PL212811B1 - Sposób uzyskiwania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych - Google Patents
Sposób uzyskiwania oczyszczonych preparatów bakteriofagowychInfo
- Publication number
- PL212811B1 PL212811B1 PL391328A PL39132810A PL212811B1 PL 212811 B1 PL212811 B1 PL 212811B1 PL 391328 A PL391328 A PL 391328A PL 39132810 A PL39132810 A PL 39132810A PL 212811 B1 PL212811 B1 PL 212811B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- phage
- bacteriophage
- endotoxin
- lysate
- purification
- Prior art date
Links
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 20
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 66
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 40
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 14
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 2
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 2
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000595586 Coryne Species 0.000 description 1
- 241000476239 Escherichia coli O128 Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000011538 cleaning material Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012297 crystallization seed Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012525 endotoxin sample Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 208000010544 human prion disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940041153 polymyxins Drugs 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Wyzwaniem obecnych czasów jest wygranie wyścigu z mikroorganizmami przekazującymi między sobą informację genetyczną umożliwiającą im nabycie oporności na antybiotyki. Powszechnie stosowana antybiotykoterapia spowodowała, że mikroorganizmy stały się miej wrażliwe na antybiotyki, w tym na wankomycynę - antybiotyk zakłócający biosyntezę peptydoglikanu. Obecnie lawinowo narasta liczba informacji mówiących o alternatywie dla terapii antybiotykowej - wykorzystaniu bakteriofagów. Wśród tych informacji jest wypowiedź laureata Nagrody Nobla profesora Lederberga zapowiadająca wykorzystanie bakteriofagów w terapii zakażeń bakteryjnych.
Badania nad terapeutycznym wykorzystaniem bakteriofagów są prowadzone w kilku ośrodkach na świecie i liczba ich będzie rosła. Najdłuższe tradycje terapii fagami ma Instytut Mikrobiologii i Wirusologii w Tbilisi i Instytut Immunologii PAN we Wrocławiu. Obecnie powstaje wiele firm nastawionych na wykorzystanie fagów w terapii zakażeń bakteryjnych. Przykłady to: Novolytics, Do-CoopTechnologies Ltd, CEO Novolytics Ltd, Phico Therapeutics Ltd itd.
W cyklu litycznym w trakcie terapii bakterie zostają zniszczone przez namnażające się w nich bakteriofagi. Do środowiska uwalniane są potomne, zwielokrotnione w liczbie cząsteczki bakteriofagów, które lizują następne populacje bakterii.
W przypadku produkcji lizatów bakteriofagowych do celów technologicznych znaczenie ma nie tylko liczba potomnych cząsteczek fagowych ale i uwalniane do środowiska elementy budulcowe bakterii, takie jak kwasy nukleinowe, białka i składniki ściany komórkowej. Ściana bakterii Gram ujemnych zbudowana jest z w istotnym ułamku (nawet do 70%) z lipopolisacharydów (nazywanych pirogenami, endotoksynami), peptydoglikanów i białek. Efektywne usunięcie pirogenów z lizatów bakteryjnych jest kluczowym wymogiem otrzymywania preparatów bakteriofagowych dedykowanych terapii zakażeń bakteryjnych. Endotoksyny są silnymi stymulatorami układu immunologicznego indukując produkcję interleukin, TNF, NO, itd.
Procedury usuwania lub izolacji endotoksyn bazują na ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi jak na przykład wodnym roztworem fenolu Westphal O., Lueritz O., Bister F. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol/wasser. Z. Naturforsch. 7: 148-155, 1952), mieszaniną kwasów i amin alifatycznych (Patent application Publication US 2007/0020292A1), metodami ekstrakcyjnymi i chromatograficznymi (Patent Application publication US 2007/0031447A1). Oczyszczanie preparatów biologicznych z endotoksyn przeprowadzano wykorzystując interakcje jonów metali z białkami (patent US 6,942,802 B2 Sep. 13, 2005; WO 02083710A1; WO 04003215A1), przez precypitację endotoksyn alkoholem i dwuwartościowymi przeciwjonami (US 5039610). Zastosowanie dwuwartościowych jonów w kombinacji z alkoholami, żywicami i detergentami jest przedmiotem wielu patentów na przykład EPO 407037B1. Do usuwania endotoksyn wykorzystywano białka izolowane z limfy kraba (US 5760177). Opisano wiele metod chromatografii kolumnowej. Wykorzystuje się w nich powinowactwo lipopolisacharydu do zasadowych haptenów takich jak polimysksyna (Petsch D, Beeskow TC, Anspach FB, Deckwer WD, (1997) Membrane adsorbers for selective removal of bacterial endotoxin. J. Chromatogr B Biomed Sci Appl. 693 (1):79-91), złoże oparte na krzemianie wapnia (Hang JP, Wang Q, Smith TR, Hurst WE, Sulpizio T, (2005) Endotoxin removal using a synthetic adsorbent of crystalline calcium silicate hydrate. Biotechnol Prog. 21(4): 1220-5), polimery syntetyczne (Hirayama Ch, Sakata M, (2002) Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles. Journal of
Chromatography B, 781:419-432) lub złoża polianionowe (Boratyński J, Syper D, Weber-Dabrowska B, Łusiak-Szelachowska M, Poźniak G, Górski A. Preparation of endotoxin-free bacteriophages Cell Mol Biol Lett. 2004; 9(2):253-9).
