PL213133B1

PL213133B1 - Zastosowanie aromatycznych amidyn i guanidyn, pochodnych estrów difenylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych

Info

Publication number: PL213133B1
Application number: PL370944A
Authority: PL
Inventors: Józef Oleksyszyn; Anna Marcinkowska; Marcin Sieńczyk; Małgorzata Drąg-Zalesińska; Teresa Wysocka
Original assignee: Politechnika Wroclawska
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2004-11-02
Publication date: 2013-01-31
Also published as: PL370944A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie aromatycznych amidyn i guanidyn, pochodnych estrów difenylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych do wytwarzania leku przeciwko chorobie nowotworowej płuc, w charakterze czynnika indukującego apoptozę komórek rakowych.

Stosowane metody zwalczania chorób nowotworowych takie jak chemioterapia, radioterapia, metody immunologiczne, metody chirurgiczne nie gwarantują niestety pełnego powodzenia w leczeniu. Dzieje się tak między innymi dlatego, że niektóre rodzaje nowotworów są odporne na leczenie jedną metodą i bardzo często konieczne jest stosowanie równocześnie kilka z nich. Metody chirurgiczne dają pozytywne rezultaty pod warunkiem wczesnego wykrycia zmian nowotworowych. Zbyt późno postawiona diagnoza często prowadzi do stanu, w którym komórki rozprzestrzeniły się w organizmie i stworzyły nowe ogniska choroby - proces przerzutowania.

Ponadto niska selektywność metod chemioterapeutycznych i radioterapeutycznych oraz ich wysoka toksyczność prowadzi do niszczenia zdrowych komórek organizmu. Dodatkowo wszystkie ze znanych metod są bezsilne wobec nowotworów, które rozpoczęły fazę przerzutowania - metastazy. Rozprzestrzenienie się komórek nowotworowych w organizmie jest praktycznie niemożliwe do zatrzymania.

Inwazja komórek nowotworowych oraz tworzenie przerzutów stanowią bardzo złożoną grupę procesów biologicznych, które w głównej mierze zależą od możliwości przeprowadzenia przez komórki rakowe proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej. Dzięki temu komórka nowotworowa zyskuje możliwość opuszczenia miejsca, w którym powstała i przejścia naczyniami krwionośnymi czy limfatycznymi do innych, często bardzo oddalonych miejsc w organizmie tworząc nowe ogniska choroby.

Jedną z metod walki z procesami nowotworowymi jest wprowadzenie do komórek rakowych czynnika, który dostarczy tej komórce sygnału do popełnienia „samobójstwa”. Proces ten nazywany jest apoptozą i dotyczy wszystkich zdrowych komórek organizmu, gdyż w genach każdej z nich zawarta jest informacja, kiedy komórka ma zginąć - wobec czego każda komórka ma określony wiek życia, po przekroczeniu którego sama się unicestwia. Każdego dnia ginie w naszym organizmie ponad miliard komórek i tyleż samo rodzi się nowych.

Najistotniejszą różnicą pomiędzy komórkami nowotworowymi a zdrowymi jest to, iż komórki nowotworowe na skutek mutacji genetycznych pozbawione są zdolności uruchomienia sygnału autodestrukcji. Brak wewnętrznego, własnego sygnału inicjującego apoptozę umożliwia im praktycznie nieograniczony wzrost prowadzący do wyniszczenia, a w konsekwencji do śmierci organizmu. Dlatego też poszukuje się czynników, które w sposób selektywny zainicjują indukcję apoptozy w komórkach rakowych. Działanie większości znanych leków przeciwnowotworowych opiera się w mniejszym lub większym stopniu na indukcji w nich procesu apoptozy - dostarczenie komórce nowotworowej sygnału śmierci eliminuje ją z organizmu. Mechanizmy tych procesów nie są jednak zbyt dobrze poznane.

Współczesne doniesienia literatury naukowej i patentowej wskazują, iż czynnikami indukującymi apoptozę komórek nowotworowych mogą być m.in. steroidy roślinne jak diosgenina (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci., 2004, 808, 255-62), chimerowe kwasy nukleinowe (PCT/US99/00637), przeciwciała monoklonalne (PCT/JP98/04118) czy szereg związków chemicznych pochodzenia naturalnego, jak i tych otrzymanych na drodze syntetycznej. Każdy nowy związek zdolny do indukcji apoptozy komórek rakowych, a tym samym prowadzący do jej śmierci, jest potencjalnym lekiem w walce z chorobą nowotworową.

