PL210545B1 - Kompozycja farmaceutyczna i zestaw farmaceutyczny zawierające przeciwciała ukierunkowane na receptory ERB-B1 oraz ich zastosowanie do otrzymywania leku do leczenia nowotworów - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku są kompozycje farmaceutyczne zawierające różne cząsteczki biologiczne, korzystnie przeciwciała monoklonalne, z których każde zawiera epitopy, które wiążą się jednocześnie do różnych epitopów tej samej domeny receptora ErbB1. Korzystnymi przeciwciałami według wynalazku są MAb 425 i MAb 225, oba w wersji mysiej, chimerycznej i humanizowanej. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie takich kompozycji oraz sposoby ulepszonego leczenia, korzystnie nowotworów przy pomocy takich kompozycji.

Description

Przedmiotem wynalazku są kompozycja farmaceutyczna i zestaw farmaceutyczny zawierające przeciwciała ukierunkowane na receptory ERB-B1 (EGF) oraz Ich zastosowanie do otrzymywania leku do leczenia nowotworów.

STAN TECHNIKI

Cząsteczki biologiczne, takie jak przeciwciała monoklonalne (MAb) lub inne białka/ polipeptydy, jak również niewielkie związki chemiczne skierowane przeciwko różnym receptorom i innym antygenom znajdującym się na powierzchni komórek nowotworowych, wykorzystuje się w terapii nowotworowej od ponad dwudziestu lat. W odniesieniu do podejścia z użyciem przeciwciała, większość z tych przeciwciał MAb jest chimeryzowana lub humanizowana w celu polepszenia tolerowania przez ludzki układ odpornościowy. Przeciwciała MAb lub wyżej wymienione jednostki chemiczne wiążą się w sposób specyficzny do ich struktur docelowych na komórkach nowotworowych i w większości wypadków również na zdrowych tkankach i mogą powodować różne efekty, które zależą od specyficzności ich epitopu i/lub cech funkcjonalnych indywidualnego antygenu. Od przeciwciał MAb dla receptorów sierocych albo innych nie-funkcjonalnych cząsteczek powierzchni komórkowej, jak również przeciwciał MAb skierowanych przeciw strukturom spoza wiążącego ligand miejsca funkcjonalnie aktywnych receptorów (na przykład receptorów czynnika wzrostu o aktywności kinazy) należałoby oczekiwać wywoływania przede wszystkim immunologicznych funkcji efektorowych przeciw komórce docelowej (mechanizmu cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał - ang. antibody-dependent cellmediated cytotoxicity - ADCC, mechanizmu cytotoksyczności zależnej od dopełniacza - ang. complement-dependent cytotoxicity - CDC). Dodatkowo, w zależności od własności antygenu i przeciwciała MAb, wiązanie przeciwciała może doprowadzać do wiązania krzyżowego receptorów. Wynikająca z tego internalizacja kompleksów receptor-przeciwciało może doprowadzić do przedłużonej modulacji „w dół gęstości receptora na powierzchni komórki.

Przeciwciała MAb lub niewielkie związki chemiczne, które wiążą się do epitopu wewnątrz miejsca wiązania ligandu lub w jego bezpośrednim sąsiedztwie konkurują ze sobą o wiązanie ligandów naturalnych do ich receptora i w ten sposób redukują albo zupełnie hamują wiązanie liganda oraz mogą przemieszczać związane już ligandy od ich receptorów. Taka blokada receptora hamuje aktywację receptora zależną od liganda oraz szlak sygnałowy biegnący poniżej receptora. Na przykład, blokada receptorów ErbB, takich jak receptor nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR), przez przeciwciała monoklonalne skutkuje różnymi efektami komórkowymi obejmującymi hamowanie syntezy i proliferacji DNA, wywoływanie zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozę, jak również efekty antymetastatyczne i anty-angiogenne.

Receptory ErbB są typowymi receptorowymi kinazami tyrozynowymi, które w latach osiemdziesiątych były uważane za czynniki związane z nowotworem. Kinazy tyrozynowe należą do klasy enzymów, które katalizują transfer końcowego fosforanu z adenozynotrifosforanu na reszty tyrozynowe w substratach biał kowych. Panuje poglą d, ż e dzię ki fosforylacji substratu, kinazy tyrozynowe mogą odgrywać krytyczne role w przetwarzaniu sygnału w wielu funkcjach komórkowych. Chociaż dokładne mechanizmy przetwarzania sygnału są ciągle niejasne, to wykazano, że kinazy tyrozynowe są ważnymi wspierającymi czynnikami w proliferacji komórki, powstawaniu nowotworu i różnicowaniu komórki.

Kinazy tyrozynowe można sklasyfikować jako typ receptorowy albo niereceptorowy. Zarówno kinazy tyrozynowe typu receptorowego jak i niereceptorowego są uważane za czynniki związane ze szlakami transmisji sygnałów prowadzącymi do licznych stanów chorobotwórczych, włączając w to raka, łuszczycę i nadmierną odpowiedź immunologiczną. Wiele kinaz tyrozynowych bierze udział we wzroście komórki, jak również w angiogenezie. Niereceptorowe kinazy tyrozynowe zawierają również wiele podrodzin, które obejmują Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack i LIMK. Każda z tych podrodzin jest z kolei wewnętrznie podzielona na rozmaite receptory. Przykładowo, podrodzina Src jest jedną z największych podrodzin i obejmuje Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, BIk, Hck, Fgr i Yrk. Enzymy z podrodziny Src został y przypisane do procesu nowotworzenia (onkogenezy). Bardziej szczegół owy opis niereceptorowych kinaz tyrozynowych zawiera opracowanie: Bolen Oncogene, 8:2025-2031 (1993).

Receptorowe kinazy tyrozynowe mają część zewnątrzkomórkową, transbłonową i wewnątrzkomórkową, podczas gdy niereceptorowe kinazy tyrozynowe są całkowicie wewnątrzkomórkowe. Kinazy tyrozynowe połączone z receptorem są białkami transbłonowymi, które zawierają domenę wiążącą ligand zewnątrzkomórkowy, sekwencję transbłonową i cytoplazmatyczną domenę kinazy tyrozynowej.

PL 210 545 B1

Receptorowe kinazy tyrozynowe są złożone z dużej liczby receptorów transbłonowych o rozmaitej aktywności biologicznej.

Zidentyfikowane zostały różne podrodziny receptorowych kinaz tyrozynowych. Domniemane kinazy tyrozynowe obejmują receptory czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), receptory nabłonkowego czynnika wzrostu (EGF) rodziny klasy głównej ErbB i receptory płytkowego czynnika wzrostu (PDGF). Domniemanymi receptorami należącymi do tej grupy są również receptory czynnika wzrostu nerwu (NGF), receptory mózgowego czynnika wzrostu nerwów (BDNF) oraz receptory neutrofiny-3 (NT-3) i neutrofiny-4 (NT-4).

Jedna podrodzina receptorowej kinazy tyrozynowej, oznaczona jako podrodzina HER lub ErbB, składa się z EGFR (ErbB1), HER2 (ErbB2 lub p185neu), HER3 (ErbB3) i HER4 (ErbB4). Ligandy tej podrodziny receptorów obejmują nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF), TGF-α, amfiregulinę, HB-EGF, betacelulinę, heregulinę oraz neureguliny. Podrodzina PDGF obejmuje rodzinę FLK, która składa się z receptora domeny insercji kinazy (KDR).

Przypadkowo stwierdzono, że EGFR, kodowany przez gen erbB1, jest powiązany z ludzką chorobą nowotworową. W szczególności, zaobserwowano zwiększoną ekspresję EGFR w nowotworze piersi, pęcherza, płuca, głowy, szyi i żołądka jak również w glejakach zarodkowych) (ang. glioblastomas). Zwiększona ekspresja receptora EGFR jest często powiązana ze zwiększoną produkcją ligandu EGFR, transformującego czynnika wzrostu alfa (TGF-α), przez te same komórki nowotworowe prowadząc do aktywacji receptora poprzez autokrynny szlak pobudzający. (Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994)).

Receptor EGF jest glikoproteiną transbłonową o masie cząsteczkowej 170000 i znajduje się na wielu typach komórek nabłonkowych. Jest on aktywowany przez co najmniej trzy ligandy: EGF, TGF-α (transformujący czynnik wzrostu alfa) i amfiregulinę. Zostało udowodnione, że zarówno nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF) jak i transformujący czynnik wzrostu alfa (TGF-α) wiążą się do receptora EGF i prowadzą do proliferacji komórkowej i wzrostu nowotworu. Te czynniki wzrostu nie wiążą się do HER2 (Ulrich i Schlesinger, 1990, Cell 61,203). W przeciwieństwie do kilku rodzin czynników wzrostu, które wywołują dimeryzację receptora na mocy ich dimerycznej natury (na przykład PDGF), monomeryczne czynniki wzrostu, takie jak EGF, zawierają dwa miejsca wiązania receptorów, i przez to mogą łączyć krzyżowo dwa sąsiednie receptory EGF (Lemmon et al., 1997, EMBO J. 16,281). Ostatnie badania (J.Schlessinger, 2002, Cell 110, 669) wykazują, że w dimeryzacji receptora pośredniczą interakcje receptor-receptor, w których pętla wystająca z sąsiednich receptorów pośredniczy w dimeryzacji i aktywacji receptora.

Dimeryzacja receptora jest niezbędna dla stymulowania nieodłącznej aktywności katalitycznej oraz dla autofosforylacji receptorów czynnika wzrostu na resztach tyrozynowych. Reszty te pełnią rolę miejsc kotwiczenia różnych białek adaptorowych lub enzymów, które jednocześnie inicjują wiele kaskad białek sygnałowych. U wyższych eukariontów, prosty liniowy szlak rozwinął się do postaci w pełni interaktywnej, wielowarstwowej sieci, w której ekspresja kombinatoryjna i aktywacja komponentów pozwala na reakcje biologiczne o specyficznym kontekście na wskroś rozwoju. Sieć ErbB może integrować nie tylko swoje własne sygnały wejściowe ale również sygnały heterologiczne, włączając w to hormony, limfokiny, neuroprzekaźniki i induktory stresu.

Należy zauważyć, że receptorowe białkowe kinazy tyrozynowe (ang. protein tyrosine kinases - PTK) mogą przejść zarówno homo- jak i heterodimeryzację, przy czym homodimeryczne kombinacje receptorów są mniej mitogenne i transformujące (brak lub słabe inicjowanie sygnałowania) niż odpowiednie kombinacje heterodimeryczne. Heterodimery zawierające ErbB2 są kompleksami o najsilniejszym działaniu (zobacz artykuły przeglądowe: Yarden i Sliwkowski, 2001, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, volume 2, 127-137; Tzahar i Yarden, 1998, BBA 1377, M25-M37).

Zostało wykazane, że przeciwciała receptora anty-EGF podczas blokowania wiązania EGF i TGF -α do tego receptora wydają się hamować proliferację komórki nowotworowej. W wyniku tych odkryć, opracowano i przetestowano dla ich zdolności do hamowania wzrostu komórek nowotworowych in vitro oraz in vivo wiele mysich i szczurzych przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko receptorowi EGF (Modjtahedi i Dean, 1994, J. Onkology 4, 277). Humanizowane przeciwciało monoklonalne 425 (hMAb 425, US 5,558,864; EP 0531 472) i chimeryczne przeciwciało monoklonalne 225 (cMAb 225), oba skierowane przeciwko receptorowi EGF, wykazały skuteczność w próbach klinicznych. Wykazano, że przeciwciało C225 (Cetuximab) hamuje wzrost komórki nowotworowej, w której pośredniczy EGF w warunkach in vitro i hamuje tworzenie się ludzkiego nowotworu w warunkach in vivo u nagich myszy. Ponadto przeciwciało to, a w zasadzie również wszystkie przeciwciała

PL 210 545 B1 anty-EGFR, przede wszystkim wykazywały działanie w synergii z pewnymi czynnikami chemioterapeutycznymi (to znaczy z doksorubicyną, adriamycyną, taksolem i cisplatyną) w usunięciu ludzkich nowotworów w warunkach in vivo w modelach myszy z heteroprzeszczepem (zobacz na przykład opis patentowy: EP 0667165). W pozycji: Ye et al. (1999, Oncogene 18, 731), opisano, że ludzkie komórki nowotworu jajnika mogą być skutecznie leczone z zastosowaniem kombinacji zarówno chimerycznego MAb 225 jak i humanizowanego MAb 4D5, która jest skierowana przeciwko receptorowi HER2.

Drugi przedstawiciel rodziny ErbB, jest HER2 (ErbB2 lub p185neu), został pierwotnie zidentyfikowany jako produkt genu transformującego w niedojrzałych nerwiakach chemicznie leczonych szczurów. Aktywowana forma nowego proto-onkogenu jest wynikiem mutacji punktowej (waliny na kwas glutaminowy) w regionie transbłonowym kodowanego białka. Amplifikacja ludzkiego homologa neu jest obserwowana w przypadku nowotworów piersi i jajnika i jest ona skorelowana ze słabym rokowaniem (Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 707-7 12 (1989); US 4,968,603). ErbB2 (HER2) ma masę cząsteczkową równą około 185000, ze znaczną homologia do receptora EGF (HER1), chociaż jak dotychczas specyficzny ligand dla HER2 nie został jeszcze zidentyfikowany. Ponadto okazało się, że przeciwciało 4D5 skierowane przeciwko receptorowi HER2 uwrażliwia linie komórek nowotworu piersi indukujące nadekspresję ErbB2 na efekty cytotoksyczne TNFa (US 5,677,171). Rekombinacyjna, humanizowana wersja mysiego anty-ErbB2 przeciwciała 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 lub HERCEPTIN®; US 5,821,337) jest klinicznie aktywna u pacjentów z przerzutowym nowotworem piersi wywołującym nadekspresję ErbB2, którzy byli poddani rozległej wcześniejszej terapii przeciwnowotworowej (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14: 737-744 (1996)). HERCEPTIN® otrzymał dopuszczenie do sprzedaży w 1998 roku do leczenia pacjentów z przerzutowym nowotworem piersi, którego guzy nadekspresjonują białko ErbB2.

W publikacji międzynarodowego zgłoszenia wynalazku WO 94/00136 oraz w publikacji: Kasprzyk P.G. et al.: Therapy of an animal model of human gastric cancer using a combination of anti-erbB-2 monoclonal antibodies; Cancer Research 52, 2771-2776, 15.05.1992, ujawniono kompozycją farmaceutyczną, która zawiera dwa różne przeciwciała monoklonalne, przy czym każde z nich rozpoznaje dwa różne epitopy na zewnętrznej domenie receptora ErbB-2, oraz jej zastosowanie do leczenia nowotworów. Opisane w tych dokumentach rozwiązania dotyczą wyłącznie kombinacji dwóch różnych przeciwciał ErbB2 (inaczej HER-2). Należy przy tym zwrócić uwagę na to, że receptor ErbB2 jest preferowanym partnerem dimeryzacji innych członków rodziny ErbB. Podczas gdy EGFR jest receptorem, który może działać samodzielnie. Ponadto ogólną zasadą jest, że przeciwciała anty-ErbB2 inhibitują dimeryzację receptora, podczas gdy wiele przeciwciał anty-EGFR zapobiega aktywacji receptora nie poprzez inhibitowanie dimeryzacji receptora lecz innymi drogami. W odróżnieniu od ErbB1, które jest aktywowane poprzez wiązanie liganda (na przykład EGF), receptor ErbB2 nie ma żadnego naturalnego liganda. Charakterystyczną cechą ErbB2 jest możliwość regulowania go receptorami hormonalnymi, która nie ma zastosowania w przypadku EGFR.

Poza przeciwciałami anty-ErbB, istnieje wiele małych cząsteczek chemicznych, które są znane jako skuteczne inhibitory cząsteczek receptora ErbB blokujące miejsce wiązania ligandów naturalnych (zobacz szczegółowy opis wynalazku), albo blokujące reszty tyrozynowe miejsca wiązania receptorowej kinazy, zapobiegając w ten sposób fosforylacji oraz następującej po niej kaskadzie białek sygnałowych. Jednym z leków wykazującym wysoką skuteczność w próbach klinicznych jest Iressa™ (ZD-1839), który może być stosowany do oznaczania NSCLC (niedrobnokomórkowego raka płuca).

