PL212182B1 - Sposób wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny z użyciem substratu fluoro/chromogennego, zestaw do wykrywania i/lub oznaczania aktywności esterazy lowastatyny oraz zastosowanie substratu fluoro/chromogennego do pozaustrojowego wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej - Google Patents

Sposób wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny z użyciem substratu fluoro/chromogennego, zestaw do wykrywania i/lub oznaczania aktywności esterazy lowastatyny oraz zastosowanie substratu fluoro/chromogennego do pozaustrojowego wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej

Info

Publication number
PL212182B1
PL212182B1 PL383818A PL38381807A PL212182B1 PL 212182 B1 PL212182 B1 PL 212182B1 PL 383818 A PL383818 A PL 383818A PL 38381807 A PL38381807 A PL 38381807A PL 212182 B1 PL212182 B1 PL 212182B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
fluoro
alkyl
chromogenic substrate
detection
group
Prior art date
Application number
PL383818A
Other languages
English (en)
Other versions
PL383818A1 (pl
Inventor
Ryszard Ostaszewski
Waldemar Kurek
Olga Piotrowska
Dominik Koszelewski
Original Assignee
Inst Chemii Organicznej Polska Akademia Nauk
Instytut Chemii Organicznej Polska Akademia Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Chemii Organicznej Polska Akademia Nauk, Instytut Chemii Organicznej Polska Akademia Nauk filed Critical Inst Chemii Organicznej Polska Akademia Nauk
Priority to PL383818A priority Critical patent/PL212182B1/pl
Priority to PCT/PL2008/000085 priority patent/WO2009067031A1/en
Publication of PL383818A1 publication Critical patent/PL383818A1/pl
Publication of PL212182B1 publication Critical patent/PL212182B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/06—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2
    • C07D311/08—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring
    • C07D311/16—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring substituted in position 7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/06—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2
    • C07D311/08—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring
    • C07D311/18—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring substituted otherwise than in position 3 or 7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy Iowastatyny z użyciem substratu fluoro/chromogennego, zestawu do wykrywania i/lub oznaczania aktywności esterazy Iowastatyny oraz zastosowania substratu fluoro/chromogennego do pozaustrojowego wykrywania i/lub oznaczania i aktywności enzymatycznej.
Enzym, esteraza lowastatyny, niezależnie od źródła pochodzenia, jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy wiązania estrowego łańcucha bocznego kwasu 2-metylomasłowego lowastatyny i jej pochodnych. Enzym ten może być pozyskany między innymi z hodowli grzyba Clonostachys compactiuscula, zdeponowanego pod numerem ATCC 38009 lub ATCC 74178. Enzym charakteryzuje się wysoką selektywnością względem struktury łańcucha bocznego lowastatyny i nie katalizuje hydrolizy innej statyny o bardzo podobnej budowie, tj. symwastatyny i jej pochodnych. Właściwość ta jest wykorzystywana w procesie wytwarzania oczyszczonej symwastatyny. Zastosowanie esterazy lowastatyny w procesie syntezy symwastatyny jest ujawnione w opisie patentowym USA 5,223,415.
W toku procesu syntezy, z soli potasowej lowastatyny (la: M = K) otrzymuje się mieszaninę soli amonowych lowastatyny (la: M = NH4) i symwastatyny (Ib: M = NH4), którą poddaje się selektywnej hydrolizie w obecności materiału pochodzenia biologicznego zawierającego esterazę lowastatyny, albo hydrolizie z użyciem oczyszczonego enzymu, według schematu I.
Aby proces mógł przebiegać z dużą wydajnością i selektywnością enzym ten powinien być wydzielony z materiału biologicznego i oczyszczony. Oznaczanie aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny z użyciem substratu barwnego, takiego jak ester o-nitrofenylowy kwasu masłowego, jest ujawnione w opisie patentowym USA 5,223,415. Jednakże niski współczynnik ekstynkcji molowej o-nitrofenolu, będącego produktem hydrolizy tego estru, oraz niska selektywność substratu barwnego wykazywana w reakcji hydrolizy względem innych enzymów hydrolitycznych obecnych w materiale biologicznym, utrudnia uzyskanie dokładnego oznaczenia.
W metodzie ujawnionej przez Schimmel'a i współpr. (Appl. Environ. Microbiology, 1997, 63, str. 1307-1311), oznaczanie aktywności enzymu przeprowadza się z użyciem soli amonowej lowastatyny (la: M = NH4), a wielkością mierzoną jest stopień konwersji lowastatyny (la: M=NH4) do „triolu” (lc: M=NH4) określany za pomocą izokratycznej wysokosprawnej chromatografii cieczowej w fazach odwróconych. Metoda ta jest kosztowna ze względu na rodzaj stosowanego substratu oraz technikę oznaczania. Nadto, metoda nie może być stosowana do badania małych próbek materiału biologicznego oraz do wykrywania obecności enzymu na żelu w metodzie elektroforezy.
Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny z użyciem substratu fluoro/chromogennego, zestaw do wykrywania i/lub oznaczania aktywności esterazy lowastatyny oraz zastosowanie substratu fluoro/chromogennego do pozaustrojowego wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej.
PL 212 182 B1
Sposób wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny, z użyciem substratu fluoro/chromogennego, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się substrat fluoro/chromogenny o wzorze II,
w którym:
R oznacza C1-C6-alkil,
R' oznacza jeden lub dwa podstawniki pierścienia A niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, OH, CN, NO2,
R'' oznacza jeden lub dwa lub trzy podstawniki pierścienia B niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, który to substrat dodaje się do materiału o aktywności enzymatycznej i prowadzi się reakcję hydrolizy pod działaniem enzymu, następnie wykrywa się i/lub oznacza się uwolniony związek kumarynowy o wzorze III
w którym:
R' i R mają wyżej podane znaczenia, aby wykrywać i/lub oznaczać aktywność enzymatyczną esterazy lowastatyny.
Korzystnie, stosuje się substrat fluoro/chromogenny o wzorze II, w którym:
R oznacza C1-C6-alkil,
R' oznacza jeden lub dwa podstawniki pierścienia A niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, C1-C6-alkil,
R'' oznacza jeden lub dwa lub trzy podstawniki pierścienia B niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, C1-C6-alkil.
Stosuje się, zwłaszcza, substrat fluoro/chromogenny o wzorze II, w którym:
R oznacza metyl lub C3-C6-alkil, wybrany z grupy obejmującej mieszaninę racemiczną substrat wzbogacony w enancjomer R, substrat wzbogacony w enancjomer S, optycznie czysty enancjomer S i optycznie czysty enancjomer R.
Korzystnie, stosuje się substrat fluoro/chromogenny wybrany z grupy obejmującej:
ester 2-okso-2H-chromen-7-ylowy kwasu 2-metylomasłowego, ester 4-metylo-2-okso-2H-chromen-7-ylowy kwasu 2-metylomasłowego.
Stosuje się, zwłaszcza, substrat fluoro/chromogenny w postaci mieszaniny racemicznej, mieszaniny wzbogaconej w enancjomer R, mieszaniny wzbogaconej w izomer S, optycznie czystego enancjomeru S i optycznie czystego enancjomeru R.
Korzystnie, reakcję hydrolizy prowadzi się w roztworze buforowanym.
W szczególności, reakcję hydrolizy prowadzi się kontrolując zmiany pH i korygując pH z użyciem zasady.
Reakcję hydrolizy prowadzi się, zwłaszcza, przy pH w zakresie od 6 do 11,5.
Korzystnie, reakcję hydrolizy prowadzi się przy pH w zakresie od 7,5 do 11, a zwłaszcza przy pH w zakresie od 8,5 do 10,5.
Korzystnie, reakcję hydrolizy prowadzi się w temperaturze od 20°C do 50°C, a zwłaszcza w temperaturze od 26°C do 40°C.
PL 212 182 B1
Korzystnie, uwolniony związek kumarynowy o wzorze III wykrywa się i/lub oznacza się metodą spektrofotometryczną.
