PL211730B1

PL211730B1 - Enzym pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Sphingobacterium, mikroorganizm i sposób otrzymywania dipeptydu

Info

Publication number: PL211730B1
Application number: PL391108A
Authority: PL
Inventors: Kenzo Yokozeki; Sonoko Suzuki; Seiichi Hara; Satoshi Katayama
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2002-07-26
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2012-06-29
Also published as: RU2005105321A; BR0305638A; CN1316016C; PL211754B1; RU2300565C2; US20040253665A1; JP4501689B2; CA2509765A1; JPWO2004022733A1; EP1553171A4; CN1671840A; PL374192A1; WO2004022733A1; KR20050025677A; AU2003248117A1; CA2509765C; EP1553171A1

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowego enzymu pochodzącego z bakterii należącej do rodzaju Sphingobacterium, który łatwo, niedrogo i z wysoką wydajnością wytwarza peptyd bez przechodzenia przez złożoną syntezę. Dokładniej, wynalazek dotyczy nowego enzymu pochodzącego z bakterii należącej do rodzaju Sphingobacterium, który katalizuje reakcję otrzymywania peptydu z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego, mikroorganizmu, który wytwarza enzym i sposobu wytwarzania dipeptydu z zastosowaniem enzymu lub mikroorganizmu.

Peptydy stosuje się w produktach farmaceutycznych, żywności i w różnych innych dziedzinach. Na przykład, ze względu na większą trwałość i rozpuszczalność w wodzie w porównaniu do L-glutaminy, L-alanylo-L-glutamina jest szeroko stosowana jako składnik płynu infuzyjnego i pożywek bezsurowiczych.

Metody syntezy chemicznej, znane jako metody wytwarzania peptydów, nie zawsze są proste. Do znanych przykładów takich sposobów należy sposób, w którym stosuje się N-benzyloksykarbonyloalaninę („Z-alanina) i zabezpieczoną L-glutaminę (Bull. Chem. Soc. Jpn., 34, 739 (1961), Bull. Chem. Soc. Jpn., 35, 1966 (1962)), sposób, w którym stosuje się Z-alaninę i zabezpieczony ester γ-etylowy kwasu L-glutaminowgo (Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200 (1964)), sposób, w którym stosuje się ester Z-alaniny i niezabezpieczony kwas glutaminowy (zgłoszenie JP H1-96194), sposób obejmujący syntezę pochodnej N-(2-podstawionej)propionyloglutaminowej jako produktu pośredniego z halogenku 2-podstawionego propionylu jako surowca (JP H6-234715).

Ponieważ jednak wszystkie te sposoby wymagają wprowadzenia i usunięcia grup zabezpieczających lub stosowania optycznie czynnych produktów pośrednich, nie uważa się ich za wystarczająco zadowalające pod względem ich przydatności w przemyśle.

Z drugiej strony, powszechnie znane przykłady typowych sposobów wytwarzania peptydów z zastosowaniem enzymów obejmują reakcję kondensacji z zastosowaniem komponentu karboksylowego zabezpieczonego na atomie azotu a niezabezpieczonego na atomie węgla i niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego („Reakcja 1) oraz reakcję podstawienia z zastosowaniem zabezpieczonego na atomie azotu i zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego i niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego („Reakcja 2).

Przykładem Reakcji 1 jest sposób wytwarzania estru metylowego Z-asparaginofenyloalaniny z kwasu Z-asparaginowego i estru metylowego fenyloalaniny (JP S53-92729), natomiast przykładem Reakcji 2 jest sposób wytwarzania acetylofenylo-alanylo-leucynoamidu z estru etylowego acetylofenyloalaniny i leucynoamidu (Biochemical J., 163, 531 (1977)). Bardzo mało jest opisanych przykładów badań nad metodami z zastosowaniem niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego. Przykład reakcji podstawienia z zastosowaniem niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego i niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego („Reakcja 3) jest opisany w publikacji WO 90/01555. Jako przykład można wskazać sposób otrzymywania arginyloleucynoamidu z estru etylowego argininy i leucynoamidu. Przykłady reakcji podstawienia z użyciem niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego i niezabezpieczonego na atomie azotu, niezabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego („Reakcja 4) opisano w publikacjach EP 278787A1 i EP 359399B1. Jako przykład można wskazać sposób otrzymywania tyrozyloalaniny z estru etylowego tyrozyny i alaniny.

Najmniej kosztowny spośród Reakcji 1-4 sposób wytwarzania należy oczywiście do klasy Reakcji 4, która wymaga najmniej grup zabezpieczających.

Przykład Reakcji 4 według dotychczasowego stanu techniki (EP 278787A1) stwarza jednak istotne problemy:

(1) wyjątkowo mała szybkość wytwarzania peptydu, (2) niska wydajność wytwarzania peptydu, (3) peptydy, które można wytwarzać są ograniczone do tych, które zawierają aminokwasy o stosunkowo wysokiej hydrofobowości, (4) ilość dodanego enzymu jest wyjątkowo duża oraz (5) potrzebne są stosunkowo drogie preparaty karboksypeptydazy pochodzące z pleśni, drożdży lub roślin.

PL 211 730 B1

W Reakcji 4 nie jest znany żaden sposób z zastosowaniem enzymu pochodzącego od bakterii lub drożdży innych niż rodzaj Saccharomyces i nie jest znany sposób otrzymywania alanyloglutaminy i innych wysoce hydrofilowych peptydów. W tej sytuacji potrzebne jest opracowanie niedrogiego w warunkach przemysł owych sposobu wytwarzania tych peptydów.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowego enzymu pochodzącego z bakterii rodzaju Sphingobacterium, który może łatwo, niedrogo i z wysoką wydajnością wytwarzać peptyd, bez konieczności przechodzenia przez złożone metody syntezy. W szczególności, celem wynalazku jest dostarczenie nowego enzymu katalizującego reakcję otrzymywania peptydu z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego, mikroorganizmu wytwarzającego enzym i sposób niedrogiego wytwarzania peptydu z użyciem enzymu lub mikroorganizmu. Twórcy wynalazku opracowali nowy enzym pochodzący z rodzaju Sphingobacterium, który wydajnie wytwarza peptyd.

Przedmiotem wynalazku jest enzym pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Sphingobacterium, który tworzy peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego. Enzym ma przy tym masę cząsteczkową 75 kDa według oznaczenia elektroforetycznego w żelu SDS a według oznaczenia chromatografią filtracyjną na żelu ma masę cząsteczkową 150 kDa. Enzym z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego korzystnie tworzy peptyd i L-alanylo-L-glutaminę z szybkością wytwarzania 0,03 mM/min lub większą, w reakcji wytwarzania dipeptydu w warunkach (i) do (iv):

(i) komponentem karboksylowym jest chlorowodorek estru metylowego L-alaniny (100 mM), (i) komponentem aminowym jest L-glutamina (200 mM), (iii) pH wynosi 9,0 i (iv) ilość dodanego enzymu oczyszczonego do homogeniczności, jako ilość białka jest mniejsza niż 0,61 mg/ml.

Korzystnie komponent karboksylowy jako substrat obejmuje zarówno ester aminokwasu i amid aminokwasu. Korzystnie substrat dla komponentu aminowego obejmuje dowolny aminokwas, aminokwas o zabezpieczonym atomie węgla i aminy.

W korzystnym rozwią zaniu enzym ma zdolność wytwarzania peptydu w pH od 6,5 do 10,5 a w temperaturze od 0 do 60°C. Enzym, korzystnie, nie jest hamowany przez inhibitor enzymu serynowego, fluorek fenylometylosulfonylu lecz jest inhibowalny przez p'-guanidynobenzoesan p-nitrofenylu. Przedmiotem wynalazku jest także szczep Sphingobacterium sp. FERM BP-8124 (depozyt: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data złożenia depozytu międzynarodowego: 22 lipca 2002).

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania dipeptydu, obejmujący wytwarzanie dipeptydu z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego, w którym stosuje się enzym według wynalazku lub substancję zawierającą enzym.

Przedmiot wynalazku został przedstawiony na rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia wykres pH optymalnego dla enzymu według wynalazku.

Fig. 2 przedstawia wykres optymalnej temperatury dla enzymu według wynalazku oraz

Fig. 3 przedstawia wykres przebiegu w czasie wytwarzania L-alanylo-L-glutaminy z estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy.

Sposoby wykonania wynalazku są wyjaśnione szczegółowo w kolejności:

(1) Mikroorganizm wytwarzający enzym, (2) Hodowla mikroorganizmu, (3) Oczyszczanie enzymu, (4) Właściwości enzymu, i (5) Metoda syntezy dipeptydu.

(1) Mikroorganizm wytwarzający enzym

Enzymem według wynalazku jest każdy enzym, który wytwarza peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego. W opisie określenie komponent karboksylowy odnosi się do komponentu, który dostarcza grupę karbonylową (CO) w wiązaniu peptydowym (-CONH-), natomiast komponent aminowy odnosi się do komponentu, który w wiązaniu peptydowym dostarcza grupę aminową (NH). Dodatkowo, określenie „peptyd użyte samodzielnie odnosi się do polimeru mającego przynajmniej jedno wiązanie peptydowe, jeśli nie zaznaczono inaczej. Określenie „dipeptyd w opisie odnosi się do peptydu mającego jedno wiązanie peptydowe.

PL 211 730 B1 (1) Mikroorganizm wytwarzający enzym

Przykłady mikroorganizmów, które wytwarzają enzym według wynalazku obejmują bakterie należące do rodzaju Sphingobacterium sp., a zwłaszcza szczep FERM BP-8124. Sphingobacterium sp., zwłaszcza szczep FERM BP-8124 są mikroorganizmami, które zostały opracowane przez twórców wynalazku w wyniku poszukiwania mikroorganizmów, które z wysoką wydajnością tworzą peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego. Mikroorganizmy o wł a ś ciwoś ciach bakteriologicznych podobnych do właściwości Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 są również mikroorganizmami wytwarzającymi enzym według wynalazku.

Sphingobacterium sp. szczep AJ 110003 zdeponowano 22 lipca 2002 r. w International Patent Organism Depositary of National Institute for Advanced Industrial Science and Technology i oznaczono numerem depozytu FERM BP-8124. Należy zauważyć, że szczep AJ 110003 został zidentyfikowany w opisanych poniżej doświadczeniach identyfikacyjnych, jako wspomniany Sphingobacterium sp.

