PL210720B1 - Chimeryczne lub humanizowane przeciwciało monoklonalne lub jego fragmenty F(ab')2 lub Fab, przeciwciało jednołańcuchowe lub przeciwciało pojedynczej domeny zdolne do wiązania się z ludzkim polipeptydem NogoA_632-640, polinukleotyd, wektor ekspresyjny, układ ekspresyjny, izolowana komórka gospodarza, zastosowanie przeciwciała i kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy chimerycznego lub humanizowanego przeciwciała monoklonalne lub jego fragmentów F(ab')2 lub Fab, przeciwciała jednołańcuchowego lub przeciwciała pojedynczej domeny zdolnego do wiązania się z ludzkim polipeptydem NogoA_623-640 (SEQ ID NO: 6). Ponadto, wynalazek dotyczy polinukleotydu zawierającego polinukleotydy kodujące przeciwciało według wynalazku lub jego fragment, wektora ekspresyjnego zawierającego te polinukleotydy, układu ekspresyjnego zawierającego wspomniany polinukleotyd lub wektor, izolowanej komórki gospodarza zawierającej ten układ ekspresyjny, zastosowań przeciwciała według wynalazku lub jego fragmentów oraz kompozycji farmaceutycznej zawierającej przeciwciało według wynalazku lub jego fragment.

Regeneracja neuronów po ich uszkodzeniu, w przypadku ośrodkowego układu nerwowego (CNS) osoby dorosłej, jest ograniczona ze względu na obecność hamującego środowiska mielinowego, które otacza aksony pochewką i na tworzenie tkanki bliznowatej. W ciągu ostatnich kilku lat dokonano ważnych odkryć dla zrozumienia dlaczego ośrodkowy układ nerwowy nie jest zdolny do samoistnej naprawy neuronów po ich uszkodzeniu. Cząsteczki hamujące w mielinie są główną przeszkodą w regeneracji aksonów, szczególnie tuż po wystą pieniu uszkodzenia. Do chwili obecnej jako skuteczne inhibitory przyrostu neurytów scharakteryzowano NogoA, glikoproteinę związaną z mieliną (MAG) i glikoproteinę mielino-oligodendrocytową (OMgp). Ponadto, mielina zawiera również inne składniki hamujące, takie jak proteoglikany chondroityno siarczanu. Nogo-A należy do rodziny białek retikulonu i ma przynajmniej dwie biologiczne aktywno ś ci, i farmakologicznie odmienne domeny nazwane AminoNogo i Nogo-66. Podczas gdy miejsce receptorowe dla tych domen nie jest do chwili obecnej znane, wiadomo że Nogo-66 hamuje wzrost neuronów in vitro i in vivo poprzez neuronowy receptor NgR. Ponadto Nogo-66, MAG i OMgp również wiążą się z NgR z wysokim powinowactwem i hamują przyrost neurytów.

Ewentualne nowe podejścia badawcze obecnie stosowane w celu poprawienia naprawy nerwów obejmują trawienie tkanki bliznowatej przez enzym, chondroitynazę ABC, techniki mostowe, stosując w celu zwiększenia wzrostu neuronów: węchowe komórki kostniny przejściowej okołokostnej i komórki macierzyste, jak i białkowe czynniki wzrostu. Działania blokujące inhibitory przerostu neurytów, przez modulowanie aktywności środków pośredniczących przekazywanie sygnałów międzykomórkowych takich jak Rho, guanozyno trisfosfataza (GTPaze) związana z błoną, która wydaje się kluczowym ogniwem w hamowaniu wzrostu aksonów. Cykliczny adenozyno monofosforan (cAMP), który in vitro może przezwyciężyć hamowanie związane z mieliną, a in vivo może indukować regenerację. Zastosowano peptydowy inhibitor receptora NgR (NEP 1-40) do indukowania ponownego wzrostu neuronów i odzyskania funkcjonalnej sprawności u szczurów po uszkodzeniu rdzenia.

Oprócz zastosowania rozwiązań opisanych powyżej, uwaga badaczy skupiała się również na zastosowaniu pewnych monoklonalnych przeciwciał do neutralizowania cząsteczek hamujących wzrost neurytów ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, w szczególności do neutralizacji aktywności NogoA w zakresie hamowania wzrostu neurytów. Wykazano zatem, że przeciwciało monoklonalne IN-1 lub jego fragment Fab IN-1 indukuje in vitro przyrost neurytów i zwiększa tworzenie wypustek, jak również regenerację neuronów in vivo (Schwab ME i wsp. (1996) Physiol. Rev. 76, 319 -370). Badanie różnych domen NogoA pod kątem aktywności hamowania wzrostu neurytów wyodrębniło w cząsteczce kilka domen inhibitorowych (Chen i wsp. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre i wsp. (2000) Nature 403, 439-444; Prinjha i wsp. (2000) Nature 403, 383-384; patrz również szczegółowa analiza w przykładzie 1).

Naturalne immunoglobuliny lub przeciwciała obejmują zasadniczo wielomerową cząsteczkę o kształ cie litery Y mają c ą miejsce wią zania antygenu na końcu każ dego z jej górnych ramion. Pozostała część struktury, w szczególności podstawa litery Y pośredniczy w działaniach efektorowych związanych z immunoglobulinami. Przeciwciała składają się z 2 ciężkich i 2 lekkich łańcuchów. Zarówno ciężki jak i lekki łańcuch zawierają domenę zmienną i część stałą. Miejsce wiążące antygen składa się ze zmiennej domeny ciężkiego łańcucha związanego ze zmienną domeną lekkiego łańcucha. Zmienne domeny ciężkiego i lekkiego łańcucha mają taką samą strukturę ogólną. Bardziej szczegółowo, charakterystyka przeciwciała w zakresie jego wiązania z antygenem jest zasadniczo wyznaczana przez 3 specyficzne regiony w zmiennej domenie ciężkiego i lekkiego łańcucha, które są zwane hiper-zmiennymi regionami lub regionami wyznaczającymi dopasowanie (CDR). Te 3 hiper-zmienne regiony zmieniają się naprzemiennie z 4 regionami zrębowymi (FR), których sekwencje są w stosunkowo znacznym stopniu konserwatywne i które nie są bezpoś rednio zaangaż owane

PL 210 720 B1 w wią zanie. Regiony CDR tworzą pę tle i są utrzymywane bardzo blisko siebie przez regiony zrę bowe, które w znacznym stopniu przyjmują konformację β-kartki. Regiony CDR ciężkiego łańcucha razem ze związanymi regionami CDR lekkiego łańcucha tworzą zasadniczo miejsce wiążące antygen przez przeciwciało. Wyznaczenie co tworzy region FR lub CDR zwykle przeprowadza się przez porównywanie sekwencji aminokwasowych pewnej liczby przeciwciał wytwarzanych przez te same gatunki. Ogólne zasady identyfikacji regionów CDR i FR leżą w zakresie wiedzy ogólnej specjalisty w dziedzinie wynalazku i wskazówki mogą być na przykład znalezione na stronie internetowej (http://www.bioinf.org.uk/abs/).

Obecnie niespodziewanie stwierdzono, że nowe monoklonalne mysie przeciwciało (określane poniżej jako 11C7) skierowane przeciwko polipeptydowemu fragmentowi szczurzego NogoA (SEQ ID NO: 1) i typ IgG1 ma lepsze właściwości niż przeciwciała przeciwko NogoA znane ze stanu techniki, zwłaszcza w odniesieniu do powinowactwa wiązania z NogoA z różnych gatunków, obejmujących Homo sapiens i w odniesieniu do jego większego przerostu neurytów neutralizując aktywność NogoA przy danym stężeniu przeciwciała. Ponadto obecnie możliwe jest skonstruowanie innych cząsteczek wiążących Nogo, mających te same hiper-zmienne regiony jak opisane powyżej przeciwciało.

Przedmiotem wynalazku jest zatem chimeryczne lub humanizowane przeciwciało monoklonalne lub jego fragmenty F(ab')2 lub Fab, przeciwciało jednołańcuchowe lub przeciwciało pojedynczej domeny zdolne do wiązania się z ludzkim polipeptydem NogoA_623-640 (SEQ ID NO: 6), które posiada co najmniej jedno miejsce wiążące antygen zawierające w sekwencji hiper-zmienne regiony CDR1-:11C7 (SEQ ID NO: 8), CDR2-1C7 (SEQ ID NO: 9) i CDR3-11C7 (SEQ ID NO: 10); oraz w sekwencji hiper-zmienne regiony CDR1'-11C7 (SEQ ID NO: 11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO: 12) i CDR3'-11C7 (SEQ ID NO: 13).

W jednym z korzystnych wariantów realizacji przeciwciało według wynalazku tub jego fragment zawiera ponadto stałą część ludzkiego łańcucha ciężkiego i stałą część ludzkiego łańcucha lekkiego. W szczególnie korzystnym przypadku stała część ludzkiego łańcucha ciężkiego jest typu γ4, a stała część ludzkiego łańcucha lekkiego jest typu κ.

Przedmiotem wynalazku jest również polinukleotyd zawierający polinukleotydy kodujące przeciwciało lub jego fragment określony powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny zawierający polinukleotydy określone powyżej.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest układ ekspresyjny zawierający polinukleotyd lub wektor określone powyżej, przy czym układ ekspresyjny lub jego część jest zdolna do wytwarzania polipeptydu określonego powyżej, gdzie układ ekspresyjny lub jego część jest obecna w kompatybilnej komórce gospodarza.

Następnym przedmiotem wynalazku jest izolowana komórka gospodarza zawierająca układ ekspresyjny określony powyżej.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentu określonego powyżej jako środka farmaceutycznego.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentu określonego powyżej do wytwarzania leku do leczenia obejmującego naprawę nerwu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało lub jego fragment określony powyżej w połączeniu z przynajmniej jednym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.

Jak wskazano powyżej, wynalazek dotyczy przeciwciał monoklonalnych zdolnych do wiązania się ze szczególnym regionem lub epitopem NogoA (tutaj poniżej określane jako przeciwciała monoklonalne według wynalazku lub po prostu przeciwciała monoklonalne). Bardziej konkretnie przeciwciała monoklonalne według wynalazku wiążą się z ludzkim NogoA_623-640 (ortologiczny fragment przeciwko, któremu skierowane jest 11C7; = SEQ ID NO: 6), ludzkim Nig-D20 (ortologiczny z najmniejszym fragmentem NogoA o aktywności hamowania przerostu neurytów, SEQ ID NO: 24), ludzkim NogoA (SEQ ID NO: 5) lub ludzkim polipeptydem NiG (który jest fragmentem najsilniej hamującym wzrost neurytów NogoA i rozpoczyna się od aminokwasu nr 186 i kończy się na aminokwasie nr 1004 ludzkiego NogoA, = SEQ ID NO: 5) ze stałą dysocjacji (Kd) < 1000 nM, korzystniej ze stałą Kd < 100 nM, najkorzystniej ze stałą Kd < 10 nM. Reakcja wiązania może być wykazana standardowymi sposobami (testy jakościowe) obejmującymi, na przykład, metodę ELISA opisaną w przykładzie 6 i metodę

PL 210 720 B1 powinowactwa biosensora opisaną w przykładzie 7. Ponadto, wiązanie z ludzkim NogoA i, co zasadniczo ważniejsze, skuteczność mogą być wykazane w teście przyrostu neurytów, jak np. opisano poniżej.

W korzystnym wariancie realizacji wynalazku przeciwciała monoklonalne (przy stężeniu 1 mg/ml, korzystniej 0,1 mg/ml nawet korzystniej 0,01 mg/ml pożywki hodowlanej) zwiększają ilość neurytów w szczurzych komórkach ziarnistych z móżdżku na substracie będącym ekstraktem białkowym szczurzego rdzenia kręgowego o przynajmniej 20%, korzystnie 50%, najkorzystniej 100% w porównaniu do iloś ci neurytów w szczurzych komórkach ziarnistych z móż dż ku, które traktowano przeciwciałem kontrolnym, które nie wiąże się z ludzkim polipeptydem NogoA_623-640 (to jest ma stałą dysocjacji > 1000 nM).

Gdy miejsce wiążące antygen obejmuje domeny zarówno pierwszą jak i drugą, mogą być one zlokalizowane na tej samej cząsteczce polipeptydu lub, korzystnie, każda domena może być na innym łańcuchu, tak że pierwsza domena będzie częścią ciężkiego łańcucha immunoglobulinowego lub jego fragmentu, a druga domena będzie częścią lekkiego łańcucha immunoglobulinowego lub jego fragmentu.

Przykłady przeciwciał monoklonalnych według wynalazku obejmują przeciwciała takie, jakie są wytwarzane przez limfocyty B lub komórki hybrydomy i chimeryczne lub humanizowane przeciwciała lub dowolny ich fragment, np. F(ab')2; i fragmenty Fab, jak i przeciwciała o jednym łańcuchu lub o jednej domenie.

Przeciwciało o jednym łańcuchu obejmuje zmienne domeny ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała kowalencyjnie związane łącznikiem peptydowym, zwykle składającym się z 10 do 30 aminokwasów, korzystnie z 15 do 25 aminokwasów. Dlatego, taka struktura nie obejmuje stałej części ciężkiego i lekkiego łańcucha i uważa się, że mały łącznik peptydowy powinien być mniej antygenowy niż cała stała część. Termin przeciwciało chimeryczne oznacza przeciwciało, w którym stałe regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha lub oba pochodzą od człowieka, podczas gdy zmienne domeny ciężkiego i lekkiego łańcucha są pochodzenia innego niż ludzkie (np. mysiego). Termin humanizowane przeciwciało oznacza przeciwciało w którym regiony hiper-zmienne (CDR) są pochodzenia innego niż ludzkie (np. mysiego), podczas gdy wszystkie lub zasadniczo wszystkie inne części immunoglobulin np. regiony stałe i silnie konserwowane części domen zmiennych, to jest regiony zrębowe, pochodzą od człowieka. Jednakże przeciwciało humanizowane może w częściach regionów zrębowych sąsiadujących z regionami hiper-zmiennymi zachować kilka aminokwasów z mysiej sekwencji.

Regiony hiper-zmienne mogą być związane z dowolnym rodzajem regionów zrębowych, korzystnie pochodzenia mysiego lub ludzkiego. Odpowiednie regiony zrębowe opisano w pracy pt. Sequences of proteins of immunological interest, Kabat E.A. i in.. Departament Zdrowia i Opieki Społecznej USA, Zakład Zdrowia Publicznego, Narodowy Instytut Zdrowia. Korzystnie stała część ludzkiego ciężkiego łańcucha cząsteczek wiążących może być typu IgG4, włącznie z podtypami, korzystnie stała część ludzkiego lekkiego łańcucha może być typu κ lub λ, korzystniej typu κ.

Monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko białku naturalnie występującemu u wszystkich ludzi mogą być wytworzone w układzie niebędącym ludzkim np. u myszy. Bezpośrednią tego konsekwencją jest ksenogeniczne przeciwciało, które jest wytwarzane przez hybrydomę i gdy jest podawane ludziom, wywołuje niepożądaną odpowiedź immunologiczną, w której głównie pośredniczy stała część immunoglobuliny ksenogenicznej. To zdecydowanie ogranicza zastosowanie takich przeciwciał, gdyż nie mogą one być podawane przez dłuższy czas. Dlatego zwłaszcza korzystne jest zastosowanie przeciwciała o jednym łańcuchu, pojedynczej domenie, chimerycznego lub humanizowanego, w przypadku których mało prawdopodobne jest wywołanie znaczącej allogenicznej odpowiedzi po podaniu ludziom.

Wspomniana powyżej stała dysocjacji może być dogodnie badana różnymi testami obejmując, na przykład, metodę powinowactwa biosensora opisaną w przykładzie 7. Ponadto wiązanie i wpływ funkcjonalny cząsteczek wiążących może być wykazany w teście biologicznym, np. jak opisano poniżej.

Stała część ludzkiego ciężkiego łańcucha może być typu γ1; γ2; yS; γ4; α1; α2; δ lub ε, korzystnie typu γ, korzystniej typu γ4; podczas gdy stała część ludzkiego lekkiego łańcucha może być typu κ lub λ (który obejmuje podtypy λ1; λ2; i λ3) lecz jest korzystnie typu κ. Sekwencję aminokwasową wszystkich tych stałych części przedstawiono w pracy Kabata i in. (Supra).

Wynalazek opisuje również koniugaty przeciwciał monoklonalnych według wynalazku, np. koniugaty z enzymami, toksynami lub radioizotopami.

Określenie polipeptyd, jeśli nie wyszczególniono inaczej, obejmuje tutaj dowolny peptyd lub białko zawierające aminokwasy połączone ze sobą przez wiązania peptydowe, mające sekwencję

PL 210 720 B1 aminokwasową rozpoczynającą się odcinkiem N-końcowym i kończący się odcinkiem C-końcowym. Korzystnie polipeptyd według niniejszego wynalazku jest przeciwciałem monoklonalnym, korzystnej jest chimerycznym (również zwanym szczepionym-V) lub humanizowanym (również zwanym szczepionym-CDR) przeciwciałem monoklonalnym. Humanizowane (szczepione-CDR) przeciwciało monoklonalne może lub nie obejmować dalsze mutacje wprowadzone do sekwencji zrębowej (FR) przeciwciała akceptorowego.

Funkcjonalna pochodna polipeptydu jak stosowano tutaj obejmuje cząsteczkę mającą jakościową biologiczna aktywność wspólną z polipeptydem według wynalazku, to jest ma zdolność wiązania z ludzkim polipeptydem NogoA, ludzkim polipeptydem NiG, ludzkim polipeptydem NiG-D20, lub ludzkim polipeptydem NogoA_623-640. Funkcjonalna pochodna obejmuje fragmenty i analogi peptydowe polipeptydu według niniejszego wynalazku. Fragmenty obejmują regiony w obrębie sekwencji polipeptydu według niniejszego wynalazku, np. o wyszczególnionej sekwencji. Termin pochodna zastosowano aby zdefiniować odmiany sekwencji aminokwasowej i kowalencyjne modyfikacje polipeptydu według niniejszego wynalazku, np. o wyszczególnionej sekwencji. Funkcjonalne pochodne polipeptydu według niniejszego wynalazku, np. o wyszczególnionej sekwencji, np. hiper-zmiennego regionu lekkiego lub ciężkiego łańcucha, korzystnie mają przynajmniej około 65%, korzystniej przynajmniej około 75%, nawet korzystniej przynajmniej około 85%, najkorzystniej przynajmniej około 95, 96, 97, 98, 99% ogólnej homologii sekwencji z sekwencją aminokwasową polipeptydu według niniejszego wynalazku, np. o wyszczególnionej sekwencji, i zasadniczo zachowuje zdolność do wiązania z ludzkim polipeptydem NogoA, ludzkim polipeptydem NiG, ludzkim polipeptydem NiG-D20, lub ludzkim polipeptydem NogoA_623-640.

Termin modyfikacja kowalencyjna obejmuje modyfikacje polipeptydu według niniejszego wynalazku, np. o wyszczególnionej sekwencji; lub jego fragmentu przez organiczne białkowe lub niebiałkowe środki do tworzenia pochodnych, fuzje z heterologicznymi sekwencjami polipeptydowymi i modyfikacje potranslacyjne. Kowalencyjnie modyfikowane polipeptydy, np. o wyszczególnionej sekwencji, utrzymują zdolność wiązania się z ludzkim polipeptydem NogoA, ludzkim polipeptydem NiG, ludzkim polipeptydem NiG-D20, lub ludzkim polipeptydem NogoA_623-640 przez sieciowanie. Kowalencyjne modyfikacje są tradycyjnie wprowadzane w wyniku reakcji określonych reszt aminokwasowych z organicznym środkiem do tworzenia pochodnych, który jest zdolny do reakcji z wybranymi resztami bocznymi lub końcowymi, lub przez sprzęgające mechanizmy modyfikacji potranslacyjnych, które funkcjonują w wybranych zrekombinowanych komórkach gospodarza. Pewne modyfikacje potranslacyjne są wynikiem oddziaływania zrekombinowanych komórek gospodarza na polipeptyd, który ulega w nich ekspresji. Często potranslacyjnie deamidowane są reszty glutaminowe i asparaginowe do odpowiadających im reszt glutamylowych i aspartylowych. W innym rozwiązaniu, reszty te ulegają deaminacji w słabo kwasowych warunkach. Inne potranslacyjne modyfikacje obejmują hydroksylowanie reszt proliny i lizyny, fosforylację grupy hydroksylowej reszty seryny, tyrozyny lub treoniny, metylowanie grupy α-aminowej grup bocznych lizyny, argininy i histydyny, patrz np. T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79-86 (1983). Modyfikacje kowalencyjne np. obejmują białka fuzyjne zawierające polipeptyd według niniejszego wynalazku, np. o wyszczególnionej sekwencji i ich odmiany sekwencji aminokwasowych, takie jak immunoadhezyny i fuzja końca N z heterologicznymi sekwencjami sygnałowymi.

Określenie homologia w odniesieniu do natywnego polipeptydu i jego funkcjonalnej pochodnej jest zdefiniowane tutaj jako procentowa zawartość reszt aminokwasowych w rozpatrywanej sekwencji, które są identyczne z resztą odpowiadającego mu naturalnie występującego polipeptydu, po przypisaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli jest to konieczne, aby osiągnąć maksymalny procent homologii i nie rozważając żadnych konserwatywnych podstawień jako części identyczności sekwencji. Żadne z zakończeń N- końców lub C-końców i insercje nie będą interpretowane jako zmniejszające identyczność lub homologię. Metody i oprogramowanie komputerowe stosowane do przypisania sekwencji są dobrze znane.

Termin aminokwas(y) odnosi się do wszystkich naturalnie występujących L-a-aminokwasów, np. i obejmuje D-aminokwasy. Aminokwasy są identyfikowane poprzez dobrze znane kody - jednoliterowy bądź trzyliterowy.

