PL210715B1 - Sposób indukowania apoptozy komórek nowotworowych, środek terapeutyczny, związek oraz zastosowanie inhibitora - Google Patents
Sposób indukowania apoptozy komórek nowotworowych, środek terapeutyczny, związek oraz zastosowanie inhibitoraInfo
- Publication number
- PL210715B1 PL210715B1 PL371640A PL37164004A PL210715B1 PL 210715 B1 PL210715 B1 PL 210715B1 PL 371640 A PL371640 A PL 371640A PL 37164004 A PL37164004 A PL 37164004A PL 210715 B1 PL210715 B1 PL 210715B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- suv3
- protein
- gene
- seq
- expression
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 31
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 title claims description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 15
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 107
- 101000696694 Homo sapiens ATP-dependent RNA helicase SUPV3L1, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 68
- 102100029005 ATP-dependent RNA helicase SUPV3L1, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 64
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 50
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 39
- 101001017961 Homo sapiens Ragulator complex protein LAMTOR5 Proteins 0.000 claims description 37
- 102100033373 Ragulator complex protein LAMTOR5 Human genes 0.000 claims description 37
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 37
- 101150111287 SUV3 gene Proteins 0.000 claims description 32
- 102000000763 Survivin Human genes 0.000 claims description 29
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 claims description 29
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 17
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 17
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 14
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 13
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 4
- 229940122498 Gene expression inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 7
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000256182 Anopheles gambiae Species 0.000 description 3
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 101710179684 Poly [ADP-ribose] polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102100023712 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 Human genes 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 102000049055 human SUPV3L1 Human genes 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 102100038385 Coiled-coil domain-containing protein R3HCC1L Human genes 0.000 description 2
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000743767 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein R3HCC1L Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101710173438 Late L2 mu core protein Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229920000776 Poly(Adenosine diphosphate-ribose) polymerase Polymers 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 108700025184 hepatitis B virus X Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M mitoTracker Red Chemical compound [Cl-].C1=CC(CCl)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000133 DNA helicases Proteins 0.000 description 1
- 102000003844 DNA helicases Human genes 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000929583 Homo sapiens N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000666730 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015335 Ku Autoantigen Human genes 0.000 description 1
- 108010025026 Ku Autoantigen Proteins 0.000 description 1
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 1
- 102100036658 N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710194648 NTPase/helicase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 101710188306 Protein Y Proteins 0.000 description 1
- 102100024147 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 14A Human genes 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 108010007131 Pulmonary Surfactant-Associated Protein B Proteins 0.000 description 1
- 102100032617 Pulmonary surfactant-associated protein B Human genes 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102100038410 T-complex protein 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 101150073031 cdk2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040620 helicase family Human genes 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 210000004692 intercellular junction Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000012223 nuclear import Effects 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000003439 radiotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób indukowania apoptozy komórek nowotworowych, środek terapeutyczny, związek dla zastosowania do indukowania apoptozy komórek nowotworowych oraz zastosowanie inhibitora ekspresji genu kodującego białko SUV3.
Jest wiele metod i środków do niszczenia lub ograniczania rozwoju komórek nowotworowych. Jednak w wielu przypadkach środki te nie są w pełni skuteczne i wymagają ulepszeń.
Podstawowe procesy komórkowe, takie jak cykl komórkowy, różnicowanie komórek i ich śmierć często zależą od ekspresji poszczególnych genów. Nowotwory powstają w wyniku utraty przez komórki mechanizmów kontroli podziałów oraz pozbycie się mechanizmów programowanej śmierci komórek zwanej apoptozą. Żywe organizmy bronią się przed nowotworami między innymi w taki sposób, że komórka uszkodzona, która potencjalnie mogłaby przekształcić się w komórkę nowotworową, uruchamia genetycznie zaprogramowaną ścieżkę programowanej śmierci i w efekcie popełnia samobójstwo, likwidując tym samym zagrożenie dla całego organizmu. Niektóre komórki na skutek mutacji potrafią jednak wyłączyć mechanizmy apoptozy, stają się w ten sposób nieśmiertelne i ich podziały doprowadzają do nowotworu i do śmierci pacjenta.
Ostatnie badania dowiodły, że jeden z podstawowych mechanizmów unikania apoptozy przez komórki nowotworowe zależy od białka surwiwiny (Altieri DC. (2004) Molecular circuits of apoptosis regulation and cell division control the survivin paradigm. J Cell Biochem 92(4):656-63).Poziom tego białka jest wysoki w absolutnej większości nowotworów stanowiących zagrożenie dla życia pacjentów. W normalnych komórkach surwiwina, białko o masie 17 kDa, jest eksprymowana w bardzo małych ilościach, jest zlokalizowana w jądrze komórkowym i prawdopodobnie związana z replikacja DNA. W nowotworach poziom surwiwiny wielokrotnie wzrasta, jej lokalizacja zmienia się z jądrowej na cytosolową a jej aktywność skierowana jest na hamowanie procesów apoptycznych poprzez hamowanie enzymów zwanych kaspazami.
Udowodniono doświadczalnie, że inaktywacja surwiwiny w komórkach nowotworowych przywraca zdolność do apoptozy i w efekcie komórki nowotworowe popełniają samobójstwo. Modulowanie aktywności surwiwiny na drodze specyficznego hamowania ekspresji genu przez II generację antysensownych RNA jest obecnie badane klinicznie.
Surwiwina działa w kompleksie z innym białkiem: HBXIP (Hepatitis B interacting protein). HBXIP jest niezbędnym kofaktorem surwiwiny, dlatego też zahamowanie ekspresji HBXIP także skierowuje komórki nowotworowe na ścieżkę programowanej śmierci (Marusawa H. et al. HBXIP functions as a cofactor of survivin in apoptosis suppression, EMBO J. 2003, 22(ll):2729-40). Zastosowanie HBXIP w modulacji apoptozy nowotworów został o przedstawione w opisie zgł oszenia US 2004/0138119.
Gen SUV3 jest znany jako jeden z genów regulujących funkcję motochodriów [A. Dmowska, P. Stankiewicz, P. Golik, P.P. Stępień, E. Bocian, I. Hansmann oraz E. Bartnik (1998) Cytogenetics and Celi Genetics 83:84-85]. Sekwencję cDNA ludzkiego genu hSUV3 przedstawia SEK. Nr ID 1, sekwencję pełnego genu hSUV3 przedstawia SEK. Nr ID 2, a sekwencję aminokwasową ludzkiego SUV3 przedstawia SEK. Nr ID 3. Produkt genu SUV3 należy do rodziny NTPaz/helikaz. Ludzki hSUV3p opisano jako białko rozpuszczalne zlokalizowane w mitochondrialnym podłożu [M. Minczuk, J. Piwowarski, M. A. Papworth, K. Awiszus, S. Schalinski, A. Dziembowski, A. Dmochowska, E. Bartnik, K. Tokatlidis, P.P.Stępień, P. Borowski (2002) Nucl. Acids Research, vol. 30, nr 23].
Istota niniejszego wynalazku opiera się na stwierdzeniu, że możliwe jest indukowanie apoptozy komórek nowotworowych przez drugi kofaktor surwiwiny: białko SUV3.
Prowadzone badania wykazały, że kofaktorem HBXIP w komórkach ludzkich jest białko SUV3, przy czym stwierdzono, że zahamowanie ekspresji genu SUV3 powoduje apoptozę komórek nowotworowych.
Tak więc nieoczekiwanie wykryto, że ekspresja genu SUV3 ma zasadnicze znaczenie dla przeżycia komórek nowotworowych.
W ten sposób znaleziono także nowy ś rodek terapeutyczny przeznaczony szczególnie do indukowania apoptozy komórek nowotworowych i leczenia nowotworów u zwierząt oraz ludzi.
Wynalazek dotyczy sposobu indukowania apoptozy komórek nowotworowych, w którym komórki nowotworowe lub komórki prekursorów nowotworowych wykazujące podwyższony poziom surwiwiny kontaktuje się in vitro z inhibitorem ekspresji genu kodującego białko SUV3 przedstawionego na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2 i/lub z inhibitorem aktywności białka SUV3 o sekwencji przedstawionej na Sek. Nr. ID. 3 albo jego oddziaływania z HBXIP i/lub z surwiwiną.
PL 210 715 B1
Korzystnie w sposobie, jako inhibitor ekspresji genu kodującego białko SUV3 stosuje się cząsteczkę reagującą z promotorem genu SUV3, specyficznie hamującą inicjację lub elongację transkrypcji lub cząsteczkę reagującą z białkami, które specyficznie wiążą się z promotorem genu SUV3.
W sposobie, jako inhibitor ekspresji genu kodują cego biał ko SUV3 korzystnie stosuje się czą steczkę, która upośledza proces translacji lub stabilności mRNA genu SUV3, przy czym korzystniej stosuje się mikro RNA lub siRNA komplementarny do sekwencji genu kodującego białko SUV3 przedstawionej na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2. oddziaływujący z sekwencją genu kodującego białko SUV3 przedstawione na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2.
W równie korzystnym sposobie inhibitor aktywnoś ci biał ka SUV3 oddział uje z regionem obejmującym aminokwasy 650-786 białka SUV przedstawionego na Sek. Nr. ID. 3.
Wynalazek również dotyczy środka terapeutycznego, który jako substancję czynną zawiera, co najmniej jeden związek z grupy obejmującej związek hamujący ekspresję genu kodującego białko SUV3 przedstawionego na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2, związek hamujący aktywność białka SUV3 o sekwencji przedstawionej na Sek. Nr. ID. 3, związek hamujący oddziaływanie białka SUV3 z HBXIP i/lub z surwiwiną .
Środek jako substancję czynną z grupy obejmującej związek hamujący ekspresję genu kodującego białko SUV3 korzystnie zawiera cząsteczkę, która upośledza proces translacji lub stabilności mRNA genu SUV3, przy czym środek korzystniej zawiera mikroRNA lub siRNA komplementarny do sekwencji genu kodującego białko SUV3 przedstawionej na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2 oddziaływujący z sekwencją genu kodującego białko SUV3 przedstawione na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2.
W korzystnym środku związek hamujący aktywność białka SUV3 oddziałuje z regionem obejmującym aminokwasy 650-786 białka SUV przedstawionego na Sek. Nr. ID. 3.
Wynalazek ponadto dotyczy związku z grupy obejmującej związek hamujący ekspresję genu kodującego białko SUV3 przedstawionego na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2, związku hamującego aktywność białka SUV3 przedstawionego na Sek. Nr. ID. 3 lub związku hamującego oddziaływanie białka SUV3 z HBXIP i/Iub z surwiwiną dla zastosowania do indukowania apoptozy komórek nowotworowych.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie inhibitora ekspresji genu kodującego białko SUV3 przedstawionego na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2 i/lub inhibitora ekspresji aktywności białka SUV3, którego sekwencja przedstawiona jest na Sek. Nr. ID. 3 i/lub inhibitora oddziaływania białka SUV3 z HBXIP i/lub z surwiwiną do wytwarzania środka przeznaczonego do hamowania apoptozy w komórkach nowotworowych lub komórkach prekursorów nowotworowych wykazują cych podwyż szony poziom surwiwiny. W zastosowaniu, jako inhibitor ekspresji genu kodującego białko SUV3 korzystnie stosuje się cząsteczkę reagującą z promotorem genu SUV3, specyficznie hamującą inicjację lub elongację transkrypcji lub cząsteczkę reagującą z białkami, które specyficznie wiążą się z promotorem genu SUV3.
W zastosowaniu korzystnie, jako inhibitor ekspresji genu kodują cego bia ł ko SUV3 stosuje się cząsteczkę, która upośledza proces translacji lub stabilności mRNA genu SUV3, przy czym korzystniej stosuje się mikroRNA lub siRNA komplementarny do sekwencji genu kodującego białko SUV3 przedstawionej na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2 oddziaływujący z sekwencją genu kodującego białko SUV3 przedstawione na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID.
W równie korzystnym zastosowaniu inhibitor oddziaływania białka SUV3 oddziałuje z regionem obejmującym aminokwasy 650-786 białka SUV przedstawionego na Sek. Nr. ID. 3.
W sposobie według wynalazku można stosować inhibitor, który hamuje, tzn. blokuje lub osłabia, gen SUV3 albo aktywność jego produktu. Może to następować przez: 1) specyficzne hamowanie transkrypcji genu SUV3, 2) specyficzne hamowanie translacji genu SUV3, 3) specyficzne hamowanie aktywności białka SUV3, 4) specyficzne hamowanie obróbki transkryptu genu SUV3 lub 5) specyficzne indukowanie degradacji mRNA SUV3. Metody osłabiania ekspresji genów lub aktywności ich produktów są znane. Jako inhibitor można więc stosować związek hamujący ekspresję genu SUV3.
Inhibitorem ekspresji genu kodującego białko SUV3 może być cząsteczka reagująca z promotorem genu SUV3, specyficznie hamująca inicjację lub elongację transkrypcji lub cząsteczka reagująca z biał kami, które specyficznie wiążą się z promotorem genu SUV3. Mogą to być białka, kwasy nukleinowe lub inne związki.
Korzystnie, jako inhibitor ekspresji genu kodującego białko SUV3 stosuje się cząsteczkę, która upośledza proces translacji lub stabilności mRNA genu SUV3, w szczególności mikroRNA lub siRNA.
PL 210 715 B1
Inna korzystna grupa inhibitorów może obejmować zmodyfikowane lub niezmodyfikowane kwasy nukleinowe, związane lub niezwiązane z nośnikami, o dowolnej długości, pojedynczoniciowe lub podwójnoniciowe, o pełnej lub niepełnej komplementamości w obrębie cząsteczek dwuniciowych oraz o pełnej lub niepełnej komplementamości w stosunku do dowolnego odcinka genu SUV3, włączając obszary kodujące i niekodujące, a także promotor genu SUV3.
Związki te można otrzymywać znanymi sposobami, np. przez syntezę chemiczną lub enzymatyczną.
Inhibitorem aktywności białka SUV3 może być związek, który zmienia lub hamuje aktywność białka SUV3 lub jego zdolność do oddziaływania z białkiem HBXIP i/lub surwiwiną, albo innym białkiem lub białkami. Inhibitorami mogą być przeciwciała lub związki makro- albo mikrocząsteczkowe.
Grupa ta obejmuje przeciwciała swoiste dla SUV3, przeciwciała wiążące się swoiście z kompleksem SUV3-HBXIP, zwłaszcza w obecności surwiwiny lub z surwiwiną w obecności kompleksu SUV3-HBXIP. Przeciwciała te zakłócają oddziaływanie kompleksu SUV3-HBXIP z surwiwiną, co w rezultacie prowadzi do apoptozy.
Przeciwciała i ich fragmenty otrzymuje się standardowymi technikami, na ogół przez immunizację zwierząt. Monoklonalne przeciwciała można uzyskiwać w hodowli linii komórkowych z wykorzystaniem techniki hybrydom.
