PL213156B1

PL213156B1 - Test ureazowy

Info

Publication number: PL213156B1
Application number: PL387568A
Authority: PL
Inventors: Weronika Pych; Maksymilian Pych
Original assignee: Maksymilian Pych; Weronika Pych
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2009-03-20
Publication date: 2013-01-31
Also published as: PL387568A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest test ureazowy zawierający co najmniej jeden element chłonny nasączony kompozycją mocznika i ewentualnie wskaźnika.

Wynalazek dotyczy dziedziny suchych testów urazowych. Może mieć on np. postać wykonanej z tworzywa sztucznego przezroczystej pł ytki. Tego rodzaju testy mogą być stosowane do wykrywania ureazy w śrucie sojowej, a także do wykrywania bakterii Helicobacter pylori.

Testy ureazowe, zwłaszcza testy służące do wykrywania bakterii Helicobacter pylori są znane. Zazwyczaj zawierają one kompozycję mocznika oraz wskaźnik sygnalizujący zmianę pH na skutek wydzielania się amoniaku z kompozycji mocznika po naniesieniu na test badanej próbki.

Indeks ureazy jest najbardziej rozpowszechnionym testem opracowanym przez Amerykański Związek Olejarski (AOCS) w 1980 roku. Test stosowany jest do pomiaru aktywności ureazy pozostałej w produktach sojowych (śrucie sojowej) po obróbce termicznej w czasie której ureaza ulega dezaktywacji. Test wykonuje się następująco: w probówce umieszcza się 0,2 g śruty sojowej, dodaje się 10 ml roztworu mocznika (30 g mocznika w 1 litrze roztworu buforowego, na który składa się 4,45 g Na2HPO4 i 3,4 g KH2PO4), probówkę umieszcza się w łaźni wodnej o temp. 30°C na 30 minut i mierzy się pH. Wzrost pH wskazuje na uwolnienie do roztworu amoniaku powstałego na skutek rozkładu mocznika przez ureazę.

Z polskiego opisu patentowego PL 176717 znany jest suchy test ureazowy w postaci krążków bibuły chromatograficznej nasączonej kompozycją zawierającą jednozasadowy fosforan potasowy oraz mocznik i wskaźnik, korzystnie czerwień fenolową lub krezolową. Zawartość mocznika w kompozycji wynosi 75 - 150 g na litr. Test może być stosowany przez rok od wyprodukowania.

Z polskiego opisu patentowego PL 192 707 znany jest suchy test ureazowy złożony z dwóch oddzielonych od siebie elementów z bibuły, przy czym jeden z nich nasączony jest roztworem mocznika. Zastosowano roztwór 100 g mocznika w litrze wody.

Reakcja rozkładania mocznika przez ureazę zachodząca po wprowadzeniu na powierzchnię testu badanej próbki jest zazwyczaj powolna. W związku z tym wynik testu zazwyczaj otrzymuje się po stosunkowo długim czasie np. po godzinie lub dwóch.

Wciąż istnieje więc zapotrzebowanie na testy działające szybko i niezawodnie, a także charakteryzujące się wydłużonym okresem przydatności do użycia. Przy badaniu szybkości działania testu stwierdzono, że szczególnie istotne jest dostarczenie stosunkowo dużej ilości kompozycji mocznikowej na nośnik, aby wydzielanie amoniaku w trakcie badania próbki zachodziło szybciej. Zwłaszcza w przypadku stosowania do wytwarzania testów zwykł ych wodnych roztworów mocznika wymagane jest jego podwyższone stężenie.

Celem wynalazku jest opracowanie trwałego i szybkiego testu o dużej zawartości mocznika w chłonnym elemencie nośnikowym. Test przeznaczony jest do badania obecności ureazy w badanej próbce tj. zarówno w próbce takiej jak śruta sojowa jak i do badań in vitro na obecność Helicobacter pylori.

Przedmiotem wynalazku jest test ureazowy zawierający co najmniej jeden element chłonny nasączony kompozycją mocznika i ewentualnie wskaźnika, charakteryzujący się tym, że kompozycja mocznika zawiera 20-30%-owy roztwór mocznika w wodzie apyrogennej oraz fosforan mocznika uzyskany przez zmieszanie mocznika i kwasu ortofosforowego w stosunku molowym 1:1, przy czym kompozycja mocznika zawiera od 0,1 do 0,2 g fosforanu mocznika na 100 g roztworu mocznika.

Korzystnie pH kompozycji mocznika wynosi od 3 do 4.

Test ureazowy zawierać może element wskaźnikowy oraz dwa, ustawione naprzeciwlegle, elementy chłonne nasączone kompozycją mocznika, przy czym badana próbka jest osadzana pomiędzy nimi.