Ewentualnie, uwolniony związek kumarynowy o wzorze III wykrywa się i/lub oznacza metodą fluorescencyjną.
Korzystnie, oznacza się ilościowo związek kumarynowy i wyznacza zawartość/aktywność esterazy lowastatyny.
Zestaw do wykrywania i/lub oznaczania aktywności esterazy lowastatyny, według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera substrat fluoro/chromogenny o wzorze Il
w którym:
R oznacza C1-C6-alkil,
R' oznacza jeden lub dwa podstawniki pierścienia A niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, OH, CN, NO2,
R'' oznacza jeden lub dwa lub trzy podstawniki pierścienia B niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, oraz kompatybilny rozcieńczalnik.
Według wynalazku, substrat fluoro/chromogenny o wzorze Il
w którym:
R oznacza C1-C6-alkil,
R' oznacza jeden lub dwa podstawniki pierścienia A niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, OH, CN, NO2,
R” oznacza jeden lub dwa lub trzy podstawniki pierścienia B niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, stosuje się do pozaustrojowego wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny.
Korzystnie, substrat fluoro/chromogenny stosuje się do wykrywania esterazy lowastatyny na żelu w metodzie elektroforezy.
Ewentualnie, substrat fluoro/chromogenny stosuje się do wykrywania i/lub oznaczania esterazy lowastatyny w eluacie w metodzie chromatograficznej.
Substrat fluoro/chromogenny stosuje się, zwłaszcza, do wykrywania i/lub oznaczania esterazy lowastatyny w sposobie wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny.
Stosowanie enzymu EL w procesie biotechnologicznym wymaga uprzedniego oznaczenia jego aktywności i oczyszczenia z wydzieleniem właściwej frakcji. Metoda wykrywania i/lub oznaczania aktywności według wynalazku charakteryzuje się wysoką czułością powtarzalnością oraz prostotą wykonania. Dzięki temu, że produkt reakcji jest substancją wykazującą silną absorpcję w świetle widzialnym lub UV i/lub wykazującą fluorescencję w UV, efekt hydrolityczny enzymu jest wykrywany z użyciem optycznych metod detekcji (takich jak fotometria, spektrofotometria, fluorescencja, luminescencja), które zapewniają wysoki standard oznaczeń.
PL 212 182 B1
W szczególności, oznaczanie bardzo małych ilości enzymu jest możliwe z zastosowaniem substratu fluoro/chromogennego, z którego w wyniku reakcji katalizowanej przez oznaczany enzym powstaje produkt wykazujący silną fluorescencję. Jeśli zarazem sam substrat substratu fluoro/chromogenny nie wykazuje fluorescencji, to można go użyć do jakościowego i ilościowego oznaczania nawet bardzo małych ilości enzymu. Ponieważ zmiany fluorescencji w jednostce czasu są proporcjonalne do stężenia enzymu, możliwe jest określenie ilości enzymu nawet w bardzo rozcieńczonych próbkach. Z wykorzystaniem metody wykrywania i/lub oznaczania według wynalazku, proces wydzielania i oczyszczania enzymu jest bardzo ułatwiony.
Termin substrat fluoro/chromogenny w obrębie opisu niniejszego wynalazku i zastrzeżeń patentowych, określa substrat reakcji enzymatycznej, w której pod działaniem enzymu, esterazy lowastatyny, substrat fluoro/chromogenny jest rozszczepiany z wytworzeniem związku fluoryzującego i/lub barwnego, wykrywalnego metodami optycznymi, w szczególności drogą pomiaru fluorescencji i/lub absorpcji w świetle widzialnym i UV.
Termin „triol” w obrębie opisu niniejszego wynalazku i zastrzeżeń patentowych określa związek o wzorze Ic
w którym:
M oznacza atom wodoru, a także w którym M oznacza kation metalu, amonowy lub amoniowy, tj. związek w postaci wolnego kwasu lub postaci soli, o ile w konkretnym przypadku nie określono inaczej. Z uwagi, że związek Ic w postaci wolnego kwasu (M = H) łatwo ulega laktonizacji, termin „triol” może też obejmować postać laktono-diolu o wzorze Id, o ile w konkretnym przypadku nie określono inaczej.
Nazwy „lowastatyna” i „symwastatyna” oznaczają odpowiednio związki o wzorach Ie i If
W obrębie opisu niniejszego wynalazku i zastrzeżeń patentowych, nazwy „lowastatyna” i „symwastatyna” obejmują także postacie kwasów karboksylowych tych związków, o wzorach Ia i Ib (M = H)
PL 212 182 B1 a także sole związków o wzorach Ia i Ib, o ile w konkretnym przypadku nie określono inaczej. „Sól lowastatyny” oznacza związek o wzorze la, w którym M oznacza kation metalu, amonowy lub amoniowy, a „sól symwastatyny” oznacza związek o wzorze Ib, w którym M stanowi oznacza kation metalu, amonowy lub amoniowy.
Esteraza lowastatyny w obrębie opisu niniejszego wynalazku i zastrzeżeń patentowych określa materiał komórkowy lub bezkomórkowy pochodzenia naturalnego lub rekombinantowego o czynności enzymatycznej, która to czynność przejawia się w katalizowaniu hydrolizy lowastatyny i jej soli, z wytworzeniem triolu o wzorze Ic (M = H) lub jego soli lub pochodnej, przy czym symwastatyna i jej sole w analogicznych warunkach hydrolizy enzymatycznej nie ulegają hydrolizie tego rodzaju albo ulegają hydrolizie z szybkością co najmniej o rząd wielkości mniejszą.
Substratem fluoro/chromogennym według wynalazku jest związek o wzorze Il
w którym:
R oznacza C1-C6-alkil,
R' oznacza jeden lub dwa podstawniki pierścienia A niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, OH, CN, NO2,
R'' oznacza jeden lub dwa lub trzy podstawniki pierścienia B niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl.
Korzystnie, R' oznacza jeden lub dwa podstawniki pierścienia A niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, C1-C6-alkil, a R'' oznacza jeden lub dwa lub trzy podstawniki pierścienia B niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, C1-C6-alkil.
Jeśli we wzorze 1 podstawnik R oznacza metyl lub C3-C6-alkil, to oznaczony gwiazdką atom węgla grupy C2H5*CH(R)-C(O)-O- jest atomem chiralnym, wskutek czego substrat fluoro/chromogenny może występować w postaci mieszaniny racemicznej złożonej z mieszaniny enancjomerów R i S. W sposobie według wynalazku do wykrywania i/lub oznaczania enzymu EL stosuje się substrat fluoro/chromogenny wybrany z grupy obejmującej mieszaninę racemiczną substrat wzbogacony w enancjomer R1 substrat wzbogacony w izomer S, optycznie czysty enancjomer S i optycznie czysty enancjomer R.
Substrat fluoro/chromogenny o wzorze II, według wynalazku stosuje się do wykrywania i oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny w surowych i oczyszczonych preparatach biologicznych otrzymanych z organizmów naturalnych i/lub genetycznie modyfikowanych. W reakcji hydrolizy katalizowanej przez enzym, przedstawionej na schemacie II
powstają związki kumarynowe o wzorze III (w którym R' i R'' mają wyżej podane znaczenia), które silnie pochłaniają promieniowanie w zakresie widzialnym i/lub UV, i/lub silnie fluoryzują co umożliwia wykrywanie i/lub oznaczanie uwolnionego związku kumarynowego o wzorze III metodami optycznymi.
Pozwala to na szybkie jakościowe i ilościowe oznaczanie enzymu, esterazy lowastatyny, w próbkach. W szczególności, wykrywanie obecności i/lub oznaczanie odpowiednich związków kuPL 212 182 B1 marynowych o wzorze 2, przeprowadza się metodami spektrofotometrycznymi i/lub spektrofluorymetrycznymi.