Można otrzymywać pojedyncze łańcuchy przeciwciał swoistych dla docelowego produktu. Można także generować fragmenty przeciwciał rozpoznające swoiste epitopy (np. fragment Fab lub Fv) przez komputerowe projektowanie łańcuchów polipeptydowych i ich sekwencji kodujących, które następnie poddaje się ekspresji. Można również stosować przeciwciała wielowartościowe.
Inną grupę inhibitorów stanowią związki makro- i mikrocząsteczkowe wybrane z biblioteki związków otrzymywanych przez syntezę chemiczną lub biologiczną. W procesie skriningu przeszukuje się bibliotekę i wybiera związki, które hamują oddziaływanie SUV3 z HBXIP i/lub z surwiwiną.
Inhibitor wprowadza się do komórek nowotworowych bezpośrednio albo w połączeniu z nośnikiem, albo jako gen kodujący inhibitor w terapii genowej.
Kwasy nukleinowe dogodnie jest wprowadzać na drodze transfekcji, stosując odpowiednie nośniki lipidowe, za pomocą wektorów ekspresyjnych albo innymi znanymi metodami.
Przeciwciało lub jego fragment można poddać ekspresji w komórkach docelowych lub wprowadzać konwencjonalnymi metodami.
Sposób według wynalazku umożliwia selektywne niszczenie komórek nowotworowych.
W sposobie prowadzonym in vitro moż na wykorzystać np. komórki wyizolowane z organizmu ssaków, w tym ludzi. Komórki nowotworowe można usuwać z mieszanin hodowli komórek stosowanych np. do otrzymywania użytecznych reagentów lub w celach badawczych. Środek terapeutyczny według wynalazku, charakteryzuje się tym, że jako substancję czynną zawiera, co najmniej jeden związek, który hamuje tzn. blokuje lub osłabia ekspresję genu kodującego białko SUV3, hamuje aktywność białka SUV3, hamuje oddziaływanie białka SUV3 z HBXIP i/lub z surwiwiną.
Jako substancję czynną środek może zawierać każdy z wyżej wymienionych inhibitorów.
Korzystną substancją czynną z grupy inhibitorów ekspresji genu kodującego białko SUV3 jest cząsteczka, która upośledza proces translacji lub stabilności mRNA genu SUV3, w szczególności mikroRNA lub siRNA.
Inna substancja czynna z grupy inhibitorów ekspresji genu kodującego białko SUV3 może obejmować zmodyfikowane lub niezmodyfikowane kwasy nukleinowe, związane lub niezwiązane z nośnikami, o dowolnej długości, pojedynczoniciowe lub podwójnoniciowe, o pełnej lub niepełnej komplementamości w obrębie cząsteczek dwuniciowych oraz o pełnej lub niepełnej komplementamości w stosunku do dowolnego odcinka genu SUV3, włączając obszary kodujące i niekodujące, a także promotor genu SUV3.
Środek zwiera substancję czynną w ilości skutecznej do indukowania apoptozy.
Ponieważ surwiwina ulega nadekspresji w większości komórek nowotworowych, środek według wynalazku może mieć zastosowanie w leczeniu różnych nowotworów, zwłaszcza raka jajnika.
Środek według wynalazku można stosować w kombinowanej terapii antynowotworowej.
W tym przypadku ś rodek wedł ug wynalazku zawiera dodatkowy znany skł adnik wspomagają cy apoptozę do jednoczesnego lub kolejnego zastosowania w terapii antynowotworowej.
Dodatkowym składnikiem wspomagającym apoptozę może być znany środek chemioterapeutyczny, np. cis platyna lub środek radioterapeutyczny. W takiej terapii zmniejsza się niepożądany efekt uboczny.
PL 210 715 B1
Środek podaje się na ogół w postaci odpowiednich form farmaceutycznych, gdzie substancja czynna jest połączona z terapeutycznie dopuszczalnym nośnikiem albo, jako gen kodujący inhibitor w terapii genowej.
Wybór terapeutycznie dopuszczalnego nośnika będzie zależał od drogi podania środka jak również od rozpuszczalności inhibitora i konieczności zabezpieczenia go przed inaktywacją lub degradacją przed wprowadzeniem do komórek, tkanek lub organizmu. Terapeutycznie dopuszczalne nośniki obejmują rozpuszczalniki, środowiska dyspersyjne i środki pomocnicze (powlekające, powierzchniowo czynne, smakowo-zapachowe, antyoksydanty i inne). Środek według wynalazku można podawać różnymi drogami, w tym na drodze iniekcji, doustnie, miejscowo i rektalnie.
Preparaty doustne mogą być w postaci roztworów, zawiesin, emulsji, kapsułek, tabletek lub proszków. Ciekłe preparaty doustne mogą zawierać rozcieńczalniki, takie jak woda i alkohole ewentualnie z dodatkiem środków powierzchniowo czynnych, zawieszających lub emulgatorów. Kapsułki mogą być typu żelatynowego, a tabletki mogą zawierać powszechnie znane zarobki.
Preparaty do iniekcji obejmują wodne i niewodne izotoniczne sterylne roztwory, ewentualnie zawierające antyoksydanty, bufory, dodatki izotoniczne i podobne. Typowym nośnikiem jest np. woda lub fizjologiczny roztwór soli.
Środek według wynalazku można również stosować miejscowo, w formie aerozolu oraz czopków.
Środek otrzymuje się na ogół przez rozcieńczenie lub zmieszanie substancji czynnej z nośnikiem lub zamknięcie jej w nośniku.
Jeżeli substancją czynną jest kwas nukleinowy, można go podawać w specjalnych układach liposomowych, które rozpoznają odpowiedni typ komórek lub tkanek. W innym wariancie kwas nukleinowy można wprowadzać za pomocą ekspresyjnego wektora zawierającego sekwencję kodującą żądany inhibitor, np. mikro RNA lub siRNA.
Dawkę ustala się uwzględniając drogę podania, stan wymagający leczenia lub profilaktyki, a także inne specyficzne okoliczności.
W dalszej części opisu HBXIP bę dzie określany w skrócie jako XIP.
Na załączonych rysunkach fig. 1 ilustruje testy fuzji fragmentów hSUV3p z Lex A. A-test na samoistną aktywację transkrypcji przez fuzje Lex A- hSUV3p 1-479 i Lex A-hSUV3p 380-786. Komórki szczepu drożdżowego EGY48 stransformowane plazmidem reporterowym pSH18-34 hodowano na pożywce z CSM Gal/Raf ura-his-leu oraz na pożywce CSM Gal/Raf ura-his- z X-Gal. Brak wzrostu na pożywce bez leucyny oraz brak niebieskiego zabarwienia kolonii świadczy, że badane fuzje hSUV3p nie są czynne transkrypcyjnie. Lekki wzrost komórek stransformowanych pustym wektorem, kodującym tylko Lex A oraz miejsce wielokrotnego klonowania (Lex A-MCS) wynika z faktu, że fragment peptydowy kodowany przez sekwencję polilinkera ma zdolność do aktywacji transkrypcji na niskim poziomie. B-test importu do jądra i wiązania operatorów Lex A fuzji Lex A-hSUV3p 1-479 i Lex A-hSUV3p 380-786. Komórki szczepu drożdżowego EGY48 stransformowane plazmidem reporterowym pJKlOl oraz plazmidami kodującymi badane fuzje hSUV3p i fuzje kontrolne hodowano na podłożu CSM Gal/Raf ura-his- z X-Gal. Mniej intensywne niebieskie zabarwienie kolonii w przypadku fuzji Lex A-hSUV3p 380-786 świadczy o hamowaniu ekspresji fuzji reporterowej.
Fig. 2 przedstawia uliniowanie sekwencje ortologów XIP. Sekwencje białkowe ortologów uzyskano w bazie GenBank stosując program Blastp (Numery dostępu: H. sapiens AAC52032; M musculus AAH28547; D. melanogaster AAF45672; A. gambiae EAA08876) i uliniowano wykorzystując program ClustalW (Thompson et al., 1994)
Fig. 3 przedstawia końce 5' klonów cDNA X1P zidentyfikowanych przy wykorzystaniu systemu dwuhybrydowego w drożdżach. Wszystkie klony miały sekwencję DNA zgodną z sekwencją opublikowaną w Melegari et al., (1998). Przedstawiono jedynie pierwszych 15 nukleotydów sekwencji XIP; pogrubioną czcionką zaznaczono kodon inicjacyjny dla translacji otwartej ramki odczytu.
Fig. 4 przedstawia identyfikację domeny hSUV3p odpowiedzialnej za wiązanie z XIP. Komórki drożdżowego szczepu reporterowego EGY48 stransformowane plazmidem reporterowym pSH18-34, plazmidem kodującym XIP (klon 3-54 XIP-C) w fuzji z domeną aktywatorową B42 oraz różnymi fragmentami hSUV3p w fuzji z Lex A hodowano na pożywce z CSM Gal/Raf ura-his-trp-leu- oraz na pożywce CSM Gal/Raf ura-his-trp- z X-Gal. Zależny od galaktozy wzrost na pożywce bez leucyny oraz niebieskie zabarwienie kolonii świadczy, że badane fuzje białkowe oddziaływują z sobą in vivo.
Fig. 5 przedstawia oddziaływanie hSUV3p i XIP in vitro. A - oczyszczanie fuzji XIPTAP na złożu z IgG. Po heterologicznej ekspresji XIPTAP oczyszczano z ekstraktów E. coli. Ścieżka 1 - barwienie żelu SDS-PAGE błękitem Coomassie, ścieżka 2 - analiza Western oczyszczonej frakcji przy zastosowaniu
PL 210 715 B1 przeciwciał PAP. Prążek zaznaczony gwiazdką stanowi produkt alternatywnej translacji w zgodnej ramce odczytu, wynikający z obecności alternatywnego RBS w środku sekwencji. B - analiza SDS-PAGE wiązania hSUV3myc i hSUV3myc 1-650 z XIPTAP. Białko hSUV3myc wiąże się (ścieżka 1), natomiast tiSUV3myc 1-650 nie wiąże się (ścieżka 2) do XIPTAP immobilizowanego na złożu z IgG. Żadne z białek nie wiąże się do samego złoża IgG-agaroza (ścieżki 3 i 4) oraz do unieruchomionego na nim znacznika TAP (ścieżki 5 i 6). W ścieżkach 7 i 8 pokazano 20% ilości użytej do testu wiązania odpowiednio, hSUV3myc i hSUV3myc 1-650.
Fig. 6 przedstawia ekspresję i lokalizację mutanta hSUV3p 1-650. A - analiza lokalizacji hSUV3myc WT i hSUV3myc 1-650 w komórkach COS-1 po przejściowej transfekcji. Białka tych fuzji po utrwaleniu i permeabilizacji komórek wykrywano przeciwciałami anty-c-myc i wizualizowano FITC (zielony), mitochondria barwiono na czerwono - Mito Tracker CMXRos. Żółta barwa oznacza kolokalizację. B - analiza ekspresji hSUV3myc WT i hSUV3myc 1-650 w komórkach COS-1 przy zastosowaniu GFP, jako markera transfekcji - przykładowy obraz z mikroskopu fluorescencyjnego. Białka fuzji po utrwaleniu i permeabilizacji komórek wykrywano przeciwciałami anty-c-myc i wizualizowano TexasRed (czerwony), zielona fluorescencja pochodzi od GFP. C - analiza korelacji fluorescencji pochodzącej od TexasRed vs. fluorescencji GFP. Dla 100 losowo wybranych komórek, jak w punkcie B czerwoną i zieloną fluorescencję określano w jednostkach umownych (dyskretne wartoś ci 0; 0,5 i 1). Wykres przedstawia średnią i odchylenie standardowe dla pięciu powtórzeń z dwóch niezależnych transfekcji.
Fig. 7 przedstawia analizę Western z przeciwciałami anty- hSUV3.
Niżej podane przykłady ilustrują wynalazek.
P r z y k ł a d I. Oddziaływanie hSUV3p z XIP
System dwuhybrydowy
W celu zidentyfikowania potencjalnych białek oddziałujących z hSUV3p, zastosowano drożdżowy system dwuhybrydowy, opracowany przez J. Gyurisa (Gyuris, J., E. Golemis, H. Chertkov and R. Brent (1993). Cdil, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75: 791-803) i zmodyfikowany przez Finleya i Brenta (Finley, R. J. and R. Brent (1996). Interaction trap cloning in yeast., Oxford University Press.). System dwuhybrydowy jest powszechnie stosowaną metodą, pozwalającą na badanie interakcji pomiędzy białkami w układach in vivo. Metoda ta wykorzystuje fakt, iż wiele aktywatorów transkrypcji posiada przynajmniej dwie domeny fiinkcjonalne, z których jedna odpowiedzialna jest za wiązanie z DNA, a druga za aktywację transkrypcji. Domeny te pozostają funkcjonalne nawet w układach hybrydowych i nie muszą być ze sobą związane kowalencyjnie, aby aktywować transkrypcję. Tworząc dwie fuzje białkowe: białka X z domeną wiążącą DNA (tzw. przynęta) oraz białka Y z domeną aktywującą (tzw. zdobycz) można, wykorzystując gen(y) reporterowy(e) połączony(e) z odpowiednim regionem promotorowym, zbadać interakcję białka X i Y.
Fuzje białkowe hSUV3p do systemu dwuhybrydowego w drożdżach
W użytym systemie wykorzystywana jest domena wiążąca DNA, pochodząca z bakteryjnego białka LexA (aminokwasy 1-202), wyrażana konstytutywnie z promotora ADHl na plazmidzie. Domeną aktywującą transkrypcję w tym układzie jest fragment białka nazwany B42 (bakteryjna domena aktywatorowa), wyrażany z plazmidu pod kontrolą indukowanego galaktozą drożdżowego promotora GALI. Genami reporterowymi są zaś: (i) wintegrowany w genom drożdżowy gen LEU2, w którym w region regulatorowy na końcu 5' wstawiono operatory LexA (LexAop-LEU2; szczep drożdżowy EGY48) oraz (ii) plazmidowa fuzja promotora i krótkiego kawałka sekwencji kodującej genu GALI z sekwencją kodującą LacZ, w której sekwencje UASq promotora GALI zastąpiono operatorami LexA (LexAop-GALlLacZ; plazmid pSH18-34). Niewątpliwą zaletą tego systemu jest możliwość wykonania wielu testów kontrolnych przed wykonaniem właściwego przeszukiwania interaktorów.