Szczep FERM BP-8124 (depozyt: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi,

Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002) jest Gramujemną pałeczką (0,7 do 0,8 x 1,5 do 2,0 mikrometrów („urn)), która nie tworzy przetrwalników i nie jest ruchliwa. Jej kolonie są okrągłe i mają całkowicie gładkie brzegi, zawierają niewielkie wypukłości i mają lśniący, jasnożółty kolor. Organizm wzrasta w 30°C i jest katalazododatni, oksydazododatni i ujemny wobec testu OF (glukoza) i na podstawie tych właściwości został zidentyfikowany jako bakteria należąca do rodzaju Sphingobacterium. Ponadto, na podstawie tego, że jest ujemny w teście redukcji azotanów, ujemny w teście wytwarzania indolu, ujemny w teście otrzymywania z glukozy, ujemny w teście z dihydrolazą argininy, dodatni wobec ureazy, dodatni w teście hydrolizy eskuliny, ujemny w teście hydrolizy żelatyny, dodatni w teście z β-galaktozydazą, dodatni w teście asymilacji glukozy, ujemny w teście asymilacji L-arabinozy, dodatni w teście asymilacji D-mannozy, ujemny w teście asymilacji D-mannitu, dodatni w teście asymilacji N-acetylo-D-glukozoaminy, dodatni w teście asymilacji maltozy, ujemny w teście asymilacji glukonianu potasu, ujemny w teście z kwasem n-kapronowym, ujemny w teście asymilacji kwasu adypinowego, ujemny w teście asymilacji kwasu dl-jabłkowego, ujemny w teście asymilacji cytrynianu sodu, ujemny w teście asymilacji octanu fenylu i dodatni w teście z cytochromooksydazą. Stwierdzono, że mikroorganizm ma właściwości podobne do właściwości Sphingobacterium multivorum lub Sphingobacterium spiritivorum. Ponadto, mimo że w wyniku przeanalizowania homologii sekwencji bazowej genu 16S rRNA wykazano najwyższy stopień homologii (98,8%) ze Sphingobacterium multivorum, nie było szczepu, z którym dopasowanie byłoby całkowite. Omawiany szczep bakteryjny zidentyfikowano jako Sphingobacterium sp. Enzym można otrzymać przez jego wyodrębnienie i oczyszczenie z komórek Sphingobacterium sp. Ponadto, enzym a także mikroorganizmy, które wytwarzają ten enzym można również otrzymywać w oparciu o wyizolowany enzym metodami inżynierii genetycznej. Enzym i mikroorganizm można również otrzymywać przez wyizolowanie DNA kodującego ten enzym w oparciu o wyodrębniony i oczyszczony enzym, a następnie ekspresję DNA w wyniku wprowadzenia DNA do odpowiedniego gospodarza. Dodatkowo, enzym mogący wytwarzać peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego można otrzymać również z innych mikroorganizmów przez wytworzenie sondy opartej na polinukleotydzie, która koduje enzym. Różne metody rekombinacji genów zostały opisane w Molecular Cloning, wyd. drugie, Cold Spring Harbor Press (1989) i w innych publikacjach.

(2) Hodowla mikroorganizmów

Otrzymanie hodowanych komórek mikroorganizmów zawierających enzym stosowany w wynalazku polega na hodowli i wzroście mikroorganizmów we właściwej pożywce. Nie ma szczególnych ograniczeń dotyczących pożywki stosowanej w tym celu, pod warunkiem, że pozwala ona na wzrost mikroorganizmów. Pożywką tą może być zwykła pożywka zawierająca zwykłe źródła węgla, źródła azotu, źródła fosforu, źródła siarki, jony nieorganiczne oraz potrzebne źródła organicznych czynników odżywczych.

Można na przykład zastosować dowolne źródło węgla, pod warunkiem, że mikroorganizmy mogą je wykorzystać.

Do przykładowych źródeł węgla, które można użyć, należą cukry takie jak glukoza, fruktoza, maltoza i amyloza, alkohole takie jak sorbit, etanol i gliceryna, kwasy organiczne takie jak kwas fumarowy, kwas cytrynowy, kwas octowy i kwas propionowy i ich sole, węglowodory takie jak parafina a także ich mieszaniny.

Przykładowe źródła azotu, które można użyć obejmują sole amonowe soli nieorganicznych takie jak siarczan amonu i chlorek amonu, sole amonowe kwasów organicznych takie jak fumaran amoPL 211 730 B1 nu i cytrynian amonu, azotany takie jak azotan sodu i azotan potasu, organiczne związki azotu takie jak peptony, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny i wyciąg namokowy kukurydzy a także ich mieszaniny.

Jako dodatki można odpowiednio domieszać i użyć również zwykłe dodatki odżywcze stosowane w pożywkach, takie jak sole nieorganiczne, sole metali śladowych i witaminy. Nie ma szczególnych ograniczeń co do warunków hodowli i można ją prowadzić na przykład przez około 12 do około 48 godzin przy odpowiedniej kontroli pH i temperatury, odpowiednio w zakresie pH 5 do 8 i zakresie temperatury 15 do 40°C, w warunkach tlenowych.

(3) Oczyszczanie enzymu

Jako przykład oczyszczania enzymu objaśniono sposób wyodrębniania i oczyszczania wytwarzającego peptyd enzymu z Empedobacter brevis.

Po pierwsze, z komórek, na przykład Empedobacter brevis szczepu FERM BP-8113 (depozyt: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1-1 Higashi, Miasto Tsukuba, Prefektura Ibaraki, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 8 lipca 2002) sporządza się ekstrakt z komórek mikroorganizmów przez destrukcję komórek metodą fizyczną taką jak zniszczenie komórek ultradźwiękami lub metodą enzymatyczną z użyciem enzymu rozpuszczającego ścianki oraz oddzielenie frakcji nierozpuszczalnej przez rozdział przez wirowanie.

Enzym o zdolności do tworzenia peptydu można następnie wyodrębnić z ekstraktu komórkowego otrzymanego opisanym sposobem poprzez kombinację zwykłych metod oczyszczania białek takich jak chromatografia anionowymienna, chromatografia kationowymienna lub filtracyjna chromatografia żelowa.

Przykładem nośnika, który można zastosować w chromatografii anionowymiennej jest Q-Sepharose HP (wytwarzany przez Amersham). Enzym odzyskuje się we frakcji niezaadsorbowanej w warunkach pH 8,5 gdy umoż liwi się przejś cie ekstraktu komórkowego zawierają cego enzym przez kolumnę wypełnioną nośnikiem. Przykładem nośnika, który można zastosować w chromatografii kationowymiennej jest MonoS HR (wytwarzany przez Amersham). Po zaadsorbowaniu enzymu na nośniku (w kolumnie) przez umożliwienie przejścia ekstraktu komórkowego zawierającego enzym przez kolumnę wypełnioną nośnikiem a następnie przemycie kolumny, enzym eluuje się roztworem buforowym o wysokim stężeniu soli. W tym czasie stężenie soli można zwiększać sekwencyjnie lub gradientowo. Na przykład, w przypadku zastosowania MonoS HR, enzym zaadsorbowany na nośniku eluuje się przy stężeniu NaCl około 0,2 - 0,5M. Tak oczyszczony enzym można dalej oczyszczać do homogeniczności np. przez filtracyjną chromatografię żelową. Przykładem nośnika do zastosowania w filtracyjnej chromatografii żelowej jest Sephadex 200pg (wytwarzany przez Amersham).

Obecność enzymu we frakcji uzyskanej w procesie oczyszczania, określa się badając aktywność w każdej frakcji przy wytwarzaniu peptydu opisaną poniżej metodą.

(4) Właściwości enzymu

Ponieważ enzym według wynalazku jest enzymem, który może tworzyć peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego, poniżej omówiono korzystną odmianę enzymu, z punktu widzenia jego właściwości.

Enzym o opisanych właściwościach gdzie szybkość wytwarzania dipeptydu jest wykorzystywana jako wskaźnik, jest korzystną odmianą enzymu. Korzystną odmianą enzymu jest mianowicie enzym, który ma zdolność do tworzenia peptydu z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego i może wykazywać szybkość tworzenia L-alanylo-L-glutaminy w reakcji wytwarzania dipeptydu w warunkach (i) do (iv), korzystnie 0,03 mM/min lub wię kszą , korzystniej 0,3 mM/min lub wię kszą , a szczególnie korzystnie 1,0 mM/min lub większą.

Warunki reakcji tworzenia dipeptydu są następujące:

(i) Komponentem karboksylowym jest chlorowodorek estru metylowego L-alaniny (100 milimolowy („mM”), (ii) Komponentem aminowym jest L-glutamina (200 mM), (iii) pH wynosi 9,0 i (iv) Ilość dodanego enzymu w przeliczeniu na ilość białka jest mniejsza niż 0,61 mg/ml.

Podana ilość dodanego enzymu wskazuje końcową ilość dodanego enzymu, to znaczy dodaną do układu reakcyjnego a pożądane jest dodanie 0,01 mg/ml lub więcej, korzystnie 0,02 mg/ml lub więcej w przeliczeniu na ilość białka. Określenie „ilość białka odnosi się do wartości oznaczonej metodą kolorymetryczną z błękitem brylantowym Coomassiego przy użyciu roztworu CBB do oznaczania białka (dostarczanego przez Nakarai) i albuminy z surowicy bydlęcej jako wzorca. Podana szybkość

PL 211 730 B1 wytwarzania dalece przewyższa tradycyjną szybkość wytwarzania dla wytwarzania peptydu przy użyciu enzymu a enzym może katalizować wytwarzanie peptydu z wyjątkowo dużą szybkością.

Jako szczegółowy przykład sposobu postępowania przy badaniu aktywności enzymu, aktywność enzymu można badać przez doprowadzenie do reakcji enzymu w roztworze buforu boranowego zawierającym ester aminokwasu i aminę jako substraty, z następnym oznaczaniem ilościowym powstającego peptydu.

W bardziej szczegółowym przykładzie, doprowadza się do reakcji enzymu przez kilka minut w 25°C, stosują c 100 mM roztwór buforu boranowego (pH 9,0) zawierają cy 100 mM ester metylowy L-alaniny i 200 mM L-glutaminę.

Jednostka aktywności enzymu stosowana w wynalazku jest zdefiniowana tak, że 1 jednostka (J) jest ilością enzymu, która wytwarza 1 mikromol peptydu w ciągu jednej minuty w warunkach reakcji w 25° C przy uż yciu 100 mM roztworu buforu boranowego (pH 9,0) zawierają cego 100 mM estru metylowego L-alaniny i 200 mM L-glutaminy.