Oznaczenia takie można prowadzić dla różnych preparatów biologicznych zawierających enzym o takiej czynności, niezależnie od ich pochodzenia, w roztworach wodnych, w procesie oczyszczania enzymu, w procesie jego immobilizacji, w badaniu aktywności próbek otrzymywanych w procesie oczyszczania tego enzymu po rozdziale metodą średniociśnieniowej chromatografii cieczowej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej, hodowlach inokulum, fermentacji w skali laboratoryjnej i przemysłowej. Ponadto stosując związek o wzorze Il, jako substrat w metodzie wykrywania i oznaczania aktywności enzymatycznej, można wykrywać obecność esterazy lowastatyny na żelach po procesie rozdziału próbek metodą elektroforezy. Identyfikacja taka polega na oświetleniu powierzchni żelu np. światłem UV o długości fali 366 nm i obserwacji fluoryzującego prążka na jego powierzchni, w miejscu, gdzie znajduje się produkt reakcji katalizowanej przez enzym, tj. związek kumarynowy o wzorze III.
Rozwiązania według wynalazku są bliżej objaśnione w poniższych przykładach realizacji i zilustrowane rysunkiem, na którym fig. 1 przedstawia zmianę intensywności fluorescencji (w jednostkach względnych) substratu wywołaną kinetycznym efektem katalitycznym enzymu w funkcji czasu oraz fig. 2, która przedstawia zmiany aktywności właściwej enzymu w funkcji pH, określone z wykorzystaniem tegoż substratu. W obrębie poniższych przykładów określenie enzym EL oznacza enzym, esterazę lowastatyny.
P r z y k ł a d y
Substraty fluoro/chromogenne o wzorze Il otrzymuje się w typowy sposób, przedstawiony na schemacie III, w reakcji pomiędzy podstawionym związkiem kumarynowym a pochodną alifatycznego kwasu karboksylowego o wzorze C2H5CH(R)COOH, w którym R oznacza C1-C6-alkil. W korzystnej realizacji stosuje się pochodną kwasu 2-metylo- masłowego (R oznacza metyl). Pochodną alifatycznego kwasu karboksylowego, korzystnie jest aktywna postać kwasu, taka jak halogenek kwasowy, aktywny ester, bezwodnik kwasowy lub mieszany bezwodnik uzyskany in situ albo przygotowany uprzednio. Reakcję prowadzi się zazwyczaj w rozpuszczalnikach polarnych aprotycznych, np. tetrahydrofuranie, chlorku metylenu lub w węglowodorach aromatycznych, albo w ich mieszaninach, w obecności zasady organicznej (takiej jak trietyloamina, pirydyna, lutydyna) lub nieorganicznej (takiej jak węglan sodu lub potasu), w temperaturze od 0 do 100°C, przez 1-24 godziny.
Schemat III
R3 R1 R3 R1
R5 R6 R5 (IV) (V)
P r z y k ł a d 1
Otrzymywanie racemicznego estru 2-okso-2H-chromen-7-ylowego kwasu 2-metylomasłowego
Roztwór 7-hydroksykumaryny (145 mg, 1 mmol), trietyloaminy (140 μΙ, 1 mmol) i N,N'-dimetylopirydyny (2 mg) w DME (10 ml) chłodzi się do temperatury 0°C i dodaje roztwór chlorku kwasu 2-metylomasłowego (140 μΙ, 1,1 mmol) w DME (1 ml). Mieszaninę reakcyjną pozostawia się w temperaturze pokojowej na 30 minut, a następnie ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną przez 5 godzin. Rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszcza w chloroformie (5 ml) i przemywa kolejno kwasem solnym (3%, 2 ml) i nasyconym roztworem węglanu potasu (5 ml). Otrzymuje się tytułowy związek (165 mg, wydajność 75%). TLC, Rf = 0,32 w układzie n-heksan/octan etylu (8:2 obj./obj.).
1H NMR (200 MHz, CDCI3) δ: 6,4-7,7 (m, 5H), 2,7 (m, 1 H), 1,6-1,9 (m, 2H), 1,3 (d, J=7 Hz, 3H),
1,0 (t, J=7,3 Hz, 3H).
13C NMR (50 MHz, CDCI3) δ: 175,0, 160,8, 155,2, 154,0, 143,4, 129,0, 118,9, 117,0, 116,6,
116,5, 110,9, 41,7, 27,3, 17,0, 12,2.
PL 212 182 B1
HR-MS, obliczono dla C14H15O4 [M+H]+: 247,0970; znaleziono: 247,1028.
Analiza elementarna obliczono dla C14H15O4: C 68,27%, H 5,73%; znaleziono: C 68,34%, H 5,67%.
UV (c = 0,093 mmol/dm3, 20 mM bufor TRIS/aceton 20/1 obj./obj.)
Xmax: 329 (ε = 11120), 266 (ε = 18260) Xmin: 302 (ε = 7810), 258 (ε = 18030).
IR (KBr) cm-1: 2969, 1757, 1726, 1621, 1656, 1400, 1268, 1224, 1124, 1101, 1053, 1019, 989, 906, 855.
Postępując według powyższej procedury, ale zastępując chlorek kwasu 2-metylomasłowego przez chlorek kwasu (S)-2-metylomasłowego (otrzymany według ujawnienia Kharasch i współpracownicy, J. Org. Chem.; 1954; 19; 1283-1288) otrzymano enancjomer (S) estru 2-okso-2H-chromen-7-ylowego kwasu 2-metylomasłowego. Analiza spektralna dostarczyła widma o analogicznych sygnałach i przesunięciach jak wskazano powyżej dla racemicznego estru 2-okso-2H-chromen-7-ylowego kwasu 2-metylomasłowego.
Postępując według powyższej procedury, ale zastępując chlorek kwasu 2-metylomasłowego przez chlorek kwasu (R)-2-metylomasłowego (otrzymany według ujawnienia Weisenborn i współpracownicy, J. Am. Chem. Soc.; 1954; 76; 1792-1795) otrzymano enancjomer (R) estru 2-okso-2H-chromen-7-ylowego kwasu 2-metylomasłowego. Analiza spektralna dostarczyła widma o analogicznych sygnałach i przesunięciach jak wskazano powyżej dla racemicznego estru 2-okso-2H-chromen-7-ylowego kwasu 2-metylomasłowego.
P r z y k ł a d 2
Otrzymywanie racemicznego estru 4-metylo-2-okso-2H-chromen-7-ylowego kwasu 2-metylomasłowego
Roztwór 4-metylo-7-hydroksykumaryny (352 mg, 2 mmol), trietyloaminy (280 μΙ, 2 mmol) i N,N'-dimetylopirydyny (5 mg) w tetrahydrofuranie (2,5 ml) chłodzi się do temperatury 0°C i dodaje roztwór chlorku kwasu 2-metylomasłowego (275 μΙ, 2,2 mmol) w tetrahydrofuranie (1 ml). Po 30 minutach usuwa się łaźnię chłodzącą i mieszaninę reakcyjną pozostawia na 12 godzin w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość poddaje chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując jako eluent mieszaninę heksan i octan etylu (9:1, obj./obj.). Otrzymuje się tytułowy związek (338 mg, wydajność 65%). TLC, Rf = 0,25 w układzie n-heksan/octan etylu (8:2, obj./obj.).
1H NMR (200 MHz, CDCI3) δ: 7,6 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 6,2 (s, 1H), 2,7 (d.k, J=6,9 Hz, J=7,0 Hz, 1 H), 2,4 (s, 3H), 1,7 (m, 2H), 1,3 (d, J=7,0 Hz, 3H), 1,0 (t, J=7,3 Hz, 3H).
13C NMR (50 MHz, CDCI3) δ: 175,0, 160,9, 154,7, 153,9, 152,4, 125,8, 118,6, 118,6, 118,2, 114,9, 110,9, 41,6, 27,2, 19,2, 16,9, 12,0.
HR-MS, obliczono dla C15H16O4 [M+H]: 261,1127 znaleziono: 261,1126.
Analiza elementarna:
obliczono dla C15H16O4: C 69,22%, H 6,20%; znaleziono: C 69,47%, H 6,46%.
UV (c=0,014 mmol/dm3, 20 mM bufor TRIS/aceton 20/1 obj./obj.)
