PL210783B1 - Wyrób wszczepialny do naprawy chrząstki - Google Patents

Description

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wyrób wszczepialny do naprawy chrząstki. Niniejszy wynalazek należy do dziedziny transplantacji chondrocytów, przeszczepiania kości i chrząstki, gojenia, regeneracji stawu i zapobiegania patologiom stawów. W szczególności w wynalazku ujawniono sposoby przygotowywania miejsca przeszczepu, przyrządów służących do takiego przygotowania i do autologicznej transplantacji komórek do wytworzonego miejsca przeszczepu.

Stan techniki

Co roku w Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej przeprowadza się ponad 500000 zabiegów plastyki stawów i całkowitej wymiany stawu. W przybliżeniu taką samą liczbę podobnych zabiegów przeprowadza się w Europie. Te liczby obejmują około 90000 zabiegów całkowitej wymiany stawu kolanowego i około 50000 zabiegów naprawy defektów stawu kolanowego, na rok w Europie. Liczba zabiegów jest w istocie taka sama w Stanów Zjednoczonych Ameryki (w: Praemer A., Furner S., Rice, D. P., Musculoskeletal conditions in the United States, American Academy of Ortopaedic Surgeons, Park Ridge, HI., 1992, 125). Najbardziej przydatny byłby sposób leczenia regeneracyjnego chrząstki, i mógłby być przeprowadzony we wcześniejszym stadium uszkodzenia stawu, zmniejszając w ten sposób liczbę pacjentów wymagają cych operacji wstawienia sztucznego stawu. Dzię ki takim zapobiegawczym metodom leczenia, zmniejszyłaby się także liczba pacjentów, u których rozwija się zapalenie kości i stawów.

W technikach stosowanych do odnowy powierzchni chrząstki stawowej podejmowano głównie próby indukowania naprawy chrząstki stosując wiercenie podchrząstkowe, abrazję i inne metody, w których wycina się chorą chrząstkę i kość podchrząstkową, pozostawiając odsłoniętą unaczynioną kość gąbczastą (Insall, I, Clin. Ortop. 1974, 101, 61; Ficat R. P. i in., Clin Ortop. 1979,-144, 74; Johnson L. L., In: Operative Arthroscopy, McGinty J. B., Ed., Raven Press, Nowy York, 1991, 341).

Coon i Cahn (Science 1966, 153, 1116) opisali technikę hodowania chrząstki syntetyzującej komórki z somitów zarodków kurcząt. Później, Cahn i Lasher (PNAS USA 1967, 58,1131) stosowali system do analizy zaangażowania syntezy DNA jako wstępnego warunku różnicowania chrząstki. Chondrocyty reagują wzrostem zarówno na EFG jak i FGF (Gospodarowicz i Mescher, J. Cell Physiology 1977, 93, 117), lecz ostatecznie tracą swoje zróżnicowane funkcje (Benya i in.. Cell 1978, 15, 1313). Metody hodowania chondrocytów opisał i głównie stosuje z niewielkimi zamianami, Brittberg, M. i in. (New Engl. J. Med. 1994, 331, 889). Komórki hodowane z zastosowaniem tych metod stosowano jako autologiczne przeszczepy do stawów kolanowych pacjentów. Ponadto, Kolettas i in. (J. Cell Science 1995, 108, 1991) badali ekspresję cząsteczek specyficznych dla chrząstki takich jak kolageny i proteoglikany w warunkach przedłużonego hodowania komórek. Ci autorzy stwierdzili, że pomimo występowania zmian morfologicznych podczas hodowania w hodowlach jednowarstwowych (Aulthouse, A. i in., In Vitro Cell Dev. Biol., 1989, 25, 659; Archer, C. i in., J. Cell Sci. 1990, 97, 361; Hanselmann, H. i in., J. Cell Sci. 1994, 107, 17; Bonaventure, J. i in., Exp. Cell Res. 1994, 212, 97), w porównaniu z hodowlami w zawiesinie hodowanymi na żelach agarozowych, kulkach alginianowych lub jako hodowle obrotowe (utrzymujące okrągłą morfologię komórek), badane przez różnych naukowców, nie zmieniały się markery ulegające ekspresji na chondrocytach, takie jak kolageny typu II i IX i duże proteoglikany występujące w agregatach, agrekan, wersykan i białko łączące nie zmieniły się (Kolettas, E. i in., J. Cell Science 1995, 108, 1991).

Chondrocyty stawów są wyspecjalizowanymi komórkami pochodzenia mezenchymalnego występującymi wyłącznie w chrząstce. Chrząstka jest beznaczyniową tkanką, której właściwości fizyczne zależą od macierzy pozakomórkowej wytwarzanej przez chondrocyty. Podczas kostnienia śródchrzęstnego chondrocyty ulegają dojrzewaniu co prowadzi do przerostu komórek, charakteryzującego się zapoczątkowaniem ekspresji kolagenu typu X (Upholt, W. B. i Olsen, R. R., In: Cartilage Molecular Aspects (Wyd. Hall, B & Newman, S) CRC BocaRaton 1991, 43; Reichenberger, E. i in.. Dev. Biol. 1991, 148, 562; Kirsch, T. i in. Differentiation, 1992, 52, 89; Stefens, M. i in., J. Cell Sci. 1993, 103, 1111).

Nadmierna degradacja kolagenu typu II w zewnętrznych warstwach lub powierzchniach stawowych stawów jest także spowodowana zapaleniem kości i stawów. Zgodnie z tym sieć kolagenu jest osłabiana i następnie wywołuje tworzenie się włókienek, dzięki czemu substancje macierzy takie jak proteoglikany są tracone i w końcu całkowicie przemieszczone. Takie tworzenie się włókienek w osłabionej chrząstce w zapaleniu kości i stawów może sięgnąć aż do zwapniałej chrząstki i do kości podchrząstkowej (Kempson, G. E. i in., Biochim. Biophys. Acta 1976, 428, 741; Roth, V. i Mow, V. C.,

PL 210 783 B1

J. Bone Joint Surgery, 1980, 62A, 1102; Woo, S. L.-Y. i in., in Handbook of Bioengineering (R. Skalak i S. Chien wyd.), McGraw-Hill, Nowy York, 1987, str. 4,1-4,44).

Opisy podstawowego rozwoju, histologicznej i mikroskopowej anatomii kości, chrząstki i innych takich tkanek łącznych można znaleźć np. w: Wheater, Burkitt i Daniels, Functional Histology, wydanie 2, (Churchill Livingstone, London, 1987, Rozdział 4). Opisy podstawowej anatomii histologicznej defektów w kości, chrząstce i innych tkankach łącznych można znaleźć np. w: Wheater, Burkitt, Stevens i Lowe, Basic Histopathology (Churchill Livingstone, London, 1985, Rozdział 21).

Pomimo postępów w hodowaniu chondrocytów, i manipulowaniu kością i chrząstką, nie osiągnięto znacznego powodzenia w próbach przeszczepiania chrząstki lub chondrocytów w celu naprawy uszkodzonych powierzchni stawowych. Wskazówki według wynalazku zapewniają skuteczne i efektywne środki wspomagania transplantacji chrząstki i/lub chondrocytów do miejsca uszkodzenia w połączeniu stawowym lub innej pokrytej chrząstką powierzchni kości, dzięki czemu chrząstka zostaje zregenerowana powodując naprawę uszkodzenia. W wynalazku przedstawiono także przyrządy chirurgiczne, które zaprojektowano w celu przygotowania miejsca przeszczepu tak, aby ułatwić efektywną integrację przeszczepianego materiału z miejscem przeszczepu.

Przedmiotem wynalazku wyrób wszczepialny do naprawy chrząstki metodą implantacji u zwierzęcia, charakteryzujący się tym, że zawiera kolagenową macierz nośnikową, komórki chrzestne i spoiwo biokompatybilne przylegające do brzegu wymienionej macierzy noś nikowej.