W pierwszym etapie doś wiadczeń , stworzono fuzje (tzw. przynę ty) fragmentów sekwencji kodującej hSUV3 z sekwencją kodującą domenę wiążącą DNA LexA. W przypadku pierwszej fuzji dołączono N-końcową domenę białka hSuv3p (aminokwasy: 1-479; LexA-hSuv3p 1-479), w drugiej zaś C-końcową (aminokwasy 380-786; LexA-hSuv3p 380-786). Wykonano testy kontrolne dla obu fuzji przed wykonaniem właściwego przeszukiwania interaktorów. Po pierwsze sprawdzono, czy fuzje hSuv3p z LexA samoistnie nie aktywują transkrypcji genów reporterowych, co uniemożliwiłoby przeprowadzenie przeszukiwania. Fig. 1 pokazuje, że obie fuzje hSuv3p z LexA są nieczynne transkrypcyjnie. Następnie, sprawdzono, czy badane fuzje białkowe są importowane do jądra komórkowego i czy wiążą operatory LexA powyżej genów reporterowych in vivo. W tym celu, badano ich zdolność represji transkrypcji fuzji promotora i fragmentu sekwencji kodującej GALI z sekwencją kodującą LacZ, w której pomiędzy element TATA, a sekwencje UASq wstawione są operatory LexA (plazmid pJKlOl). Jak
PL 210 715 B1 przedstawiono na fig. 1 fuzja LexA-hSuv3p 380-786 w dużo większym stopniu hamowała transkrypcję reportera w porównaniu z LexA-hSuv3p 1-479, co określano obserwując intensywność niebieskiego zabarwienia koloni.
Identyfikacja XIP jako białka oddziałującego z hSUV3p za pomocą drożdżowego systemu dwuhybrydowego
W powyższych testach wykazano, że fuzja LexA-hSuv3p 380-786 samoistnie nie aktywuje transkrypcji, wiąże się z operatorami LexA po imporcie do jądra i jest wyrażana, jako produkt pełnej długości. Dlatego też, tę fuzję wykorzystano, jako białko przynęty do przeszukiwania banku ludzkiego cDNA z komórek HeLa. Biblioteka cDNA była skonstruowana w taki sposób, że fragmenty cDNA były wyrażane w fuzji z domeną aktywatorową B42. Przeszukano 6 x 106 klonów biblioteki. Poddano analizie 142 kolonie leu+ na podłożu z galaktozą, jako źródłem węgla. Spośród pozytywnych klonów leu+ 57 charakteryzowało się zależnym od galaktozy niebieskim zabarwieniem na pożywce z X-Gal i brakiem wzrostu na podłożu bez leucyny z glukozą. Z tych kolonii izolowano plazmidowy DNA, amplifikowano wstawkę w reakcji PCR, trawiono restrykcyjnie w celu odróżnienia niezależnych klonów i poddawano sekwencjonowaniu. Wyniki przeprowadzonego przeszukiwania podsumowano w tabeli 1.
Tabela 1 Wyniki przeszukiwania biblioteki cDNA komórek HeLa pod kątem białek oddziałujących z C-końcową domeną (aminokwasy 380-786) hSuv3p
Zidentyfikowane białko niezależnych klonów
Białko oddziałujące z białkiem X wirusa HBV - X1P 7
Białko z domeną o charakterze powtórzenia tetratrichopeptydowego (TPR) 2
Białko wiążące się do domeny cytoplazmatycznej integryny β 1 - Icap-1a 2
Białko opiekuńcze matriks mitochondrialnej - Hsp60p 2
Białko o nieznanej funkcji (26kDa) - brak homologii do innych białek 1
Podjednostka S5a proteasomu cytoplazmatycznego 26S 1
Białko ER1 (Early Response Protein 1) 1
Białko opiekuńcze Hsp90a 1
ATP-zależna helikaza DNA typu II (antygen Ku70)1
Wśród klonów wyizolowanych w drożdżowym systemie dwuhybrydowym najliczniej reprezentowanym był cDNA kodujący białko XIP. Z danych literaturowych (Melegari, M., P. P. Scaglioni and J. R. Wands (1998). Cloning and characterization of a novel hepatitis B virus X binding protein that inhibits viral replication. J Virol 72: 1737-43) wynikało, że XIP jest 9,6 kDa białkiem wiążącym się z C-końcową domeną białka HBx kodowanego przez genom wirusa żółtaczki zakaźnej typu B (HBV). HBx jest białkiem regulatorowym, niezbędnym do infekcji HBV o bardzo zróżnicowanej funkcji. Z wielu nowszych prac wynikało, że wirusowe białko HBx lokalizuje się przede wszystkim w mitochondriach i bierze udział w wielu procesach z nimi związanych; (Huh, K. W. and A. Siddiqui (2002). Characterization of the mitochondrial association of hepatitis B virus X protein, HBx. Mitochondrion 1: 349-359).
Z analizy baz danych sekwencji wynikało, że XIP, podobnie jak hSuv3p, jest białkiem dość silnie konserwowanym w ewolucji, a jego ortologi są obecne u kręgowców (mysz, szczur) i owadów (np. D. melanogaster i A. gambiae) - zob. fig. 2. Nie zidentyfikowano natomiast ortologa XIP w drożdżach. Dodatkowo, analizując profile ekspresji genów XIP i hSUV3 w różnych tkankach ludzkich, okazało się, że są one niezwykle do siebie podobne, co mogłoby wskazywać na wspólną regulację ekspresji obu genów i potencjalne oddziaływanie ich produktów białkowych.
W celu sprawdzenia specyficzności oddziaływania hSuv3p-XIP w systemie dwuhybrydowym, odzyskiwano plazmidy kodujące poszczególne klony i transformowano nimi ponownie szczepy, zawierające plazmidy kodujące białko fuzji LexA-hSuv3p 380-786 lub niespecyficzne białka przynęty tj. LexA-bicoid, LexA-CD4, LexA-CD4A85, LexA-lC. Tylko w przypadku szczepu z plazmidem kodującym LexA-hSuv3p 380-786 uzyskano fenotyp wynikający z oddziaływania pomiędzy białkami, co wskazywało na specyficzną interakcję pomiędzy hSuv3p i XIP. Charakterystykę wyizolowanych klonów cDNA XIP przedstawiono na fig. 3.
PL 210 715 B1
Identyfikacja domeny hSUV3p odpowiedzialnej za wiązanie z XIP
W celu identyfikacji i wstę pnej charakteryzacji domeny hSuv3p odpowiedzialnej za wią zanie XIP skonstruowano kilka mutantów delecyjnych fuzji LexA-hSuv3p 380-786. Skonstruowano również fuzję LexA z hSuv3p pełnej długości (LexA-hSuv3p 1-786). Następnie testowano zdolność poszczególnych fuzji i ich mutantów do oddziaływania z XIP w systemie dwuhybrydowym. Jak wynika z fig. 4 fuzja hSuv3p pełnej długości oddziaływała z XIP podobnie jak fragment 380-786 użyty do przeszukiwania w systemie dwuhybrydowym. Fragment 1-479 hSuv3p nie oddzia ływał z XIP, co mogło jednakż e wynikać z niższego poziomu ekspresji i/lub słabszego wiązania się fuzji LexA-hSuv3p 1-479 do operatorów LexA. Wykonano zatem delecję 113 aminokwasów pomiędzy resztami 393-506 we fragmencie 380-786 (fuzja LexA-hSuv3p 380-786 A393-506). Powyższa delecja nie wpływała na wiązanie obu testowanych białek, co silnie sugerowało, że N-końcowy fragment regionu 380-786 nie jest istotny dla oddziaływań hSuv3p-XIP. Delecja 51 aminokwasów na C-końcu (fuzja LexA-hSuv3p 380-735) powodowała częściową utratę zdolności XIP do oddziaływania z hSuv3p, a usunięcie 136 C-końcowych aminokwasów (fuzja LexA-hSuv3p 380-735) prowadziło do całkowitego zniesienia oddziaływania pomiędzy badanymi białkami. Przeprowadzona analiza wskazywała, że region 650-786 hSuv3p jest odpowiadany za wiązanie z białkiem XIP.
Oddziaływanie białek XIP i HSUV3p in vitro
W celu wykluczenia moż liwoś ci, ż e obserwowana w systemie dwuhybrydowym interakcja hSuv3p-XIP jest artefaktem zastosowanej metody, przeprowadzono eksperymenty polegające na badaniu bezpośrednich oddziaływań obu białek in vitro. Skonstruowano fuzję XIP ze znacznikiem TAP (składającym się z peptydu wiążącego kalmodulinę CBP, miejsca cięcia proteazą TEV oraz białka A (Rigaut,
G., A. Shevchenko, B. Rutz, M. Wilm, M. Marm and B. Seraphin (1999). A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol 17: 1030-2) umieszczonym na C-końcu (XIPTAP). Taką fuzję oczyszczono na złożu z IgG po ekspresji heterologicznej w E. coli Fig. 5. Następnie badano interakcję oczyszczonego XIP z hSuv3myc pełnej długości oraz z hSuv3myc pozbawionym 136 aminokwasów na C-końcu (hSuv3myc 1-650). W obu przypadkach białka miały epitop c-myc na C-końcu. Obie formy hSuv3p wytworzono w systemie translacji in vitro (IVT), znakując [35S]-metionina i inkubowano ze złożem ze związanym XIPTAP. Jedynie pełnej długości białko hSuv3myc powstające w reakcji IVT oddziaływało z fuzją XIPTAP immobilizowaną na złożu IgG-agaroza. Żadne z wyznakowanych białek nie wiązało się z samym znacznikiem TAP oczyszczonym po ekspresji w E. coli ani ze złożem IgG-agaroza. Otrzymane wyniki potwierdzają specyficzność oddziaływań i istotność C-końca w wiązaniu hSuv3p-XIP.
Podjęto również próbę zbadania, czy białka hSuv3p oraz XIP mogą być immunoprecypitowane w postaci kompleksu przeciwciałami poliklonalnymi anty-hSuv3p lub monoklonalnymi anty-c-myc in vitro. W tym celu, fuzję XIPTAP pozbawiono Białka A, tworząc w ten sposób fuzję XIPCBP. Usunięcie sekwencji kodującej Białko A ze znacznika TAP było konieczne, ponieważ w przeciwnym razie przy próbie immunoprecypitacji fuzji. Białko A oddziaływałoby zarówno z przeciwciałami poliklonalnymi anty-hSuv3p, jak i monoklonalnymi, anty-myc uniemożliwiając interpretację wyników.
Następnie białka hSuv3myc oraz XIPCBP wytworzono w systemie translacji in vitro, znakując [35S]-metioniną i inkubowano z surowicą anty-hSuv3p lub przeciwciałami mAb skierowanymi przeciwko c-myc. Ani przeciwciała anty-hSuv3p ani anty-c-myc nie strącały kompleksu hSuv3p-XIP. Mogło to wynikać z faktu maskowania miejsca wiązania hSuv3p-XIP przez przeciwciała.
Lokalizacja komórkowa XIP
Po wykazaniu oddziaływania białek hSuv3p i XIP in vivo w komórkach drożdżowych oraz w układzie in vitro, postanowiono zbadać lokalizację komórkową XIP. W poprzednich badaniach, po zidentyfikowaniu XIP jako białka oddziałującego z HBx nie wykazano jego lokalizacji komórkowej (Melegari et al, 1998). Ponieważ hSuv3p jest białkiem mitochondrialnym, badanie, w którym przedziale komórkowym występuje XIP mogło wskazać na charakter interakcji XIP-hSuv3p - zasugerować, czy białka tworzą trwały kompleks na terenie mitochondriów, czy może oddziałują przejściowo w innym przedziale komórkowym. Przeprowadzono analizę sekwencji białkowej XIP i jego ortologów in silico. Przewidywanie komputerowe programem PSORT (Nakai, K. and P. Horton (1999). PSORT: a program for detecting sorting signals in proteins and predicting their subcellular localization. Trends Biochem Sci 24: 34-6.) wykazało, że białko to ma sekwencje sygnałowe, charakterystyczne dla białek cytoplazmatycznych i jądrowych. Otrzymano następujące wyniki modelowania komputerowego (podano jako prawdopodobieństwo wstępowania w poszczególnym przedziale komórkowym) H. sapiens: 0,56 cytoplazma, 0,21 jądro komórkowe, 0,04 mitochondria; M musculus: 0,61 cytoplazma, 0,26 jądro
PL 210 715 B1 komórkowe, 0,09 mitochondria; D. melanogaster: 0,52 cytoplazma, 0,17 jądro komórkowe, 0,17 mitochondria oraz A.gambiae: 0,09 cytoplazma, 0,70 jądro komórkowe, 0,22 mitochondria.
W celu wykazania lokalizacji białka XIP w komórkach ssaczych skonstruowano fuzję białkową, w której na C-końcu białka dołączono epitop c-myc (9E10; sekwencja EQKLISEEDL), umożliwiający łatwą detekcję produktu przy zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych. Lokalizację fuzji XIPmyc badano w przejściowo transfekowanych, a następnie utrwalonych i permeabilizowanych komórkach HeLa, inkubując je z przeciwciałami monoklonalnymi anty-c-myc oraz z drugorzędowymi przeciwciałami anty-mysie IgG sprzężonymi z FITC. Mitochondria znakowano stosując barwnik MitoTracker Red CMXRos. Jądra komórkowe barwiono DAPI. Przeprowadzona analiza wykazała, że białko XIPmyc lokalizuje się w cytoplazmie i jądrze komórkowym (fig. 6.). Te same wyniki otrzymano przy zastosowaniu komórek COS-1.
P r z y k ł a d II. Indukowanie apoptozy komórek HeLa przez obniżeniu poziomu hSUV3 w wyniku traktowania komórek siRNA
Zaprojektowano komplementarne względem siebie oligonukleotydy RN A odpowiadające sekwencji kodującej hSUV3: (SEK. NR ID 1; SEK. NR ID 2; SEK. NR ID 3), dostępne w bazie danych GENBANK AF042169; AL596223) suv 637 sense r(GAC UUA UCA CGC AAU CCA G)d(TT) SEK. NR ID 4 suv 637 antisense r(CUG GAU UGC GUG AUA AGU C)d(TT) SEK. NR ID 5
Zsyntetyzowane chemicznie w syntetyzerze na fazie stałej pojedynczoniciowe oligonukleotydy
RNA (Xeragon, USA) połączono uzyskując w ten sposób podwójnoniciowe dsRNA.
Komórki HeLa (linia ludzkich komórek nabłonkowych pochodzących z raka szyjki macicy) wysiewano na płytki do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm (Sarstedt) w ilości 5 x 104 komórek na ml w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma) uzupełnionej 10% surowicą z płodów cielęcych (FSC, Sigma), glutaminą (2 mM), pirogronianem (100 μg/ml) i urydyną (50 μg/ml). Komórki hodowano przez 20 godz. w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 uzyskując około 30% konfluencji. Komórki transfekowano dsRNA przy użyciu odczynnika OLIGOFECTAMINE® (Invitrogen) (lipidowy koktail do transfekcji, dostępny u wielu producentów) zgodnie z zaleceniami producenta. Stężenie używanego dsRNA wynosiło 20 μΜ/ml. Jako kontrolę zastosowano syntetyczne siRNA wobec mitochondrialnej PAP (Tomecki i wsp. Nucleic Acid Res. 32 (2004) 6001-6014) i sam odczynnik do transfekcji. Po transfekcji komórki hodowano przez 72 godziny.