Nadal istnieje zapotrzebowanie na dostarczenie sposobu oczyszczania lizatów bakteriofagowych, zwłaszcza z endotoksyn, który mógłby być wykorzystany do przemysłowej produkcji preparatów bakteriofagowych przeznaczonych do stosowania w leczeniu zakażeń bakteryjnych występujących u ludzi. Pomimo mnogości opisanych metod oczyszczania lizatów bakteriofagowych, nie spełniają one w stopniu dostatecznym wymogów stawianych przed sposobami przemysłowej produkcji preparatów o wskazanym powyżej przeznaczeniu.
Nieoczekiwanie sposób spełniający określone powyżej wymogi został uzyskany w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych charakteryzujący się tym, że:
PL 212 811 B1
a) prowadzi się hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego, hodowlę zaszczepia się bakteriofagami i uzyskuje się lizat bakteriofagowy, korzystnie o mianie nie niższym niż 107 pfu/ml, a otrzymany lizat fagowy ewentualnie podaje się sterylizacji filtracyjnej,
b) prowadzi się oczyszczanie lizatu fagowego metodą ultrafiltracji na module tangencjalnym,
c) uzyskany przesącz oczyszcza się techniką chromatografii jonowymiennej na kolumnie wypełnionej kationitom, korzystnie zawierającej polymixin B, a następnie poddaje się ewentualnie sterylizacji filtracyjnej
d) z uzyskanego przesączu przygotowuje się oczyszczony preparat bakteriofagowy, korzystnie o mianie rzędu 109 pfu/ml i pozbawionym co najmniej 95% endotoksyn w stosunku do ich ilości w wyjściowym lizacie bakteriofagowym uzyskiwanym w etapie a.
Korzystnie, w trakcie etapu a) hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego prowadzi się w bulionie hodowlanym o pH około 7,2 zawierającym wyciąg mięsny, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, hydrolizat drożdży, pepton, NaCl.
Równie korzystnie, w trakcie etapu a) jako szczep gospodarza bakteryjnego stosuje się szczep bakteryjny wrażliwy na lityczne działanie namnażanego bakteriofaga.
Równie korzystnie, w trakcie etapu a) uzyskany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 μm.
Równie korzystnie, w trakcie etapu b) stosuje się moduł tangencjalny o cut-off 300 kDa.
Przykład. 1. Oczyszczanie roztworu wzorcowego endotoksyn oraz bulionu wzbogaconego
Przed przystąpieniem do oczyszczania w układzie moduł tangencjalny - kolumna Polymixin B, sprawdzono właściwości sorpcyjne kolumny na wzorcowym roztworze endotoksyn oraz na medium hodowlanym, w którym zawieszone są cząstki fagowe.
1. Wzorcowy roztwór endotoksyny
1. Materiały:
a) roztwór wzorcowej endotoksyny:
EW Endotoxin E.coli O55:B5. Nr serii: EVV8 198, data ważności: 07/2010. Liczba jednostek endotoksycznych 1 mln EU/ml. Producent: Charles River Endosafe.
b) woda do iniekcji do przygotowania buforów
c) złoże Polymixin B-Agarose (Sigma P1411)
1.1. Przygotowanie próbki wzorcowej endotoksyny
Obliczono, iż po przejściu przez moduł tangencjalny teoretyczna zawartość endotoksyn w próbce lizatu fagowego wynosi ok. 320 EU/ml.
Założenia: zagęszczaniu na module poddano 1 litr lizatu o zawartości endotoksyn 16 EU/ml, czyli w 1 litrze lizatu mamy 16 0000 EU. Po przejściu przez moduł objętość próbki wynosi 50 ml. Przyjmując na podstawie objętości, iż zagęszczeni próbki jest ok. 20 krotne, poziom endotoksyn powinien teoretycznie wynosić 320 EU w 1 ml. Wartość 320 EU/ml jest to teoretyczna wartość EU, która zostanie poddana oczyszczaniu na kolumnie. W doświadczeniu założono tzw. „najgorszy przypadek tzn., że na module nie następuję żadne oczyszczanie z endotoksyn, choć w praktyce endotoksyny na module są oczyszczane.
1.2. Roztwór endotoksyny wzorcowej
Sporządzono roztwór wzorcowej endotoksyny (w wodzie apyrogennej) o stężeniu ok. 320 EU/ml w objętości 50 ml.