Termin odmiana sekwencji aminokwasowej odnosi się do cząsteczek o pewnych różnicach w ich sekwencjach aminokwasowych w porównaniu do polipeptydu według niniejszego wynalazku, np. o wyszczególnionej sekwencji. Odmiany sekwencji aminokwasowej polipeptydu według niniejszego wynalazku, np. o wyszczególnionej sekwencji, mają ponadto zdolność do wiązania się z ludzkim

PL 210 720 B1 polipeptydem NogoA lub ludzkim polipeptydem NiG lub korzystniej - polipeptydem NogoA_623-640. Substytucyjne odmiany obejmują te, z których usunięto przynajmniej jedną resztę aminokwasową i w jej miejsce wprowadzono inny aminokwas, w tej samej pozycji w polipeptydzie według niniejszego wynalazku, np. o wyszczególnionej sekwencji. Te podstawienia mogą być pojedyncze, gdzie tylko jeden aminokwas w cząsteczce będzie podstawiony, lub mogą być wielokrotne, gdzie dwa lub większa liczba reszt aminokwasowych będzie podstawionych w tej samej cząsteczce. Insercyjne odmiany obejmują te, w których jeden lub większa liczba aminokwasów jest wprowadzonych tuż przy aminokwasie w wyszczególnionej pozycji w polipeptydzie według niniejszego wynalazku, np. o wyszczególnionej sekwencji. Sąsiadujące bezpośrednio lub tuż przy aminokwasie oznacza połączenie z α-karboksylową lub α-aminową grupą funkcyjną aminokwasu. Delecyjne odmiany obejmują te, w których został usunięty jeden lub większa liczba aminokwasów w polipeptydzie według niniejszego wynalazku, np. o wyszczególnionej sekwencji. Zwykle, delecyjne odmiany będą miały usunięty jeden lub dwa aminokwasy w szczególnym regionie przeciwciała monoklonalnego.

Przeciwciało monoklonalne według wynalazku może być wytwarzane technikami rekombinacji DNA. Zgodnie z powyższym, konieczne jest skonstruowanie jednej lub większej liczby cząsteczek DNA kodujących przeciwciało monoklonalne, umieszczonych pod kontrolą odpowiednich sekwencji kontrolnych i przeniesionych do odpowiedniego organizmu gospodarza, w celu uzyskania ekspresji tego przeciwciała.

Zgodnie z obecnym stanem techniki specjalista w dziedzinie wynalazku jest w stanie zsyntetyzować cząsteczki DNA według wynalazku na podstawie informacji podanej tutaj, to jest sekwencji aminokwasowych regionów hiper-zmiennych i kodujących je sekwencji DNA. Sposób konstrukcji genu kodującego domenę zmienną jest na przykład opisany w opisie EP 239 400 i może być pokrótce podsumowany następująco: Sklonowano gen kodujący domenę zmienną przeciwciała monoklonalnego o dowolnej specyficzności. Wyznaczane są DNA kodujące zrębowe i hiper-zmienne regiony, po czym regiony DNA kodujące hiper-zmienne regiony są usuwane tak aby, regiony DNA kodujące regiony zrębowe zostały połączone razem z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi w połączeniach. Miejsca restrykcyjne mogą być wytworzone w odpowiednich pozycjach w wyniku mutagenezy cząsteczki DNA przy zastosowaniu standardowych procedur. Dwuniciowe syntetyczne kasety CDR wytwarzano metodą syntezy DNA zgodnie z podanymi powyżej sekwencjami CDR1-11C7, CDR2-11C7, CDR3-11C7, CDR1'-11C7, CDR2'-11C7 i CDR3'-11C7. Kasety te są dostarczone z lepkimi końcami, tak aby zapewnić możliwość ich ligacji z połączeniami w obrębie regionu zrębowego, przy zastosowaniu standardowego protokołu w celu uzyskania cząsteczki DNA kodującej zmienną domeną immunoglobuliny.

Ponadto, do otrzymania konstruktu DNA kodującego monoklonalne przeciwciała według wynalazku, nie jest konieczny dostęp do mRNA wytwarzanego przez linię komórkową hybrydoma. Zatem zgłoszenie PCT opublikowane pod nr WO 90/07861 zawiera pełne instrukcje wytwarzania przeciwciała monoklonalnego z zastosowaniem techniki rekombinacji DNA, dostarczając jedynie pisemnych informacji odnośnie sekwencji nukleotydowej genu.

Sposób obejmuje syntezę wielu oligonukleotydów, ich zwielokrotnienia metodą PCR i ich składanie (ang. splicing) w celu otrzymania żądanej sekwencji DNA.

Wektory ekspresyjne zawierające odpowiedni promotor lub geny kodujące stałe części ciężkiego i lekkiego łańcucha są ogólnie dostępne. Zatem, gdy cząsteczka DNA według wynalazku zostanie wytworzona, może być ona dogodnie przenoszona w odpowiednim wektorze ekspresyjnym.

Cząsteczki DNA kodujące przeciwciała o jednym łańcuchu mogą również być wytwarzane standardowymi sposobami, na przykład, jak opisano w WO 88/1649.

W szczególnym rozwiązaniu wynalazku, środki do rekombinacji stosowane do wytwarzania pewnych cząsteczek wiążących według wynalazku obejmują pierwszy i drugi konstrukt DNA jak opisano poniżej:

Pierwszy konstrukt DNA koduje ciężki łańcuch lub jego fragment i obejmuje

a) pierwszą cześć, która koduje domenę zmienną zawierającą ewentualnie zrębowy i hiper-zmienny region, gdzie te hiper-zmienne regiony zawierają w sekwencji DNA-CDR1-11C7 (SEQ ID NO: 15), DNA-CDR2-11C7 (SEQ ID NO: 16) i DNA-CDR3-11C7 (SEQ ID NO: 17); ta pierwsza cześć rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas domeny zmiennej i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas domeny zmiennej i

b) drugą cześć kodującą stałą część ciężkiego łańcucha lub jej fragment, która rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas stałej części ciężkiego łańcucha i kończy się kodonem

PL 210 720 B1 kodującym ostatni aminokwas stałej części lub jego fragmentu, a następnie wprowadza się kodon nonsensowny.

Korzystnie, druga część koduje stałą część ludzkiego ciężkiego łańcucha, korzystniej stałą część ludzkiego łańcucha γ4. Ta druga część może być fragmentem DNA pochodzenia genomowego (zawierająca introny) lub fragmentem DNA (bez intronów).

Drugi konstrukt DNA koduje lekki łańcuch lub jego fragment i obejmuje

a) pierwszą cześć, która koduje domenę zmienną zawierającą ewentualnie regiony zrębowy i hiper-zmienny; gdzie te hiper-zmienne regiony zawierają w sekwencji DNA-CDR1'-11C7 (SEQ ID NO: 17), DNA-CDR2'-11C7 (SEQ ID NO: 18) i DNA-CDR3'-11C7 (SEQ ID NO: 19), a pierwsza cześć rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas domeny zmiennej i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas domeny zmiennej i

b) drugą cześć kodującą stałą część lekkiego łańcucha lub jego fragment, który rozpoczyna się kodonem kodującym pierwszy aminokwas stałej części lekkiego łańcucha i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas stałej części lub jego fragmentu, a następnie wprowadza się kodon nonsensowny.

Korzystnie, druga część koduje stałą część ludzkiego lekkiego łańcucha, korzystniej stałą część ludzkiego łańcucha κ.

Pierwszy lub drugi konstrukt DNA korzystnie obejmuje trzecią część, która jest zlokalizowana w górę od części pierwszej i która koduje cz ęść liderową peptydu; ta trzecia część rozpoczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas i kończy się ostatnim aminokwasem peptydu liderowego. Peptyd ten jest konieczny dla uzyskania wydzielania łańcuchów z organizmu gospodarza, w którym ulegają one ekspresji i jest następnie usuwany przez organizm gospodarza. Korzystnie, trzecia część pierwszego konstruktu DNA kodująca peptyd liderowy ma sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z sekwencją aminokwasową ciężkiego łańcucha sekwencji liderowej jak pokazana na SEQ ID NO: 21 (rozpoczyna się od aminokwasu w pozycji -19 i kończy się aminokwasem w pozycji -1). Również korzystnie, trzecia część drugiego konstruktu DNA koduje peptyd liderowy mający sekwencję aminokwasową jak przedstawiono na SEQ ID NO: 23 (lekki łańcuch, rozpoczyna się od aminokwasu w pozycji -18 i koń czy się aminokwasem w pozycji -1).

Każdy z konstruktów DNA umieszczono pod kontrolą odpowiednich sekwencji kontrolnych, w szczególnoś ci pod kontrolą odpowiedniego promotora. Moż e być zastosowany dowolny rodzaj promotora, pod warunkiem, że jest on dostosowany do organizmu gospodarza, do którego konstrukty DNA będą przenoszone w celu uzyskania ekspresji. Jednakże, jeśli ekspresja ma mieć miejsce w komórce ssaczej, zwłaszcza korzystne jest zastosowanie promotora genu kodującego immunoglobulinę.

Żądane przeciwciało może być wytworzone w hodowli komórkowej lub w organizmie zwierzęcia transgenicznego. Odpowiednie zwierze transgeniczne może być otrzymane według standardowych metod, które obejmują mikroiniekcje do jaj, pierwszego i drugiego konstruktu DNA umieszczonego pod odpowiednimi sekwencjami kontrolnymi, przeniesienie tak otrzymanych jaj do odpowiedniej samicy z ciążą rzekomą i wybranie potomka, u którego występuje ekspresja żądanego przeciwciała.

Gdy łańcuch przeciwciała ma być wytworzony w hodowli komórkowej, konstrukty DNA muszą być najpierw wprowadzone bądź do jednego wektora ekspresyjnego bądź do dwóch oddzielnych lecz kompatybilnych wektorów ekspresyjnych, korzystne jest to ostatnie rozwiązanie.

Zgodnie z powyższym, wynalazek również dostarcza wektor ekspresyjny zdolny do replikacji w liniach komórkowych prokariotycznych lub eukariotycznych, które obejmują przynajmniej jeden z konstruktów DNA opisanych powyż ej.

Każdy wektor ekspresyjny zawierający konstrukt DNA jest następnie przenoszony do odpowiedniego organizmu gospodarza. Gdy konstrukty DNA są wprowadzone oddzielnie w dwóch wektorach ekspresyjnych, mogą one być przenoszone oddzielnie, to jest jeden rodzaj wektora do komórki, lub wprowadzane razem, korzystne jest to ostatnie rozwiązanie. Odpowiedni organizm gospodarza może być wybrany z grupy obejmującej bakterie, drożdże lub ssaczą linię komórkową, korzystne jest to ostatnie rozwiązanie. Korzystniej, ssacza linia komórkowa jest pochodzenia limfoidalnego np. z komórek szpiczaka, hybrydomy lub normalnych unieś miertelnionych limfocytów B, lecz które nie prowadzą ekspresji żadnego ciężkiego lub lekkiego łańcucha z endogennych przeciwciał.

Jest również korzystne, aby organizm gospodarza zawierał dużą ilość kopii wektora na komórkę. Jeśli organizm gospodarza jest ssaczą linią komórkową, ten żądany cel może być osiągnięty przez amplifikację (zwielokrotnienie liczby kopii zgodnie ze standardowymi metodami]. Metody amplifikacji

PL 210 720 B1 zwykle obejmują wybór pod kątem oporności na lek, oporność ta jest kodowana przez wektor ekspresyjny.

Jak wskazano powyżej w innym aspekcie wynalazek opisuje sposób wytwarzania wielołańcuchowego przeciwciała monoklonalnego według wynalazku, który to sposób obejmuje (i) hodowlę organizmu, który jest transformowany pierwszym i drugim konstruktem DNA według wynalazku i (ii) uzyskiwanie z hodowli aktywnego przeciwciała monoklonalnego według wynalazku.

W innym rozwiązaniu, ciężki i lekki łańcuch może być uzyskiwany oddzielnie i wprowadzany do aktywnego przeciwciała monoklonalnego po poddaniu ich składaniu in vitro. Metody ponownego wprowadzenia są dobrze znane w dziedzinie. Przykłady takich metod zostały w szczególności przedstawione w opisach EP 120 674 lub EP 125 023.

Dlatego sposób może również obejmować:

(i) hodowlę pierwszego organizmu, który jest transformowany opisanym powyżej pierwszym konstruktem DNA i uzyskiwanie z hodowli tego ciężkiego łańcucha lub jego fragmentu oraz (ii) hodowlę drugiego organizmu, który jest transformowany opisanym powyżej drugim konstruktem DNA i uzyskiwanie z hodowli tego lekkiego łańcucha lub jego fragmentu; oraz (iii) przywrócenie naturalnej postaci in vitro aktywnego przeciwciała monoklonalnego według wynalazku z ciężkiego łańcucha lub jego fragmentu otrzymanego jak opisano w (i) i lekkiego łańcucha lub jego fragmentu otrzymanego jak opisano w (ii).

Inny podobny sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego według wynalazku o jednym łańcuchu lub o jednej domenie obejmuje (i) hodowlę organizmu który jest transformowany konstruktem DNA odpowiednio kodującym przeciwciało monoklonalne o jednym łańcuchu lub o jednej domenie według wynalazku i (ii) uzyskiwanie tego przeciwciała z hodowli.

Przeciwciała monoklonalne według wynalazku wykazują bardzo dobrą aktywność naprawy nerwów jak wykazano, na przykład, w modelu przyrostu neurytów w komórkach ziarnistych.

1. Test przyrostu neurytów w komórkach ziarnistych (in vitro)

Przyrost neurytów ze zdysocjowanych komórek ziarnistych z móżdżku określono jak opisano uprzednio (Niederost i wsp. (1999) J.Neurosci. 19: 8979-8989). Pokrótce, móżdżki wyodrębniono z odciętych głów nowonarodzonych szczurów w wieku 5-7 dniu po urodzeniu i móżdżki rozdrobniono traktując trypsyną. W celu ograniczania zanieczyszczenia fibroblastem, komórki wstępnie wysiano na szalki do hodowli bakteryjnych. Następnie hodowano w pożywce (Neurobasal z surowicą zastąpioną B27, Invitrogen) 75 000 komórek na studzienkę w 4-dołkowych szalkach Greinera do hodowli tkankowych (Huber & Co AG,Rheinach, Basel) (powierzchnia studzienki: 1 cm²). Szalki do hodowli powlekano poli-L-lizyną (Sigma). Białkami ekstrahowanymi Chapsem z całkowitego homogenatu z rdzenia kręgowego dorosłych szczurów (Spillmann i wsp. (1998) J. Biol. Chem. 273: 19283-19293) powlekano przy stężeniach białka 0,5 do 8 μg na studzienkę, przez noc w temp. 4°C i przemywano. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku następnie wstępnie inkubowano przez 30 min na badanym substracie i usuwano zanim dodano komórki. Dodano ziarniste komórki z móżdżku i inkubowano przez 24 godziny. Aby zatrzymać doświadczenie, powoli do szalek do hodowli dodawano 2 ml 4% zbuforowanego formaldehydu. Hodowle następnie wybarwiano immunofluorescencyjnie pod kątem związanego ze wzrostem białka GAP-43 i barwnikiem Hoechst w celu zidentyfikowania jądra komórkowego (komórki ziarniste barwiono barwnikiem Hoechst w celu sprawdzenia czy wszystkie komórki mają neuryty (neuryt wizualizowano przeciwciałem anty-GAP-43)). Trzy zdjęcia górnej, dolnej i bocznej krawędzi każdej studzienki wykonywano losowo w określonej odległości, stosując obiektyw 40x w mikroskopie fluorescencyjnym Zeiss Axiophot. Na kodowanych numerycznie, losowo ułożonych zdjęciach zliczano wszystkie neuryty w polu widzenia. Odpowiedź (przerost neurytów w komórkach ziarnistych) zależy od dawki w zakresie od około 0,1 - 10 μq całkowitego białka na studzienkę (specyficzne aktywności danych preparatów różnią się w tym zakresie).

Zwiększenie przyrostu neurytów w komórkach ziarnistych z móżdżku w niezezwalającym na rozwój środowisku powyżej uzyskanego ekstraktu z rdzenia kręgowego przez wstępną inkubację z przeciwciałem monoklonalnym według wynalazku może być obserwowane. Np. typowy profil wpływu neutralizującego na mysie przeciwciało 11C7-IgG1 w modelu przyrostu neurytów komórek ziarnistych przedstawiono poniżej:

PL 210 720 B1

Test 1:

szczurza mielina

powlekana przy stęż. 1 μg na studzienkę	Neuryty w polu	Procentowość
bez przeciwciała	80,5	100%
+mysie IgG	86,5	108%
11C7 250 pg/ml	160	199%
Test 2:
szczurza mielina
(prep. 2) powlekana przy stęż. 8 pg na studzienkę	Neuryty w polu	Procentowość
bez przeciwciała	20	100%
+mysie IgG	17,3	86,5%
11C7 250 pg/ml	31	155%
11C7 75 pg/ml	26	130%
11C7 7,5 pg/ml	26	130%

Neutralizująca aktywność cząsteczek według wynalazku może również być oszacowana przez pomiar regeneracyjnego tworzenia wypustek i przyrostu neurytów w modelu szpiku kostnego in vivo jak następuje:

2. Model uszkodzenia szpiku kostnego (in vivo)

Dorosłe szczury Lewisa poddano mikrochirugicznemu urazowi przez przecięcie grzbietowej połowy rdzenia kręgowego obustronnie na poziomie 8. kręgu piersiowego. Wycięcie łuku kręgu, anestezję i zabieg opisano w Schnell i Schwab 1993 (Eur.J. Neurosci. 5: 1156 - 1171). Związki kontrolne lub przeciwciała monoklonalne według wynalazku zastosowano w dwóch różnych sposobach, zarówno przez wszczepianie 10⁶ świeżo zebranych komórek hybrydomy z jednej strony kory mózgowej (szczepione zwierzęta) lub w innym rozwiązaniu, przez wszczepianą wewnątrzkomorowo rurkę połączoną z podskórnie wszczepioną 2ml pompą Alzet (Alza Corporation, Palo Alto) (pompa zwierzę ca).

- Zwierzę ta szczepione komórkami hybrydoma: Szczury poddano immunosupresji przez 7 - 10 dni stosując cyklosporynę A i uśmiercano przez perfuzję przezsercową 4% buforowanej formaliny 14 dni po uszkodzeniu.

- Pompy zwierzęce: Przeciwciał a monoklonalne wedł ug wynalazku (np. przy 3,3 mg/ml dla mysich 11C7) wprowadzono do 2 ml pomp dostarczających 0,5 μΐ/godzinę do bocznej komory przez 2 tygodnie. Pompy wszczepiano w momencie uszkodzenia szpiku kostnego i szczury uśmiercano 2 tygodnie później.

Obserwacja neuroanatomiczna: Motoryczna i czuciowa droga korowordzeniowa jest obserwowana przez iniekcję poruszającego się do przodu znacznika: biotynylowanej dekstranoaminy (BDA) do boku kory naprzeciwko pompy lub przeszczepu. BDA jest transportowana do rdzenia kręgowego w ciągu 10 - 14 dni i wizualizowana przy użyciu diaminobenzydyny (DAB) jako substratu, jak opisano w Brosamle i wsp., (2000 J.Neurosci. 20: 8061-8068).

Ocena wyników anatomicznych: zastosowano dwa sposoby określania wyników: półilościowy i ilościowy. Ocena półilościowa intensywności tworzenia wypustek i regeneracji: Pełne serie skrawków strzałkowych oznaczonych numerami, losowo zmieszanych zwierząt określano w celu określenia obecności i gęstości ulegających regeneracji tworzących wypustki neuronów rostralnych do uszkodzenia, stosując następujące definicje: regenerujące się tworzące wypustki neurony obejmują włókna wychodzące z przeciętego CST; są one długie, nieregularne w przebiegu, znacznie mniej rozgałęzione niż normalne nerwy oboczne istoty szarej i rosną one w kierunku uszkodzenia i brzusznie lub bocznie dookoła uszkodzenia. Regenerujące się neurony tworzące wypustki często zakończone są stożkiem wzrostu, który może być mały i bulwkowaty lub duży i rozgałęziony. Gęstość tworzących wypustki neuronów jest określana w skali od 0 - 3 dla każdego zwierzęcia.

Regeneracja dalekiego zasięgu: włókna, które mogą przebiegać przez uszkodzenie do ogonowego rdzenia kręgowego są uważane za regenerujące się włókna dalekiego zasięgu. Ich maksymalna odległość od uszkodzenia może być zmierzona, lecz jest często minimalna, gdyż często obecne są pewne nieuszkodzone włókna z małych brzusznych sznurów rdzenia CST; ich odgałęzienia mieszają się z tymi ze zregenerowanych aksonów i powodują, że rozróżnienie ich jest trudne.

Zliczenia włókien (analiza ilościowa): Linię umieszczoną -0,5 mm rostralnie względem końca przeciętego CST umieszczono na zmiennych skrawkach istoty szarej mózgu i zliczano są wszystkie

PL 210 720 B1 przecięcia się z włóknami CST (normalne nerwy oboczne lub neuryty tworzące wypustki). Podobne linie umieszczono ogonowo do uszkodzenia w odległości +0,5, +2 i +5 mm od centrum uszkodzenia. Zliczano przecięcia się linii z włóknami i do sumy odzwierciedlającej włókna CST w ogonowym rdzeniu kręgowym dodano 3 poziomy. Aby otrzymać stosunek, uzyskaną ilość ogonowych włókien podzielono przez ilość włókien -0,5 mm rostralnie ułożonych względem końcowego CST.

Dwa tygodnie po uszkodzeniu rdzenia kręgowego, które to uszkodzenie spowodowało zniszczenie około 40% segmentu T8 rdzenia kręgowego, głównie w połowie grzbietowej, włącznie z dwoma głównymi włóknami CST, obserwacja CST u zwierząt kontrolnych wykazała umiarkowany stopień reaktywnego tworzenia się wypustek szlaku. Zjawisko to odpowiada dobrze znanemu z literatury spontanicznemu tworzeniu wypustek w odpowiedzi na uszkodzenie. Szczury z uszkodzeniem traktowane przeciwciałami monoklonalnymi według wynalazku lub z pompami dostarczającymi przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą wykazywać zwiększenie tworzenia wypustek w miejscu uszkodzenia i regenerację uszkodzonych aksonów przyrostu neurytów uszkodzonych neurytów.

W związku z powyższym niniejszy wynalazek umożliwia również

i. zastosowanie przeciwciał monoklonalnych według wynalazku w naprawie nerwów ssaczego układu nerwowego, w szczególności ludzkiego układu nerwowego, ii. sposób naprawy nerwów ssaczego układu nerwowego, w szczególności ludzkiego układu nerwowego, który obejmuje podawanie skutecznej ilości przeciwciał monoklonalnych według wynalazku pacjentowi który potrzebuje takiego leczenia, lub iii. wytwarzanie kompozycji farmaceutycznej do naprawy nerwów ssaczego układu nerwowego, w szczególności ludzkiego układu nerwowego, która to kompozycja zawiera przeciwciała monoklonalne według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.