Stosuje się kompozycję mocznika według wynalazku tj. zawierającą 20-30%-owy roztwór mocznika w wodzie apyrogennej oraz fosforan mocznika uzyskany przez zmieszanie mocznika i kwasu ortofosforowego w stosunku molowym 1:1, przy czym ilość fosforanu mocznika w roztworze wynosi od 0,1 do 0,2 g na 100 g roztworu mocznika.

Test może mieć postać przezroczystej, wykonanej z tworzywa sztucznego płytki z wgłębieniem, korzystnie cylindrycznym, w którym znajdują się element wskaźnikowy i dwa ustawione naprzeciwlegle elementy chłonne nasączone kompozycją mocznika, przy czym jeden z tych elementów chłonnych osadzony jest we wgłębieniu a drugi znajduje się na wewnętrznej powierzchni samoprzylepnej powłoki z tworzywa znajdują cej się na powierzchni pł ytki i zamykają cej wgłębienie.

Test ma postać wykonanej z tworzywa sztucznego, przezroczystej płytki 1 z plombą 2 i z wgłębieniem 3, w którym osadzone są element wskaźnikowy 4 oraz dwa elementy chłonne 5, 6 nasączone

PL 213 156 B1 kompozycją mocznika, przy czym wgłębienie 3 połączone jest kanalikiem odpowietrzającym 7 z zamykającym go występem 8 znajdującym się na krawędzi 9 plomby 2.

Wklęsła powierzchnia 15 płytki 1 zabezpieczona jest powłoką z tworzywa 10 obejmującą powierzchnię plomby 2, a wgłębienie 3 ma występ 11 pozycjonujący element wskaźnikowy 4. Element 4 jest umieszczony we wgłębieniu 3.

Wynalazek dotyczy dziedziny ureazowych testów suchych. Test według wynalazku zawiera element chłonny nasączony przed wysuszeniem kompozycją mocznika według wynalazku tj. kompozycją o wyjątkowo dużym stężeniu mocznika wynoszącym od 20 do 30% np. 25%. Nieoczekiwanie stwierdzono, że kompozycja wykazuje bardzo dobre właściwości z punktu widzenia przydatności do wytwarzania testów ureazowych, kiedy zawiera również fosforan mocznika NH₂CONH₂^H₃PO₄ pełniący rolę buforu. Skład kompozycji, a zwłaszcza zastąpienie znanych wcześniej buforów fosforanem mocznika pozwala na osiągnięcie korzystnego pH mieszczącego się w granicach od 3,0 do 4,0. Fosforan mocznika jest wytwarzany np. poprzez reakcję 85%-owego kwasu ortofosforowego i czystego mocznika. Istotne jest, że substraty te są mieszane w stosunku molowym 1M/1M. Woda stosowana w kompozycji powinna być najwyższej czystości tj. apyrogenna, co oznacza, że została ona np. zdejonizowana, przefiltrowana, redestylowana i sterylizowana.

Element chłonny użyty w teście według wynalazku może stanowić w zasadzie dowolny nośnik zapewniający osadzenie roztworu kompozycji mocznika. Mogą to być organiczne lub nieorganiczne materiały chłonne takie jak materiały na bazie celulozy nitrocelulozy, octanu celulozy i estrów celulozy, a więc np. wszelkiego rodzaju bibuły, a także różnego typu, jedno- lub wielowarstwowe włókniny z tworzyw sztucznych np. na bazie polipropylenu, poliestrów lub włókniny wiskozowe. Nośnikiem kompozycji mogą być również silikażele szerokoporowate lub żele agarowe, a także membrany wykonane z różnych materiałów organicznych i nieorganicznych.

Wysokie stężenie mocznika w kompozycji czyni ją bardzo uniwersalną i pozwala na zastosowanie różnych materiałów chłonnych, również tych o niższych właściwościach sorpcyjnych.