Wymienione powyżej komórki chrzestne i spoiwo biokompatybilne są mieszane homogennie albo nie-homogennie lub są nanoszone naprzemiennie w jednej lub wielu warstwach na macierz nośnikową, przy czym wymienione komórki chrzestne i wymienione spoiwo biokompatybilne występują w postaci mieszanki.

Wymieniona macierz nośnikowa, korzystnie jest elementem w kształcie arkusza zdolnym do podtrzymywania wzrostu komórek chrzestnych i do zapewnienia wyrobowi wszczepialnemu i fizycznej integralności aby ułatwić manipulację nim.

W innym korzystnym rozwią zaniu wymieniona macierz noś nikowa zawiera polipeptydy lub biał ka, który to wymieniony kolagen korzystnie jest wybrany spośród grupy składającej się zasadniczo z kolagenu końskiego, świńskiego, wołowego, owczego i kurzego.

W wyrobie wszczepialnym według wynalazku, wymieniona macierz nośnikowa jest korzystnie w stanie stałym, lub ewentualnie tak że korzystnie wymieniona macierz noś nikowa jest żelopodobna.

W nastę pnej korzystnej realizacji wynalazku wymieniony kolagen jest kolagenem typu I, lub ewentualnie jest kolagenem typu II.

Wyrób wszczepialny według wynalazku korzystnie jest odwracalnie podatny na odkształcenie.

Wymieniona macierz nośnikowa w wyrobie wszczepialnym według wynalazku ma szorstką stronę. W bardziej korzystnym wykonaniu szorstka strona jest porowata.

Jest także możliwy wyrób wszczepialny według wynalazku, w którym wymieniona macierz nośnikowa ma gładką stronę, lub również korzystnie macierz nośnikowa ma szorstką i gładką stronę.

W pewnym rozwią zaniu, noś nik moż e być wchł aniany przez organizm zwierzę cia.

Wyrób wszczepialny do naprawy chrząstki pozwala na realizację metody skutecznego leczenia chrząstki pokrywającej połączenie stawowe metodą transplantacji chondrocytów, w odpowiedniej macierzy, na powierzchnię, która ma być leczona, z barierą hemostatyczną i bezkomórkowym opatrunkiem pokrywającym, obejmujący: najpierw umieszczenie bariery hemostatycznej proksymalnie do powierzchni, która ma być leczona, umieszczenie chondrocytów w odpowiedniej macierzy na powierzchni, która ma być leczona, dystalnie do bariery hemostatycznej, pokrywanie powierzchni, która ma być leczona bezkomórkowym opatrunkiem pokrywającym. Bariera hemostatyczną, jak będzie następnie opisane poniżej, oznacza barierę, która hamuje penetrację komórek i tkanki unaczyniającej do przeszczepianego materiału. W szczególności, metoda ta zapewnia barierę hemostatyczną, która jest wchłanialnym, półprzepuszczalnym materiałem, który hamuje lub uniemożliwia naciekanie naczyń poprzez barierę. W jednym rozwiązaniu bariera hemostatyczna zawiera kolagen. Pojęcie bezkomórkowy stosuje się w tym opisie jak w dziedzinie, i oznacza materiał, który jest w znacznym stopniu wolny od nienaruszonych komórek, które są zdolne do następnych podziałów komórkowych, rozprzestrzeniania się lub aktywności biologicznej. Bezkomórkowy materiał może być wolny od jakichkolwiek nienaruszonych komórek jądrzastych. W jednym rozwiązaniu, niniejsza metoda obejmuje zastosowanie bezkomórkowego opatrunku pokrywającego, który zawiera półprzepuszczalną macierz kolagenową. W pewnej odmianie metody leczenia, porowata powierzchnia bezkomórkowego opatrunku pokrywającego jest skierowana do wszczepianego materiału.

PL 210 783 B1

W niniejszym opisie ujawnia się również autologiczną transplantację kolagenu lub chondrocytów do miejsca przeszczepu, w której miejsce przeszczepu najpierw wytworzono metodą manipulacji chirurgicznej w celu lepszego przyjęcia się przeszczepianego materiału. Miejsce przeszczepu powinno być tak wyrzeźbione, aby ścianki miejsca przeszczepu były ukształtowane w sposób falisty tak, aby przeszczepiany materiał, po umieszczeniu w miejscu przeszczepu i rozłożony tak, aby wszedł w kontakt ze ścianką miejsca przeszczepu, był oporny na usunięcie lub wydalenie całego przeszczepu z miejsca przeszczepu. Omawianą transplantację autologiczną kolagenu realizuje się za pomocą przyrządów chirurgicznych zaprojektowanych w celu rzeźbienia miejsca przeszczepu.

Do transplantacji chrząstki i/lub chondrocytów na powierzchnię połączenia stawowego użyteczny jest zestaw zawierający barierę hemostatyczną, bezkomórkowy półprzepuszczalny opatrunek pokrywający i klej organiczny. Zestaw może ewentualnie dodatkowo zawierać jeden lub więcej przyrządów chirurgicznych, które można stosować do rzeźbienia miejsca przeszczepu zgodnie z metodami podanymi w niniejszym opisie.

Krótki opis rysunku

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania jest uwidoczniony na rysunku na którym:

Fig. 1A przedstawia typowy koniec stawowy kości. Typowo, materiał kostny jest pokryty na powierzchni stawowej kapturkiem chrzestnym (zaznaczonym przez kreskowanie).

Fig. 1B pokazuje przykład występowania ubytku lub uszkodzenia kapturka chrzestnego (przerwa w kreskowaniu), i takie uszkodzenie można bezpośrednio leczyć, lekko powiększyć lub wyrzeźbić, w celu przyję cia się przeszczepianego materiał u, metodami chirurgicznymi przed leczeniem.

Fig. 1C pokazuje jak umieszcza się barierę hemostatyczną (obszar zaczerniony, oznaczony cyfrą 1) w obrębie uszkodzenia i w kapturku chrzestnym w celu hamowania lub zapobiegania unaczynieniu regenerującej chrząstki, z niżej leżącej kości. Następnie chondrocyty, które mają być implantowane do jamy ubytku rozprowadza się w postaci warstwy na szczycie bariery hemostatycznej.

Fig. 2 jest rysunkiem przedstawiającym potraktowany ubytek (przerwa w kreskowanej powierzchni) w kapturku chrzestnym (powierzchnia kreskowana) pokryty bezkomórkowym półprzepuszczalnym materiałem (obszar zaczerniony, oznaczony cyfrą 2), który stosuje się w celu wytworzenia kapturka/opatrunku lub bandaża na miejscu ubytku. Ten kapturek umocowuje się na miejscu, albo przyszywa się do brzegu jamy do zdrowej chrząstki, lub zamocowuje w inny sposób. Kapturek ten pokrywa powierzchnię ubytku stawu, w którym umieszczono klej i hodowany przeszczep chondrocytów/chrząstki.

Fig. 3A jest diagramem ilustrującym różnicową odpowiedź na siły ściskania i ścinania przez twardszą i miększą chrząstkę z późniejszą strefą demarkacji.

Fig. 3B ilustruje miejsce przeszczepu, po wyrzeźbieniu ubytku tak aby miał faliste ścianki.

Fig. 3C ilustruje wyrzeźbione miejsce przeszczepu z barierą hemostatyczną 1, przeszczepianym materiałem 3 i bezkomórkowym opatrunkiem pokrywającym 2 na miejscu w obrębie chrząstki powierzchni stawowej 4.

Fig. 4A ilustruje jedno rozwiązanie przyrządu chirurgicznego przedstawiając zęby tnące 5 i wystający kołek umieszczający 6.

Fig. 43 ilustruje drugie rozwiązanie przyrządu chirurgicznego.

Fig. 5 jest diagramem ilustrującym zmodyfikowaną odpowiedź różnicową na siły ściskania i ścinania przez twardszą chrząstkę i miększą chrząstkę po rzeźbieniu miejsca przeszczepu.

