co moż e pozwolić na prowadzenie hodowli w warunkach naturalnych.

Zaletą sposobu według wynalazku jest fakt, że dla cyjanobakterii Spirulina species preferowanym źródłem niezbędnego dla rozwoju bakterii fosforu jest glifosat, również wtedy, gdy istnieją inne konkurencyjne źródła tego pierwiastka. Sposób nadaje się do stosowania w obecności nawet wysokich stężeń glifosatu, gdyż cyjanobakteria adoptuje się do warunków środowiska i nadal prowadzi rozkład tego związku.

PL 210 219 B1

Sposób według wynalazku jest przedstawiony w przykładach realizacji.

P r z y k ł a d 1

Sposób degradacji N-fosfonometyloglicyny prowadzi się z wykorzystaniem zliofilizowanych komórek Spiruliny species firmy SIGMA ALDRICH. Herbicyd w postaci N-fosfonometyloglicyny, poddawany biodegradacji wytrąca się z chemicznie z preparatu Roundup.

Do hodowli Spiruliny species używa się standardowej pożywki Zarrouka z dodatkiem glukozy oraz mikroelementów. Sole NaHCO3 oraz K2HPO4 rozpuszcza się w 500 cm³ wody destylowanej (roztwór I), w takiej samej ilości wody destylowanej rozpuszcza się pozostałe składniki pożywki (z glifosatem) (roztwór II). Tak otrzymane dwa roztwory sterylizuje się osobno. Po zmieszaniu roztworów otrzymuje się pożywkę zawierającą komplet składników pokarmowych, która określana jest jako pożywka 100%. Do hodowli używa się 50% pożywki o pH wynoszącym około 9,4 o stężeniu K2HPO4 0.25 g/dm³.

Hodowlę spiruliny prowadzi się w kolbie Erlenmayera o pojemności 250 cm³, zamykanej korkiem mikrobiologicznym. Szkło, sprzęt laboratoryjny oraz wodę destylowaną, niezbędne do założenia hodowli sterylizuje się 20 minut w autoklawie wodnym ciśnieniowym w temp. 126°C.

₃

Spirulinę w ilości 0,05 g liofilizowanych komórek umieszcza się w kolbie stożkowej z 20 cm³ wysterylizowanej wody destylowanej i pozostawia na 24 h w temperaturze pokojowej, w miejscu gdzie natężenie światła wynosi powyżej 1000 lx. Doba ta określona jest jako doba zero. Po tym czasie, do uwodnionej Spiruliny dodaje się po 25 cm³ roztworu I i II oraz 30 cm³ wody destylowanej (łącznie 80 cm³), otrzymując w ten sposób 100 cm³ zawiesiny komórek w 50% pożywce Zarrouka. Bezpośrednio po pomiarze pH, hodowle przenosi się do miejsca o ściśle zdefiniowanych, optymalnych dla rozwoju mikroorganizmów warunkach.

Proces prowadzi się w temperaturze 24°C, przez 14 h oświetlenia na dobę (14/10 L/D), światłem o natężeniu 1675 lx emitowanym przez lampy typu „Day Light”. Raz dziennie zawartość kolb miesza się ruchem okrężnym w celu niedopuszczenia do tworzenia się skupisk sinic na dnie naczynia. Początkowe stężenie glifosatu wynosi 0,2 mmola/dm³, hodowle prowadzi się w ciągu 7 pełnych dni.

Oznacza się świeżą masę, która wynosi 0,892 [g] oraz zawartość chlorofilu, która wynosi 16,84 ^g/100 mg FW]. Stopień biodegradacji glifosatu oceniono na podstawie badań metodą ³¹P NMR przy użyciu spektrometru NMR Bruker DRX 300 MHz, stwierdzono, że 90% zawartości całego fosforu wynosi fosforan nieorganiczny, a 10% fosforu istnieje w postaci innych produktów rozkładu glifosatu.

P r z y k ł a d II

Sposób degradacji N-fosfonometyloglicyny prowadzi się jak w przykładzie I, z tą różnicą, że hodowle prowadzi się w pH około 7,0 i nie wprowadza się dodatkowych źródeł fosforu, stężenie glifosatu wynosi 0,2 mmola/dm³.