Komórki zbierano w następujący sposób. Pożywkę znad warstwy komórek przywartych do płytki zebrano i odzyskano znajdujące się w niej komórki poprzez wirowanie przy 1200 obr./min. przez 3 min (próbki B). Komórki na płytce zalano roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem PBS (Sigma), zeskrobano z płytki przy użyciu skrobaczki (Medlab) i odzyskano z roztworu poprzez wirowanie jak wyżej. Osady komórkowe zawieszono w 50 μl PBS. Połowę zawiesiny komórek z próbki A dodano do komórek zeskrobanych z szalki (pulę oznaczono, jako próbka A).
Do zawiesiny komórek dodawano równą objętość roztworu Laemmliego (100 mM Tris-Cl pH 6,8; 4% SDS, 0,2% błękit bromofenolowy, 20% glicerol, 200 mM p-merkaptoetanol) i próbki gotowano przez 3-4 minuty.
W celu oszacowania stopnia obniżenia poziomu hSUV3 i zbadania procesu apoptozy w komórkach traktowanych siRNA anty-hSUV przeprowadzono analizę Western z zastosowaniem, odpowiednio, króliczych przeciwciał poliklonalnych anty-hSUV (Minczuk i wsp. Nucleic Acid research 2004) i przeciwciał monoklonalnych anty-human PARP (BD Pharmingen). W czasie apoptozy białko PARP (116 kDa) jest trawione na dwa fragmenty, o wielkości 85 kDa i 25 kDa.
Analizę Western przeprowadzono jak następuje. 10 μl próbek białka rozdzielano w 8% żel poliakryloamidowym z SDS. Białka przenoszono na filtr nitrocelulozowy Hybond-C (Amersham) w aparacie do elektrotransferu Trans-blot Celi (Bio-Rad). Filtr blokowano przez 4-5 godzin w roztworze 5% odtłuszczonego mleka w buforze PBST w temperaturze pokojowej. Inkubację z pierwszorzędowymi przeciwciałami (anty-human PARP) prowadzono w objętości 10 ml przez noc w temperaturze 4°C w roztworze 5% odtłuszczonego mleka w PBST. Niezwiązane przeciwciała odpłukiwano jednokrotnie przez 15 minut i dwukrotnie przez 5 minut przy użyciu PBST w temperaturze pokojowej. Inkubację z drugorzędowymi przeciwciałami (królicze przeciwciało poliklonalne anty-mysia IgG połączone z peroksydazą z chrzanu, Sigma) prowadzono przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w objętości 10 ml w 5% mleku w PBST. Przed przystąpieniem do wywoływania filtr płukano w identyczny sposób jak po przeciwciele pierwszorzędowym.
PL 210 715 B1
Związane przeciwciała wykrywano przy użyciu zestawu ECL Detection Kit (Amersham Life Sciences) według protokołu opisanego na stronie http://celljunction.med.nyu.edu (100 mM Tris-Cl, pH 8,5; 1,25 mM luminol (Fluka), 0,2 mM kwas kumarynowy (Sigma), 0,1%o H2O2).
W celu wykrycia biał ka hSUV3 filtr inkubowano w temperaturze 65°C przez 1 godz. w buforze zawierającym 100 mM P-merkaptoetanol, 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,7. Przed przystąpieniem do kolejnego blokowania filtr wielokrotnie przemywano dużymi objętościami PBST w celu odpłukania resztek buforu. Następnie przeprowadzono postępowanie jak wyżej z tą różnicą, że przeciwciałem pierwszorzędowym było królicze przeciwciało poliklonalne anty-hSUV, a przeciwciałem drugorzędowym kozie przeciwciało poliklonalne anty-królicza IgG.
Wyniki są przedstawione na fig. 7.
Poziom wyciszenia oceniany na podstawie analizy Western z przeciwciałami anty-hSUV3 wynosi około 70%. W komórkach HeLa traktowanych siRNA wobec hSUV i zebranych z pożywki (próbka B) obserwuje się wyłącznie wzór prążków charakterystyczny dla procesu apoptozy (brak prążka odpowiadającego masie 116 kDA i obecność prążka odpowiadającego masie 85 kDa. Komórki kontrolne traktowane OLIGOFECTAMINE® bez siRNA nie wykazują oznak apoptozy.
PL 210 715 B1
Wykaz sekwencji
SEK. NR ID 1
Sekwencja cDNA ludzkiego SUV3.
actgtccgcc gccgtgtccg cggctgcgcc agacagtgta gaacctgcgg cctcgatgtc 61 cttctcccgt gccctattgt gggctcggct cccggcgggg cgccaggctg gccaccgggc
121 agccatctgc tctgcccttc gtccccactt tgggcccttt cccggggttc tggggcaagt
181 ttctgtcctt gccaccgcct cctcctctgc ctccggtggc tccaaaatac caaacacgtc
241 cttgttcgtg cccctgactg tgaaacctca gggccccagc gccgacggcg acgtcggggc
301 cgagctaacc cggcctctgg acaagaatga agtaaagaag gtcttagaca aattttacaa
361 gaggaaagaa attcagaaac tgggtgctga ttatggactt gatgctcgtc tcttccacca
421 agctttcata agctttagaa attatattat gcagtctcat tccctggatg tggacattca
481 cattgttttg aatgatattt gcttcggtgc agctcatgcg gatgatttat tcccattttt
541 cttgagacat gccaaacaaa tatttcctgt gttggactgt aaggatgatc tacgtaaaat
601 cagtgactta agaataccac ctaactggta cccagatgct agagccatgc agcggaagat
661 aatatttcat tcaggcccca caaacagtgg aaagacttat cacgcaatcc agaaatactt
721 ctcagcaaag tctggagtgt attgtggccc tctaaaatta ctggcacatg agatcttcga
781 aaagagtaat gctgctggtg tgccatgtga cttggtgaca ggtgaagagc gtgtgacagt
841 tcagccaaat gggaaacagg cttcacatgt ttcttgtaca gttgagatgt gcagtgttac
901 aactccttat gaagtggctg taattgatga aattcaaatg attagagatc cagccagagg
961 atgggcctgg accagagcac ttctaggact gtgtgctgaa gaggttcatt tgtgtggaga 1021 acctgctgct attgacctgg tgatggagct tatgtacaca acgggggagg aagtggaggt 1081 tcgagactat aagaggctta cccccatttc tgtgctggac catgcactag aatctttaga
1141 taaccttcgg cctggggact gcattgtctg ttttagcaag aatgatattt attctgtgag
1201 tcggcagatt gaaattcggg gattagaatc agctgttata tatggcagtc tcccacctgg
1261 gaccaaactt gctcaagcaa aaaagtttaa tgatcccaat gacccatgca aaatcttggt
1321 tgctacagat gcaattggca tgggacttaa tttgagcata aggagaatta ttttttactc
1381 ccttataaag cccagtatca atgaaaaggg agagagagaa ctagaaccaa tcacaacctc
1441 tcaagccctg cagattgctg gcagagctgg cagattcagc tcacggttta aagaaggaga
1501 ggttacaaca atgaatcatg aagatctcag tttattaaag gaaattttga agaggcctgt
1561 ggatcctata agggcagctg gtcttcatcc aactgctgag cagattgaaa tgtttgccta
1621 ccatctccct gatgcaacac tgtccaatct cattgatatt tttgtagact tttcacaagt
1681 tgatgggcag tattttgtct gcaatatgga tgattttaaa ttttctgcag agttgatcca
1741 gcatattcca ctaagtctgc gagtgaggta tgttttctgc acagctccta tcaacaagaa
1801 gcagcctttt gtgtgttctt cactgttaca gtttgccagg cagtatagca ggaatgagcc
1861 cctgaccttt gcatggttac gccgatacat caaatggcct ttacttccac ctaagaatat
1921 taaagacctc atggatcttg aagctgtcca cgatgtcttg gatctttact tgtggctaag
1981 ctaccgattt atggatatgt ttccagatgc cagccttatt cgagatctcc agaaagaact
2041 agatggtatt atccaagatg gtgtgcacaa tatcactaaa ttgattaaaa tgtctgagac
2101 gcataagctg ttgaatttgg agggctttcc atcagggagc cagtcacgat tgtcaggaac
2161 cttaaagagc caagctagaa ggacacgcgg caccaaagct ctagggagta aagctactga
2221 gccacccagc cccgatgcag gagagctgtc ccttgcttcc agattggtgc agcaaggact
2281 cctcactcca gacatgctga aacagctaga aaaagagtgg atgacacaac aaactgaaca
2341 caacaaagaa aaaacagagt ctgggactca tccaaaaggg acgagaagaa agaagaagga 2401 acctgattcg gactagtttt ctgttcctgt tttttttttt ttatttaatt ttgcaaataa 2461 aaatttattt tgaagaaaaa aaaaaaaaaa a
SEK NR ID2
Sekwencja ludzkiego genu Suv3.
Start transkrypcji-nukleotyd 3401, terminacja transkrypcji-nukleotyd 32257.
tcaccagatg ccagcctctt gatcttggac ttcctagcct ccagaactaa aagaaataaa ttcattttct ttacaaatta ctcagtctgt ggtgttctgt tatagcaatg caaaatggag 121 taagtgttat cttggcccta tcctgaagga actttaatcc agagcagtgg ttctcaaaag 181 tgtggtctca gaccagcaga gttgcatcat ctgaaatgtt ttagaaatgt aaactctcag 241 atcccactcc agatctactg aatcagaaac ttcagggatg gggcccaaca atcttgttgc 301 actctaacgt ttaagaacca ctgacccaga gacacaatta cgatagtttt cattctatga 361 tagagcctct actgggacct gtgatatgta agagaagcac ccagtgtgtt cagaggtgca 421 gaggtaagaa acgatgatat aactggtgta tagttccagc atgaatagaa tggtagatgt
PL 210 715 B1 ggggagtaga aataaagctg gaagaggcat atagggccaa ccaatttagg acagaacctg gatgccatac gatggaatat gggctttatc tgaacattta ttcagaatca ccaaaggact ctaagcagga gtaacttacc agatttgtgt tttcaaaaga tcattatggt gctacggcaa agtataggag gataccagtt acatagttac tgcattaatc cattcaacaa gcaaaataaa acatttatag aggctctaat atgtgttagg tgctgattac acttactgct ataaatatga cataaccagt atagatatga catctttttt tgtaaaagca aaaattttat attgaatttt cccatttcaa tgtttatagt agaacttaat gaatggctga aagggaaagc ctgtatgtgc tatcataaaa ttcagattgc attttctacc tgcaaggagg tgcaaacaaa attacagtta aaatagtttt gaggattttt tttttctgta aaactatact agggttgggc tagatctgta agactagtaa ctgccaggtg ctgtggcatg cacctgtagt tccagttact caggaggctg acacaggatt gcttgagccc aggagttcac gatcaccctt ccaaagaaaa aaaaagactc gtacaaatgt tgattctggc ctaatatgct gctcctgtcc aaaaagccca cctatttgct ttgaaatcag aaagactggc tgggcacggt ggctcacacc tgtaatccca gcactttggg aggccgaggc agctggatca cttgaggcca ggagttctga gaccagcctg gccaacatgg tgaaactaaa gagaatacaa aaattagcca ggtattgtgg tgcaagcctg tagtcccagc tactcgggag gctgaggcat gagaattgct tgagcctggg aggtggacgt tgcagtgagt tatgattgca ccactgcact tcagcctggg caacagagtg agactgtctc aaaaaaaaga aaaaaaaaag atttagattt gtatctgact ctaccactta ctggggcaag ttagttaacc tggtgacaat aatacctcta aattgttgtc aagcatatta aaagattaaa aggaacaaca tagtgcttgc ctcagttacg tattaaacgt ttggtttatc cttcattctc ctagtttcca aatctgacga gacatcattg tttattaaca ttttctagca tatttagtca ctcactacat tatctaagga gtcttgtaaa acctctcatt ccacatacat ggtctccatc ataactcaga cacaggaatc taccaccttc agctagaact gttgataaag ttgtaatttt cctccctgca tatttgtgtt tatcctagtc tatcctaggt acttcctaat gaatgatttc tcttctcaaa aatataatca ctatttgtaa gccatagaat taggtctgcg ttaactctgt tacttaaatt tttttcagta tgtcttttcc ttagttaagc ctctgcttac atcgtttcca ctgactagaa tttacttacc gcttctctat gttttacttt taagtctggc agaaatctcc ttaccactct caaattgctc ctttctttga actgccatta gtctattaga gtaataagtg cattatttaa cgtgtactgt tcttaccacc aaaaccagat cagaaccttt gaaagcaaag gactgtctcc ttgtatccct gatgtttaaa aattattttg tgaatcaaag gcacgtggca aattgttact ggaatcctat tagacataca gtattgtata ttacataaca cgttccttca agttgtaaga tcttaatgat gtaagtataa agagatgtgg atggagatgc taaacttgtg aatttttttt ttttttagac ggagtctcac tctgttgccc aggctggaga gcagtggccc gatctcggct cactgcaacc tctggcaccc aggttcaaac gattctcctg cctccgcctc cctagtaatt gggattacag gtgtgcacca ccacgcccgg ctgattcttg tatttttagt agagagggga tttcaccatg tttgccaggc tggtctcgaa ctcctgacct cagatgatcc accggcctcg ccctccctaa gtgctgcgat tacaggcgtg aaccaccacg cccgggttaa acttgtgaat ttaacatgtt gcagcctcac atgagaacac ggtattcaac aaatgcaatg gaacgaaact atggctgggg tacagagcac gtatttttgc catgtggtca caactatgtg gtcatagctg ctaggatgat gtacgcaaac tgctcacatt aaagcaaaag tacttacgta atacaagggg tttaatagtg caacaatatt tcttagcaac atttctgagg ggcatatcaa gttattatcg ctaacgttat catatcagga aatgacggtt aacaatgcaa gaaacttttg ggaaatgcta tttagtgttt gagtccgcaa gacatactcg taccctgagc attcgcagtt gctgctccac cacccattct ctcactgctc acccacgtgc ttctggacac ttgcttacca aagtactagt ttgcatcacg tgacacgact agcaggcccc ctccgctcat gtatgacatc ccaaagatgc ctgattattt tcccttcttt agggaaaggt ggtcccaatc accaacaaaa cagagaaaga gaacgagaat tatctctagt ggttttgcct gctaatcttc tttttccctg aaagaacacc ctcacggcac ggcgttttcc ttaacggtca ggcgttttcc cgggcagctt acctgctcgg cctgggtctt tctggacagc aggcgctgga ggtgcgcgtc actgtccgcc gccgtgtccg cggctgcgcc agacagtgta gaacctgcgg cctcgatgtc cttctcccgt gccctattgt gggctcggct cccggcgggg cgccaggctg gccaccgggc agccatctgc tctgcccttc gtccccactt tgggcccttt cccggggttc tggggcaagt ttctgtcctt gccaccgcct cctcctctgc ctccggtggc tccaaaatac caaacacgtc cttgttcgtg cccctgactg tgaaacctca gggccccagc gccgacggcg acgtcggggc cgagctaacc cggcctctgg acaagagtga gtgcgggaac tactgagggc ggcagagggt ggtgtctgct gggccgaggc tggttgggag gaagctacat ccccttcccc tggggatccg aggtcccatc gagtgttgtc