1.3. Oczyszczanie próbki roztworu endotoksyny wzorcowej
W szklanej kolumnie o wymiarach x/y upakowano 10 ml złoża Polymixin B-Agarose (Sigma P1411) i zrównoważono 100 ml buforu 20 mM fosforan sodu, 150 mM NaCl. Następnie nakładano 50 ml wzorcowego roztworu endotoksyny (320 EU/ml) przy przepływie 0,2 ml/min. w temperaturze pokojowej. Zebrano roztwór wypływający z kolumny (próbka nr 2). Kolumnę płukano 50 ml buforu, po czym nałożono 25 ml próbki 2 przy przepływie 0,2 ml/min. w temperaturze pokojowej. Zebrano roztwór wypływający z kolumny (próbka 3).
Próbki do analiz poziomu endotoksyny:
Próbka nr 1 - bufor równoważący (25 ml)
Próbka nr 2 - roztwór endotoksyny wzorcowej po jednokrotnym przepuszczeniu przez kolumnę
Polymixin B (25 ml)
Próbka nr 3 - roztwór endotoksyny wzorcowej po dwukrotnym przepuszczeniu przez kolumnę
Polymixin B (25 ml)
PL 212 811 B1
Próbka nr 4 - Wyjściowy roztwór endotoksyny wzorcowej, teoretyczna zawartość endotoksyn 320 EU/ml (12 ml).
Próbki zostały poddane sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 pm Millex GP (firmy Millipore, nr kat. SLGP033RS).
1.4. Wyniki oczyszczania
Wyniki zawartości endotoksyn w próbce nr 2 i próbce nr 4
a) próbka nr 4 - więcej niż 640 EU/ml mniej niż 1280 EU/ml
b) próbka nr 2 - więcej niż 0,25 EU/ml mniej niż 0,5 EU/ml.
Po przeanalizowaniu uzyskanych wyników nie uznano za celowe sprawdzanie zawartości endotoksyn w próbce nr 1 i próbce nr 3. Uzyskane wyniki dla próbki nr 2 dowodzą, iż bufor równoważący posiadał odpowiednią czystość (pod kątem endotoksyn) oraz jednokrotne przepuszczenie przez kolumnę pozwala na uzyskanie roztworu o wysokiej czystości (pod kątem endotoksyn).
1.5. Wniosek końcowy z eksperymentu
Przy założonych warunkach rozdziału kolumna Polymixin B-Agarose posiada zdolność redukcji endotoksyn co najmniej na poziomie 2560 razy (640 EU/ml zawierał roztwór oczyszczany, po oczyszczaniu poziom endotoksyn wynosił 0,25 EU/ml). (Za wynik końcowy przyjęto dolną granicę w oznaczeniach poziomu endotoksyn).
2. Bulion wzbogacony
2.1. Materiały do oczyszczania
a) bulion wzbogacony do bakteriofagów s. 18/09/PC fagi
b) woda do iniekcji do przygotowania buforów
c) złoże Polymixin B-Agarose (Sigma P1411)
2.2. Oczyszczanie bulionu wzbogaconego
Około 1000 ml bulionu wzbogaconego zagęszczono do 25 ml (ustawienie pompy 0,70). Dodano 25 ml buforu (20 mM fosforan sodu, 150 mM NaCl, pH 7,2). Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml, cyrkulowano w module bez filtracji (wężyk „filtrate zamknięty) 5 min, ustawienie pompy 0,9. Wypompowano faga z modułu. Dodano 25 ml buforu, cyrkulowano w module bez filtracji (wężyk „filtrate” zamknięty) 5 min, ustawienie pompy 0.9. Wypompowano bulion z modułu, połączono obie porcje bulionu. Kolumienkę z wypełnieniem Polymixin B-Agarose Immobilised Sigma P1411 (10 ml złoża) przepłukano buforem przy przepływie 0,2 ml/min. Nakładano próbkę bulionu przy takim samym przepływie.
Próbki do analiz poziomu endotoksyny:
Próbka nr 1 - bufor do płukania (35 ml)
Próbka nr 2 - bulion wyjściowy (wzbogacony)
Próbka nr 3 - bulion flow z modułu (25 ml)
Próbka nr 4 - bulion zagęszczony do 50 ml (5 ml)
Próbka nr 5 - bulion po moduł (przepłukany) (5ml)
Próbka nr 6 - bulion po Polymixin B (42 ml)
Próbki zostały poddane sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 pm Millex GP (firmy Millipore, nr kat. SLGP033RS).
2.3. Wyniki oczyszczania:
a) próbka nr 2 (bulion wzbogacony) - więcej niż 8 EU/ml mniej niż 16 EU/ml
b) próbka nr 6 - więcej niż 0,125 EU/ml mniej niż 0,25 EU/ml.
próbka nr 5 (bulion po moduł, przepłukany) - więcej niż 0,25 EU/ml mniej niż 0,5 EU/ml.