Xmax: 324 (ε=11870), 268 (ε=13840), Xmin:299 (ε=7800), 256 (ε=13100).
IR (KBr) cm-1: 2971, 1758, 1732, 1615, 1388, 1263, 1148, 1131, 1108, 1017, 858.
Postępując według powyższej procedury, ale zastępując chlorek kwasu 2-metylomasłowego przez chlorek kwasu (S)-2-metylomasłowego (otrzymany według ujawnienia Kharasch i współpracownicy, J. Org. Chem.; 1954; 19; 1283-1288) otrzymano enancjomer (S) estru 4-metylo-2-okso-2H-chromen-7-ylowego kwasu 2-metylomasłowego. Analiza spektralna dostarczyła widma o analogicznych sygnałach i przesunięciach jak wskazano powyżej dla racemicznego estru 4-metylo-2-okso-2H- chromen-7-ylowego kwasu 2-metylomasłowego.
Postępując według powyższej procedury, ale zastępując chlorek kwasu 2-metylomasłowego przez chlorek kwasu (S)-2-metylomasłowego (otrzymany według ujawnienia Weisenborn i współpracownicy, J. Am. Chem. Soc.; 1954; 76; 1792-1795) otrzymano enancjomer (R) estru 4-metylo-2-okso-2H-chromen-7-ylowego kwasu 2-metylomasłowego.
Analiza spektralna dostarczyła widma o analogicznych sygnałach i przesunięciach jak wskazano powyżej dla racemicznego estru 4-metylo-2-okso-2H-chromen-7-ylowego kwasu 2-metylomasłowego.
PL 212 182 B1
P r z y k ł a d 3
Otrzymywanie estru 2-okso-2H-chromen-7-ylowego kwasu masłowego
Roztwór 7-hydroksykumaryny (1 g, 6,17 mmol), trietyloaminy (1,12 ml, 8,02 mmol) i N,N'-dimetylopirydyny (5 mg) w tetrahydrofuranie (10 ml) chłodzi się do temperatury 0°C i dodaje roztwór chlorku kwasu masłowego (710 μΙ, 6,8 mmol) w tetrahydrofuranie (2 ml). Po 30 minutach usuwa się łaźnię chłodzącą i mieszaninę reakcyjną pozostawia na 12 godzin w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość poddaje chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując jako eluent mieszaninę n-heksan i octan etylu (9:1, obj./obj.). Otrzymuje się tytułowy związek (1,36 g, wydajność 95%). Po krystalizacji z układu heksan/ octan etylu uzyskuje się produkt o temperaturze topnienia 72°C [72-73°C, według R. B. Sharma, i współpr., Indian. J. Chem. 1983, 22B, 538-541].
1H NMR (200 MHz, CDCI3) δ: 1,03 (t, J=7,1 Hz, 3H), 1,65-1,90 (m, 2H), 2,56 (t, J=7,0, 2H), 6,35 (d, J=9,6 Hz, H1), 6,98-7,15 (m, 2H), 7,45 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,72 (d, J=9,6, Hz 1H).
13C NMR (50 MHz, CDCI3) δ: 13,8; 18,5, 36,3, 110,6, 116,1, 116,8, 118,7, 128,8, 143,1, 153,4, 154,8, 160,6, 171,6.
IR (KBr) cm-1: 2976, 1746, 1625, 1418, 1400, 1378, 1268, 1229, 1159, 1124, 1096, 991,
856, 843.
P r z y k ł a d 4
Otrzymywanie estru 4-metylo-2-okso-2H-chromen-7-ylowego kwasu masłowego
Roztwór 4-metylo-7-hydroksykumaryny (1,1 g, 6,24 mmol), trietyloaminy (1,12 ml, 8,02 mmol) i N,N'-dimetylopirydyny (5 mg) w tetrahydrofuranie (10 ml) chłodzi się do temperatury 0°C i dodaje roztwór chlorku kwasu masłowego (710 μΙ, 6,8 mmol) w tetrahydrofuranie (2 ml). Po 30 minutach usuwa się łaźnię chłodzącą i mieszaninię reakcyjną pozostawia się na 12 godzin w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość poddaje chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując jako eluent mieszaninę n-heksan i octan etylu (9:1, obj./obj.). Otrzymuje się tytułowy związek (1,39 g, wydajność 92%). Po krystalizacji z układu n-heksan/octan etylu uzyskuje się produkt o temperaturze topnienia 94°C.
1H NMR (200 MHz, CDCI3) δ: 1,04 (t, J=7,1 Hz, 3H), 1,67-1,88 (m, 2H), 2,43 (s, 3H), 2,57 (t, J=7,1 Hz, 2H), 6,27 (s, 1H), 7,03-7,12 (m, 2H), 7,65 (d, J=8,5 Hz, 1H).
13C NMR (50 MHz, CDCI3) δ: 13,9, 18,6, 19,1, 36,5, 110,7, 114,7, 118,4, 125,6, 152,2, 153,5, 154,5, 160,8, 171,7.
IR (KBr) cm-1: 2977, 1754, 1729, 1627, 1615, 1420, 1388, 1271, 1264, 1147, 1133, 1091, 984, 871, 857.
P r z y k ł a d y 5-32
Postępując według procedury opisanej w przykładzie 3 i stosując zamiast 7-hydroksykumaryny odpowiednie podstawione pochodne tego związku, otrzymano acylowane pochodne kumarynowe 5-32 wskazane w poniższej tabeli 1.
P r z y k ł a d 33
Postępując według procedury opisanej w przykładzie 1 i stosując zamiast kwasu 2-metylomasłowego, kwas 2-etylokapronowy otrzymano substrat fluoro/chromogenny 33 wskazany w poniższej tabeli 1.
P r z y k ł a d 34
Postępując według procedury opisanej w przykładzie 2 i stosując zamiast kwasu 2-metylomasłowego, kwas 2-etylokapronowy otrzymano substrat fluoro/chromogenny 34 wskazany w poniższej tabeli 1.
PL 212 182 B1
R3 R2
Przykład R1 R2 R3 R4 R5 R6 T.t./t.w. (°C)
1 2 3 4 5 6 7 8
5 -H OH -H -H -H -H 180-181 EtOH, H2O
6 -H -CH3 -H -CI -H -H 119 EtOH
7 -H -CH3 -H -Br -H -H 120 EtOH
8 -H -CH3 -Et -H -H 125 EtOH
9 -Br -CH3 -H -H -H -H 138
10 -H -H -H -OCH3 -H -H 135/4 Pa
11 -CI -CH3 -H -Br -H -H 138 AcOH
12 -C(O)CaH7 OH -H -H -H -H 131-132 EtOH
13 -Et -H -H -H -H -H 94-95
14 -C(CHa)2CHCH2 -H -H -OCH3 -H -H 98-99
15 -H -H -H -OCH3 -C(CH3)2CHCH2 -H 104-106
16 -Et -H -H -H OC(O)C3H7 -H 101-103
17 -Et -H OC(O)C3H7 -H -H -H 118-120
18 -H -H -H -C(CH3)2CHCH2 -H -H 69-70
19 -H -H -OCH3 -H -C(CH3)2CHCH2 -H
20 -C(CHa)2CHCH2 -H OCH3 -H -H -H 87
21 -C(CHs)2CHCH2 -H OCH3 -H -C(CH3)2CHCH2 -H 94
22 -H -H -H -H -C(CH3)2CHCH2 -H
23 -C(CHa)2CHCH2 -H -H -H -H -H
24 -H -H -H -CH(CH2OAc)CCH3CH2 -H
25 -benzoksazolil -H -H -H -H -H 193-195 dioksan
26 -benzotiazolil -CN -H -H -H -H 244-246 dioksan
PL 212 182 B1 cd. tabeli 1
1 2 3 4 5 6 7 8
27 -(2-pirydynyl) -H -H -H -H -H 158 i-PrOH
28 -(3-pirydynyl) -H -H -H -H -H 178-179 i-PrOH
29 -(4-pirydynyl) -H -H -H -H -H 190-200 i-PrOH
30 -H -H -H -H -CH2CH2CH(CH3)2 -H
31 -H -CH3 -OC(O)C3H7 -H -H -H 79-80
32 -H -CH3 -H -H OC(O)C3H7 -H 99-100
33 -H -H -H -H -H n- C4H9
34 -H -CH3 -H -H -H n- C4H9
Poniżej, w kolejnych przykładach realizacji, przedstawiono zastosowanie związków o wzorze V do szybkiego wykrywania enzymu EL w materiale biologicznym (z wykorzystaniem reakcji enzymatycznej według schematu IV), do spektrofotometrycznego oznaczania aktywności enzymatycznej EL w uzyskiwanych próbkach, oraz w procesie oczyszczania enzymu.