Chociaż w fazie powstawania oraz na rynku istnieje już wiele obiecujących leków i metod leczenia nowotworów, to ciągle istnieje potrzeba odnajdywania kolejnych czynników oraz kompozycji i kombinacji farmaceutycznych o ulepszonych własnościach i zwiększonej skuteczności.

ISTOTA WYNALAZKU

Wynalazek jest oparty na obserwacjach twórców, że pewne receptorowe kinazy tyrozynowe takie jak cząsteczki przeciwciała receptora ErbB1 (EGFR), które ulegają nadekspresji na powierzchniach komórek chorobowych, przykładowo komórek nowotworowych, posiadają specyficzne miejsca epitopowe wewnątrz domeny wiążącej ligand naturalny, do której jednocześnie, bez lub tylko z nieznaczną wzajemną zawadą, mogą zostać przyłączone różne cząsteczki przeciwciała. Te cząsteczki przeciwciała najwyraźniej posiadają epitopy wiążące, które w odniesieniu do ich konfiguracji trójwymiarowej, są stosunkowo małe w porównaniu z całkowitym rozmiarem domeny wiążącej cząsteczki receptora. Cząsteczki te wywołują zwiększoną aktywność modulacyjną szlaku sygnałowego, korzystnie zwiększone blokowanie receptora ErbB i tym samym całej kaskady białek sygnałowych. Wynalazek opisuje po raz pierwszy nową koncepcję w terapii nowotworowej dla podawania pacjentowi jednePL 210 545 B1 go lub większej liczby biologicznie i terapeutycznie efektywnych czynników, które blokują lub hamują receptor EGF (EGFR) (ErbB1), poprzez wiązanie tego czynnika (czynników) do co najmniej jednego i drugiego różnego epitopu, przykładowo wewnątrz domeny liganda naturalnego tego samego receptora. Można wykazać, że na przykład dwie lub większa liczba, korzystnie dwie, różnych cząsteczek antagonistycznych względem receptora może jednocześnie wiązać się do tej samej domeny receptora na tej samej cząsteczce receptora, bez wzajemnej zawady lub współzawodnictwa, umożliwiając w ten sposób istnienie wyższej gęstości antagonisty związanego do receptora i wpływając (poprzez mniejszą zdolność do wiązania ligandów (agonistycznych) naturalnych takich jak EGF lub TGF) na znacznie silniejsze hamowanie kaskady białek sygnałowych cząsteczek odpowiedniego receptora jak jednostki monomeryczne lub dimeryczne.

Powinno to prowadzić do silniejszej inhibicji wzrostu nowotworu i/lub zwiększać apoptozę nowotworów litych lub przerzutów nowotworowych. Cząsteczki te mogą być małymi chemicznymi i syntetycznymi związkami lub białkami, polipeptydami lub peptydami, immunoglobulinami, takimi jak przeciwciała lub ich fragmenty, lub immunokoniugatami. Cząsteczkami takimi są według wynalazku, dwa różne przeciwciała anty-EGFR: MAb 425 w humanizowanej wersji albo jego fragment, taki jak F(ab')2, oraz MAb 225 w chimerycznej wersji albo jego fragment, taki jak F(ab')2. Możliwe jest zastosowanie kombinacji humanizowanego MAb 425 i chimerycznego MAb 225 w postaci całego przeciwciała lub fragmentu F(ab')2.

Niemniej jednak możliwe jest również zastosowanie stosunkowo krótkich syntetycznych (poli) peptydów pochodzących i otrzymywanych z wymienionych konstrukcji przeciwciała zawierających sekwencje aminokwasowe jednego, dwóch lub trzech regionów CDR odpowiedniego przeciwciała, przy czym opcjonalnie w celu zwiększenia powinowactwa wiązania i/lub zdolności wiązania do receptora kilku reszt aminokwasowych wewnątrz miejsca wiązania antygenu lub w jego bliskim sąsiedztwie (1-5 reszt aminokwasowych) może zostać zmodyfikowanych w wyniku odpowiedniego podstawienia. Zaletą takich syntetycznych peptydów, które mogą wiązać się do receptora w sposób porównywalny z odpowiednim przeciwciałem, jest prosty i tani sposób produkcji. Możliwe jest także syntetyzowanie jednego pojedynczego peptydu, który zawiera wymienione sekwencje aminokwasowe pierwszej cząsteczki jak i drugiej cząsteczki, które pochodzą od CDR, takiego jak na przykład (poli)peptyd zawierający sekwencje aminokwasowe pochodzące od 1 - 3 regionów CDR MAb 425 i 1 - 3 regionów CDR MAb 225.

Okazało się, że kompozycje farmaceutyczne według ogólnej idei wynalazku mogą wpływać na wzmocnione wiązanie krzyżowe/dimeryzację różnych lub identycznych receptorów ErbB, wzmocnione blokowanie/hamowanie receptorów ErbB i wzmocnione wywoływanie modulacji szlaku sygnałowego w porównaniu z pojedynczą cząsteczką zawierającą tylko jedno z wymienionych miejsc wiązania. W szczególnoś ci zgodnie z istotą wynalazku mieszanina zawierają ca MAb 425 i MAb 225 wywoł uje wzmocnione hamowanie i regulację „w dół receptora EGFR w porównaniu do przeciwciał monoklonalnych MAb 425 lub 225 zastosowanych jako pojedynczy czynnik o tym samym stężeniu.

Chociaż powyżej opisane obserwacje zostały przeprowadzone tylko dla receptorów ErbB jako docelowych cząsteczek receptora, to należy podkreślić, że podstawy naukowe odkryte przez twórców wynalazku i przedstawione w niniejszym opisie mogą być także stosowne dla różnych biologicznych receptorów innych niż ErbB.

Opcjonalnie, taka kompozycja według wynalazku zawiera ponadto terapeutycznie aktywne związki, które mogą wspierać i zwiększać skuteczność wymienionych powyżej cząsteczek. Czynnikami takimi są korzystnie czynniki cytotoksyczne, przykładowo cząsteczki antagonistyczne, takie jak antagoniści kinazy tyrozynowej, inni antagoniści ErbB, antagoniści receptora wzrostu hormonów, antagoniści kinazy białkowej, czynniki anty-angiogenne lub cytokiny. Poniżej znajduje się bardziej szczegółowy opis tego rodzaju cząsteczek wykorzystywanych według wynalazku.

Według wynalazku te terapeutycznie aktywne czynniki mogą być również dostarczone za pomocą zestawu farmaceutycznego składającego się z opakowania zawierającego jeden lub większą liczbę takich czynników antagonistycznych w pojedynczym pojemniku lub oddzielnych pojemnikach. Terapia z zastosowaniem takich kombinacji może opcjonalnie zawierać leczenie promieniowaniem. Zasadniczo podawaniu może towarzyszyć radioterapia, przy czym radioterapia może być zasadniczo przeprowadzana jednocześnie albo przed lub po podaniu leku. Podawanie różnych czynników takiej terapii łączonej może być również realizowane jednocześnie lub sekwencyjnie. Nowotwory, posiadające na swoich powierzchniach komórkowych receptory biorące udział w rozwoju naczyń krwionośnych nowotworu, mogą być pomyślnie leczone przez terapię łączoną.

PL 210 545 B1

Wiadomym jest, że nowotwory wykazują alternatywne drogi rozwoju i wzrostu. Jeżeli jedna z dróg jest zablokowana, nowotwory mają moż liwość wejścia na inną drogę w wyniku ekspresji i uż ywania innych receptorów i szlaków sygnałowych. Dlatego kombinacje farmaceutyczne według ogólnej idei wynalazku mogą blokować kilka takich możliwych strategii rozwoju nowotworu i w konsekwencji dostarczyć różnych korzyści. Takie kombinacje farmaceutyczne mogą być użyteczne w leczeniu i zapobieganiu nowotworom, zaburzeniom nowotworowo-podobnym i zaburzeniom powstawania nowotworu oraz przerzutom nowotworowym, które rozwijają się i rosną w wyniku aktywacji odpowiadających im receptorów hormonalnych, które są obecne na powierzchni komórek nowotworowych. Różne tego rodzaju czynniki stosowane w połączeniu mogą być podawane w połączeniu w niskiej dawce, niższej niż dawka stosowana konwencjonalnie w sytuacjach klinicznych. Korzyścią obniżenia dawki związków, kompozycji, czynników i terapii według ogólnej idei wynalazku podawanych pacjentowi jest zmniejszenie rozmiaru szkodliwych efektów związanych z wyższymi dawkami. Na przykład, poprzez obniżanie dawkowania czynnika opisanego powyżej i poniżej, zostanie osiągnięta redukcja częstości oraz nasilenia nudności i wymiotów w porównaniu do objawów obserwowanych przy wyższych dawkach. Przez obniżenie rozmiaru szkodliwych efektów, oczekuje się polepszenia jakości życia pacjentów cierpiących na nowotwory. Kolejnymi korzyściami płynącymi z obniżenia rozmiaru szkodliwych efektów są poprawa w podatności pacjenta, redukcja liczby potrzebnych hospitalizacji do leczenia szkodliwych efektów i zmniejszenie ilości czynników przeciwbólowych potrzebnych do leczenia bólu związanego ze wymienionymi szkodliwymi efektami. Alternatywnie, metody i kombinacja według ogólnej idei wynalazku może również maksymalnie zwiększać efekt terapeutyczny przy wyższych dawkach.

Wspomniane powyżej kombinacje według ogólnej idei wynalazku wykazują zadziwiający efekt synergii. Podczas badań klinicznych przy podawaniu kombinacji leków można było zaobserwować rzeczywiste kurczenie się i dezintegrację nowotworu bez wykrycia żadnych znaczących niekorzystnych reakcji lekowych.

Ogólnie wynalazek dotyczy grupy następujących rozwiązań:

• Kompozycja farmaceutyczna zawierają ca jedną lub wię cej efektywnych biologicznie i/lub terapeutycznie cząsteczek przeciwciała (lub ich fragmentów) posiadających zdolność do wiązania z różnymi epitopami domeny wiążącej cząsteczki receptora ErbB, przy czym taka jedna lub większa liczba cząsteczek przeciwciała zawiera przynajmniej miejsce wiązania, które wiąże się z pierwszym specyficznym epitopem rzeczonej domeny wiążącej receptora oraz przynajmniej inne miejsce wiązania, które wiąże się z drugim specyficznym epitopem tej samej domeny wiążącej receptora ErbB.

• Odpowiednia kompozycja farmaceutyczna zawierająca dwie lub wię cej czą steczek przeciwciała, przy czym jedna cząsteczka przeciwciała zawiera przynajmniej miejsce wiązania, które wiąże się z pierwszym specyficznym epitopem rzeczonej domeny wiążącej receptora oraz przynajmniej inna cząsteczka przeciwciała zawiera przynajmniej inne miejsce wiązania, które wiąże się z drugim specyficznym epitopem tej samej domeny wiążącej receptora.

• Odpowiednia kompozycja farmaceutyczna, przy czym przynajmniej jedna z cząsteczek przeciwciała wiąże się z epitopem znajdującym się w domenie wiążącej receptora, z którą wiąże się ligand naturalny receptora.

• Odpowiednia kompozycja farmaceutyczna powodują ca wzmocnione blokowanie i/lub hamowanie receptora ErbB oraz wzmocnione wywoływanie modulacji szlaku transmisji sygnałów specyficznego względem receptora ErbB w porównaniu z pojedynczą cząsteczką przeciwciała, zawierającą tylko jedno z rzeczonych miejsc wiązania.

• Odpowiednia kompozycja farmaceutyczna powodująca wzmocnione wywoływanie wiązania krzyżowego i/lub dimeryzacji różnych cząsteczek receptora o tej samej lub innej specyficzności.

• Odpowiednia kompozycja farmaceutyczna, przy czym receptor ErbB jest receptorem EGF (EGFR).

• Odpowiednia kompozycja farmaceutyczna zawierają ca pierwsze i drugie przeciwciał o monoklonalne lub jego biologicznie aktywny fragment, każdy skierowany przeciwko różnym epitopom receptora EGF.

• Odpowiednia kompozycja farmaceutyczna, przy czym pierwsze przeciwciało jest humanizowanym MAb 425 • Odpowiednia kompozycja farmaceutyczna, przy czym drugie przeciwciało jest chimerycznym MAb 225.

• Odpowiednia kompozycja farmaceutyczna, przy czym pierwsze przeciwciało jest humanizowanym MAb 425 (h425) a drugie przeciwciało jest chimerycznym MAb 225 (c225, Cetuximab).

PL 210 545 B1 • Odpowiednia kompozycja farmaceutyczna zawierają ca dodatkowo lek cytotoksyczny.

Zestaw farmaceutyczny zawierający (i) pierwsze opakowanie zawierające przynajmniej pierwszą aktywną biologicznie cząsteczkę przeciwciała lub jej fragment, która wiąże się z pierwszym specyficznym epitopem domeny wiążącej cząsteczkę receptora ErbB, i (ii) drugie opakowanie zawierające przynajmniej drugą cząsteczkę przeciwciała lub jej fragment, która wiąże się z innym drugim specyficznym epitopem domeny wiążącej cząsteczkę tego samego receptora ErbB.

• Odpowiedni zestaw farmaceutyczny, przy czym co najmniej jedna z cząsteczek przeciwciała wiąże się z epitopem znajdującym w domenie wiążącej receptora, do której wiąże się ligand naturalny tego receptora.

• Odpowiedni zestaw farmaceutyczny, przy czym pierwsza czą steczka przeciwciał a jest humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym 425 lub jego fragmentem aktywnym biologicznie, a druga cząsteczka przeciwciała jest chimerycznym przeciwciałem monoklonalnym 225 lub jego fragmentem aktywnym biologicznie.

• Odpowiedni zestaw farmaceutyczny skł adają cy się z pierwszego opakowania, które zawiera humanizowane MAb 425 (h425) i drugiego opakowania, które zawiera chimeryczne MAb 225 (c225).

• Odpowiedni zestaw farmaceutyczny skł adają cy się dodatkowo z trzeciego opakowania, które zawiera dalszy lek posiadający zdolność do zwiększania skuteczności leków dostarczanych przez pierwsze i drugie opakowanie.

• Odpowiedni zestaw farmaceutyczny, przy czym dodatkowy lek jest lekiem cytotoksycznym.

• Sposób leczenia chorób powią zanych z nowotworami pacjenta obejmujący podawanie temu pacjentowi terapeutycznie efektywnej ilości (i) przynajmniej pierwszej cząsteczki przeciwciała (lub jej fragmentu), która wiąże się do pierwszego specyficznego epitopu domeny wiążącej cząsteczkę receptora ErbB i (ii) przynajmniej drugiej cząsteczki przeciwciała, która wiąże się do różnego drugiego specyficznego epitopu regionu wiążącego tą samą cząsteczkę receptora ErbB.

• Odpowiedni sposób, przy czym przynajmniej jedna z wymienionych cząsteczek przeciwciała wiąże się do epitopu znajdującego się w obrębie domeny wiążącej receptora, do której wiąże się ligand naturalny receptora.

• Odpowiedni sposób, przy czym cz ąsteczka przeciwciała, która wiąże się do podanego epitopu blokuje i/lub hamuje receptor, wywołując w ten sposób modulację szlaku transmisji sygnałów specyficznego względem receptora.

• Odpowiedni sposób, przy czym wiązanie tej cząsteczki przeciwciała wywołuje wiązanie krzyżowe i/lub dimeryzację różnych cząsteczek receptora posiadających tę samą lub różną specyficzność.

• Odpowiedni sposób, przy czym pierwsza czą steczka przeciwciał a jest humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym 425 (h425) lub jego biologicznie aktywnym fragmentem i druga cząsteczka jest chimerycznym przeciwciałem monoklonalnym 225 (c225) lub jego biologicznie aktywnym fragmentem.

Według wynalazku receptor ErbB jest receptorem EGF (EGFR) a przeciwciała skierowane przeciwko różnym epitopom są przeciwciałami anty-EGFR.

Tak więc bardziej szczegółowo istotą wynalazku jest:

• Kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera pierwszą cząsteczkę przeciwciała i drugą, odmienną cząsteczkę przeciwciała, które posiadają zdolność wiązania się do różnych epitopów zlokalizowanych na tej samej cząsteczce receptora EGF (EGFR), przy czym pierwsza cząsteczka przeciwciała zawiera miejsca wiązania, które wiążą się do pierwszego specyficznego epitopu na cząsteczce EGFR a druga cząsteczka przeciwciała zawiera miejsca wiązania, które wiążą się do drugiego specyficznego epitopu na tej samej cząsteczce receptora, przy czym pierwsza cząsteczka przeciwciała jest humanizowanym MAb 425 lub jego fragmentem Fab', F(ab')2 lub Fv, zaś druga cząsteczka przeciwciała jest chimerycznym MAb 225 lub jego fragmentem Fab', F(ab')2 lub Fv.