Wniosek końcowy z eksperymentu
Kolumna Polymixin B powoduje całkowite oczyszczanie bulionu wzbogaconego z endotoksyn (redukcja 64 krotna). Warunki oczyszczania medium, w którym zawieszone są bakteriofagi, na kolumnie Polymixin B zostały dobrane prawidłowo.
W kolejnych eksperymentach przetestowano oczyszczanie mieszanka fagowa przeciwko gronkowcom o nazwie roboczej P-A-Ż-3 z zastosowaniem identycznych warunków jakie zastosowano w eksperymencie z endotoksyną oraz w eksperymencie z bulionem wzbogaconym. (Za wynik końcowy przyjęto dolną granicę w oznaczeniach poziomu endotoksyn)
PL 212 811 B1
PL 212 811 B1
Przykład 2. Sposób oczyszczania mieszanki lizatów fagowych przeciwko gronkowcom
1. Produkcja lizatów fagowych
1.1. Materiał wyjściowy:
Lizaty fagowe przeciwko gronkowcom otrzymano z IITD PAN Wrocław.
Lizaty stanowią cząstki fagowe o mianie nie niższym niż rzędu 107 pfu/ml, zawieszone w bulionie wzbogaconym do namnażania bakteriofagów. Lizaty fagowe spełniają wymagania specyfikacji jakościowej IBSS BIOMED S.A. pod względem postaci i właściwości, zanieczyszczeń mechanicznych widocznych okiem nieuzbrojonym, jałowości oraz aktywności (miana wyrażonego w pfu/.ml). Lizaty fagów są wolne od wirusów HCV, HBS oraz HIV. W czasie produkcji lizatów fagowych stosowana jest wytyczna ds. minimalizacji ryzyka przenoszenia TSE.
1.2. Substancje pomocnicze
Szczepy gospodarze bakteriofagów - szczepy Staphylococcus aureus otrzymano z IITD PAN Wrocław. Charakterystyka szczepów zawarta jest w Karcie charakterystyki szczepu.
Z otrzymanych szczepów S. aureus przygotowywano pulę macierzystą (macierzystą serię siewną, master seed lot) i wykonano następujące operacje:
- ożywianie i namnażanie otrzymanego szczepu,
- separacja masy bakteryjnej,
- zawieszenie odwirowanej masy bakteryjnej w nośniku mlecznym,
- rozlew zawiesiny do ampułek lutowanych,
- liofilizacja szczepu puli macierzystej,
- zatapianie ampułek pod próżnią,
- kontrola szczelności ampułek
Na reprezentatywnych próbkach szczepu puli macierzystej. Dział Kontroli Jakości wykonuje następujące badania kontrolne:
- jednorodność szczepu - morfologia szczepu - test biochemiczny API Coryne
Wyniki badań są zapisywane w Karcie Kontrolnej Puli Macierzystej Szczepu i na ich podstawie KJ dopuszcza szczepy do stosowania.
Szczepy przechowywane są w postaci liofilizatów, w temp. 2-8°C, co zapewnia stabilność ich cech biotechnologicznych.
1.3. Podłoże do namnażania bakteriofagów
Bakteriofagi są namnażane na bulionie wzbogaconym do bakteriofagów.
Skład bulionu
Skład (podano ilości w g na 1000 ml H2Odest.):
1. Wyciąg mięsny 0,4
2. Enzymatyczny hydrolizat kazeiny 5,4
3. Hydrolizat drożdży 1,7
4. Pepton 4,0
5. NaCl 3,5
Wszystkie składniki są dokładnie rozpuszczane w wodzie oczyszczonej i mieszane.
Przy pomocy 10% NaOH ustalana jest pH na wartość 7,2.
Podłoże jest sterylizowane w autoklawie w 12°C, 1 atm., 20 min.
Wszystkie składniki stosowane do produkcji bulionu wzbogaconego pochodzą od certyfikowanych dostawców. Dla każdego ze stosowanych składników opracowane są specyfikacje jakościowe.
1.4. Namnażanie bakteriofagów
1.4.1. Sporządzenie zawiesiny szczepu
1.4.1.1. Do sporządzenia zawiesiny używa się szczep wyhodowany uprzednio na 3% agarze krwawym. Ze szczepu przygotowuje się inokulum o gęstości 1,5 McF w bulionie wzbogaconym do bakteriofagów. Zawiesinę szczepu o gęstości 1,5 w skali McFarlanda inkubuje się w 37°C przez 3 godziny. Po zakończonej inkubacji sprawdza się gęstość zawiesiny. Zawiesinę powinna mieć gęstości ok. 2,0 w skali McFarlanda.