Po trzech dniach hodowli oznacza się świeżą masę, która wynosi 0,945 [g] oraz zawartość chlorofilu w ekstrakcie z komórek, która wynosi 5,448 [Lg/100 mg FW] Stopień biodegradacji glifosatu oceniono na podstawie badań metodą ³¹P NMR przy użyciu spektrometru NMR Bruker DRX 300 MHz, stwierdzono, że 84% zawartości całego fosforu wynosi fosforan nieorganiczny, a 16% fosforu istnieje w postaci innych produktów rozkładu glifosatu

P r z y k ł a d III

Sposób degradacji N-fosfonometyloglicyny prowadzi się jak w przykładzie I, z tą różnicą, że hodowle prowadzi się w pH około 8, a stężenie glifosatu wynosi 0,8 mmola/dm³.

Po pięciu dniach hodowli oznacza się świeżą masę, która wynosi 1,151 [g] oraz zawartość chlorofilu w ekstrakcie z komórek, która wynosi 3,725 [Lig/100 mg FW]. Stopień biodegradacji glifosatu oceniono na podstawie badań metodą ³¹P NMR przy użyciu spektrometru NMR Bruker DRX 300 MHz, stwierdzono, że 85% zawartości całego fosforu wynosi fosforan nieorganiczny, a 11% fosforu istnieje w postaci innych produktów rozkładu glifosatu, a 4% istnieje w postaci nieprzetworzonego glifosatu

P r z y k ł a d IV

Sposób degradacji N-fosfonometyloglicyny prowadzi się jak w przykładzie I, z tą różnicą, że hodowlę prowadzi się w pH około 10,0 i nie wprowadza się dodatkowego źródła fosforu, a stężenie glifosatu wynosi 0,8 mmola/dm³.

Po dziesięciu dniach hodowli oznacza się świeżą masę, która wynosi 1,421 [g] oraz zawartość chlorofilu w ekstrakcie z komórek, która wynosi 5,726 [Lig/100 mg FW]. Stopień biodegradacji glifosatu oceniono na podstawie badań metodą ³¹P NMR przy użyciu spektrometru NMR Bruker DRX 300 MHz, stwierdzono, że 98% zawartości całego fosforu wynosi fosforan nieorganiczny, a 2% fosforu istnieje w postaci innych produktów rozkładu glifosatu.

PL 210 219 B1

P r z y k ł a d V

Sposób degradacji N-fosfonometyloglicyny prowadzi się jak w przykładzie I, z tą różnicą, że hodowlę prowadzi się w pH około 7,4, a stężenie glifosatu wynosi 2 mmola/dm³.

Po trzech dniach hodowli oznacza się świeżą masę, która wynosi 0,856 [g] oraz zawartość chlorofilu w ekstrakcie z komórek, która wynosi 5,226 [ng /100 mg FW]. Stopień biodegradacji glifosatu oceniono na podstawie badań metodą ³¹P NMR przy użyciu spektrometru NMR Bruker DRX 300 MHz, stwierdzono, że 30% zawartości całego fosforu wynosi fosforan nieorganiczny, a 10% fosforu istnieje w postaci innych produktów rozkładu glifosatu a 60% istnieje w postaci nieprzetworzonego glifosatu

P r z y k ł a d VI

Sposób degradacji N-fosfonometyloglicyny prowadzi się jak w przykładzie I, z tą różnicą, że hodowlę prowadzi się w pH około 8,0 i nie wprowadza się dodatkowego źródła fosforu, stężenie glifosatu wynosi 2 mmola/dm³.

Dane dla stężenia glifosatu mmola/dm³ bez dodatku K2HPO4.

Po dwunastu dniach hodowli oznacza się świeżą masę, która wynosi 1,383 [g] oraz zawartość chlorofilu w ekstrakcie z komórek, która wynosi 2,557 [Lig/100 mg FW]. Stopień biodegradacji glifosatu oceniono na podstawie badań metodą ³¹P NMR przy użyciu spektrometru NMR Bruker DRX 300 MHz, stwierdzono, że 95% zawartości całego fosforu wynosi fosforan nieorganiczny, a 5% fosforu istnieje w postaci innych produktów rozkładu glifosatu.

Claims

1. Sposób biodegradacji N-fosfonometyloglicyny przy użyciu bakterii z jednego szczepu, znamienny tym, że do biodegradacji N-fosfonometyloglicyny, stosuje się grupę cyjanobakterii z rodzaju Spirulina species, a proces prowadzi się w środowisku o pH 7-10.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biodegradację prowadzi się w czasie od 3 do 12 dni.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biodegradację prowadzi się w środowisku zawierającym dodatkowe źródła fosforu.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biodegradację N-fosfonometyloglicyny przez cyjanobakterie prowadzi się przy stężeniach 0,2-2 mmol/dm³ herbicydu.