PL 210 715 B1 atcgtgcctc tcagtgtctg cctccttcgc tggtgtgtga gcccctcaaa cggcttagga ctgtatctga ttaattctta acgcctcgtc ccagaagcgg ccttttccct tttactgccc tgctctctga atggtttaga cactcatgtg ttgggaagat ttgacttttt tgagttgtta ggtggacgcc cgctctttct tgcattcttt gtttctctcc cacccccgaa tgggatgtgg cagtgaaaag ccagcggaga ctccttttag gattctttat cattgaggag gcgccgactc ataccacgct gttaggctgt gtggtggttg ccaagaggaa ccagactcag atccagatcc cctcttaaga aacgtaacgg tatcgtgggg gaggacacgt gtatggaaag tgaactgtaa tacaaggtag aacatgacaa ggtctagaac aaggtagggt gtccccggct ccagagagaa aagaagaggt agcatcagtt agtggcagcg ggctttgctc agcaaaactt aagtttggat ggattcgttg acagagaggc atgtgaatgt tttcaaggtg agtttcggga tgattaggga ggtaagggag tttcctctga ccatatgaaa ctgggagatt gaggaaatgc tatccagaat tgtctccagg aataggagga gaaatgtctc acttcaacaa gcgacattgg tgcctcctat tgtaaatcta aaatatagac tacaatatgt ttttcagagc agaagtacag tactttcact aaacatgtga tggaactcac agtatatgtt attctttgac atattcttcc agtgttaagc aaggcctttc actttacttg gtgctgggag actgtcttta ttttctgctg ttataacata atacctgaga ctgagtaatt tataaacaat agaggtgtat ttgactcatg gttctgagcc gggatctgat gagggccttt ggctgcatca tcacatggtg gaaggtggaa aggcaaatga gcctgtgaga cagagaaagg gggctgaact tatccttttt tcctgtgata actgactcct gtgataatgg cattaatcca ctcacaaagg caaactcctc atgtcctaat cacctcttaa aggttccacc tctcaactgt taaaatagca attaaatttc aatatgagtc ttggagaaga cattcaaacc atagcagaga atgtgttatt ttaataatgt aattatacta ttatttattt ttaaattata aaaatacata aaatttactc ttttaagctt ttttttagtt tttttttctt tacttttttt tttttagaga cagggtcttg ctctgttacc caagctggag tatagtggta tgatcatagc tcactgtaac ctccaactcc cagactcaag caatcctcct ggctcagcct tctaagtagc taggaataca ggcgtgcatc accatgcctg gataattttt taattttttg tagagatggg gtcttgctat gttgcccagg ctggtctcaa acttctgggc tccagggatc ctcctgccat ggcctcccaa agccctgaga ttacagacct gagccactgc acccagccag tcttaattgt ttttaagcac atagttcact agcgttaagt atattgacat tgtcgcgaaa tagatgagaa ctttttcatc ttgcagagtt gaaactcaaa caatagttta cccattaaag aacaattttc cattatttta tattatttga aggcataagg taatttggat gagataattt gccttattgt attcaaatat tgataaattc ttattttctg cagctattcc aattcacctg aaaatgtaaa tgtctttgct gcttcctgta agaagataga ataaagacat gggtttgtca gcactagatt ttcttctggt ggagaatcct tagatacttc attgggtctg tgtgccaggt gatttttcat ctcctttgac tgggattggt ccagatgttg aatttactag aatgattttt cagcatggca ggaggggcta cagaagatgg tgcattacta cactctgata tagccatgtg gttaaggtgt cagatttcca cttagcttag caatcaggac aagaagctgt cacttctcaa tctcttttgc ctactcataa cccaaaaagt tgaggtactt aaaggctttg tcctgcgtca ccttgctgcc ttattctgtg ctgtctatgg ggtgtctcat tctctctctc ccctcactaa ttcagtattc ctctcagatc tttgtctcta ccctggacct ctctccttca ccctggacct atatatctcg ctgcctacca ggtgtctcca cttgtctttc ttacacacac ctcaccttag catgtcaaga caacttacct tcccctcagc ctgctcctgc aggtgctcag gtcaaaacct ggtagtcttt gttcttccat ccctcacccc tacatctaac aatcagagaa agcccagtta atgagtcttg ttgattctac ctcataaatg ttggattcat tcatttccct cattctccac tgcaaccagc ttagtctaaa ttgccagctt ccatcttttg actggactgc acatatagcc ccttatgtgt ctcctcatat gcctttgatc ccttcattct attctctacc tgcagtcaga atgttctttt aaaaagacta ggctgggcgc agtgtctcgt gcctgcaatc ccagcacttt gggaggccca ggagggtgga tcgcttgagc ccaggagctc aagacgagct tgggcaacat ggcaaaactc catctctaca aaaaatacag aaattagcca ggcatgatgg tgtgtgcctg tagttccagc tacttgggag gctgaggtgg gagggttgct tgagcttggg tagtagtaga ggttgcagtg agccgagatt gcaccaccac actccagcct gggtgacaag agtgagaccc tgtctcaaat aaaaaaagaa agatacaatt ttaatttaca tactagaaag ctcacccttt aaaagtgtat aattcactgg gttttagtgt atttgcagga ttgtacaatc atcaccataa tttcatttta gaacattttt atcaccctaa aaagaaacct gatatctgtt agcaagtcac tctctagttc cccagtcccc agtgtctttt tttttttttt agctccagat aaccactaat ccacattctg tctgttgatt tgcctgtttt gtgtatttca tatttatagt gtcatatagt attggtcttt tgtaactggt ttcttttact tagcataatg agaaatttca cattttggaa
PL 210 715 B1 gcattttaat ttgagtaaag cagcatgaat cttatataac accgtagtat tagtcacaga aaataggtta attctaaata aatgtgatct gtctttagtt tgtatcgagt ttataggtca gcagaatttt cccaagcaat gatggcatgt gcctttttcc aatcttttat ttgtcattgg tttttctacc cttgatacca agaaactgtt ggccaggtgc agtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggctggcaga tcacctgagg tcaggagttc gagaccggcc tgaccaacat ggagaaaccc tgtctctact aaaaatacaa aattagtcgg gcatggtgca tggtgatgca tgcctgtaat cccagctact tgggaggctg aggcaggaga atctcttgag cccgaaaggc ggaggttgca gtgagctgag atcgcgccat tgccctccag cctgggcaac aagagtgaaa cactgtctcc aagaaaaaaa gaaactgttg ttcctacccg gcacaaagta acagagaccc agaaatctgc ctgtgatctg aaatataaat acacacacac acacacacac acacacacac acacactgtg tgtgtatgtg tatctcatat ttaattgtgg gcagatctag tgattctgaa atttcctcat tctgtcaaac agttttatta gtggaatgct ttgttcaggc ttgatttctt caatgagtgt tgtgtgtgtt ggactgtgtg aaaatgtggt tggcacattt gtgaaaggta aaaatacagg tcacttggcc tttctgaatt tcatgggtaa aggctgtgtc ctcattgtgg cttctcctcc tagaaataca tagtgtgtga ctgagtcagt aaaatgttta ttgaataatg ctgtagtatt ttaacatata caaccataat acaatctcag cttgattagt ttaaaatact tttacctcta agattattga ttcatagtgg catgttatct cccaatagca tagacatttc tctgccgtca cccttgacag tcatctaacc cttgcttgag taattccatt ggcaaggagc tctcactttt cactgttcta attgttagga agttcttgta taaattccac tgaaatctgc tcccactgac tttagttatg ccatctagca caaaacaagt gtaatctttt atccctgaaa tcatcatcct caaacttaac atcagcgtgg cttccttaag catgaggatc tggtccttgc tatattggtt gtctttctgg atgtgtttta gctgctcact gtttggatgt gcagaatcgt tataagtgaa tgacagtgtg gctctctacc tataagtggc ctggtgaagg cttgaggctg cctctcatcc cagagtgcat tgctcattcc tctatggtat aacagggtgc tgcattattt gactcgatca tttttctctt tttttttttt tttgagacgg agactcgctc tgtctcctag gctggagtgc agtgggccca tctcggctca ctgcaagctc cgcctcccgg gttcatgcca ttctcctgcc tcagcctcct gggtagctgg gactacaggc gcccaataac aggcccagct aatttttgta tttttagtag agacggggtt tcaccatgtt agccaggatg gtctctatct cctgacctcg tgatccgccc acctcagcct cccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc accgtgcccg gccaactcga tcatttttct taacactccc atcgcatatg aattcataaa gaaggatcga ctaaaacctt ctagttcttg caacactcat tagactgctg cctttagtgt tattgcttca agtttctttt gctttttttc agcatttatc taagataagg aaacgttaaa ttttgacatc tctcttctag atgaagtaaa gaaggtctta gacaaatttt acaagaggaa agaaattcag aaactgggtg ctgattatgg acttgatggt aaggcccaaa acatcttcat agaggtattt tattacctct tacggtacag cttggtcagg actgtacgac ccctcatgtg acctggctgt tgtagtctgg agacacgtcc ctgctctttg cttctggctg agtgggagac tggcgaggct cacctggtga gccatactgc acggcagagg agctgcagct gcggccttcc ttcatgctgt gctaggactt cagttttagc ccagatcata ataaaccagc tgtactgcca aaaaaaaaaa aaaaaaaaga aaaaaaaaga ctctttgatg agtttggtgt ggtgtgtctg tgtgcttttt aaaatgagaa ctacacctta catcttttca ttttgtgttt ctacagctcg tctcttccac caagctttca taagctttag aaattatatt atgcagtctc attccctgga tgtggacatt cacattgttt tgaatgatat ttgcttcggt gcaggcaagt gtttagagac tttttaaaat cctattgaac ataccttcta tttcttctca tacttcatgc tcatttctct agaagggctt atttggttta gagtgggtct ggtaacatcc tctgtaaata attcagtgct ttcacaggat gacttctagg ttgtttgctt ttatattggg tccctgagct ggttattaca tcacccatat gtcttagact ggaggaagac tggggcccag tgaaataagc tctcacacaa gttggaatta gtgcatagca gattccatct gtttttgcca ctggcttcct tctccctcat atcaggacaa agttcttgct ataaaagaaa aaaaaaaagt caaaatatca tagtttcatt cccacaggca gtttggcttt ggttatgtat ttgactctta gacctgtacc ttgtgcccag cactgaggat acaacgcaga atgggacatg ccccagcctc ctctcagagc cactaagatg tggagaattc ttgctgagga acaaacacat gtttttgcct gtctgtggtt ttcgaagttt aaaaaatgtt tgcgccttca tctctgtaat gtacatgtct aggttcttta tttttaattt aacttttgcc aatgctaatc tttgcctgtt tgtactaaag gagtaggacg tggtggttgc tagccaattt cctgaaaata taaattaaaa ggaaaaagta agacaaaaca ggatcccaga aaaggataag gcctgtaacc tcaggacttt tctacttttt tttttctttt cttccttttt tttttttttt tttttttttt gtgacacggt ctcactctgt cacccaggct
PL 210 715 B1 ctggagtgca gtggctcagt ctcagctcag tgtgtagcct caacctcctg ggctcaagcc atccttccag gtcagctttc caaagtggtg ggattgttga cgtgagctac tgtgcccaga gaggactttt ctttttaccc tggcagtgcc cccgcaactt agcttgttaa gaaaaaagat ttcactaaat ttagttacga attttatgta gattgcacat gttaatacag tgttttattt tccagctcat gcggatgatt tattcccatt tttcttgaga catgccaaac aaatatttcc tgtgttggac tgtaaggatg atctacgtaa aatcagtgac ttaagaatac cacctaactg gttagtttct ccatttgtgg atttgaaatt ttcagtttct aatcttggat gattcgtggt cattattttt ttttattgta ttctagataa caaattataa ggagtctgga ttaggttgtt ttcctaaaat aaaaagaggc agttaactct tttaggcaat tcactggtat cttaccttga tccggattga gtgtggtttt aggttttatt agggcagatc tagaatagcc ctgacttaag gatgttgtcc ttaagtgtaa gctatggcct tcctggtgtt ttagctgagc gcctgggtgt taatgagttc tttccaccat ggctggaact gcaacatcac ctagcacttg agacgtcttt gagactttcc actgaaaccc ttggtaggct gctcattcct agaccctgcc gattcttacc ttgtacatgg ttagcccagc ccttggccag gaattcgcag ggaaccccca cacagacttc tgggctctcc ttctatgcac ccttctcttc cacagtctat tcttcacatt ttagctgctg aagcagctct gaacttaatc tctgctgctc gcttcagtgg gactgtcata ttctgcttgg gttccacctc cctatgcctt gctggggtgc agtacggctc atcccaagtg ttcttttctt tcaaggattg cagtcctgca ctgccttgtg gcccatgtcc ccacacattt attgcatgta ttttgcccca ctttgtactt gatttttttt gtttgttttt gagagagagt ctcactctgt cacccaggct ggagtgcagt ggtgcgttct cggctcactg caacctgcac ctcacaggtt caagtgattc tcctgcctca gcctcctgag tagctgggat tacaggcgtg tgctaccaca cctggttaat ttttgtattt ttaatagata cgggggctca ccatgttggc caggctggtc tcgagctcct gacctcaagt gatcctcctg ccttgacctc ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca ccatgcctcg cctgtacttg tttttagtgg gagggcaagt ctagtgccag ttattccact atggccagag gtagaagact ctgttattat atttgtgtat gttggaattc aggggcctgg gaatgtttgc ctttagagtt atgtgtttag agctgtggga atgatgtgaa catagtatgg aactgatagc agcttaaatt tatttttagt aaccgctgag aaaaagagat ttgtacaatg ggaaaaattt ccaagacatt aatttgcatt tgggtttttc tgtcctctag ttagtaaatg ctattcttgg aaaccagtca ttattttaat gtggatatga aacccattgt ttagtttttc aaagacttga tcttgtgaac attaagagga tatttcattt ggaatttgtt tcatttgctg tctttgccag gatggatttt gaggttaatg gattaagctg tttacctact catgttttag gtacccagat gctagagcca tgcagcggaa gataatattt cattcaggcc ccacaaacag tggaaagact tatcacgcaa tccagaaata cttctcagca aagtctggag tgtattgtgg ccctctaaaa ttactggcac atgagatctt cgaaaagagt aatgctgctg tcagtatatt accaaatatt tgctcatttt tttcttaatt ttcttttttg gtgggagtgg gaaaagatgt ttgtagtaat ttactgttaa caagaaatta ccatatttca ttgtgtctaa gaggctgtca attgtaagat gtaccattat tttatataca gttaagaaag aaaaagatgc taccaactga ctctgacatg ctatcaattc tttttttttt ttttttttga gatggagtct cgctttgtca cccaggctgg agtgcagtgg tgcgatcttg gctcactgca agctccgcct ctcgggttca tgccattctc ttgcctcagc ctccccagta gctgggacta caggcgccca ccaccacgcc tggctaattt tttgtatttt tagtagagac ggggtttcac catgttagcc aggatggtct caatctcctg acctcgtgat ctgcccgtct cggcctccca aagtgctggg attacaggcg tgagccaccg cacccagctc tatcaattct taagatgcat cttgatttca gagatacaaa aacatgaaaa catgtgccag tacagtgaat gaaatacaat attgaagaac attttacata tgtagagaaa tgcagaaagt aacatacaaa taagcttgaa cctattacac cacctcatca tatctttaca ttttatcata cttgcttcac ttactttttt aagaaataaa atattgttgc tactctcaaa actctgtagt cctttgcccc atcagagtta agcactactc tatgatattt aatttacctt ttatagatta gacctctgat gctatcagct agagctaatg ataaagactg aagctacctt ttcaaaactg aaaggactga agccctgtag tctgaggcat cattttcact aaatgggcta cattttggtt cattgtttta ttatgacttt ataatgtgag tttaaccagt tttggtaggt aatttgcatt ctcttttttt ttttctgaac agtttgagca atttacatac ataatacctc tttatctgta aatacttgag aatatgtttc ctcagaacag acttttacgt aaccacagga tatttgtctg aagcaggaca tttaatattg atagattact cttacttaat acacaatcta tattcaaatt ttatcaattg tccaattaca ccccatcctc cacccctcca gggttctttt cagggtctta cactgtattt agttgtcata tctctagttt ccattaatct tggacagttc ctcagtcttc ctttgtcttt cataacctgt acattttgga