1.4.1.2. Łączenie zawiesiny bakterii i lizatu fagowego
Bulion wzbogacony doprowadza się do temperatury pokojowej. Lizat fagowy i zawiesinę szczepu dodaje się do bulionu wzbogaconego w proporcji 3:1, z zachowaniem kolejności najpierw lizat,
PL 212 811 B1 potem zawiesinę szczepu bakterii. Równocześnie wykonuje się kontrolę wzrostu szczepu bakterii - do bulionu wzbogaconego odmierza się taką samą objętość zawiesiny bakterii jak przy namnażaniu faga.
1.4.1.3. Inkubacja
Hodowlą bakteriofagów (pkt 1.4.1.2) oraz z kontrolą wzrostu szczepu S. aureus poddaje się następującym inkubacjom:
- inkubacja I - temperatura pokojowa 30 min.
- inkubacja II - temperatura 37°C przez 4 h
- inkubacja III - temperatura 2-8°C przez 18-48 h.
1.5. Otrzymanie lizatu fagowego
Po okresie inkubacji w 2-8°C w kontrola wzrostu szczepu powinno wykazywać intensywne zmętnienie hodowli. Po okresie inkubacji w 2-8°C w hodowli bakteriofagów nie powinno być zmętnienia, hodowla powinna być przejrzysta.
1.6. Sterylizacja filtracyjna lizatu fagowego
Otrzymany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 ąm.
1.7. Badania lizatu fagowego
Lizat fagowy poddaje się badaniom aktywności, jałowości oraz zawartości endotoksyn bakteryjnych.
2. Oczyszczanie bakteriofagów
Głównym źródłem zanieczyszczenia lizatów fagowych są pozostałości komórek S. aureus, metabolity oraz toksyny S. aureus, endotoksyny, a także składniki podłoża do namnażania (bulion wzbogacony). Zasadniczym celem procesu oczyszczania jest redukcja zanieczyszczeń organicznych, a także obniżenie zawartości endotoksyn bakteryjnych. Dopuszczalna zawartość endotoksyn jest zależna od drogi podania produktu leczniczego i jest zdefiniowana w Farmakopei Europejskiej (monografia 2034 „Substancje do celów farmaceutycznych”). Farmakopea Europejska precyzuje wymagania co do zawartości endotoksyn dla preparatów podawanych drogą parenteralną, dla preparatów podawanych doustnie i miejscowo określenie poziomu endotoksyn nie jest wymagane.
Aktualnie w literaturze światowej istnieją dwa trendy oczyszczania bakteriofagów: pierwszy to strącanie bakteriofagów z pożywki hodowlanej glikolem polietylenowym, a następnie ich wirowanie w gradiencie chlorku cezu, drugi to oczyszczanie bakteriofagów metodami chromatograficznymi.
Oczyszczanie w gradiencie chlorku cezu wykonywane jest głównie do celów laboratoryjnych. Dla celów przemysłowych ze względu na aspekty ekonomiczne, a także techniczne bardziej użyteczne są chromatograficzne metody oczyszczania bakteriofagów.
Z doświadczeń twórców w oczyszczaniu toksoidów wynika, iż ważnym etapem w oczyszczaniu jest separacja biomasy i wstępne oczyszczanie z użyciem modułu tangencjalnego.
Na podstawie badań rozwojowych prowadzonych przez twórców stwierdzono, iż najlepsze rezultaty co do wydajności oraz jakości oczyszczonych fagów uzyskuje się stosując oczyszczanie dwustopniowe: najpierw metodą ultrafiltracji na module tangencjalnym a następnie za pomocą chromatografii jonowymiennej stosując jako złoże Polymixin B-Agarose.
2.1. Moduł tangencjalny
Moduł tangencjalny jest urządzeniem przeznaczonym do ultrafiltracji.
Filtracja poprzez moduł tangencjalny (TFF) jest szybką i skuteczną metodą separacji i oczyszczania biocząsteczek. Moduł tangencjalny może być zastosowany do zagęszczania i odsalania próbek w objętości od 10 ml do tysięcy litrów. Jest używany do frakcjonowania cząstek, pozyskiwania zawiesiny komórek oraz klarowania lizatów komórek. Moduł TFF jest łatwy do montażu i szybszy niż dializa, pozwala na uzyskanie wyższego stężenia w krótszym czasie w porównaniu z urządzeniami do wirowania. Pozwala na równoczesne skoncentrowanie i klarowanie próbki (oszczędność czasu i uniknięcie strat produkcyjnych). Moduł TFF daje możliwość zwiększania i zmniejszania skali i jest urządzeniem wielokrotnego użytku. Można wykonać prosty test integralności, potwierdzający, iż membrana nie została uszkodzona.