Schemat IV
P r z y k ł a d 35
Zastosowanie związku o wzorze V, jako substratu fluoro/chromogennego do optycznego oznaczania esterazy lowastatyny.
Enzym esteraza lowastatyny (EL) wytwarza się z użyciem grzyba Clonostachys compactiuscula ATCC 38009. Preparat biologiczny z grzyba przygotowuje się zgodnie z procedurą ujawnioną w opisie patentowym USA 5,223,415.
Zamrożoną grzybnię (50 g) umieszcza się w wymrożonym, porcelanowym moździerzu, zalewa ciekłym azotem i rozciera z dodatkiem kulek szklanych (d = 0,4 mm, 6 mg) do momentu uzyskania konsystencji pudru (ok. 7 godzin). Zamrożony homogenat przenosi się do probówek wirówkowych, a następnie pozostawia do rozmarznięcia. Enzym ługuje się buforem glicynowym (50 mM, pH 9,4, 4°C) użytym w objętości proporcjonalnej do masy grzybni (50 ml). Po odwirowywaniu materiału komórkowego (20 min., 14000 obr./min., 4°C) pastylkę ponownie poddaje się ługowaniu buforem uzyskując w sumie 130 ml supernatantu.
Stężenie białka określa się poprzez bezpośredni pomiar absorbancji roztworów lub metodą Lowry'ego (Ćwiczenia z biochemii, pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowic, PWN, 2005).
Stężenie białka (c) wyznacza się znaną metodą poprzez pomiar absorbancji [a] dla białka w buforze, przy długości fali λ = 280 nm, umieszczając próbkę o objętości vo (określonej w mililitrach) w naczyniu miarowym i dopełniając buforem (bufor glicynowy, 50 mM, pH 9,4) do 10 ml. Stężenie odczytano z przygotowanej uprzednio krzywej wzorcowej wykonanej na białku BSA (albuminie cielęcej), przedstawionej równaniem:
PL 212 182 B1 (1434,4 · a + 5,3228) · 10 [mg] 1 000 · v o [mZ]
Ekstrakt białkowy przed oczyszczeniem na kolumnie chromatograficznej (0,5 ml) rozcieńczono przed pomiarem 20-krotnie, ekstrakt białkowy po oczyszczeniu nie był rozcieńczany, z uwagi na mniejsze stężenie białka. Za każdym razem oznaczenie powtarzano trzykrotnie.
Do oznaczania aktywności pobiera się próbkę 15 μΙ. Masę białka zawartego w próbce wyznacza się z iloczynu danego stężenia białka i pobranej objętości.
Wykrywanie obecności enzymu EL w uzyskanym supernatancie przez substrat fluoro/chromogenny o wzorze V.
Do 1 ml uzyskanego supernatantu dodaje się związek o wzorze V (50 μΙ roztworu w acetonie, o stężeniu 0,01 M) i pozostawia na 1 minutę w temperaturze pokojowej. Po tym czasie roztwór umieszcza się pod lampą UV emitującą światło o długości fali λ = 366 nm i porównuje uzyskany wynik ze ślepą próbą (zawierającą tylko bufor). Po naświetleniu próbki zawierającej enzym EL, w przypadku roztworu badanego obserwuje się charakterystyczne niebieskie zabarwienie pochodzące od produktu hydrolizy, związku o wzorze IV, którego nie obserwuje się dla ślepej próby. Próbę powtarza się dla supernatantu rozcieńczonego wodą destylowaną w proporcji 1:100 i po 1 minucie trwania reakcji roztwór umieszcza się pod lampą UV emitującą światło o długości fali λ = 366 nm. Także i w tym przypadku obserwuje się charakterystyczne niebieskie zabarwienie pochodzące od produktu hydrolizy związku o wzorze V.
P r z y k ł a d 36
Do buforu (3 ml, Tris, 20 mMol, pH = 9,6) dodaje się roztwór związku z przykładu 1 (1 μΙ, 0,01 M w acetonie) i rejestruje się widmo fluorescencji uzyskanego roztworu na aparacie Hitachi F-7000 z użyciem kuwety 10 mm Quartz Suprasil R firmy Hellma. Następnie do tego roztworu dodaje się 300 mg grzybni w 2 ml buforu, rozciera i pobiera 200 μΙ supernatantu. Całkowite stężenie białka jest niższe od 1 μg/ml. Zmiany fluorescencji roztworu rejestrowane w czasie przedstawiono na fig. 1. Liniowe zmiany stężenia w czasie potwierdzają że reakcja jest zerowego rzędu, co pozwala na ilościowe określanie zawartości enzymu EL w próbkach w warunkach tego badania.
P r z y k ł a d 37
Zastosowanie związków o wzorze V do spektrofotometrycznego oznaczania aktywności enzymatycznej materiału zawierającego enzym EL - metoda ogólna.
Opis układu.
Układ pomiarowy obejmuje termostatowany reaktor (30°C±1), o pojemności 20 ml umieszczony na mieszadle magnetycznym, z zastosowaniem mieszania przy szybkości 300 obr./min. Zmiany absorbancji mieszaniny reakcyjnej rejestruje się z użyciem detektora Shimadzu SPD-6A.
Sposób wykonywania analizy.
Do termostatowanego buforu Tris (20 mM, pH 7,8), uprzednio poddanego filtracji i sterylizacji w autoklawie, dodaje się aceton (0,5 ml) i odgazowuje całość na łaźni ultradźwiękowej. Całkowita objętość próbki wynosi 12 ml. Szybkość autohydrolizy związków o wzorze V wyznacza się notując wskazania spektrofotometru przez 3 minuty, co 15 sekund, od momentu dodania danego związku (50 μΙ roztworu w acetonie o stężeniu 0,01 M). Następnie dodaje się roztwór enzymu EL (frakcja supernatantu wysolona siarczanem amonu, w przedziale 40-80%, 0,487 mg białka). Po upływie 1 minuty rozpoczyna się notowanie wskazań spektrofotometru co 15 sekund przez kolejne 3 minuty. Na podstawie otrzymanych wyników wykreślono zależność zmian absorbancji w funkcji czasu. Pomiar wykonano dwukrotnie. Uzyskane dane po przeliczeniu przedstawiono tabelach 2, 3, 4, 5 (aktywność właściwą, w przypadku reakcji 0 rządu, wyznacza się z liniowej zależności stężenie [nmol/mg]/czas [min], jako współczynnik nachylenia.
P r z y k ł a d 38
Zastosowanie związków z przykładów 1 i 2, jako substratów fluoro/chromogennych do barwnych i spektrofotometrycznych oznaczeń esterazy lowastatyny.
Dla związków z przykładów 1 i 2 wyznaczono aktywności właściwe podczas oznaczania aktywności enzymu EL i zestawiono w tabeli 2. Wysokie wartości aktywności właściwej obu związków pokazują że są one dobrymi substratami barwnymi dla tego enzymu. Pomiar porównawczy przeprowadzony z wykorzystaniem znanego sposobu (z użyciem maślanu o-nitrofenylu) pokazuje, że oznaczona dla maślanu o-nitrofenylu wartość aktywności właściwej jest znacznie mniejsza.
PL 212 182 B1
Aktywność właściwą w przypadku reakcji 0 rzędu, wyznacza się z liniowej zależności stężenie [nmol/mg]/czas [min], jako współczynnik nachylenia.