W szczególności, przeciwciała monoklonalne według wynalazku są stosowane do regeneracji aksonów i zwiększonego tworzenia wypustek po uszkodzeniu włókna nerwowego. Zatem przeciwciała według wynalazku mają szerokie zastosowanie w szczególności u ludzi. Na przykład przeciwciała monoklonalne według wynalazku są stosowane do leczenia różnych chorób obwodowego (PNS) i centralnego (CNS) układu nerwowego, to jest zwłaszcza w chorobach neurodegeneracyjnych takich, jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), patologie typu Lewy'iego lub ogólnie inne demencje, choroby po urazie czaszkowym, mózgowym lub rdzenia kręgowego, udar lub choroby demielinizacyjne. Takie choroby demielinizacyjne obejmują, nie ograniczając zakresu, stwardnienie rozsiane, demielinizację jednofazową, zapalenie mózgu i rdzenia, leukoencefalopatię wieloogniskową, ogólnie zapalenie mózgu, chorobę Marchiafavy-Bignamiego, mostowy rozpad mieliny, adrenoleukodystrofię, chorobę Pelizaeusa-Merzbachera, zwyrodnienie gąbczaste, chorobę Alexandra, chorobę Canavana, leukodystrofię metachromatyczną i choroba Krabbego. W jednym przykładzie, podawanie przeciwciał monoklonalnych według wynalazku może być stosowane do leczenia choroby demielinizacyjnej związanej z białkiem NogoA. W innym przykładzie, komórki, które eksprymują przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą być przeszczepione do miejsca uszkodzenia rdzenia kręgowego aby ułatwić wzrost aksonów w obrębie miejsca uszkodzenia. Takie przeszczepione komórki dostarczyłyby środków do odbudowania funkcji rdzenia kręgowego po uszkodzeniu lub urazie. Takie komórki mogą obejmować komórki osłonowe nerwów węchowych i komórki macierzyste z różnych linii nerwu płodowego lub przeszczepy tkankowe.

Ponadto, przeciwciała monoklonalne według wynalazku są użyteczne do leczenia degeneracyjnych zaburzeń ocznych, które bezpośrednio lub pośrednio mogą być związane z degeneracją komórek siatkówki lub rogówki, obejmujących ogólnie niedokrwienne retinopatię, przednią niedokrwienną neuropatię oczną, wszystkie formy zapalenia nerwu wzrokowego, związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej, retinopatię cukrzycową, torbielowaty obrzęk plamki żółtej (CME), barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, chorobę Stargardta, chorobę Besta - żółtkowe zwyrodnienie siatkówki, ślepotę wrodzoną Lebera i inne dziedziczne zwyrodnienia siatkówki, patologiczną krótkowzroczność, fibroplazję pozasoczewkową i dziedziczną neuropatię oczną Lebera, objawy występujące po przeszczepieniu rogówki lub refrakcyjnych zabiegach na rogówce i opryszczkowe zapalenie rogówki.

Ponadto, wykazano, że NogoA odgrywa rolę w stanach psychiatrycznych, w szczególności w schizofrenii i depresji. Zatem, przeciwciała monoklonalne według wynalazku są użyteczne w leczeniu stanów psychiatrycznych, w szczególności schizofrenii i depresji.

Przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą być dostarczane same, lub w połączeniu, lub w sekwencyjnym połączeniu z innymi środkami. Na przykład, przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą być podawane w połączeniu ze środkami przeciwzapalnymi takimi, jak między innyPL 210 720 B1 mi kortykosteroidy po udarze lub uszkodzeniu rdzenia kręgowego jako środki do blokowania dalszego uszkodzenia neuronów i hamowania regeneracji aksonów, neurotroficzne czynniki takie, jak NGF, BDNF lub inne leki do leczenia chorób neurodegeneracyjnych takich jak Exelon^TM lub Levodopa. Uważa się, że dwa środki są podawane w połączeniu, gdy dwa środki są podawane równocześnie lub są podawane niezależnie w taki sposób, że te środki będą działać w tym samym czasie.

Do leczenia stanów psychiatrycznych, w szczególności schizofrenii lub depresji, przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą być dostarczone same lub w połączeniu w szczególności z innymi środkami wybranymi z grupy obejmującej:

(a) leki przeciwpadaczkowe wybrane z grupy obejmującej: barbiturany i ich pochodne, benzodiazepiny, karboksyamidy, hydantoiny, sukcynoimidy, kwas walproinowy i inne pochodne kwasów tłuszczowych i inne leki przeciwpadaczkowe, (b) tradycyjne środki przeciwpsychotyczne, (c) nietypowe środki przeciwpsychotyczne i (d) środki przeciwdepresyjne.

Stosowany w niniejszym opisie termin barbiturany i ich pochodne obejmuje, między innymi fenobarbital i prymidon. Stosowany w niniejszym opisie termin benzodiazepiny obejmuje, między innymi klonazepam, diazepam i lorazepam. Stosowany w niniejszym opisie termin karboksyamidy obejmuje, między innymi karbamazepinę, okskarbazepinę i 10-hydroksy-10,11-dihydrokarbamazepinę. Stosowany w niniejszym opisie termin hydantoiny obejmuje, między innymi fenytoinę. Stosowany w niniejszym opisie termin sukcynoimidy obejmuje, między innymi etosuksymid i mesuksymid. Stosowany w niniejszym opisie termin kwas walproinowy i inne pochodne kwasów tłuszczowych obejmuje, między innymi sól sodową kwasu walproinowego, jednowodzian chlorowodorku tiagabiny i wigrabatrynę. Stosowany w niniejszym opisie termin inne leki przeciwpadaczkowe obejmuje, między innymi lewetyracetam, lamotryginę, gabapentynę i felbamat.

Stosowany w niniejszym opisie termin tradycyjne środki przeciwpsychotyczne obejmuje, między innymi haloperidol i flufenazynę.

Stosowany w niniejszym opisie termin nietypowe środki przeciwpsychotyczne odnosi się do klozarylu, risperidonu, olanzapiny, kwetiapiny, zyprazydonu i aripiprazolu.

Stosowany w niniejszym opisie termin środki przeciwdepresyjne obejmuje, między innymi selektywne inhibitory ponownego poboru serotoniny (SSRI's), lub selektywne inhibitory poboru serotoniny i norepinefryny (SNRI-s). Odpowiedni SSRI's do stosowania w obecnym wynalazku może być wybrany z grupy obejmującej: fluoksetynę, fuwoksaminę, sertralinę, paroksetynę, cytalopram i escytalopram.

Struktura aktywnych składników określona jest przez odpowiadające im numery, nazwy rodzajowe lub handlowe i może być odnaleziona z bieżącego wydania standardowego kompendium The Merck Index lub z baz danych, np. międzynarodowych baz patentów (np. IMS Worid Publications). Dowolny specjalista w dziedzinie jest w pełni zdolna do zidentyfikowania składników aktywnych oraz, w oparciu o podane odnośniki, podobnie jest w stanie otrzymać i sprawdzić wskazania farmaceutyczne i właściwości na standardowych modelach badawczych, zarówno in vitro, jak i in vivo.

Oczywiście we wskazaniach wymienionych powyżej, odpowiednie dawkowanie będzie na przykład zależało od danego przeciwciała według wynalazku, które będzie stosowane, trybu podawania oraz właściwości i dotkliwości stanu, który jest leczony. Przeciwciała monoklonalne według wynalazku są korzystnie podawane przez pompy lub iniekcje jako środki terapeutyczne w miejscu uszkodzenia, np. mogą one być podawane bezpośrednio do CNS doczaszkowo lub dooponowo do kręgosłupa do miejsca uszkodzenia.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być wytwarzane w tradycyjny sposób. Np. kompozycja według wynalazku zawierająca przeciwciała monoklonalne jest korzystnie dostarczana w postaci zliofilizowanej. Do natychmiastowego podawania jest ona rozpuszczana w odpowiednim wodnym nośniku, na przykład sterylnej wodzie do iniekcji lub sterylnym zbuforowanym roztworze fizjologicznym.

Aby pomóc w wytwarzaniu odpowiednich kompozycji, przeciwciała monoklonalne według wynalazku i opqonalnie drugi lek zwiększający wpływ cząsteczek wiążących według wynalazku, mogą być pakowane oddzielnie w obrębie tego samego opakowania, z instrukcjami określającymi mieszanie lub wspólne podawanie. Opcjonalne środki odpowiednie jako drugi lek są przedstawione powyżej.

Działanie synergistyczne połączenia przeciwciał monoklonalnych według wynalazku i czynników wzrostu takich jak NGF może być wykazane in vivo stosując model uszkodzenia szpiku kostnego opisany powyżej.

PL 210 720 B1

Krótki opis rysunku:

Figura 1: Porównanie sekwencji: Porównanie sekwencji NiG z różnych gatunków, przedstawiające sekwencję immunogenicznego peptydu względem 11C7 mAb.

Wynalazek będzie jeszcze lepiej, w pełni zrozumiały w odniesieniu do następujących przykładów. Przykłady te nie powinny, jednakże, być interpretowane jako ograniczające zakres wynalazku.

W następujących przykładach temperaturę zawsze podawano w stopniach Celsjusza (°C).

Przeciwciałem monoklonalnym określonym w przykładach jest przeciwciało zawierające zmienną część lekkiego łańcucha (SEQ ID NO: 3) i zmienną część ciężkiego łańcucha (SEQ ID NO: 2).

Zastosowano następujące skróty:

ELISA test enzymatyczny immunosorpcji

FACS rozdzielenie komórek na podstawie aktywacji fluorescencji

FITC izotiocjanian fluoresceiny

FBS bydlęca surowica płodowa

HCMV ludzki promotor cytomegalowirusa

IgG immunoglobulina o izotypie G

MAb przeciwciało monoklonalne

PBS buforowany fosforanem roztwór wodny soli

PCR reakcja łańcuchowa polimerazy

P r z y k ł a d 1:

NiG-D20 (SEQ ID NO: 24) jest jednym fragmentów NogoA hamującym przyrost neurytów,

Metody:

a) Szczurza biblioteka delecji Nogo-A: Konstrukty z delecjami wykonano stosując wewnętrzne miejsca restrykcyjne, stosując Egzonukleazęlll/Nukleazę z fasolki mung i technikę PCR ze szczurzymi starterami specyficznymi wobec Nogo-A na szczurzym Nogo (metoda według opisu WO00/31235): szczurze Nogo-A (aa 1-1163; DNA jak wykazano tutaj poniżej w odniesieniu do aminokwasów szczurzego NogoA (SEQ ID NO: 26), np. aa 1-1163 oznacza, że konstrukt cDNA koduje polipeptyd, który rozpoczyna się od aminokwasu 1 i kończy się na aminokwasie 1163 sekwencji szczurzego polipeptydu NogoA), szczurze Nogo-B (aa 1-172 + 976-1163), szczurze Nogo-C (Nogo-C N-końcowy 11 aa + aa 976-1163), szczurze Nogo-66 (aa 1019-1083), szczurze GST-Nogo-66 (aa 1026-1091), szczurze NiR-G (aa 1-979), szczurze NiR (1-172), szczurze NiR-D1 (aa 1-31), szczurze NiR-D2 (aa 59-172), szczurze NiR-D3 (aa 1-31 + 59-172), szczurze EST-Nogol (aa 762-1163), szczurze NiG (aa 174-979), szczurze NiG-D1 (aa 174-909), szczurze NiG-D2 (aa 174-865), szczurze NiG-D3 (aa 172-723), szczurze NiG-D4 (aa 172-646), szczurze NiG-D5 (aa 293-647), szczurze NiG-D6 (aa 763-975), szczurze NiG-D7 (aa 174-235 + 294-979), szczurze NiG-D8 (aa 218-653), szczurze NiG-D9 (aa 172-259 + 646 -974), szczurze NiG-D10 (aa 293-979), szczurze NiG-D11 (aa 209-268), szczurze NiG-D12 (aa 198 -233), szczurze NiG-D13 (aa 174-216), szczurze NiG-D14 (aa 174-260), szczurze NiG-D15 (aa 174 -190 + 493-979), szczurze NiG-D16 (aa 174-190 + 621-979), szczurze NiG-D17 (aa 174-190 + 259 -979), szczurze NiG-D18 (aa 174-190 + 263-979), szczurze NiG-D19 (aa 763-865), szczurze NiG-D20 (aa 544-725), szczurze NiG-D21 (aa 812-918), szczurze NiG-D22 (aa 866-975), szczurze NiG-D23 (aa 914-975), szczurze NiG-D24 (aa 544-685), szczurze NiG-D25 (aa 614-725), szczurze NiG-D26 (aa 544-613), szczurze NiG-D27 (aa 581-648), szczurze NiG-D28 (aa 614-685), szczurze NiG-D29 (aa 648-725), szczurze NiG-D30 (aa 682-725), szczurze NiG-D31 (aa 544-580), szczurzego NiG-D32 (aa 581-613), szczurze NiG-D33 (aa 614-648), szczurze NiG-D34 (aa 648-685), szczurze NiG-D35 (aa 260-556), szczurze NiG-D36 (aa 260-415). NiR-G i NiR-a uzyskano z Nogo-A-pET28 w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi. NiG uzyskano z NiR-G w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi i traktowanie nukleazą z fasolki mung. NiG-D1, -D3, -D4, -D5, -D7, -D8, -D9, -D10 uzyskano z NiG-pET28 w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi. NiG-D15, -D16, -D17, -D18 uzyskano z NiG-pET28 w wyniku trawienia Egzonukleazą III. NiR-b, NiR-D1, -D2, -D3 uzyskano metodą PCR, stosując NiR-a-pET28 jako matrycę. NiG-D2, -D6, -D11, -D12, -D13, -D14, -D19, -D20, -D21, -D22, -D23, -D24, -D25, -D26, -D27, -D28, -D29, -D30, -D31, -D32, -D33, -D34, -D35, -D36 uzyskano metodą PCR stosując NiG-pET28 jako matrycę. Wszystkie konstrukty wklonowano do pET28. pET28 stosowano we wszystkich konstruktach wymienionych powyżej. pGEX-6P stosowano w GST-Nogo66 i pET26 do uzyskania ekspresji okołobłonowej szczurzej NiG. Ludzki GST-Nogo-66 (aa 1055-1120 ludzkiego Nogo-A) sklonowano metodą PCR stosując jako matrycę ludzką NogoA DNA (SEQ ID NO: 4). Konstrukty z delecjami następnie wklonowano do wektora pET28 (Novagen), pGEX-6P (Amersham Pharmacia Biotech) i wektora pET26 (Novagen). Ludzki GST-Nogo-66 odpowiada białku GST-Nogo

PL 210 720 B1 jak opublikowano w GrandPre i wsp. (supra). Syntetyczny szczurzy peptyd 4 EELVQKYSNSALGHVNSTIKELRRL (SEQ ID NO: 27) odpowiada ludzkiemu peptydowi 4 (Wykazano, że ludzki peptyd 4 stanowi region hamujący domeny Nogo-66 (GrandPre i wsp., 2000)). Ortologiczny szczurzy peptyd ma pojedynczą niezgodność C->S (patrz sekwencja peptydu 4 w GrandPre i wsp., 2000, supra). Syntetyczny bogaty w Pro/Ser peptyd PSSPPPSSPPPSSPPPS (SEQ ID NO: 28) jak i szczurzy peptyd 4 zostały wytworzone i oczyszczone techniką HPLC stosując Primm SA. Ludzki NogoA_623-640 (SEQ ID NO: 6) zsyntezowano i oczyszczono stosując Research Genetics Inc.

b) Wytworzenie ludzkich konstruktów do ekspresji Nogo-A (pRK7-hNogo-A): Ludzką bibliotekę cDNA skonstruowaną w fagu lambda gt10 (Clontech) przeszukiwano stosując podwójny zestaw filtrów według standardowych procedur. Fragmenty ludzkiej Nogo-A zamplifikowano metodą PCR z ludzkiego cDNA z całego mózgu (Clontech) stosując standardowy protokół a następnie wklonowano do pBluescript, trawiono i wyodrębniono, lub stosowano bezpośrednio jako sondy do przeszukiwania. Fragment Xhol/Smal o długości 400 par zasad zastosowano jako sondę 5', sondę 3' zamplifikowano stosując startery CA-NA-2F: 5'-AAG CAC CAT TGA ATT CTG CAG TTC C-3' (SEQ ID NO: 29) i CA-NA-3R: 5'-AAC TGC AGT ACT GAG CTC CTC CAT CTG C-3' (SEQ ID NO: 30). Klony pozytywne wyodrębniono, wklonowano i potwierdzono sekwencję. Aby otrzymać pełnej długości ludzki Nogo-A cDNA, nachodzące na siebie klony złożono stosując pojedyncze miejsce restrykcyjne EcoRI w ludzkiej sekwencji Nogo-A i wklonowano do wektora Bluescript, nazwanego Pbsnogoa. Aby otrzymać pRK7-hNogo-A, pełnej długości cDNA wprowadzono do eukariotycznego wektora ekspresyjnego pRK-7 przez bezpośrednie klonowanie.

c) Wytworzenie plazmidów ekspresyjnych(pET28a-hNiG) ludzkich NiG (hNiG) do wytwarzania w bakteriach: Fragment DNA kodujący hNiG wklonowano do BamHI/XhoI pET28a (Novagen), po amplifikacji metodą PCR odpowiedniego regionu kodującego z Pbsnogoa, w ramce z końcem N His- i T7-tag w celu uzyskania ekspresji w bakterii, stosując zestawy starterów: przedni (forward) 5'-GTC GCG GAT CCA TGG AGA CCC TTT TTG CTC TTC-3' (SEQ ID NO: 31); wsteczny (reverse) 5'-GTT CTC GAG TTA TGA AGT TTT ACT CAG-3' (SEQ ID NO: 32). Ostateczny plazmid jest nazwany pET28a-hNiG. Następnie eskprymowano hNiG w E.coli BL21 pRP przez wprowadzenie 1 mM izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozydu (IPGT).

d) Wytworzenie plazmidu ekspresyjnego mysiego NiG-egzon3 (mNiG-exon3): Region kodujący mysi egzon 3 został zamplifikowany z matrycy mysiego genomu BAC stosując startery: przedni 5'-GTG CGG ATC CAT GGA TTT GAA GGA GCA GC-3' (SEQ ID NO: 33); wsteczny 5'-GTT TCT CGA GTG AAG TTT TAT TCA GCT C-3' (SEQ ID NO: 34) i wklonowany w miejsca klonowania BamHI/XhoI pET28a. Ostateczny konstrukt nazwano pET28a-mNiG-exon3.

Klonowanie małpiego NiG: PolyA RNA wyodrębniono z zamrożonej tkanki mózgowej małpy i cDNA zsyntetyzowano stosując starter oligo dT. Dwa nachodzące na siebie fragmenty pokrywające region 5' i 3' cDNA zamplifikowano metodą PCR stosując specyficzne dla sekwencji startery i enzym korekcyjny. Startery zaprojektowano stosując znaną sekwencję ludzkiego cDNA kodującego NiG. Do przeprowadzenia amplifikacji zastosowano startery fragmentu 5' takie jak 5'TCCACCCCGGCCGCGCCCAA-3' (SEQ ID NO: 35) i 5'-AATGATGGGCAAAGCTGTGCTG-3' (SEQ ID NO: 36), fragmentu 3'- 5'-GGTACAAAGATTGCTTATGAAACA-3' (SEQ ID NO: 37) i 5'-AGCAGGGCCAAGGCAATGTAGG-3' (SEQ ID NO: 38). Następnie dwa fragmenty klonowano i dla każdego fragmentu zsekwencjonowano przynajmniej 4 niezależne klony. Pełnej długości cDNA złożono przez nakładanie metodą PCR stosując startery wspomniane powyżej i otrzymany produkt sklonowane i zsekwencjonowano ponownie.

e) Wytwarzanie zrekombinowanych białek NogoNiG i biblioteki delecji Nogo-A- jak zdefiniowano powyżej: Bakteryjną bibliotekę delecji Nogo-A eksprymowano w Escherichia coli. Białka ekstrahowano zarówno przez powtarzaną sonikację w buforze do sonikacji (20 mM Tris, 50 mM NaH2PO4, 100 mM NaCI, pH 8,0) z 0,75 mg/ml lizozymu, przez rozpuszczenie z B-Per™ (Pierce) lub z 8 M mocznikiem. NiG poddano ekspresji z pelB-liderem i otrzymano z przestrzeni okołobłonowej zgodnie z protokołem Novagen oczyszczania białka okołobłonowego. Nadsącze konstruktów pET28 oczyszczono stosując żywicę powinowactwa z metalem Co²⁺-Talon™ (Clontech) zgodnie z procedurą laboratoryjną. 8 M mocznik i rozpuszczone lizaty B-Per™ doprowadzono do warunków niedenaturujących przez stałe zwiększanie zamiennego buforu przez bufor do sonikacji w czasie procedury zestaw-żywica. Białka wymywano 250 mM imidazolem w buforze do sonikacji na kolumnie grawitacyjnej (BioRad). Białka NiG dalej oczyszczano stosując filtrację w żelu na Superdex 200 HiLoad 16/60. Nadsącze konstruktów pGEX-6P oczyszczono w kolumnie z G-sefarozą według procedury zestawu zgodnie ze wskaza14

PL 210 720 B1 niami producenta (Amersham Pharmacia). Cięcie GST-Nogo-66 wykonywano przez inkubację rozpuszczonego GST-Nogo-66 z proteazą PreScission, a następnie zastosowano oczyszczanie metodą HPLC. Elektroelucja z żelu przeprowadzono stosując preparacyjną SDSPAGE oczyszczonego na IMAC zrekombinowanego Nogo i wymywano stosując Electro-Eluter z BioRad do 50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCI, 0,2% (masa/obj.) CHAPS przez 1 godzinę przy 250 mA, a następnie 30 s przy odwróconej polaryzacji elektrod. Stężenia białka dla białek oczyszczonych chromatograficznie określono stosując barwienie Pierce Coomassie i BSA jako białko wzorcowe. Stężenia białka dla białek wymytych z żelu oszacowano na podstawie intensywności prążków w żelach barwionych azotanem srebra (MerriI CR, Dunau ML, Goldman D (1981) A rapid sensitive silver stain for polypeptydes in polyakrylamid gels. Analyt.Biochem. 110:201-207) stosując jako wzorzec BSA.