2.2. Chromatografia jonowymienna
Podstawą chromatografii jonowymiennej jest współzawodnictwo jonów znajdujących się w roztworze oraz zjonizowanych makrocząsteczek o możliwość oddziaływania z przeciwnie naładowanymi grupami funkcyjnymi jonowymieniacza. Zatem rozdział makrocząsteczek w chromatografii jonowymiennej polega na odwracalnym oddziaływaniu złoża zawierającego grupy funkcyjne o zdefiniowanym ładunku z makrocząsteczkami, niosącymi ładunek o znaku przeciwnym.
PL 212 811 B1
Technika ta służy do preparatywnego izolowania białek i peptydów, bazując na występowaniu w ich cząsteczkach bocznych reszt aminokwasowych zdolnych do jonizacji. Determinują one tzw. punkt izoelektryczny białka, a co za tym idzie - jego sumaryczny ładunek w środowisku o danym pH.
Złoża chromatograficzne stosowane w tej technice noszą nazwę jonowymieniaczy, stanowią je odpowiednie nośniki (np. celulozowe, polistyrenowe) zawierające unieruchomione grupy funkcyjne, zdolne do dysocjacji w środowisku polarnym. Złoża te dzielimy na:
a) kationity - oddziałują z kationami, same obdarzone ładunkiem ujemnym
b) anionity - oddziałują z anionami, same obdarzone ładunkiem dodatnim.
Jako złoże do chromatografii jonowymienne wybrano Polymixin B (firmy SIGMA, nr kat. P1411) które jest silnym kationitem, cyklicznym antybiotykiem wyizolowanym z Bacillus polymyxa. Hamuje wzrost drobnoustrojów, włączając E. coli. Polymixin B jest zmienną mieszaniną B1 i B2 z masą molekularną ok. 1450. Polymiksiny łączą się ze ścianą komórkową i niszczą normalną przepuszczalność dla małych cząsteczek. Polymixin B i inne polimiksyny antybiotyków działają głównie przez wiązanie się do fosfolipidów błonowych i niszą błonę cytoplazmatyczną. Polymixin B działa bakteriobójczo na większość pałeczek Gram ujemnych z wyjątkiem Proteus, nie są także aktywne wobec gatunków Neisseria, większości grzybów, a także Gram (+) bakterii.
Ponieważ stwierdzono powinowactwo Polymixin B do ściany komórkowej bakterii (które zawierają LPS, zwane endotoksynami), Polymixin B immobilizowano na agarozie i użyto do usunięcia endotoksyn z roztworów. Agaroza histaminowa była użyta w tym samym celu. Polymixin B (firmy SIGMA, nr kat. P1411) była testowana pod względem zdolności wiązania LPS z E. coli O128:B12. W ulotce informacyjnej opisano sposób preparatyki z zastosowaniem Polymixin B (w załączeniu). Kolumnę można regenerować co najmniej 10 razy.
2.3. Przeprowadzenie procesu oczyszczania lizatu fagowego
2.3.1. Zagęszczanie na module tangencjalnym
Około 1000 ml lizatu fagowego zagęszczono na module tangencjalnym o cut-off 300 kDa (Minmate™ TFF z firmy Pall Life Science), do 25 ml (ustawienie pompy perystaltycznej 0,70). Dodano 25 ml buforu (20 mM fosforan sodu, 150 mM NaCl, pH 7,2). Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml bufona. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml bufona. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml. Dodano 25 ml buforu. Zagęszczono do 25 ml, cyrkulowano w module bez filtracji (wężyk „filtrate zamknięty) 5 min, ustawienie pompy 0,9. Wypompowano faga z modułu. Dodano 25 ml buforu, cyrkulowano w module bez filtracji (wężyk „filtrate zamknięty) 5 min, ustawienie pompy 0,9. Wypompowano faga z modułu, połączono obie porcje faga.
2.3.2. Oczyszczanie faga na kolumnie chromatograficznej
Kolumienkę szklaną z wypełnieniem Polymixin B-Agarose Immobilised Sigma nr kat. P1411 (10 ml złoża Polymixin B) przepłukano buforem (20 mM fosforan sodu, 150 mM NaCl, pH 7,2), o zawartości endotoksyn więcej niż 0,25 EU/ml mniej niż 0,5 EU/ml, przy przepływie 0,2 ml/min. Nakładano próbkę faga przy takim samym przepływie. Z kolumny (frakcje niezaadsorbowane) wyeluowano kilka frakcji pośrednich oraz frakcję oczyszczonego faga w objętości ok. 50 ml.
Wydajność pierwszego etapu oczyszczania poprzez zagęszczanie i przepłukiwanie na module tangencjalnym wynosi 74-87%. Końcowa wydajność oczyszczania wynosi około 47%. Straty pojawiają się głównie na drugim etapie oczyszczania (kolumna Polymixin B) i wynikają najprawdopodobniej z silnego wiązania endotoksyny do cząstek fagowych, które zatrzymywane są razem z endotoksyną na kolumnie.