Fig. 6A jest obrazem MRI stawu kolanowego świni przedstawiającym ubytek chrząstki w lewym (przyśrodkowym) kłykciu.

Fig. 6B jest obrazem MRI tego samego stawu kolanowego świni trzy miesiące po leczeniu.

Fig. 7 ilustruje miejsce przeszczepu lub ubytek 23 bez bariery hemostatycznej, obejmujące mieszaninę przeszczepianych komórek 21 i biokompatybilny klej 22 na macierzy nośnikowej 18 posiadającej stronę porowatą, materiał chrzestny i powierzchnię rozdziału przeszczepianego materiału 30, chrząstkę 10, powierzchnię rozdziału materiału kostnego i materiału chrzestnego 12, wchłanialny kołek 24 i materiał kostny 14.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek dotyczy wyrobu wszczepialnego do naprawy chrząstki, który to wyrób zawiara w sobie produkty, które hamują powstawanie tkanki naczyniowej, na przykład takiej jak pętle naczyń włosowatych wyrastające do tworzącej się chrząstki, podczas procesu transplantacji autologicznej chondrocytów do ubytków w chrząstce. Powstawanie tkanki naczyniowej z leżącej poniżej kości będzie

PL 210 783 B1 mieć tendencję do rzutowania się do nowej, mającej się wytworzyć chrząstki, prowadząc do pojawienia się komórek innych niż pożądane mezenchymalne wyspecjalizowane chondrocyty.

Zanieczyszczające komórki wprowadzone przez unaczynienie mogą zapoczątkować wkroczenie i nadmierny wzrost implantowanych chondrocytów do chrząstki, która ma się wytworzyć. Jednym z typów produktów handlowych, które można stosować w wyrobie według wynalazku jest Surgicel® (Ethicon Ltd., UK), który może się wchłonąć po okresie 7-14 dni. Zastosowanie tej substancji w sposobie według wynalazku jest przeciwne do normalnego zastosowania przyrządu hemostatycznego, takiego jak Surgicel® jak opisano w ulotce firmy Ethicon Ltd.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że w sytuacji, gdy pożądane jest hamowanie ponownego unaczynienia chrząstki, materiał hemostatyczny będzie działać jak żelopodobny sztuczny koagulat. Jeśli krwinki czerwone pojawią się w obrębie pełnej grubości ubytku chrząstki stawowej nakrytej taką barierą hemostatyczną, te krwinki będą chemicznie zmienione w hematynę, i w ten sposób staną się niezdolne do indukowania wzrostu naczyń. Tak więc, produkt hemostatyczny stosowany jako bariera hamująca ponowne unaczynienie z lub bez spoiw fibrynowych, taki jak np. Surgicel®, jest skuteczny w niniejszym wynalazku. Jako opatrunek pokrywający powierzchnię ubytku stawu moż na zastosować składnik bezkomórkowy do którego przeszczepia się hodowane chondrocyty/chrząstkę, stosując autologiczne chondrocyty do transplantacji. W wynalazku rozważa się także zastosowanie odpowiednich alogenicznych chondrocytów lub ksenogenicznych chondrocytów w celu naprawy ubytku chrząstki.

Tak więc niniejszy wynalazek pozwala na skuteczną naprawę lub leczenie ubytków chrząstki w powierzchniach kości tworzących połączenie stawowe, które obejmują podawanie ś rodka lub urządzenia do blokowania inwazji naczyń do miejsca w chrząstce, które ma być naprawione, a także dostarczenie bezkomórkowej bariery, która będzie izolować miejsce naprawy i utrzymywać przeszczepiane komórki na miejscu. Niniejszy wynalazek przedstawia także zestaw zawierający składnik w postaci bariery hemostatycznej do wprowadzania do miejsca, które ma być naprawione tak, aby występowało skuteczne hamowanie unaczynienia miejsca, które ma być naprawione; i po umieszczeniu chondrocytów, które mają być przeszczepiane, w miejscu, które ma być naprawione, miejsce naprawy nakrywa się bezkomórkową półprzepuszczalną barierą tak, aby przeszczepiane chondrocyty były utrzymywane na miejscu, lecz wciąż mogły mieć dostęp do składników odżywczych.

Pewne aspekty według wynalazku przedstawiono przykładowo stosując system in vitro do badania zachowania chondrocytów będących w kontakcie z pewnym produktem lub kombinacją pewnych produktów, które hamują powstawanie tkanki naczyniowej. To testowanie in vitro przewiduje zdolność pewnych badanych materiałów do hamowania unaczynienia, tak jak to występuje in vivo, gdzie pętle naczyń włosowatych wyrastają w kierunku chrząstki tworzącej się podczas procesu autologicznej transplantacji chondrocytów do ubytków w chrząstce.

Odpowiednie produkty hemostatyczne będą się charakteryzowały zdolnością do hamowania wzrostu lub inwazji tkanki naczyniowej, osteocytów, fibroblastów itp. do rozwijającej się chrząstki. Odpowiedni materiał hemostatyczny powinien zapobiec inwazji naczyń i komórek do rozwijającej się chrząstki, w celu optymalizacji powstawania chrząstki i osiągnięcia naprawy pełnej grubości dowolnych ubytków w chrząstce stawowej. Idealnie, bariera hemostatyczna będzie trwała przez dłuższy czas wystarczający aby umożliwić pełną naprawę chrząstki, a następnie będzie mogła być resorbowana lub z czasem inaczej rozłożona. Pewien materiał zidentyfikowany jako odpowiedni nazywa się Surgicel® W1912 (wchłanialny hemostat zawierający utlenioną, regenerowaną sterylną celulozę; seria GG3DH, Ethicon Ltd. UK). Innym przykładem odpowiedniego materiału jest BioGide® (dostępny na rynku opatrunek z macierzą z kolagenu typu I; Geistlich Sohne, Switzerland).

Odpowiedni klej organiczny można znaleźć na rynku, taki jak np. Tisseel® lub Tissucol® (spoiwo oparte na fibrynie; Immuno AG, Austria), Adhesive Protein (Cat. #A-2707, Sigma Chemical, USA), i Dow Corning Medical Adhesive B (Cat. #895-3, Dow Corning, USA).

Przyrządy chirurgiczne, które rozważa się w niniejszym wynalazku można wytwarzać z metalu i/lub plastiku odpowiedniego do wytwarzania jednorazowych lub wielokrotnego użytku przyrządów chirurgicznych. Przyrząd tnący może zawierać zęby tnące, które są całkowicie okrągłe lub płaskie, lub mają dowolny kształt pośredni między tymi dwoma. Ponieważ chrząstka jest względnie miękkim materiałem, korzystne może być wytwarzanie utwardzonych plastikowych brzegów tnących, które będą zdolne rzeźbić chrząstkę bez uszkadzania kości. Takie przyrządy tnące można wytwarzać tak, aby zawierały w sobie otwory do podawania płynu, odessania skrawków i płynów, i włókna optyczne do oświetlenia i wizualizacji miejsca ubytku.

PL 210 783 B1

W niniejszym wynalazku wyrób wszczepialny obejmuje komórki 21 i klej 22 po łączone razem jako (1) mieszaninę kleju 22 i komórek 21 lub (2) jedną lub więcej naprzemiennych warstw komórek 21 i kleju 22 na macierzy noś nikowej 18.