Test może zawierać nowy układ elementów chłonnych nasączonych kompozycją mocznika. Dwa takie elementy są położone naprzeciwlegle (układ dwuwarstwowy, sandwiczowy, kanapkowy) w taki sposób, że jeden element mocznikowy znajduje się nad drugim elementem nasączonym mocznikiem. W przykładowym wykonaniu test ma postać wykonanej z tworzywa sztucznego przezroczystej płytki, w której pierwszy element chłonny jest osadzony na folii samoprzylepnej pokrywającej płytkę w takim miejscu, że znajduje się dokładnie nad pierwszym elementem mocznikowym znajdującym się we wgłębieniu płytki. Powoduje to, że po otwarciu testu i odklejeniu folii próbkę umieszcza się na jednym z elementów chłonnych nasączonych kompozycją mocznikową i dociska drugim elementem chłonnym nasączonym kompozycją mocznikową. Badana próbka zostaje zamknięta pomiędzy dwoma warstwami materiału chłonnego po ponownym zabezpieczeniu powłoką w postaci folii samoprzylepnej. Zapewnia to stabilizację próbki oraz dużą powierzchnię kontaktu próbki z mocznikiem. Wydzielanie amoniaku pod wpływem działania ureazy jest intensywniejsze, a co za tym idzie odczyt wyniku testu jest szybszy i wynosi od 4 do 30 minut. Układ dwuwarstwowy (kanapkowy) elementów chłonnych zawierających mocznik może być stosowany dla dowolnych kompozycji mocznika. Rozwiązanie takie polega na „otoczeniu” badanej próbki materiałem chłonnym zawierającym mocznik. W testach takich stosuje się opisaną powyżej kompozycję mocznikową o zwiększonej zawartości mocznika. Układ dwuwarstwowy może być osadzony w płytkach z wgłębieniem stosowanych do wytwarzania testów.

Korzystnie stosuje się szczególną konstrukcję testu w postaci przezroczystej płytki 1 wykonanej z tworzywa sztucznego, jak pokazano na rysunku, przy czym fig. 1 przedstawia widok ogólny testu w postaci płytki i jej przekroje, fig. 2 przedstawia przekrój podłużny płytki testu z osadzonymi elementami chłonnymi nasączonymi kompozycją mocznika i elementem wskaźnikowym, a fig. 3 przedstawia test w postaci płytki w odmiennym wykonaniu. Zastosowanie kompozycji mocznika o zwiększonym stężeniu powoduje, że wydzielanie amoniaku i CO2 może być bardzo intensywne. W związku z tym płytka testu według wynalazku zawiera kanalik odpowietrzający 7 doprowadzony do cylindrycznego wgłębienia 3. Aktywacja kanalika, czyli otwarcie, następuje dopiero w momencie użycia testu. Pożądane jest bowiem, aby test w czasie przechowywania pozostawał szczelny, a więc odporny na wszelkie warunki otoczenia, szczególnie warunki transportu czy trudne do przewidzenia warunki laboratoryjne. Otwieranie testu i kanalika odpowietrzającego odbywa się poprzez wyłamanie plomby 2 zaopatrzonej w występ 8, który stanowi bezpośrednie zamknięcie kanalika 7. Plombę 2 stanowi wycinek płytki zespolony z nią tylko poprzez występ 8 znajdujący się na krawędzi 9 oraz poprzez dodatkowe występy mocujące 12. Układ taki powoduje powstanie wolnej przestrzeni 13, co ułatwia wyłamanie plom4

PL 213 156 B1 by. Wyłamanie plomby powoduje nie tylko otwarcie kanalika odpowietrzającego ale również prowadzi do otwarcia testu, czyli odsłonięcia wgłębienia 3, co pokazano na fig. 3. Płytka testu jest pokryta samoprzylepną powłoką z tworzywa 10, która obejmuje lekko wklęsłą w stosunku do zewnętrznych powierzchni 14 środkową część płytki 15 i plombę 2. Test jest bardzo trwały i może być stosowany po dwóch, a nawet po trzech latach od wyprodukowania. W cylindrycznym wgłębieniu może być umieszczony dowolny zestaw odczynnika i wskaźnika stosowany w testach. Korzystnie we wgłębieniu 3 umieszczony jest element wskaźnikowy 4, korzystnie certyfikowany i elementy chłonne 5 i 6 nasączone kompozycją mocznika według wynalazku. Elementy 4, 5 i 6 mogą mieć dowolny kształt, korzystnie są kwadratowe lub okrągłe (krążki). Certyfikowany element wskaźnikowy 4 jest korzystnie cięty z typowego certyfikowanego wskaźnika w kształcie paska korzystnie izolowanego z jednej strony nieprzepuszczalnym materiałem (folią), tak aby nie następował bezpośredni kontakt z elementami nasączonymi mocznikiem. Ten sam efekt można osiągnąć stosując element chłonny izolowany od strony wskaźnika. Kwadratowe elementy wskaźnikowe mogą być w sposób powtarzalny stabilizowane w odpowiednim położeniu za pomocą występu 11. Elementy chłonne 5 i 6 mogą mieć kształt krążka lub kwadratów o średnicy lub przekątnej mniejszej niż rozmiary wgłębienia 3. Elementy wskaźnikowe i chł onne mogą być stabilizowane we wgłębieniu pł ytki systemem wystę pów pozycjonują cych. Test w postaci pł ytki ma korzystnie kształ t kwadratowy lub prostoką tny, a kanalik odpowietrzaj ą cy jest ustawiony prostopadle do jednej z krawędzi płytki, ale możliwe jest również wykonanie płytek o innych kształtach. Również kształt wgłębienia w płytce i ustawienie kanalika odpowietrzającego oraz plomby można modyfikować. Przykładową odmianę testu w postaci wykonanej z tworzywa sztucznego przezroczystej płytki pokazano na fig. 2.