T a b e l a 2
Aktywności właściwe roztworów enzymu EL dla preparatu enzymatycznego przy pH 7,8 oznaczone dla substratów z przykładów 1 i 2, w porównaniu z maślanem o-nitrofenylu
Związek λ [nm] Aktywność właściwa [nmol/min mg]
ó 420 10
Przykład 1 350 69
Przykład 2 350 44
P r z y k ł a d 39
Pomiary według przykładu 38 zostały powtórzone w buforze Tris (20 mM) o pH 9,6, tj. w takich warunkach pH, w których, zgodnie z danymi literaturowymi, enzym EL wykazuje maksymalną aktywność. Uzyskane wyniki zostały zebrane w tabeli 3. Także przy tej wartości pH wartości aktywności właściwej dla związków o wzorze V są znacząco wyższe niż wynik uzyskany z pomiaru porównawczego przeprowadzonego z wykorzystaniem znanego sposobu (z użyciem maślanu o-nitrofenylu).
T a b e l a 3
Aktywności właściwe roztworów enzymu EL dla preparatu enzymatycznego w pH 9,6 oznaczone dla substratów fluoro/chromogennych z przykładów 1, 2, w porównaniu z maślanem o-nitrofenylu
Związek λ [nm] Aktywność właściwa [nmol/min^mg]
NO, ? :Y 420 2
Przykład 1 350 11
Przykład 2 350 13
Przykład 3 400 19,3
Przykład 4 400 18,9
P r z y k ł a d 40
Zastosowanie związków z przykładów 1 i 2 do ilościowego i jakościowego oznaczania aktywności enzymatycznej enzymu EL podczas procesu oczyszczania enzymu (metoda ogólna)
Frakcję białkową uzyskaną w przykładzie 44 przez wytrącenie wysycaniem siarczanem amonu (w przedziale 40-80% nasycenia), rozpuszczoną w buforze glicynowym (5 ml, 12,8 mg/ml), wprowadza się na kolumnę oddziaływań hydrofobowych (HIC) z wypełnieniem Phenyl- Sepharose (1,5 x 18 cm). Białka wymywa się stosując jako eluent tenże bufor glicynowy o pH 9,4 (przepływ: 1,5 ml/min, ciśnienie 69 kPa). Po wymyciu białek nie zaadsorbowanych na kolumnie (detekcja za pomocą spektrofotometru UV, 254 nm), dotychczasowy układ elucyjny zastępuje się wodą jako eluentem.
Fig. 2 przedstawia uzyskany chromatogram. Obecność enzymu EL w poszczególnych frakcjach wykrywa się poprzez dodawanie do nich acetonowego roztworu substratu fluoro/chromogennego (0,01 M). Aktywność wykazuje tylko frakcja wyeluowana po zastąpieniu układu elucyjnego wodą, jako eluentem (czas retencji 20 min). Aktywność wyznaczono metodą opisaną w przykładzie 37.
PL 212 182 B1
Aktywność właściwa dla tak oczyszczonego białka była także oznaczona spektrofotometrycznie metodą opisaną poniżej, w przykładzie 44, a wyniki uzyskane zostały zebrane w tabeli 4.
T a b e l a 4
Aktywności właściwe roztworów aktywnej frakcji zawierającej enzym EL oznaczone dla substratów fluoro/chromogennych z przykładów 1 i 2, w porównaniu ze stanem techniki (maślan o-nitrofenylu)
Związek λ [nm] Aktywność właściwa [nmol/min^mg]
0 NO, H ά° 420 8
Przykład 1 350 32
Przykład 1 400 40,2
Przykład 2 350 42
Przykład 2 400 40
Przykład 3 400 38
Przykład 4 400 40
Uzyskane wyniki pokazują, że związki z przykładu 1 i 2 są bardzo dobrymi substratami do oznaczania enzymu EL.
P r z y k ł a d 41
Zmianę aktywności enzymu EL w funkcji pH wyznaczono stosując ester 2-okso-2H-chromen-7-ylowy kwasu 2-metylomasłowego z przykładu 1, zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 37. Wartości aktywności wyznaczono zmieniając wartości pH zastosowanego buforu od wartości 7,8 do wartości 9,9 i przedstawiono na diagramie słupkowym według fig. 2. Uzyskane dane wskazują, że dla wartości 9,6 aktywność enzymu EL jest najwyższa.
P r z y k ł a d 42
Wpływ rodzaju buforu na aktywność enzymu EL wyznaczono zgodnie z procedurą podaną w przykładzie 37, stosując ester 2-okso-2H-chromen-7-ylowy kwasu 2-metylomasłowego opisany w przykładzie 1.
Wykonano serię pomiarów, w której reakcja hydrolizy prowadzona była w różnych buforach. Przeprowadzone badania nie wykazały wpływu rodzaju buforu na aktywność enzymatyczną a otrzymane wyniki zawarte w tabeli 5 mieszczą się w wyznaczonym błędzie pomiaru (5 %). Niezależnie od stosowanego typu buforu reakcja enzymatyczna przebiegała z podobną szybkością.
T a b e l a 5
Wpływ rodzaju buforu na aktywność enzymatyczną roztworu enzymu EL
Bufor Zmiana aktywności EL (%)
Węglanowy (50 mM) 103
Tris (20 mM) 100
Glicynowy (50 mM) 99,5
P r z y k ł a d 43
Zastosowanie związków z przykładów 1 i 2 do oznaczania aktywności enzymatycznej enzymu EL podczas procesu oczyszczania enzymu metodą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym.
Frakcję białkową uzyskaną poprzez wytrącenie w przedziale 40-80% nasycenia siarczanem amonu, rozpuszcza się w buforze glicynowym (5 ml, 12,8 mg/ml) i pobiera próbkę (50 μΙ). Uzyskaną frakcję poddaje się analizie metodą SDS/PAGE w warunkach redukujących (zgodnie z protokołem ujawnionym w Appl. Environ. Microbiolog. 63, 1997, 1307-1311).
PL 212 182 B1
Do wybarwiania żelu stosuje się roztwór acetonowy związku z przykładu 1 albo 2 (50 μΙ roztworu w acetonie o stężeniu 0,01 M) nanosząc roztwór na żel. Po 5 minutach oświetla się powierzchnię żelu lampą UV (λ=366 nm) uwidaczniając fluoryzujące na niebiesko pasmo odpowiadające esterazie lowastatyny.
P r z y k ł a d 44
Zamrożoną grzybnię Clonostachys compactiuscula (70 g) umieszcza się w wymrożonym, porcelanowym moździerzu, zalewa ciekłym azotem i rozciera z dodatkiem kulek szklanych (d=0,4 mm, 30 mg) do momentu uzyskania konsystencji pudru (ok. 13 godzin). Homogenizowany materiał komórkowy ługuje się buforem fosforanowym (20 mM, pH 7,8, 4°C, Tween 80 (0,1 %), NaN3 (0,01 %), 50 ml) mieszając ekstrakt delikatnie szklaną bagietką dla uniknięcia pienienia. Po odwirowaniu materiału komórkowego (20 minut, 11000 obr./min., 4°C) otrzymuje się supernatant 1. Procedurę ługowania pastylki powtarza się wyznaczając w kolejno uzyskanych supernatantach stężenia białek oraz aktywności właściwe, z użyciem jako substratu fluoro/chromogennego związku z przykładu 3. Uzyskane wyniki zestawiono w tabeli 5.
Stężenie białka określa się poprzez bezpośredni pomiar absorbancji roztworów lub metodą Lowry'ego (Ćwiczenia z biochemii, pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowic, PWN, 2005). Dokładna procedura podana jest poniżej.
Stężenie białka wyznaczono na podstawie pomiaru absorbancji przy długości fali λ=280 nm. Stężenie odczytano z przygotowanej uprzednio krzywej wzorcowej wykonanej na białku BSA (albuminie cielęcej) (y = 1434,4 x + 5,3). Ekstrakt białkowy przed oczyszczeniem na kolumnie chromatograficznej (0,5 ml) rozcieńczono przed pomiarem 20-krotnie, ekstrakt białkowy po oczyszczeniu nie był rozcieńczany, z uwagi na mniejsze stężenie białka. Za każdym razem oznaczenie powtarzano trzykrotnie.