W jednym z rozwią zań , komórki 21 są autologicznymi komórkami chrz ęstnymi, które mają być przeszczepiane do miejsca uszkodzenia 23. Chondrocyty 21 miesza się, homogenicznie lub niehomogenicznie, z odpowiednim klejem 22 przed zastosowaniem mieszaniny chondrocytów/kleju na macierz nośnikową 18. Korzystnie, klej 22 i chondrocyty 21 miesza się bezpośrednio (tj. na sali operacyjnej) przed nakładaniem kleju 22 i komórek 21 na macierz nośnikową 18, i implantacją kombinacji kleju 22, komórek 21 i macierzy nośnikowej 18 do ubytku 23. Alternatywnie komórki 21 i klej 22 stosuje się naprzemiennie w jednej lub więcej warstwach na macierz nośnikową 18. W jednym rozwiązaniu, klej 22 oznacza biokompatybilny klej, taki jak klej fibrynowy, a dokładniej albo autologiczny klej fibrynowy albo nie autologiczny klej fibrynowy. Korzystnie stosuje się autologiczny klej fibrynowy.

Gdy chondrocyty 21 połączy się z klejem 22 na macierzy nośnikowej 23, kombinację kleju/chondrocytów/macierzy nośnikowej implantuje się do ubytku 23 z lub bez bariery hemostatycznej (jak to tu opisano) pomiędzy kością 14 i kombinacją kleju/chondrocytów/macierzy nośnikowej. W jednym rozwiązaniu, jak pokazano na Fig. 2, leczony ubytek 23 nie zawiera bariery hemostatycznej pomiędzy kością 14 i kombinacją kleju/chondrocytów/macierzy nośnikowej.

W jednym rozwią zaniu, pokazanym na Fig. 7, leczenie ubytku 23 przeprowadza się podobnie bez zastosowania bariery hemostatycznej pomiędzy kombinacją kleju/chondrocytów/macierzy nośnikowej i podstawą ubytku 23.

Ponadto, w rozwiązaniu pokazanym na Fig. 7, kombinacja kleju 22 i chrondrocytów 21 występuje tylko na części macierzy nośnikowej 18. Np. klej 22 i chondrocyty 21 korzystnie znajdują się tylko na zewnętrznym brzegu strony porowatej macierzy nośnikowej 18. Alternatywnie, chondrocyty 21 i/lub klej 22 przenikają na stronę porowatą macierzy nośnikowej 18 do pożądanego poziomu, np. 2 do 50% głębokości macierzy nośnikowej 18. Typowo porowatość macierzy nośnikowej 18 jest największa najbliżej szorstkiej strony, tj. strony, na której osadza się komórki 21 i klej 22, i najmniejsza na przeciwnej stronie macierzy nośnikowej 18. Jak następnie zilustrowano za pomocą Fig. 7, porowatość macierzy nośnikowej 18 wskazano przez zacienienie, gdzie ciemniejsze zacienienie wskazuje mniejszą porowatość, a jaśniejsze zacienienie wskazuje większą porowatość.

W jeszcze innym rozwiązaniu, chondrocyty 21 stosuje się na macierz nośnikową 18, następnie pokrywa się warstwą odpowiedniego biokompatybilnego kleju 22. Chociaż pojedyncza warstwa chondrocytów 21 na macierzy nośnikowej 18 i pojedyncza warstwa kleju 22 umieszczona na chondrocytach 21 wystarcza do skutecznego leczenia ubytku, można stosować więcej niż jedną naprzemienną warstwę kleju 22 i chondrocytów 21. Alternatywnie, warstwę biokompatybilnego kleju 22 można początkowo osadzać na macierzy nośnikowej 18, a następnie osadzać warstwę chondrocytów 21 na kleju 22.

W pewnym rozwiązaniu, macierz nośnikowa 18 jest elementem w kształcie arkusza zdolnym do podtrzymywania wzrostu chondrocytów 21 i zapewnienia fizycznej integralności wyrobu wszczepialnego aby ułatwić manipulację nim. W pewnym rozwiązaniu, macierz nośnikowa 18 obejmuje polipeptydy lub białka takie jak kolagen. W szczególności, macierz nośnikowa 18 obejmuje kolagen koński, świński, wołowy, owczy i kurzy. Ponadto, kolagen może być albo typu I albo typu II. Przykłady odpowiednich kolagenowych matryc nośnikowych 18 obejmują ChondraGide® i BioGide® (dostępne na rynku opatrunki z macierzą z kolagenem typu I; firmy Geistlich Sohne, Switzerland). Ponadto, macierz nośnikowa 18 jest odwracalnie podatna na odkształcenie i ma albo szorstką tj. porowatą stronę, jak opisano powyżej, lub gładką stronę, lub dwie szorstkie strony. Chociaż dowolna strona może być porowata, w jednym rozwiązaniu jak to tu opisano, szorstka strona ma większą porowatość w stosunku do strony gładkiej. Macierz nośnikowa 18 i komórki 21 umieszczone na niej można ewentualnie utrzymywać na miejscu w ubytku za pomocą dodatkowego biokompatybilnego kleju 22 i/lub jednego lub więcej biokompatybilnych wchłanialnych kołków 24, jak pokazano na Fig. 7. W jednym rozwiązaniu, jedna lub więcej porcji macierzy nośnikowej 18 ma właściwości żelopodobne albo stałe.

Wynalazek został zilustrowany na podstawie następujących przykładów wykonania.

P r z y k ł a d 1

W celu zastosowania Surgicel® w wyrobie według wynalazku do zapobiegania rozwojowi naczyń krwionośnych do autologicznej implantowanej chrząstki lub chondrocytów, Surgicel® najpierw potraktowano środkiem utrwalającym, takim jak aldehyd glutarowy. Krótko, Surgicel® potraktowano 0,6% aldehydem glutarowym przez 1 minutę, a następnie kilkakrotnie przemyto w celu wyeliminowaPL 210 783 B1 nia pozostałości aldehydu glutarowego, które w przeciwnym razie mogą być toksyczne dla tkanki. Alternatywnie, Surgicel® potraktowano spoiwem fibrynowym o nazwie Tisseel® przed traktowaniem aldehydem glutarowym jak opisano w przykładzie 2. Stwierdzono, że Surgicel® utrwalony na przykład środkiem utrwalającym takim jak aldehyd glutarowy, przemyty sterylną solą fizjologiczną (0,9%) i przechowywany w chłodziarce, nie rozpuszcza się przez 1 do 2 miesięcy. Na ogół, Surgicel® jest resorbowany w okresie pomiędzy 7 i 14 dni. Ten czas byłby zbyt krótki, ponieważ dłuższy czas jest potrzebny do zapobiegania rozwojowi naczyń krwionośnych lub unaczynienia jako takiego z struktury kości do implantowanej chrząstki zanim implantowane chondrocyty przekształcą się w warstwę stałej chrząstki zaspokajając swoje potrzeby odżywcze z sąsiadującej chrząstki. Innymi słowy, wystarczające hamowanie unaczynienia jest potrzebne przez dłuższy czas, taki jak na przykład jeden miesiąc. Tak więc, produkt nie powinien ulegać absorpcji znacznie wcześniej. Z drugiej strony resorpcja jest potrzebna na końcu. Zatem, organiczny materiał stosowany jako bariera hamująca będzie miał te własności, i stwierdzono, że Surgicel® potraktowany w ten sposób zapewnia tę funkcję.

P r z y k ł a d 2

Surgicel® pokrywano także klejem organicznym, w tym przykładzie stosowanym klejem był Tisseel® lecz można także stosować inne. Ten produkt, razem z Surgicel® wytwarza nadającą się do użytku barierę dla specyficznego celu. Można stosować dowolny inny hemostat lub naczyniową barierę hamującą. Tisseel® mieszano jak opisano poniżej. Surgicel® pokryto następnie klejem Tisseel® przez opryskiwanie materiału Surgicel® na obu stronach aż do nasiąknięcia.

Następnie Tisseel® (klej fibrynowy) pozostawiono do zestalenia się w temperaturze pokojowej.

Bezpośrednio przed zakończeniem zestalania, pokryty Surgicel® umieszczono w 0,6% aldehydzie glutarowym na 1 minutę i następnie przemyto sterylną solą fizjologiczną (0,9%). Następnie uregulowano pH przez dodanie PBS i/lub NaOH aż do ustalenia pH na poziomie 7,2 do 7,4. Potem tak potraktowany Surgicel® przemyto w podłożu do hodowli tkankowej takim jak minimalnie stężone podłoże podstawowe /F12 z 15 mM buforu Hepes.