PL 210 715 B1 agactatagg tcagttgtgt tgtgaactgt ctctcagttt ggatgtgtct ggtgtttccc catgattaga ttcaggctat tatgatgacc agccatccca gtttgcctgg acttctccag atttagcacc aagagtcctc cattctgggg aacccattag tcctagacaa accagaatgg ttgatcaccc tgatacagca ttaatgttgg tccctctcag ggaattataa taggaggtct ttacattctt aaattgtatt tataatgttc ttcttgaata tagaaacaac tcattttaat gaagtcaaat agttcagaga tgtacaaagt taaaatgtga aactgctgca gtgtctcatg cttttgttac ctgaggattt agctgatttg agatgtttcc aggtttaccc aagttgtgta agagagtggc tcttatttta ctttattttt tataaaaggg aaaaaagcat tgggaatttt tttttttttt tttttgagac agtcttgctc tgtctccagg ctggagtgca gtggcatgat ctcggctcac tgaacctcca tctctcagtt caagtgattc ccctgcctca gcctcccgag tagctgggac cacaggtgtg caacaccact cccagctact ttttctgttt ttggtagaga tgggatttca tcatgttggc caggatggtc tctatctctt gaccttgtga tctgcccacc tcagcctccc aaagtgctgg gattacaggc atgagccacc gtgtctggcc gtgggaacat tatgttttaa ctgtgaaaca aactaatttg gtggtagtgg agagaacacc ctgttaaata tccaaaacgt atttttgcat tattttcaat aattctagtt ttttttctgt ctttctaggg tgtgccatgt gacttggtga caggtgaaga gcgtgtgaca gttcagccaa atgggaaaca ggcttcacat gtttcttgta cagttgagat gtgcagtgtt acaactcctt gtatgtatat gctgtttaag aaactatggt ttggtatttt taattttttt tttttttcaa gacagagtct tgctctgttg tccaggctgg aatgcaatgg tactatctcg gctcactgcg acctctgcct ccccagttca agcgattctc ctgcctcagc ctcccaagta gccgggatta caggtgcccg ccaccacacc cggctaattt ttgtattttt actagagacg gggtttctcc atgttggtca ggctggtctc aaactcccga cctcaggtga tctgcccacc tcggcctccc aaagtactgg gattacaggc gtgagccact gcgcctgacc atggtatttt taattttaaa atacacttga acatgtgaaa tacgattttt ttgtgtgaag aaaaaatttt aaaatctaga aaaagaagag aataagtatg acaaacgtgc gatcctgcca ccactgacaa atgcctgcac ctgaagttct ttcccttttt ctcttaaaag agctgaaatg ttaataagca taattgaaat ttcctttgta ccactctcca gtttaattcc tctctcctct tttgttctaa ctggtaacag atatttggtg tgtatagttt tcctgtctct tttcaggata tatattatat cactgatacg tattaccagt attctagatt gttgtgtttt aaaacattta tgtgattatt gtattattat tgttctacca cttgcttgtt tactccacaa atgtgtttag atctatctag tcttattgaa gtatctatag ctacatattt gtagttattt catttaaact gttttatagt attccatctt agaactgaaa ttatttgttc cccatttgtt aaaggatatt taggttgttt aaagtttttt cctgttatgt acactgccac aatgagcttc tatttaaagt tgttttgttt tgtttttgag tcaggggctc actgtgtcac ccaggctgaa gtgcaatggc gcagtcatgg cttactgcag cctcgacctc ctgggctcaa gcaatccttc tgccttagcc tcctgagtag ctacaactac aggtgtgagc caccacaccc agctaatttt ttattaataa attttttgtg gagatgggtt cttgctgtgt tgcccggact ggtctctaat tcctggcctt gtgtggtcct cccacctagg tctcccaaag cagtgggatt acaggtataa cccaccgcac ctggccttaa catttaagtg aaaattaact ttttccttat tatgtaagca atcatatctt cattattgaa aatataaaaa tgtaagcaag caaacagaag aaaacaaatg tacataattt cccagtccca cctatccgga atcaataggt gttaattaac cctatatatt ttccagactt tgttaatatt tgtgttcatg ttgtgtatgc atatagttat atgtgcatgg tgggtgtgta tattaaacaa ataggaaggt actttactat ttggtagctt gctttttttc attttaataa tcaactttgt gagaagaata gtttttaaaa aatcaataca ttataaagta atatattgta cagttgcaca gaagtttata aatcagaatt tcttctctat gtcttctctt ctagtcttgt ttgtacatat ccagatcacg aagtagtttt tttttttttt tttttgagac agggtctcac tcctgtcgtt caggtgggag tgcagtggca cgatgacagc ttattgcagt cgtgacctcc tgggctcaaa caatcctcct gcctcacttt taaatttttc ttttgtagag aagaggtctc actttgttgc ccaggctggc ctcgaactcc cgggctcaag cagtccgcct cgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc caccatgtcc agcctcaata agtaattttt aatctgatga ttgttcaata taaaattagc tttctttact ttcctaagtg tcattgtatt tttaaatgtt ctcttttcaa ttctgtagta tttggggaag aaagtaaaat ataatatatg aattacaggg aatagaataa ggtatttgga agcattttag ctttagaaaa tgagatgaga cactactttt tgccatagcg atggatttaa aacccctaag gatgagcatg actgaggccc aaggaattat tccttccact tcactttctg ctcctgagag ctgcctggtt tcctgtggta gagatgcttc attagtaaat gaagggctgt cacctccttg ttctggaact tgccttcttc ttttacttct gtccagatgt gatagttctc
PL 210 715 B1 atcagagaaa ttctccaggc tgtctcttag attgcaaaaa aacaggacaa gtggaactgc tcagtgtggg aggcagtgtg gtagagtatg taagagtatg gacttggagc tggatgtggt gacttgtgcc tgttaattct ggctacttaa gagattgaga tgggaggatt gcttgaggcc aggagttcga gaccagcctg agtaacatag caagaccctc atctctaaag aaaaaaaaac cttttttttt tttgagctgg agtcttgctg tgttgcccag gctcgagtgc agtagtgcaa tcttggctca ctgcaggctc cgcctcccgg gatcaaatga ttctcctgcc tcagcctcca gagtagctgg gactacaggc gcacgccacc atgcccggct aatttttgta tctttagtgg agacggggtt tcaccatatt ggccaggatg gtctcgatct cctgacattg tgatccaccc gcctcgacct cccaagaaaa tgtttttaaa attagctggt catggtgctg cgtgcctgta gtcccagctg cttggaagct gaggcaggag gattgcttga gcctaggagt ttgaagttac agtgagctat gattgtgcca ctggactcag gctgtatgac agtgagacac tgttaggaag atcactttca acccaggagt tcaaggccat cctgaacaac agtgagaccc tgtatctaaa ttaaaaagaa aaaaaaaaga gtatagactt tggagctaga tggcctgggt ttgaatttca tctctgcatt taactgtata acttaaggca agtaacttaa tttctctggg cctctgactt tttctgtcaa atggagatag tgataatact taacctcata gatttgttgt gaggattaaa gaggaggtac ttaagaggag gtaaaacact tagaacaaac ctgctggaaa agaggaaccc agtaagtgat ggtggtagtg gtgatggtga tgcttgaatt ttggtgttgg aatttgttta taatactatt taagtagatg gtattgctca tgttaacttt tttattttaa gatgaagtgg ctgtaattga tgaaattcaa atgattagag atccagccag aggatgggcc tggaccagag cacttctagg ttggtggtcg taatgctata aaacccgtgc tttatgacat ctgcgctgag atgcattttt atctgcttgc cattgccaac caaatagagt cacctagaac ctttcttttt gacacaaaaa agtaaactaa gtatgagttt ttattttcta aatattattt taataatggg aaatctattt tttcctgtgc taaaactagc ataaccatgt aattaaagtt aaaatgttca aatctcatat ttacacaact acaatttatg ttttggtgtg tttcatgcta gtcttttctt ttttgtatgt gcatatggtg ttttgagaac attagttttg tatcttgctg tttttcatgt gacatttttc attatgtatt aatatgatcg catatctcta ttgaagggca atactgtaat ttgctccata gagttgaacc tttttttccc tattactaat aacgctgcag taaaaatctt tgtggccaaa gctttttatt ttttgagaca gggtcttgct ctgatgccca ggttggagtg tgatggcgca gttgtggctc actgcagcct tgacctcctg ggctcaagca gtcctcccat ctcagtctcc cgagcagctg ggaccacagc tgtttgccaa catgccccct ggttaacttt ttaaattttt tgtaaagaca gagtctccct atgttgccca ggctggtctt gaactcctgg gttcaagcac tcttcccacc tcagcctccc caaatgctgg gattacaggc atgagccact acacccagct tattttttat ctttttaatt atttctttag gataggctcc tgtaagtgga gttcttgagg tccatagaca tgaatgaaca tttctactgc ttgatgttgg agtgaatttt tgatcatgtt ttagggcaga tgttttcaaa tttaaaaaca aatagctgaa cttggctggg tgcggtggct cacgcctgta atcccagcac tttgggaggc cgaggctggc cgattgcttg aggcaaggaa ttcaagacca gcttggccaa catggcgaaa ccctgtctct actaaaaata taaaaattag ccaggcgtgg tggcgcatgc ctgtaaccca gctactccag aggctgaggc acaagaatca cttgagcctg gaaaggagat attgcagtga accacagtga accgaggtca tgccactgca ctccagcctg ggcgacagag caagactctg tctcatggaa aaaaaaaaaa aggctgaact ctttttttaa acaaagagta tacattgaag cctgttatgt aaaatacatg gaagtggatc tgctcgggga taaggagctt ggagtttctt ctgccctcca acccccaacc tctgaggtac ctcagcgatt ccatggagcc taatttgaaa aacacaagta tagggtctgt gttcagtact tagcatccaa atgccagctt ctaatcctgg ctcatttcac tctgatagag ttgaaacttt ggccaaagca atttaaaagg cctgagatta ataaaaattg gataatcttt gcccattaga agttggtgat tatttcaagg tttgcatcag agataatatt tttgaaaata cttggtaagg ttgtaaagca atatgtaagc caacgtaaag tactttggct atgtaaaatg ttgtatattt aattataaat ctttaaaatt aagaaaccca gttttgcatt gacaggactg tgtgctgaag aggttcattt gtgtggagaa cctgctgcta ttgacctggt gatggagctt atgtacacaa cgggggagga agtggaggta ttcgattaga tgctttgttc tccaggtggc atatcaaata gtccagagta cctaggcagt ggcttcagag gccctagata atgccagcgt cagaacttaa ctaaaaagaa agcttcattt tcttgtgatc aactagacca tatatatttg attgaacctc atgatctgaa gttctgacag agtggtcatc acaccctaag tcttccaaga gtacaggaaa ttcttcactt cttgacaaaa ccttgtgggg cttgagtaga tctcttcgaa ttaaataaat cagtactctt agaagttgga gacccagcaa gtttgtcgtt ttcaaagtgt tgtatgtcag atattggggc ctttgataca catctaattg ccagacacag tttatattcc
PL 210 715 B1 tttttgaaat tcttagagtt ggaagtaact ggtttccttt taatcctgct tctctttttc tttaccagag ttctatagta aaatgaatta ttattattat tattattttt tgagacaagg tctcactctg ttacccaggc tggagtgctg tggtgcaatc acaactcact gcagtctcag cctcctggac tcaagtgatc ctcccacttc agcctcccaa atagctggga ctacaggtgt ttgccaccat gcccatctaa ttttttattt tttgagcaga gggcatctca ctgtgttacc aaggctggtc tcgaactcca gtgctcaagc aattctccca ccttggcctc ccaaagtgct gggattataa gcataagcca aggaaatagt tttgaattag cctgttattt tagttttgtg ctcagttttc aaggagagat agtggaatat agtggaagaa attttggagt ccattctgtg ttttgccatt cttagctttg cattctttag acaagtcaca gaaggttaga cttgcaaaat gtgcctcaga cattaatttt ttattgggct cagttttact attttataaa atggaaatag cagttaataa cctttctgaa cttaacacat tgccgtgaaa atgaaatata tgagaaaaag ctttgaaaac aggtgaaaca ctctgtttca tcttattaat ttagagatgc caatgagaag tgatggtaac acttataata tcaaaataaa tgtttttctg tgttttcttt tgaaaaacat tggtacttat cagtttttag ctactcttaa ctgcattaca atcttttcac ttaattacta gtcacaagaa gttgagttgg gtgtgtcatt ttgccatttc atgtctttat tgtaggttcg agactataag aggcttaccc ccatttctgt gctggaccat gcactagaat ctttagataa ccttcggcct ggggactgca ttgtctgttt tagcaagaat gatatttatt ctgtgagtcg gcagattgaa attcggggat tagaatcagc tgttatatat ggcagtctcc cacctggtaa ttattgactt tcctcgtgac aagatatgaa atctcctatc tttgcaattt atgttgagat atatataaaa aaatggtaaa caatattgaa ttaagctgct tgatgtattg gtaatttgtt aaacgtcata taaaataaat aattttctat ttcatcttag tggaaataga agtattttaa ttatagttct tgttagttgc tgctattatt agactgtatc ttaaatgttg agtttattat tttcttacag aaatgtcatt gaaatctggt cttgaccatg tccttttaag ttgtagtcct gaaatctgtg tcctcaggaa taaggctagt gtggtggggg attgtgttgc tatatgacgg agtatttgaa ggaatggatg taaaggataa gtggctcttt gaggatataa agaaataaag tttgaaacag taaaggtttt atcattaaaa atgggaagaa caggaggtga gggtttccaa gatgtactta gcttgatgta ataaaagact gagaacactg atttaacata aattgttctt gttttaggga ccaaacttgc tcaagcaaaa aagtttaatg atcccaatga cccatgcaaa atcttggttg ctacagatgc aattggcatg ggacttaatt tgtaagtaat ttgtttttaa taagatgaat atttggtgag ttaaatggtg gtttttttgt ttttcagttt tctaattggc attaatgacc aaacgctatg atttgggaga ataaatatta taggctagat ttgaggtttg tcttgcctac acctattgag ggaaataaaa agaaaatatt aaatagtgcc aggacttttc ttagggacag ggtcttgctc ttttacccac gctggagtgc agtgatcaaa ttgtagctca gtgcagtctt gaactcctgg gcccaagtga tcctcctgcc tcagcctcca gagtagctgg gaccacaggt gcacaccaca aagcctggtt attttctttt tttttgggta gtgacaaggt cttaccctgt tgcccaagct agtctctaac tcctggcctc cagtgatctt cccacctcag cctcccaaag tgctaggatt acaggcatga gccactacac tcggcccaca ctaggacgtt tgaatgctgc ccaccactac tgctaaccta ttgtactacg tcactttact ttcagtttct cagtcaggtg tccgagtgcc tattatgcac atggggctag ttattatctc taaatgataa caatgttaag cctaaatatt atttatttat gtatttattt atttctgaga cagagtctca ctctgtgccc cacgccggag tacagtggtg tgatcatggc tcaccgcagc ttcaaactcc tgggctcaag cggtctttgt gcctcagccc cccgagtact agagcaacag gcacacacca ctgaacctag ctgatgtttt taattttttg tagagacttg ggtcttgcta tgttgcccag gctggttttg aactcctggc ctcaaaacaa tcctcctgcc tcagcctccc aaagtgctgg gattatgggt gtgagccact gtgccagact ttccttaatt ttgtaagtgg cagtcaaggt tgcaagagga cctaagctag tattggagtg agcattatgc aatgacccaa gtattggagg gtttttcata cagtctgcag gatcactttt atttctgttt caggagcata aggagaatta ttttttactc ccttataaag cccagtatca atgaaaaggg agagagagaa ctagaaccaa tcacaacctc tcaagccctg cagattgctg gcagagctgg cagattcagc tcacggttta aagaaggaga ggttacaaca atgaatcatg aagatctcag tttattaaag gaaattttga agaggcctgt ggatcctata agggtaagag gtaacatgtt aactactgct tctctgtgga ggagagtcat tctttccctc acccaccatc cagactctca cctcagacac atttctggat acagacataa gtgaaagaaa attttgtgcc atgaaaactg cattaaaaaa agccctactt tattgctttg gagagccaca gagttctttg atcagagaat ggtatgcaag tgaaggtcca gattgacaaa gtttagtgag cctgatttgc ctttacttcc ttccggaatc tagcagcggg aaggaacagg gagaaaagca gtttcttcag ctgagcacac agagctacat tagtggactg