• Kompozycja farmaceutyczna, która zawiera dodatkowo czynnik cytotoksyczny.

• Kompozycja farmaceutyczna, w której czynnik cytotoksyczny jest czynnikiem chemioterapeutycznym.

• Kompozycja farmaceutyczna, w której czynnik chemioterapeutyczny jest dowolnym związkiem wybranym z grupy obejmującej cisplatynę, doksorubicynę, gemcytabinę, docetaksel, paklitaksel, bleomycynę.

PL 210 545 B1 • Zestaw farmaceutyczny charakteryzujący się tym, że zawiera: (i) pierwsze opakowanie zawierające pierwszą cząsteczkę przeciwciała, która zawiera miejsca wiązania, które wiążą się do pierwszego specyficznego epitopu istniejącego na cząsteczce receptora EGF (EGFR), i (ii) drugie opakowanie zawierające drugą cząsteczkę przeciwciała, która zawiera miejsca wiązania, które wiążą się do drugiego innego specyficznego epitopu na tej samej cząsteczce receptora EGF (EGFR), przy czym pierwsza cząsteczka przeciwciała jest humanizowanym MAb 425 lub jego fragmentem Fab', F(ab')2 lub Fv, zaś druga cząsteczka przeciwciała jest chimerycznym MAb 225 lub jego fragmentem Fab', F(ab')2 lub Fv.

• Zestaw farmaceutyczny, który zawiera dodatkowo trzecie opakowanie zawierają ce czynnik cytotoksyczny.

• Zestaw farmaceutyczny, w którym czynnik cytotoksyczny jest czynnikiem chemioterapeutycznym.

• Zestaw farmaceutyczny, w którym czynnik chemioterapeutyczny jest dowolnym związkiem wybranym z grupy obejmującej cisplatynę, doksorubicynę, gemcytabinę, docetaksel, paklitaksel, bleomycynę.

• Zastosowanie zdefiniowanej powyż ej kompozycji farmaceutycznej lub zdefiniowanego powyżej zestawu farmaceutycznego do otrzymywania leku do leczenia nowotworów.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Wynalazek jest oparty na obserwacji, że dwie lub większa liczba różnych przeciwciał monoklonalnych (MAb) ze specyficznościami dla różnych struktur immunogennych, mogą wiązać się w tym samym czasie i bez zawady z ich epitopami, które mogą być zlokalizowane na tej samej domenie receptora ErbB, korzystnie ErbB1, przykładowo wewnątrz domeny wiązania liganda ErbB (ErbB1). Zastosowanie jednej lub większej liczby cząsteczek chemicznych lub biologicznych posiadających opisane właściwości, takich jak MAb monospecyficzne lub kombinacje przeciwciał skierowanych przeciwko tym samym lub różnym epitopom może znacząco polepszyć skuteczność terapeutyczną w porównaniu ze skutecznością leczenia z zastosowaniem wyłącznie jednego przeciwciała monospecyficznego:

• Dwa lub wi ę ksza liczba MAb wiąże się niezależ nie do róż nych epitopów na ich receptorze docelowym (na przykład EGFR).

• Ze względu na niezależne wiązanie do rożnych epitopów receptora, ilość przeciwciała związanego przez receptor a zatem i przez komórkę może być zwiększona przy tej samej dawce lub stężeniu przeciwciała. W optymalnych warunkach stężeń wysycenia lub dawek dla każdego przeciwciała, liczba cząsteczek przeciwciała związanych przez receptor i przez komórkę może być teoretycznie podwojona, w przypadku zastosowania dwóch przeciwciał skierowanych przeciwko różnym epitopom. Z zastosowaniem każdego dodatkowego przeciwciała mógłby być osiągnięty wzrost liniowy białek przeciwciała związanych przez receptor.

• Komórki o gę stoś ciach antygenu poniż ej progu dla immunologicznych funkcji efektorowych zależnych od przeciwciała, które są oporne na terapię przeciwciałami w normalnych warunkach, wykazują zwiększone ilości przeciwciała na ich powierzchni po leczeniu z zastosowaniem dwóch lub większej liczby przeciwciał skierowanych przeciwko różnym epitopom tego samego receptora i tym samym stają się potencjalnie dostępne dla ADCC i CDC.

• W porównaniu ze skutecznoś cią blokowania receptora uzyskanego tylko za poś rednictwem jednego pojedynczego przeciwciała, zastosowanie dwóch lub większej liczby przeciwciał monospecyficznych ze specyficznością dla różnych epitopów wewnątrz lub w pobliżu domeny wiążącej ligand wyraźnie zwiększa skuteczność blokowania receptora.

• Ponieważ blokada receptora poprzez kombinację róż nych przeciwciał skierowanych przeciwko tej samej domenie receptora jest bardziej efektywne niż blokowanie receptora wyłącznie przez jedno pojedyncze przeciwciało, osiągane jest bardziej efektywne hamowanie wiązania liganda, który skutkuje bardziej efektywną dezaktywacją tego receptora.

• Ta bardziej skuteczna dezaktywacja receptora skutkuje wydajniejszym hamowaniem sygnalizacji receptora biegnącej poniżej na szlaku transmisji sygnału a w konsekwencji zwiększonym wpływem na funkcje komórkowe zależne od liganda.

• Ze wzglę du na bardziej efektywne blokowanie receptora, dawka (lub stężenie) każ dego stosowanego przeciwciała może być zredukowana bez utraty wydajności. Może to być wielką korzyścią w przypadku stosowania przeciwciał terapeutycznych, które wykazują toksycznoś ci ograniczające podawaną dawką lub wywołują efekty uboczne już poniżej terapeutycznie optymalnej dawki.

PL 210 545 B1 • Przeciwciała monospecyficzne, które reagują z jednym pojedynczym epitopem receptora będą pozwalały wyłącznie na tworzenie agregatów składających się z dwóch cząsteczek receptora. Dla porównania, krzyżowe wiązanie receptorów wywołane przez dwa lub większą liczbę przeciwciał skierowanych przeciwko różnym epitopom prowadzi do powstania kompleksów receptor-przeciwciało, które zawierają znacznie większą liczbę receptorów.

• Tworzenie większych kompleksów receptor-przeciwciało wywoływane przez zastosowanie dwóch lub większej liczby przeciwciał polepsza internalizację receptorów i w ten sposób może być skuteczniejsze w usuwaniu receptorów z powierzchni komórek i wynikającej z niej regulacji „w dół funkcji komórkowych zależnych od receptora.

• Kombinacje dwóch lub wię kszej liczby przeciwciał skierowanych przeciwko tym samym lub różnym receptorom mogą być zastosowane do leczenia nowotworów niosących odpowiednie receptory. Nowotwory pozytywne względem EGFR są typowym przykładem, niemniej jednak zastosowanie opisanej zasady terapeutycznej nie jest ograniczone do tego nowotworu. A zatem wiele rozmaitych nowotworów niosących inne receptory, rodziny receptorów lub inne struktury antygenowe może być leczonych z zastosowaniem tej samej zasady.

• Łączone leczenie z wykorzystaniem dwóch lub większej liczby przeciwciał skierowanych przeciwko różnym antygenom na tych samych lub różnych receptorach może zostać również zastosowane w formie terapii łączonej razem z lekami chemioterapeutycznymi i/lub promieniowaniem.

• Łączone leczenie z wykorzystaniem dwóch lub większej liczby przeciwciał skierowanych przeciwko różnym antygenom na tych samych lub różnych receptorach może być również zastosowane w połączeniu z innymi zasadami terapeutycznymi, które obejmują ale nie są ograniczone do leczenia z wykorzystaniem antagonistów lub agonistów hormonów, inhibitorów angiogennych oraz innych sposobów leczenia.

W niniejszym opisie zasada łączonego leczenia z zastosowaniem odpowiednich czą steczek, korzystnie przeciwciał, o różnych specyficznościach do struktur antygenów na tych samych lub różnych receptorach jest przedstawiona w sposób przykładowy do leczenia nowotworów pozytywnych na obecność EGFR. Niemniej jednak zasada ta nie jest ograniczona do EGFR i może być zaadoptowana dla zastosowania z dowolnym innym antygenem docelowym.

Jeżeli nie zostało to w inny szczególny sposób podkreślone, to zawarte w opisie określenia i wyrażenia oznaczają i są zdefiniowane tak jak zostało to opisane poniżej. Ponadto, poniższe definicje i oznaczenia opisują przedmiot wynalazku w sposób bardziej szczegółowy, włączając w to korzystne przykłady realizacji wynalazku.

Określenie „receptor lub „cząsteczka receptora oznacza rozpuszczalne lub związane z błoną białko lub glikoproteinę zawierające jedną lub większą liczbę domen, do których dla utworzenia kompleksu receptor-ligand wiąże się ligand. Poprzez wiązanie ligand ten, który może być agonistą lub antagonistą receptora, jest aktywowany lub dezaktywowany i może inicjować lub blokować szlak transmisji sygnałów.

Określenie „typ cząsteczki receptora lub „ typ cząsteczki receptora ErbB (ErbB1) oznacza określony typ receptora taki jak ErbB1, ErbB2, itd., a nie specyficzną pojedynczą cząsteczkę tego typu receptora. Jeżeli gdzieś w opisie jest napisane, że przeciwciała według wynalazku w zakresie ich kombinacji wiążą się do określonego typu cząsteczki receptora ErbB, to obejmuje to wiązanie przeciwciał do tych samych lub różnych cząsteczek tego samego typu receptora ErbB, który został wskazany. Tak więc możliwe jest, że pierwsze przeciwciało wiąże się do specyficznego epitopu na pojedynczej cząsteczce receptora ErbB1 a drugie przeciwciało wiąże się do innego specyficznego epitopu tej samej pojedynczej cząsteczki receptora ErbB1. Chociaż możliwe jest również, że drugie przeciwciało wiąże się do tego samego innego receptora innej pojedynczej cząsteczki receptora tego samego typu.

Przez określenie „ligand lub „ligand receptora należy rozumieć naturalny lub syntetyczny związek, który wiąże cząsteczkę receptora dla utworzenia kompleksu receptor-ligand. Określenie to obejmuje agonistów, antagonistów i związki o działaniu częściowo agonistycznym a częściowo antagonistycznym.

Określenie „agonista lub „agonista receptora oznacza naturalny lub syntetyczny związek, który wiąże receptor dla utworzenia kompleksu receptor-agonista poprzez aktywowanie tego receptora i kompleksu receptor-agonista, odpowiednio inicjowanie szlaku przekazywania sygnał ów i dalszych procesów biologicznych.

Przez określenie „antagonista lub „antagonista receptora należy rozumieć naturalny lub syntetyczny związek, który wywołuje odwrotny w stosunku do agonisty efekt biologiczny. Antagonista wiąże

PL 210 545 B1 się z receptorem i blokuje czynność agonisty receptora poprzez współzawodniczenie z agonistą o receptor. Antagonista jest zdefiniowany poprzez jego zdolność do blokowania czynnoś ci agonisty. Antagonista receptora może być również przeciwciałem lub jego efektywnym immunoterapeutycznie fragmentem. Korzystni antagoniści według wynalazku są przedstawieni i opisani poniżej.

„Receptor ErbB jest receptorową białkową kinazą tyrozynową, która, jak już określono powyżej, należy do rodziny receptorowej ErbB i obejmuje receptory EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 i ErbB4 oraz innych przedstawicieli tej rodziny, którzy zostaną zidentyfikowani w przyszłości. Ogólnie receptor ErbB będzie zawierał domenę zewnątrzkomórkową, która może wiązać ligand ErbB; lipofilową domenę transbłonową; zakonserwowaną wewnątrzkomórkową domenę kinazy tyrozynowej i domenę sygnalną na C-końcu chroniącą kilka reszt tyrozynowych, które mogą być fosforylowane. Receptor ErbB może być receptorem ErbB o „sekwencji natywnej” lub jej „wariantem sekwencji aminokwasowej. Receptor ErbB jest korzystnie ludzkim receptorem ErbB o sekwencji natywnej. ErbB1 odnosi się do genu kodującego produkty białkowe EGFR. Zgodnie z istotą wynalazku receptorem tym jest receptor EGF (EGFR, HER1). Wyrażenia „ErbB1, „HER1 i „EGFR są w opisie stosowane zamiennie i odnoszą się do ludzkiego białka HER1. Wyrażenia „ErbB2 i „HER2 są w opisie stosowane zamiennie i odnoszą się do ludzkiego białka HER2. Według istoty wynalazku receptorami tymi są receptory ErbB1 (EGFR).

„Ligand ErbB jest polipeptydem, który wiąże się do i/lub aktywuje receptor ErbB. Ligandy ErbB, które wiążą EGFR, obejmują przykładowo EGF, TGF-alpha, amfiregulinę, betacelulinę, HB-EGF i epiregulinę, korzystnie EGF i TGF-alpha.

„Domena wiążąca receptor ErbB” jest w kontekście wynalazku lokalnym regionem (sekwencją wiążącą/pętlą/kieszonką) receptora ErbB, do którego wiąże się ligand naturalny lub lek antagonistyczny lub agonistyczny. Region ten może obejmować nie tylko jedno specyficzne miejsce wiązania lub epitop ale odpowiednio dwa lub większą ilość epitopów i miejsc wiązania. Jeden specyficzny epitop wiązania wewnątrz tej domeny wiąże się z jednym rodzajem leku antagonistycznego lub agonistycznego lub liganda. Niemniej jednak uważa się, że wiązanie różnych czynników do różnych epitopów wewnątrz domeny wiążącej lub epitopów prawie przyległych do domeny wiążącej tego samego typu receptora, poprzez hamowanie lub aktywowanie zasadniczo wywołuje odrębny i unikalny szlak transmisji sygnałów, który jest typowy dla tego receptora. Ponadto należy podkreślić, że stosowane w opisie i zastrzeżeniach sformułowanie „wewnątrz domeny wiążącej obejmuje również lokalizacje w bliskim sąsiedztwie rzeczywistej domeny wiążącej odpowiedniego ligand(y) naturalny(e).

„Epitop wiążący ErbB” lub „miejsce wiązania ErbB oznacza konformację i/lub konfigurację aminokwasów wewnątrz lub w bliskim sąsiedztwie domeny wiążącej receptora ErbB, z którą wiążą się ligandy lub antagoniści/agoniści.

Określenie „taka sama cząsteczka receptora ErbB/ErbB1” niekoniecznie oznacza identyczną cząsteczkę receptora, ale obejmuje również inną cząsteczkę receptora tego samego typu. Korzystnie oznacza ono identyczną cząsteczkę receptora.

Termin „antagonista/inhibitor receptora ErbB oznacza biologicznie efektywną cząsteczkę, która wiąże się z i blokuje lub hamuje receptor ErbB. Tak więc poprzez blokowanie receptora, antagonista zapobiega wiązaniu liganda (agonisty) ErbB i aktywowaniu kompleksu receptorowego agonista/ligand. Antagoniści ErbB mogą być skierowani przeciwko HER1 (ErbB1, EGFR), HER2 (ErbB2) oraz ErbB3 i ErbB4. Antagoniści według istoty wynalazku są skierowani przeciwko receptorowi EGF (EGFR, HER1). Antagonista receptora ErbB może być przeciwciałem lub jego immunoterapeutycznie efektywnym fragmentem lub cząsteczką nie-immunobiologiczną, taką jak peptyd, polipeptyd. Grupa ta obejmuje również cząsteczki chemiczne, chociaż korzystnymi antagonistami według ogólnej idei wynalazku są przeciwciała anty-EGFR i przeciwciała anty-HER2.