Jak wymieniono w tym przykładzie, stosowano Tisseel® jako spoiwo fibrynowe do pokrycia Surgicel®. Ponadto spoiwo fibrynowe lub klej można także stosować bezpośrednio na dno uszkodzenia w kierunku kości, na którą nakleja się Surgicel®. Stosowany system in vitro, zamiast testowania in vivo, składał się z sterylnej jednorazowej 6-studzienkowej płytki MJNCLON^TM Delta do prac badawczych na komórkach (NUNC. InterMed, Roskilde, Dania). Każda studzienka ma w przybliżeniu 4 cm średnicy.

Według wynalazku, spoiwo fibrynowe może być dowolnym spoiwem, które razem z składnikiem fibrynowym wytworzy klej, który może być tolerowany u ludzi (Biara, N, i in., Burns Incl. Therm. Inj., 1984, 10, 396). Wynalazek przewiduje także dowolny inny klej, który można stosować zamiast spoiwa fibrynowego. Według tego wynalazku stosowano Tisseel® lub Tissucol® (Immuno AG, Vienna, Austria). Zestaw Tisseel® składa się z następujących składników:

Tisseel, liofilizowany, inaktywowany pod względem wirusów środek uszczelniający, zawierający wykrzepialne białko: fibrynogen, fibronektynę osoczową (CIG) i czynnik XIII, i plazminogen;

- roztwór Aprotyniny (bydlę cej);

- Trombina 4 (bydlęca);

- Trombina 500 (bydlę ca); i

- roztwór chlorku wapnia.

Zestaw Tisseel® zawiera System stosowania DUPLOJECT®. Spoiwo fibrynowe lub dwuskładnikowe szczeliwo wykorzystujące Zestaw Tisseel® łączy się w następujący sposób według ulotki do produktu Immuno AG.

P r z y k ł a d 3

Chondrocyty hodowano w minimalnej ilości podłoża podstawowego do hodowli zawierającego HAM F12 i 15 mM buforu Hepes i 5 do 7,5% autologicznej surowicy, w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C i wykonano w laboratorium Class 100 w Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenhagen, Dania. Do hodowania chondrocytów można stosować inne kompozycje podłoża do hodowli. Komórki poddano działaniu trypsyny stosując trypsyna EDTA przez 5 do 10 minut i zliczono, stosując barwienie na żywotność barwnikiem Trypan Blue w komorze Burker-Turk. Liczbę komórek uregulowano do 7,5x10⁵ komórek na ml. Jedną płytkę NUNCLON^TM odsłonięto w Laboratorium Class 100.

Barierę hemostatyczną Surgicel® przycięto do odpowiedniego wymiaru dopasowując do dna studzienki w tacy do hodowli tkankowej NUNCLON™. W tym przypadku wycięto koło o wymiarze w przybliżeniu 4 cm (lecz mogłoby mieć dowolny możliwy wymiar) i umieszczono w warunkach asep8

PL 210 783 B1 tycznych na dnie w studzience w sterylnej jednorazowej, 6-studzienkowej płytce NUNCLON^TM Delta do prac badawczych na komórkach (NUNC, InterMed, Roskilde, Dania). Barierę hemostatyczną przygotowaną do umieszczenia na dnie studzienki potraktowano wstępnie jak opisano w przykładzie 1. To traktowanie znacznie opóźnia absorpcję Surgicel. Tę barierę hemostatyczną przemyto następnie kilka razy w wodzie destylowanej i później kilka razy aż aldehyd glutarowy, który nie przereagował, został wypłukany. Zastosowano małą ilość podłoża do hodowli komórek zawierającego surowicę w celu zaabsorbowania go przez barierę hemostatyczną i jednocześ nie utrzymania bariery hemostatycznej w stanie wilgotnym na dnie studzienki.

W przybliżeniu 10⁶ komórek w 1 ml podłoża do hodowli umieszczono bezpośrednio na wierzchu bariery hemostatycznej, rozproszono na powierzchni bariery hemostatycznej potraktowanej wstępnie 0,4% aldehydem glutarowym, jak opisano powyżej. Następnie płytkę inkubowano w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C przez 60 minut. Podłoże do hodowli tkankowej w ilości 2 do 5 ml zawierające 5 do 7,5% surowicy ostrożnie dodano do studzienki zawierającej komórki, unikając rozpryskiwania komórek przez utrzymanie końcówki pipety stycznie do boku studzienki podczas wypuszczania podłoża. Okazało się, że pH podłoża było za niskie (pH ~ 6,8). Następnie uregulowano pH do 7,4 do 7,5. Następnego dnia część chondrocytów zaczęła rosnąć na barierze hemostatycznej, ułożona w grona. Pewne komórki zginęły z uwagi na narażenie na niskie pH przed jego regulacją. Płytkę inkubowano przez 3 do 7 dni zmieniając podłoże w dniu 3.

Pod koniec okresu inkubacji podłoże zdekantowano, i dodano schłodzony 2,5% aldehyd glutarowy zawierający 0,1M sól sodową kwasu dimetyloarsenowego, (nazywany także kakodylanem sodu, pH uregulowane stosując HCl do 7,4), jako środek utrwalający do otrzymywania komórki i nośnika (bariera hemostatyczna) w celu późniejszego przygotowania do mikroskopii elektronowej.

P r z y k ł a d 4

Chondrocyty hodowano w minimalnej ilości podłoża podstawowego do hodowli zawierającego HAM F12 i 15 mM buforu Hepes i 5 do 7,5% autologicznej surowicy, w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C i wykonano w laboratorium Class 100 w Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenhagen, Dania. Do hodowania chondrocytów można stosować inne kompozycje podłoża do hodowli. Komórki poddano działaniu trypsyny, stosując trypsynę EDTA przez 5 do 10 minut i zliczono stosując barwienie na żywotność barwnikiem Trypan Blue w komorze Burker-Turk. Liczbę komórek uregulowano do 7,5x10⁵ komórek na ml. Jedną płytkę NUNCLON^TM odsłonięto w Laboratorium Class 100.

Surgicel® (do zastosowania jako bariera hemostatyczna) potraktowano 0,6% aldehydem glutarowym przez jedną minutę jak opisano w Przykładzie 1, i przemyto 0,9% sterylnym roztworem chlorku sodu lub korzystnie buforem takim jak bufor PBS lub podłożem do hodowli takim jak MEM/F12, ponieważ pH po traktowaniu aldehydem glutarowym wynosi 6,8 i powinno korzystnie wynosić 7,0 do 7,5. Tisseel® zastosowano na obie strony Surgicel® wykorzystując system DUPLOJECT®, pokrywając w ten sposób obie strony Surgicel®, opatrunku który zamierzano zastosować , spoiwem fibrynowym. Klej pozostawia się do wyschnięcia w warunkach aseptycznych przez co najmniej 3 do 5 minut. „Pokrytą barierę hemostatyczną umieszczono na dnie studzienki w sterylnej jednorazowej 6-studzienkowej płytce NUNCLON^TM Delta do prac badawczych na komórkach. Małą ilość podłoża do hodowli tkankowej zawierającego surowicę zastosowano w celu zaabsorbowania go przez barierę hemostatyczną. W przybliżeniu 10⁶ komórek w 1 ml podłoża do hodowli tkankowej zawierającego surowicę umieszczono bezpośrednio na wierzchu Hemostatu, rozproszonego na powierzchni bariery hemostatycznej. Następnie płytkę inkubowano w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C przez 60 minut. Podłoże do hodowli tkankowej w ilości 2 do 5 ml, zawierające 5 do 7,5% surowicy ostrożnie dodano do studzienki zawierającej komórki unikając rozpryskiwania się komórek przez utrzymanie końcówki pipety stycznie do boku studzienki podczas wypuszczania podłoża. Po 3 do 6 dniach, badanie mikroskopowe wykazało, że komórki przylegały do i wrastały w Surgicel® w zadowalający sposób co sugerowało, że Surgicel® nie wykazywał toksyczności wobec chondrocytów i że chondrocyty wrastały w zadowalają cy sposób w Surgicel®.