f) Wytwarzanie zrekombinowanych fragmentów NogoA w komórkach CHO: fragment obejmujący 3119 par zasad otrzymany z częściowego trawienia HincII szczurzego cDNA kodującego Nogo-A, NiR-G, wklonowano do wektorów ekspresyjnych pSecTag2 (Invitrogen, Groningen, Holandia). Transfekcja komórek CHO wektorem pNiR-G doprowadziła do wewnątrzkomórkowej, cytoplazmowej ekspresji NiR-G. Stabilne linie komórkowe NiR-G CHO wybrano stosując 250 μg/ml zeocyny (Invitrogen). Zrekombinowany NiR-G z lizatu komórkowego oczyszczono stosując kolumnę Ni²⁺-NTA (Qiagen AG, Bazylea, Szwajcaria). Geny kodujące szczurze NiG-D20 i Nogo-66 wklonowano do wektora pAPtag5 metodą PCR. Transfekcja komórek CHO wektorem pNiG-D20-AP doprowadziła do uzyskania NiG-δ -20-AP, które było wydzielane do nadsączu hodowli. Stabilne linie komórkowe pNiG-D20-AP i pNogo-66-AP wybrano stosując 250 μg/ml zeocyny (Invitrogen), Obie linie komórkowe dostosowano do pożywki pozbawionej surowicy (Gibco) i hodowano w komorze do hodowli komórkowych (Integra). Nadsącze zatężono dziesięciokrotnie przed zastosowaniem i zatężony preparat białka fuzyjnego oznaczano jak opisano w innych pracach (Flanagan JG, Leder P (1990) Set ligand: a cell surface molecule altered in steel mutant fibroblasts. Cell 63:185-194).

g) Testy rozprzestrzeniania się fibroblastów 3T3 i CHO: Testy rozprzestrzeniania się 3T3 wykonywano jak opisano uprzednio (Spillmann AA, Bandtlow CE, Lottspeich F, Keller F, Schwab ME (1998) Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220). J.Biol.Chem. 273:19283-19293). Testy rozprzestrzeniania się CHO wykonywano zasadniczo w ten sam sposób jak dla fibroblastów 3T3. Pokrótce, komórki CHO podzielono 1:2. 24 godziny później poddano trypsynizacji w PBS-EDTA przez 30 sekund i ~8 000 komórek CHO wysiano na szalki do hodowli wstępnie powlekane NiG lub Nogo-66 w ilości 5, 1,0,5 i 0,2 μg/studzienkę. Po 30-45 min komórki utrwalono stosując 4% (masa/obj.) PFA, 5% (masa/obj.) sacharozy, a następnie analizowano jak opisano w pracy Spillmanna i wsp., supra). Zliczono z użyciem mikroskopu świetlnego około 100 komórek na studzienkę; kryteria dla rozprzestrzeniania się komórek: (a) przyleganie do szalki i (b) wydłużona morfologia wskazująca na występowanie lamellipodiów; obserwowane przez mikroskop świetlny komórki te wydają się ciemniejsze niż te nierozprzestrzeniające się i większe niż te rozprzestrzeniające się, komórki okrągłe; za nierozprzestrzeniające się komórki są uważane te komórki, które są (a) nieprzylegające do szalki lub (b) przylegające do szalki, lecz małe, zaokrąglone bez wykrywalnych lamellipodiów penetrujących szalkę. Stosunek komórek rozprzestrzeniających się do nierozprzestrzeniających się określa stopień nie zezwalania podłoża na rozprzestrzenianie się.

h) Test wzrostu neurytów PC12: Test wzrostu neurytów PC12 wykonywano jak opisano uprzednio (Rubin BP, Spillmann AA, Bandtlow CE, Keller F, Schwab ME (1995) Inhibition of PC-12 cell attachment and neurite outgrowht by detergent solubilized CNS mieline peptides. Europ. J. Neurosci. 7: 2524-2529). Komórki PC12 (Klon komórek PC12 zdolny do wzrostu niezależnie od lamininy otrzymany z Moses Chao, Nowy Jork) testowano następnie przez dwa dni z 50-100 ng/ml NGF (Harlan Bioproducts, Indianapolis) dodanym do DMEM, 5% bydlęcej surowicy płodowej, 10% surowicy końskiej, 100 U/ml penicyliny i 0,5 mg/ml streptomycyny (Pen-Strep z Gibco-BRI). Komórki PC12 zostały odłączone mechanicznie, poddane trypsynizacji przez 5 minut stosując 0,05% trypsyny (Sigma) w HBSS (Gibco) i wysiane przy gęstości 3000-5000 komórek/cm² do pożywki hodowlanej z 100 ng/ml NGF. Testy zatrzymano po 24 godzinach dodając 4% (masa/obj.) PFA, 5% (masa/obj.) sacharozy w PBS, pH 8. Szalki do hodowli komórkowej powlekano dla komórek PC12 w ten sam sposób jak dla komórek 3T3.

i) Testy paskowe siatkówkowych komórek zwojowych: Test paskowe siatkówkowych komórek zwojowych przeprowadza się, zgodnie z pracą Vieimettera (patrz Vielmetter J, Stolze B, Bonhoeffer F, Stuermer CA (1990) In vitro test to test differential substrate affinities of growing axons and migratory

PL 210 720 B1 cells. Exp. Brain Res. 81:283-287) z modyfikacjami (patrz Schmalfeldt et al., 2000) Brain derived versican V2 is a potent inhibitor of axonal growth. J. Cell Sci. 113:807-816). Hodowle tkankowe analizowano po utrwaleniu przy pomocy 4% (masa/obj.) PFA, 0,1% (obj./obj.) glutaraldehydu w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej. Do barwienia immunologicznego, utrwalone hodowle tkankowe blokowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym RNO (0,5% (masa/obj.) BSA, 0,3% (masa/obj.) TopBlock (Juro Supply), 0,1% (masa/obj.) NaN3 w PBS), zwiększano przepuszczalność przez 10 min stosując 0,05% (obj./obj.) Tx-100 w roztworze blokującym RNO, zamrażano przez jedną minutę w temp. -20°C i inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi (AS Bianca dla NiR, AS Laura dla Nogo-A, NiR-G, NiG, NiG-D3 i NiG-D20, Novagen mAb anty-T7 dla Nogo-C i beta-Gal jak białko kontrolne). Po przemyciu PBS, do hodowli tkankowych dodano przeciwciała sprzężone FITC- i TRITC (FITC: Fluoresceino-IzoTioCyjanian: TRITC: Tetrametylo Rodamino IzoTioCyjanian) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) (1:150). Próbki nakrywano szkiełkiem nakrywkowym w 50% (obj./obj.) glicerolu, 25 mM NaHCO3, 40 mM NaCI, 1% (masa/obj.) p-genylenodiaminy (Sigma).

Wyniki:

a) Dwa regiony Nogo-A w części końca N są inhibitorami rozprzestrzeniania się fibroblastów 3T3: Aby zidentyfikować regiony Nogo-A odpowiedzialne za hamowanie rozprzestrzeniania się fibroblastów 3T3, utworzono bibliotekę 50 konstruktów Nogo z delecjami i uzyskano w bakteriach ekspresję zrekombinowanych białek (patrz metoda 1a). Rzeczywiste wartości EC50 hamowania rozprzestrzeniania się fibroblastów 3T3 wynosiły w przybliżeniu 400-500 ng/0,1 ml Nogo-A powlekanego przez noc na cm² szalki do hodowli (~4 pmol/cm²). Traktowanie Nogo-A lub jej fragmentów 8 M mocznikiem prowadzi do silnego obniżenia aktywności hamującej, wskazując, że ważna jest konformacja. Analiza fragmentów Nogo w teście rozprzestrzeniania się fibroblastów wykazała, że przynajmniej dwa fragmenty białka Nogo-A biorą udział w hamowaniu rozprzestrzeniania się świeżo wysianych fibroblastów, mianowicie NiR-D2 (aa 59-172) i NiG-D20 (aa 544-725). Wszystkie fragmenty pochodzące z regionu NiG wykazującego aktywność inhibitorów (np. NiG-D4 i NiG-D8) częściowo nakładają się z NiG-D20. Mniejszą aktywność inhibitorów przy wyższym stężeniu białka obserwowano dla NiG-D19 w obrębie regionu NiG-D6. Nogo-C, Nogo-66 i szczurzego peptydu 4 (jak wykazano będące regionem hamującym

Nogo-66 w pracy GrandPre et al., 2000) nie są inhibitorami rozprzestrzeniania się fibroblastów. Dane te wykazują, że aktywność Nogo-A hamująca rozprzestrzenianie się fibroblastów w teście fibroblastów 3T3 opiera się na dwóch zdefiniowanych fragmentach zlokalizowanych na końcu N (NiR-D2) i w obrębie części specyficznej dla Nogo-A (NiG-D20) białka. Niespecyficzne fizykochemiczne właściwości (kwasowość fragmentów, wpływy strukturalne spowodowane resztami prolinowymi i serynowymi) nie biorą udziału w tym działaniu. C-końcowa domena RTN nie bierze udziału w hamowaniu rozprzestrzeniania się fibroblastów.

b) Region NiG-D20 Nogo-A jest inhibitorem przyrostu neurytów: Aby określić czy fragmenty Nogo-A, które nie zezwalają na rozprzestrzenianie się komórek, są również inhibitorami przyrostu neurytów, serie wytworzonych w bakteriach fragmentów Nogo-A jak i eukariotycznie wytworzonych chimer Nogo-AP są badane w różnych testach neuronalnych. W teście paskowym (metoda 1), neuryty unikają pasków powlekanych lamininą/Nogo-A, rosnąc na paskach powlekanych jedynie lamininą, a paski powlekane lamininą/beta-galaktozydazą nie są omijane przez rosnące neuryty. Pełnej długości Nogo-A w znacznym stopniu nie zezwala na przyrost neurytów w nerwowych komórkach siatkówki (RGC), podczas gdy cześć N-końcowa (NiR) miała jedynie znikome działanie. Aktywność Nogo-C nie da się odróżnić od działania kontrolnego białka p-galaktozydazy. Specyficzny region Nogo-A, NiG-D20, wydaje się zawierać główny region odpowiedzialny za aktywność nie zezwalającą na przyrost neurytów RGC; stożki wzrostu zatrzymują się gdy napotkają paski powlekane NiG-D20. Działanie niezezwalające na przyrost neurytów jest zależne od stężenia. Przy niższych stężeniach Nogo-A ilość przecinających włókien jest większa. Żadnej wyraźnej różnicy nie obserwowano pomiędzy nosowymi a skroniowymi neurytami RGC rozważając ich odpowiedź na fragmenty peptydów Nogo-A. Wstępnie sprawdzano niezależny od lamininy klon komórek PC12 odpowiadający na NGF, stosując 50 ng/ml NGF przez 24 godziny, a następnie komórki wysiewano na szalki powlekane wytworzonymi przez bakterie fragmentami Nogo przy 0,1-3 pg/cm². Przyrost neurytów określano dzień później. Regiony specyficzne dla Nogo-A (NiG) i fragment tego białka NiG-520 silnie hamowały w PC12 przyrost neurytów. Przeciwnie, fragment N-końcowy NiR ma jedynie mniejsze działanie, wykrywalne jedynie przy wysokich stężeniach białka. Nogo-C i Nogo-66 są nieaktywne.

PL 210 720 B1

P r z y k ł a d 2:

Obecność miejsca (miejsc) wiążących dla NiR-G i NiG-D20 w obrębie fibroblastów 3T3 i błon z kory mózgowej szczura:

Metody

a) Doświadczenia obejmujące radioaktywne znakowanie i wiązanie: oczyszczone na IMAC białko NiG-D20 podano jodowaniu stosując ANAWA Trading SA (Wangen, Szwajcaria) (2,030 Ci/mmol) i laktoperoksydazę, i oczyszczono techniką HPLC o odwróconej fazie. Błony z kory mózgowej szczura uzyskano jak opisano w literaturze (Olpe HR, Karlsson G, Pozza MF, Brugger F, Steinmann M, Van Riezen H, Fagg G, Hall RG, Froestl W, Bittiger H (1990) CGP 35348: a centrally acitive blocker of GABAB receptors. Eur.J.Pharmacol. 187:27-38). Wiązanie przeprowadza się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej zasadniczo jak opisano w literaturze (Kaupmann K, Huggel K, Heid J, Flor PJ, Bischoff S, Mickel SJ, McMaster G, Angst C, Bittiger H, Froestl W, Bettler B (1997) Expression cloning of GABA(B) receptors uncovers similarity to metabotropic glutamate receptors. Nature 386:239-246.) stosując 1,5 ml probówki wstępnie inkubowane przez 2 godziny z 1% (masa/obj.) albuminą z surowicy bydlęcej w celu ograniczania wiązania niespecyficznego. Homogenaty błon w buforze HEPES, pH 7,4 (125 mM NaCI, 5 mM KCI, 0,6 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 6 mM dekstroza) zawierającym inhibitory proteaz (Roche Diagnostics, Mannheim, FRG) inkubowano z 13 nM jodowanym NiG-D20 przy braku lub w obecności zwiększających się stężeń nieznakowanego NiG-D20.

b) Cytometria przepływowa: Cytometrię przepływową i selekcję komórek wykonywano stosując urządzenie do szybkiej selekcji komórek Cytomation MoFlo (Fort Collins, Colorado). Cytometr przepływowy jest wyposażony w laser argonowy-jonowy/UV Enterprise II ustawiony na 488 nm o mocy 130 mW. Fluorescencję fluoresceiny (FITC) zliczano stosując filtr pasmowoprzepustowy 530/40 nm. Do analizy fibroblasty 3T3 oddzielano od podłoża stosując bufor do dysocjacji komórek (Cell Dissociation Buffer, Gibco). Wstępnie utworzy kompleks stosowany do wykrywania wiązania NiR-G z fibroblastami 3T3 wytworzono jak następuje: NiR-G i przeciwciało anty-Myc (9E10) inkubowano w stosunku molowym 1:1 przez 30 min w temp. 4°C. Następnie, dodano FITC skoniugowane z F(ab)2 koziej antymysiej IgG i inkubowano przez kolejne 30 min w temp. 4°C. Otrzymany stosunek molowy trimerowego kompleksu wynosi 1:1:0,5. Kompleks dodano do 1x10⁶ fibroblastów 3T3 o końcowej objętości 0,1 ml, inkubowano przez 2 godziny w temp. 4°C, przemyto i analizowano stosując cytometrię przepływową.

Wyniki:

Obecność miejsca(miejsc) wiążącego(ych) dla specyficznych aktywnych fragmentów Nogo-A w obrębie fibroblastów 3T3 i błon z kory mózgowej szczura: Ponieważ regiony NiR-D2 i NiG-D20 białka Nogo-A są inhibitorami rozprzestrzeniania się komórek i przyrostu neurytów pomimo braku Nogo-66 i niezależnie od NgR, wprowadzono hipotezę występowania oddzielnego, receptora specyficznego dla Nogo-A. Zatem wykonano badania wiązania NiR-G zmultimeryzowanego, z etykietą myc i oczyszczonego na IMAG z żywymi fibroblastami 3T3, które analizowano stosując cytometrię przepływową. Skompleksowane Ab- NiR-G jest skutecznie związane z komórkami 3T3 jak zaobserwowano poprzez przesunięcie się fluorescencji w przypadku ponad 90% komórek 3T3. Przeciwnie, komórki 3T3 nie są znakowane po inkubacji z pierwszorzędowym 9E10 mysim anty-myc mAb skompleksowanym ze sprzężonym FITC-drugorzędowym F(ab)2 przeciwciałem skierowanym przeciwko mysiej IgG ani z samym drugorzędowym Ab. Aby zbadać wiązanie NiG-D20 z błonami z kory mózgowej szczura, zastosowano NiG-D20 znakowane [¹²⁵l] w testach wiązania ze znacznikiem promieniotwórczym. Dowody na występowanie specyficznych miejsc wiążących dla NiG-D20 w błonach z kory mózgowej szczura wykazano przy stężeniu 1,3 nM [¹²⁵l]-NiG-D20, stosując zależne od stężenia kompetycyjne wiązanie związku znakowanego i obserwując wypieranie go przez nieznakowany NiG-D20. Te wyniki wykazują, że koniec aminowy fragmentów Nogo-A może wiązać się z powierzchnią komórek 3T3 i z błonami z kory mózgowej szczura, wykazując obecność związanych z błoną, specyficznych dla Nogo-A miejsc wiążących lub receptora(ów).

P r z y k ł a d 3:

Wytwarzanie mysiej 11C7-IgG1

Myszy (rasy C3H i C57BI6/J) immunizowano podskórnie syntetycznym peptydem SYDSIKLEPENPPPYEEA (= szczurza NogoA_623-640; SEQ ID NO: 1), odpowiadającym szczególnemu epitopowi w NiG-D20. Epitop ten jest silnie konserwatywny w regionie Nogo-A specyficznym wobec NiG-D20 u ludzi, makaków jawajskich i myszy, i rozpoczyna się od aminokwasu 623 i kończy się na aminokwasie 640 ludzkiej sekwencji aminokwasowej NogoA (SEQ ID NO: 5) (Patrz również porównanie sekwencji: Fig. 1).

PL 210 720 B1 mAb 11C7 otrzymano w wyniku fuzji szczurzego NogoA_623-640 z białkiem nośnikowym hemaglutyniny z Megathura Crenulata (KLH) z immunizowanej myszy. Monoklonalne przeciwciała przeszukiwano testem ELISA pod kątem szczurzego peptydu NogoA_623-640-KLH, szczurzego wolnego peptydu NogoA_623-640 i niespokrewnionego peptydu-KLH. W dalszym przeszukiwaniu, mAbs poddano badaniu metodą ELISA pod kątem NiR-G w porównaniu z b-galaktozydazą, z których oba ulegają ekspresji jako białka o etykiecie his i oczyszczane są z zastosowaniem chromatografii powinowactwa z metalem. Następnie, mAbs badano pod kątem rozpoznawania Nogo-A w analizie typu Western blot z oligodendrocytami i lizatami mózgu (ze szczura). Przeciwciała badano pod kątem rozpoznawania białka w immunocytochemii komórek CHO lub COS transfekowanych szczurzym Nogo-A i endogennego Nogo-A szczurzych oligodendrocytów (komórek permeabilizowanych). Badano je również pod kątem wiązania powierzchniowego z oligodendrocytami żywych szczurów. Reaktywność krzyżową pomiędzy gatunkami badano w teście ELISA stosując zrekombinowane białko NiG ze szczura, myszy, od człowieka i pochodzenia bydlęcego i stosując endogenne Nogo-A ze szczura, myszy, od człowieka i małpy, techniką Western blot z wykorzystaniem tkanki lub ekstraktów komórkowych.

Analiza techniką Western blot: SDS-PAGE i Westernblot wykonywano jak opisano uprzednio (Huber AB, Weinmann O, Brosamle C, Oertle T, Schwab ME (2002) Patterns of Nogo mRNA and protein expression in the developing and adult rat and after CNS lesions. J. Neurosci. 22: 3553-3567), blokowanie przeprowadzano stosując 3% (masa/obj.) Top Block (Juro Supply, Lucerne, Szwajcaria). Przeciwciała rozcieńczano następująco: Oczyszczone monoklonalne 11C7 lub nadsącze z hodowli hybrydomy 1:150. Drugorzędowe przeciwciała stanowią koniugat HRP- anty-mysi ((Pierce; 1:5000,) 1:50,000). Hybrydyzację z przeciwciałem 11C7 prowadzono przez noc w temp. 4°C. W celu wykrywania, stosowano odczynniki ECL do detekcji z Amersham Pharmacia.

Wyniki:

11C7 mAb identyfikuje prążek 190 kD Nogo-A na obrazie uzyskanym metodą Western blot w homogenacie hodowli komórkowej oligodendrocytów. 11C7 również identyfikuje ludzki NiG, NiG makaka jawajskiego w lizacie komórkowym i szczurzy NiG-D20 w obrazach uzyskanych metodą Western blot. 11C7 mAb został scharakteryzowany jako izotyp IgG1 (IsoStrip Kit, Roche).

P r z y k ł a d 4:

Charakterystyka mysiego 11C7 mAb

Immunocytochemia: Oligodendrocyty nerwu wzrokowego wytwarzano jak opisano w literaturze (Schwab, Caroni, 1988, Neuron). Hodowle po trzech do pięciu dni hodowane na szkiełkach nakrywkowych powlekanych poli-L-lizyną przemyto dwukrotnie PBS, utrwalono w 4% (masa/obj.) paraformaldehydu (PFA), 5% (masa/obj.) sacharozie w PBS przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT) i niespecyficzne blokowano 10% (obj./obj.) FCS. Komórki następnie inkubowano z mysim 11C7 (1:100). Drugorzędowe przeciwciała stanowią kozie przeciwciała anty-mysie TRITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Do wyznakowania powierzchni komórek, hodowle szczurzego nerwu wzrokowego hodowane przez dwa dni, inkubowano z przeciwciałem monoklonalnym w pożywce przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Drugorzędowe przeciwciała sprzężone z fosfatazą alkaliczną (Milan Analytica, Lausanne) stosowano przy 1:7 500 w 0,1 M kwasie maleinowym z 1% (masa/obj.) odczynnika blokującego (1 godzina). Hodowle przemyto dwukrotnie buforem z kwasem maleinowym, jeden raz buforem z fosfatazą alkaliczną (0,1 M Tris-HCI pH 9,5, 0,1 M NaCI, 5 mM MgCl2) i znakowanie prowadzono przez 3 godziny w temperaturze pokojowej z 0,175 mg/ml BCIP (Sigma) i 0,338 mg/ml NBT (Sigma) w buforze z fosfatazą alkaliczną.