Estry difenylowe kwasów 1-aminoalkanofosfonowych i ich pochodne są związkami znanymi w literaturze naukowej (Synthesis 1979, 985-986, J.Med.Chem. 1994. 37, 3969-3976). Aromatyczne amidyny i guanidyny stanowią niewielką grupę pochodnych należących tej klasy związków chemicznych (J.Med.Chem. 2004, 47, 2411-2413, Tetrahedron Lett. 2004, 45, 7251-7254). Ich biologiczna aktywność w głównej mierze ogranicza się do hamowania różnych enzymów proteolitycznych, w szczególności proteaz serynowych (Biochemistry, 1991, 30, 485-493, Biochemical Pharm. 1997, 54, 173-179). Doniesienia literaturowe wskazują, iż aromatyczne amidyny i guanidyny, pochodne estrów difenylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych są skutecznymi inhibitorami urokinazowego aktywatora plazminogenu, enzymu proteolitycznego silnie zaangażowanego w rozwój i metastazę komórek nowotworowych (J.Med.Chem. 2004, 47, 2411-2413). Zależność pomiędzy hamowaniem tego enzymu a indukcją apoptozy komórek rakowych nie została jednak do tej pory wyjaśniona; co więcej, brak jakichkolwiek doniesień, jakoby związki będące inhibitorami urokinazy zmuszały komórki nowotworowe do popełnienia samobójstwa.

PL 213 133 B1

Brak jest, zarówno w literaturze naukowej jak i patentowej, doniesień dotyczących zdolności tego typu pochodnych do indukcji apoptozy komórek nowotworowych.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie do wytwarzania leku przeciwko chorobie nowotworowej płuc, związków przestawionych wzorem ogólnym 1, w którym podstawnik R1 oznacza grupę benzyloksykarbonylową lub łańcuch peptydowy o sekwencji Cbz-Ala-Pro, natomiast podstawnik R1 oznacza grupę guanidynową lub amidynową jako czynnika wywołującego apoptozę komórek rakowych. Korzystnie stosuje się aromatyczne guanidyny, posiadające grupę guanidynową w pozycji 4, przedstawione wzorem 2 lub w pozycji 3, przedstawione wzorami 3 i 4 oraz aromatyczne amidyny posiadające grupę amidynową w pozycji 4, przedstawione wzorem 5, pochodne estrów difenylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych.

Korzystnie efektywna ilość aromatycznych amidyn i guanidyn, pochodnych estrów' difenylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych w leku do leczenia choroby nowotworowej płuc na drodze indukcji apoptozy komórek rakowych zawiera się w przedziale od 0,01 mg do 200 mg na kilogram masy ciała chorego.

Leczenie schorzeń nowotworowych poprzez indukowanie w nich procesu apoptozy może być stosowane w przypadku różnych rodzajów nowotworów. Będące przedmiotem wynalazku związki przeznaczone są do otrzymywania leków stosowanych w zapobieganiu i leczeniu raka płuc (forma drobnokomórkowa i niedrobnokomórkowa). Zaletą tych związków jest możliwość wykorzystania ich w leczeniu guzów litych jak i zaawansowanych form raka, których leczenie jest niemożliwe tradycyjnymi metodami. Związki według wynalazku nadają się do stosowania w leczeniu nowotworów trzustki, mózgu, pęcherza, karku i głowy, nerek, prostaty, macicy, skóry, wątroby, jelita grubego, piersi, różnych form leukemii.

Dostarczanie do organizmu aromatycznych amidyn i guanidyn, pochodnych estrów difenylowych kwasów 1-aininoalkanofosfonowych według wynalazku, może następować drogą doustną, dożylną, podskórną lub miejscową w różnych postaciach farmaceutycznych. Możliwe jest także dostarczanie leku bezpośrednio do tkanki zmienionej chorobowo, to jest bezpośrednio do guza. Dawkowanie uzależnione jest od rodzaju nowo tworu, jego inwazyjności, stanu zdrowia pacjenta oraz rodzaju podawanego związku a także od rodzaju terapii współtowarzyszącej.

Zdolność związków według wynalazku do indukowania apoptozy komórek nowotworowych przetestowano na komórkach nowotworowych ludzkiego, epitelialnego raka płuc (Lung carcinoma) A549 i przylegających w hodowli do podłoża, a zdeponowanych w pracowni hodowli komórkowych Zakładu Biochemii Lekarskiej Akademii Medycznej we Wrocławiu.