Płytkę inkubowano przez 3 do 7 dni zmieniając podłoże w dniu 3. Pod koniec okresu inkubacji podłoże zdekantowano, i schłodzono, i dodano 2,5% aldehyd glutarowy zawierający 0,1M sól sodową kwasu dimetyloarsenowego, nazywany także kakodylanem sodu, pH uregulowane z zastosowaniem HCL do 7,4, jako środkiem utrwalającym do otrzymywania komórki i nośnika (bariera hemostatyczna) do późniejszego przygotowania do mikroskopii elektronowej.

PL 210 783 B1

P r z y k ł a d 5

Chondrocyty hodowano w minimalnej ilości podłoża podstawowego do hodowli zawierającego HAM F12 i 15 mM buforu Hepes i 5 do 7,5% autologicznej surowicy, w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C i wykonano w laboratorium Class 100 w Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenhagen, Dania. Komórki poddano działaniu trypsyny, stosując trypsynę EDTA przez 5 do 10 minut i zliczono stosując barwienie na żywotność barwnikiem Trypan Blue w komorze Burker-Turk. Liczbę komórek uregulowano do 7,5x10⁵ do 2x10⁶ komórek na ml. Jedną płytkę NUNCLON^TM odsłonięto w Laboratorium Class 100.

Stwierdzono, że Bio-Gide® można stosować jako wchłanialną dwuwarstwową błonę, która będzie stosowana jako opatrunek lub bandaż pokrywający powierzchnię ubytku stawu, do którego przeszczepia się hodowane chondrocyty jak również barierę hemostatyczną. Bio-Gide® jest błoną z czystego kolagenu otrzymywaną w standardyzowanych, kontrolowanych procesach wytwarzania (E. D. Geistlich Sohne AG, CH-6110 Wolhusen). Kolagen uzyskuje się od świń z certyfikatem weterynaryjnym i ostrożnie oczyszcza się w celu uniknięcia reakcji antygenowych, i sterylizuje w podwójnych blistrach promieniowaniem gamma. Dwuwarstwowa błona ma powierzchnię porowatą i powierzchnię zwartą. Błona jest wykonana z kolagenu typu I i typu III bez późniejszej obróbki sieciującej lub chemicznej. Kolagen jest resorbowany w ciągu 24 tygodni. Błona utrzymuje swoją integralność strukturalną nawet w stanie wilgotnym i można ją umocowywać szwami lub gwoździami. Błonę można także „przyklejać stosując spoiwo fibrynowe takie jak Tisseel® do sąsiadującej chrząstki lub tkanki, albo zamiast szwów lub jednocześnie z szwami.

Bio-Gide® odsłonięto w Laboratorium Class 100 i umieszczono w warunkach aseptycznych na dnie studzienki w sterylnej jednorazowej 6-studzienkowej płytce NUNCLON^TM Delta do prac badawczych na komórkach, kierując do góry porowatą powierzchnię albo zwartą powierzchnię dwuwarstwowej błony. W przybliżeniu 10⁶ komórek w 1 ml podłoża do hodowli tkankowej zawierającego surowicę umieszczono bezpośrednio na wierzchu Bio-Gide®, rozpraszając albo na porowatej albo na zwartej powierzchni Bio-Gide®. Następnie płytkę inkubowano w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C przez 60 minut. Podłoże do hodowli tkankowej w ilości 2 do 5 ml, zawierające 5 do 7,5% surowicy, ostrożnie dodano do studzienki zawierającej komórki unikając rozpryskiwania się komórek przez utrzymanie końcówki pipety stycznie do boku studzienki podczas wypuszczania podłoża.

W dniu 2 po umieszczeniu chondrocytów w studzience zawierają cej Bio-Gide®, komórki zbadano w mikroskopie odwróconym firmy Nikon. Zauważono, ż e pewne chondrocyty przylegał y do brzegu BioGide. Oczywiście nie było możliwe przejrzenie samego Bio-Gide® z zastosowaniem tego mikroskopu.

Płytkę inkubowano przez 3 do 7 dni zmieniając podłoże w dniu 3. Pod koniec okresu inkubacji podłoże zdekantowano, i dodano schłodzony 2,5% aldehyd glutarowy zawierający 0,1M sól sodową kwasu dimetyloarsenowego, nazywaną także kakodylanem sodu, pH uregulowane z zastosowaniem HCL do 7,4, jako środkiem utrwalającym do otrzymywania komórki i nośnika Bio-Gide® z komórkami hodowanymi na porowatej powierzchni albo zwartej powierzchni. Następnie opatrunki Bio-Gide® wysłano do zbadania w mikroskopie elektronowym do Wydziału Patologii Szpitala Herlev, Dania.

Mikroskopia elektronowa wykazała, że chondrocyty hodowane na zwartej powierzchni Bio-Gide® nie wrastały w strukturę kolagenową Bio-Gide®, podczas gdy komórki hodowane na porowatej powierzchni faktycznie wrastały w strukturę kolagenową i ponadto, wykazały obecność proteoglikanów i żadnych oznak struktur fibroblastów. Ten wynik wskazuje, że gdy opatrunek kolagenowy, jak na przykład opatrunek Bio-Gide® przyszywa się jako opatrunek pokrywający ubytek chrząstki, porowata powierzchnia będzie zwrócona w dół w kierunku ubytku, do którego hodowane chondrocyty mają być wstrzykiwane. Będą one potem zdolne do przenikania przez kolagen i wytwarzania gładkiej powierzchni chrząstki w linii nienaruszoną powierzchnią, i w tym obszarze zostanie zbudowana gładka warstwa proteoglikanów. Podczas gdy, jeśli zwarta powierzchnia kolagenu jest skierowana w dół do ubytku, chondrocyty, które mają być implantowane, nie zintegrują się z kolagenem, a komórki nie wytworzą takiej samej gładkiej powierzchni jak opisano powyżej.

P r z y k ł a d 6

Chondrocyty hodowano w minimalnej ilości podłoża podstawowego do hodowli, zawierającego HAM F12 i 15 mN buforu Hepes i 5 do 7,5% autologicznej surowicy, w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C i wykonano w laboratorium Class 100 w Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenhagen, Dania. Komórki poddano działaniu trypsyny, stosując trypsynę EDTA przez 5 do 10 minut i zliczono stosują c barwienie na ż ywotność barwnikiem Trypan Blue w komorze Burker-Turk. Liczbę

PL 210 783 B1 komórek uregulowano do 7,5x10⁶ do 2x10⁶ komórek na ml. Jedną płytkę NUNCLON^TM odsłonięto w Laboratorium Class 100.

Bio-Gide® stosowaną jako wchłanialna dwuwarstwowa błona można także stosować razem z klejem organicznym takim jak Tisseel® z dodatkową , znacznie większą zawartością Aprotyniny niż normalnie znajduje się w Tisseel®, jak opisano w ulotce do produktu. Przez zwiększanie zawartości Aprotyniny do około 25000 KTU/ml, opóźni się resorpcję materiału o tygodnie i zamiast normalnego okresu dni.

W celu zbadania tej cechy in vitro, Tisseel® stosuje się na dno studzienki pł ytki NUNCLON^TM i pozostawia do niepełnego zestalenia się. Następnie stosuje się opatrunek kolagenowy taki jak Bio-Gide® na Tisseel® i przykleja na dno studzienki. Ta kombinacja Bio-Gide® i Tisseel® jest zaprojektowana jako bariera hemostatyczna, która będzie hamować lub zapobiegać rozwojowi lub naciekaniu naczyń krwionośnych do obszaru transplantacji chondrocytów. Ten hybrydowy opatrunek kolagenowy można obecnie stosować zarówno jako barierę hemostatyczną na dnie uszkodzenia (najbliżej obszaru, który ma być naprawiony) jak również jako nośnik dla powstawania chrząstki, ponieważ dystalna powierzchnia może być stroną porowatą opatrunku kolagenowego a więc wspomagać naciekanie chondrocytów i macierzy chrząstki. Tak więc, ten hybrydowy opatrunek kolagenowy można także stosować do pokrywania wierzchu implantu z kolagenową powierzchnią porowatą skierowaną w dół w kierunku implantowanych chondrocytów i barierą tworzą c ą wierzch. Hybrydowy opatrunek kolagenowy, z większą zawartością Aprotyniny, może także być stosowany bez jakiegokolwiek kleju organicznego takiego jak Tisseel® i umieszczany bezpośrednio w obrębie ubytku, przylegając dzięki naturalnym siłom. Tak więc opatrunek kolagenowy można stosować zarówno jako barierę hemostatyczną, jak i bezkomórkowe pokrycie miejsca naprawy/przeszczepu, z porowatymi powierzchniami opatrunków skierowanymi w kierunku przeszczepianych chondrocytów/chrząstki. W innym wariancie zastosowany byłby opatrunek kolagenowy, który składa się z kolagenu typu II (tj. firmy Geistlich Sohne AG, CH-6110 i Wolhusen).

Tak więc przedmiotem niniejszego wynalazku jest hybrydowy opatrunek kolagenowy, który jest opatrunkiem i macierzy kolagenowej ze zwiększoną zawartością Aprotyniny, korzystnie około 25000 KlU/ml, w połączeniu z organicznym klejem do macierzy, przy czym skł adnik kolagenowy jest podobny do wchłanialnego dwuwarstwowego materiału Bio-Gide® lub kolagenu typu II, a klej organiczny jest podobny do materiału Tisseel®. W innym rozwiązaniu, w hybrydowym opatrunku kolagenowym nie stosuje się jakiegokolwiek kleju organicznego, aby przylegał do miejsca naprawy.

P r z y k ł a d 7

Ze względu na osłabioną strukturę chrząstki w zapaleniu kości i stawów, przyleganie hodowanych autologicznych chondrocytów przeszczepianych w miejsce przeszczepu w wadliwej chrząstce może być hamowane, tworząc w ten sposób strefę brzeżną (strefę demarkacji) pomiędzy niedawno implantowaną chrząstką/chondrocytami i otaczającą ustaloną chrząstką. Ta strefa brzeżna będzie najsilniej wyrażona jeśli miejsce przeszczepu przygotowuje się pod przeszczep tworząc proste, gładkie ścianki wycięte liniowo. Siły ścinania i ściskania w poprzek takiej strefy brzeżnej (jak zilustrowano na Fig. 3 A) będą wywierać wielką siłę wypierającą przeszczep, gdy miejsce przeszczepu jest wycięte liniowo. Ta strefa brzeżna, i różnicowy ruch materiałów wzdłuż tej strefy będą hamować gojenie się poprzez zrastanie przeszczepianego materiału i otaczającego materiału. W wielu przypadkach przeszczepiany materiał jest miększy niż otaczający materiał, jednakże, w pewnych przypadkach zapalenia kości i stawów, otaczająca chrząstka może właściwie być miększa niż implantowane chondrocyty/chrząstka.

Tak więc, aby rozwiązać ten problem, sposób według wynalazku wskazuje zastosowanie przyrządów chirurgicznych do rzeźbienia ścianek miejsca przeszczepu tak, aby ścianki były nieliniowe, a wię c zapewnia uzyskanie powierzchni falistych. Moż liwe jest też kształ towanie miejsca przeszczepu tak, aby średnica miejsca proksymalnie do powierzchni kości była większa niż otwór dystalnie do kości, a przy powierzchni chrząstki. Jednakże, korzystne rozwiązanie opisuje rzeźbienie ścianek miejsca przeszczepu w sposób podobny do gwintowanego otworu dla śruby lub wkrętu (jak zilustrowano na Fig. 3B), zapewniając w ten sposób mechaniczną oporność na ściskanie i/lub wypychanie przeszczepianego materiału z miejsca przeszczepu, które można opisać jako gwint „męski i „żeński.

Przyrządy chirurgiczne rozważane przez niniejszy wynalazek można wytwarzać z metalu i/lub plastiku odpowiedniego do wytwarzania przyrządów chirurgicznych jednorazowych lub wielokrotnego użytku. Ponieważ chrząstka jest względnie miękkim materiałem, korzystne może być wytwarzanie utwardzonych plastikowych brzegów tnących, które będą mogły rzeźbić chrząstkę bez możliwości

PL 210 783 B1 uszkodzenia kości. Takie przyrządy tnące można wytwarzać tak, aby zawierały w sobie otwory do podawania płynu, odessania skrawków i płynu, i włókna optyczne do oświetlenia i wizualizacji miejsca ubytku. W pewnych rozwiązaniach przyrządu, podstawa przyrządu może mieć wystający punkt lub strukturę kołkowatą, która będzie pomagać w prowadzeniu i umieszczaniu przyrządu w miejscu przeszczepu. Oczywiście taki kołek byłby tak zaprojektowany, aby minimalizować uszkodzenie leżącej poniżej kości.

Podczas gdy powierzchnia tnąca przyrządu może być pojedynczo ząbkowana, lub wielokrotnie ząbkowana, lub opisana wzorem śrubowym takim jak w metalowym gwintowniku stosowanym w celu wytworzenia gwintowanych otworów w częściach metalowych, od przyrządu tnącego wymagana jest taka właściwość, aby uzyskane wyrzeźbione boki miejsca przeszczepu były faliste i nieliniowe. Np. w pewnych rozwiązaniach, tnący brzeg przyrządu można ukształtować podobnie do kształtu pokazanego na Fig. 4A lub na Fig. 4B. Brzeg tnący może być płaski lub kolisty w tym sensie, że owija się wokół średnicy przyrządu tnącego. Można zaprojektować wiele innych kształtów dla osiągnięcia celu według wynalazku, aby stworzyć powierzchnię rozdziału, która zapewnia mechaniczną odporność na różnicową reakcję na siły ściskania i ścinania na materiał przeszczepiany i otaczający.

P r z y k ł a d 8

Czteromiesięczną świnię mieszańca Yorkshire poddano znieczuleniu ogólnemu i położono na grzbiecie. Świnię umyto i ubrano do operacji w sali operacyjnej Centrum Badawczego Zapalenia Stawów Harrington, Phoenix, Arizona. Cały zabieg chirurgiczny przeprowadzono aseptycznie. Lewą tylną nogę i sąsiadujący obszar brzucha i pachwiny oczyszczono jodyną. Zlokalizowano staw kolanowy i rzepkę . Przeprowadzono cię cie przyś rodkowe w przybliż eniu 3 cm od tylnej części rzepki i przecię to kilka warstw tkanki podskórnej, mięśni i więzadeł w pobliżu, w celu uzyskania dostępu do przyśrodkowego kłykcia udowego. Stosując okrągły nóż wytworzono uszkodzenie w białej chrząstce na przyśrodkowej części kłykcia przyśrodkowego, pozostawiając margines 0,5 do 1 cm od brzegu chrząstki pokrywającej tylno-przyśrodkową część kłykcia (lewy kłykieć. Fig. 6A). Ubytek 0,5 do 1 cm umieszczono w masie ogonowej podtrzymującej część przyśrodkowego kłykcia. Cały zabieg chirurgiczny wykonano bez opaski uciskowej na lewym udzie. Różne warstwy i skórę odpowiednio zszyto.