Epitop NogoA_623-640 z Nogo-A obecny na powierzchni komórek w hodowli oligodendrocytów: Żywe hodowle oligodendrocytów inkubowano z mysim 11C7 mAb znakując zróżnicowane ciała komórkowe oligodendrocytów i wyrostki promieniowe. Kontrolne mysie IgG i przeciwciała przeciwko wewnątrzkomórkowemu białku CNPazy nie znakują żywych komórek. Wstępna inkubacja mysiego 11C7 z odpowiadającym mu immunogennym peptydem (= szczurzy NogoA_623-640 SEQ ID NO: 1) obniża znakowanie do poziomu tła (test współzawodnictwa/kompetycji). Znakowanie powierzchni komórki występuje we wszystkich głównych i mniejszych wyrostkach i na ciele komórki. Zatem, specyficzna względem Nogo-A część przeciwciała rozpoznawanego przez mysie 11C7 mAb jest eksponowana do przestrzeni międzykomórkowej na błonie komórkowej oligodendrocytów.

Wytwarzanie i oczyszczanie mysiego 11C7 mAb: 10 I szklany reaktor biologiczny zastosowano do hodowli w trybie ciągłym klonu hybrydoma wytwarzającego mysie 11C7 mAb. Reaktor biologiczny jest wyposażony w mieszadło śmigłowe umieszczone na centralnej rurce w celu łagodnego mieszania, filtr wirujący do zatrzymywania komórek i silikonowe nawijane przewody rurowe do napowietrza18

PL 210 720 B1 nia bez bąblowania. Komórki hybrydomy hodowano w naszym opartym na RPMI pozbawionym surowicy płynie hodowlanym. Płyn zaszczepiano komórkami przy 3,7x10⁵/ml. Po 28 godzinach rozpoczęto stały przepływ pożywki przez reaktor biologiczny przy szybkości przepływu 0,5 objętości fermentatora/ /dzień (5 litrów/dzień). Kolejne 24 godziny później szybkość przepływu zwiększono do końcowej wartości 1 objętości fermentatora/dzień (10 litrów/dzień). Po 1 tygodniu hodowla osiągała stały stan przy 11x10⁵ komórek/ml i hodowlę kontynuowano przez kolejny tydzień. Miano mysich 11C7 mAb określano codziennie metodą HPLC. Całkowitą ilość 150 litrów nadsączu hodowli zebrano z reaktora biologicznego, sterylnie przesączono w celu usunięcia komórek i resztek komórek. 150 I nadsączu hodowli zatężono do około 6 I stosując przepływowe urządzenie tangensowe Pellikon (Millipore; odcięcie 10 kDa). Zatężony nadsącz oczyszczono w 3 przebiegach przez kolumnę ze złożem o objętości 220 ml; nazwa złoża: Protein A Sepharose C-4B (Pharmacia; wysokość złoża 11 cm). Pokrótce, nadsącz hodowli po korekcji pH do 8,1 wprowadzono z szybkością 4 ml/min i kolumnę przemyto do linii podstawowej przy 8 ml/min stosując 100 mM Na2HPO4, pH 8,1. Związany materiał ostatecznie wymywano przy 8 ml/min stosując 50 mM NaH2PO4, pH 3,0, 140 mM NaCI i natychmiast zobojętniano (pH 7,0) stosując 5 N NaOH i sterylnie sączono. Absorbancję monitorowano przy 280 nm. Część oczyszczonego materiału może być ewentualnie dalej zatężana przez ultrafiltrację i/lub dializowana w PBS. Wszystkie bufory stosowane w oczyszczaniu przesączono przez urządzenie filtracyjne z przepływem stycznym 10 kDa ULTRASETTE™ (Filtron Technology Corporation), aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia endotoksyną. Z tego samego powodu żywica z białkiem A była obficie przemywana roztworem 20% etanolu i wszystkie rury/pompy były traktowane przed użyciem 0,1 M NaOH. Stężenie białka mierzono spektrofotometrycznie przy 280 nm stosując absorpcję referencyjną 1,35 dla 1 mg/ml. Czystość rutynowo oznaczano metodą SDS-PAGE w warunkach redukujących stosując żele gradientowe 4-20% Novex. Zawartość endotoksyny mierzono klasyczną reakcją LAL (Limulus Amoebocyte Lysate - LAI) zgodnie z instrukcjami producenta (Endotell AG, Allschwil, Szwajcaria).

Wytwarzanie Fragmentów Fab: Część mysiego 11C7 mAb dokładnie dializowano w obecności 100 mM Na-octan, pH 5,5, 2 mM EDTA i doprowadzono do stężenia 6 mg/ml. Fragmenty Fab wytworzono trawiąc papainą (stosunek 1:200 przy udziale wagowym) w obecności 0,25 mM cysteiny. Pozostawiono, aby zaszła reakcja przez 16 godzin w temp. 37°C, a następnie reakcję zatrzymywano przez dodanie w dużym nadmiarze (10 μΜ) specyficznego inhibitora papainy, E64 (N-[N-(L-3-trans-karboksyrano-2-karbonylo)-L-leucylo]-agmatyny). Trawione przeciwciało następnie naniesiono na kolumnę typu Protein A Sepharose Fast Flow, aby usunąć niezmieniony materiał i fragmenty Fc. Frakcję Fab dokładnie dializowano w obecności PBS i zatężono do około 3 mg/ml. (Papaina i E64 były z Roche Molecular Biochemicals).

HPLC, spektrometria mas i sekwencjonowanie aminokwasów końca N regionów VL i VH:

Redukcja i alkilowanie: Oczyszczone, wysuszone przeciwciała 11C7 rozpuszczono w 40 μl 8 M mocznika, 0,4 M NH₄HCO₃, pH 8,3. Dodano 60 μg DTT (Calbiochem) wstępnie rozpuszczonego w 10 μl tego samego buforu co białko. Przeprowadzono redukcję w temperaturze 50°C przez 30 minut w atmosferze argonu (100-krotny nadmiar molowy DTT w porównaniu do tioli białkowych). Po redukcji, próbkę schłodzono do temperatury pokojowej. Dodano 304 μg jodoacetamidu (Sigma Ultra, I-1149) rozpuszczonego w tym samym buforze co białko. Karboksyamidometylowanie przeprowadzono w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności. W celu zakończenia reakcji dodano 1 μl β-merkaptoetanolu.

Wyodrębnienie ciężkiego i lekkiego łańcucha: Wyodrębniono karboksyamidometylowany ciężki i lekki łańcuch przeciwciała stosując wysokociśnieniową chromatografię cieczową o odwróconej fazie (RP-HPLC) używając sprzętu Hewlett Packard 1090M HPLC System z układem pompującym DR5 i detektorem z układem diod UV.

Warunki chromatografii są następujące: kolumna PerSeptive Biosystems Poros 2,1x100 mm wypełniona materiałem R1/H; przepływ wynosił 0,5 ml/min; układ rozpuszczalników: (A) 0,1% TFA w wodzie i (B) 0,09% TPA /acetonitryl/woda 9:1; gradient 25-70% B w ciągu 8 minut w temp. 80°C; wykrywanie przy 218/280 nm.

LC-ESI-MS: spektrometrię mas przeprowadzono na spektrometrze Q-Tof (Micromass, Manchester, UK) z kwadrupolem, hybrydowym tandemowym analizatorem czasu przelotu, z jonizatorem Micromass Z, w którym jonizacja próbki następuje przez rozpylanie w polu elektrycznym (ESI). Zakres

PL 210 720 B1 przemiatania m/z typowo wynosi 500-2000. Dane zapisywano i poddano obróbce stosując oprogramowanie MassLynx. Kalibrację w skali 500-2500 m/z przeprowadzano na podstawie pików wielokrotnie naładowanych jonów mioglobiny z serca konia (Masa cząsteczkowa 16951,5).

d) HPLC-MS ciężkiego i lekkiego łańcucha: Rozdzielenie zredukowanego i karboksyamidometylowanego ciężkiego i lekkiego łańcucha przeprowadza się używając układ HP1100 HPLC (Hewlett Packard, Palo-Alto, CA, USA) na kolumnie 1 mm x 150 mm LC Packings wypełnionej Perseptive Biosystems POROS R1/H. Kolumnę utrzymywano w temp. 60°C. Objętości próbek 10 μl wprowadzano strzykawką na kolumnę stosując automatyczny podajnik próbek CTC PAL (CTC, Zwingen, Szwajcaria) wyposażony w zawór Valco, model C6UW HPLC (Valco, Houston, TX, USA) i pętlę do iniekcji 10 gl. HPLC kontrolowano stosując oprogramowanie MassLynx (Micromass, Manchester, UK). Wykrywanie prowadzono UV przy 214 nm. Eluent A jest wodą zawierającą 0,05% TFA. Eluent B jest mieszaniną woda:acetonitryl 1:9 zawierającą 0,045% TFA. Przebieg gradientu z 20% B do 90% B stosowano w ciągu 20 minut w temp. 80°C. Szybkość przepływu typowo wynosiła 60 gl/min. Całkowity przepływ z układu LC wprowadzono do komory detekcyjnej UV, a następnie do źródła ESI bez dalszego rozbijania. Układ HPLC kontrolowano i sygnał z detektora UV przetwarzano stosując oprogramowanie MassLynx (Micromass, Manchester, UK). Wykryto kolejne 5 sygnałów:

T a b e l a 1

Zmierzona wartość:	Interpretacja sygnału
A= 50959,0 Da B= 51119,5 Da C= 51086,0 Da D= 51251,0 Da E= 24464,8 Da	Łańcuch H z karboksyamidometylo-cysteiną (CAMCys)* Sygnał A + 162 Da (= heksoza)** Sygnał A + 127 (Lys), Łańcuch H z CAMCys* sygnał C + 162 Da (=heksoza)** Łańcuch L z CAMCys
	* Występują dwa rodzaje łańcucha H, jeden z i jeden bez reszty Lys na zakończeniu końca C. Stosunek obu form wynosi w przybliżeniu 50:50%. ** Oba rodzaje łańcucha H mają dwie odpowiadające im formy glikozylowane (+162)

a) Sekwencjonowanie aminokwasów na końcu N regionów VL i VH: Zebrane na HPLC frakcje odpowiadające pikom pochodzącym od łańcuchów H+L zastosowano w analizie sekwencji. Sekwencje aminokwasowe określono stosując układ do sekwencjonowania N-końca białka Hewlett Packard G1000A. Układ przeprowadza zautomatyzowaną analizę próbek białka na podstawie metody Edmana zatrzymywanych na miniaturowych dwufazowych kolumnach adsorpcyjnych. Zoptymalizowana metoda chemiczna (podwójne sprzężenie 3,0) jest stosowana do zwiększenia chemicznej skuteczności, minimalizowania opóźnień i w ten sposób przedłuża analizę sekwencji do około 50 reszt. Analizę aminokwasów-PTH przeprowadza się w czasie ciągłego procesu wykorzystując układ Hewlett Packard HP1090 HPLC wyposażony w potrójny układ pompujący i kolumnę PTH o małej średnicy (2,1 mm x 25 cm).

Wyniki:

Na podstawie analizy mas określono homogenny ciężki i lekki łańcuch mysiej 11C7-IgG1. Łańcuch H jest pojedynczo glikozylowany i istnieją dwie postacie różniące się obecnością lizyny na końcu C. Całkowita analiza masy ciężkiego i lekkiego łańcucha przedstawia osobne masy dla obu łańcuchów. Chromatogram HPLC mysiej 11C7-IgG1 przedstawia jeden pik. Po oczyszczaniu techniką HPLC, po redukcji i alkilacji uzyskuje się czysty ciężki i lekki łańcuch. Degradację sekwencji końca N przeprowadza się na lekkim łańcuchu i ciężkim łańcuchu. 45 do 55 aminokwasów z sekwencji końca N łańcucha L i łańcucha H zidentyfikowano przez degradację sekwencji.

PL 210 720 B1

Lekki łańcuch

5 10 15 20 25 30 ▼ ▼▼▼▼▼▼

DVLLTQTPLTLSITlGQPASISCKSSQSLL

31 35 40 45	50	55	60
▼ ▼ ▼ ▼ ▼	▼	▼
HSDGKTYLNWLLGRPGO
Ciężki łańcuch
1 5 10 15	20	25	30
▼ ▼ ▼ ▼ ▼	▼	▼

EVKLLESGGGLVGPGGSLKLSCVVSGFDFR 31 35 40 45 50 55 60 ▼ ▼▼▼▼▼▼

RNWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPD

P r z y k ł a d 5:

Klonowanie genów kodujących ciężki i lekki łańcuch mysiego 11C7 mAb

Całkowite RNA uzyskano z 10⁷ komórek hybrydoma (klon 11C7) stosując odczynnik TriPure (Roche diagnostics, Germany, Nr kat. 1667157) zgodnie z instrukcjami producenta. Do syntezy cDNA, wyodrębniono mRNA z powyżej uzyskanego całkowitego RNA stosując żywicę Oligotex (Qiagen, Germany, Nr kat. 70022).

cDNA wytworzono przez odwrotną transkrypcję stosując następujące warunki: 2 pl mRNA, 2 pl 10 x bufor do odwrotnej transkrypcji, 2 pl (dT)20 startera (10 pM), 0,5 pl RNazyny (Promega, 40 U/ml), p l dNTPs (5 mM każdy), 1 pl odwrotnej transkryptazy Omniscript™ (Qiagen, Nr kat. 205110), 10,5 p l ddH2O, Reakcja: 1 godzina w temp. 37°C. Do amplifikacji cDNA kodującego VH i VL metodą PCR zastosowano enzym ProofStart™ naprawiający błędy polimerazy DNA.

PCR lekkiego i ciężkiego łańcucha: Mieszanina do reakcji: 2 pl cDNA, 5 pl 10 x bufor do reakcji, p l dNTPs (każ dy 5 mM), 2 pl startera 5' (10 p M) (patrz Tabela 2), 2 p l starter 3' (10 pM) (patrz Tabela 2), 1 pl ProofStart (Qiagen, Nr kat. 202203), 36 pl ddH2O. Warunki PCR: 95°C/5 min, (95°C/40 sek, 53°C/1 min, 72°C/1 min) x 35, 72°C/10 min. Otrzymane produkty PCR ligowano bezpośrednio z pCRbluntTOPO (Invitrogen). Mieszaniną ligacyjną transfekowano komórki TOP 10 (Invitrogen) i wybrano kilka klonów. Sekwencje nukleotydowe cDNA kodujących zmienne części łańcucha ciężkiego 11C7 mAb (V-H, SEQ ID NO: 43) i lekkiego łańcucha 11C7 mAb (V-L, SEQ ID NO: 44) określono aparatem do sekwencjonowania ABI. Następujące sekwencje aminokwasowe V-H i V-L przedstawiono na SEQ ID NO: 2 (V-H) i SEQ ID NO: 3 (V-l). Startery stosowane do amplifikacji cDNA kodujących VH i VL techniką PCR; wszystkie startery zsyntetyzowano w MWG Biotech, Germany.

T a b e l a 2

Starter	Sekwencja	SEQ ID NO:
lider 5'-Vl	AATATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTC	39
3'-Ck	TTAGGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG	40
lider 5'-Vh	AATATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTMATTG	41
zawias 3'-Ch	AATTGGGCAACGTTGCAGGTGACG	42

PL 210 720 B1

P r z y k ł a d 6:

Wiązanie 11C7 i Fab z domenami Nogo-A stosując test ELISA dołkowe szalki PS Greinera (#655161) powlekano 0,4-2 μg/ml fragmentów białka Nogo w PBS (100 μl/zagłębienie) powlekano i inkubowano 4 godziny w temperaturze pokojowej. Szalki potrząśnięto i napełniono 200 μl/studzienkę buforu blokującego (PBS+2% BSA), powlekano i inkubowano 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temp. 4°C, następnie przemyto 4 razy wodą i PBS. Różne stężenia mysiego 11C7 mAb lub 11C7 Fab rozcieńczono w PBS + 2% BSA (100 μl/studzienkę) i inkubowano 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temp. 4°C. Etap przemywania powtarzano i dodawano kozie anty-mysie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) przy rozcieńczeniu 1:5000 (ICN #55550) w PBS/0,1% BSA/0,1% Nonidet 40 (100 gl/studzienkę) i inkubowano 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temp. 4°C i etap przemywania powtarzano. Reakcję HRP zapoczątkowywano przez dodanie 100 gl/studzienkę błękitu BM POD (Roche #1484281) i inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodano 1M H2SO4 50 gl/studzienkę aby zatrzymać reakcję substratu HRP i wyznaczono gęstość optyczną stosując czytnik do mikroszalek (Packard Spectra Count) ustawiony na 450 nm.

Mysie 11C7 mAb wiąże się z ludzkim NiG, szczurzym NiG, mysim NiG, szczurzym NiG-D20 i peptydem 472 przy bardzo niskich stężeniach 0,02 do 2,5 nM. Wiązanie z ludzkim NiG, szczurzym NiG, mysim NiG przy bardzo niskich stężeniach jest potwierdzane przez bardzo wysokie powinowactwo (Kd 0,1 - 0,44 nM pomiar powinowactwa biosensorem) i jest zgodne z faktem, że peptyd 472 z wyjątkiem 2-3 aminokwasów jest identyczny z ludzkim w porównaniu z równoważnymi regionami u szczura i myszy. Specyficzność wiązania wskazano poprzez fakt, że mysie 11C7 mAb nie wykazuje żadnego wiązania ze szczurzym NiG-D6 i fragmentami Nogo-66 w tym samym zakresie stężeń. Jednowartościowy fragment Fab był związany z ludzkim NiG i szczurzym NiG-D20 przy stężeniach 0,025 do 25 nM, lecz nie wykazał wiązania ze szczurzym NiG-D6 i fragmentami Nogo-66 przy tym samym zakresie stężeń. Kd mierzone przez Biosensor wynosiło 7,14 nM dla ludzkiego polipeptydu NiG.

P r z y k ł a d 7:

Pomiary powinowactwa biosensorem mysiego 11C7-IgG1 i Fab z domenami Nogo-A

Powinowactwo mysiego 11C7 mAb i Fab 11C7 zmierzono stosując technologię plazmonowego rezonansu powierzchniowego (surface plasmon resonance - SPR) i optyczny biosensor BIAcore 2000 (Biacore, Uppsala, Szwecja) zgodnie instrukcjami producenta (patrz Fig. 2). Zrekombinowane ludzkie, mysie i szczurze NIG są kowalencyjnie połączone z trzema oddzielnymi komórkami przepływu na chipie czujnika pomiarowego CM5 z wykorzystaniem metody sprzęgania amin. Pokrótce; podłoże z karboksymetylowanego dekstranu aktywowano przez iniekcję 35 gl roztworu zawierającego 0,025 M NHS i 0,1M EDC. Do unieruchomienia na chipie czujnika pomiarowego zrekombinowane mysie, ludzkie i szczurze NIG rozcieńczono w 0,01M buforze cytrynianowym przy pH w zakresie od 3,5 do 4,5 i wstrzykiwano przy szybkości przepływu 5 gl/min, aby osiągnąć poziomy sprzęgania umożliwiające pomiary powinowactwa. Dezaktywację pozostałych grup NHS-ester przeprowadzono przez iniekcję 35 gl 1M chlorowodorku etanolaminy (pH 8,5). Powierzchnia na chipie czujnika pomiarowego jest regenerowana przez iniekcję 5 gl 0,1M HCI. Do pomiaru powinowactwa przeciwciała wstrzykiwano w różnych stężeniach, w zakresie od 0,50 nM do 100 nM przy szybkości przepływu 200 gl/min. Po każdym wstrzykiwaniu powierzchnię na chipie czujnika pomiarowego regenerowano przez iniekcję 10 gl 0,1M HCI nie tracąc aktywności wiązania na powierzchni. Stałe kinetyczne, ka i kd i stałe powinowactwa KA i KD analizowano stosując oprogramowanie BIAevaluations 3.0 dostarczone przez producenta.

Pomiar powinowactwa w BIAcore: zmierzono stałe kinetyczne i powinowactwo wiązania mysiego 11C7 mAb i jednowartościowego fragmentu Fab pochodzącego z 11C7 ze zrekombinowanym NogoA w czasie rzeczywistym stosując technologię plazmonowego rezonansu powierzchniowego (surface plasmon resonance - SPR) (Biacore). Do tej analizy zrekombinowane ludzkie, mysie i szczurze NIG sprzęgano na trzech niezależnych powierzchniach chipa czujnika pomiarowego i wstrzyknięto różne stężenia przeciwciał. Parametry kinetyczne oddziaływań wiążących pochodziły z sensorgramów w wyniku nie-liniowego dopasowywania krzywej. Stałe powinowactwa w stanie równowagi mysich 11C7-IgG1 wynoszą KD = 0,1 nM, KD = 0,4 nM i KD = 0,19 nM odpowiednio dla ludzkiego, szczurzego i mysiego NIG (tabela 3). Dla fragmentu Fab pochodzącego z 11C7 stała powinowactwa wiązania z ludzkim NIG wynosi KD = 7,14 nM. Niższe powinowactwo fragmentu Fab wynika z obniżenia zarówno stałych kinetyki, asocjacji i dysocjacji (ka, kd). Niższe powinowactwo fragmentu Fab w porównaniu

PL 210 720 B1 do pełnego przeciwciała jest prawdopodobnie związane z efektem zachłanności (avidity effect), który polega na braku monomerycznego Fab.