Przeciwciałami takimi według ogólnej idei wynalazku mogą być przeciwciała anty-Her1 i antyHer2, przy czym korzystniejsze są przeciwciała anty-Her1. Przeciwciałami anty-Her1 mogą być MAb 425, na przykład humanizowane MAb 425 (hMAb 425, US 5,558,864; EP 0531 472) i chimeryczne MAb 225 (CETUXIMAB®). Monoklonalne przeciwciało h425 w jednolekowej terapii wykazało wysoką skuteczność w połączeniu ze zredukowanymi skutkami niekorzystnymi i ubocznymi. Mające korzystne właściwości przeciwciało anty-HER2 jest pod nazwą HERCEPTIN® sprzedawany przez firmę Genentech/Roche. Skutecznymi antagonistami receptora EGF mogą być również naturalne lub syntetyczne związki chemiczne. Kilka przykładów cząsteczek z tej kategorii obejmuje związki organiczne, związki metaloorganiczne, sole związków organicznych i metaloorganicznych. Przykładowymi chemicznymi antagonistami receptora HER2 są: związki heteroarylowe podstawione styrylem (opis patentowy US 5,656,655); heteroarylowe, karbocykliczne i heterokarbocykliczne związki bis mono i/lub dwupierPL 210 545 B1 ścieniowego arylu (opis patentowy US 5,646,153); trójpierścieniowe związki pirymidynowe (opis patentowy US 5,679,683); pochodne chinazoliny wykazujące czynność hamowania receptorowej kinazy tyrozynowej (opis patentowy US 5,616,582); związki heteroaryloetenodyilu lub heteroarylo-etenodiylarylu (opis patentowy US 5,196,446); związek określony wzorem 6-(2,6-dichlorofenylo)-2-(4-(2-dietyloaminoetoksy)fenyloamino)-8-metylo-8H-pirydo(2,3)-5-pirymidyno-7-onu (Panek, et al., 1997, J. Pharmacol. Exp. Therap. 283,1433) hamujący rodziny receptorów EGFR, PDGFR I FGFR.

Określenie „antagonista/inhibitor kinazy tyrozynowej według wynalazku odnosi się do naturalnych lub syntetycznych czynników, które są zdolne do hamowania lub blokowania kinaz tyrozynowych, włączając w to receptorowe kinazy tyrozynowe. Tak więc, określenie to obejmuje per se zdefiniowanych powyżej antagonistów/inhibitory receptora ErbB. Za wyjątkiem wspomnianych powyżej i poniż ej przeciwciał receptora anty-ErbB, bardziej korzystnymi czynnikami antagonistycznymi kinazy tyrozynowej są według tej definicji związki chemiczne, które wykazują skuteczność w jednolekowej terapii raka piersi i prostaty. Odpowiednie inhibitory kinazy tyrozynowej typu indolokarbazolowego mogą być otrzymane wykorzystując informacje zaczerpnięte z dokumentów takich jak amerykańskie opisy patentowe US 5,516,771; US 5,654,427; US 5,461,146; US 5,650,407. Opisy patentowe US 5,475,110; US 5,591,855; US 5,594,009 i W096/11933 ujawniają inhibitory kinazy tyrozynowej typu pirolokarbazolowego i raka prostaty. Jednym z najbardziej obiecujących czynników antyrakowych w tym kontekś cie jest gefitinib (IRESSA®, Astra Zeneca), który jak jest to opisywane posiada znakomitą skuteczność terapeutyczną i jest wyjątkowo dobrze tolerowany u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC) jak również z zaawansowanym rakiem głowy i płuc.

Dawka zdefiniowanych powyżej chemicznych inhibitorów kinazy tyrozynowej ma korzystną wartość od 1 pg/kg do 1 g/kg wagi ciała na dzień. Bardziej korzystnie, dawka inhibitorów kinazy tyrozynowej ma wartość od 0.01 mg/kg do 100 mg/kg wagi ciała na dzień.

Cząsteczki biologiczne według ogólnej idei wynalazku są przeciwciałami lub ich fragmentami lub dowolnymi wariantami przeciwciał takimi jak immunokoniugaty.

W tym kontek ś cie, okreś lenie „przeciwciał o lub „immunoglobulina stosowane w opisie jest używane w najszerszym znaczeniu a szczególnie obejmuje ono nienaruszone przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała wielospecyficzne (przykładowo przeciwciała bispecyficzne) utworzone z co najmniej dwóch nienaruszonych przeciwciał, i fragmenty przeciwciała, tak długo jak wykazują one pożądaną aktywność biologiczną. Określenie to ogólnie obejmuje heteroprzeciwciała, które są złożone z dwóch lub większej liczby przeciwciał lub ich fragmentów o różnej specyficzności wiązania, które są ze sobą razem połączone.

W zależ noś ci od sekwencji aminokwasowej ich części stał ych, nienaruszone przeciwciał a mog ą być przypisane do różnych „klas przeciwciał (immunoglobulin). Istnieje pięć głównych klas nienaruszonych przeciwciał: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich może być dalej podzielona na „podklasy (izotypy), przykładowo lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA i lgA2. Domeny stałe łańcucha ciężkiego, które odpowiadają różnym klasom przeciwciał, są nazywane odpowiednio α, δ, ε, γ i μ. Główną klasą dla przeciwciał według ogólnej idei wynalazku jest klasa IgG, a bardziej szczegółowo lgG1 i lgG2.

Przeciwciała są zwykle glikoproteinami o masie cząsteczkowej wynoszącej około 150.000, złożonymi z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim poprzez pojedyncze kowalencyjne wiązanie disulfidowe, podczas gdy liczba wiązań disulfidowych pomiędzy łańcuchami ciężkimi jest zmienna w przypadku róż nych izotypów immunoglobulin. Między każ dym ł a ń cuchem ciężkim i lekkim znajdują się również regularnie rozmieszczone wewnątrzłańcuchowe mostki disulfidowe. Każdy łańcuch ciężki posiada na jednym końcu domenę zmienną (VH), po której następuje kilka domen stałych. Każdy łańcuch lekki posiada domenę zmienną (VL) na jednym końcu i domenę stałą na drugim końcu. Domena stała łańcucha lekkiego jest wyrównana z pierwszą domeną stałą łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego jest wyrównana z domeną zmienną łańcucha ciężkiego. Przypuszcza się, że poszczególne reszty aminokwasowe tworzą połączenie pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i ciężkiego. „Łańcuchy lekkie przeciwciał od dowolnych gatunków kręgowców mogą być przypisane do jednego z dwóch wyraźnie odmiennych typów, nazywanych kappa (κ) i lambda (λ), w oparciu o sekwencje aminokwasowe ich domen stałych.

Określenie „przeciwciało monoklonalne używane w opisie odnosi się do przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogenicznych przeciwciał, to znaczy poszczególne przeciwciała tworzące populację są identyczne za wyjątkiem możliwych, naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w nieznacznych ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne, będąc skie12

PL 210 545 B1 rowanymi przeciwko pojedynczemu miejscu antygenowemu. Ponadto, w przeciwieństwie do preparatów z przeciwciał poliklonalnych, które zawierają różne przeciwciała skierowane przeciwko różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciwko pojedynczemu determinantowi na antygenie. Dodatkowo poza ich specyficznością, korzystną cechą przeciwciał monoklonalnych jest to, że mogą one być syntetyzowane przez inne przeciwciała w stanie niezanieczyszczonym. Sposoby otrzymywania przeciwciał monoklonalnych obejmują metodę hybrydomy opisaną przez Kohler'a i Milstein'a (1975, Nature 256, 495) i przedstawioną w pracy „Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas (1985, Burdon et al., Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam), lub mogą być zrealizowane według dobrze znanych metod rekombinacji DNA (zobacz przykładowo opis patentowy US 4,816,567). Przeciwciała monoklonalne mogą być również izolowane z bibliotek przeciwciał fagowych z wykorzystaniem technik opisanych na przykład w pracy: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991).

Określenie „przeciwciało chimeryczne oznacza przeciwciała, w których część łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego jest identyczna z lub homologiczna do odpowiednich sekwencji w przeciwciałach pochodzących od poszczególnych gatunków lub należących do konkretnej klasy lub podklasy przeciwciał, podczas gdy reszta łańcucha (łańcuchów) jest identyczna z lub homologiczna do odpowiednich sekwencji w przeciwciałach pochodzących od innych gatunków lub należących do innych klas lub podklas przeciwciał, jak również ich fragmenty, tak długo jak wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (przykładowo: opis patentowy US 4,816,567; Morrison et al.. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Sposoby wytwarzania chimerycznych i humanizowanych przeciwciał są również dobrze znane ze stanu techniki. Przykładowo, metody wytwarzania przeciwciał chimerycznych obejmują sposoby przedstawione w opisach patentowych Boss'a (Celltech) i Cabilliego (Genentech) (US 4,816,397; US 4,816,567).

„Przeciwciała humanizowane są formami nie-ludzkich (przykładowo od gryzoni) przeciwciał chimerycznych, które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą od immunoglobuliny nie-ludzkiej. W większej części, przeciwciała humanizowane są immunoglobulinami ludzkimi (przeciwciało biorcy), w których reszty z regionu hiperzmiennego (ODR) biorcy są zastę powane przez reszty z regionu hiperzmiennego gatunków nie-ludzkich (przeciwciało dawcy) takich jak mysz, szczur, królik lub makaki posiadające pożądaną specyficzność, powinowactwo lub wydajność. W kilku przypadkach, reszty regionu zrębowego (FR) immunoglobuliny ludzkiej są zastąpione przez odpowiednie reszty nieludzkie. Ponadto, przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty, które nie znajdują się w przeciwciale biorcy lub w przeciwciale dawcy. Modyfikacje te są realizowane dla dalszego udoskonalenia wydajności przeciwciała. Ogólnie, przeciwciało humanizowane będzie zawierało zasadniczo wszystkie z co najmniej jednej, a typowo dwóch, domen zmiennych, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie pętle hiperzmienne odpowiadają pętlom w nie-ludzkiej immunoglobulinie a wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony zrębowe FR są regionami zrębowymi posiadającymi sekwencję ludzkiej immunoglobuliny. Opcjonalnie, przeciwciała humanizowane będą również zawierały co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), a typowo regionu ludzkiej immunoglobuliny. Sposoby wytwarzania przeciwciał humanizowanych są przedstawione na przykład w opisach patentowych zgłoszonych przez firmy Winter (US 5,225, 539) i Boss (Celltech, US 4,816, 397).

„Fragmenty przeciwciała obejmują część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie zawierającą region wiążący antygen lub region zmienny. Przykłady fragmentów przeciwciała obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab')2, Fv i Fc, diciałka (ang. diabodies), przeciwciała liniowe, jednołańcuchowe cząsteczki przeciwciała i przeciwciała wielospecyficzne utworzone z fragmentu (fragmentów) przeciwciała. „Nienaruszone przeciwciało jest przeciwciałem, które zawiera region zmienny wiązania antygenu jak również domenę stałą łańcucha lekkiego (CL) i domeny stałe łańcucha ciężkiego: CH1, CH2 i CH3. Nienaruszone przeciwciało posiada korzystnie jedną lub większą liczbę funkcji efektorowych. Trawienie przeciwciał papainą daje dwa identyczne fragmenty wiążące antygen, nazywane fragmentami „Fab, z których każ dy zawiera pojedyncze miejsce wią zania antygenu oraz region CL i CH1, i resztkowy fragment „Fc, którego nazwa odzwierciedla jego zdolność do łatwej krystalizacji.

Region „Fc przeciwciał obejmuje z reguły CH2, CH3 i region zawiasowy głównej klasy przeciwciała lgG1 lub lgG2. Region zawiasowy jest grupą około 15 reszt aminokwasowych, które łączą region CH1 z regionem CH2-CH3.

PL 210 545 B1

Potraktowanie pepsyną daje w rezultacie fragment „F(ab')2, który posiada dwa miejsca wiązania antygenu i w dalszym ciągu jest zdolny do krzyżowego łączenia antygenu.

„Fv jest niewielkim fragmentem przeciwciała, który zawiera kompletne miejsce rozpoznające oraz wiążące antygen. Region ten składa się z dimeru, który stanowi domenę zmienną jednego łańcucha ciężkiego i domenę zmienną jednego łańcucha lekkiego będące bliskim związku niekowalencyjnym. W takiej konfiguracji, trzy regiony hiperzmienne (CDR) każdej domeny zmiennej oddziałują ze sobą w celu określenia miejsca wiązania antygenu na powierzchni dimeru VH-VL. Sześć regionów hiperzmiennych wspólnie nadaje przeciwciału specyficzność wiązania antygenu. Niemniej jednak nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv zawierająca tylko trzy regiony hiperzmienne o specyficzności do antygenu) ma zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, chociaż z niższym powinowactwem niż całe miejsce wiązania.

Fragment „Fab zawiera również domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego i posiada tylko jedno miejsce wiązania antygenu.

Fragmenty „Fab' różnią się od fragmentów Fab dodatkowymi kilkoma resztami na końcu karboksylowym domeny łańcucha ciężkiego CH1 obejmującym jedną lub większą liczbę cystein z regionu zawiasowego przeciwciała.

Fragmenty przeciwciała F(ab')2 zostały pierwotnie wyprodukowane jako pary fragmentów Fab', pomiędzy którymi znajdowały się reszty cysteiny z regionu zawiasowego. Znane są również inne cłiemiczne sprzęgacze fragmentów przeciwciała (zobacz na przykład Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996; US 4,342,566).

Fragmenty przeciwciała „jednołańcuchowe Fv lub „scFv zawierają domeny VH, i VL, przeciwciała, przy czym domeny te są obecne w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Ponadto polipeptyd Fv może zawierać łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami VH i VL, który umożliwia scFv utworzenie pożądanej struktury wiązania antygenu. Przeciwciała jednołańcuchowe FV są znane na przykład z pozycji: Ptockthun (The Pharmacology of Monoclonal antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)), W093/16185 ; US 5,571,894; US 5,587,458; Huston et al. (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85,5879) lub Skerra i Plueckthun (1988, Science 240,1038).

Termin „zmienny lub „FR odnosi się do faktu, że pewne części domen zmiennych różnią się znacznie w sekwencji pomiędzy przeciwciałami i są użyte w wiązaniu i specyficzności każdego pojedynczego przeciwciała do jego indywidualnego antygenu. Niemniej jednak zmienność ta nie jest równomiernie rozmieszczona na wszystkich domenach zmiennych przeciwciał. Jest ona skoncentrowana w trzech segmentach nazywanych regionami „hiperzmiennymi zarówno w domenach zmiennych łańcuchów lekkich jak i domenach zmiennych łańcuchów ciężkich. Silnie zakonserwowane części domen zmiennych są nazywane regionami zrębowymi (FR). Każda z domen zmiennych naturalnych łańcuchów ciężkich i lekkich zawiera cztery regiony FR (FR1-FR4), w dużej mierze przyjmujące konfigurację β-strony (ang. β-sheet), połączone przez trzy regiony hiperzmienne, które tworzą pętle łączące, a w niektórych przypadkach tworzące część struktury p-strony. Regiony hiperzmienne są w każdym łańcuchu utrzymywane w dużej bliskości przez regiony FR i, razem z regionami hiperzmiennymi z innego łańcucha, przyczyniają się do tworzenia miejsca wiązania antygenu przeciwciał (zobacz Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Domeny stałe nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązanie przeciwciała do antygenu ale wykazują różne funkcje efektorowe, takie jak uczestniczenie przeciwciała w mechanizmie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). Stosowane w opisie określenie „region hiperzmienny lub „CDR odnosi się do reszt aminokwasowych przeciwciała, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Ogólnie, region hiperzmienny obejmuje reszty aminokwasowe z „regionu wyznaczającego komplementarność lub „CDR (przykładowo reszty 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; i/lub takie reszty z „pętli hiperzmiennej (przykładowo reszty 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i reszty 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917(1987)). Jak zostało to zdefiniowane w opisie, reszty „regionu zrębowego lub „FR są tymi resztami domeny zmiennej, które są inne niż reszty regionu hiperzmiennego.

Określenie „monospecyficzny odnosi się do przeciwciał według wynalazku, w których dwa miejsca wiązania przeciwciała mają taką samą specyficzność, będąc w ten sposób zdolnymi do wiązania się do tego samego epitopu na receptorze. Według ogólnej idei wynalazku, kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać przeciwciała monospecyficzne.