W dniu 3 zwierzę ponownie przyniesiono na salę operacyjną i umieszczono, jak powyżej, na stole operacyjnym i podano znieczulenie ogólnemu. Lewą tylną nogę i sąsiadujący obszar brzucha i pachwiny zdezynfekowano jodyną, jak opisano powyżej. Szwy rozcięto i otwarto ten obszar. Zauważono, że w stawie kolanowym wystąpił umiarkowany krwiak. Skrzep krwi usunięto i zbadano ubytek. W ubytku był skrzep krwi, który usunię to.

Sterylny przyrząd chirurgiczny zaprojektowany z męskim gwintowanym brzegiem tnącym, o wymiarze odpowiednim do, lub niewiele wię kszym niż obwód uszkodzenia ostroż nie wkrę cono w ubytek. Opatrunek BioGide® przycięto do wymiaru równego wymiarowi dna ubytku. Pierwszy stosowany klej, o nazwie Adhesive Protein (A-2707, Sigma Chemical, USA) zastosowano na zwartą stronę przyciętego opatrunku z barierą hemostatyczną, i opatrunek umieszczono zwartą stroną w dół na dno uszkodzenia, stosując go jako barierę, jak opisano powyżej. Stwierdzono, że ten klej nie wysychał zbyt szybko. Nieznaczne krwawienie z dna ubytku zatrzymano natychmiast. Drugi BioGide® przycięto tak, że miał trochę większy obwód niż uszkodzenie i umieszczono zwartą stroną do góry (tak więc stroną porowatą w dół w kierunku przeszczepu), jak opisano powyżej.

Następnie ten niekomórkowy opatrunek pokrywający przyszyto do wgłębienia, pozostawiając jeden brzeg otwarty, w miejscu gdzie można będzie wstrzykiwać przeszczepiane chondrocyty. Otaczającą część brzegu opatrunku pokryto drugim klejem, Dow Corning Medical Adhesive B (Cat. #895-3, Dow Corning, USA). Ten drugi klej osuszono dużo szybciej i bardziej skutecznie niż pierwszy klej. Stwierdzono, że podczas tej konkretnej procedury, pierwszy klej nie wysychał dostatecznie do utrzymania bariery hemostatycznej na miejscu, gdy próbowano przyszyć kapturek. Tak więc, główna bariera na proksymalnej powierzchni miejsca przeszczepu była utworzona przez sam klej.

Stosując strzykawkę 1 ml i igłę o grubości 16, zawiesinę chondrocytów (około 0,6 ml) wciągnięto do cylindra strzykawki. Krótką igłę o grubości 23 zamieniono na igłę o grubości 16, i zawiesinę komórek wstrzykiwano pod przyszyty opatrunek pokrywający do miejsca przeszczepu (około 10x10⁶ komórek). Następnie otwarty brzeg kapturka przyklejono przed usunięciem igły, i igłę ostrożnie wycofano. Nie zaobserwowano wycieku komórek. Ranę zeszyto i jak powyżej, nie stosowano opaski uciskowej, nie obserwowano krwawienia. Zeszyto końcowe warstwy skóry. Po zeszyciu skóra nie wystawała, co wskazuje, że nie było krwiaka. Zdrowienie po operacji przebiegało bez powikłań.

PL 210 783 B1

Jak się spodziewano, przeszczepione chondrocyty wytworzyły macierz chrząstki wystarczającą do naprawy ubytku wykonanego w powierzchni chrząstki stawowej stawu kolanowego badanej świni. Fig. 6A jest obrazem MRI stawu kolanowego świni przedstawiającym ubytek chrząstki wytworzony w kolanie (lewy kłykieć, przyśrodkowy kłykieć), i Fig. 6B jest obrazem MRI tego samego stawu kolanowego świni trzy miesiące po leczeniu wykazującym naprawę ubytku.

P r z y k ł a d 9

Zestaw zawierający składniki przydatne do praktycznej realizacji sposobu według wynalazku, umożliwi dogodne zastosowanie praktyczne sposobu według wynalazku w warunkach chirurgicznych. W korzystnym rozwiązaniu, zestaw według wynalazku dostarczy sterylne składniki odpowiednie do łatwego zastosowania w środowisku chirurgicznym, i zapewni odpowiednią barierę hemostatyczną, odpowiedni opatrunek pokrywający, i jeśli potrzeba klej organiczny. Zestaw według wynalazku może także dostarczać sterylny, bezkomórkowy materiał macierzy odpowiedni do podtrzymywania chondrocytów autologicznych, które mają być implantowane do ubytku powierzchni połączenia stawowego. W jednym rozwią zaniu, zestaw według wynalazku zawiera barierę hemostatyczną Surgicel® i opatrunek pokrywający Bio-Gide® z odpowiednim pokryciem w postaci kleju organicznego Tisseel®, gdzie Surgicel® i Bio-Gide® potraktowano według wskazań według wynalazku w celu zwiększenia czasu jaki upłynie do resorpcji. W przypadkach, gdzie Tisseel® jest uprzednio nałożony, w jednym rozwiązaniu Tisseel® jest uzupełniony dodatkową aprotyniną aby zwiększyć czas jaki upłynie do resorpcji.

W innym korzystnym rozwiązaniu, zarówno bariera hemostatyczna jak i opatrunek pokrywający są półprzepuszczalną macierzą kolagenową, którą traktuje się w celu wydłużenia czasu do resorpcji materiału. Możliwe jest też dostarczenie kleju Tisseel® we wzmocnionej formie jako oddzielnego składnika do zastosowania w razie potrzeby ze względu na nieodłączną zmienność i wyjątkowe okoliczności jakie napotka zabieg naprawy/transplantacji.

Ponadto, rozwiązanie zestawu będzie obejmować przyrząd chirurgiczny jak opisano powyżej w przykładzie 7.

Fachowcy w dziedzinie powinni rozumieć, że można dokonywać licznych zmian i/lub modyfikacji wynalazku przedstawionego w specyficznych rozwiązaniach, bez odchodzenia od myśli przewodniej i zakresu wynalazku, jak to tu szeroko opisano.

Claims (13)

1. Wyrób wszczepialny do naprawy chrząstki metodą implantacji u zwierzęcia, znamienny tym, że zawiera kolagenową macierz nośnikową (18), komórki chrzestne (21) i spoiwo biokompatybilne (22) przylegające do brzegu wymienionej macierzy nośnikowej.

2. Wyrób wszczepialny według zastrz. 1, znamienny tym, ż e wymieniona macierz nośnikowa jest elementem w kształcie arkusza.

3. Wyrób wszczepialny według zastrz. 1, znamienny tym, ż e wymieniona macierz nośnikowa zawiera polipeptydy lub białka.

4. Wyrób wszczepialny według zastrz. 3, znamienny tym, ż e wymieniony kolagen jest wybrany spośród grupy składającej się z zasadniczo z kolagenu końskiego, świńskiego, wołowego, owczego i kurzego.

5. Wyrób wszczepialny według zastrz. 1, znamienny tym, ż e wymieniona macierz nośnikowa jest w stanie stałym.

6. Wyrób wszczepialny według zastrz. 1, znamienny tym, ż e wymieniona macierz nośnikowa jest żelopodobna.

7. Wyrób wszczepialny według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniony kolagen jest kolagenem typu I.

8. Wyrób wszczepialny wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e wymieniony kolagen jest kolagenem typu II.

9. Wyrób wszczepialny wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e wymieniony wyrób wszczepialny jest odwracalnie podatny na odkształcenie.

10. Wyrób wszczepialny według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniona macierz nośnikowa ma szorstką stronę.

PL 210 783 B1

11. Wyrób wszczepialny według zastrz. 10, znamienny tym, że wymieniona szorstka strona jest porowata.

12. Wyrób wszczepialny według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniona macierz nośnikowa ma gładką stronę.

13. Wyrób wszczepialny według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniona macierz nośnikowa ma szorstką i gładką stronę.