T a b e l a 3

11C7	Ka (1/Ms)	kd (1/s)	KA (M-1)	KD (M)
Ludzka NIG	4,48 x 105	4,6 x 10'5	9,73 x 109	1,03 x 10-10
Szczurza	8,76 x 105	3,89 x 10'4	2,25 x 109	4,44 x 10-10
Mysia NIG	5,52 x 105	1,06 x 10'4	5,2 x 109	1,92 x 10-10
11C7 Fab	Ka (1/Ms)	kd (1/s)	KA (M-1)	KD (M)
Ludzka NIG	7,29 x 104	5,28 x 10'4	1,4 x 108	7,14 x 10-9

PL 210 720 B1

Lista sekwencji <110> Novartis AG <12O> Cząsteczki wiążące Nogo A i ich zastosowanie farmaceutyczne <130> 4-32761P1/UNZ <160> 44 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(18) <223> szczurzy NogoA_623-640 <400> 1

Ser Tyr Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu 15 10 15

Glu Ala

PL 210 720 B1 <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221> ŁAŃCUCH <222> (1)..(221) <223> Zmienne części ciężkiego łańucha 11C7 z sekwencją liderową <400> 2

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val 15 10 15

Gin Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro 20 25 30

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Asp Phe Arg 35 40 45

Arg Asn Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro

70 75 80

Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

90 95

PL 210 720 B1

Leu Tyr Leu Gin Val Ser Thr Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr 100 105 110

Tyr Cys Val Arg Pro Val Trp Met Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 115 120 125

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 130 135 140

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190

Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 195 200 205

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala 210 215 220 <210> 3 <211> 238 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221> ŁAŃCUCH

PL 210 720 B1 <222> (1)..(238) <223> Lekki łańcuch 11C7 z sekwencją liderową <400> 3

Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe 1 5

Thr Ser Gly Asp Val Leu Leu Thr 20

Thr Ile Gly Gin Pro Ala Ser Ile 35 40

Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 50 55

Gly Gin Ser Pro Lys Arg Leu Ile 65 70

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 85

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala 100

Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Gin 115 120

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 130 135

Ser Ser Glu Gin Leu Thr Ser Gly 145 150

Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu 10 15

Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Ile 25 30

Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu 45

Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro 60

Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 75 80

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 90 95

Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys 105 110

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 125

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

140

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 155 160

PL 210 720 B1

Asn Asn

Phe

Tyr

Pro Lys Asp Ile Asn Val

Lys Trp Lys

Ile Asp 175

Gly

165

170

Ser Glu

Arg

Gin

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

Asp

Ser

180

185

190

Lys Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Lys

Asp

195

200

205

Glu Tyr

Glu

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Ala

Thr

His

Lys

Thr

210

215

220

Ser Thr

Ser

Pro

Ile

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

235

<210>

4

<211>

3919

<212>

DNA

<213>

Homo

sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(3579) <223> Ludzkie NogoA

PL 210 720 B1

ccc cgg

ccg cag

ccc gcg ttc aag

tac cag

ttc gtg agg gag ccc gag

96

Pro

Arg

Pro

Gin 20

Pro Ala Phe

Lys

Tyr 25

Gin

Phe Val Arg

Glu 30

Pro Glu

gac

gag

gag

gaa

gaa

gag

gag

gag

gaa

gag

gag

gac

gag

gac

gaa

gac

144

Asp

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Asp

Glu

Asp

Glu

Asp

35

40

45

ctg

gag

gag

ctg

gag

gtg

ctg

gag

agg

aag

ccc

gcc

gcc

ggg

ctg

tcc

192

Leu

Glu

Glu

Leu

Glu

Val

Leu

Glu

Arg

Lys

Pro

Ala

Ala

Gly

Leu

Ser

50

55

60

gcg

gcc

cca

gtg

ccc

acc

gcc

cct

gcc

gcc

ggc

gcg

ccc

ctg

atg

gac

240

Ala

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Ala

Pro

Ala

Ala

Gly

Ala

Pro

Leu

Met

Asp

65

70

75

80

ttc

gga

aat

gac

ttc

gtg

ccg

ccg

gcg

ccc

cgg

gga

ccc

ctg

ccg

gcc

288

Phe

Gly

Asn

Asp

Phe

Val

Pro

Pro

Ala

Pro

Arg

Gly

Pro

Leu

Pro

Ala

85

90

95

gct

ccc

ccc

gtc

gcc

ccg

gag

cgg

cag

ccg

tct

tgg

gac

ccg

agc

ccg

336

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Pro

Glu

Arg

Gin

Pro

Ser

Trp

Asp

Pro

Ser

Pro

100

105

110

gtg

tcg

tcg

acc

gtg

ccc

gcg

cca

tcc

ccg

ctg

tct

gct

gcc

gca

gtc

384

Val

Ser

Ser

Thr

Val

Pro

Ala

Pro

Ser

Pro

Leu

Ser

Ala

Ala

Ala

Val

115

120

125

tcg

ccc

tcc

aag

ctc

cct

gag

gac

gac

gag

cct

ccg

gcc

cgg

cct

ccc

432

Ser

Pro

Ser

Lys

Leu

Pro

Glu

Asp

Asp

Glu

Pro

Pro

Ala

Arg

Pro

Pro

130

135

140

cct

cct

ccc

ccg

gcc

agc

gtg

agc

ccc

cag

gca

gag

ccc

gtg

tgg

acc

480

Pro

Pro

Pro

Pro

Ala

Ser

Val

Ser

Pro

Gin

Ala

Glu

Pro

Val

Trp

Thr

145 150 155 160

PL 210 720 B1

ccg cca gcc

ccg gct Pro Ala 165

ccc gcc gcg ccc

ccc tcc acc

ccg gcc gcg ccc

Pro

Pro

Ala

Pro

Ala

Ala

Pro

Pro Ser 170

Thr

Pro

Ala

Ala 175

Pro

aag

cgc

agg

ggc

tcc

tcg

ggc

tca

gtg

gat

gag

acc

ctt

ttt

gct

ctt

Lys

Arg

Arg

Gly

Ser

Ser

Gly

Ser

Val

Asp

Glu

Thr

Leu

Phe

Ala

Leu

180

185

190

cct

gct

gca

tct

gag

cct

gtg

ata

cgc

tcc

tct

gca

gaa

aat

atg

gac

Pro

Ala

Ala

Ser

Glu

Pro

Val

Ile

Arg

Ser

Ser

Ala

Glu

Asn

Met

Asp

195

200

205

ttg

aag

gag

cag

cca

ggt

aac

act

att

tcg

gct

ggt

caa

gag

gat

ttc

Leu

Lys

Glu

Gin

Pro

Gly

Asn

Thr

Ile

Ser

Ala

Gly

Gin

Glu

Asp

Phe

210

215

220

cca

tct

gtc

ctg

ctt

gaa

act

gct

gct

tct

ctt

cct

tct

ctg

tct

cct

Pro

Ser

Val

Leu

Leu

Glu

Thr

Ala

Ala

Ser

Leu

Pro

Ser

Leu

Ser

Pro

225

230

235

240

ctc

tca

gcc

gct

tct

ttc

aaa

gaa

cat

gaa

tac

ctt

ggt

aat

ttg

tca

Leu

Ser

Ala

Ala

Ser

Phe

Lys

Glu

His

Glu

Tyr

Leu

Gly

Asn

Leu

Ser

245

250

255

aca

gta

tta

ccc

act

gaa

gga

aca

ctt

caa

gaa

aat

gtc

agt

gaa

gct

Thr

Val

Leu

Pro

Thr

Glu

Gly

Thr

Leu

Gin

Glu

Asn

Val

Ser

Glu

Ala

260

265

270

tct

aaa

gag

gtc

tca

gag

aag

gca

aaa

act

eta

ctc

ata

gat

aga

gat

Ser

Lys

Glu

Val

Ser

Glu

Lys

Ala

Lys

Thr

Leu

Leu

Ile

Asp

Arg

Asp

275

280

285

tta

aca

gag

ttt

tca

gaa

tta

gaa

tac

tca

gaa

atg

gga

tca

tcg

ttc

Leu

Thr

Glu

Phe

Ser

Glu

Leu

Glu

Tyr

Ser

Glu

Met

Gly

Ser

Ser

Phe

290 295 300

PL 210 720 B1

agt gtc tct

cca Pro

aaa Lys

gca gaa tct gcc gta

ata gta gca aat cct agg

960

Ser Val 305

Ser

Ala 310

Glu Ser

Ala Val

Ile Val 315

Ala Asn

Pro

Arg 320

gaa

gaa

ata

atc

gtg

aaa

aat

aaa

gat

gaa

gaa

gag

aag

tta

gtt

agt

1008

Glu

Glu

Ile

Ile

Val

Lys

Asn

Lys

Asp

Glu

Glu

Glu

Lys

Leu

Val

Ser

325

330

335

aat

aac

atc

ctt

cat

aat

caa

caa

gag

tta

cct

aca

gct

ctt

act

aaa

1056

Asn

Asn

Ile

Leu

His

Asn

Gin

Gin

Glu

Leu

Pro

Thr

Ala

Leu

Thr

Lys

340

345

350

ttg

gtt

aaa

gag

gat

gaa

gtt

gtg

tct

tea

gaa

aaa

gca

aaa

gac

agt

1104

Leu

Val

Lys

Glu

Asp

Glu

Val

Val

Ser

Ser

Glu

Lys

Ala

Lys

Asp

Ser

355

360

365

ttt

aat

gaa

aag

aga

gtt

gca

gtg

gaa

gct

cct

atg

agg

gag

gaa

tat

1152

Phe

Asn

Glu

Lys

Arg

Val

Ala

Val

Glu

Ala

Pro

Met

Arg

Glu

Glu

Tyr

370

375

380

gca

gac

ttc

aaa

cca

ttt

gag

ega

gta

tgg

gaa

gtg

aaa

gat

agt

aag

1200

Ala

Asp

Phe

Lys

Pro

Phe

Glu

Arg

Val

Trp

Glu

Val

Lys

Asp

Ser

Lys

385

390

395

400

gaa

gat

agt

gat

atg

ttg

gct

gct

gga

ggt

aaa

atc

gag

age

aac

ttg

1248

Glu

Asp

Ser

Asp

Met

Leu

Ala

Ala

Gly Gly

Lys

Ile

Glu

Ser

Asn

Leu

405

410

415

gaa

agt

aaa

gtg

gat

aaa

aaa

tgt

ttt

gca

gat

age

ctt

gag

caa

act

1296

Glu

Ser

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Cys

Phe

Ala

Asp

Ser

Leu

Glu

Gin

Thr

420

425

430

aat

cac

gaa

aaa

gat

agt

gag

agt

agt

aat

gat

gat

act

tct

ttc

ccc

1344

Asn

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Glu

Ser

Ser

Asn

Asp

Asp

Thr

Ser

Phe

Pro

435 440 445

PL 210 720 B1

agt Ser

acg Thr 450

cca gaa

ggt ata aag gat

cgt Arg

tca Ser

gga gca tat

atc Ile

aca Thr

tgt Cys

1392

Pro

Glu

Gly Ile Lys 455

Asp

Gly

Ala 460

Tyr

gct

ccc

ttt

aac

cca

gca

gca

act

gag

agc

att

gca

aca

aac

att

ttt

1440

Ala

Pro

Phe

Asn

Pro

Ala

Ala

Thr

Glu

Ser

Ile

Ala

Thr

Asn

Ile

Phe

465

470

475

480

cct

ttg

tta

gga

gat

cct

act

tca

gaa

aat

aag

acc

gat

gaa

aaa

aaa

1488

Pro

Leu

Leu

Gly Asp

Pro

Thr

Ser

Glu

Asn

Lys

Thr

Asp

Glu

Lys

Lys

485

490

495

ata

gaa

gaa

aag

aag

gcc

caa

ata

gta

aca

gag

aag

aat

act

agc

acc

1536

Ile

Glu

Glu

Lys

Lys

Ala

Gin

Ile

Val

Thr

Glu

Lys

Asn

Thr

Ser

Thr

500

505

510

aaa

aca

tca

aac

cct

ttt

ctt

gta

gca

gca

cag

gat

tct

gag

aca

gat

1584

Lys

Thr

Ser

Asn

Pro

Phe

Leu

Val

Ala

Ala

Gin

Asp

Ser

Glu

Thr

Asp

515

520

525

tat

gtc

aca

aca

gat

aat

tta

aca

aag

gtg

act

gag

gaa

gtc

gtg

gca

1632

Tyr

Val

Thr

Thr

Asp

Asn

Leu

Thr

Lys

Val

Thr

Glu

Glu

Val

Val

Ala

530

535

540

aac

atg

cct

gaa

ggc

ctg

act

cca

gat

tta

gta

cag

gaa

gca

tgt

gaa

1680

Asn

Met

Pro

Glu

Gly

Leu

Thr

Pro

Asp

Leu

Val

Gin

Glu

Ala

Cys

Glu

545

550

555

560

agt

gaa

ttg

aat

gaa

gtt

act

ggt

aca

aag

att

gct

tat

gaa

aca

aaa

1728

Ser

Glu

Leu

Asn

Glu

Val

Thr

Gly

Thr

Lys

Ile

Ala

Tyr

Glu

Thr

Lys

565

570

575

atg

gac

ttg

gtt

caa

aca

tca

gaa

gtt

atg

caa

gag

tca

ctc

tat

cct

1776

Met

Asp

Leu

Val

Gin

Thr

Ser

Glu

Val

Met

Gin

Glu

Ser

Leu

Tyr

Pro

580 585 590

PL 210 720 B1

gca Ala

gca cag ctt Ala Gin Leu 595

tgc Cys

cca tca ttt gaa gag tca gaa gct act

cct Pro

tca Ser

1824

Pro

Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala

Thr

600

605

cca

gtt

ttg

cct

gac

att

gtt

atg

gaa

gca

cca

ttg

aat

tct

gca

gtt

1872

Pro

Val

Leu

Pro

Asp

Ile

Val

Met

Glu

Ala

Pro

Leu

Asn

Ser

Ala

Val

610

615

620

cct

agt

gct

ggt

gct

tcc

gtg

ata

cag

ccc

agc

tca

tca

cca

tta

gaa

1920

Pro

Ser

Ala

Gly

Ala

Ser

Val

Ile

Gin

Pro

Ser

Ser

Ser

Pro

Leu

Glu

625

630

635

640

gct

tct

tca

gtt

aat

tat

gaa

agc

ata

aaa

cat

gag

cct

gaa

aac

ccc

1968

Ala

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Glu

Ser

Ile

Lys

His

Glu

Pro

Glu

Asn

Pro

645

650

655

cca

cca

tat

gaa

gag

gcc

atg

agt

gta

tca

eta

aaa

aaa

gta

tca

gga

2016

Pro

Pro

Tyr

Glu

Glu

Ala

Met

Ser

Val

Ser

Leu

Lys

Lys

Val

Ser

Gly

660

665

670

ata

aag

gaa

gaa

att

aaa

gag

cct

gaa

aat

att

aat

gca

gct

ctt

caa

2064

Ile

Lys

Glu

Glu

Ile

Lys

Glu

Pro

Glu

Asn

Ile

Asn

Ala

Ala

Leu

Gin

675

680

685

gaa

aca

gaa

gct

cct

tat

ata

tct

att

gca

tgt

gat

tta

att

aaa

gaa

2112

Glu

Thr

Glu

Ala

Pro

Tyr

Ile

Ser

Ile

Ala

Cys

Asp

Leu

Ile

Lys

Glu

690

695

700

aca

aag

ctt

tct

gct

gaa

cca

gct

ccg

gat

ttc

tct

gat

tat

tca

gaa

2160

Thr

Lys

Leu

Ser

Ala

Glu

Pro

Ala

Pro

Asp

Phe

Ser

Asp

Tyr

Ser

Glu

705

710

715

720

atg

gca

aaa

gtt

gaa

cag

cca

gtg

cct

gat

cat

tct

gag

eta

gtt

gaa

2208

Met

Ala

Lys

Val

Glu

Gin

Pro

Val

Pro

Asp

His

Ser

Glu

Leu

Val

Glu

725

730

735

PL 210 720 B1

2256

gat

tcc

tca

cct

gat

tct

gaa

cca

gtt

gac

tta

ttt

agt

gat

gat

tca

Asp

Ser

Ser

Pro

Asp

Ser

Glu

Pro

Val

Asp

Leu

Phe

Ser

Asp

Asp

Ser

740

745

750

ata

cct

gac

gtt

cca

caa

aaa

caa

gat

gaa

act

gtg

atg

ctt

gtg

aaa

Ile

Pro

Asp

Val

Pro

Gin

Lys

Gin

Asp

Glu

Thr

Val

Met

Leu

Val

Lys

755

760

765

2304

gaa

agt

ctc

act

gag

act

tca

ttt

gag

tca

atg

ata

gaa

tat

gaa

aat

Glu

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Ser

Phe

Glu

Ser

Met

Ile

Glu

Tyr

Glu

Asn

770

775

780

2352

aag

gaa

aaa

ctc

agt

gct

ttg

cca

cct

gag

gga gga

aag

cca

tat

ttg

Lys

Glu

Lys

Leu

Ser

Ala

Leu

Pro

Pro

Glu

Gly Gly

Lys

Pro

Tyr

Leu

785

790

795

800

2400

gaa

tct

ttt

aag

ctc

agt

tta

gat

aac

aca

aaa

gat

acc

ctg

tta

cct

Glu

Ser

Phe

Lys

Leu

Ser

Leu

Asp

Asn

Thr

Lys

Asp

Thr

Leu

Leu

Pro

805

810

815

2448

gat

gaa

gtt

tca

aca

ttg

agc

aaa

aag

gag

aaa

att

cct

ttg

cag

atg

Asp

Glu

Val

Ser

Thr

Leu

Ser

Lys

Lys

Glu

Lys

Ile

Pro

Leu

Gin

Met

820

825

830

2496

gag

gag

ctc

agt

act

gca

gtt

tat

tca

aat

gat

gac

tta

ttt

att

tct

Glu

Glu

Leu

Ser

Thr

Ala

Val

Tyr

Ser

Asn

Asp

Asp

Leu

Phe

Ile

Ser

835

840

845

2544

aag

gaa

gca

cag

ata

aga

gaa

act

gaa

acg

ttt

tca

gat

tca

tct cca

Lys

Glu

Ala

Gin

Ile

Arg

Glu

Thr

Glu

Thr

Phe

Ser

Asp

Ser

Ser Pro

850

855

860

2592

att

gaa

att

ata

gat

gag

ttc

cct

aca

ttg

atc

agt

tct

aaa

act

gat

Ile

Glu

Ile

Ile

Asp

Glu

Phe

Pro

Thr

Leu

Ile

Ser

Ser

Lys

Thr

Asp

865

870

875

880

2640

PL 210 720 B1

tca ttt tct

aaa tta gcc

agg gaa tat act gac

eta gaa gta tcc cac

2688

Ser Phe

Ser

Lys

Leu 885

Ala

Arg

Glu

Tyr

Thr 890

Asp

Leu Glu Val

Ser His 895

aaa agt

gaa

att

gct

aat

gcc

ccg

gat

gga

gct

ggg tca ttg

cct tgc

2736

Lys Ser

Glu

Ile

Ala

Asn

Ala

Pro

Asp

Gly

Ala

Gly Ser Leu

Pro Cys

900

905

910

aca gaa

ttg

ccc

cat

gac

ctt

tct

ttg

aag

aac

ata caa ccc

aaa gtt

2784

Thr Glu

Leu

Pro

His

Asp

Leu

Ser

Leu

Lys

Asn

Ile Gin Pro

Lys Val

915

920

925

gaa gag

aaa

atc

agt

ttc

tca

gat

gac

ttt

tct

aaa aat ggg

tct gct

2832

Glu Glu

Lys

Ile

Ser

Phe

Ser

Asp

Asp

Phe

Ser

Lys Asn Gly

Ser Ala

930

935

940

aca tca

aag

gtg

ctc

tta

ttg

cct

cca

gat

gtt

tct gct ttg

gcc act

2880

Thr Ser

Lys

Val

Leu

Leu

Leu

Pro

Pro

Asp

Val

Ser Ala Leu

Ala Thr

945

950

955

960

caa gca

gag

ata

gag

agc

ata

gtt

aaa

ccc

aaa

gtt ctt gtg

aaa gaa

2928

Gin Ala

Glu

Ile

Glu

Ser

Ile

Val

Lys

Pro

Lys

Val Leu Val

Lys Glu

965

970

975

gct gag

aaa

aaa

ctt

cct

tcc

gat

aca

gaa

aaa

gag gac aga

tca cca

2976

Ala Glu

Lys

Lys

Leu

Pro

Ser

Asp

Thr

Glu

Lys

Glu Asp Arg

Ser Pro

980

985

990

tct gct

ata

ttt

tca

gca

gag

ctg

agt aaa act tca gtt gtt gac ctc

3024

Ser Ala

Ile

Phe

Ser

Ala

Glu

Leu

Ser Lys Thr Ser Val Val Asp Leu

995 1000 1005 ctg tac tgg aga gac att aag aag act gga gtg gtg ttt ggt gcc 3069

Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala

1010 1015 1020

PL 210 720 B1

agc eta Ser Leu

ttc ctg ctg

ctt tca

ttg aca gta ttc agc

att gtg agc

3114

Phe

Leu

Leu

Leu

Ser 1030

Leu Thr

Val

Phe

Ser 1035

Ile

Val

Ser

1025

gta

aca

gee

tac

att

gee

ttg

gee

ctg

ctc

tct

gtg

acc

atc

agc

3159

Val

Thr

Ala

Tyr

Ile

Ala

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

Val

Thr

Ile

Ser

1040

1045

1050

ttt

agg

ata

tac

aag

ggt

gtg

atc

caa

gct

atc

cag

aaa

tca

gat

3204

Phe

Arg

Ile

Tyr

Lys

Gly

Val

Ile

Gin

Ala

Ile

Gin

Lys

Ser

Asp

1055

1060

1065

gaa

ggc

cac

cca

ttc

agg

gca

tat

ctg

gaa

tct

gaa

gtt

gct

ata

3249

Glu

Gly

His

Pro

Phe

Arg

Ala

Tyr

Leu

Glu

Ser

Glu

Val

Ala

Ile

1070

1075

1080

tct

gag

gag

ttg

gtt

cag

aag

tac

agt

aat

tct

gct

ctt

ggt

cat

3294

Ser

Glu

Glu

Leu

Val

Gin

Lys

Tyr

Ser

Asn

Ser

Ala

Leu

Gly

His

1085

1090

1095

gtg

aac

tgc

acg

ata

aag

gaa

ctc

agg

ege

ctc

ttc

tta

gtt

gat

3339

Val

Asn

cys

Thr

Ile

Lys

Glu

Leu

Arg

Arg

Leu

Phe

Leu

Val

Asp

1100

1105

1110

gat

tta

gtt

gat

tct

ctg

aag

ttt

gca

gtg

ttg

atg

tgg

gta

ttt

3384

Asp

Leu

Val

Asp

Ser

Leu

Lys

Phe

Ala

Val

Leu

Met

Trp

Val

Phe

1115

1120

1125

acc

tat

gtt

ggt

gee

ttg

ttt

aat

ggt

ctg

aca

eta

ctg

att

ttg

3429

Thr

Tyr

Val

Gly

Ala

Leu

Phe

Asn

Gly

Leu

Thr

Leu

Leu

Ile

Leu

1130

1135

1140

gct

ctc

att

tca

ctc

ttc

agt

gtt

cct

gtt

att

tat

gaa

cgg

cat

3474

Ala

Leu

Ile

Ser

Leu

Phe

Ser

Val

Pro

Val

Ile

Tyr

Glu

Arg

His

1145

1150

1155

PL 210 720 B1

cag gca

cag ata gat cat

tat Tyr 1165

eta gga Leu Gly

ctt gca aat

aag aat gtt

3519

Gin

Ala 1160

Gin Ile

Asp His

Leu Ala

Asn 1170

Lys

Asn Val

aaa

gat

gct

atg

gct

aaa

atc

caa

gca

aaa

atc

cct

gga

ttg

aag

3564

Lys

Asp

Ala

Met

Ala

Lys

Ile

Gin

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Lys

1175

1180

1185

cgc aaa gct gaa tga aaacgcccaa aataattagt aggagttcat ctttaaaggg 3619 Arg Lys Ala Glu