PL 210 545 B1 „Przeciwciała bispecyficzne (BAb) są pojedynczymi, dwuwartościowymi przeciwciałami (lub ich terapeutycznie efektywnymi fragmentami), które posiadają dwa miejsca wiązania antygenu o różnej specyficzności. Według ogólnej idei wynalazku przeciwciała BAb są określane jako BAb <MAb 1, MAb 2>, przy czym <MAb 1> i <MAb 2> oznaczają miejsca wiązania antygenu pochodzące od MAb 1 i MAb 2. Na przykład pierwsze miejsce wiązania antygenu jest ukierunkowane na receptor procesu angiogenezy (na przykład integrynę lub receptor VEGF), podczas gdy drugie miejsce wiązania antygenu jest ukierunkowane na receptor ErbB (na przykład EGFR lub HER2). Przeciwiciała bispecyficzne mogą być produkowane technikami chemicznymi (zobacz na przykład, Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,5807), technikami polidoma (zobacz opis patentowy US 4,474,893) lub technikami rekombinacji DNA, które wszystkie są dobrze znane per se. Kolejne metody są przedstawione w opisach patentowych WO 91/00360, WO 92/05793 i WO 96/04305. Przeciwciała bispecyficzne mogą być również otrzymane z jednołańcuchowych przeciwciał (zobacz na przykład, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85,5879; Skerra and Plueckthun (1988) Science 240, 1038). Istnieją analogi regionów zmiennych przeciwciała wytwarzane jako pojedynczy łańcuch polipeptydowy. Dla utworzenia bispecyficznego czynnika wiążącego, jednołańcuchowe przeciwciała mogą być sprzęgane ze sobą chemicznie lub metodami inżynierii genetycznej znanymi ze stanu techniki. Możliwe jest również wytworzenie przeciwciał bispecyficznych według wynalazku z zastosowaniem sekwencji zamka (suwaka) leucynowego. Zastosowane w tym przypadku sekwencje pochodzą z regionów zamka leucynowego czynników transkrypcyjnych Fos i Jun (Landschulz et al., 1988, Science 240,1759; do przeglądu, patrz Maniatis and Abel, 1989, Naturę 341,24). Zamki leucynowe są specyficznymi sekwencjami aminokwasowymi o długości około 20-40 reszt, przy czym leucyna występuje typowo na każdej co siódmej reszcie. Takie sekwencje zamka leucynowego tworzą amfipatyczne α-helisy, z resztami leucynowymi przyłączonymi po hydrofobowej stronie układu dimera. Peptydy odpowiadające zamkom leucynowym białek Fos i Jun tworzą preferencyjnie heterodimery (0'Shea et al., 1989, Science 245,646). Zamek zawierający przeciwciała bispecyficzne jak i sposoby ich wytwarzania są również ujawnione w opisach patentowych WO 92/10209 i WO 93/11162.

Termin „białko fuzyjne odnosi się do naturalnej lub syntetycznej cząsteczki zawierającej jedną lub większą liczbę zdefiniowanych powyżej cząsteczek biologicznych, przy czym dwie lub większa liczba cząsteczek opartych na peptydzie lub białku (włączając w to glikoproteiny) posiadających różną specyficzność jest złączona razem opcjonalnie przez chemiczne cząsteczki linkerowe lub cząsteczki linkerowe oparte na aminokwasach. Połączenie to może zostać uzyskane poprzez fuzję C-N lub fuzję N-C (w kierunku 5' >3'), korzystnie poprzez fuzję C-N. Niemniej jednak korzystnymi białkami fuzyjnymi według ogólnej idei wynalazku są zdefiniowane poniżej immunokoniugaty.

Termin „immunokoniugat odnosi się do białka fuzyjnego i oznacza odpowiednio przeciwciało lub immunoglobulinę lub ich immunologicznie efektywny fragment, który jest połączony wiązaniem kowalencyjnym z nie-immunologicznie efektywną cząsteczką. Taką cząsteczką fuzyjną może być peptyd lub białko, które może być glikozylowane. Taka cząsteczka nieimmunologiczna może być przyłączona do końca stałych łańcuchów ciężkich przeciwciała lub do N-końców zmiennych łańcuchów lekkich i/lub ciężkich. Współuczestnicy wiązania mogą być połączeni poprzez cząsteczkę linkerową, która w zasadzie jest peptydem zawierającym 3-15 reszt aminokwasowych. Immunokoniugaty takie są białkami fuzyjnymi składającymi się z immunoglobuliny lub jej immunoterapeutycznie efektywnego fragmentu, które są skierowane przeciwko receptorowi ErbB, na przykład cytokinie, takiej jak TNFa, IFNy lub IL-2, lub innemu toksycznemu czynnikowi. Takie cząsteczki oparte na peptydzie lub białku mogą być połączone swoim N-końcem do C-końca takiej immunoglobuliny, który jest jej częścią Fc.

„Heteroprzeciwciała są białkami fuzyjnymi składającymi się zasadniczo z dwóch lub większej liczby przeciwciał lub fragmentów wiążących przeciwciała, które są połączone ze sobą poprzez regularnie rozmieszczone chemiczne łączniki krzyżowe, a każde z tych przeciwciał posiada różną specyficzność wiązania. Heteroprzeciwciała mogą być otrzymywane poprzez koniugację ze sobą dwóch lub większej liczby przeciwciał lub fragmentów przeciwciała. Takie heteroprzeciwciała mogą zawierać połączone ze sobą krzyżowo fragmenty Fab/Fab'. Dla procesu koniugacji przeciwciał mogą zostać użyte różne czynniki sprzęgające lub łączące-krzyżowo. Przykładowymi czynnikami tego rodzaju są białko A, karboimid, N-sukcynoimidylo-S-acetylo-tiooctan (SATA) i N-sukcynoimidylo-3-(2-pirydyloditio) propionian (SPDP) (zobacz przykładowo, Karpovsky et al. (1984) J. EXP. Med. 160, 1686; Liu et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8648). Inne metody obejmują sposoby opisane przez: Paulus, Behring Inst. Mitt., No. 78, 118 (1985); Brennan et al. (1985) Science 30, 81, lub Glennie et al. (1987), J. Immunol. 139, 2367. Inna metoda wykorzystuje o-fenylenodimaleimid (oPDM) dla sprzęgaPL 210 545 B1 nia trzech fragmentów Fab' (opis patentowy WO 91/03493). Według ogólnej idei wynalazku, odpowiednie do zastosowania mogą być również przeciwciała wielospecyficzne, które mogą być otrzymywane przykładowo według sposobów ujawnionych w opisach patentowych WO 94/13804 i WO 98/50431. Takim heteroprzeciwciał em moż e być biał ko fuzyjne zawierają ce dwa przeciwciał a anty-EGFR (każde z przeciwciał jest skierowane przeciwko różnym epitopom tego samego receptora) połączone ze sobą w opisywany sposób (na przykład MAB 425 - MAB 225).

Określenie „cytokina jest określeniem ogólnym dla białek uwolnionych przez populację jednej komórki, które oddziałują na inną komórkę jako mediatory międzykomórkowe. Przykładami takich cytokin są limfokiny, monokiny i tradycyjne hormony polipeptydowe. Cytokiny obejmują hormony wzrostu, takie jak ludzki hormon wzrostu, N-metionylowy ludzki hormon wzrostu i wołowy hormon wzrostu; hormon przytarczycy; tyroksyna; insulina; proinsulina; relaksyna; prorelaksyna; hormony glikoproteinowe takie jak hormon stymulujący dojrzewanie pęcherzyków w jajniku (FSH), hormon stymulujący tarczycę (TSH) i hormon luteinizujący (LH); wątrobowy czynnik wzrostu; czynnik wzrostu fibroblastu; prolaktyna; laktogen łożyskowy; peptyd związany z mysią gonadotropiną; inhibina; aktywina; czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF); integryna; trombopoetyna (TPO); czynniki wzrost nerwu, takie jak NGFe; czynnik wzrostu płytek krwi; transformacyjne czynniki wzrostu (TGF), takie jak TGFa i TGFe; erytropoetyna (EPO); interferony, takie jak IFNa, IFNe i IFNy; czynniki stymulujące tworzenie kolonii, takie jak M-CSF, GM-CSF i G-GSF; interleukiny, takie jak IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; oraz TNF-α lub TNF-β. Korzystnymi cytokinami są interferony, TNF-α i IL-2.

Określenie „funkcje efektorowe przeciwciała odnosi się do tych biologicznych czynności, które dają się przypisać do regionu Fc (regionu Fc o naturalnej sekwencji lub regionu Fc o wariancie sekwencji aminokwasowej) przeciwciała. Przykłady funkcji efektorowych przeciwciała obejmują cytotoksyczność zależną od dopełniacza, wiązanie receptora Fc, mechanizm cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), fagocytozę; regulację „w dół receptorów powierzchni komórkowej (przykładowo receptorów komórkowych B), itd.

Określenie „ADCC (mechanizm cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał) odnosi się do reakcji za pośrednictwem komórki, w której niespecyficzne komórki cytotoksyczne, które wywołują ekspresję receptorów Fc (FcR) (na przykład naturalne komórki niszczące (NK), neutrofile i makrofagi), rozpoznają związane na komórce docelowej przeciwciało a następnie powodują lizę komórki docelowej. Podstawowe komórki pośredniczące w ADCC, jakimi są komórki NK, wywołują jedynie ekspresję FcyRIII, podczas gdy monocyty wywołują ekspresję FcyRI, FcyRII i FcyRIII. Dla ustalenia aktywności ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić test in vitro ADCC, taki jak ten, który został opisany w stanie techniki (US 5,500,362; US 5,821,337). Użytecznymi komórkami efektorowymi dla takiego testu są komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i naturalne komórki niszczące (NK).

Określenia „receptor Fc lub „FcR są używane dla opisania receptora, który wiąże się z regionem Fc przeciwciała. FcR może być ludzkim FcR o sekwencji natywnej. Ponadto, FcR może być FcR, który wiąże przeciwciało IgG (receptor gamma) i obejmuje receptory podklas FcyRI, FcyRII i FcyRIII, włączając w to odmiany alleliczne i alternatywne formy tych receptorów otrzymane w wyniku mechanizmu splicingu. Przegląd FcR-ów jest zamieszczony w pracy: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92(1991).

Terapeutyczne podejście według ogólnej idei wynalazku jako specyficzny przykład realizacji obejmuje podawanie kolejnych efektywnych czynników cytotoksycznych, które wspierają pożądany efekt, przykładowo skuteczność cytotoksyczności nowotworowej. Tak więc wynalazek obejmuje kombinację takich czynników z kompozycją farmaceutyczną zdefiniowaną i zastrzeżoną powyżej i poniżej, przy czym takimi czynnikami mogą być czynniki cytotoksyczne. Wynalazek związany jest również z połączeniem zdefiniowanych w opisie kompozycji z radioterapią prowadzoną znanymi metodami.

Stosowane w tym kontekście określenie „czynnik cytotoksyczny jest zdefiniowane bardzo szeroko i odnosi się do substancji, która hamuje lub uniemożliwia funkcjonowanie komórek i/lub powoduje zniszczenie komórek (śmierć komórki), i/lub wywiera skutki anty-neoplastyczne/anty-proliferacyjne, przykładowo zapobiega bezpośrednio lub pośrednio rozwojowi, dojrzewaniu i rozprzestrzenianiu się neoplastycznych komórek nowotworowych. Określenie to obejmuje również bardzo wyraźnie takie czynniki, które powodują wyłącznie efekt cytostatyczny a nie sam efekt cytotoksyczny. Określenie to obejmuje wymienione poniżej czynniki chemioterapeutyczne, jak również innych antagonistów ErbB (takich jak przeciwciała anty-ErbB), czynniki anty-angiogenne, inhibitory kinazy tyrozynowej, inhibitory

PL 210 545 B1 kinazy białkowej A, przedstawicieli rodziny cytokin, izotopy radioaktywne oraz toksyny takie jak enzymatycznie aktywne toksyny pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego.

Określenie „czynnik chemioterapeutyczny stanowi podzbiór określenia „czynnik cytotoksyczny i w szczególności oznacza czynniki chemiczne, które wywierają efekty anty-neoplastyczne, korzystnie bezpośrednio na komórki nowotworowe a mniej korzystnie pośrednio poprzez mechanizmy takie jak modyfikacja odpowiedzi biologicznej. Odpowiednimi czynnikami chemioterapeutycznymi według wynalazku są ogólnie naturalne i syntetyczne związki chemiczne. Istnieje duża liczba chemicznych czynników anty-neoplastycznych dostępnych komercyjnie, znajdujących się w fazie analiz klinicznych i przedklinicznych, które mogłyby być zawarte w zakresie wynalazku dla leczenia nowotworu/powstawania nowotworu (neoplazji) przez terapię łączoną z antagonistami receptora opisywanymi i zastrzeganymi zgodnie z wynalazkiem. Należy podkreślić , że według wynalazku czynniki chemioterapeutyczne mogą być opcjonalnie podawane razem z tymi przeciwciałami anty-EGFR.

Przykłady czynników chemioterapeutycznych obejmują czynniki alkilujące, na przykład gorczyce azotowe, związki etylenoiminy, sulfoniany alkilowe i inne związki o działaniu alkilującym, takie jak nitrozomoczniki, cisplatyna i dekarbazyna; antymetabolity, na przykład kwas foliowy, antagoniści puryny lub pirymidyny; inhibitory mitotyczne, na przykład alkaloidy z rośliny rodzaju Vinca i pochodne podofilotoksyny; antybiotyki cytotoksyczne i pochodne kamptotecyny.

Korzystnymi czynnikami chemioterapeutycznymi są cisplatyna, doksorubicyna (adriamycyna), gemcytabina (Gemzar), bleomycyna, paklitaksel (taksol), docetaksel (Taxotere). Innymi przykładowymi czynnikami terapeutycznymi są dekarbazyna (DTIC), daktynomycyna, mechloretamina (gorczyca azotowa), streptozocyna, cyklofosfamid, karmustyna (BCNU), lomustyna (CCNU), doksorubicyna lipo (Doxil), daunorubicyna, daunorubicyna lipo (Daunoxome), prokarbazyna, mitomycyna, cytarabina, etopozyd, metotreksat, 5-fluorouracyl (5-FU), winblastyna, winkrystyna, aldesleukina, asparaginaza, busulfan, karboplatyna, kladrybina, kamptotecyna, CPT-11, 10-hydroksy-7-etylo-kamptotecyna (SN38), gefitinib (Iressa), dakarbazyna, Floxuridine, fludarabina, hydroksymocznik, ifosfamid, idarubicyna, Mesna, interferon alfa, interferon beta, irynotekan, mitoksantron, topotekan, leuprolid, megestrol, melfalan, merkaptopuryna, plikamycyna, mitotan, pegaspargaza, pentostatyn, pipobroman, streptozocyna, tamoksyfen, tenipozyd, testolakton, tioguanina, tiotepa, uramustyna, winorelbina, chlorambucyl i ich kombinacje.

Określenie „czynnik anty-angiogenny odnosi się do naturalnego lub syntetycznego związku, który blokuje lub w pewnym stopniu ingeruje w rozwój naczyń krwionośnych. Cząsteczka antyangiogenna może być przykładowo cząsteczką biologiczną, która wiąże się do i blokuje angiogenny czynnik wzrostu lub receptor czynnika wzrostu. W takim przypadku cząsteczka antyangiogenna może wiązać się do receptora, przykładowo do receptora integryny lub do receptora VEGF. Określenie to według wynalazku obejmuje również proleki takiego czynnika angiogennego. Określenie to ponadto obejmuje czynniki efektywne opisane jak również sklasyfikowane jako czynniki cytotoksyczne, korzystnie chemioterapeutyczne.

Istnieje wiele cząsteczek posiadających różną strukturę i pochodzenie, które ujawniają właściwości antyangiogenne. Najbardziej istotnymi klasami czynników hamujących lub blokujących angiogenezę, które są odpowiednie dla wynalazku, są przykładowo:

(i) anty-mitotyki takie jak fluorouracyl, mitomycyna-C, taksol;

(ii) metabolity estrogenowe takie jak 2-metoksyestradiol;

(iii) inhibitory metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP), które hamują metaloproteinazy cynku (metaloproteazy) (na przykład betimastat, BB16, TIMPs, minocyklina, GM6001 lub związki opisane w „Inhibition of Matrix Metalloproteinases: Therapeutic Applications (Golub, Annals of the New York Academy of Science, Vol. 878a; Greenwald, Zucker (Eds.), 1999));

(iv) wielo-funkcjonalne czynniki anty-angiogenne i związki takie jak, IFNa (US 4,530,901; US 4,503,035; US 5,231,176); fragmenty angiostatyny i plazminogenu (na przykład kringle1-4, kringle 5, kringle 1-3 (O'Reilly, M. S. et al.. Cell (Cambridge, Mass.) 79(2): 315-328, 1994; Cao et al., J. Biol.