Ponadto, przykładem korzystnej modyfikacji enzymu jest enzym katalizujący reakcję, w której substrat komponentu karboksylowego obejmuje dowolny ester aminokwasu i amid aminokwasu. Sformułowanie „substrat obejmuje zarówno ester aminokwasu jak i amid aminokwasu oznacza, że jako substrat może zostać użyty przynajmniej jeden ester aminokwasu i przynajmniej jeden rodzaj amidu aminokwasu. Ponadto, korzystnym rozwiązaniem enzymu jest enzym, katalizujący reakcję, w której substrat komponentu aminowego obejmuje dowolny aminokwas, aminokwas o zabezpieczonym atomie węgla i aminę. Sformułowanie „substrat obejmuje dowolny aminokwas, aminokwas o zabezpieczonym węglu i amina oznacza, że jako substrat mogą zostać użyte przynajmniej jeden rodzaj aminokwasu, przynajmniej jeden rodzaj aminokwasu zabezpieczonego na atomie węgla i przynajmniej jeden rodzaj aminy.

W wyniku szerokiego zakresu specyficzności substratu wzglę dem komponentu karboksylowego lub komponentu aminowego, enzym jest korzystny w tym znaczeniu, że może zostać dobrany szeroki zakres materiałów wyjściowych, który z kolei jest korzystny pod względem kosztów i aparatury produkcyjnej w przypadku produkcji przemysłowej.

Konkretne przykłady komponentów karboksylowych obejmują estry L-aminokwasów, estry D-aminokwasów, amidy L-aminokwasów i amidy D-aminokwasów. Estry aminokwasów obejmują nie tylko estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom występującym w przyrodzie ale także estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom niewystępującym w przyrodzie lub ich pochodne. Ponadto przykłady estrów aminokwasów obejmują zarówno estry α-aminokwasów jak i estry β-, γ i ω-aminokwasów i tym podobne, z różnymi miejscami związania grupy aminowej. Do typowych przykładów estrów aminokwasów należą estry metylowe, estry etylowe, estry n-propylowe, estry izopropylowe, estry n-butylowe, estry izobutylowe i estry tert-butylowe aminokwasów itp.

Konkretne przykłady komponentów aminowych obejmują L-aminokwasy, zabezpieczone na atomie węgla L-aminokwasy, D-aminokwasy, zabezpieczone na atomie węgla D-aminokwasy i aminy.

Przykłady amin obejmują nie tylko aminy występujące w przyrodzie ale także aminy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Ponadto przykłady aminokwasów obejmują nie tylko aminokwasy występujące w przyrodzie, lecz także aminokwasy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Należą do nich zarówno β-aminokwasy jak i β-, γ- i ω-aminokwasy, z różnymi miejscami związania grupy aminowej. Dodatkowo, pod różnymi względami, korzystną modyfikacją enzymu jest enzym, dla którego zakres pH, w którym może być katalizowana reakcja wytwarzania peptydu jest 6,5 do 10,5. Zdolność enzymu do katalizowania tej reakcji w szerokim zakresie pH jest korzystna z tego względu, że umożliwia elastyczne dostosowanie do produkcji przemysłowej, w której mogą występować różne ograniczenia. Przy aktualnej produkcji peptydu korzystnie jest jednak użyć enzymu przy dostosowaniu do optymalnego pH odpowiadającego pozyskanemu enzymowi tak, aby maksymalizować efektywność katalityczną enzymu.

Ponadto, przykładem innej korzystnej modyfikacji enzymu jest enzym, dla którego zakres temperatury w jakim enzym może katalizować reakcje wytwarzania peptydu jest w granicach o do 60°C. Ponieważ enzym może katalizować reakcję w szerokim zakresie temperatury, jest korzystny ze względu na to, że umożliwia elastyczne dostosowanie do produkcji przemysłowej, w której mogą występować różne ograniczenia. Przy aktualnej produkcji peptydu korzystnie jest jednak użyć enzym przy dostosowaniu do optymalnej temperatury odpowiadającej pozyskanemu enzymowi tak, aby maksymalizować efektywność katalityczną enzymu.

PL 211 730 B1 (5) Sposób syntezy dipeptydu

Sposób wytwarzania dipeptydu obejmuje syntezę dipeptydu przez umożliwienie enzymowi mogącemu wytwarzać peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego lub substancji, która zawiera ten enzym, działania na komponent karboksylowy i komponent aminowy.

Umożliwia się enzymowi lub substancji zawierającej ten enzym działanie na komponent karboksylowy i komponent aminowy poprzez zmieszanie enzymu lub substancji zawierającej enzym, komponentu karboksylowego i komponentu aminowego. Dokładniej, można zastosować sposób, w którym enzym lub substancję zawierającą enzym dodaje się do roztworu zawierającego komponent karboksylowy i komponent aminowy i umożliwia się reakcję lub, w przypadku użycia mikroorganizmu wytwarzającego enzym, można zastosować sposób, w którym hoduje się mikroorganizm wytwarzający enzym, enzym znajdujący się w mikroorganizmie lub bulion z hodowli mikroorganizmu oczyszcza się i zatęża, a następnie do bulionu dodaje się komponent karboksylowy i komponent aminowy. Zsyntetyzowany dipeptyd można następnie zebrać standardowymi metodami i w razie potrzeby oczyścić.

Określenie „substancja zawierająca enzym odnosi się do tego, co zawiera enzym, a przykłady konkretnych tego postaci obejmują hodowlę mikroorganizmów wytwarzających enzym, komórki mikroorganizmów wyizolowane z hodowli i produkt obróbki komórek mikroorganizmów. Hodowla mikrorganizmów odnosi się do tego, co uzyskuje się w wyniku hodowania mikroorganizmów, a ściślej do mieszaniny komórek mikroorganizmów, pożywki użytej do hodowli mikroorganizmów oraz substancji wytworzonych przez hodowane mikroorganizmy i tym podobnych. Dodatkowo, komórki mikroorganizmów mogą zostać przemyte i stosowane w postaci przemytych komórek mikroorganizmów. Produkt obróbki komórek mikroorganizmów obejmuje dodatkowo zmiażdżone, lizowane lub liofilizowane komórki mikroorganizmów i obejmuje również surowy enzym odzyskany w wyniku przetworzenia komórek mikroorganizmów i tak dalej, a także oczyszczony enzym otrzymany przez oczyszczenie surowego enzymu. Do otrzymania oczyszczonego enzymu można użyć częściowo oczyszczony enzym otrzymany różnymi metodami oczyszczania lub enzym immobilizowany, który immobilizowano przez wiązanie kowalentne, adsorpcję lub pułapkowanie. Dodatkowo, ponieważ niektóre mikroorganizmy zależnie od ich rodzaju są częściowo lizowane w trakcie hodowli, w takich przypadkach jako substancja zawierająca enzym może również zostać użyty nadsącz z hodowli. Ponadto, stosować można nie tylko dzikie szczepy mikroorganizmów zawierających enzym ale również szczepy rekombinowane genetycznie. Mikroorganizmy nie są ograniczone do nienaruszonych komórek lecz można stosować komórki mikroorganizmów po obróbce acetonem, liofilizowane komórki mikroorganizmów lub komórki inaczej obrabiane. Można też stosować immobilizowane komórki mikroorganizmów, które immobilizowano przez wiązanie kowalencyjne, adsorpcję, pułapkowanie lub innymi metodami a także obrobione immobilizowane komórki mikroorganizmów.

Należy zauważyć, że w przypadku użycia hodowli, hodowanych komórek mikroorganizmów lub produktu pochodzącego z poddanych obróbce komórek mikroorganizmów, występują liczne przypadki, w których istnieje enzym, który nie uczestniczy w wytwarzaniu peptydów lecz rozkłada otrzymane peptydy i w takich przypadkach jest korzystne dodanie inhibitora metaloproteazy takiego jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), zależnie od przypadku. Dodana ilość jest w zakresie 0,1 mM do 300 mM, a korzystnie 1 mM do 100 mM.

Użyta ilość enzymu lub substancji zawierającej enzym powinna być ilością, przy której wykazany zostaje zamierzony skutek („skuteczna ilość). Skuteczna ilość może zostać z łatwością wyznaczona w prostym, wstępnym doświadczeniu przez osobę przeciętnie biegłą w tej dziedzinie, w przypadku użycia na przykład enzymu jego użyta ilość wynosi około 0,01 do 100 jednostek (J), podczas gdy w przypadku użycia przemytych komórek mikroorganizmów ich ilość wynosi około 1 do 500 g/l. Użyty może być dowolny komponent karboksylowy, pod warunkiem, że może on wytwarzać peptyd przez kondensację z innym substratem w postaci komponentu aminowego. Przykłady komponentów karboksylowych obejmują estry L-aminokwasów, estry D-aminokwasów, amidy L-aminokwasów i amidy D-aminokwasów. Przykłady estrów aminokwasów obejmują nie tylko estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom występującym w przyrodzie, ale także estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom niewystępującym w przyrodzie lub ich pochodnych. Ponadto przykłady estrów aminokwasów obejmują zarówno estry α-aminokwasów jak i estry β-, γ- i ω-aminokwasów i tym podobne, z różnymi miejscami związania grupy aminowej.

PL 211 730 B1

Do typowych przykładów estrów aminokwasów należą estry metylowe, estry etylowe, estry n-propylowe, estry izopropylowe, estry n-butylowe, estry izobutylowe i estry tert-butylowe aminokwasów.

Można zastosować dowolny komponent aminowy, pod warunkiem, że może on wytwarzać peptyd przez kondensację z innym substratem w postaci komponentu karboksylowego. Przykłady komponentów aminowych obejmują L-aminokwasy, zabezpieczone na węglu L-aminokwasy, D-aminokwasy, zabezpieczone na węglu D-aminokwasy i aminy. W dodatku przykłady amin obejmują nie tylko aminy występujące w przyrodzie, ale także aminy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Przykłady aminokwasów obejmują nie tylko aminokwasy występujące w przyrodzie, lecz także aminokwasy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Należą do nich zarówno aa-aminokwasy jak i β-, γi ω-aminokwasy, z różnymi miejscami związania grupy aminowej.

Chociaż stężenia komponentu karboksylowego i komponentu aminowego służących jako materiały wyjściowe są odpowiednio 1 mM do 10 M, a korzystnie 0,05 molowe („M) do 2 M, są przypadki, w których korzystne jest dodanie komponentu aminowego w ilości równej lub większej niż ilość komponentu karboksylowego. Ponadto w przypadku substratów, które w wysokich stężeniach hamują reakcję, mogą one być korygowane do stężenia, które nie powoduje hamowania i stopniowo dodawane są w trakcie reakcji.

Temperatura reakcji, która umożliwia wytwarzanie peptydu wynosi 0 do 60°C, a korzystnie 5 do 40°C. pH reakcji które umożliwia wytwarzanie peptydu wynosi 6,5 do 10,5, a korzystnie 7,0 do 10,0.

P r z y k ł a d y

Chociaż poniżej przedstawiono bardziej szczegółowe wyjaśnienie wynalazku poprzez jego przykłady, wynalazek nie jest do nich ograniczony.