PL 210 715 B1 aaaaatgacc agaagcctga atatagacga aaccttgtat tgcttggggc aaaaacagcc ctaagcaata caacttcatc cagtgaggag aaggttaaat tttggttaat attagttaat gagttagaat tgtacatatt tgaaacaaac tttctagtaa tagtcaaaat ttaaagttcc ctggaaaatt cacttacatg gcttatctca tttgtgacac tagatgaagg ggagtataga catgagatca tacagggaga agcatgcagg gagagaagct tccaggggaa ggctgtgctg gaatcatttc tgtaacttct cagcagtaca gttaggttcg tggttggctc ctgtgacctc cctgcttccc tcctgggcac ctcatgtctt ggactcttct tccctccctt atgactaatt tctcttgcct cttttcttct gtctttttca ttcactttct ctctctgttt catacttcat tccttatact ttcctgtggc catgtcctaa cggtgtaatg tgtagctaaa gagaactcac ttccagttta aaaatgttct catgtctttc tagatgtata tatctatgtt agttttattg ccttggttaa agtgactggg tttttcttat tcattttaat tcaatgagga gaaatgagac atggaaaatg gttttaccct ggaaaacagg tttttctttc cttttttttt ttttttgaga tagtgtttca ctctgttact caggcttcag tgctgtggca tgatcacggc tcacggtaac cccaatctcc tgagctcagg agagccttgc acctcagcct cttgagcagc tgggacttca ggtgctcacc accatgcttg gctgattttt taaaaatttt ttgtagagat gggaatctcc ttttgttgcc caggctgatc ttgaactact gtcctcaagt aatcctccca ccttggcctc ccaaagtgtt gggattacag gcatgagcca ctgcacctgg ccgtaaaatc tttttttttt ttttagacgg agtcttgctc tgtcgccagg ctggagtgca gtggcgcgat ctcggctcac tgcaagctct gcctgctggg ttcaagtgat tctcatgcct cagcctcccg agtagctggg attacaggca cgcagcacca cacccagcta atttttgcat ttttagtaga gacggggttt caccatgttg ggcaggatgg tctcaatctc ctgacctcgt gatccgccca ccttggcctc ccaaagtgct gggattacag gcatgagcca ccacacccag cccataaaat cattttttgt acactgccag atcatcatag gttttagaaa tataactaaa atgtaagcaa aagactaatt tctcagtggc cataatctgt catttttact aaatcatcaa cttttctaat tggtaataaa tggtaaaatg atattttttc tcttttactc aaattcttgg catttacttc atatggtgag agcttagcct gaatgggact ttatcgtgca ataacttaag aaaatttgtc ctttttgaaa aaaaaaaaat cagcttatga ttgttttttc ttttactaaa aggcagctgg tcttcatcca actgctgagc agattgaaat gtttgcctac catctccctg atgcaacact gtccaatctc attgtaagtg gaaactccct ttcacatctc ccctaaaaat gttgatatgt caggtgatta ctggttaacc tcatgagcat gaatggatag tctgcctttg agaagttgct atttataaaa tttattttac aagtgaaaat tttttctcaa aatcttttgg gactttagcc ctgaggaatt tcctctcagt atttcaggtg gggaaggata tgagggagtg attaaagcaa gcctttatgg aagtttgttc tggattaaag agattgtctt ttatagactt gagtatgtta ttcattgttc attttaattc acttaggcag tccagtaatt tctgtctttt tttccccaag gatatttttg tagacttttc acaagttgat gggcagtatt ttgtctgcaa tatggatgat tttaaatttt ctgcagagtt gatccagcat attccactaa gtctgcgagt gaggtatgtt ttctgcacag ctcctatcaa caagaagcag ccttttgtgt gttcttcact gttacaggta agcctttatc tttaagctat tttgagttcc ttctggttga tgcaggttcc ccaaacagta ctttgttatt caaaataaaa taattacaag agtattcagt aatatgagag actttgtaaa aacttaaata ggggttaata gtagcaacag tgttcagttt tcttaagtgt aaagcactga gccaggggtt actgtcttgt atgagcacca tgccagggtt ctagcctctt ttaactcatt tgggtaggga tgcaaatctc tgacttctga gaagcacagg attcctgggg gccaggaagg acagtggact atggagaacc ataaatctct accaaggccg ggtgcagtgg ctcacgcctg taatcccagc actttgggag gccgaggcgg gtggatcact tgaggtcagg aattcgagac cagcctggcc aagctggtga aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaaatt atccgggcat ggtggtgggc acctgtaatc ccagctactc gggaggctga ggcaggagaa tcacttaaac caaggaggca gaggttgcag tgagccaaga tcgcaccatt gcactccagc ctgggtgaca gagcgagact ctgtctcaaa aaaaaaaaaa acaaaactct accaaggttt atcataacaa tacttttatt taatttaatt ttatttattt tatatttgag gcagggtctt gctctgttgc ccaggctgga gtgcaatggt gcaatcacag ctcactgcaa cctcaacctc cctggctcaa gtgatcctgc cacctcagcc tcccaagtag ctgggactac aggcatgtgc caccatgccc agctaatttt tgcatttttt gtagagacag atctctctat gttacccagg ctggtctcga gctcctggag gcaagtgatc atcccacctc agcctcccaa agtgctggga ttacaggcat gagccaccta gtccagccta atattttaat tattaaaaat gtttttgaaa ggatccaaat gtccaacaag agggaaaagg ttaactacat tatggcatat ccacttgatt ggatattagg aagacattgc aatgataatt atgattataa tgaagaaatc tacataagtg gttacactat aacagtaagt
PL 210 715 B1 gagggaagcg gttcagaact gtatgtacct tataaacata acatgttctc tcacctcccg ccctatttcc tctgctttgc atgctctccc caccccacta aacccaaagg cctcctcttc tctgaatctt gtcctgactc actgaggttc actgccattt cctctgtagg cctgagcatt ctacatatga gctatattct aatcaaatct agctctaaac ttatttttta aataacataa atagtccagt gctgtggctc atgcctgtaa tcccagcact ttgggaggca ggaaggattg cttaagccta ggagttcgag aacatctcca gcaacatagc aagactctgc cctttaaaaa aaaaattaca taaataatac atacattctc tttatacaaa atgagaacat tacagatagc ttaaatgtgg ctccctcccc aatcttagtc ctctgaaata actacttgtg taagtttgtg tgtatctttg cagactgttt ttcattgcgt ttgcctatgt gcatgttcat gtggaaacac tagatttgtt gtgagggtgc atttccccat aaaaaattat cttttttttt tttttgagac agagtctcac tctgtcgctg aggctggagt acagttgtgt catctcagct cactgcaacc tctgcctcct gggttcaagc gattctcgtg cctcagcctc ctgagtatct gggattacag gcatgtgcca tgcctggcta atttttgtat attttgtaga ggcagggttt cgccatgttc cccaggctgg tcacgaactc ctgagctcaa gcagtccacc tgcctcagcc tcccaaagtg ctaggattac aggcatgagc cattgtgccc agccctatca acgttatctt aatgaattac tcacaacttg ccttttcttt ttctcttaat aatatgtgtt agagatcttc catgtccaga tgtttaccta gaaaatatgt ttcttagagc tggcatttgt gaaaaactta gctagcataa ggttgaagtt tatggaacag tcttgaactg ctgtaaactg acctgagtgg aactcagtcc catggccttg gcaccattca caccatcctt taaacagcta ttctagtgaa tagaagctct ttactaaggt gtagggagtc tctggaacat gcaggtcaac agttgcttgt tttcttaaga taaggtctca ctatgttgcc caggctgcag tgcagtggca caatcatagc tcactgtaac cccaaactcc tgggctcagg cgatccttcc acctcagcct cctgagtagc taggactaca ggtgtgcgcc atgatgcgtg gtgtgttttc tttttgagat gaagtctcac tctgttgccc aagctggagt gcagtggtat gagcttggct cactgcaacc tccgcctccc aggttcaggc gattctcctg tctcagcctc ccgagtagct gggattacag gtgcccgcca ccatgcctgg ctaatttttt gtatttttag tagagatggg gtttcaccat gttggccagg ctggtctcaa actcctgacc tcaagtgatc cacccgcctt ggcctcccaa agtgcaggga ttacaggcat gagccaccac acccggccgc tccgtgtgtt ttctgtttaa aaattagaat atgaaatcta gaggcttttc cttttttcct gatctttgtc attactgaac tatgaaagag ctcaatcaca ttaatgactt aggatgcccc ttaggactgt gatttggaag ctgtgctcca tggagctcct ttagggccag ctgctggatg gatggatgga tggatggatg gatgggcggg catctctccc tgctctctct gcatagctcc ttacttagct cttttatgta ttgggcttcc actagttgtt tgtggccaaa aaaaatagag ccactgcctt tataagataa cttgagaact catgcttggc ctgtcctgcc tagcaggtag tgtggtcaca tttctaccct ttatggctat cctacttggc atttattaaa cttagcagag tggaccagac tgaatttaac aaaattgtgg cattatttaa ctacaattga tctaaaactg ctcttcctct ctgaagtatt aaccttgctt aggttaagca tttagagata atttccccta atcaggaaat gaatcatttg aaatcagctt gaatcttgaa gctgaagatt ttatttaaac tcttgcttga ggggtcttac tgtgtggttg tatgtctatc ttctgtagta caggtgatgt ataatattgc ctaattctgg gatgcaacat ggttttgaaa gcacattccc cagcagtgtc ttgtggttca agacagggct gtgatgtctc acgttaccag tgaggaagct gaagcaaaga gtgttgactt ggccaaagcc acacagctcg caggaggcag atccaagatt gacttctgac cagccttgca ccaggccacc tcagagggtt tctatataat aagggaggac agccaggtgc ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccga ggcgggtgga tcacaaggtc gggagtttga gaccagcctg accaacatga tgaaaccccg tctgcactaa aaatacaaaa attagctggg tgttgtggcg ggcgcctgta atcccagcta ctcaggaggt tgaggcagga gaatcacttg aacccaggag gcggaggttg cagtgagcca agatcgtgcc attgcactcc agcctgggta acagagcgag actccgtctc aaaaaaataa aaaataaggg aggacattaa caagatagag aaacttaagc tcgtatttga ggttatagga ctattacata tgagatagaa ataggagtct tcaggtactg tctgtccata gctttagaac atcacatatt cctaaataag agttaacaga cttaggccct ggaaagttag tccttctaca gcttcttttt ttttttaact gctccttgtg gagcagggat accctatagg tagtgtgccc agagtagccc ttgaacttct gctgcacata ttattaccct ggttttagaa aaagaaggaa atcatctttt tttgtttttt ctttctccaa atggtctcac tgctggagtg cagtggcacg atcatggcgc actgcagcct tgacctccct gggctcagta atcctccacc tcagcttcct gaggagtaga tggaatcaca ggcacacacc accatgccca gctaattctt tgtgtttttt gtatggatgg ggtttctcca tgttgcccca gctggtctcg aactcctggg ctcaagtgat
PL 210 715 B1
30721 ctacccgctt cagactccca gagtgctggg attatagacg tgagccactg tacctggcct
30781 tataaagtat taaatgttct ttaaaatgta gaagagtata aaggagaaaa gaaaccacct
30841 gtctattgaa atacaaccac aatgttttgt tttgctttct tttttttctc tttctaatta
30901 tagacttaag ggaattctga cacttctctg aaaccctttt cctctttctc tctcagtttg
30961 ccaggcagta tagcaggaat gagcccctga cctttgcatg gttacgccga tacatcaaat
31021 ggcctttact tccacctaag aatattaaag acctcatgga tcttgaagct gtccacgatg
31081 tcttggatct ttacttgtgg ctaaggtacc aacatttttc ctttatgtgc tctcattttt
31141 ctagtaggac aaattaaagg ttttatgaat ttgtttttct atttcaaatt atggacatat
31201 ttgcaagatg ctctatatta tgtctattgt ccataaaggc aattcaactg atggaatggt
31261 ttcccattcc aaaaatgact tgagttcttg caattctagt taagatggct aggtgagaag
31321 gaaggtccac tggactcctg ctggtcaaag gatggtcctt ggaccaaaag cattggtatc
31381 acctgggagc ttgttagaac taaggagtat caggcccatg cctgacttga tcagattctg
31441 cattttaaca agatccctgg gtgattcact tgtacattat catttgagaa gtcctgttct
31501 aggccagtga ttctcaaagg aggggcatgt ccctctccag gagtatatca gagtctattg
31561 aggtatagtg ctgacccacc ctcaggatga catattcctc cgatatgtgg gggcagaaat
31621 caaggttgag caaaggcact gaagagagtt tgcaaaaaga acatttagaa tttatcaatg
31681 tcatgatgta ggtgtgccat tgagagttgt ccagtgactg cgataagagc tgttgctata
31741 atgctaatgt gtctttttcc cagctaccga tttatggata tgtttccaga tgccagcctt
31801 attcgagatc tccagaaaga actagatggt attatccaag atggtgtgca caatatcact
31861 aaattgatta aaatgtctga gacgcataag ctgttgaatt tggagggctt tccatcaggg