Chem. 271: 29461-29467,1996; Cao et al., J. Biol. Chem 272: 22924-22928, 1997); endostatyna (O'Reilly, M. S. et al.. Cell 88(2), 277, 1997 i opis patentowy WO 97/15666), trombospondyna (TSP-1; Frazier, 1991, Curr Opin Cell Biol 3(5): 792); czynnik płytkowy 4 (PF4);

(v) inhiibitory aktywatora plazminogenu/urokinazy;

(vi) antagoniści receptora urokinazy;

(vii) heparynazy;

(viii) analogi fumagiliny takie jak TNP-470;

PL 210 545 B1 (ix) inhibitory kinazy tyrozynowej takie jak SUI 0. Wielu z wymienionych powyżej i poniżej antagonistów receptora ErbB (antagonistów EGFR/HER2) jest również inhibitorami kinazy tyrozynowej, i dlatego mogą oni wykazywać aktywność do blokowania receptora anty-EGF, która prowadzi do hamowania wzrostu nowotworu, jak również aktywność anty-angiogenną, która prowadzi odpowiednio do hamowania rozwoju naczyń krwionośnych i komórek śródbłonkowych;

(x) suramin i analogi suraminu;

(xi) steroidy angiostatyczne;

(xii) antagoniści VEGF i bFGF;

(xiii) antagoniści receptora VEGF, tacy jak przeciwciała receptora anty-VEGF (DC-101);

(xiv) antagoniści flk-1 i flt-1;

(xv) inhibitory cyklooksygenazy-ll;

(xvi) antagoniści integryny i antagoniści receptora integryny, tacy jak antagoniści αν i antagoniści receptora αν, na przykład przeciwciała receptora anty-αν i peptydy RGD. Według ogólnej idei wynalazku korzystni są antagoniści (receptora) integryny.

Określenie „antagoniści/inhibitory integryny lub „antagoniści/inhibitory receptora integryny odnoszą się do naturalnej lub syntetycznej cząsteczki, która blokuje lub hamuje receptor integryny. W niektórych przypadkach, określenie to obejmuje antagonistów skierowanych przeciwko ligandom takich receptorów integryny (takich jak dla ανβ3: witronektyna, fibryna, fibrynogen, czynnik von Willebranda, trombospondyna, laminina; dla ανβ5: witronektyna; dla ανβ1: fibronektyna i witronektyna dla ανβ6: fibronektyna).

Antagoniści tacy mogą być skierowani przeciwko receptorom integryny. Antagoniści (receptora) integryny mogą być naturalnymi lub syntetycznymi peptydami, niepeptydami, peptydomimetykami, immunoglobulinami, takimi jak przeciwciała albo ich funkcjonalne fragmenty, albo immunokoniugatami (białkami fuzyjnymi).

Inhibitory integryny mogą być skierowane na receptor integryny αν (na przykład ανβ3, ανβ5, ανβ6 i podklasy). W szczególności inhibitory integryny mogą być antagonistami αν a w szczególności antagonistami ανβ3. Przykładowymi antagonistami αν są peptydy RGD, antagoniści peptydomimetyczni (niepeptydowi) i przeciwciała receptora anty-integryny, takie jak przeciwciała blokujące receptory αν. Przykładowi nie-immunologiczni antagoniści ανβ3 są ujawnieni w opisach patentowych US 5,753,230 i US 5,766,591. Antagoniści tacy mogą być liniowymi i cyklicznymi peptydami zawierającymi RGD. Peptydy cykliczne są, z reguły, bardziej stabilne i wykazują ulepszone okresy półtrwania w surowicy. Niemniej jednak najbardziej odpowiednim antagonistą integryny według ogólnej idei wynalazku jest cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (EMD 121974, Cilengitide®, Merck KgaA, Germany; EP 0770 622), który jest skuteczny w blokowaniu receptorów integryny α_νβ₃, α_νβ₁, α_νβ₆, α_νβ₈, a_IIbe₃.

Odpowiedni antagoniści peptydowi jak również peptydomimetyczni (niepeptydowi) receptora integryny ανβ3/ανβ5/ανβ6 zostali opisani zarówno w literaturze naukowej jak i patentowej. Przykładowo można w tym miejscu nawiązać do pozycji: Hoekstra and Poulter, 1998, Curr. Med. Chem. 5, 195; WO 95/32710; WO 95/37655; WO 97/01540; WO 97/37655; WO 97/45137; WO 97/41844; WO 98/08840; WO 98/18460; WO 98/18461; WO 98/25892; W098/31359; WO 98/30542; WO 99/15506; WO 99/15507; WO 99/31061; WO 00/06169; EP 0853 084; EP 0854 140; EP 0854 145; US 5,780,426 i US 6,048,861. Opisy patentowe, które ujawniają benzozepinę jak również powiązane z nią benzodiazepinę i benzocykloheptan będące antagonistami receptora integryny ανβ3, które również mogą być odpowiednie do zastosowania według ogólnej idei wynalazku, obejmują opisy patentowe: WO 96/00574, WO 96/00730, WO 96/06087, WO 96/26190, WO 97/24119, WO 97/24122, WO 97/24124, WO 98/15278, WO 99/05107, WO 99/06049, WO 99/15170, WO 99/15178, WO 97/34865, WO 97/01540, WO 98/30542, WO 99/11626 i WO 99/15508. Inni antagoniści receptora integryny charakteryzujący się ograniczeniami konformacyjnymi pierścienia strukturalnego zostali przedstawieni w opisach patentowych: WO 98/08840; WO 99/30709; WO 99/30713; WO 99/31099; WO 00/09503; US 5,919,792; US 5,925,655; US 5,981,546 i US 6,017,926. W opisach patentowych US 6,048,861 i WO 00/72801 zostały ujawnione szeregi pochodnych kwasu nonanowego, które są silnymi antagonistami receptora integryny ανβ3. Inni chemiczni małocząsteczkowi antagoniści integryny (głównie antagoniści witronektyny) są opisani w opisie patentowym WO 00/38665. Zostało wykazane, że inni antagoniści receptora ανβ3 są skuteczni w hamowaniu angiogenezy. Przykładowo syntetyczni antagoniści receptora, tacy jak kwas (S)-10,11-Dihydro-3-[3-(pirydyno-2-yloamino)-1-propyloksylo]-5H-dibenzo[a,d]cycloheptene-10-octowy (znany jako SB-265123), zostali przetestowani w rozmaitych systemach modelowych ssaków (Keenan et al., 1998, Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(22), 3171;

PL 210 545 B1

Ward et al., 1999, Drug Metab. Dispos. 27(11), 1232). Metody identyfikacji antagonistów integryny odpowiednich do zastosowania w charakterze antagonisty są opisane na przykład w: Smith et al., 1990, J. Biol. Chem. 265,12267, i w literaturze patentowej, do której czyni się tu odniesienia. Dobrze znane są również przeciwciała receptora anty-integryny. Odpowiednie anty-integrynowe (przykładowo ανβ3, ανβ5, ανβ6) przeciwciała monoklonalne mogą być zmodyfikowane dla otoczenia ich fragmentów wiążących antygen, włączając w to F(ab)2, Fab i zbudowania Fv lub przeciwciała jednołańcuchowego. Jedno odpowiednie tego rodzaju przeciwciało monoklonalne ukierunkowane przeciwko receptorowi integryny ανβ3 jest zidentyfikowane jako LM609 (Brooks et al., 1994, Cell 79, 1157; ATCC HB 9537).

Silnie specyficzne przeciwciało anty-a_ve₅, P1F6, które również może być korzystne według ogólnej idei wynalazku, jest ujawnione w opisie patentowym WO 97/45447. Kolejnym odpowiednim przeciwciałem selektywnym względem ανβ6 jest MAb 14D9.F8 (WO 99/37683, DSM ACC2331, Merck KGaA, Germany) jak również MAb 17.E6 (EP 0719 859, DSM AGC2160, Merck KGaA), które jest selektywnie ukierunkowane przeciwko łańcuchowi αν receptorów integryny. Innym odpowiednim przeciwciałem anty-integrynowym jest komercyjnie dostępny Vitraxin®.

Stosowane w opisie określenie „czynnik anty-hormonalny obejmuje naturalne lub syntetyczne związki organiczne lub peptydowe, które działają w celu regulowania lub hamowania oddziaływania hormonów na nowotwory. Bardziej szczegółowo „czynnik anty-hormonalny (1) hamuje produkcję androgenów surowicy, (2) blokuje wiązanie androgenów surowicy do receptorów androgenowych lub (3) hamuje konwersję testosteronu w DHT lub połączenie dwóch lub większej liczby takich związków. Czynnik anty-hormonalny według ogólnej idei wynalazku obejmuje zasadniczo antagonistów receptorów steroidów a bardziej szczegółowo anty-estrogeny obejmujące przykładowo tamoksyfen, raloksyfen, 4(5)-imidazole hamujące aromatazę, 4-hydroksytamoksyfen, trioksyfen, Keoxifene, LY 117018, onapriston i toremifene (Fareston); i anty-androgeny, takie jak flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelina; oraz farmaceutycznie tolerowane sole, kwasy lub pochodne wymienionych powyżej substancji. Określenie to obejmuje również agonistów i/lub antagonistów hormonów glikoproteinowych takich jak folikulostymulina (FSH), tyreotropina (TSH) oraz hormon luteinizujący (LH) i LHRH (hormon uwalniający hormon luteinizujący). Według ogólnej idei wynalazku użytecznym agonistą LHRH jest octan gesereliny, komercyjnie dostępny jako ZOLADEX© (Zeneca). Innym przykładem użytecznego agonisty LHRH jest GANIRELIX© (Roche/Akzo Nobel). Przykładami anty-androgenów steroidowych są octan cyproteronu (CPA) i octan megestrolu, komercyjnie dostępne jako MEGACE® (Bristol-Myers Oncology). Anty-androgeny steroidowe mogą blokować sterczowe receptory androgenowe. Mogą one również hamować uwalnianie LH. CPA jest korzystnie podawane pacjentom w dawkach od 100 mg/dzień do 250 mg/dzień. Anty-androgeny niesteroidowe blokują receptory androgenowe. Mogą one również powodować wzrost poziomów LH surowicy i poziomy testosteronu surowicy. Przykładowym tego rodzaju anty-androgenem niesteroidowym jest flutamid (2-metylo-N-[4-20-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo propanamid), komercyjnie dostępny jako EULEXIN® (Schering Corp.). Flutamid działa antyandrogenne poprzez hamowanie wychwytywania androgenu, poprzez hamowanie jądrowego wiązania androgenu w tkankach docelowych lub poprzez jedno i drugie. Innym anty-androgenem niesteroidowym jest nilutamid, którego nazwą chemiczną jest 5,5-dimetylo-3-[4-nitro-3-(trifluorometylo-4'-nitrofenylo)-4,4-dimetylo-imidazolidino-dion. W kilku przykładach realizacji wynalazku, czynnik antyhormonalny jest kombinacją agonisty LHRH, takiego jak octan leuprolidu, i anty-androgenu, takiego jak flutamid lub nilutamid. Przykładowo, octan leuprolidu może być podawany przez wstrzykiwanie podskórne, śródmięśniowe lub dożylne, a równocześnie flutamid może być podawany doustnie. Czynniki anty-hormonalne według ogólnej idei wynalazku obejmują, jak zostało to powyżej podkreślone, antagonistów receptorów hormonów steroidowych/tarczycowych, włączając w to antagonistów dla innych receptorów nie-przyzwalających, takich jak antagoniści dla RAR, TR, VDR i temu podobne. Co zostanie łatwo zauważone przez znawców dziedziny, wielu antagonistów receptora kwasu retinowego (RAR), zarówno syntetycznych jak i naturalnie występujących, może zostać zastosowanych według ogólnej idei wynalazku.

Podsumowując, kompozycje i zestawy farmaceutyczne według ogólnej idei wynalazku mogą zawierać następujące kombinacje leków:

(i) dwa różne przeciwciała monoklonalne (MAb), ich fragmenty lub immunokoniugaty (korzystnie immunocytokiny), skierowane przeciwko różnym epitopom na receptorze EGF.

(ii) MAb 425 i MAb 225 lub ich fragmenty lub immunokoniugaty (korzystnie immunocytokiny, z których każde jest skierowane przeciwko różnym epitopom receptora EGF.

PL 210 545 B1 (iii) Humanizowane MAb 425 i chimeryczne MAb 225 lub ich fragmenty lub immunokoniugaty (korzystnie immunocytokiny), z których każde jest skierowane przeciwko różnym epitopom receptora EGF.

(iv) Kombinacje od (i) do (iii) w połączeniu z jednym lub większa liczbą czynników cytotoksycznych.

(v) Kombinacje od (i) do (iii), wyjątkowo z MAb 425 i MAb 225 w wersjach mysich, chimerycznych lub humanizowanych lub ich fragmenty lub immunokoniugaty (korzystnie immunocytokiny), w połączeniu z jednym lub wię kszą liczbą czynników chemioterapeutycznych), korzystnie cisplatyna, gemcytabina lub taksolem.

(vi) Kombinacje od (i) do (iii), w szczególności z MAb 425 i MAb 225 w wersjach mysich, chimerycznych lub humanizowanych lub ich fragmenty lub immunokoniugaty (korzystnie immunocytokiny), w połączeniu z innym antagonistą ErbB.

(vii) Kombinacje od (i) do (iii), w szczególności z MAb 425 i MAb 225 w wersjach mysich, chimerycznych lub humanizowanych lub ich fragmenty lub immunokoniugaty (korzystnie immunocytokiny), w połączeniu z przeciwciał em skierowanym przeciwko ErbB-2, korzystnie Herceptin®, lub ErbB-3, ErbB-4.

(viii) Kombinacje od (i) do (iii), w szczególności z MAb 425 i MAb 225 w wersjach mysich, chimerycznych lub humanizowanych lub ich fragmenty lub immunokoniugaty (korzystnie immunocytokiny), w połączeniu z lekami wybranymi z następującej grupy:

• inhibitory kinazy tyrozynowej, takie jak Iressa®;

• czynniki anty-angiogenne, korzystnie inhibitory integryny, bardziej korzystnie peptydy RGD, włączając w to peptydy cykliczne, takie jak cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe- NMeVal) (Cilengitide®, Merck KGaA);

• przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi VEGF, takie jak DC-101, lub antagoniści VEGF;

• inhibitory COX-ll;

• cytokiny, takie jak TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2;

• inhibitory kinazy białkowej A typu I (PKAI), takie jak połączone strukturalne oligonukleotydy antysensowne, jak HYB 165 (zobacz na przykład, Tortora et al., 1999, Glin. Cancer Res., 875-881);

• czynniki anty-hormonalne, takie jak goserelina, boserelina, leuprorelina, tamoksyfen.

Określenie „rak i „nowotwór odnoszą się do lub opisują stan fizjologiczny ssaka, który typowo jest scharakteryzowany nieuregulowanym wzrostem komórek. Za pomocą kompozycji farmaceutycznych według wynalazku mogą być leczone nowotwory takie jak nowotwory piersi, serca, płuca, jelita cienkiego, okrężnicy, śledziony, nerki, pęcherza, głowy i szyi, jajnika, prostaty, mózgu, trzustki, skóry, kości, szpiku kostnego, krwi, grasicy, macicy, jądra, szyjki macicy i wątroby. Bardziej specyficznie nowotwór ten jest wybrany z grupy obejmującej gruczolaka, naczyniako-mięsaka, gwiaździaka, raka nabłonkowego, rozrodczaka, glejaka zarodkowego, glejaka, odpryskowca, naczyniaka krwionośnego śródbłonkowego, naczyniako-mięsaka krwionośnego, krwiaka, wątrobiaka zarodkowego, białaczki, chłoniaka, cewiaka nerwowego, czerniaka, nerwiaka niedojrzałego, kostniako-mięsaka, siatkówczaka zarodkowego, mięśniako-mięsaka prążkowanego, mięsaka i potworniaka.

Szczegółowo, nowotwór ten jest wybrany z grupy obejmującej kończynowego piegowatego czerniaka, rogowacenia aktyniczne, gruczolakoraka, raka gruczolakowotorbielowatego, gruczolaka, gruczolako-mięsaka, raka gruczołowo-łuskowego, gwiaździaki, raka gruczołu Bartholin'a, raka podstawno-komórkowego, raka gruczołu oskrzelowego, rakowiaków naczynia włoskowatego, raka, rakomięsaka, przepastnego raka przewodu żółciowego, chrzęstniaka mięsakowego, brodawczak/rak splotu kosmówki, raka jasnokomórkowego, torbielakogruczolaka, guza pęcherzyka żółtkowego, endometrium macicy, zrębowego mięsaka śluzówki macicy, gruczolakoraka endometrioidalnego, ependymalnego, epiteloidalnego mięsaka Ewing'a, włóknisto-blaszkowy ogniskowy rozrost guzkowaty, guzy wydzielające gastrynę, guzy komórki zarodkowej, glejaka zarodkowego, glucagonoma, hemangioblastomę, naczyniaka krwionośnego śródbłonkowego, naczyniaka krwionośnego, gruczolaka wątrobowego, gruczolakowatość wątrobową, raka komórek wątroby, wyspiaka, powstawanie nowotworu śródnabłonkowego, powstawanie nowotworu kolczystokomórkowego międzynabłonkowego, inwazyjnego raka kolczystokomórkowego, raka wielkokomórkowego, mięśniakomięsaka gładkiego, złośliwego czerniaka piegowatego, czerniaka złośliwego, złośliwe guzy nabłonka surowiczego, cewiaka nerwowego, rdzeniowego raka skóry, czerniaka, oponowego raka przerzutowego nabłonka surowiczego, raka mukoepidermalnego, nerwiaka niedojrzałego, nerwowo-nabłonkowego guzkowatego czerniaka gruczolakorakowego, raka drobnokomórkowego, oligodendromę, kostniakomięsaka, polipeptyd trzustkowy, brodawkowego surowiczego gruczolakoraka, przysadkowe guzy komórki szyszynki, szpiczaka plazmocytowego, pseudo-mięsaka, nowotwór płuc z niezróżnicowanych komórek (pulmonary blastoma, blaste20

PL 210 545 B1 ma płuc), raka komórki nerkowej, siatkówczaka zarodkowego, mięśniakomięsaka prążkowanego, mięsaka, raka surowiczego, raka drobnokomórkowego, raki tkanek miękkich, guza wydzielającego somatostatynę, raka łuskowego (squamous carcinoma), raka kolczystokomórkowego, pod-nabłonkowo surowiczego powierzchiowno rozciągającego się czerniaka, raka niezróżnicowanego, czerniaka jagodówkowego, vermucous carcinoma, VIPoma, raka dobrze zróżnicowanego i guza Wilm'a.

Nowotworami, które mogą być korzystnie leczone cząsteczkami przeciwciała według wynalazku są nowotwory lite lub przerzuty nowotworów, które wywołują ekspresję receptorów ErbB, szczególnie receptorów ErbB1, w dużych ilościach, takie jak rak piersi, rak prostaty, rak głowy i szyi, SCLC, rak trzustki.

Określenie „efektywny biologicznie/funkcjonalnie lub „ilość efektywna terapeutycznie odnosi się do leku/cząsteczki, która wywołuje funkcję biologiczną lub zmienia funkcję biologiczną w warunkach in vivo lub in vitro, i która jest efektywna w określonej ilości dla leczenia choroby lub zaburzenia u ssaka, korzystnie u człowieka. W przypadku raka, ilość leku efektywna terapeutycznie może zredukować liczbę komórek rakowych; zmniejszyć rozmiar guza; hamować (to znaczy, w pewnej mierze spowalniać a korzystnie zatrzymać) przerzuty nowotworu; w pewnej mierze hamować wzrost nowotworu; i/lub w pewnej mierze wywołać ulgę w znoszeniu jednego lub większej liczby symptomów związanych z nowotworem. Lek według wynalazku może do pewnego stopnia zapobiegać wzrostowi i/lub zabijać istniejące komórki rakowe, może być cytostatyczny i/lub cytotoksyczny. Dla terapii nowotworowej, skuteczność może być zmierzona na przykład poprzez oszacowanie czasu do progresji choroby (TTP) i/lub określenie stopnia odpowiedzi (RR).

Określenie „efektywny immunologicznie odnosi się do cząsteczek biologicznych, które wywołują u ssaka odpowiedź immunologiczną. Bardziej specyficznie, określenie to odnosi się do cząsteczek, które mogą rozpoznać i związać antygen. Typowo, przeciwciała, fragmenty przeciwciał i białka fuzyjne przeciwciała zawierające miejsca wiążące antygen (regiony determinujące dopasowanie, ang. complementary determining regions - CDR) są efektywne immunoterapeutycznie.

„Radioterapia: według ogólnej idei wynalazku nowotwory mogą być dodatkowo leczone za pomocą promieniowania lub radiofarmaceutyków. Źródło promieniowania może być albo wewnętrzne albo zewnętrzne względem pacjenta podlegającego leczeniu. Jeśli takie źródło znajduje się na zewnątrz pacjenta, to terapię taką nazywa się naświetlaniem ze źródła zewnętrznego (ang. external beam radiation therapy -EBRT). Natomiast jeżeli takie źródło promieniowania znajduje się wewnątrz pacjenta, to leczenie takie jest nazywane brachyterapią (BT). Kilkoma typowymi atomami radioaktywnymi, które mogą znaleźć tutaj zastosowanie są rad, cez-137 i iryd-192, ameryk-241 i złoto-198, kobalt-57, miedź-67, technet-99, jodek-123; jodek-131 i ind-111. Według ogólnej idei wynalazku możliwe jest również oznaczenie czynników izotopami radioaktywnymi. Obecnie radioterapia jest standardową metodą leczenia nowotworów nie dających się wyciąć lub nieoperacyjnych i/lub przerzutów nowotworowych. Polepszone rezultaty zostały zauważone, w przypadku jeżeli radioterapia była łączona z chemioterapią. Radioterapia jest oparta na zasadzie, według której wysoka dawka promieniowania doprowadzona do docelowej powierzchni będzie skutkowała śmiercią komórek rozrodczych, zarówno w nowotworze jak i w tkankach zdrowych. Tryb dawkowania promieniowania jest generalnie określony pod względem dawki promieniowania zaabsorbowanego (w radach), czasu i frakcjonowania, i musi być dokładnie określony przez onkologa. Ilość promieniowania, którą otrzymuje pacjent, będzie zależała od rozmaitych warunków, przy czym dwoma najbardziej istotnymi warunkami są lokalizacja nowotworu względem innych krytycznych struktur lub organów ciała i obszar, na którym rozprzestrzenił się nowotwór. Korzystny przebieg leczenia pacjenta przechodzącego radioterapię będzie rozłożony na okres od 5 do 6 tygodni, przy całkowitej dawce promieniowania przyjętej przez pacjenta o wartości od 50 do 60 Gy i przy jednorazowej dziennej dawce od 1.8 do 2.0 Gy podawanej 5 dni w tygodniu. Jednostką dawki pochłoniętej jest Grej, w skrócie Gy, i odnosi się do dawki 100 radów. Jeżeli nowotwory są leczone przeciwciałami anty-ErbB jak zostało przedstawione w opisie wynalazku w kontekście trybu radioterapii, możliwe jest zwykle zaobserwowanie pozytywnego a nawet synergicznego efektu. Innymi słowy, hamowanie wzrostu nowotworu za pomocą wymienionych związków jest polepszone w przypadku połączenia go z promieniowaniem i/lub czynnikami chemioterapeutycznymi. Według ogólnej idei wynalazku radioterapia może być zastosowana opcjonalnie. Jest ona zalecana i korzystna w przypadkach, w których pacjentowi można podawać niewystarczające ilości czynników według wynalazku.

„Leczenie farmaceutyczne: pod względem etapów leczenia sposób według ogólnej idei wynalazku obejmuje rozmaite praktyczne sposoby realizacji wynalazku. Odpowiednie czynniki mogą być

PL 210 545 B1 przykładowo podawane jednocześnie, sekwencyjnie lub oddzielnie. Ponadto, czynniki takie mogą być oddzielnie podawane przy czasie przerwy około trzech tygodni pomiędzy kolejnym podawaniem, to znaczy długość czasu przerwy liczy się zasadniczo natychmiast od momentu, w którym zakończyło się podawanie pierwszego czynnika aktywnego aż do około trzech tygodni po tym czasie, to znaczy zasadniczo niezwłocznie po podaniu pierwszego czynnika aktywnego do około 3 tygodni od tego czasu. Metoda ta może być również praktykowana zgodnie z procedurą chirurgiczną. Alternatywnie, taka procedura chirurgiczna może być wykorzystywana w czasie przerwy pomiędzy podawaniem pierwszego i drugiego czynnika aktywnego. Przykładem tej metody jest łączenie sposobu według ogólnej idei wynalazku z chirurgicznym usuwaniem nowotworu. Leczenie według tej metody będzie typowo obejmowało podawanie kompozycji terapeutycznych w jednym lub większej liczbie cykli podawania. Przykładowo tam gdzie realizowane jest jednoczesne podawanie, kompozycja terapeutyczna zawierająca oba czynniki jest podawana przez okres czasu od około 2 dni do około 3 tygodni w pojedynczym cyklu. Następnie, cykl leczenia może być powtórzony jeśli taką potrzebę stwierdzi praktykujący lekarz. Podobnie tam gdzie przewidywane jest podawanie sekwencyjne, czas podawania dla każdego indywidualnego terapeutyka będzie dostosowany dla typowego pokrycia tego samego okresu czasu. Przerwa pomiędzy cyklami może zmieniać się od około zera do 2 miesięcy.

Odpowiednie dla takiego sposobu czynniki mogą być podawane pozajelitowo poprzez wstrzykiwanie lub poprzez stopniowe wlewanie w czasie. Chociaż dostęp do leczonej tkanki w ciele może być w typowym przypadku zapewniony przez podawanie ogólnoustrojowe i dlatego najczęściej mogą one być leczone poprzez dożylne podawanie kompozycji farmaceutycznych, to rozważane są inne tkanki i środki dostarczania dla sytuacji, w których istnieje prawdopodobieństwo, że tkanki docelowe zawierają cząsteczkę docelową. Tak więc czynniki takie mogą być podawane śródocznie, dożylnie, śródotrzewnowo, śród mięśniowo, podskórnie, wnękowo/do jam ciała, przezskórnie, przez wstrzykiwanie i wlewanie ortopowe oraz mogą być również dostarczone środkami perystaltycznymi. Terapeutyczne kompozycje zawierające na przykład antagonistów integryny według ogólnej idei wynalazku są w konwencjonalny sposób podawane dożylnie, przykładowo poprzez wstrzyknięcie dawki jednostkowej.

Kompozycje terapeutyczne według wynalazku zawierają fizjologicznie tolerowany nośnik razem z rozpuszczonym lub rozproszonym w nim stosownym czynnikiem przedstawianym w opisie, jako składnikiem aktywnym.

Stosowane w opisie określenie „farmaceutycznie tolerowany odnosi się do kompozycji, nośników, rozczynników i reagentów, które oznaczają materiały, które nadają się do podawania do lub na ssaka bez wywoływania niepożądanych skutków fizjologicznych takich jak mdłości, zawroty głowy, rozstrój żołądka i tym podobne. Otrzymywanie kompozycji farmakologicznej, która zawiera rozpuszczone lub rozproszone w niej składniki aktywne jest dobrze znane ze stanu techniki i nie musi być ograniczone do sformułowanego opisu. Typowo, kompozycje takie są przygotowane w formie środków do wstrzykiwania albo jako płynne roztwory lub zawiesiny, chociaż mogą być również otrzymane w formie stałej, którą przed zastosowaniem należy rozpuścić w płynie lub przygotować z niej zawiesinę. Preparat taki może być również emulgowany. Składnik aktywny może być wymieszany z rozczynnikami, które są tolerowane farmaceutycznie i kompatybilne ze składnikiem aktywnym, w ilościach odpowiednich dla zastosowania w opisywanych tutaj metodach terapeutycznych. Odpowiednimi rozczynnikami są na przykład woda, roztwór soli, dekstroza, glicerol, etanol lub tym podobne oraz ich związki. Dodatkowo, jeżeli jest to pożądane, kompozycja ta może zawierać nieznaczne ilości substancji pomocniczych takich jak czynniki zwilżające lub emulgujące, czynniki buforowania pH i tym podobne, które zwiększają efektywność składnika aktywnego. Terapeutyczna kompozycja według wynalazku może zawierać farmaceutycznie tolerowane sole takich komponentów. Farmaceutycznie tolerowane sole obejmują sole kwasowo-addycyjne (utworzone z wolnych grup aminowych polipeptydu), które są utworzone z kwasów nieorganicznych, takich jak na przykład kwasy chlorowodorowe lub fosforowe, lub z takich kwasów organicznych jak kwas octowy, winny, migdałowy i tym podobne. Sole utworzone z wolnych grup karboksylowych mogą również pochodzić od zasad nieorganicznych, takich jak na przykład wodorotlenki sodu, potasu, amonu, wapnia lub żelaza, lub takich organicznych zasad jak izopropyloamina, trójmetyloamina, 2-etyloamino etanol, histydyna, prokaina i tym podobne. Do zastosowania w otrzymywaniu antagonistów cyklicznego polipeptydu αν szczególnie korzystna jest sól HGI. Fizjologiczne tolerowane nośniki są dobrze znane ze stanu techniki. Przykładowymi nośnikami płynnymi są wysterylizowane roztwory wodne, które nie zawierają żadnych substancji poza składnikami aktywnymi i wodą, lub zawierają bufor taki jak fosforan sodu o fizjologicznej wartości pH, fizjologiczny roztwór soli lub obie takie substancje, takie jak bufor fosforanowy. Ponadto, nośniki wodne mogą za22

PL 210 545 B1 wierać więcej niż jedną buforowaną sól, jak również sole takie jak chlorki sodu i potasu, dekstroza, glikol polietylenowy lub inne substancje rozpuszczone. Kompozycje płynne mogą również zawierać fazy płynne z i bez wody. Takimi przykładowymi dodatkowymi fazami płynnymi są glicerol, oleje roślinne, takie jak olej z nasion bawełny, i emulsje wodno-olejowe.

Typowo, ilość czynnika immunoterapeutycznego efektywna terapeutycznie, na przykład, w formie przeciwciał bispecyficznych blokujących receptor ErbB (ErbB1), przeciwciała lub fragmentu przeciwciała lub koniugatu przeciwciała blokującego receptor integryny albo przeciwciała, fragmentu lub koniugatu blokującego receptor anty-VEGF, jest taką ilością, że jeśli jest ona podawana w fizjologicznie tolerowanej kompozycji, jest wystarczająca dla osiągnięcia stężenia w osoczu od około 0.01 mikrograma ^g) na mililitr (ml) do około 100 μg/ml, korzystnie od około 1 μg/ml do około 5 μg/ml, a zwykle około 5 μg/ml. Mówiąc inaczej, dawka ta może się zmieniać od około 0.1 mg/kg do około 300 mg/kg, korzystnie od około 0.2 mg/kg do około 200 mg/kg, bardziej korzystnie od około 0.5 mg/kg do około 20 mg/kg, w jednej lub większej liczbie dziennych dawek przez jeden lub kilka dni. Jeżeli czynnik terapeutyczny jest w formie fragmentu przeciwciała monoklonalnego lub koniugatu, to ilość ta może być łatwo dostosowywana na podstawie masy fragmentu/koniugatu zależnej od masy całego przeciwciała. Korzystne stężenie w osoczu wyrażone stężeniem molowym wynosi od około 2 mikromoli TM) do około 5 milimoli (mM) a korzystnie od około 100 μM do 1 mM antagonisty przeciwciała.

Ilość czynnika efektywnego terapeutycznie według ogólnej idei wynalazku, który jest peptydem nie-immunoterapeutycznym lub polipeptydem białkowym lub inną cząsteczką biologiczną o podobnej wielkości, jest typowo taką ilością polipeptydu, która, jeśli jest podawana w fizjologicznie tolerowanej kompozycji, jest wystarczająca dla osiągnięcia stężenia w osoczu o wartości od około 0.1 mikrograma ^g) na mililitr (ml) do około 200 ng/ml, korzystnie od około 1 μg/ml do około 150 μg/ml. W oparciu o polipeptyd posiadający masę około 500 gramów na mol, korzystne stężenie w osoczu wyrażone stężeniem molowym wynosi od około 2 μM do około 5 mM a korzystnie od około 100 μM do 1 mM antagonisty polipeptydu.

Typowa dawka składnika aktywnego, który jest korzystnym chemicznym cytotoksycznym lub chemioterapeutycznym składnikiem według wynalazku (a nie składnikiem immunoterapeutycznym, czy też białkiem/peptydem nieimmunoterapeutycznym) wynosi od 10 do 1000 mg, korzystnie od 20 do 200 mg, a zwłaszcza od 50 do 100 mg na kilogram masy ciała na dzień. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać fazę obejmującą leczenia pacjenta czynnikami, które redukują lub pozwalają uniknąć efektów ubocznych związanych z terapią łączoną według ogólnej idei wynalazku („terapia wspomagająca), włączając w to ale nie ograniczając się do takich czynników, które przykładowo redukują efekt toksyczny leków przeciwrakowych, na przykład inhibitorów resorpcji kości, czynników chroniących serce. Tego rodzaju czynniki dodatkowe zapobiegają lub redukują występowanie nudności i wymiotów związanych z chemioterapią, radioterapią lub operacją, lub redukują występowanie infekcji związanej z podawaniem leków przeciwrakowych hamujących czynności szpiku. Takie czynniki dodatkowe są dobrze znane ze stanu techniki. Czynniki immunoterapeutyczne według ogólnej idei wynalazku mogą być podawane dodatkowo z substancjami pomocniczymi takimi jak BCG i stymulatory systemu immunologicznego. Ponadto, takie kompozycje mogą zawierać czynniki immunoterapeutyczne lub chemioterapeutyczne, które zawierają efektywne izotopy cytotoksyczne wyznakowane radioaktywnie, lub inne czynniki cytotoksyczne, takie jak peptydy cytotoksyczne (na przykład cytokiny) lub leki cytotoksyczne i tym podobne.

Określenie „zestaw farmaceutyczny” dla leczenia nowotworów lub przerzutów nowotworowych odnosi się do opakowania i zasadniczo do instrukcji stosowania tych odczynników w sposobach leczenia nowotworów i przerzutów nowotworów. Odczynnik w zestawie według wynalazku ma typowo postać przedstawianej w opisie kompozycji farmaceutycznej, i dlatego może mieć dowolną z wielu postaci odpowiednich do rozprowadzania w formie zestawu. Formy takie obejmują płyn, proszek, tabletkę, zawiesinę i temu podobne postacie dla dostarczania farmaceutycznych cząsteczek według wynalazku, korzystnie przeciwciał anty-ErbB1. Odczynniki te mogą być dostarczane w oddzielnych pojemnikach odpowiednich dla oddzielnego podawania sposobami według ogólnej idei wynalazku, lub alternatywnie mogą one być dostarczone w postaci połączonej w formie kompozycji w jednym pojemniku w opakowaniu. Opakowanie może zawierać ilość wystarczającą dla jednej lub większej liczby dawek odczynników zgodnie ze sposobami leczenia według ogólnej idei wynalazku. Zestaw taki może również zawierać „instrukcje użytkowania” substancji zawartych w opakowaniu.

PL 210 545 B1

SKRÓCONY OPIS FIGUR RYSUNKU

Fig. 1 przedstawia wiązanie MAb 425 (EMD 72 000) i c225 (Cetuximab) do różnych komórek rakowych (A431, SK-OV3, HCT 116, MiaPaca-2, KYSE-30, KYSE-70) oddzielnie i w kombinacji, zmierzone cytometrią przepływową.

Fig. 2 przedstawia agregację efektor-komórka docelowa w zależności od stężenia przeciwciała (MAb 425, MAb 225 lub ich mieszanina).

Fig. 3 przedstawia hamowanie wiązania EGF do komórek nowotworowych A431 przez MAb 425, MAb 225 lub ich mieszaninę.

Fig. 4 przedstawia przemieszczenie związanego EGF na komórkach nowotworowych A431 przez MAb 425, MAb 225 lub ich mieszaninę.

Fig. 5 przedstawia regulację „w dół receptora EGF na komórkach A431 przez mieszaninę humanizowanego MAb 425 (EMD 72 000) i chimerycznego MAb 225.

P R Z Y K Ł A D Y

P r z y k ł a d 1

Zwiększone wiązanie przeciwciała dla komórki przez połączenie dwóch przeciwciał blokujących

EGFR (Cetuximab, EMD 72 000) o różnych specyficznościach epitopu.

Sześć linii ludzkich nowotworów pozytywnych względem EGFR pochodzących od epidermoidalnego raka sromu (A431), gruczolakoraka jajnika (SK-OV-3), raka okrężnicy (HCT 116), raka trzustki (MiaPaca-2) i raka przełyku (KYSE-30, KYSE-70) wywołujących ekspresję różnych poziomów EGFR było inkubowanych przez 15 minut na lodzie z 10 μg/ml odpowiednio Cetuximab lub EMD 72 000, lub z mieszaniną zawierającą ostatecznie 2.5 ng/ml Cetuximab i 2.5 μg/ml EMD 72 000 (całkowite stężenie MAb: 5 μg/ml). Następnie komórki były przemywane i inkubowane przez dodatkowe 15 minut na lodzie z 20 μg/ml koziego anty-ludzkiego lgG+lgM(H+L)-F(ab')₂, wyznakowanego barwnikiem FITC, który jest odczynnikiem stosowanym w drugim etapie. Po przemywaniu komórki poddano analizie przy użyciu techniki cytometrii przepływowej (FACScan, Becton Dickinson) pod względem natężenia fluorescencji, które w przybliżeniu jest równoważne ilości przeciwciała związanego na komórkę. Jak przedstawiono, niezależnie od zmniejszenia stężenia barwnika zastosowanego dla mieszaniny przeciwciał, natężenia fluorescencji komórek barwionych taką mieszaniną były we wszystkich przypadkach wyższe od natężenia fluorescencji komórek, które były barwione tylko jednym przeciwciałem o wyższym stężeniu (rysunek fig. 1).

P r z y k ł a d 2

Agregacja efektor-komórka docelowa jako warunek wstępny w mechanizmie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał oraz jej ulepszenie poprzez połączenie dwóch przeciwciał o specyficzności dla różnych epitopów ludzkiego EGFR (Cetuximab i EMD 72 000).

W tym eksperymencie modelowym jako komórki docelowe wykorzystano komórki A431 pozytywne EGFR. Do naśladowania komórek efektorowych zastosowano komórki chłoniaka histiocytowego U937, które są negatywne względem EGFR a pozytywne względem receptora Fc-gamma (CD64 (FcyRI) i CD32 (FcyRII)). Komórki A431 wyznakowano fluorescencyjnie barwnikiem zielonym PKH2 a komórki U937 czerwonym PKH26. Następnie obie linie komórek zostały wymieszane w stosunku 3:1 efektor-komórka docelowa i inkubowane przez 15 minut na lodzie z kolejnymi rozcieńczeniami (końcowe stężenia: 4.74-0.0015 μg/ml = 3.16 x 10^-8 - 1 x 10^-11 M jak obliczono z masy cząsteczkowej (MW) wynoszącej 150 kDa dla obydwu przeciwciał) odpowiednio z Cetuximab lub EMD 72 000, lub z kolejnym rozcieńczeniem mieszaniny obu przeciwciał zawierającej połowę całkowitego stężenia immunoglobuliny (2.37 - 0.00075 μg/ml = 1.58 x 10^-8 - 5 x 10^-11 M; stężenie każdego z MAb w tej mieszaninie wynosiło połowę tego stężenia). Po wirowaniu trwającym pięć minut przy 50 x g i temperaturze 4°C komórki były inkubowane przez kolejne 60 minut na lodzie bez uszkodzenia osadów. Ostatecznie osady powtórnie zawieszono a stosunki agregatów określono poprzez cytometrię przepływową z wykorzystaniem instrumentu FACScan.

Jak pokazano na rysunku Fig. 2, w porównaniu do wyników z inkubacji komórek z tylko jednym pojedynczym przeciwciałem, maksymalny odsetek agregatów jest zwiększony w próbkach, które były inkubowane z mieszaniną obu MAb przy niższym całkowitym stężeniu białka. Wznosząca część krzywej miareczkowania dla mieszaniny przeciwciał nie jest znacząco przesunięta pomimo zredukowanego stężenia białka w tych próbkach w porównaniu z próbkami inkubowanymi tylko z jednymi MAb.

PL 210 545 B1

P r z y k ł a d 3

Zwiększone hamowanie wiązania EGF do komórek nowotworowych A431 przez mieszaninę dwóch przeciwciał skierowanych przeciwko różnym epitopom domeny wiążącej ligand EGFR.

Komórki A431 były wstępnie inkubowane przez 15 minut na lodzie z 0.5 μg/ml EMD 72 000, Cetuximab lub mieszaniną obu przeciwciał przy tym samym stężeniu. Po odpłukaniu niezwiązanych przeciwciał komórki były inkubowane przez następne 15 minut na lodzie z 0.01, 0.1, 1 lub 10 μg/ml EGF znakowanego FITC z gruczołów podszczękowych myszy (Molecular Probes Europe, Leiden, The Netherlands), przepłukane i analizowane cytometrią przepływową.

Oba przeciwciała silnie hamują wiązanie EGF-FITC przy wszystkich stężeniach). Niemniej jednak mieszanina obu przeciwciał była bardziej efektywna niż jakiekolwiek samodzielne przeciwciało (rysunek Fig. 3).

P r z y k ł a d 4

Przemieszczenie związanego EGF z EGFR komórek A431.

Komórki A431 były wstępnie inkubowane przez 15 minut na lodzie z 10 μg/ml EGF znakowanego FITC-em z gruczołów podszczękowych myszy (Molecular Probes Europe, Leiden, The Netherlands). Następnie komórki były przemywane i inkubowane przez 15 minut z 10.0, 1 lub 0.1 μg/ml odpowiednio EMD 72 000 lub Cetuximab albo mieszaniną 2.5, 0.25 lub 0.025 μg/ml obu przeciwciał (całkowite stężenie immunoglobuliny: 5, 0.5 lub 0.05 μg/ml). Następnie komórki zostały przemyte i przeanalizowane poprzez cytometrię przepływową dla wiązania EGF-FITC.

Oba przeciwciała jako pojedyncze czynniki w sposób zależny od stężenia przemieszczały EGF z EGFR komórek A431. Mieszanina obu przeciwciał, która zawierała tylko jedną czwartą stężeń przeciwciała (jedną drugą całkowitej immunoglobuliny) każdego MAb, posiadała podobną efektywność w przemieszczeniu ligandu wyznakowanego FITC-em jak każde z dwu przeciwciał przy wyższym stężeniu.

P r z y k ł a d 5

Regulacja „w dół EGFR przez mieszaninę co najmniej dwóch przeciwciał skierowanych przeciwko różnym epitopom receptora ale bez żadnej albo tylko z niewielką redukcją poziomów EGFR powierzchni komórkowej przez jedno pojedyncze przeciwciało po 24-godzinnym inkubowaniu komórek A431 z przeciwciałami MAb.

2x10⁶ komórek A431 w 2.5 ml pożywki zawierającej 10% FCS (płodową surowicę bydlęcą) zostało rozpipetowane do płytek 6-dołkowych. Przeciwciała (Cetuximab, EMD 72 000) zostały dodane do tych hodowli do stężenia końcowego wynoszącego 10 μg/ml. Zastosowano mieszaniny obu przeciwciał o stężeniach) końcowych wynoszących 10 μg/ml (mieszanina 1) lub 5 μg/ml (mieszanina 2) dla każdego przeciwciała, co skutkowało całkowitym stężeniem przeciwciała o wartości odpowiednio 20 i 10 μg/ml. Następnie komórki były inkubowane w obecności przeciwciał przez 24 godziny w 10% CO₂ przy temperaturze 37°C.

Następnie komórki zostały wyizolowane przez poddanie je działaniu Trypsyny/EDTA (0.05/0.02%), przemyte i inkubowane przez 15 minut na lodzie albo z 20 μg/ml koziego anty-ludzkiego lgG+lgM(H+L)-F(ab')2 wyznakowanego FITC-em jako odczynnik drugiego etapu dla wykrywania przeciwciał anty-EGFR związanych powierzchniowo, albo z 10 μg/ml MAb 425 wyznakowanego FITC-enn (mysi przodek EMD 72 000) dla wykrycia wolnych, nie zajętych miejsc wiązania dla EMD 72 000. Ostatecznie komórki zostały przeanalizowane cytometrią przepływową. Rysunek fig. 5 dowodzi, że EMD 72 000 i jego mysi przodek MAb425 rywalizują ze sobą o wiązanie do ich epitopów na EGFR oraz, że wcześniej związane EMD 72 000 prawie całkowicie może hamować wiązanie MAb425-FITC. W porównaniu do nie poddanych obróbce komórek kontrolnych, wcześniej związany Cetuximab hamuje wiązanie MAb425-FITC tylko w stopniu minimalnym. Fakty te jasno wskazują, że oba przeciwciała wiążą się do oddzielnych epitopów EGFR. Ponadto rysunek ten pokazuje, że po inkubacji komórek przez 24 godziny w obecności obu stężeń mieszaniny przeciwciał, natężenie fluorescencji odczynnika drugiego etapu wyznakowanego FITC-em zastosowanego dla wykrywania przeciwciał związanych z powierzchnią jest wyraźnie ograniczone.

Oznacza to, że zewnętrzne poziomy EGFR komórek poddanych działaniu mieszaniny przeciwciał są wyraźnie zredukowane w porównaniu do komórek, które zostały wyhodowane tylko z jednego z przeciwiciał.

Tak więc kompleksy receptor-przeciwciało utworzone przez mieszaninę przeciwciał wydają się być internalizowane i/lub przetwarzane przez inne mechanizmy niż małe kompleksy receptor-przeciwciało złożone tylko z dwóch receptorów po wiązaniu krzyżowym przez jedną cząsteczkę przeciwciała.

Claims (9)

1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera pierwszą cząsteczkę przeciwciała i drugą, odmienną cząsteczkę przeciwciała, które posiadają zdolność wiązania się do różnych epitopów zlokalizowanych na tej samej cząsteczce receptora EGF (EGFR), przy czym pierwsza cząsteczka przeciwciała zawiera miejsca wiązania, które wiążą się do pierwszego specyficznego epitopu na cząsteczce EGFR a druga cząsteczka przeciwciała zawiera miejsca wiązania, które wiążą się do drugiego specyficznego epitopu na tej samej cząsteczce receptora, przy czym pierwsza cząsteczka przeciwciała jest humanizowanym MAb 425 lub jego fragmentem Fab', F(ab')2 lub Fv, zaś druga cząsteczka przeciwciała jest chimerycznym MAb 225 lub jego fragmentem Fab', F(ab')2 lub Fv.

2. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że dodatkowo zawiera czynnik cytotoksyczny.

3. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, że czynnik cytotoksyczny jest czynnikiem chemioterapeutycznym.

4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 3, znamienna tym, że czynnik chemioterapeutyczny jest dowolnym związkiem wybranym z grupy obejmującej cisplatynę, doksorubicynę, gemcytabinę, docetaksel, paklitaksel, bleomycynę.

5. Zestaw farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera:

(i) pierwsze opakowanie zawierające pierwszą cząsteczkę przeciwciała, która zawiera miejsca wiązania, które wiążą się do pierwszego specyficznego epitopu istniejącego na cząsteczce receptora

EGF (EGFR), i (ii) drugie opakowanie zawierające drugą cząsteczkę przeciwciała, która zawiera miejsca wiązania, które wiążą się do drugiego innego specyficznego epitopu na tej samej cząsteczce receptora EGF (EGFR), przy czym pierwsza cząsteczka przeciwciała jest humanizowanym MAb 425 lub jego fragmentem Fab', F(ab')2 lub Fv, zaś druga cząsteczka przeciwciała jest chimerycznym MAb 225 lub jego fragmentem Fab', F(ab')2 lub Fv.

6. Zestaw farmaceutyczny według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera on dodatkowo trzecie opakowanie zawierające czynnik cytotoksyczny.

7. Zestaw farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że czynnik cytotoksyczny jest czynnikiem chemioterapeutycznym.

8. Zestaw farmaceutyczny według zastrz. 7, znamienny tym, że czynnik chemioterapeutyczny jest dowolnym związkiem wybranym z grupy obejmującej cisplatynę, doksorubicynę, gemcytabinę, docetaksel, paklitaksel, bleomycynę.

9. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej zdefiniowanej w zastrz. 1-4 lub zestawu farmaceutycznego zdefiniowanego w zastrz. 5-8, do otrzymywania leku do leczenia nowotworów.