1190 gatattcatt tgattatacg ggggagggtc agggaagaac gaaccttgac gttgcagtgc 3679 agtttcacag atcgttgtta gatctttatt tttagccatg cactgttgtg aggaaaaatt 3739 acctgtcttg actgccatgt gttcatcatc ttaagtattg taagctgcta tgtatggatt 3799 taaaccgtaa tcatatcttt ttcctatctg aggcactggt ggaataaaaa acctgtatat 3859 tttactttgt tgcagatagt cttgccgcat cttggcaagt tgcagagatg gtggagctag 3919 <210> 5 <211> 1192 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

PL 210 720 B1

Met Glu Asp Leu Asp Gin Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro 15 10 15

Pro Arg Pro Gin Pro Ala Phe Lys iyr Gin Phe Val Arg Glu Pro Glu 20 25 30

Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp 35 40 45

Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser 50 55 60

Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp 65 70 75 80

Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95

Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gin Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro 100 105 110

Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val 115 120 125

Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro 130 135 140

PL 210 720 B1

Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gin Ala Glu Pro Val Trp Thr

145 150 155 160

Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro

165 170 175

Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu 180 185 190

Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp 195 200 205

Leu Lys Glu Gin Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gin Glu Asp Phe 210 215 220

Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro

225 230 235 240

Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser

245 250 255

Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gin Glu Asn Val Ser Glu Ala 260 265 270

Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp 275 280 285

PL 210 720 B1

Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe 290 295 300

Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn Pro Arg 305 310 315 320

Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser 325 330 335

Asn Asn Ile Leu His Asn Gin Gin Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys 340 345 350

Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser 355 360 365

Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr 370 375 380

Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys 385 390 395 400

Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu 405 410 415

Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu Gin Thr 420 425 430

PL 210 720 B1

PL 210 720 B1

PL 210 720 B1

PL 210 720 B1

Ile 865	Glu Ile	Ile	Asp Glu 870	Phe	Pro Thr Leu	Ile Ser Ser Lys Thr Asp
875	880
Ser	Phe Ser	Lys	Leu Ala	Arg	Glu Tyr Thr	Asp Leu Glu Val Ser	His
			885		890	895
Lys	Ser Glu	Ile	Ala Asn	Ala	Pro Asp Gly	Ala Gly Ser Leu Pro	Cys
		900			905	910
Thr	Glu Leu	Pro	His Asp	Leu	Ser Leu Lys	Asn Ile Gin Pro Lys	Val
	915				920	925
Glu	Glu Lys	Ile	Ser Phe	Ser	Asp Asp Phe	Ser Lys Asn Gly Ser	Ala
	930			935		940
Thr	Ser Lys	Val	Leu Leu	Leu	Pro Pro Asp	Val Ser Ala Leu Ala	Thr
945			950			955	960
Gin	Ala Glu	Ile	Glu Ser	Ile	Val Lys Pro	Lys Val Leu Val Lys	Glu
			965		970	975
Ala	Glu Lys	Lys	Leu Pro	Ser	Asp Thr Glu	Lys Glu Asp Arg Ser	Pro
		980			985	990
Ser	Ala Ile	Phe	Ser Ala	Glu	Leu Ser Lys Thr Ser Val Val Asp Leu
	995				1000	1005

PL 210 720 B1

Leu Tyr	Trp	Arg	Asp Ile	Lys 1015	Lys	Thr Gly Val Val 1020	Phe	Gly Ala
	1010
Ser	Leu	Phe	Leu	Leu Leu	Ser	Leu	Thr Val Phe Ser	Ile	Val Ser
	1025				1030		1035
Val	Thr	Ala	Tyr	Ile Ala	Leu	Ala	Leu Leu Ser Val	Thr	Ile Ser
	1040				1045		1050
Phe	Arg	Ile	Tyr	Lys Gly	Val	Ile	Gin Ala Ile Gin	Lys	Ser Asp
	1055				1060		1065
Glu	Gly	His	Pro	Phe Arg	Ala	Tyr	Leu Glu Ser Glu	Val	Ala Ile
	1070				1075		1080
Ser	Glu	Glu	Leu	Val Gin	Lys	Tyr	Ser Asn Ser Ala	Leu	Gly His
	1085				1090		1095
Val	Asn	Cys	Thr	Ile Lys	Glu	Leu	Arg Arg Leu Phe	Leu	Val Asp
	1100				1105		1110
Asp	Leu	Val	Asp	Ser Leu	Lys	Phe	Ala Val Leu Met	Trp	Val Phe
	1115				1120		1125
Thr	Tyr	Val	Gly	Ala Leu	Phe	Asn	Gly Leu Thr Leu	Leu	Ile Leu

1130 1135 1140

PL 210 720 B1

Ala

Leu

Ile

Ser

Leu

Phe

Ser

Val

Pro

Val

Ile

Tyr

Glu

Arg

His

1145

1150

1155

Gin

Ala

Gin

Ile

Asp

His

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ala

Asn

Lys

Asn

Val

1160

1165

1170

Lys

Asp

Ala

Met

Ala

Lys

Ile

Gin

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Lys

1175

1180

1185

Arg

Lys

Ala

Glu

1190

<210> β <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(18) <223> Ludzkie NogoA_623-640

PL 210 720 B1 <400> 6

Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu 15 10 15

Glu Ala <210> 7 <211> 819 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(819) <223> ludzkie Nig <400> 7

Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg 15 10 15

PL 210 720 B1

Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp Leu Lys Glu Gin Pro Gly Asn Thr Ile 20 25 30

Ser Ala Gly Gin Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala 35 40 45

Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His 50 55 60

Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu 65 70 75 80

Gin Glu Asn Val Ser Glu Ala Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys 85 90 95

Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr 100 105 110

Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala 115 120 125

Val Ile Val Ala Asn Pro Arg Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp 130 135 140

Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser Asn Asn Ile Leu His Asn Gin Gin Glu 145 150 155 160

PL 210 720 B1

Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser 165 170 175

Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu 180 185 190

Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val 195 200 205

Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly 210 215 220

Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe 225 230 235 240

Ala Asp Ser Leu Glu Gin Thr Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser 245 250 255

Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg 260 265 270

Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu 275 280 285

Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu 290 295 300

PL 210 720 B1

PL 210 720 B1

Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala 450 455

Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro 465 470

Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile 460

Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val 475 480

Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile 485

Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu 490 495

Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gin Glu 500

Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile 505 510

Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr 515 520

Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro 525

Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met 530 535

Ala Lys Val Glu Gin Pro Val Pro 540

Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp 545 550

Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val 555 560

Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile 565

Pro Asp Val Pro Gin Lys Gin Asp 570 575

Glu Thr Val Met Leu Val Lys Glu 580

Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu 585 590

PL 210 720 B1

Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro 595 600 605

Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn 610 615 620

Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys 625 630 635 640

Glu Lys Ile Pro Leu Gin Met Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser 645 650 655

Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser Lys Glu Ala Gin Ile Arg Glu Thr Glu 660 665 670

Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr 675 680 685

Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr 690 695 700

Thr Asp Leu Glu Val Ser His Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp 705 710 715 720

Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu 725 730 735

PL 210 720 B1

Lys Asn Ile Gin Pro Lys Val Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp 740 745 750

Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro 755 760 765

Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr Gin Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys 770 775 780

Pro Lys Val Leu Val Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr

785 790 795 800

Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser

805 810 815

Lys Thr Ser <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Mus tnusculus <220>

PL 210 720 B1 <221> WIĄZANIE <222> (1)..(10) <223> hyper-zmienne części ciężkiego łańucha 11C7 <400> 8

Gly Phe Asp Phe Arg Arg Asn Trp Met Ser

10 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221> WIĄZANIE <222> (1)..(17) <223> hyperzmienne części ciężkiego łańucha 11C7 <400> 9

PL 210 720 B1

Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 15 10 15

Asp <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221> WIĄZANIE <222> (1)..(9) <223> hyperzmienne części ciężkiego łańucha 11C7 <400> 10

Pro Val Trp Met Tyr Ala Met Asp Tyr

5 <210> 11

PL 210 720 B1 <211> 16 <212> PRT <213 > Mus musculus <220>

<221> WIĄZANIE <222> (1)..(16) <223> hyperzmienne części lekkiego łańcucha 11C7 <400> 11

Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 15 10 15 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

PL 210 720 B1 <221> WIĄZANIE <222> (1)..(7) <223> hyperzmienne części lekkiego łańcucha 11C7 <400> 12

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221> WIĄZANIE <222> (1)..(9) <223> hyperzmienne części lekkiego łańcucha 11C7 <400> 13

PL 210 720 B1

Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Gin Thr

5 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213 > Mus musculus <220>

<221> misc_wiązanie <222> (1) . . (30) <223> DNA-CDR1-11C7 <400> 14 ggattcgatt ttagaagaaa ttggatgagt 30 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus

PL 210 720 B1 <220>

<221> misc_wiązanie <222> (1)..(51) <223> DNA-CDR2-11C7 <400> 15 gaaattaatc cagatagcag taagataaac tatacgccat ctctaaagga t 51 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> misc_wiązanie <222> (1) . . (27) <223> DNA-CDR3-11C7

PL 210 720 B1 <400> 16 ccggtctgga tgtatgctat ggactac 27 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> misc_wiązanie <222> (1)..(48) <223> DNA-CDR'1-11C7 <400> 17 aagtcaagtc agagcctctt gcatagtgat ggaaagacat atttgaat 48 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213 > Mus musculus

PL 210 720 B1 <220>

<221> misc_wiązanie <222> (1)..(21) <223> DNA-CDR¹2-11C7 <400> 18 ctggtgtcta aactggactc t <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> misc_wiązanie <222> (1)..(27) <223> DNA-CDR'3-11C7

PL 210 720 B1 <400> 19 tggcaaggta cacattttcc tcagacg 27 <210> 20 <211> 54 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(54) <223> sekwencja liderową dla ciężkiego łańcucha 11C7 <400> 20 atg gat ttt ggg ctg att ttt ttt att gtt ggt ctt tta aaa ggg gtc 48

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val 15 10 15 cag tgt 54

Gin Cys <210> 21

PL 210 720 B1 <211> 18 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val ¹ 5 10 15

Gin Cys <210> 22 <211> 57 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(57) <223> sekwencja liderowa dla lekkiego łańcucha 11C7

PL 210 720 B1 <400> 22 atg agt cct gcc cag ttc ctg ttt ctg tta gtg ctc tgg att cgg gaa 48

Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu 15 10 15 acc agc ggt 57

Thr Ser Gly <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23

Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu 15 10 15

Thr Ser Gly <210> 24 <211> 181

PL 210 720 B1 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(181) <223> ludzkie Nig-D20 <400> 24

Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Met Asp Leu Val Gin. Thr Ser 15 10 15

Glu Val Met Gin Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gin Leu Cys Pro Ser 20 25 30

Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val 35 40 45

Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val 50 55 60

Ile Gin Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu 65 70 75 80

PL 210 720 B1

Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met 85 90 95

Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu 100 105 110

Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gin Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile 115 120 125

Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro 130 135 140

Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gin Pro 145 150 155 160

Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu 165 170 175

Pro Val Asp Leu Phe 180 <210> 25 <211> 3492 <212> DNA

PL 210 720 B1 <213> Rattus norvegicus <220>

<221> CDS <222> (1)..(3492)