T a b e l a 6
Supernatant Stężenie białka [mg/ml] Aktywność właściwa [nmol/mimmg]
1 1,598 360
2 0,684 250
3 0,661 90
4 0,383 60
5 0,291 30
Supernatanty oznaczone nr 1 i 2 (które wykazują najwyższą aktywność) łączy się, chłodzi do temperatury 4°C. Następnie enzym EL oczyszcza się poprzez wysalanie. Do uzyskanego supernatantu dodaje się porcjami siarczan amonu (58 g) do osiągnięcia 40% wysycenia roztworu, roztwór miesza przez 1 godzinę i pozostawia na 14 godzin. Wytrąconą frakcję A odwirowuje się (20 minut, 14000 obr./min., 4°C), rozpuszcza się w buforze fosforanowym (15 ml, pH = 7,8) i oznacza jej aktywność właściwą (wynik <30, co wskazuje na niską wartość aktywności właściwej). Do supernatantu o objętości 275 ml dodaje się siarczan amonu (98,3 g) do wysycenia 85%. Po 24 godzinach odwirowuje się wytrąconą frakcję B (20 minut, 11000 obr./min., 4°C), rozpuszcza w buforze fosforanowym (15,65 ml, 20 mM, pH 7,8, 4°C) uzyskując roztwór, który wykazuje bardzo wysoką aktywność całkowitą. Natomiast otrzymany na tym etapie oczyszczania supernatant (260 ml), wykazuje bardzo niską aktywność właściwą (<30).
Frakcję B oczyszcza się metodą chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC) stosując kolumnę z wypełnieniem Phenyl-Sepharose, eluując buforem fosforanowym (20 mM, pH 6,5, EDTA 5mM, NaCI 0,5 M; przepływ: 1,6 ml/min, ciśnienie 10 psi, czułość detektora 0,1).
Po odmyciu białek nie zaadsorbowanych na kolumnie (czas 0-15 minut, UV 254 nm), zmienia się układ elucyjny na wodę. Obecność enzymu EL w poszczególnych frakcjach wykrywa się poprzez dodawanie do nich roztworu substratu fluoro/chromogennego (0,1 ml, 0,05 mol). Zbiera się frakcję wykazującą aktywność w reakcji z substratem fluoro/chromogennym, o czasie retencji 20 minut, o objętości 50 ml (frakcja C). Analiza aktywności frakcji C doprowadza do wniosku, że frakcja C zawiera enzym EL oczyszczony z wydajnością 8% (określoną, jako proporcję aktywności całkowitej danej frakcji do aktywności całkowitej homogenatu, wyrażona w procentach), o stopniu oczyszczenia 25 (określonym, jako proporcja aktywności właściwej danej frakcji do aktywności właściwej homogenatu).
PL 212 182 B1
Mieszaninę soli amonowych symwastatyny (18 mg) i lowastatyny (2 mg) rozpuszcza się w 25 ml buforu glicynowego (50 mM, pH=9,4). Do 1 ml tego roztworu dodaje się frakcję C zawierającą 0,666 mg białka (jako oczyszczony roztwór enzymu EL) i całość miesza się w temperaturze 20°C. Przebieg reakcji kontroluje się metodą HPLC. Po 24 godzinach stwierdzono, że mieszanina reakcyjna nie zawierała lowastatyny a tylko symwastatynę oraz odpowiednią ilość triolu.
Analizy HPLC wykonywane były przy użyciu chromatografu cieczowego HPLC ProStar firmy Varian, wyposażonego ProStar 330 Photodiode Array Detektor, Prostar 410 AutoSampIer, ProStar 410 Solvent Delivery Module. Rozdział związków dokonano na kolumnie RP LiChro Cart 55-4, z wypełnieniem octadecylsilyl silica gel for chromatography R (RP-18), 3 μm. Elucja cząsteczek prowadzona była rozpuszczalnikiem o składzie: acetonitryl (350 ml), kwas ortofosforowy (0,375 ml), woda (150 ml) z szybkością przepływu 1,5 ml/min, przy długości fali 238 nm. Czasy retencji kolejnych składników mieszaniny reakcyjnej wynosiły: 0,51 minuty - triol, 2,21 minuty - lowastatyna, 3,22 minuty - symwastatyna.

Claims (20)

1. Sposób wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny, z użyciem substratu fluoro/chromogennego, znamienny tym, że stosuje się substrat fluoro/chromogenny o wzorze II,
R' oznacza jeden lub dwa podstawniki pierścienia A niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6 -alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, OH, CN, NO2,
R'' oznacza jeden lub dwa lub trzy podstawniki pierścienia B niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, który to substrat dodaje się do materiału o aktywności enzymatycznej i prowadzi się reakcję hydrolizy pod działaniem enzymu, następnie wykrywa się i/lub oznacza się uwolniony związek kumarynowy o wzorze III w którym:
R' i R'' mają wyżej podane znaczenia, aby wykrywać i/lub oznaczać aktywność enzymatyczną esterazy lowastatyny.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się substrat fluoro/chromogenny o wzorze II, w którym:
R oznacza C1-C6 -alkil,
R' oznacza jeden lub dwa podstawniki pierścienia A niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, C1-C6 -alkil,
R'' oznacza jeden lub dwa lub trzy podstawniki pierścienia B niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, C1-C6-alkil.
PL 212 182 B1
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się substrat fluoro/chromogenny o wzorze II, w którym R oznacza metyl lub C3-C6 -alkil, wybrany z grupy obejmującej mieszaninę racemiczną substrat wzbogacony w enancjomer R, substrat wzbogacony w enancjomer S, optycznie czysty enancjomer S i optycznie czysty enancjomer R.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się substrat fluoro/chromogenny wybrany z grupy obejmującej:
- ester 2-okso-2H-chromen-7-ylowy kwasu 2-metylomasłowego,
- ester 4-metylo-2-okso-2H-chromen-7-ylowy kwasu 2-metylomasłowego.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się substrat fluoro/chromogenny w postaci mieszaniny racemicznej, mieszaniny wzbogaconej w enacjomer R, mieszaniny wzbogaconej w izomer S, optycznie czystego enancjomeru S i optycznie czystego enancjomeru R.
6. Sposób według zastrz. 1, 2, albo 4, znamienny tym, że reakcję hydrolizy prowadzi się w roztworze buforowanym.
7. Sposób według zastrz. 1, 2, albo 4, znamienny tym, że reakcję hydrolizy prowadzi się kontrolując zmiany pH i korygując pH z użyciem zasady.
8. Sposób określania aktywności enzymatycznej według zastrz. 1, 2, albo 4, znamienny tym, że reakcję hydrolizy prowadzi się przy pH w zakresie od 6 do 11,5.
9. Sposób według zastrz. 1, 2, albo 4, znamienny tym, że reakcję hydrolizy prowadzi się przy pH w zakresie od 7,5 do 11.
10. Sposób według zastrz. 1, 2, albo 4, znamienny tym, że reakcję hydrolizy prowadzi się przy pH w zakresie od 8,5 do 10,5.
11. Sposób zastrz. 1, 2, albo 4, znamienny tym, że reakcję hydrolizy prowadzi się w temperaturze od 20°C do 50°C.
12. Sposób według zastrz. 1, 2, albo 4, znamienny tym, że reakcję hydrolizy prowadzi się w temperaturze od 26°C do 40°C.
13. Sposób według zastrz. 1, 2, albo 4, znamienny tym, że uwolniony związek kumarynowy o wzorze III wykrywa się i/lub oznacza się metodą spektrofotometryczną.
14. Sposób według zastrz. 1, 2, albo 4, znamienny tym, uwolniony związek kumarynowy o wzorze III wykrywa się i/lub oznacza metodą fluorescencyjną.