31921 agccagtcac gattgtcagg aaccttaaag agccaagcta gaaggacacg cggcaccaaa 31981 gctctaggga gtaaagctac tgagccaccc agccccgatg caggagagct gtcccttgct 32041 tccagattgg tgcagcaagg actcctcact ccagacatgc tgaaacagct agaaaaagag 32101 tggatgacac aacaaactga acacaacaaa gaaaaaacag agtctgggac tcatccaaaa 32161 gggacgagaa gaaagaagaa ggaacctgat tcggactagt tttctgttcc tgtttttttt
32221 tttttattta attttgcaaa taaaaattta ttttgaatcc tttttcctca tatgcattta
2281 ctccctcctc tagtattgtg gctatctggt actgggggat ttttggtgtg tgtgtgtgtt
32341 tgtgtgtgtg tttgtttgtt ttttcttttt ttgcacagaa aaatctctct tgatgactaa
32401 acttgttttt ttttttttca acatttagaa aatactagga tatcatggag gtttaattta
32461 agtctttata taatggccat ttgtagaata gtactaagac agtgcactat aaggaactct
32521 gcatgggaat aaaatcactt tggtgaattg tttgaccagt ttcctatgcc atgctgagga
32581 tgtcatggat gcagttcttt gacaaacatt gctgtctgtt gtacccatat accagaggct
32641 atttaggtgc tggaaatatg cagtaagcaa gactgacaat cttctaccct catggatctc
32701 atatttggta ggagagacag gaacaggtta acaaataaat cctgtcagat cggtgagggc
32761 agagattgta gtctatttca ctactgcatc cacagtatct ggaatatagc agaagcaaaa
32821 tcattctttg tgagatgaat gggtgtaatt ttagagatga atgctagaaa gaataaggaa
32881 agagtgatgc tgagtggcag ggaagggctg ttttaggtag ggtggtcttc ccttgtccaa
32941 aggccagcct acacttgttc aacgaagttt tcaaccctgt tcagaaacct agctaaaagg
33001 ggtttaaaga tggaagcttt ggagttagac agatgtggtt ccttttcata tcacagctta
33061 gcagccttgc catctctggg cttgatctca catctgaaga aaatggtcag tatgctcact
33121 tagagttgtt tgggaggtta agtgtgatca cgtgccattt agcacagggc ctggcacaca
33181 ggaagcattt tattatataa atgaacctga aggtttgggt ccagtctggg ctgtgaattg
33241 agctctcaga ttattctgac aactgaacta atttcttgag caactattga attggggctg
33301 acctcctggt agggattaaa tatgatttga ctcaaattgg gtgagggaac gtagccagat
33361 ctgcaacctc tctctgcttt tttctttggt ggttcagagg taacatttaa ctgagatgac
33421 aatcttcatt ctgacctttg ccttcatggg agtaaaggct gagtgggtgg cactgactct
33481 atttcctcct tgcttatgga taaactagtg aaatgcctgg aagggcttat ctcttgatat
33541 tctgcagtgg ggcaactgca gcttctagaa tttgcttacc cctgtaactt acaccatagc
33601 agacataatc attcttgtcc agatggttac aagaaatacc tatgaactga accaaatagt
33661 ggatttggtc ccatcgtatg taagtgatgg ggtgcatcac ttagaatgct gttaactctc
33721 ccattttctc cagtttgggg gccagagttg ttaagtcaga gaaaggactt aggcaagaca
33781 cttaaaaact aaggcaagtg aaaagtcctg aatatgttaa ataaagaagt ggctgggtgc
33841 agtggctcat acctgtaatc ccagcacttt gagagaccaa ggcaggaaga ttgcttgagg
33901 ccaggagttt gagaccagct tgggcaacac agtgagaccc catctctaca aaaaatttaa
33961 aaaattagcc ggatatggtg gcattcacca gtagtacagc tccttgggag gctctggtgg
34021 aaggatcact tgagcccagc gtgttgaagc tgcagtgagc agtgatcatg ccactgcatt
PL 210 715 B1
34081 ccagcttgga caacagagcg agaccctgtc tctaaataag taaataaata aagcctcaaa 34141 taagagaggt gggggtg SEK. Nr ID 3
Sekwencja aminokwasowa ludzkiego SUV3.
msfsrallwa tslfvpltvk
121 hqafisfrny
181 kisdlrippn
241 fek;snaagvp
301 rgwawtrall
361 Idnlrpgdci
421 lvatdaigmg
481 gevttmnhed
541 qvdgqyfvcn
601 epltfawlrr
661 eldgiiqdgv
721 teppspdage
781 kepdsd
SEK. NR ID 4 suv 637 sense r(GAC UUA UCA COC AAU CCA G)d(TT)
SEK. NR ID 5 suv 637 antisense r(CUG GAU UGC GUG AUA AGU C)d(TT)
Claims (15)
1. Sposób indukowania apoptozy komórek nowotworowych, znamienny tym, że komórki nowotworowe lub komórki prekursorów nowotworowych wykazujące podwyższony poziom surwiwiny kontaktuje się in vitro z inhibitorem ekspresji genu kodującego białko SUV3 przedstawionego na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2 i/lub z inhibitorem aktywności białka SUV3 o sekwencji przedstawionej na Sek. Nr. ID. 3 albo jego oddziaływania z HBXIP i/lub z surwiwiną.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako inhibitor ekspresji genu kodującego białko SUV3 stosuje się cząsteczkę reagującą z promotorem genu SUV3, specyficznie hamującą inicjację lub elongację transkrypcji lub cząsteczkę reagującą z białkami, które specyficznie wiążą się z promotorem genu SUV3.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako inhibitor ekspresji genu kodującego białko SUV3 stosuje się cząsteczkę, która upośledza proces translacji lub stabilności mRNA genu SUV3.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się mikroRNA lub siRNA komplementarny do sekwencji genu kodującego białko SUV3 przedstawionej na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2. oddziaływujący z sekwencją genu kodującego białko SUV3 przedstawione na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inhibitor aktywności białka SUV3 oddziałuje z regionem obejmującym aminokwasy 650-786 białka SUV przedstawionego na Sek. Nr. ID. 3.
6. Środek terapeutyczny, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera, co najmniej jeden związek z grupy obejmującej związek hamujący ekspresję genu kodującego białko SUV3 przedstawionego na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2, związek hamujący aktywność białka SUV3 o sekwencji przedstawionej na Sek. Nr. ID. 3, związek hamujący oddziaływanie białka SUV3 z HBXIP i/lub z surwiwiną.
7. Środek według zastrz. 6, znamienny tym, że jako substancję czynną z grupy obejmującej związek hamujący ekspresję genu kodującego białko SUV3 zawiera cząsteczkę, która upośledza proces translacji lub stabilności mRNA genu SUV3.
8. Środek według zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera mikroRNA lub siRNA komplementarny do sekwencji genu kodującego białko SUV3 przedstawionej na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2 oddziaływujący z sekwencją genu kodującego białko SUV3 przedstawione na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2.
9. Środek według zastrz. 6, znamienny tym, że związek hamujący aktywność białka SUV3 oddziałuje z regionem obejmującym aminokwasy 650-786 białka SUV przedstawionego na Sek. Nr. ID. 3.
PL 210 715 B1
10. Związek z grupy obejmującej związek hamujący ekspresję genu kodującego białko SUV3 przedstawionego na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2, związek hamujący aktywność białka SUV3 przedstawionego na Sek. Nr. ID. 3 lub związek hamujący oddziaływanie białka SUV3 z HBXIP i/lub z surwiwiną dla zastosowania do indukowania apoptozy komórek nowotworowych.
11. Zastosowanie inhibitora ekspresji genu kodującego białko SUV3 przedstawionego na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2 i/lub inhibitora ekspresji aktywności białka SUV3, którego sekwencja przedstawiona jest na Sek. Nr. ID. 3 i/lub inhibitora oddziaływania białka SUV3 z HBXIP i/lub z surwiwiną do wytwarzania środka przeznaczonego do hamowania apoptozy w komórkach nowotworowych lub komórkach prekursorów nowotworowych wykazujących podwyższony poziom surwiwiny.
12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że jako inhibitor ekspresji genu kodującego białko SUV3 stosuje się cząsteczkę reagującą z promotorem genu SUV3, specyficznie hamującą inicjację lub elongację transkrypcji lub cząsteczkę reagującą z białkami, które specyficznie wiążą się z promotorem genu SUV3.
13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że jako inhibitor ekspresji genu kodującego białko SUV3 stosuje się cząsteczkę, która upośledza proces translacji lub stabilności mRNA genu SUV3.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że stosuje się mikroRNA lub siRNA komplementarny do sekwencji genu kodującego białko SUV3 przedstawionej na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2 oddziaływujący z sekwencją genu kodującego białko SUV3 przedstawione na Sek. Nr. ID. 1 albo Sek. Nr. ID. 2.
15. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że inhibitor oddziaływania białka SUV3 oddziałuje z regionem obejmującym aminokwasy 650-786 białka SUV przedstawionego na Sek. Nr. ID. 3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL371640A PL210715B1 (pl) | 2004-12-08 | 2004-12-08 | Sposób indukowania apoptozy komórek nowotworowych, środek terapeutyczny, związek oraz zastosowanie inhibitora |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL371640A PL210715B1 (pl) | 2004-12-08 | 2004-12-08 | Sposób indukowania apoptozy komórek nowotworowych, środek terapeutyczny, związek oraz zastosowanie inhibitora |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL371640A1 PL371640A1 (pl) | 2006-06-12 |
| PL210715B1 true PL210715B1 (pl) | 2012-02-29 |
Family
ID=38739570
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL371640A PL210715B1 (pl) | 2004-12-08 | 2004-12-08 | Sposób indukowania apoptozy komórek nowotworowych, środek terapeutyczny, związek oraz zastosowanie inhibitora |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL210715B1 (pl) |
-
2004
- 2004-12-08 PL PL371640A patent/PL210715B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL371640A1 (pl) | 2006-06-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2022203239B2 (en) | Hsd17b13 variants and uses thereof | |
| AU2020267282B2 (en) | Compositions and methods for decreasing tau expression | |
| AU2021200783B2 (en) | Mitigating tissue damage and fibrosis via latent transforming growth factor beta binding protein (LTBP4) | |
| KR102391812B1 (ko) | B형 간염 감염을 치료하기 위해 PAPD5 또는 PAPD7 mRNA를 감소시키기 위한 핵산 분자 | |
| AU2016206870B2 (en) | Gene editing through microfluidic delivery | |
| KR20210040948A (ko) | 단핵구 및 대식세포의 염증성 표현형을 조절하기 위한 조성물 및 방법, 그리고 이의 면역요법 용도 | |
| KR20230124915A (ko) | 세포 사멸 유도 dffa 유사 이펙터 b(cideb) 억제제를 이용한 간 질환의 치료 | |
| CN107602690B (zh) | 肺动脉高压相关的ptgis基因突变及其应用 | |
| CN111032093A (zh) | 控制心肌纤维化和重塑的方法和组合物 | |
| KR102517872B1 (ko) | 암의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| CN114531876B (zh) | Rna编辑抑制剂及其用途 | |
| KR102393682B1 (ko) | 항암제 내성 진단 또는 치료용 조성물 | |
| CN110167563A (zh) | 用于调节心脏细胞功能的方法、相关核苷酸和化合物 | |
| WO2003014340A2 (en) | Human histone deacetylase-related gene and protein hdac10 | |
| DK2951317T3 (en) | PROCEDURE FOR PREDICTING THE BENEFIT OF INCLUSING TAXAN IN A CHEMOTHERAPY PLAN FOR BREAST CANCER PATIENTS | |
| KR102074157B1 (ko) | Itpkc 및 slc11a1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 발병 예측 방법 | |
| KR20200121080A (ko) | 광역동 항암 치료의 내성 극복용 약학적 조성물 | |
| PL210715B1 (pl) | Sposób indukowania apoptozy komórek nowotworowych, środek terapeutyczny, związek oraz zastosowanie inhibitora | |
| KR102958345B1 (ko) | Hsd17b13 변종 및 이것의 용도 | |
| RU2859009C2 (ru) | Варианты hsd17b13 и их применения | |
| RU2777570C2 (ru) | Композиции и способы для снижения экспрессии tau | |
| AU2026202687A1 (en) | Compositions and methods for modulating monocyte and macrophage inflammatory phenotypes and immunotherapy uses thereof | |
| KR20130048240A (ko) | Ｐｃｂｐ―１ 항원에 대한 모노클로날 항체, 및 그의 용도 | |
| KR20260061292A (ko) | Hsd17b13 변종 및 이것의 용도 | |
| Class et al. | Patent application title: COMBINATION TREATMENT OF CANCER Inventors: Qiang Yu (Singapore, SG) Qiang Yu (Singapore, SG) Zhenlong Wu (Singapore, SG) Assignees: Agency For Science, Technology and Research |