<223> i

3zczurze

NogoA

<400> 25

atg

gaa

gac

ata

gac

cag

teg

teg

ctg

gtc

tcc

teg

tcc

acg

gac

agc

48

Met

Glu

Asp

Ile

Asp

Gin

Ser

Ser

Leu

Val

Ser

Ser

Ser

Thr

Asp

Ser

1

5

10

15

ccg

ccc

cgg

cct

ccg

ccc

gcc

ttc

aag

tac

cag

ttc

gtg

acg

gag

ccc

96

Pro

Pro

Arg

Pro

Pro

Pro

Ala

Phe

Lys

Tyr

Gin

Phe

Val

Thr

Glu

Pro

20

25

30

gag

gac

gag

gag

gac

gag

gag

gag

gag

gag

gac

gag

gag

gag

gac

gac

144

Glu

Asp

Glu

Glu

Asp

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Asp

Glu

Glu

Glu

Asp Asp

35

40

45

gag

gac

eta

gag

gaa

ctg

gag

gtg

ctg

gag

agg

aag

ccc

gca

gcc

ggg

192

Glu

Asp

Leu

Glu

Glu

Leu

Glu

Val

Leu

Glu

Arg

Lys

Pro

Ala

Ala

Gly

50

55

60

ctg

tcc

gca

gct

gcg

gtg

ccg

ccc

gcc

gcc

gcc

gcg

ccg

ctg

ctg

gac

240

Leu

Ser

Ala

Ala

Ala

Val

Pro

Pro

Ala

Ala

Ala

Ala

Pro

Leu

Leu

Asp

65

70

75

80

ttc

agc

agc

gac

teg

gtg

ccc

ccc

gcg

ccc

ege

ggg

ccg

ctg

ccg

gcc

288

PL 210 720 B1

Phe

Ser Ser Asp Ser 85

Val

Pro

Pro

Ala

Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala

90

95

gcg

ccc

cct

gcc

gct

cct

gag

agg

cag

cca

tcc

tgg

gaa

cgc

agc

ccc

Ala

Pro

Pro

Ala

Ala

Pro

Glu

Arg

Gin

Pro

Ser

Trp

Glu

Arg

Ser

Pro

100

105

110

gcg

gcg

ccc

gcg

cca

tcc

ctg

ccg

ccc

gct

gcc

gca

gtc

ctg

ccc

tcc

Ala

Ala

Pro

Ala

Pro

Ser

Leu

Pro

Pro

Ala

Ala

Ala

Val

Leu

Pro

Ser

115

120

125

aag

ctc

cca

gag

gac

gac

gag

cct

ccg

gcg

agg

ccc

ccg

cct

ccg

ccg

Lys

Leu

Pro

Glu

Asp Asp

Glu

Pro

Pro

Ala

Arg

Pro

Pro

Pro

Pro

Pro

130

135

140

cca

gcc

ggc

gcg

agc

ccc

ctg

gcg

gag

ccc

gcc

gcg

ccc

cct

tcc

acg

Pro

Ala

Gly

Ala

Ser

Pro

Leu

Ala

Glu

Pro

Ala

Ala

Pro

Pro

Ser

Thr

145

150

155

160

ccg

gcc

gcg

ccc

aag

cgc

agg

ggc

tcc

ggc

tea

gtg

gat

gag

acc

ctt

Pro

Ala

Ala

Pro

Lys

Arg Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

Val

Asp

Glu

Thr

Leu

165

170

175

ttt

gct

ctt

cct

gct

gca

tct

gag

cct

gtg

ata

ccc

tcc

tct

gca

gaa

Phe

Ala

Leu

Pro

Ala

Ala

Ser

Glu

Pro

Val

Ile

Pro

Ser

Ser

Ala

Glu

180

185

190

aaa

att

atg

gat

ttg

atg

gag

cag

cca

ggt

aac

act

gtt

tcg

tct

ggt

Lys

Ile

Met

Asp

Leu

Met

Glu

Gin

Pro

Gly

Asn

Thr

Val

Ser

Ser

Gly

195

200

205

caa

gag

gat

ttc

cca

tct

gtc

ctg

ctt

gaa

act

gct

gcc

tct

ctt

cct

Gin

Glu

Asp

Phe

Pro

Ser

Val

Leu

Leu

Glu

Thr

Ala

Ala

Ser

Leu

Pro

210

215

220

tct

eta

tct

cct

ctc

tea

act

gtt

tct

ttt

aaa

gaa

cat

gga

tac

ctt

PL 210 720 B1

Ser 225

Leu Ser Pro

Leu Ser Thr 230

Val

Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu

235

240

ggt

aac

tta

tca

gca

gtg

tca

tcc

tca

gaa

gga

aca

att

gaa

gaa

act

768

Gly

Asn

Leu

Ser

Ala

Val

Ser

Ser

Ser

Glu

Gly

Thr

Ile

Glu

Glu

Thr

245

250

255

tta

aat

gaa

gct

tct

aaa

gag

ttg

cca

gag

agg

gca

aca

aat

cca

ttt

816

Leu

Asn

Glu

Ala

Ser

Lys

Glu

Leu

Pro

Glu

Arg

Ala

Thr

Asn

Pro

Phe

260

265

270

gta

aat

aga

gat

tta

gca

gaa

ttt

tca

gaa

tta

gaa

tat

tca

gaa

atg

864

Val

Asn

Arg Asp

Leu

Ala

Glu

Phe

Ser

Glu

Leu

Glu

Tyr

Ser

Glu

Met

275

280

285

gga

tca

tct

ttt

aaa

ggc

tcc

cca

aaa

gga

gag

tca

gcc

ata

tta

gta

912

Gly

Ser

Ser

Phe

Lys

Gly

Ser

Pro

Lys

Gly

Glu

Ser

Ala

Ile

Leu

Val

290

295

300

gaa

aac

act

aag

gaa

gaa

gta

att

gtg

agg

agt

aaa

gac

aaa

gag

gat

960

Glu

Asn

Thr

Lys

Glu

Glu

Val

Ile

Val

Arg

Ser

Lys

Asp

Lys

Glu

Asp

305

310

315

320

tta

gtt

tgt

agt

gca

gcc

ctt

cac

agt

cca

caa

gaa

tca

cct

gtg

ggt

1008

Leu

Val

Cys

Ser

Ala

Ala

Leu

His

Ser

Pro

Gin

Glu

Ser

Pro

Val

Gly

325

330

335

aaa

gaa

gac

aga

gtt

gtg

tct

cca

gaa

aag

aca

atg

gac

att

ttt

aat

1056

Lys

Glu

Asp Arg

Val

Val

Ser

Pro

Glu

Lys

Thr

Met

Asp

Ile

Phe

Asn

340

345

350

gaa

atg

cag

atg

tca

gta

gta

gca

cct

gtg

agg

gaa

gag

tat

gca

gac

1104

Glu

Met

Gin

Met

Ser

Val

Val

Ala

Pro

Val

Arg

Glu

Glu

Tyr

Ala

Asp

355

360

365

ttt

aag

cca

ttt

gaa

caa

gca

tgg

gaa

gtg

aaa

gat

act

tat

gag

gga

1152

PL 210 720 B1

Phe

Lys 370

Pro

Phe

Glu

Gin

Ala 375

Trp

Glu

Val

Lys

Asp 380

Thr

Tyr

Glu

Gly

agt

agg gat

gtg

ctg

gct

gct

aga

gct

aat

gtg

gaa

agt

aaa

gtg

gac

1200

Ser 385

Arg Asp

Val

Leu

Ala 390

Ala

Arg

Ala

Asn

Val 395

Glu

Ser

Lys

Val

Asp 400

aga

aaa

tgc

ttg

gaa

gat

agc

ctg

gag

caa

aaa

agt

ctt

ggg

aag

gat

1248

Arg

Lys

Cys

Leu

Glu 405

Asp

Ser

Leu

Glu

Gin 410

Lys

Ser

Leu

Gly

Lys 415

Asp

agt

gaa

ggc

aga

aat

gag

gat

gct

tct

ttc

ccc

agt

acc

cca

gaa

cct

1296

Ser

Glu

Gly Arg 420

Asn

Glu

Asp

Ala

Ser 425

Phe

Pro

Ser

Thr

Pro 430

Glu

Pro

gtg

aag

gac

agc

tcc

aga

gca

tat

att

acc

tgt

gct

tcc

ttt

acc

tca

1344

Val

Lys

Asp 435

Ser

Ser

Arg

Ala

Tyr 440

Ile

Thr

Cys

Ala

Ser 445

Phe

Thr

Ser

gca

acc

gaa

agc

acc

aca

gca

aac

act

ttc

cct

ttg

tta

gaa

gat

cat

1392

Ala

Thr 450

Glu

Ser

Thr

Thr

Ala 455

Asn

Thr

Phe

Pro

Leu 460

Leu

Glu

Asp

His

act

tca

gaa

aat

aaa

aca

gat

gaa

aaa

aaa

ata

gaa

gaa

agg

aag

gcc

1440

Thr 465

Ser

Glu

Asn

Lys

Thr 470

Asp

Glu

Lys

Lys

Ile 475

Glu

Glu

Arg

Lys

Ala 480

caa

att

ata

aca

gag

aag

act

agc

ccc

aaa

acg

tca

aat

cct

ttc

ctt

1488

Gin

Ile

Ile

Thr

Glu 485

Lys

Thr

Ser

Pro

Lys 490

Thr

Ser

Asn

Pro

Phe 495

Leu

gta

gca

gta

cag

gat

tct

gag

gca

gat

tat

gtt

aca

aca

gat

acc

tta

1536

Val

Ala

Val

Gin 500

Asp

Ser

Glu

Ala

Asp 505

Tyr

Val

Thr

Thr

Asp 510

Thr

Leu

tca

aag

gtg

act

gag

gca

gca

gtg

tca

aac

atg

cct

gaa

ggt

ctg

acg

1584

PL 210 720 B1

Ser

Lys

Val 515

Thr

Glu

Ala

Ala

Val 520

Ser

Asn

Met

Pro

Glu 525

Gly

Leu

Thr

cca

gat

tta

gtt

cag

gaa

gca

tgt

gaa

agt

gaa

ctg

aat

gaa

gcc

aca

1632

Pro

Asp 530

Leu

Val

Gin

Glu

Ala 535

Cys

Glu

Ser

Glu

Leu 540

Asn

Glu

Ala

Thr

ggt

aca

aag

att

gct

tat

gaa

aca

aaa

gtg

gac

ttg

gtc

caa

aca

tca

1680

Gly 545

Thr

Lys

Ile

Ala

Tyr 550

Glu

Thr

Lys

Val

Asp 555

Leu

Val

Gin

Thr

Ser 560

gaa

gct

ata

caa

gaa

tca

ctt

tac

ccc

aca

gca

cag

ctt

tgc

cca

tca

1728

Glu

Ala

Ile

Gin

Glu 565

Ser

Leu

Tyr

Pro

Thr 570

Ala

Gin

Leu

Cys

Pro 575

Ser

ttt

gag

gaa

gct

gaa

gca

act

ccg

tca

cca

gtt

ttg

cct

gat

att

gtt

1776

Phe

Glu

Glu

Ala 580

Glu

Ala

Thr

Pro

Ser 585

Pro

Val

Leu

Pro

Asp 590

Ile

val

atg

gaa

gca

cca

tta

aat

tct

ctc

ctt

cca

agc

gct

ggt

gct

tct

gta

1824

Met

Glu

Ala 595

Pro

Leu

Asn

Ser

Leu 600

Leu

Pro

Ser

Ala

Gly 605

Ala

Ser

Val

gtg

cag

ccc

agt

gta

tcc

cca

ctg

gaa

gca

cct

cct

cca

gtt

agt

tat

1872

Val

Gin 610

Pro

Ser

Val

Ser

Pro 615

Leu

Glu

Ala

Pro

Pro 620

Pro

Val

Ser

Tyr

gac

agt

ata

aag

ctt

gag

cct

gaa

aac

ccc

cca

cca

tat

gaa

gaa

gcc

1920

Asp 625

Ser

Ile

Lys

Leu

Glu 630

Pro

Glu

Asn

Pro

Pro 635

Pro

Tyr

Glu

Glu

Ala 640

atg

aat

gta

gca

eta

aaa

gct

ttg

gga

aca

aag

gaa

gga

ata

aaa

gag

1968

Met

Asn

Val

Ala

Leu 645

Lys

Ala

Leu

Gly

Thr 650

Lys

Glu

Gly

Ile

Lys 655

Glu

cct

gaa

agt

ttt

aat

gca

gct

gtt

cag

gaa

aca

gaa

gct

cct

tat

ata

2016

PL 210 720 B1

Pro Glu Ser Phe

Asn Ala

Ala Val Gin Glu Thr 665

Glu

Ala Pro 670

Tyr

Ile

660

tcc

att

gcg

tgt

gat

tta

att

aaa

gaa

aca

aag

ctc

tcc

act

gag

cca

2064

Ser

Ile

Ala

Cys

Asp

Leu

Ile

Lys

Glu

Thr

Lys

Leu

Ser

Thr

Glu

Pro

675

680

685

agt

cca

gat

ttc

tct

aat

tat

tca

gaa

ata

gca

aaa

ttc

gag

aag

tcg

2112

Ser

Pro

Asp

Phe

Ser

Asn

Tyr

Ser

Glu

Ile

Ala

Lys

Phe

Glu

Lys

Ser

690

695

700

gtg

ccc

gaa

cac

gct

gag

eta

gtg

gag

gat

tcc

tca

cct

gaa

tct

gaa

2160

Val

Pro

Glu

His

Ala

Glu

Leu

Val

Glu

Asp

Ser

Ser

Pro

Glu

Ser

Glu

705

710

715

720

cca

gtt

gac

tta

ttt

agt

gat

gat

tcg

att

cct

gaa

gtc

cca

caa

aca

2208

Pro

Val

Asp

Leu

Phe

Ser

Asp Asp

Ser

Ile

Pro

Glu

Val

Pro

Gin

Thr

725

730

735

caa

gag

gag

gct

gtg

atg

ctc

atg

aag

gag

agt

ctc

act

gaa

gtg

tct

2256

Gin

Glu

Glu

Ala

Val

Met

Leu

Met

Lys

Glu

Ser

Leu

Thr

Glu

Val

Ser

740

745

750

gag

aca

gta

gcc

cag

cac

aaa

gag

gag

aga

ctt

agt

gcc

tca

cct

cag

2304

Glu

Thr

Val

Ala

Gin

His

Lys

Glu

Glu

Arg

Leu

Ser

Ala

Ser

Pro

Gin

755

760

765

gag

eta

gga

aag

cca

tat

tta

gag

tct

ttt

cag

ccc

aat

tta

cat

agt

2352

Glu

Leu

Gly

Lys

Pro

Tyr

Leu

Glu

Ser

Phe

Gin

Pro

Asn

Leu

His

Ser

770

775

780

aca

aaa

gat

gct

gca

tct

aat

gac

att

cca

aca

ttg

acc

aaa

aag

gag

2400

Thr

Lys

Asp

Ala

Ala

Ser

Asn

Asp

Ile

Pro

Thr

Leu

Thr

Lys

Lys

Glu

785

790

795

800

aaa

att

tct

ttg

caa

atg

gaa

gag

ttt

aat

act

gca

att

tat

tca

aat

2448

PL 210 720 B1

Lys

Ile

Ser

Leu

Gin 805

Met

Glu

Glu

Phe

Asn 810

Thr

Ala

Ile

Tyr

Ser 815

Asn

gat

gac

tta

ctt

tct

tct

aag

gaa

gac

aaa

ata

aaa

gaa

agt

gaa

aca

2496

Asp

Asp

Leu

Leu 820

Ser

Ser

Lys

Glu

Asp 825

Lys

Ile

Lys

Glu

Ser 830

Glu

Thr

ttt

tca

gat

tca

tct

ccg

att

gag

ata

ata

gat

gaa

ttt

ccc

acg

ttt

2544

Phe

Ser

Asp 835

Ser

Ser

Pro

Ile

Glu 840

Ile

Ile

Asp

Glu

Phe 845

Pro

Thr

Phe

gtc

agt

gct

aaa

gat

gat

tct

cct

aaa

tta

gcc

aag

gag

tac

act

gat

2592

Val

Ser 850

Ala

Lys

Asp Asp

Ser 855

Pro

Lys

Leu

Ala

Lys 860

Glu

Tyr

Thr

Asp

eta

gaa

gta

tcc

gac

aaa

agt

gaa

att

gct

aat

atc

caa

agc

ggg

gca

2640

Leu 865

Glu

Val

Ser

Asp

Lys 870

Ser

Glu

Ile

Ala

Asn 875

Ile

Gin

Ser

Gly

Ala 880

gat

tca

ttg

cct

tgc

tta

gaa

ttg

ccc

tgt

gac

ctt

tct

ttc

aag

aat

2688

Asp

Ser

Leu

Pro

Cys 885

Leu

Glu

Leu

Pro

Cys 890

Asp

Leu

Ser

Phe

Lys 895

Asn

ata

tat

cct

aaa

gat

gaa

gta

cat

gtt

tca

gat

gaa

ttc

tcc

gaa

aat

2736

Ile

Tyr

Pro

Lys 900

Asp

Glu

Val

His

Val 905

Ser

Asp

Glu

Phe

Ser 910

Glu

Asn

agg

tcc

agt

gta

tct

aag

gca

tcc

ata

teg

cct

tca

aat

gtc

tct

gct

2784

Arg

Ser

Ser 915

Val

Ser

Lys

Ala

Ser 920

Ile

Ser

Pro

Ser

Asn 925

Val

Ser

Ala

ttg

gaa

cct

cag

aca

gaa

atg

ggc

agc

ata

gtt

aaa

tcc

aaa

tca

ctt

2832

Leu

Glu 930

Pro

Gin

Thr

Glu

Met 935

Gly

Ser

Ile

Val

Lys 940

Ser

Lys

Ser

Leu

acg

aaa

gaa

gca

gag

aaa

aaa

ctt

cct

tct

gac

aca

gag

aaa

gag

gac

2880

PL 210 720 B1

Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp

945

950

955

960

aga

tcc

ctg

tca

gct

gta

ttg

tca

gca

gag

ctg

agt

aaa

act

tca

gtt

Arg

Ser

Leu

Ser

Ala

Val

Leu

Ser

Ala

Glu

Leu

Ser

Lys

Thr

Ser

Val

965

970

975

gtt

gac

ctc

ctc

tac

tgg

aga

gac

att

aag

aag

act

gga

gtg

gtg

ttt

Val

Asp

Leu

Leu

Tyr

Trp Arg Asp

Ile

Lys

Lys

Thr

Gly

Val

Val

Phe

980

985

990

ggt

gcc

agc

tta

ttc

ctg ctg ctg

tct

ctg

aca

gtg ttc

agc

att

gtc

3024

Gly

Ala

Ser

Leu

Phe

Leu Leu Leu

Ser

Leu

Thr

Val Phe

Ser

Ile

Val

995

1000

1005

agt Ser

gta Val 1010

acg Thr

gcc Ala

tac Tyr

att gcc Ile Ala 1015

ttg gcc ctg ctc teg

gtg act

atc Ile

3069

Leu Ala

Leu Leu

Ser 1020

Val

Thr

agc

ttt

agg

ata

tat

aag ggc

gtg atc

cag gct

atc

cag

aaa

tca

3114

Ser

Phe

Arg

Ile

Tyr

Lys Gly

Val Ile

Gin Ala

Ile

Gin

Lys

Ser

1025

1030

1035

gat

gaa

ggc

cac

cca

ttc agg

gca tat

tta gaa

tct

gaa

gtt

gct

3159

Asp

Glu

Gly

His

Pro

Phe Arg

Ala Tyr

Leu Glu

Ser

Glu

Val

Ala

1040

1045

1050

ata

tca

gag

gaa

ttg

gtt cag

aaa tac

agt aat

tct

gct

ctt

ggt

3204

Ile

Ser

Glu

Glu

Leu

Val Gin

Lys Tyr

Ser Asn

Ser

Ala

Leu

Gly

1055

1060

1065

cat

gtg

aac

agc

aca

ata aaa

gaa ctg

agg cgg

Ctt

ttc

tta

gtt

3249

His

Val

Asn

Ser

Thr

Ile Lys

Glu Leu

Arg Arg

Leu

Phe

Leu

Val

1070

1075

1080

gat

gat

tta

gtt

gat

tcc ctg

aag ttt

gca gtg

ttg

atg

tgg

gtg

3294

PL 210 720 B1

Asp

Asp 1085

Leu Val

Asp

Ser

Leu 1090

Lys Phe Ala

Val Leu 1095

Met

Trp Val

ttt

act

tat

gtt

ggt

gcc

ttg

ttc

aat

ggt

ctg

aca

eta

ctg

att

3339

Phe

Thr

Tyr

Val

Gly

Ala

Leu

Phe

Asn

Gly

Leu

Thr

Leu

Leu

Ile

1100

1105

1110

tta

gct

ctg

atc

tca

ctc

ttc

agt

att

cct

gtt

att

tat

gaa

cgg

3384

Leu

Ala

Leu

Ile

Ser

Leu

Phe

Ser

Ile

Pro

Val

Ile

Tyr

Glu

Arg

1115

1120

1125

cat

cag

gtg

cag

ata

gat

cat

tat

eta

gga

ctt

gca

aac

aag

agt

3429

His

Gin

Val

Gin

Ile

Asp

His

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ala

Asn

Lys

Ser

1130

1135

1140

gtt

aag

gat

gcc

atg

gcc

aaa

atc

caa

gca

aaa

atc

cct

gga

ttg

3474

Val

Lys

Asp

Ala

Met

Ala

Lys

Ile

Gin

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

1145

1150

1155

aag

cgc

aaa

gca

gat

tga

3492

Lys

Arg

Lys

Ala

Asp

1160 <210> 26 <211> 1163 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 26

PL 210 720 B1

Met Glu Asp Ile Asp Gin Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser 15 10 15

Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gin Phe Val Thr Glu Pro 20 25 30

Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp 35 40 45

Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly 50 55 60

Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp 65 70 75 80

Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95

Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gin Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro 100 105 110

Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser 115 120 125

Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro 130 135 140

Pro

Pro

Pro

PL 210 720 B1

Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr 145 150 155 160

Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu 165 170 175

Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu 180 185 190

Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gin Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly 195 200 205

Gin Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro 210 215 220

Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu 225 230 235 240

Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr 245 250 255

Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe 260 265 270

Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met 275 280 285

PL 210 720 B1

Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val 290 295 300

Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp 305 310 315 320

Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gin Glu Ser Pro Val Gly 325 330 335

Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn 340 345 350

Glu Met Gin Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp 355 360 365

Phe Lys Pro Phe Glu Gin Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly 370 375 380

Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp 385 390 395 400

Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gin Lys Ser Leu Gly Lys Asp 405 410 415

Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro 420 425 430

PL 210 720 B1

Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser 435 440 445

Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His 450 455 460

Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala

465 470 475 480

Gin Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu

485 490 495

Val Ala Val Gin Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu 500 505 510

Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr 515 520 525

Pro Asp Leu Val Gin Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr 530 535 540

Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gin Thr Ser

545 550 555 560

Glu Ala Ile Gin Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gin Leu Cys Pro Ser

565 570 575

PL 210 720 B1

Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val 580 585 590

Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val 595 600 605

Val Gin Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr 610 615 620

Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala 625 630 635 640

Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu 645 650 655

Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gin Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile 660 665 670

Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro 675 680 685

Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser 690 695 700

Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu 705 710 715 720

PL 210 720 B1

PL 210 720 B1

Leu 865	Glu	Val Ser Asp	Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gin Ser Gly Ala
870	875	880
Asp	Ser	Leu Pro Cys 885	Leu	Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys 890 895	Asn
Ile	Tyr	Pro Lys Asp 900	Glu	Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu 905 910	Asn
Arg	Ser	Ser Val Ser 915	Lys	Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser 920 925	Ala
Leu	Glu 930	Pro Gin Thr	Glu	Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser 935 940	Leu
Thr 945	Lys	Glu Ala Glu	Lys 950	Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu 955	Asp 960
Arg	Ser	Leu Ser Ala 965	Val	Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser 970 975	Val
Val	Asp	Leu Leu Tyr 980	Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val 985 990	Phe
Gly	Ala	Ser Leu Phe 995	Leu	Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val 1000 1005

PL 210 720 B1

Ser Val

Thr

Ala Tyr

Ile Ala 1015

Leu

Ala Leu Leu

Ser 1020

Val Thr

Ile

1010

Ser

Phe

Arg

Ile

Tyr

Lys

Gly

Val

Ile

Gin

Ala

Ile

Gin

Lys

Ser

1025

1030

1035

Asp

Glu

Gly

His

Pro

Phe

Arg

Ala

Tyr

Leu

Glu

Ser

Glu

Val

Ala

1040

1045

1050

Ile

Ser

Glu

Glu

Leu

Val

Gin

Lys

Tyr

Ser

Asn

Ser

Ala

Leu

Gly

1055

1060

1065

His

Val

Asn

Ser

Thr

Ile

Lys

Glu

Leu

Arg Arg

Leu

Phe

Leu

Val

1070

1075

1080

Asp

Asp

Leu

Val

Asp

Ser

Leu

Lys

Phe

Ala

Val

Leu

Met

Trp

Val

1085

1090

1095

Phe

Thr

Tyr

Val

Gly

Ala

Leu

Phe

Asn

Gly

Leu

Thr

Leu

Leu

Ile

1100

1105

1110

Leu

Ala

Leu

Ile

Ser

Leu

Phe

Ser

Ile

Pro

Val

Ile

Tyr

Glu

Arg

1115

1120

1125

His

Gin

Val

Gin

Ile

Asp

His

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ala

Asn

Lys

Ser

1130

1135

1140

PL 210 720 B1

Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gin Ala Lys Ile Pro Gly Leu 1145 1150 1155

Lys Arg Lys Ala Asp 1160 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(25) <223> szczurzy PEP4 <400> 27

Glu Glu Leu Val Gin Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn 15 10 15

Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu 20 25

PL 210 720 B1 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd bogaty w reszty PRO/SER <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(17) <223> Peptyd syntetyczny <400> 28

Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Pro 15 10 15

Ser

PL 210 720 B1 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> CA-NA-2F <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1)..(25) <223> starter CA-NA-2F <400> 29 aagcaccatt gaattctgca gttcc 25 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 210 720 B1 <220>

<223> CA-NA-3R <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1)..(28) <223>

<400> 30 aactgcagta ctgagctcct ccatctgc 28 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> zgodny 5' <220>

PL 210 720 B1 <221> starter_wiązanie <222> (1)..(33) <223> starter zgodny <400> 31 gtcgcggatc catggagacc ctttttgctc ttc 33 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> odwrotny 5' <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1) . . (27) <223> starter odwrotny

PL 210 720 B1 <400> 32 gttctcgagt tatgaagttt tactcag 27 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> zgodny 5'-l <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1)..(29) <223> starter <400> 33 gtgcggatcc atggatttga aggagcagc 29 <210> 34 <211> 28

PL 210 720 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> odwrotny 5'-l <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1)..(28) <223 > starter <400> 34 gtttctcgag tgaagtttta ttcagctc 28 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

PL 210 720 B1 <223> 5' starter <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1) . . (20) <223> starter <400> 35 tccaccccgg ccgcgcccaa 20 <210> 36 <211> 22 <212> DNA.

<213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> 5' starter 2 <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1)..(22)

PL 210 720 B1 <223> starter <400> 36 aatgatgggc aaagctgtgc tg 22 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> 3' starter <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1) . . (24) <223> starter <400> 37 ggtacaaaga ttgcttatga aaca 24

PL 210 720 B1 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> 3' starter 2 <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1) . . (22) <223> starter <400> 38 agcagggcca aggcaatgta gg 22 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 210 720 B1 <220>

<223> lider 5'-VL <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1)..(28) <223> starter <400> 39 aatatgagtc ctgcccagtt cctgtttc 28 <210> 40 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> 3 '-Ck <220>

PL 210 720 B1 <221> starter_wiązanie <222> (1)..(32) <223> starter <400> 40 ttaggaattc ctaacactct cccctgttga ag 32 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223 > lider 5'-VH <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1)..(31) <223> starter

PL 210 720 B1 <400> 41 aatatggatt ttgggctgat tttttttatt g 31 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223 > zakręt 3'-CH <220>

<221> starter_wiązanie <222> (1) . . (24) <223> starter <400> 42 aattgggcaa cgttgcaggt gacg 24 <210> 43 <211> 663

PL 210 720 B1 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> misc_wiązanie <222> (1)..(663) <223> DNA zmienne części ciężkiego łańucha 11C7 <400> 43

atggattttg	ggctgatttt	ttttattgtt	ggtcttttaa	aaggggtcca	gtgtgaggtg	60
aagcttctcg	agtctggagg	tggcctggtg	cagcctggag	gatccctgaa	actctcctgt	120
gtagtctcag	gattcgattt	tagaagaaat	tggatgagtt	gggtccggca	ggctcctggg	180
aaagggctag	aatggattgg	agaaattaat	ccagatagca	gtaagataaa	ctatacgcca	240
tctctaaagg	ataaattcat	catctccaga	gacaatgcca	agaatacgct	gtacctgcaa	300
gtgagcacag	tgagatctga	ggacacagcc	ctttattact	gtgtgagacc	ggtctggatg	360
tatgctatgg	actactgggg	tcaaggaacc	tcagtcaccg	tctcctcagc	caaaacgaca	420
cccccatctg	tctatccact	ggcccctgga	tctgctgccc	aaactaactc	catggtgacc	480
ctgggatgcc	tggtcaaggg	ctatttccct	gagccagtga	cagtgacctg	gaactctgga	540
tccctgtcca	gcggtgtgca	caccttccca	gctgtcctgc	agtctgacct	ctacactctg	600

PL 210 720 B1

agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc	tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt	660
gcc <210> 44 <211> 717 <212> DNA. <213> Mus musculus <220> <221> misc wiązanie <222> (1)..(717) <223> zmienne części lekkiego łańcucha 11C7	663
<400> 44
atgagtcctg cccagttcct gtttctgtta	gtgctctgga ttcgggaaac cagcggtgat	60
gttctgttga cccagactcc tctcactttg	tcgataacca ttggacaacc agcctccatc	120
tcttgcaagt caagtcagag cctcttgcat	agtgatggaa agacatattt gaattggttg	180
ttacagaggc caggccagtc tccaaagcgc	ctaatctatc tggtgtctaa actggactct	240
ggagtccctg acaggttcac tggcagtgga	tcagggacgg atttcacact gaaaatcagc	300

PL 210 720 B1 agagtggagg ctgaggattt gggactttat tattgctggc aaggtacaca ttttcctcag 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtec tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggggaga gtgttag 717

Claims (10)

1. Chimeryczne lub humanizowane przeciwciał o monoklonalne lub jego fragmenty F(ab')2 lub Fab, przeciwciało jednołańcuchowe lub przeciwciało pojedynczej domeny zdolne do wiązania się z ludzkim polipeptydem NogoA_623-640 (SEQ ID NO: 6), które posiada co najmniej jedno miejsce wiążące antygen zawierające w sekwencji hiper-zmienne regiony CDR1-:11C7 (SEQ ID NO: 8), CDR2-1C7 (SEQ ID NO: 9) i CDR3-11C7 (SEQ ID NO: 10); oraz w sekwencji hiper-zmienne regiony CDR1'-11C7 (SEQ ID NO: 11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO: 12) i CDR3'-11C7 (SEQ ID NO: 13).

2. Przeciwciało lub jego fragment według zastrzeżenia 1, znamienne tym, że ponadto zawiera stałą część ludzkiego łańcucha ciężkiego i stałą część ludzkiego łańcucha lekkiego.

3. Przeciwciało lub jego fragment według zastrzeżenia 2, znamienne tym, że stała część ludzkiego łańcucha ciężkiego jest typu γ4, a stała część ludzkiego łańcucha lekkiego jest typu κ.

4. Polinukleotyd zawierający polinukleotydy kodujące przeciwciało lub jego fragment określony w jednym z zastrzeż e ń od 1 do 3.

5. Wektor ekspresyjny zawierający polinukleotydy określone w zastrzeżeniu 4.

6. Układ ekspresyjny zawierający polinukleotyd okreś lony w zastrzeżeniu 4 lub wektor określony w zastrzeżeniu 5, przy czym układ ekspresyjny lub jego część jest zdolna do wytwarzania polipeptydu określonego w jednym z zastrzeżeń od 1 do 3, gdzie układ ekspresyjny lub jego część jest obecna w kompatybilnej komórce gospodarza.

7. Izolowana komórka gospodarza zawierająca układ ekspresyjny określony w zastrzeżeniu 6.

8. Zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentu określonego w jednym z zastrzeż eń od 1 do 3 jako środka farmaceutycznego.

9. Zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentu określonego w jednym z zastrzeż eń od 1 do 3 do wytwarzania leku do leczenia obejmującego naprawę nerwu.

10. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało lub jego fragment określony w jednym z zastrzeżeń od 1 do 3 w połączeniu z przynajmniej jednym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.