Linia A549 jest scharakteryzowana w literaturze w następujący sposób:

Ludzka linia komórkowa typu A549, kaukaska, rak płuc, ECACC 86012804

Pochodzenie komórek - 58 letni mężczyzna rasy kaukaskiej. Komórki mogą syntetyzować lecytynę używając cytydynową difosfosfocholinową ścieżkę metaboliczną. Czasami komórki mogą zawierać ciała inkluzyjne, jednakże nie posiadające żadnych ludzkich patogenów. Morfologia: epiteliczny, ludzki, kaukaski rak płuc. Deponent: ATCC, USA. Szczególne właściwości i zawartość: lecytyna, duże stężenia nienasyconych kwasów tłuszczowych (ECACC. Salisbury, Wiltshire). Subkulturowe optymal₃ ne tempo podziału wynosi 1:3 do 1:6 przy posiewie w ilości 2-4 x 10.000 komórek/cm³ używając 0,25% trypsyny lub trypsy/EDTA; 5% CO2; 37°C. Kariotyp: hypotryploidalny

Medium hodowlane: Dla linii Jurkat używano medium RPMI-1640 (R8758) firmy Sigma z dodatkiem 10% FBS (Fetal Bosine Serum) firmy Cambrax, dla linii A549 stosowano medium MEM (Minimum Essential Medium Eagle M2279) firmy Sigma z suplemencją 0,292 g/l L-glutaminą i 10% FBS firmy Cambrax. Warunki hodowli: hodowle komórkowe prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CCK W celu odklejenia komórek linii A549 od podłoża stosowano trypsynizację używając 0,25% roztworu Trypsin-EDTA (T4049) firmy Sigma.

Przedmiot wynalazku jest objaśniony w przykładach wykonania.

P r z y k ł a d I

Zdolność do indukcji apoptozy aromatycznych guanidyn, pochodnych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych w postaci chlorowodorku estru difenylowego kwasu, N-benzyloksykarbonylamino-[(4-guanylo)fenylo]metanofosfonowego przedstawionego wzorem 2, testuje się w hodowlach komórek A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 48 godzinach przy użyciu testu kometkowego.

Przygotowuje się hodowle komórkowe linii A549 tej samej liczebności wyjściowej zawieszonych w toni, w objętości 0.9 ml, w dołkach (obraz m' mikroskopie - pojedyncze, średnio liczne w polu widzenia). Hodowle pozostawia się do zrównoważenia w medium. Po 24 godz. obraz w polu widzenia mikroskopu

PL 213 133 B1 taki sam we wszystkich dołkach hodowlanych - tylko komórki żywe. równomiernie rozmieszczone, niezbyt liczne - liczebność nie ogranicza proliferacji. Preparat, w postaci roztworu o stężeniu wyjściowym - 10 mM, rozcieńcza się używając medium hodowlanego dla linii A549 do stężenia 0,5 mM i filtruje się przez filtry bakteriologiczne. Dodaje się odpowiednio do hodowli uzyskując stężenia efektywne 10 μΜ, 50 μΜ, 125 μΜ, 250 μΜ. Po 48 godzinach przeprowadza się test kometkowy polegający na identyfikacji uszkodzeń DNA poszczególnych komórek w sposób identyczny jak opisano we wcześniejszych publikacjach (Drąg-Zalesińska M.. Wysocka T., Dumańska M., Jagoda E., Zabel M., Folia Histochemica et Cytobiologica, 2002, 40, 125; Drąg-Zalesińska M.. Wysocka T., Gębarowska E., Zabel M., Folia Histochemiea et Cytobiologia, 1999, 37, 133). Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli I.

Stężenie związku	Komórki apoptyczne	Niezidentyfikowane uszkodzenie DNA w komórkach	Brak uszkodzenia
10 μΜ	88,6%	5,7%	5,7%
50 μΜ	68,1%	0%	31,9%
125 μΜ	100%	0%	0%
250 μΜ	100%	0%	0%

T a b e l a I. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych, pH=7,0, wykonanego dla linii A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 48 godzinach od inkubacji z chlorowodorkiem estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonylamino-[(4guanylo)fenylo]metanofosfonowego.

P r z y k ł a d II

Zdolność do indukcji apoptozy aromatycznych guanidyn, pochodnych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych w postaci chlorowodorku estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonylamino-[(3-guanylo)fenylo]metanofosfonowego przedstawionego wzorem 3, po 48 godzinach od inkubacji z linią komórkową A549 w fazie wzrostu stacjonarnego wykonuje się metodą opisaną w przykładzie I przy stężeniach 50 μΜ, 125 μΜ oraz 250 μΜ. Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli II.

Stężenie związku	Komórki apoptyczne	Niezidentyfikowane uszkodzenie DNA w komórkach	Brak uszkodzenia
50 μΜ	22,2%	13,3%	64,5%
125 μΜ	59,3%	7,4%	33,3%
250 μΜ	100%	0%	0%

T a b e l a II. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych, pH=7,0, wykonanego dla linii A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 48 godzinach od inkubacji z chlorowodorkiem estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonylamino-[(3-guanylo)fenylo] metanofosfonowego.

P r z y k ł a d III

Zdolność do indukcji apoptozy aromatycznych guanidyn, pochodnych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych w postaci chlorowodorku estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonyl-alanyloprolilo-amino[(3-guanylo)fenylo]metano-fosfonowego - wzór 4, po 48 godzinach od inkubacji z linią komórkową A549 w fazie wzrostu stacjonarnego wykonuje się metodą opisaną w przykładach I i II przy stężeniach 10 μΜ, 50 μΜ oraz 125 μΜ. Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli III.

Stężenie związku	Komórki apoptyczne	Niezidentyfikowane uszkodzenie DNA w komórkach	Brak uszkodzenia
10 μΜ	0%	19%	81%
50 μΜ	4,3%	29,3%	66,4%
125 μΜ	10%	44,4%	44,6%

PL 213 133 B1

T a b e l a III. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych, pH=7,0, wykonanego dla linii A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 48 godzinach od inkubacji z chlorowodorkiem estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonylalanylo-prolilo-amino[(3-guanylo)-fenylojmetanofosfonowego.

P r z y k ł a d IV

Zdolność do indukcji apoptozy aromatycznych guanidyn, pochodnych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych w postaci chlorowodorku estru difenylowego kwasu N-benzyIoksykarbonyloamino-[(4-guanyIo)fenyIo]metanofosfonowego przedstawionego wzorem 2, testuje się w hodowlach komórek A549 we wstępnej fazie wzrostu po 48 godzinach przy użyciu testu kometkowego.

Przygotowano hodowle komórkowe linii A549 tej samej liczebności wyjściowej zawieszonych w toni, w objętości 0,9ml, w dołkach (obraz W mikroskopie - pojedyncze, średnio liczne w polu widzenia). Hodowle pozostawia się do zrównoważenia w medium. Po 24 godzinach obraz w polu widzenia mikroskopu taki sam we wszystkich dołkach hodowlanych - tylko komórki żywe, równomiernie rozmieszczone, niezbyt liczne - liczebność nie ogranicza proliferacji.

Preparat, w postaci roztworu o stężeniu wyjściowym - 10 mM, rozcieńcza się używając medium hodowlanego dla linii A549 do stężenia 0,5 mM i filtruje się przez filtry bakteriologiczne. Dodaje się odpowiednio do hodowli uzyskując stężenia efektywne 10 μΜ, 50 μΜ i 125 μΜ. Po 48 godzinach przeprowadza się test kometkowy polegający na identyfikacji uszkodzeń DNA poszczególnych komórek, w sposób przedstawiony w przykładzie I. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli IV.

Stężenie związku	Komórki apoptyczne	Niezidentyfikowane uszkodzenie DNA w komórkach	Brak uszkodzenia
10 μΜ	50%	10,9%	39,1%
50 μΜ	36%	49,1%	14,9%
125 μΜ	50,8%	34,9%	14,3%

T a b e l a IV. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych, pH=7,0, wykonanego dla linii A549 we wstępnej fazie wzrostu po 48 godzinach od inkubacji z chlorowodorkiem estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonylamino-[(4-guanylo)fenylo]metanofosfonowego.

P r z y k ł a d V

Zdolność do indukcji apoptozy aromatycznych guanidyn, pochodnych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych w postaci chlorowodorku estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonylamino-[(3-guanylo)fenylo]metanofosfonowego wzór 3, po 48 godzinach od inkubacji z linią komórkową A549 we wstępnej fazie wzrostu wykonuje się metodą opisaną w przykładzie IV przy stężeniach 10 μΜ, 50 μΜ, 125 μΜ oraz 250 μΜ. Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli V.

Stężenie związku	Komórki apoptyczne	Niezidentyfikowane uszkodzenie DNA w komórkach	Brak uszkodzenia
10 μΜ	6,6%	33%	59,4%
50 μΜ	36,3%	46,1%	17,6%
125 μΜ	26,8%	59,3%	13,9%
250 μΜ	55,3%	29,8%	14,9%

T a b e l a V. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych (pH=7,0) wykonanego dla linii A549 we wstępnej fazie wzrostu po 48 godzinach od inkubacji z chlorowodorkiem estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonylamino-[(3-guanylo)fenylo]metanofosfonowego.

P r z y k ł a d VI

Zdolność do indukcji apoptozy aromatycznych guanidyn, pochodnych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych w postaci chlorowodorku estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonylalanylo-prolilo-amino[(3-guanylo)fenylo]metanofosfonowego przedstawionego wzorem 4, po 48 godzinach od inkubacji z linią komórkową A549 we wstępnej fazie wzrostu wykonuje się metodą opisaną w przykładach IV i V przy stężeniach 10 μΜ, 50 μΜ i 125 μΜ. Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli VI.

PL 213 133 B1

Stężenie związku	Komórki apoptyczne	Niezidentyfikowane uszkodzenie DNA w komórkach	Brak uszkodzenia
10 μΜ	38,1%	46,4%	15,5%
50 μΜ	11,8%	31,2%	57%
125 μΜ	71,5%	7,2%	21,3%

T a b e l a VI. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych. pH=7,0, wykonanego dla linii A549 we wstępnej fazie wzrostu po 48 godzinach od inkubacji z chlorowodorkiem estru difenylowego kwasu benzyloksykarbonylalanylo-prolilo-amino[(3-guanylo)fenylo]metanofosfonowego.

P r z y k ł a d VII

Zdolność do indukcji apoptozy aromatycznych amidyn, pochodnych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych w postaci chlorowodorku estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonylamino-[(4-amidynylo)fenylo]metano fosfonowego przedstawionego wzorem 5, testuje się w hodowlach komórek A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 80 godzinach przy użyciu testu kometkowego.

Preparat, w postaci roztworu o stężeniu wyjściowym - 10 mM, rozcieńcza się używając medium hodowlanego dla linii A549 do stężenia 0,5 mM i filtruje się przez filtry bakteriologiczne. Dodaje się odpowiednio do hodowli uzyskując stężenia efektywne 150 μΜ, 250 μΜ, 350 μΜ. Po 80 godzinach przeprowadza się test kometkowy polegający na identyfikacji uszkodzeń DNA poszczególnych komórek w sposób przedstawiony w przykładzie I. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli VII.

Stężenie związku	Komórki apoptyczne	Niezidentyfikowane uszkodzenie DNA w komórkach	Brak uszkodzenia
150 μΜ	2%	4%	94%
250 μΜ	8,7%	49,5%	41.8%
350 μΜ	30%	55%	15%

T a b e l a VII. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych, pH=7,0, wykonanego dla linii A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 80 godzinach od inkubacji z chlorowodorkiem estru difenylowego kwasu N-benzyloksykarbonylamino-[(4-amidynylo)fenylo]metanofosfonowego.

Claims

1. Zastosowanie aromatycznych amidyn i guanidyn, pochodnych estrów difenylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych przedstawionych wzorem ogólnym 1, w którym podstawnik R1 oznacza grupę benzyloksykarbonylową lub łańcuch peptydowy o sekwencji Cbz-Ala-Pro, natomiast podstawnik R2 oznacza grupę guanidynową lub amidynową, korzystnie aromatycznych guanidyn, posiadających grupę guanidynową w pozycji 4, przedstawionych wzorem 2 lub w pozycji 3. przedstawionych wzorami 3 i 4 oraz aromatycznych amidyn posiadających grupę amidynową w pozycji 4, przedstawionych wzorem 5, pochodnych estrów difenylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych, jako substancji aktywnej wywołującej apoptozę komórek rakowych do wytwarzania leku do leczenia choroby nowotworowej płuc.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, iż efektywna ilość aromatycznych amidyn i guanidyn, pochodnych estrów difenylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych niezbędna do leczenia choroby nowotworowej płuc na drodze indukcji apoptozy komórek rakowych zawiera się w przedziale od 0,01 mg do 200 mg na kilogram masy ciała chorego.