15. Sposób według zastrz. 1, 2, albo 4, albo 11, albo 12, znamienny tym, że oznacza się ilościowo związek kumarynowy i wyznacza zawartość/aktywność esterazy lowastatyny.
16. Zestaw do wykrywania i/lub oznaczania aktywności esterazy lowastatyny, znamienny tym, że zawiera substrat fluoro/chromogenny o wzorze Il w którym:
R oznacza C1-C6 -alkil,
R' oznacza jeden lub dwa podstawniki pierścienia A niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, OH, CN, NO2,
R'' oznacza jeden lub dwa lub trzy podstawniki pierścienia B niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, oraz kompatybilny rozcieńczalnik.
17. Zastosowanie substratu fluoro/chromogennego o wzorze Il
PL 212 182 B1 w którym:
R oznacza C1-C6 -alkil,
R' oznacza jeden lub dwa podstawniki pierścienia A niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, OH, CN, NO2,
R'' oznacza jeden lub dwa lub trzy podstawniki pierścienia B niezależnie wybrane z grupy obejmującej wodór, halogeny, C1-C6-alkil, C1-C6-alkenyl, C1-C6-alkoksyl, do pozaustrojowego wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny.
18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że substrat fluoro/chromogenny stosuje się do wykrywania esterazy lowastatyny na żelu w metodzie elektroforezy.
19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że substrat fluoro/chromogenny stosuje się do wykrywania i/lub oznaczania esterazy lowastatyny w eluacie w metodzie chromatograficznej.
20. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że substrat fluoro/chromogenny stosuje się do wykrywania i/lub oznaczania esterazy lowastatyny w sposobie wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny.
PL383818A 2007-11-19 2007-11-19 Sposób wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny z użyciem substratu fluoro/chromogennego, zestaw do wykrywania i/lub oznaczania aktywności esterazy lowastatyny oraz zastosowanie substratu fluoro/chromogennego do pozaustrojowego wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej PL212182B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL383818A PL212182B1 (pl) 2007-11-19 2007-11-19 Sposób wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny z użyciem substratu fluoro/chromogennego, zestaw do wykrywania i/lub oznaczania aktywności esterazy lowastatyny oraz zastosowanie substratu fluoro/chromogennego do pozaustrojowego wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej
PCT/PL2008/000085 WO2009067031A1 (en) 2007-11-19 2008-11-18 Method for detection and/or assay of lovastatin esterase with use of fluorogenic/chromogenic reagent, lovastatin esterase isolated and/or purified by this method, assembly for detection and/or assay and use of fluorogenic/chromogenic reagent for detection and/or assay of lovastatin esterase

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL383818A PL212182B1 (pl) 2007-11-19 2007-11-19 Sposób wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny z użyciem substratu fluoro/chromogennego, zestaw do wykrywania i/lub oznaczania aktywności esterazy lowastatyny oraz zastosowanie substratu fluoro/chromogennego do pozaustrojowego wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL383818A1 PL383818A1 (pl) 2009-05-25
PL212182B1 true PL212182B1 (pl) 2012-08-31

Family

ID=40263512

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL383818A PL212182B1 (pl) 2007-11-19 2007-11-19 Sposób wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny z użyciem substratu fluoro/chromogennego, zestaw do wykrywania i/lub oznaczania aktywności esterazy lowastatyny oraz zastosowanie substratu fluoro/chromogennego do pozaustrojowego wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej

Country Status (2)

Country Link
PL (1) PL212182B1 (pl)
WO (1) WO2009067031A1 (pl)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9400273B1 (en) 2009-12-09 2016-07-26 Life Technologies Corporation 7-hydroxycoumarin-based cell-tracking reagents
US20120329832A1 (en) * 2011-06-27 2012-12-27 Jean Delaveau Novel Insect-Repellent Coumarin Derivatives, Syntheses, and Methods of Use
WO2013044118A2 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 Merial Limited Indirect modeling of new repellent molecules active against insects, acarids, and other arthropods
CN111039910A (zh) * 2019-12-31 2020-04-21 云南大学 一种光引发的合成3-芳基黄酮或香豆素类化合物的方法及应用
CN117665174B (zh) * 2024-02-01 2024-04-23 巴中市产品质量检验检测中心 一种检测pde5和ssri的方法及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223415A (en) * 1990-10-15 1993-06-29 Merck & Co., Inc. Biosynthetic production of 7-[1',2',6',7',8',8a'(R)-hexahydro-2'(S),6'(R)-dimethyl-8'(S)-hydroxy-1'(S)-naphthyl]-3(R),5(R)-dihydroxyheptanoic acid (triol acid)
US5859051A (en) * 1996-02-02 1999-01-12 Merck & Co., Inc. Antidiabetic agents
JP4731489B2 (ja) * 2003-10-21 2011-07-27 ヴェレニウム コーポレイション シンバスタチン及び中間体の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
PL383818A1 (pl) 2009-05-25
WO2009067031A1 (en) 2009-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1894933B1 (en) Compositions, methods and kits pertaining to luminescent compounds
CN108918700B (zh) 一种同时检测他汀侧链及其对映异构体杂质的方法
PL212182B1 (pl) Sposób wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej esterazy lowastatyny z użyciem substratu fluoro/chromogennego, zestaw do wykrywania i/lub oznaczania aktywności esterazy lowastatyny oraz zastosowanie substratu fluoro/chromogennego do pozaustrojowego wykrywania i/lub oznaczania aktywności enzymatycznej
Pérez Carlón et al. Fluorogenic polypropionate fragments for detecting stereoselective aldolases
JPH05222033A (ja) 新規の活性化カルバメートの製造及び使用
JPS60231654A (ja) 色原体アミノ酸エステル及びペプチドエステル及びその製造法並びにこれらの化合物を用いたエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬及び分析方法
Marr et al. Investigation of derivatization reagents for the analysis of diarrhetic shellfish poisoning toxins by liquid chromatography with fluorescence detection
Tao et al. A highly selective ratiometric fluorescent probe for butyrylcholinesterase: Applications in quantification, residue screening, and toxicological studies of organophosphorus pesticides
Taylor et al. PTEN and myotubularins: families of phosphoinositide phosphatases
Saito et al. Determination of psilocybin in hallucinogenic mushrooms by reversed-phase liquid chromatography with fluorescence detection
Leroy et al. Fluorogenic cyanohydrin esters as chiral probes for esterase and lipase activity
Okada et al. Detection of esterase activity by chromogenic and fluorogenic probe based on an O-nitrobenzoxadiazole (O-NBD) unit
US4777269A (en) 7-Phenylacetic acid-4-alkyl-coumarinyl amides useful in fluorometric determination of the activity of hydrolases
JP2002514438A (ja) チトクロームｐ４５０基質としての７−アルコキシクマリン類
Toyo'oka Fluorescent chiral derivatization reagents possessing benzofurazan structure for the resolution of optical isomers in HPLC: The synthesis, characteristics and application
Piovan et al. Chemoenzymatic synthesis of organoselenium (IV) compounds and their evaluation as cysteine protease inhibitors
US4769467A (en) Fluorogenic 2,1,3-benzoxadiazoles and fluorometric amine/thiol assays therewith
KR102646914B1 (ko) 아실글리세롤 이성질체 및 자유지방산 직접 동시분석법 및 이를 통한 라이페이스 입체선택성 분석법
EP2403843B1 (en) Chemiluminescent compositions, methods, assays and kits for oxidative enzymes
EP0656422A1 (en) Cat assay
JP2009504177A (ja) 生物学的に活性な血清パラオキソナーゼのレベルを決定するための方法および組成物
Katz et al. 3-Isopropylmalate is the major endogenous substrate of the Saccharomyces cerevisiae trans-aconitate methyltransferase
CN106496156A (zh) 共轭苯并噻唑衍生物、近红外荧光探针及其制备与应用
Caytan et al. Strategy for specific isotope ratio determination by quantitative NMR on symmetrical molecules: application to glycerol
AU692908B2 (en) Stable substitute tryglycerides for use in clinical chemistry assay controls or calibrators and process for their preparation

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20131119