W uzupełnieniu do potwierdzenia przez barwienie ninhydryną chromatogramów cienkowarstwowych (jakościowo), w celu zbadania produktów wykonywano oznaczenia ilościowe wysokosprawną chromatografią cieczową.

Kolumna: InertsiL ODS-2 (produkowana przez GL Science, Inc.), eluat: wodny roztwór fosforanu zawierający 5,0 mM 1-oktanosulfonian sodu (pH 2,1) : metanol = 100 : 15 do 50, szybkość przepływu: 1,0 ml/min, detekcja: 210 nanometrów („nm).

P r z y k ł a d 1

Hodowla mikroorganizmu

Empedobacter brevis szczep FERM BP-8113) ml pożywki (pH 6,2) zawierającej 5 gram glukozy, 5 g siarczanu amonu, 1 g fosforanu monopotasowego, 3 g fosforanu dipotasowego, 0,5 g siarczanu magnezu, 10 g ekstraktu z drożdży i 10 g peptonu w 1 litrze przeniesiono do 500 ml kolby Sakaguchi i przez 15 minut sterylizowano w 115°C. Pożywkę tę zaszczepiono następnie jedną ezą bulionu hodowlanego Empedobacter brevis, szczep FERM BP-8113 (depozyt: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres instytucji będącej depozytariuszem: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 8 lipca 2002), który hodowano przez 16 godzin w 30°C w tej samej pożywce, a następnie przez 16 godzin w 30°C w wytrząsarce przy 120 obrotach/min.

P r z y k ł a d 2

Otrzymywanie peptydu przy użyciu komórek mikroorganizmów

Komórki mikroorganizmów zebrano przez odwirowanie (10000 obrotów na minutę („obr/min), 15 minut) bulionu hodowlanego otrzymanego w przykładzie 1, a następnie zawieszenie do stężenia 100 g/l w 100 mM buforze boranowym (pH 9,0) zawierającym 10 mM EDTA. Po dodaniu odpowiednio 1 ml tej zawiesiny do 1 ml 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 10 mM EDTA, 200 mM poniższego komponentu karboksylowego i 400 mM poniższego aminokwasu dla doprowadzenia do objętości końcowej 2 ml, prowadzono reakcję w 18°C przez 2 godziny. Peptydy otrzymane w wyniku tej reakcji przedstawiono w tabeli 1.

PL 211 730 B1

T a b e l a 1

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd (mM)	Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd (mM)
L-Ala-OMe	L-Leu	L-Ala-L-Leu	38,2	Gly-OMe	L-His	L-Gly-L-His	22,1
L-Met	L-Ala-L-Met	68,3	L-Ser-OMe	L-Ser	L-Ser-L-Ser	29,0
L-Phe	L-Ala-L-Phe	62,4	L-Val-OMe	L-Met	L-Val-L-Met	10,5
L-Ser	L-Ala-L-Ser	51,3	L-Met-OMe	L-Phe	L-Met-L-Phe	28,5
L-His	L-Ala-L-His	52,1	L-Thr-OMe	L-Leu	L-Thr-L-Leu	23,0
L-Arg	L-Ala-L-Arg	72,1	L-Ile-OMe	L-Met	L-Ile-L-Met	8,3
L-Gln	L-Ala-L-Gln	68,0

(Wszystkie użyte komponenty karboksylowe były chlorowodorkami).

P r z y k ł a d 3

Oczyszczanie enzymu

Czynności po oddzieleniu przez wirowanie przeprowadzono na lodzie albo w temperaturze 4°C. Empedobacter brevis, szczep FERM BP-8113 (depozyt: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 8 lipca 2002) hodowano tak samo jak w przykładzie 1, a komórki mikroorganizmów zebrano przez wirowanie (10000 obr/min, 15 minut). Po przemyciu 16 g komórek mikroorganizmów 50 mM buforem Tris-HCl (pH 8,0) zawieszono je w 40 ml („ml lub „mL) tego samego buforu i poddawano przez 45 minut miażdżeniu za pomocą ultradźwięków przy 195 watach. Po zmiażdżeniu ultradźwiękami ciecz poddano wirowaniu (10000 obr/min, 30 minut) w celu usunięcia fragmentów zmiażdżonych komórek i otrzymaniu nadsączu cieczy. Ten nadsącz cieczy po zmiażdżeniu ultradźwiękami dializowano przez noc wobec 50 mM buforu Tris-HCl (pH 8,0), a następnie usunięto frakcję nierozpuszczalną przez ultrawirowanie (50000 obr/min, 30 minut) w celu otrzymania frakcji rozpuszczalnej w postaci nadsączu. Otrzymaną frakcję rozpuszczalną naniesiono na kolumnę z Q-Sepharose HP (produkcji Amersham) poddano wstępnej równowadze buforem Tris-HCl (pH 8,0) i z niezaadsorbowanej frakcji zebrano frakcję aktywną. Frakcję aktywną dializowano w ciągu nocy wobec 50 mM buforu octanowego (pH 4,5), a następnie poddano wirowaniu (10000 obr/min, 30 minut) w celu otrzymania frakcji dializowanej w postaci nadsączu. Frakcję dializowaną naniesiono na kolumnę z Mono S (produkcji Amersham) poddano wstępnej równowadze 50 mM buforem octanowym (pH 4,5) w celu wyeluowania enzymu przy liniowym gradiencie stężenia tego samego buforu zawierającego 0 do 1 M NaCl. Frakcję o najniższym spośród frakcji aktywnych poziomie zanieczyszczających białek naniesiono na kolumnę Superdex 200pg (produkcji Amersham) poddano wstępnej równowadze 50 mM buforem octanowym (pH 4,5) zawierającym 1M NaCl i przeprowadzono filtrację żelową przez zapewnienie przepływu tego samego buforu (pH 4,5) zawierającego 1M NaCl przez kolumnę w celu otrzymania roztworu frakcji aktywnej. Po przeprowadzeniu tych procedur na podstawie wyników eksperymentalnych elektroforezy potwierdzono powtarzalne oczyszczenie enzymu tworzącego peptyd. Stopień odzyskania enzymu w procesie oczyszczania wyniósł 12,2% i był 707-krotny.

P r z y k ł a d 4

Pomiar ciężaru cząsteczkowego enzymu (Elektroforeza na żelu SDS)

0,3 mikrograma ^q) frakcji oczyszczonego enzymu otrzymanej metodą według przykładu 3 poddano elektroforezie w żelu poliakryloamidowym. Jako roztwór buforowy do elektroforezy zastosowano 0,3% (w/v) Tris, 1,44% (w/v) glicynę i 0,1% (w/v) laurylosulfonian sodu, jako żel poliakryloamidowy zastosowano żel o gradiencie stężenia żelu 10 do 20% (Multigel 10 do 20, produkcji Daiichi Pure Chemicals), a jako markery ciężaru cząsteczkowego zastosowano markery ciężaru cząsteczkowego Pharmacia. Po zakończeniu elektroforezy żel wybarwiono błękitem brylantowym Coomassiego R-250 i wykryto jednorodne pasmo w miejscu ciężaru cząsteczkowego około 75 kilodaltonów

Filtracja żelowa

Frakcję oczyszczonego enzymu otrzymaną metodą według przykładu 3 naniesiono na kolumnę z Superdex 200 pg (produkcji Amersham) poddano wstępnej równowadze 50 mM buforem octano10

PL 211 730 B1 wym (pH 4,5) zawierającym 1M NaCl i w celu zmierzenia masy cząsteczkowej prowadzono filtrację żelową, doprowadzając do przepływu przez kolumnę tego samego buforu (pH 4,5) zawierającego 1M NaCl. W celu sporządzenia krzywej kalibracyjnej, jako białka wzorcowe o znanych masach cząsteczkowych użyto markery masy cząsteczkowej z Pharmacia. Masa cząsteczkowa enzymu wynosi 150 kDa.

Na podstawie wyników elektroforezy w żelu SDS i filtracji żelowej zasugerowano, że enzym jest homodimerem o ciężarze cząsteczkowym 75 kDa.

P r z y k ł a d 5

Optimum pH enzymu

Wpływ pH sprawdzono w reakcji, w której z chlorowodorku estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy wytwarza si ę L-alanylo-L-glutamin ę . Jako bufory stosowano bufor octanowy (pH 3,9 do 5,4), bufor MES (pH 5,4 do 6,4), bufor fosforanowy (pH 6,0 do 7,9), bufor boranowy (pH 7,8 do 9,3), bufor CAPS (pH 9,3 do 10,7) i bufor K2HPO4-NaOH (pH 10,8 do 11,6). 1 mikrolitr frakcji MonoS enzymu otrzymanej w przykładzie 3 (około 180 J/ml) dodano do 100 μΐ każdego buforu (100 mM) zawierającego 100 mM ester metylowy L-alaniny, 200 mM L-glutaminę i 10 mM EDTA i pozostawiono na 5 minut do reakcji w 18°C w celu określenia wpływu pH na reakcję. Wyniki oparte na przypisaniu wartości 100% przypadkowi użycia buforu boranowego (pH 9,3) przedstawiono na Fig. 1.

W rezultacie optymalne pH enzymu wynosi 8 do 9,5.

P r z y k ł a d 6

Optymalna temperatura enzymu

Wpływ temperatury sprawdzono w reakcji, w której z chlorowodorku estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy wytwarza się L-alanylo-L-glutaminę. 1 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM estru metylowego L-alaniny, 200 mM L-glutaminę i 10 mM EDTA i pozostawiono na 5 minut do reakcji w każdej temperaturze w celu określenia wpływu temperatury na reakcję.

Wyniki oparte na przypisaniu wartości 100% aktywności w 34°C przedstawiono na Fig. 2. W rezultacie optymalną temperaturą enzymu było 30 do 40°C.

P r z y k ł a d 7

Inhibitory enzymu

Wpływ inhibitorów na wytwarzanie L-alanylo-L-glutaminy badano stosując jako substraty chlorowodorek estru metylowego L-alaniny i L-glutaminę. 2 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 50 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającej każdy z inhibitorów enzymu przedstawionych w tabeli 2 w stężeniu 10 mM i pozostawiono na 5 minut do reakcji w 25°C. Należy zauważyć, że o-fenantrolina, fluorek fenylometylosulfonylu i p'-guanidynobenzoesan p'-nitrofenylu były przed użyciem rozpuszczone w metanolu do stężenia 50 mM. Aktywność enzymu w każdych warunkach była przedstawiona jako aktywność względna w przypadku przypisania wartości 100 wytwarzaniu L-alanylo-L-glutaminy przy nieobecności inhibitora enzymu.

Wyniki te przedstawiono w tabeli 2. W rezultacie spośród badanych inhibitorów enzymu serynowego enzym nie był hamowany przez fluorek fenylometylosulfonylu, lecz był hamowany przez p'-guanidynobenzoesan p-nitrofenylu.

T a b e l a 2

Inhibitor enzymu	Względna aktywność wytwarzania L-Ala-L-Gln (%)
Brak	100
Inhibitor metaloenzymu	EDTA	96
o-Fenantrolina	96
Inhibitor enzymu SH	N-Etylomaleimid	110
Monojodooctan	101
Inhibitor enzymu serynowego	Fluorek fenylometylosulfonylu	115
Fluorek 4-(2-aminoetylo)benzenosulfonylu	75
p'-Guanidynobenzoesan p-nitrofenylu	0,1

PL 211 730 B1

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie L-alanylo-L-glutaminy z estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy ul porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 ul 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorek estru metylowego L-alaniny, 200 mM L-glutaminę i 10 mM EDTA i pozostawiono do reakcji w 18°C.

W rezultacie, co przedstawiono na Fig. 3, w przypadku szarży z dodanym enzymem otrzymano 83 mM L-alanylo-L-glutaminę (L-Ala-L-Gln), a stężenie produktu ubocznego L-Ala-L-Ala-L-Gln wynosiło 1,3 mM. Z drugiej strony, w szarży bez dodanego enzymu niemal nie obserwowano wytwarzania L-Ala-L-Gln, a stężenie enzymu po reakcji trwającej 120 minut wynosiło 0,07 mM.

P r z y k ł a d 9

Wpływ stężenia L-glutaminy na wytwarzanie L-alanylo-L-glutaminy ul porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 ul 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorek estru metylowego L-alaniny, L-glutaminę w stężeniach przedstawionych w tabeli 3 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 2 godziny do reakcji w 18°C. Wyniki przedstawiono w tabeli 3.

T a b e l a 3

Chlorowodorek estru metylowego L-alaniny (mM)	L-Glutamina (mM)	L-Ala-L-Gln (mM)
100	100	68,2
110	72,1
120	73,3
130	75,1
150	75,5
200	82,0

P r z y k ł a d 10

Specyficzność substratu enzymu (1)

Zbadano specyficzność estru w przypadku użycia estru L-aminokwasu jako komponentu karboksylowego. 2 ul porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 ul 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM komponenty przedstawione w tabeli 4, 200 mM L-glutaminę i 10 mM EDTA i pozostawiono na 2 godziny do reakcji w temperaturze 25°C. Ilości L-Ala-L-Gln otrzymane w tej reakcji przedstawiono w tabeli 4 (w tabeli 4 HCl oznacza chlorowodorek).

T a b e l a 4

Komponent karboksylowy	Otrzymany L-Ala-L-Gln (mM)
Ester metylowy L-alaninyHCl	84,3
Ester etylowy L-alaninyHCl	91,5
Ester izopropylowy L-alaninyHCl	78,9
Ester t-butylowy L-alaninyHCl	7,5

P r z y k ł a d 11

Specyficzność substratu enzymu (2)

Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia estru metylowego L-alaniny jako komponentu karboksylowego i różnych L-aminokwasów jako komponentu aminowego. 2 ul porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 ul 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorek estru metylowego L-alaniny, 150 mM L-aminokwasy przedstawione w tabeli 5 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w temperaturze 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w tabeli 5. (Znak „+ oznacza te peptydy, których otrzymanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy „śl oznacza ilość śladową.)

PL 211 730 B1

T a b e l a 5

Komponent aminowy	Otrzymany peptyd (mM)	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd (mM)
Gly	L-Ala-Gly	13,7	L-Asn	L-Ala-L-Asn	65,5
L-Ala	L-Ala-L-Ala	25,4	L-Gln	L-Ala-L-Gln	79,3
L-Val	L-Ala-L-Val	20,8	L-Tyr	L-Ala-L-Tyr	17,6
L-Leu	L-Ala-L-Leu	45,3	L-CySH	L-Ala-L-CySH	+
L-Ile	L-Ala-L-Ile	33,9	L-Lys	L-Ala-L-Lys	71,8
L-Met	L-Ala-L-Met	83,3	L-Arg	L-Ala-L-Arg	88,0
L-Phe	L-Ala-L-Phe	74,4	L-His	L-Ala-L-His	66,9
L-Trp	L-Ala-L-Trp	53,9	L-Asp	L-Ala-L-Asp	2,1
L-Ser	L-Ala-L-Ser	62,5	L-Glu	L-Ala-L-Glu	42,9
L-Thr	L-Ala-L-Thr	53,9	L-Pro	L-Ala-L-Pro	śl

P r z y k ł a d 12

Specyficzność substratu enzymu (3)

Zbadano wytwarzanie enzymu w przypadku użycia estrów metylowych różnych rodzajów

L-aminokwasu jako komponentu karboksylowego i użycia L-glutaminy jako komponentu aminowego.

μΐ porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 μΐ 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorku estru metylowego L-aminokwasu (AA-OMe-HCl) przedstawione w tabeli 6, 150 mM L-glutaminę i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w tabeli 6. (Znak „+ oznacza te peptydy dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy „śl oznacza ilość śladową). W przypadku użycia L-Trp-OMe i L-Tyr-Ome do układu reakcyjnego dodano ponadto Tween-80 do stężenia końcowego 0,1%.

T a b e l a 6

Komponent karboksylowy	Otrzymany peptyd (mM)	Komponent karboksylowy	Otrzymany peptyd (mM)
Gly-OMe	Gly-L-Gln	54,7	L-Tyr-OMe	L-Tyr-L-Gln	3,4
L-Ala-OMe	L-Ala-L-Gln	74,6	CySH-OMe	L-CySH-L-Gln	+
L-Val-OMe	L-Val-L-Gln	15,4	L-Lys-OMe	L-Lys-L-Gln	+
L-Leu-OMe	L-Leu-L-Gln	+	L-Arg-OMe	L-Arg-L-Gln	7,1
L-Ile-OMe	L-Ile-L-Gln	8,4	L-His-OMe	L-His-L-Gln	+
L-Met-OMe	L-Met-L-Gln	12,0	L-Asp-a-OMe	a-L-Asp-L-Gln	śl
L-Phe-OMe	L-Phe-L-Gln	0,9	L-Asp-e-OMe	β-L-Asp-L-Gln	śl
L-Trp-OMe	L-Trp-L-Gln	+	L-Glu-a-OMe	a-L-Glu-L-Gln	+
L-Ser-OMe	L-Ser-L-Gln	24,0	L-Glu-Y-OMe	γ-L-Glu-L-Gln	+
L-Thr-OMe	L-Thr-L-Gln	81,9	L-Pro-OMe	L-Pro-L-Gln	2,2
L-Asn-OMe	L-Asn-L-Gln	+
L-Gln-OMe	L-Gln-L-Gln	0,3

(Wszystkie komponenty karboksylowe użyto w postaci chlorowodorków)

P r z y k ł a d 13

Specyficzność substratu enzymu (4)

Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia estrów metylowych różnych L-aminokwasów jako komponentów karboksylowych i różnych L-aminokwasów jako komponentów aminowych. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowePL 211 730 B1 go (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorki estru metylowego L-aminokwasu (AA-OMe · HCl) przedstawione w tabeli 7, 150 mM L-aminokwasy przedstawione w tabeli 7 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w tabeli 7. („śl oznacza ilość śladową). W przypadku L-Trp-OMe do układu reakcyjnego dodano ponadto Tween 80 do stężenia końcowego 0,1%. (Znak „+ oznacza te peptydy dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca.)

T a b e l a 7

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd (mM)	Komponent karboksyIowy	Komponent Aminowy	Otrzymany peptyd (mM)
Gly-OMe	L-CySH	Gly-L-CySH	45,6	L-Met-OMe	L-Ser	L-Met-L-Ser	12,8
L-Arg	Gly-L-Arg	25,5	L-Met	L-Met-L-Met	25,0
L-Phe	Gly-L-Phe	44,0	L-Phe	L-Met-L-Phe	34,0
L-His	Gly-L-His	31,6	L-Ile-OMe	L-Ser	L-Ile-L-Ser	17,2
L-Lys	Gly-L-Lys	9,8	L-Met	L-Ile-L-Met	10,0
L-Ser	Gly-L-Ser	44,2	L-Phe	L-Ile-L-Phe	5,2
L-Thr-OMe	Gly	L-Thr-Gly	9,4	L-Arg-OMe	L-Ser	L-Arg-L-Ser	3,6
L-Ala	L-Thr-L-Ala	9,4	L-Met	L-Arg-L-Met	0,7
L-Val	L-Thr-L-Val	0,7	L-Phe	L-Arg-L-Phe	1,9
L-Leu	L-Thr-L-Leu	28,4	L-Leu-OMe	L-Met	L-Leu-L-Met	12,2
L-Met	L-Thr-L-Met	38,6	L-Trp-OMe	L-Met	L-Trp-L-Met	4,1
L-Ser	L-Thr-L-Ser	58,2	L-Lys-OMe	L-Met	L-Lys-L-Met	6,8
L-Ser-OMe	L-Ser	L-Ser-L-Ser	38,0	L-His-OMe	L-Met	L-His-L-Met	6,5
L-Met	L-Ser-L-Met	12,5	L-Asn-OMe	L-Glu	LAsn-L-Glu	10,2
L-Phe	L-Ser-L-Phe	20,3
L-Val-OMe	L-Ser	L-Val-L-Ser	30,8
L-Met	L-Val-L-Met	10,3
	L-Phe	L-Val-L-Phe	6,1

(Wszystkie komponenty karboksylowe użyto w postaci chlorowodorków)

P r z y k ł a d 14

Specyficzność substratu enzymu (5)

Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia estrów metylowych form L lub D różnych aminokwasów jako komponentu karboksylowego i form L lub D różnych aminokwasów jako komponentu aminowego. 2 pH tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorku estru metylowego różnych aminokwasów (AA-OMeHCl) przedstawionych w tabeli 8, 150 mM różne aminokwasy przedstawione w tabeli 8 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w tabeli 8. („śl oznacza ilość śladową).

PL 211 730 B1

T a b e l a 8

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd	(mM)
D-Ala-OMe	L-Gln	D-Ala-L-Gln	69,3
D-Ala-OMe	L-Ser	D-Ala-L-Ser	20,3
D-Thr-OMe		D-Thr-L-Ser	1,0
D-Ser-OMe		D-Ser-L-Ser	3,3
D-Val-OMe		D-Val-L-Ser	0,6
D-Met-OMe		D-Met-L-Ser	5,1
L-Ala-OMe	D-Gln	L-Ala-D-Gln	0,3
L-Ala-OMe	D-Ser	L-Ala-D-Ser	5,4
L-Thr-OMe		L-Thr-D-Ser	6,9
L-Ser-OMe		L-Ser-D-Ser	16,2
L-Val-OMe		L-Val-D-Ser	1,4
L-Met-OMe		L-Met-D-Ser	1,9
D-Ala-OMe	D-Gln	D-Ala-D-Gln	śl
D-Ala-OMe	D-Ser	D-Ala-D-Ser	0,2
D-Thr-OMe		D-Thr-D-Ser	1,1
D-Ser-OMe		D-Ser-D-Ser	2,5
D-Val-OMe		D-Val-D-Ser	0,5
D-Met-OMe		D-Met-D-Ser	2,7

(Wszystkie komponenty karboksylowe użyto w postaci chlorowodorków)

P r z y k ł a d 15

Specyficzność substratu enzymu (6)

Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia amidów różnych L-aminokwasów jako komponentów karboksylowych i różnych L-aminokwasów jako komponentów aminowych. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM sole amidów

L-aminokwasów (AA-NH2 · HCl) przedstawionych w tabeli 9, 150 mM L-aminokwasy przedstawione w tabeli 9 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w temperaturze 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w tabeli 9.

T a b e l a 9

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	0trzymany ( mM ) peptyd
L-Phe-NH2	L-Gln	L-Phe-L-Gln	0,2
L-Phe-NH2	L-Ser	L-Phe-L-Ser	0,6
L-Ala-NH2	L-Gln	L-Ala-L-Gln	7,6
L-Ala-NH2	L-Met	L-Ala-L-Met	3,4
L-Ala-NH2	L-His	L-Ala-L-His	3,9
L-Thr-NH2	L-Gln	L-Thr-L-Gln	0,3

P r z y k ł a d 16

Specyficzność substratu enzymu (7)

Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia różnych estrów metylowych L-alaniny jako komponentów karboksylowych i zabezpieczonych na węglu L-aminokwasów jako komponentów amiPL 211 730 B1 nowych. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM ester metylowy L-alaniny (Ala-OMe^HCl) przedstawiony w tabeli 10, 150 mM chlorowodorki amidu L-aminokwasów przedstawione w tabeli 10 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w temperaturze 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w tabeli 10.

T a b e l a 10

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd	(mM)
L-Ala-OMe	Gly-NH2	L-Ala-Gly-NH2	7,4
L-Ala-NH2	L-Ala-L-Ala-NH2	8,3
L-Phe-NH2	L-Ala-L-Phe-NH2	12,2

P r z y k ł a d 17

Specyficzność substratu enzymu (8)

Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia estrów metylowych różnych aminokwasów jako komponentów karboksylowych i metyloaminy jako komponentu aminowego. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorek estru metylowego aminokwasu (AA-OMe^HCl) przedstawiony w tabeli 11, 150 mM metyloaminę przedstawioną w tabeli 11 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w temperaturze 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w tabeli 11.

T a b e l a 11

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany (mM) peptyd
Gly-OMe	Metyloamina	Gly-metyloamina	1,1
L-Thr-OMe	L-Thr-metyloamina	0,2
L-Ala-OMe	L-Ala-metyloamina	0,3

P r z y k ł a d 18

Specyficzność substratu enzymu (9)

Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia estru β-aminokwasu jako komponentu karboksylowego lub β-aminokwasu jako komponentu aminowego. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM komponenty karboksylowe przedstawione w tabeli 12, 150 mM komponenty aminowe przedstawione w tabeli 12 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w temperaturze 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w tabeli 12. („śl oznacza ilość śladową.)

T a b e l a 12

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany (mM) peptyd
Gly-OMe	β-Ala	GlyJAla	2,2
Gly-OMe	β-Phe	GlyJPhe	0,4
L-Ala-OMe	β-Ala	AlaJAla	7,7
L-Ala-OMe	β-Phe	Ala-β-Phe	1,4
L-Thr-OMe	β-Ala	Thr^-Ala	3,2
L-Thr-OMe	β-Phe	Thr^-Plie	1,4
β-Ala-OMe	L-a-Ala	β-Ala-L-a-Ala	śl
β-Ala-OMe	β-Ala	β-Ala-β-Ala	0,2
β-Ala-OMe	L-Gln	β-Ala-L-Gln	0,6
β-Ala-OMe	L-Ser	β-Ala-L-Ser	3,2

PL 211 730 B1

P r z y k ł a d 19

Specyficzność substratu enzymu (10)

Zbadano wytwarzanie oligopeptydu w przypadku użycia estru L-aminokwasu jako komponentu karboksylowego i peptydu jako komponentu aminowego. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM komponenty karboksylowe przedstawione w tabeli 13, 150 mM komponenty aminowe przedstawione w tabeli 13 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w temperaturze 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w tabeli 13. W wyniku wykazano wyraźnie, że przedstawiony enzym może wytwarzać nie tylko dipeptyd, lecz także peptydy o długim łańcuchu przy użyciu peptydu jako komponentu aminowego. Jak pokazano w przedstawionych wcześniej przykładach 9 do 19, przedstawiony enzym otrzymany z Empedobacter brevis szczep FERM BP-8113 (depozyt: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 8 lipca 2002) wykazał wyjątkowo szeroki zakres specyficzności substratu.

T a b e l a 13

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd (mM)
L-Ala-OMe	L-Ala	L-Ala-L-Ala	28,7
L-Ala-L-Ala	L-Ala-L-Ala-L-Ala	57,5
L-Ala-L-Ala-L-Ala	L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala	44,5
L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala	L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala	34,8
L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala	L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala	1,4*
L-Ala-L-Gln	L-Ala-L-Ala-L-GIn	15,2
Gly-L-Ala	L-Ala-Gly-L-Ala	25,9
Gly-Gly	L-Ala-Gly-Gly	41,7
L-His-L-Ala	L-Ala-L-His-L-Ala	55,9
L-Leu-L-Ala	L-Ala-L-Leu-L-Ala	48,3
L-Phe-L-Ala	L-Ala-L-Phe-L-Ala	49,7
L-Phe-Gly	L-Ala-L-Phe-Gly	43,7
Gly-OMe	L-Ala-L-Tyr	Gly-L-Ala-L-Tyr	1,7
	Gly-L-Gln	Gly-Gly-L-Gln	7,2
	Gly-L-Tyr-L-Ala	Gly-Gly-L-Tyr-L-Ala	44,2
L-Thr-OMe	Gly-Gly	L-Thr-Gly-Gly	83,0

* Ponieważ rozpuszczalność L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala była niska, komponent karboksylowy użyto w tym układzie reakcyjnym przy stężeniu 10 mM a komponent aminowy przy stężeniu 15 mM.

Inne warunki były takie same jak podano w przykładzie. Dla wszystkich komponentów karboksylowych stosowano sole chlorowodorkowe.

P r z y k ł a d 20

Porównanie zdolności do katalizowania wytwarzania peptydów ze znanymi enzymami Porównano zdolność enzymu do tworzenia peptydów ze zdolnością znanych enzymów.

Jako znane enzymy zastosowano karboksypeptydazę Y opisaną w EP 278787A1 i tioloendopeptydazy (ficynę, papainę, bromelainę i chymopapainę) opisane w EP 359399B1, które użyto w postaci oczyszczonych enzymów produkowanych przez Sigma. Jako źródło enzymu użyto enzym oczyszczony w przykładzie 3. Enzymy te dodano do układu reakcyjnego w ilościach przedstawionych w tabeli 14 w przeliczeniu na białko. Reakcję prowadzono przez dodanie enzymu do 100 μl buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorek estru metylowego L-alaniny i 200 mM glutaminę i pozostawiono do reakcji w temperaturze 25°C. Ponadto, jako karboksypeptydaza był użyty

PL 211 730 B1 enzym rozpuszczony w 10 mM buforze octanowym (pH 5,0) zawierającym 1 mM EDTA, natomiast jako tioloendopeptydaza był użyty enzym rozpuszczony w 10 mM buforze octanowym (pH 5,0) zawierającym 2 mM EDTA, 0,1 M KCl i 5 mM ditiotreitol. Stosunki szybkości tworzenia przez te enzymy L-alanino-L-glutaminy przedstawiono w tabeli 14.

W rezultacie, nawet przy nieobecności enzymu zaobserwowano utworzenie śladowej ilości L-alanino-L-glutaminy, podczas gdy niewielki w porównaniu z szarżą bez dodanego enzymu wzrost szybkości tworzenia zauważono w szarży, w której dodano karboksypeptydazę lub tioloendopeptydazę. W przeciwieństwie do tego, zaobserwowano przytłaczające zwiększenie szybkości otrzymywania L-alanino-L-glutaminy w szarży, w której dodano enzym i ta szybkość otrzymywania była około 5000 do 100000 razy większa niż dla karboksypeptydazy Y i tioloendopeptydazy. Jak opisano wyżej, została potwierdzona niezwykle duża szybkość tworzenia peptydu, nieporównywalna z jakimkolwiek enzymem według znanego stanu wiedzy. Co więcej, w przeciwieństwie do enzymu według wynalazku, który jest dimerem o ciężarze cząsteczkowym około 75000, ponieważ ciężar cząsteczkowy karboksypeptydazy Y wynosi według doniesień 61000, podczas gdy ciężar cząsteczkowy tioloendopeptydazy wynosi według doniesień około 23000 do 36000, wykazana w przykładach szybkość tworzenia L-alanylo-L-glutaminy w stosunku do ciężaru cząsteczkowego jest dla enzymu według wynalazku jeszcze większa niż w stosunku do jednostki wagi.

T a b e l a 14

Enzym	Ilość dodanego enzymu (białko mg/ml)	Szybkość tworzenia L-Ala-L-Gln (mM/min)	Stosunek szybkości tworzenia L-Ala-L-Gln na jednostkę wagi enzymu
Brak enzymu	0	0,0006
Karboksypeptydaza Y	0,61	0,0257	0,0191
Ficyna	2,60	0,0096	0,0017
Papaina	2,30	0,0106	0,0021
Bromelaina	2,80	0,0062	0,0010
Chymopapaina	3,60	0,0100	0,0013
Enzym według wynalazku	0,02	4,4000	100,0

P r z y k ł a d 21

Otrzymywanie L-alanylo-L-glutaminy z użyciem komórek drobnoustrojowych Sphingobacterium sp. 50 ml pożywki (pH 7,0) zawierającej 5 g glukozy, 5 g siarczanu amonu, 1 g fosforanu monopotasowego, 3 g fosforanu dipotasowego, 0,5 g siarczanu magnezu, 10 g ekstraktu z drożdży i 10 g peptonu w 1 l, przeniesiono do 500 ml kolby Sakaguchi i sterylizowano przez 15 minut w 115°C w celu hodowania Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (Instytucja będąca depozytariuszem: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres instytucji będącej depozytariuszem: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002). Pożywkę tę zaszczepiono następnie jedną ezą Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (Instytucja będąca depozytariuszem: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres instytucji będącej depozytariuszem: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002) hodowanego przez 24 godziny w 30°C w skośnej pożywce agarowej (agar: 20 g/l, pH 7,0) zawierającej 5 g glukozy, 10 g ekstraktu z drożdży, 10 g peptonu i 5 g NaCl w 1 l, a następnie przez 20 godzin hodowano przy wytrząsaniu w 30°C przy 120 suwach/minutę. 1 ml porcję tego bulionu hodowlanego dodano następnie do opisanej wyżej pożywki (50 ml/500 ml kolba Sakaguchi) i hodowano przez 18 godzin w temperaturze 30°C. Po doprowadzeniu hodowli do końca, komórki drobnoustrojowe oddzielono od bulionu z hodowli przez odwirowanie i zawieszono w 0,1 M buforze boranowym (pH 9,0) zawierającym 10 mM EDTA do 100 g/l jako mokre komórki drobnoustrojowe. Do 0,1 ml tej zawiesiny dodano następnie 0,1 ml porcję 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 10 mM EDTA, 200 mM chlorowodorek estru metylowego L-alanylu i 400 mM L-glutaminę i po doprowadzeniu końcowej objętości do 0,2 ml pozostawiono na 120 minut do reakcji w temperaturze 25°C. Ilość L-alanylo-L-glutaminy otrzymanej w tym czasie wyniosła 62 mM.

PL 211 730 B1

P r z y k ł a d 22

Oczyszczanie enzymu ze Sphingobacterium sp.

Poniższą procedurę po oddzieleniu przez wirowanie przeprowadzono w lodzie lub w 4°C. Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (depozyt: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002) hodowano tak samo jak w przykładzie 21 i komórki drobnoustrojowe zebrano przez wirowanie (10000 obr/min, 15 minut). Po przemyciu 2 g komórek mikroorganizmów 20 mM buforem Tris-HCl (pH 7,6) zawieszono je w 8 ml tego samego buforu i poddawano przez 45 minut operacji miażdżenia za pomocą ultradźwięków przy 195 watach. Ciecz po miażdżeniu ultradźwiękami poddano wirowaniu (10000 obr/min, 30 minut) w celu usunięcia fragmentów zmiażdżonych komórek i otrzymania nadsączu cieczy po niszczeniu komórek ultradźwiękami. Ten nadsącz cieczy po zmiażdżeniu ultradźwiękami dializowano przez noc wobec 20 mM buforu Tris-HCl (pH 7,6), a następnie usunięto frakcję nierozpuszczalną przez ultrawirowanie (50000 obr/min, 30 minut) w celu otrzymania frakcji rozpuszczalnej w postaci nadsączu. Otrzymaną frakcję rozpuszczalną naniesiono na kolumnę z Q-Sepharose HP (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną buforem Tris-HCl (pH 7,6) i z niezaadsorbowanej frakcji zebrano frakcję aktywną. Tę frakcję aktywną dializowano przez noc wobec 20 mM buforu octanowego (pH 5,0), a następnie poddano usunięciu frakcji nierozpuszczalnej przez rozdział w wirówce (10000 obr/min, 30 minut) w celu otrzymania frakcji dializowanej w postaci nadsączu. Następnie tę frakcję dializowaną naniesiono na kolumnę z SP-Sepharose HP (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną 20 mM buforem octanowym (pH 5,0) w celu otrzymania frakcji aktywnej, w której eluowano enzym przy liniowym gradiencie stężenia tego samego buforu zawierającego 0 do 1 M NaCl.

P r z y k ł a d 23

Otrzymywanie L-alanylo-L-glutaminy z użyciem frakcji enzymu 10 ul porcję frakcji z SP-Sepha rose HP (około 27 J/ml) oczyszczonej w przykładzie 22 dodano do 90 ul 111 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 111 mM chlorowodorek estru metylowego L-alaniny, 222 mM L-glutaminę i 11 mM EDTA i pozostawiono do reakcji na 120 minut w 25°C. W rezultacie, w szarży z dodanym enzymem otrzymano 73 mM L-alanylo-L-glutaminę. Z drugiej strony, w szarży bez dodanego enzymu niemal nie obserwowano wytwarzania L-Ala-L-Glu, a ilość enzymu po reakcji trwającej 120 minut wynosiła około 0,07 mM.

P r z y k ł a d 24

Specyficzność substratu enzymu (11)

Specyficzność substratu badano dla enzymu pochodzącego ze Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (depozyt: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002). 100 ul 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego różne komponenty karboksylowe o końcowym stężeniu 100 mM i różne komponenty aminowe o stężeniu końcowym 150 mM przedstawione w tabelach 15-1 do 15-4, frakcję enzymu z SP-Sepharose HP oczyszczoną w przykładzie 22 (dodanie 0,33 jednostek w cieczy reakcyjnej) i 10 mM EDTA pozostawiono na 1,5 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z otrzymanych w tej reakcji peptydów przedstawiono w tabeli 15. (Znak „+ oznacza te peptydy dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy „śl oznacza ilość śladową.) W przypadku użycia L-Tyr-OMe do układu reakcyjnego dodano ponadto Tween-80 do stężenia końcowego 0,1%. Ponadto wszystkie komponenty karboksylowe były użyte jako chlorowodorki.

T a b e l a 15-1

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd (mM)
1	2	3	4
L-Ala-OMe	Gly	L-Ala-Gly	11,1
L-Ala	L-Ala-L-Ala	13,1
L-Val	L-Ala-L-Val	10,9
L-Leu	L-Ala-L-Leu	33,0
L-Ile	L-Ala-L-Ile	24,7

PL 211 730 B1 cd. tabeli15-1

1	2	3	4
	L-Met	L-Ala-L-Met	86,9
L-Pro	L-Ala-L-Pro	1,5
L-Phe	L-Ala-L-Phe	69,5
L-Trp	L-Ala-L-Trp	46,0
L-Thr	L-Ala-L-Thr	47,3
L-Asn	L-Ala-L-Asn	52,3
L-Tyr	L-Ala-L-Tyr	11,1
L-CySH	L-Ala-L-CySH	+
L-Lys	L-Ala-L-Lys	71,2
L-Arg	L-Ala-L-Arg	72,2
L-His	L-Ala-L-His	73,6
L-Asp	L-Ala-L-Asp	2,3
L-Glu	L-Ala-L-Glu	39,1
L-Ser	L-Ala-L-Ser	43,8
D-Ser	L-Ala-D-Ser	3,3
D-Ala-OMe	L-Ser	D-Ala-L-Ser	24,1
D-Ser	D-Ala-D-Ser	5,5

T a b e l a 15-2

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd (mM)
L-Thr-OMe	L-Gln	L-Thr-L-Gln	36,1
Gly-OMe		Gly-L-Gln	61,1
L-Ser-OMe		L-Ser-L-Gln	12,9
L-Val-OMe		L-Val-L-Gln	8,2
L-Met-OMe		L-Met-L-Gln	32,6
L-Ile-OMe		L-Ile-L-Gln	6,4
L-Arg-OMe		L-Arg-L-Gln	17,2
L-Tyr-OMe		L-Tyr-L-Gln	0,6
L-Pro-OMe		L-Pro-L-Gln	1,8
L-Phe-OMe		L-Phe-L-Gln	0,8
L-Gln-OMe		L-Gln-L-Gln	0,1
Asp-a-OMe		a-L-Asp-L-Gln	0,05

T a b e l a 15-3

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd (mM)
1	2	3
L-Thr-OMe	Gly	L-Thr-Gly	0,4
L-Ala	L-Thr-L-Ala	5,8
L-Val	L-Thr-L-Val	1,3
L-Leu	L-Thr-L-Leu	15,3

PL 211 730 B1 cd. tabeli 15-3

1	2	3	4
	L-Met	L-Thr-L-Met	28,9
L-Arg	Gly-L-Arg	17,9
Gly-OMe	L-Phe	Gly-L-Phe	20,0
L-His	Gly-L-His	36,2
L-Lys	Gly-L-Lys	48,2
L-Ser	Gly-L-Ser	53,8
L-Ser-OMe	L-Ser	L-Ser-L-Ser	9,9
L-Met	L-Ser-L-Met	7,6
L-Phe	L-Ser-L-Phe	4,3
L-Val-OMe	L-Ser	L-Val-L-Ser	31,9
L-Met	L-Val-L-Met	6,8
L-Phe	L-Val-L-Phe	1,0
L-Met-OMe	L-Ser	L-Met-L-Ser	25,3
L-Met	L-Met-L-Met	28,4
L-Phe	L-Met-L-Phe	8,9
L-Ile-OMe	L-Ser	L-Ile-L-Ser	17,3
L-Met	L-Ile-L-Met	5,1
L-Phe	L-Ile-L-Phe	1,5
L-Arg-OMe	L-Ser	L-Arg-L-Ser	2,2
L-Met	L-Arg-L-Met	śl
L-Phe	L-Arg-L-Phe	śl

T a b e l a 15-4

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd (mM)
L-Ala-OMe	Gly amid	L-Ala-Gly amid	15,1
L-Ala amid	L-Ala-L-Ala amid	9,2
L-Phe amid	L-Ala-Phe amid	27,1
L-Ala-OMe	Metyloamina	L-Ala-metyloamina	0,6
L-Thr-OMe	L-Thr-metyloamina	0,3
Gly-OMe	Gly-metyloamina	1,0
L-Ala amid	L-Gln	L-Ala-L-Gln	0,3
L-Met	L-Ala-L-Met	śl
L-His	L-Ala-L-His	śl

P r z y k ł a d 25

Specyficzność substratu enzymu (12)

Specyficzność substratu w odniesieniu do wytwarzania oligopeptydów badano dla enzymu pochodzącego ze Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (depozyt: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002). 100 μl porcję buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego różne komponenty karboksylowe o końcowym stężeniu 100 mM i różne komponenty aminowe o stężeniu końcowym 150 mM

PL 211 730 B1 przedstawione w Tabeli 16, frakcję enzymu z SP-Sepharose HP oczyszczoną w przykładzie 22 (dodanie 0,33 jednostek w cieczy reakcyjnej) i 10 mM EDTA pozostawiono na 1,5 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z otrzymanych w tej reakcji peptydów przedstawiono w tabeli 18. Wszystkie komponenty karboksylowe były ponadto użyte jako chlorowodorki.

T a b e l a 16

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Otrzymany peptyd (mM)
1	2	3
	L-Ala	L-Ala-L-Ala	25,6
	L-Ala-L-Ala	L-Ala-L-Ala-L-Ala	41,1
	L-Ala-L-Ala-L-Ala	L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala	30,1
	L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala	L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala	22,8
L-Ala-OMe	Gly-Gly	L-Ala-Gly-Gly	33,7
Gly-Ala	L-Ala-Gly-L-Ala	35,1

	L-His-L-Ala	L-Ala-L-His-L-Ala	58,0
	L-Phe-Gly	L-Ala-L-Phe-Gly	34,0
	L-Leu-L-Ala	L-Ala-L-Leu-L-Ala	40,7
	L-Phe-L-Ala	L-Ala-L-Phe-L-Ala	24,8
L-Thr-OMe	Gly-Gly	L-Thr-Gly-Gly	8,4
Gly-OMe	L-Ala-L-Tyr	Gly-L-Ala-L-Tyr	0,6

P r z y k ł a d 26

Specyficzność substratu enzymu (13)

Specyficzność substratu oceniono dodatkowo stosując tę samą frakcję enzymu jak użyta w przykładzie 5.

T a b e l a 17

Komponent karboksylowy (mM)	Komponent aminowy (mM)	Otrzymany peptyd (mM)	Czas reakcji (h)
1	2	3	4
H-Ala-OMe	H-p-F-Phe-OH	H-Ala-p-F-Phe-OH	3
50 mM	50 mM	21,9 mM	3
H-Ala-OMe	H-Cl-F-Phe-OH	H-Ala-Cl-F-Phe-OH	3
40 mM	40 mM	20,8 mM	3
H-Ala-OMe	H-p-NO2-Phe-OH	H-Ala-p-NO2-Phe-OH	3
40 mM	40 mM	27,5 mM
H-Ala-OMe	H-t-Leu-OH	H-Ala-t-Leu-OH
100 mM	150 mM	0,4 mM
H-Ala-OMe	H-2-Nal-OH	H-Ala-2-Nal-OH
20 mM	20 mM	+
H-p-F-Phe-OMe	H-Gln-OH	H-p-F-Phe-H-Gln-OH	3
100 mM	150 mM	śl	3
H-Cl-F-Phe-OMe	H-Gln-OH	H-Cl-F-Phe-H-Gln-OH	3
25 mM	50 mM	śl	3
H-p-NO2-Phe-0Me	H-Gln-OH	H-p-NO2-Phe-H-Gln-	3

PL 211 730 B1 cd. tabeli 17

1	2	3	4
40 mM	40 mM	OH 1,1 mM	3
H-t-Leu-OMe	H-Gln-OH	H-t-Leu-H-Gln-OH	3
100 mM	150 mM	śl
H-2-Nal-OMe	H-Gln-OH	H-2-Nal-H-Gln-OH
40 mM	40 mM	śl
H-Aib-OMe	H-Gln-OH	H-Aib-H-Gln-OH
100 mM	150 mM	18,8 mM
H-N-Me-Ala-OMe	H-Gln-OH	H-N-Me-Ala-H-Gln-OH
100 mM	150 mM	0,5 mM
H-Aib-OMe	H-Phe-OH	H-Aib-Phe-OH	3
100 mM	150 mM	17,2 mM	3
H-CHA-OMe	H-Phe-OH	H-CHA-Phe-OH	3
40 mM	40 mM	+
H-N-Me-Ala-OMe	H-Phe-OH	H-N-Me-Ala-Phe-OH
100 mM	150 mM	śl
H-Ala-OMe	H-Ser(tBu)OH	H-Ala-Ser(tBu)-OH	2
100 mM	150 mM	48,8 mM	2
H-Ser (tBu)-OMe	H-Gln-OH	H-Ser(tBu)-Gln-OH	2
100 mM	150 mM	śl	2
H-Ala-OMe	H-Asp(OtBu)OH	H-Ala-Asp(OtBu)-OH	2
100 mM	150 mM	62,6 mM	2
H-Asp(OtBu)OMe	H-Gln-OH	H-Asp(OtBu)-Gln-OH
100 mM	150 mM	0,9 mM
H-Ala-OMe	H-Lys(Boc)OH	H-Ala-Lys(Boc)-OH
100 mM	150 mM	51,0 mM
H-Lys(Boc)OMe	H-Gln-OH	H-Lys(Boc)-Gln-OH
100 mM	ISO mM	+

100 ul roztworu reakcyjnego składającego się ze 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego każdy z komponentów karboksylowych i komponentów aminowych przedstawionych w tabeli 17, enzymu (dodanie 0,1 jednostki w roztworze reakcyjnym) i 10 mM EDTA pozostawiono na czas podany w tabeli 17 do reakcji w 25°C. Ilości każdego z otrzymanych w tej reakcji peptydów przedstawiono w tabeli 17. (Znak „+ oznacza te peptydy, dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy „śl oznacza ilość śladową.)

Skróty

H-Ala-OMe: chlorowodorek estru metylowego L-alaniny

H-p-F-Phe-OMe: chlorowodorek estru metylowego p-fluoro-L-fenyloalaniny

H-Cl-F-Phe-OMe: chlorowodorek estru metylowego p-chloro-L-fenyloalaniny

H-p-NO2-Phe-OMe: chlorowodorek estru metylowego p-nitro-L-fenyloalaniny

H-t-Leu-OMe: chlorowodorek estru metylowego tert-L-leucyny

H-2-Nal-OMe: chlorowodorek estru metylowego 3-(2-naftylo)-L-alaniny

H-Aib-OMe: chlorowodorek estru metylowego kwasu α-aminoizomasłowego

H-N-Me-Ala-OMe: chlorowodorek estru metylowego N-metylo-L-alaniny

H-CHA-OMe: chlorowodorek estru metylowego β-cykloheksylo-L-alaniny

PL 211 730 B1

H-Ser(tBu)-OMe: chlorowodorek estru metylowego O-tert-butylo-L-seryny

H-Asp (OtBu)-OMe: chlorowodorek estru α-metylowego estru β-tert-butylowego kwasu L-asparaginowego

H-Lys(Boc)-OMe: chlorowodorek estru metylowego N-i-tert-butoksykarbonylo-L-lizyny

H-p-F-Phe-OH: p-fluoro-L-fenyloalanina

H-Cl-F-Phe-OH: p-chloro-L-fenyloalanina

H-p-NO2-Phe-OH: p-nitro-L-fenyolalanina

H-t-Leu-OH: tert-L-leucyna

H-2-Nal-OH: 3-(2-naftylo)-L-alanina

H-Gln-OH: L-glutamina

H-Phe-OH: L-fenyloalanina

H-Ser(tBu)-OH: O-tert-butylo-L-seryna

H-Asp(OtBu)-OH: ester β-tert-butylowy kwasu L-asparaginowego

H-Lys(Boc)-OH: N-i-tert-butoksykarbonylo-L-lizyna

P r z y k ł a d 27

Specyficzność substratu enzymu (14)

Specyficzność substratu w odniesieniu do wytwarzania oligopeptydu oceniono stosując tę samą frakcję enzymu co w przykładzie 26. 100 μl porcję roztworu reakcyjnego składającego się ze 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego każdy z komponentów karboksylowych i komponentów aminowych w stężeniach końcowych przedstawionych w tabeli 18, enzymu (liczby jednostek dodanych do roztworu reakcyjnego przedstawiono w tabeli 18) i 10 mM EDTA pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z otrzymanych w tej reakcji oligopeptydów przedstawiono w tabeli 18. (Znak „+ oznacza te peptydy, dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy „śl oznacza ilość śladową.) Należy zauważyć, że wszystkie komponenty karboksylowe były użyte jako chlorowodorki.

T a b e l a 18

Komponent karboksylowy	Komponent aminowy	Ilość enzymu (jednostki )	Otrzymany peptyd (mM)
Gly-OMe	L-Phe-L-Met	1,0	Gly-Phe-Met	13,3
L-Ala-OMe	L-Phe-L-Met	0,2	L-Ala-L-Phe-L-Met	+
L-Tyr-OMe	Gly-Gly-L-Phe-L-Met	1,0	L-Tyr-Gly-Gly-L-Phe-L-Met	2,7
L-Ala-OMe	Gly-Gly-L-Phe-L-Met	0,2	L-Ala-Gly-Gly-L-Phe-L-Met	+
Gly-OMe	Gly-L-Phe	0,1	Gly-L-Phe	17,3
L-Ala-OMe	Gly-L-Phe	0,1	L-Ala-Gly-L-Phe	+
D-Ala-OMe	Gly-L-Phe	0,1	D-Ala-Gly-L-Phe	śl

Wynalazek dotyczy nowego enzymu, dzięki któremu można łatwo, niedrogo i z wysoką wydajnością wytwarzać peptyd przez ograniczenie stosowania złożonych metod syntezy takich jak wprowadzanie i usuwanie grup zabezpieczających.

Claims

1. Enzym pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Sphingobacterium, znamienny tym, że z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego tworzy peptyd, przy czym enzym ma masę cząsteczkową 75 000 według oznaczenia elektroforetycznego w żelu SDS a według oznaczenia chromatografią filtracyjną w żelu ma masę cząsteczkową 150 000 a szczepem jest Shingobacterium sp. FERM BP-8124.

2. Enzym według zastrz. 1, znamienny tym, że z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego tworzy peptyd i L-alanylo-L-glutaminę, z szybkością wytwarzania 0,03 mM/min lub większą, w reakcji wytwarzania dipeptydu (i)-(iv) :

(i) komponent karboksylowy stanowi chlorowodorek estru metylowego L-alaniny w ilości 100 mM, (ii) komponent aminowy stanowi L-glutamina w ilości 200 mM,

PL 211 730 B1 (iii) pH wynosi 9,0 oraz (iv) ilość dodanego enzymu oczyszczonego do homogeniczności, jako ilość białka, jest mniejsza niż 0,61 mg/ml.

3. Enzym według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że substrat komponent karboksylowy obejmuje zarówno ester aminokwasu i amid aminokwasu.

4. Enzym według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że substrat komponent aminowy obejmuje dowolny aminokwas, aminokwas o zabezpieczonym atomie węgla i aminę.

5. Enzym według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że tworzy peptyd w zakresie pH 6,5-10,5.

6. Enzym według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że tworzy peptyd w zakresie temperatury 0-60°C.

7. Enzym według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że enzym jest niewrażliwy na hamowanie przez inhibitor enzymu serynowego, fluorek fenylometylosulfonylu ale jest inhibowalny przez p'-guanidynobenzoesan p-nitrofenylu.

8. Mikroorganizm Shingobacterium sp. FERM BP-8124,

9. Sposób wytwarzania dipeptydu, znamienny tym, że obejmuje otrzymywanie dipeptydu z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego, w którym stosuje się enzym okreś lony w zastrz. 1 lub 2 lub substancję zawierającą ten enzym.