2.3.2. Parametry jakościowe oczyszczonego faga
Oczyszczony roztwór faga poddano sterylizacji filtracyjnej, a następnie wykonano badania aktywności (test Gratia), zawartości endotoksyn (test LAL), profilu zanieczyszczeń (metoda HPLC).
Uzyskane wyniki
1. Aktywność cząstek fagowych
Miano lizatu wyjściowego - wynosiło rzędu 10 pfu/ml
Miano oczyszczonego faga - wynosiło rzędu 109 pfu/ml
2. Zawartość endotoksyn bakteryjnych
Etap zagęszczania i przepłukiwania na module tangencjalnym usuwa od 90 do 97,5% endotoksyny w stosunku do jej ilości w preparacie wyjściowym. Natomiast kolumna z wypełnieniem Polymixin B usuwa dodatkowo od 50 do 87,5% endotoksyny. Zatem całościowo w wyniku oczyszczania usuwane jest od 97,5% do 99,4% endotoksyny w stosunku do jej ilości w preparacie wyjściowym. Ponieważ
PL 212 811 B1 jednak w trakcie oczyszczania faga z endotoksyny następują straty w ilości samego faga, dlatego obliczono ilość endotoksyn przypadających na jednostkę faga na każdym etapie oczyszczania. Zatem ilość endotoksyny na jednostkę faga po pierwszym etapie oczyszczania (zagęszczanie i przepłukiwanie na module) spada o około 65 do 91%. Natomiast cała procedura obniża ilość endotoksyn na jednostkę faga od 99,2 do 99,8%.
3. Profil zanieczyszczeń
Analizy „zanieczyszczeń białkowych” wykonano przy zastosowaniu kolumny TSK-G 4000 SW 7,5 x 600 mm, w buforze 0,15 M fosforan sodu pH 6,8; przepływ 1 ml/min. Objętość nakładanej próbki: 100 μ|. Detekcję prowadzono przy trzech długościach fali: 220; 254 i 280 nm. Udział poszczególnych frakcji w badanych preparatach został obliczony poprzez całkowanie pola powierzchni pod szczytami:
Stopień oczyszczenia lizatu fagowego wynosi od 1000 - 3000 razy w stosunku do lizatu wyjściowego. Największy udział w usuwaniu „zanieczyszczeń białkowych” ma kolejne zagęszczanie i przepłukiwanie faga na module tangencjalnym. Oczyszczanie na kolumnie z wypełnieniem Polymixin B nie zwiększa znacząco poziomu czystości w kontekście zanieczyszczeń białkowych. Zadaniem tej kolumny nie jest jednak oczyszczanie faga z tego typu zanieczyszczeń ale usuwanie endotoksyn.
Przykład 3 (porównawczy): Wyniki oczyszczania lizatów bakteriofagowych uzyskiwane innymi metodami
W celu porównania wyników oczyszczania lizatów fagowych uzyskiwanych sposobem według wynalazku z rezultatami stosowania znanych metod oczyszczania wykonano eksperymenty porównawcze, w których wykorzystano następujące techniki:
Eksperyment porównawczy 1: wirowanie w gradiencie chlorku cezu
Eksperyment porównawczy 2: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon
Eksperyment porównawczy 3: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon i Centricon, a następnie sączenie molekularne (Sepharose 4B)
Eksperyment porównawczy 4: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon a następnie sączenie molekularne (Sepharose 4B)
Eksperyment porównawczy 5: chromatografia jonowymienna z zastosowaniem komercyjnej membrany Mustang Acrodisc (firma Pall)
Eksperyment porównawczy 6:
etap 1: Ultrafiltracja (moduł tangencjalny) etap 2: chromatografia jonowymienna z zastosowaniem komercyjnej membrany Mustang Acrodisc (firma Pall) etap 3: kolumna do usuwania endotoksyn (Celllufine Sulfate)
Eksperyment porównawczy 7:
etap 1: Ultrafiltracja (moduł tangencjalny) etap 2: kolumna do usuwania endotoksyn Cellufine Sulfate
Wyniki eksperymentów zaprezentowano w Tabeli 2.