P r z y k ł a d 1

Wytworzono kompozycję mocznika poprzez zmieszanie 200 g 25%-owego roztworu mocznika w wodzie apyrogennej z 0,304 g fosforanu mocznika otrzymanego poprzez zmieszanie 85%-owego kwasu ortofosforowego i czystego mocznika w stosunku molowym 1:1. Otrzymano roztwór o pH równym 3,3. Roztworem nasączono bibułę chromatograficzną oraz włókninę wiskozową obie o grubości 0,3 mm. Materiały te wysuszono w temperaturze pokojowej. Wycięto z nich krążki i kwadraty o średnicy lub przekątnej wynoszącej 10 mm. Otrzymano suche elementy chłonne gotowe do osadzenia we wgłębieniach na płytkach. Na 1 cm² bibuły znajdowało się po wysuszeniu 8,5 mg mocznika, a na 1 centymetrze wł ókniny 7,5 mg mocznika. Jeden element chł onny w postaci krążka zawierającego kompozycję mocznika przeniesiono do cylindrycznego wgłębienia w przezroczystej, wykonanej z tworzywa sztucznego płytce testu, w którym wcześniej umieszczono certyfikowany wskaźnik zabezpieczony z jednej strony nieprzepuszczalną powłoką (Carl Roth GmbH) zmieniający kolor z żółtego przez różowy na czerwony w zakresie wartości pH wynoszących od 6,0 do 7,0; poniżej 6,0 jest żółty, od 6 do 7 różowy, powyżej 7 czerwony. Standardowy pasek wskaźnika o szerokości 7 mm pocięto wcześniej na kwadraty. Drugi element chłonny został przyklejony do wewnętrznej strony samoprzylepnej folii. Uzyskano dwuwarstwowy zestaw elementów chłonnych nasączonych mocznikiem. Test zastosowano do zbadania próbki śruty sojowej zawierającej ureazę. Po wyłamaniu plomby otwarto test i naniesiono próbkę śruty na element chłonny znajdujący się we wgłębieniu płytki, próbkę dociśnięto drugim elementem chłonnym poprzez ponowne przyklejenie samoprzylepnej folii. Wynik w postaci zmiany zabarwienia z żółtego na czerwony, wskazujący na obecność ureazy, można było odczytać po 6 minutach.

P r z y k ł a d 2

Wykonano suchy test ureazowy analogicznie jak w przykładzie 1 jednak jako nośnik kompozycji mocznikowej według wynalazku zastosowano włókninę poliestrową o grubości 0,3 mm. Uzyskano porównywalny czas odczytu wyniku badania próbki.

P r z y k ł a d 3

Przygotowano 10%-owy roztwór mocznika w typowym buforze Na2HPO4/KH2PO4 i nasączono nim bibułę chromatograficzną. Po wysuszeniu jej w temperaturze pokojowej pocięto ją na kwadraty i krążki o przekątnej lub średnicy wynoszącej 10 mm. We wgłębieniu płytki testu według wynalazku umieszczono standardowy element wskaźnikowy jak w przykładzie 1 a następnie jeden element nasączony mocznikiem. Próbkę do badań z przykładu 1, zawierającą ureazę umieszczono na elemencie chłonnym nasączonym mocznikiem i przykryto folią samoprzylepną. Po 60 minutach nie było możliwe w sposób pewny odczytanie wyniku, ponieważ wskaź nik nie zmienił znacząco barwy.

Claims

1. Test ureazowy zawierający co najmniej jeden element chłonny nasączony kompozycją mocznika i ewentualnie wskaźnika, znamienny tym, że kompozycja mocznika zawiera 20-30%-owy roztwór mocznika w wodzie apyrogennej oraz fosforan mocznika uzyskany przez zmieszanie mocznika i kwasu ortofosforowego w stosunku molowym 1:1, przy czym kompozycja mocznika zawiera od 0,1 do 0,2 g fosforanu mocznika na 100 g roztworu mocznika.

2. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że pH kompozycji mocznika wynosi od 3 do 4.