PL 212 811 B1
W celu porównania wyników uzyskiwanych sposobem według wynalazku z rezultatami stosowania znanych metod oczyszczania wykonano eksperymenty porównawcze, w których wykorzystano następujące techniki:
PL 212 811 B1
Eksperyment porównawczy 1: wirowanie w gradiencie chlorku cezu
Eksperyment porównawczy 2: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon
Eksperyment porównawczy 3: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon i Centricon, a następnie sączenie molekularne (Sepharose 4B)
Eksperyment porównawczy 4: ultrafiltracja z zastosowaniem urządzenia Amicon a następnie sączenie molekularne (Sepharose 4B)
Eksperyment porównawczy 5: chromatografia jonowymienna z zastosowaniem komercyjnej membrany Mustang Acrodisc (firma Pall)
Eksperyment porównawczy 6:
etap 1: Ultrafiltracja (moduł tangencjalny) etap 2: chromatografia jonowymienna z zastosowaniem komercyjnej membrany Mustang Acrodisc (firma Pall) etap 3: kolumna do usuwania endotoksyn (Celllufine Sulfate)
Eksperyment porównawczy 7:
etap 1: Ultrafiltracja (moduł tangencjalny) etap 2: kolumna do usuwania endotoksyn Cellufine Sulfate
Claims (5)
1. Sposób otrzymywania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych, znamienny tym, że:
a) prowadzi się hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego, hodowlę zaszczepia się bakteriofagami i uzyskuje się lizat bakteriofagowy, korzystnie o mianie nie niższym niż 107 pfu/ml, a otrzymany lizat fagowy ewentualnie podaje się sterylizacji filtracyjnej,
b) prowadzi się oczyszczanie lizatu fagowego metodą ultrafiltracji na module tangencjalnym,
c) uzyskany przesącz oczyszcza się techniką chromatografii jonowymiennej na kolumnie wypełnionej kationitom, korzystnie zawierającej polymixin B, a następnie poddaje się ewentualnie sterylizacji filtracyjnej
d) z uzyskanego przesączu przygotowuje się oczyszczony preparat bakteriofagowy, korzystnie o mianie rzędu 109 pfu/ml i pozbawionym co najmniej 95% endotoksyn w stosunku do ich ilości w wyjściowym lizacie bakteriofagowym uzyskiwanym w etapie a.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego prowadzi się w bulionie hodowlanym o pH około 7,2 zawierającym wyciąg mięsny, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, hydrolizat drożdży, pepton, NaCl.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) jako szczep gospodarza bakteryjnego stosuje się szczep bakteryjny wrażliwy na lityczne działanie namnażanego bakteriofaga.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) uzyskany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 μm.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu b) stosuje się moduł tangencjalny o cut-off 300 kDa.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL391328A PL212811B1 (pl) | 2010-05-26 | 2010-05-26 | Sposób uzyskiwania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL391328A PL212811B1 (pl) | 2010-05-26 | 2010-05-26 | Sposób uzyskiwania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL391328A1 PL391328A1 (pl) | 2011-12-05 |
| PL212811B1 true PL212811B1 (pl) | 2012-11-30 |
Family
ID=45374148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL391328A PL212811B1 (pl) | 2010-05-26 | 2010-05-26 | Sposób uzyskiwania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL212811B1 (pl) |
-
2010
- 2010-05-26 PL PL391328A patent/PL212811B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL391328A1 (pl) | 2011-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Magalhães et al. | Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review | |
| JP6956824B2 (ja) | 生体高分子ユニットおよびウイルスを液体から分離するための方法 | |
| ES2743156T3 (es) | Método simple para eliminación simultánea de múltiples impurezas a partir de sobrenadantes de cultivo a niveles ultrabajos | |
| CN103687600B (zh) | 一种制备多糖的方法 | |
| JP6720288B2 (ja) | ウイルス用無菌精製プロセス | |
| WO2018103619A1 (zh) | 一种口蹄疫疫苗的制备方法 | |
| CN113166792B (zh) | 一种用于从含内毒素源或潜在含内毒素源中去掉或去除内毒素的方法 | |
| Fortuna et al. | Use of sulfated cellulose membrane adsorbers for chromatographic purification of cell cultured-derived influenza A and B viruses | |
| US20150037873A1 (en) | Method for endotoxin removal | |
| Roshankhah et al. | Purification of phage for therapeutic applications using high throughput anion exchange membrane chromatography | |
| CN104710527B (zh) | 一种生物制品的内毒素去除方法 | |
| US7431842B2 (en) | Method of using silicon carbide for removal of adventitious agents | |
| JP5614936B2 (ja) | アニオン交換基が固定された多孔膜を用いた核酸の精製方法 | |
| PL212811B1 (pl) | Sposób uzyskiwania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych | |
| CN101503462B (zh) | 一种去除流感病毒原液中内毒素的方法 | |
| JPH03169893A (ja) | 精製方法 | |
| Heldt et al. | A generalized purification step for viral particles using mannitol flocculation | |
| EP2582797B1 (en) | A method of producing bacteriophages | |
| RU2851844C1 (ru) | Способ культивирования и очистки бактериофагов | |
| JP2010053259A (ja) | ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法 | |
| JP2009039038A (ja) | 被分離物質の分離方法及び精製方法 | |
| JP2009042074A (ja) | 吸着担体及び吸着担体の製造方法 | |
| CN110981946A (zh) | 用于口蹄疫病毒样颗粒抗原规模化生产的溶液及纯化和组装方法 | |
| RU2590609C2 (ru) | Способ очистки бактериофагов | |
| Liu et al. | The Removal of Endotoxins in the Actual Production Process |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |