PL213216B1 - Przeciwcialo monoklonalne, sposób jego wytwarzania, jego zastosowanie, wytwarzajaca je linia komórek hybrydoma, pojemnik je zawierajacy, zestaw terapeutyczny, DNA kodujacy przeciwcialo, wektor zawierajacy DNA, komórki gospodarza zawierajace wektor i kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko ludzkiej tenascynie, metod i materiałów do ich otrzymywania, zastosowania wspomnianych przeciwciał do wytwarzania środków diagnostycznych i leków używanych odpowiednio do diagnozowania i leczenia nowotworów ekspresjonujących tenascynę oraz materiałów zawierających wzmiankowane przeciwciała, odpowiednich do zastosowania w medycynie.

Tło wynalazku

Specyficzność terapii przeciwnowotworowej stanowi często czynnik decydujący o powodzeniu leczenia. Istotnie, pojawienie się efektów toksycznych oraz obniżonej tolerancji wobec określonych środków przeciwnowotworowych ogranicza ich zastosowanie i jakość życia pacjentów.

Spadek toksyczności jest bezpośrednio związany z selektywnością leczenia w stosunku do komórek nowotworowych. Przeciwciała monoklonalne stanowią idealny sposób selektywnego wyboru komórek nowotworowych, a w zestawieniu z systemem amplifikacji awidyna-biotyna tworzą niezwykle skuteczną i wybiórczą drogę dostarczania cząstek aktywnych do miejsca nowotworu.

Tenascyna jest jednym z białek macierzy zewnątrzkomórkowej, charakteryzuje się miejscowo-specyficzną ekspresją podczas rozwoju zarodkowego, a w tkankach dorosłych może występować podczas gojenia się ran i onkogenezy, jak również w nowo powstałych naczyniach krwionośnych nowotworu. Tenascyna nie występuje w zdrowych tkankach dorosłych, jest natomiast wytwarzana w zrębie wielu nowotworów litych, takich jak: glejaki (Burdon, et al., Cancer Res. 43:2796-2805, 1983), nowotwory sutka (Chiquet-Ehrismann, et al., 1986), płuc (Natali et al., Intl. J. Cancer 54:56-68, 1989), włókniakomięsaki oraz nowotwory płaskokomórkowe (Ramos D.M. et al., Int. J. Cancer 75:680-687, 1998). Tenascyna jest wykrywana w glejakach, natomiast nie występuje normalnej tkance mózgowej. Dyskusję na temat tenascyny można znaleźć w WO 92/04464, Wistar i podobnych odnośnikach literaturowych.

W oparciu o informacje z EP 0 496 074, G. Paganelli et al. stworzyli metodę trzyetapowego wstępnego ukierunkowania (ang. three-step pre-targeting approach) ogólnoustrojowego i miejscowego leczenia nowotworów (Cremonesi M. et al., Eur. J. Nuci. Med. 26(2):110-120, 1999: Paganelli G. et al., Eur. J. Nucl. Med. 26(4):348-357, 1999; Paganelli G. et al., Cancer Biother. & Radiopharm. 16(3):227-235, 2001).

Innymi odnośnikami dotyczącymi metody trzyetapowego wstępnego ukierunkowania są WO 94/04702 oraz US 5,578,287.

Leczenie metodą trzyetapowego wstępnego ukierunkowania jest oparte na dożylnym podawaniu kolejno: biotynylowanych przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko tenascynie, streptawidyny i biotyny znakowanej ⁹⁰Y, po którym następują dwie dawki awidyny i biotynylowanej albuminy, poprzedzające odpowiednio dawkę streptawidyny i biotyny znakowanej za pomocą ⁹⁰Y, mające na celu ograniczenie niespecyficznego tła. Selektywność trzyetapowej metody wstępnego ukierunkowania Paganellego wynika z zastosowania przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko tenascynie. Ukierunkowanie na macierz zewnątrzkomórkową posiada w porównaniu z ukierunkowaniem na antygeny komórek nowotworowych taką zaletę, że jest niezależne od modulacji antygenowej komórek nowotworowych, dzięki czemu stanowi idealny cel terapii przeciwnowotworowej.

Dawki i sposób dawkowania podczas leczenia metodą trzyetapowego wstępnego ukierunkowania zostały ustalone w celu uzyskania optymalnego stosunku rozmieszczenia nowotwór/tkanka nienowotworowa. Zawarte w pracy Paganellego dane, pochodzące z 48 przypadków glejaków (GBM) lub gwiaździaków anaplastycznych (AA), wykazały znaczący brak toksyczności z wyjątkiem kilku przypadków alergicznej reakcji na streptawidynę (której można uniknąć używając awidyny) oraz wstępnych oznak skuteczności terapeutycznej. Istotnie, 2 miesiące po zakończeniu leczenia u 25% pacjentów stwierdzono zmniejszenie rozmiarów nowotworu Pełna Odpowiedź (Zmniejszenie rozmiarów nowotworu >50%)=6%; Częściowa Odpowiedź (Zmniejszenie rozmiarów nowotworu <50%)= 11%; Nieznaczna Odpowiedź (Zmniejszenie rozmiarów nowotworu <25%)=8%), a u 52% pacjentów brak postępów choroby, co daje ogólny poziom odpowiedzi powyżej 77%. U niektórych z tych pacjentów, w przypadku których przewidywana długość życia wynosiła poniżej sześciu miesięcy, odpowiedź utrzymywała się dłużej niż przez rok (Paganelli et al., 1999).

Rola biotynylowanych przeciwciał przeciwko tenascynie polega na zlokalizowaniu miejsca nowotworu oraz prezentowaniu cząsteczek biotyny, pośredniczących w następującej potem akumulacji cząsteczek awidyny oraz ⁹⁰-Y-biotyny.

PL 213 216 B1

Przeciwciała przeciwko tenascynie zostały ujawnione na przykład w: US 5,624,659, Duke University, JP 2219590, Rikagaku oraz wspomnianej powyżej publikacji WO 92/04464. Przeciwciało przeciwko tenascynie zostało opisane w: Siri A. et al, Nucl. Acid Res. 19(3):525-531, 1991; Balza E. et al., FEBS 332:39-43, 1993, a jego zastosowanie do celów terapeutycznych we wspomnianych powyżej: Cremonesi M. et al., Eur. J. Nucl. Med 26(2):110-120. 1999; Paganelli G. et al., Eur. J. Nucl. Med 26(4):348-357, 1999; Paganelli G. et al., Cancer Biother. & Radiopharm. 16(3):227-235, 2001. Klon używany do otrzymywania przeciwciał przeciwko tenascynie znany jest w dziedzinie jako BC4. Twórcy wynalazku stwierdzili, iż klon BC4 nie nadaje się do zastosowania na skalę przemysłową i do celów regulacji, ze względu na wytwarzanie dodatkowego, niefunkcjonalnego łańcucha lekkiego (najprawdopodobniej pochodzącego z macierzystych komórek szpiczakowych), którego poziom ekspresji wzrastał w wyniku zwiększenia rozmiarów hodowli, uniemożliwiając w ten sposób oczyszczanie przeciwciał na dużą skalę.

Streszczenie wynalazku

Stwierdzono, że można otrzymać przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko ludzkiej tenascynie pozwalające na uniknięcie powyższych problemów, a mianowicie przeciwciała monoklonalne nie wytwarzające niefunkcjonalnego łańcucha lekkiego.

Dlatego też, przeciwciała te są przedmiotem niniejszego wynalazku, wraz z metodą otrzymywania wzmiankowanych przeciwciał, ich zastosowaniem w terapii, w szczególności do otrzymywania środka używanego w terapii chorób charakteryzujących się wytwarzaniem tenascyny, takich jak nowotwory.

Opis wynalazku

W niniejszym wynalazku ujawniono przeciwciała i fragmenty przeciwciał, które mogą zawierać również dodatkowe znaczniki lub czynniki diagnostyczne, preparaty zawierające te przeciwciała i fragmenty przeciwciał, zawierające je zestawy diagnostyczne i terapeutyczne, ich zastosowanie w diagnostyce i terapii oraz metody otrzymywania tych przeciwciał i fragmentów przeciwciał.

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej tenascynie, charakteryzujące się tym, że jego regiony zmienne łańcuchów lekkiego i ciężkiego posiadają sekwencje odpowiednio SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:2 oraz którego fragmenty proteolityczne wiążą epitop antygenowy w obrębie powtórzenia typu EGF-podobnego ludzkiej tenascyny C.

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej tenascynie C, znamienne tym, że jego zmienny region łańcucha lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 oraz SEQ ID NO: 13 i jego zmienny region łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 oraz SEQ ID NO: 19 lub fragment wspomnianego przeciwciała monoklonalnego, przy czym przeciwciało lub jego fragment ulega wiązaniu z epitopem antygenowym w obrębie powtórzenia typu EGF-podobnego ludzkiej tenascyny C.

Korzystnie, przeciwciało lub jego fragmenty według wynalazku zawiera dodatkowo znaczniki i/lub czynniki diagnostyczne.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto biotynylowane przeciwciało lub jego fragment, które charakteryzuje się tym, że ulega wiązaniu z epitopem antygenowym w obrębie powtórzenia typu EGF-podobnego ludzkiej tenascyny C.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest linia komórek hybrydoma wytwarzająca przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej tenascynie ulegającej wiązaniu z epitopem antygenowym w obrębie powtórzenia typu EGF-podobnego ludzkiej tenascyny C, zdeponowana na mocy Traktatu Budapesztańskiego w dniu 29 stycznia 2002 r., w Międzynarodowym Organie Depozytowym Centrum Zaawansowanych Biotechnologii, pod numerem dostępu PD02003.

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało monoklonalne wyprodukowane przez komórki hybrydoma według wynalazku.

Innym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania przeciwciała według wynalazku charakteryzujący się tym, że obejmuje hodowlę powyższych komórek hybrydoma 5 oraz izolację wspomnianego przeciwciała.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentów według wynalazku lub biotynylowanego przeciwciała lub jego fragmentu według wynalazku do wytwarzania środka diagnostycznego do wykrywania chorób związanych z ekspresją tenascyny.

Korzystnie, zastosowanie według wynalazku dotyczy choroby nowotworowej.

PL 213 216 B1

Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że nowotwór jest wybrany z grupy składającej się z: nowotworów torbielowatych mózgu, glejaków, nowotworów sutka, płuc, włókniakomięsaków oraz nowotworów płaskokomórkowych.

W zastosowaniu według wynalazku środek diagnostyczny jest stosowany w technikach obrazowania in vivo.

Innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentów według wynalazku lub biotynylowanego przeciwciała lub jego fragmentu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych związanych z ekspresją tenascyny.

Korzystnie, w powyższym zastosowaniu nowotwór jest wybrany z grupy składającej się z nowotworów torbielowatych mózgu, glejaków, nowotworów sutka, płuc, włókniakomięsaków oraz nowotworów płaskokomórkowych.

W zastosowaniu według wynalazku lek ma postać zestawu odpowiedniego do przeprowadzenia trzyetapowego wstępnego ukierunkowania.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw terapeutyczny składający się z 5 ampułek, charakteryzujący się tym, że pierwsza ampułka zawiera biotynylowane przeciwciało lub jego fragment według wynalazku, druga ampułka zawiera awidynę, trzecia ampułka zawiera biotynylowaną albuminę, czwarta ampułka zawiera streptawidynę, piąta ampułka zawiera znakowaną izotopowo biotynę lub pochodną biotyny.

Korzystnie, w zestawie terapeutycznym według wynalazku wspomniane ampułki są odpowiednie do podawania w postaci zastrzyków ludziom.

Innym przedmiotem wynalazku jest DNA kodujący przeciwciało lub jego fragmenty określone powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku są białka obejmujące regiony wiązania CDR z epitopem antygenowym w obrębie powtórzenia typu EGF-podobnego ludzkiej tenascyny C, charakteryzujące się tym, że posiadają sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11 oraz SEQ ID NO: 13 oraz sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17 oraz SEQ ID NO: 19.

Innym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający DNA według wynalazku.

Jeszcze innym przedmiotem wynalazku są komórki gospodarza zawierające wektor według wynalazku.

Innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentów według wynalazku w zestawieniu z drugim przeciwciałem specyficznym wobec tenascyny w teście podwójnego wiązania, do otrzymywania zestawu diagnostycznego do określania poziomu cyrkulującej tenascyny.

Korzystnie, zestaw diagnostyczny zawiera przeciwciało lub jego fragmenty według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest pojemnik charakteryzujący się tym, że zawiera biotynylowane przeciwciało, lub jego fragmenty według wynalazku, bufory oraz odczynniki odpowiednie do zastosowania w zestawie terapeutycznym do trzyetapowej metody wstępnego ukierunkowania.

Pojemnik według wynalazku korzystnie zawiera wiele przedziałów.

Pojemnik według wynalazku korzystnie zawiera dodatkowo oddzielne przeciwciało specyficzne wobec tenascyny, korzystnie skierowane przeciwko fragmentowi A-D.

Pojemnik według wynalazku korzystnie zawiera dodatkowo oddzielne przeciwciało specyficzne wobec nowotworu.

Korzystnie, przeciwciało według wynalazku charakteryzuje się tym, że występuje zestawieniu z drugim przeciwciałem swoistym wobec tenascyny w teście podwójnego wiązania ELISA in vitro w warunkach, w których wspomniane drugie przeciwciało wiąże się z drugim epitopem antygenowym tenascyny, przy czym wspomniany test ELISA in vitro jest użyteczny do określania poziomu cyrkulującej tenascyny.

Innym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało i/lub jego fragment według wynalazku charakteryzująca się tym, że zawiera przynajmniej jedną farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę i/lub nośnik.

Niniejszy wynalazek jest również poświęcony DNA kodującemu przeciwciało i jego fragmenty, wektorom zawierającym DNA, komórkom gospodarza zawierającym wektory, kodowanemu przez DNA białku o sekwencji SEQ ID NO: 1 i 2; DNA kodującemu białko i jego fragmenty, specyficznym regionom CDR i białkom zawierającym lub składającym się z regionów CDR.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, w jednej z jego realizacji, wspomniane przeciwciało charakteryzuje się tym, że regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego posiadają odpowiednio sekwencje: SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO 2. Sekwencje te przedstawiono na Figurach 10 i 11. Dla uproszczenia,

PL 213 216 B1 korzystne przeciwciało według niniejszego wynalazku będzie określane skrótem ST2146. Mimo iż niniejszy wynalazek skupiony jest na ST2146, jako przykładowym dla niniejszego wynalazku, każdy specjalista posiadający standardową wiedzę w dziedzinie potwierdzi, iż posiadając niniejszy opis można otrzymać i stosować w duchu niniejszego wynalazku inne podobne przeciwciała, fragmenty przeciwciała ST2146, jak również fragmenty podobnych przeciwciał. Tego typu podobne przeciwciała mogą być otrzymane przy umiarkowanym nakładzie pracy doświadczalnej przez specjalistów w dziedzinie.

Dlatego też, w niniejszym wynalazku ujawniono przeciwciało lub fragment przeciwciała, lub przeciwciało chimeryczne (takie jak, na przykład, przeciwciało chimeryczne przeciwciała mysiego i ludzkiego), lub cząsteczki immunoglobuliny, które specyficznie wiążą tenascynę.

W niniejszym wynalazku przedstawiono przeciwciało lub fragment przeciwciała, lub przeciwciało chimeryczne, lub cząsteczki immunoglobuliny zawierające przynajmniej jeden z regionów: CDR części zmiennej łańcucha lekkiego ST2146 i/lub CDR części zmiennej łańcucha ciężkiego ST2146. Przeciwciało lub fragment przeciwciała, lub przeciwciało chimeryczne, lub cząsteczka immunoglobuliny według niniejszego wynalazku mogą być przeciwciałem, fragmentem Fv, fragmentem Fab, fragmentem F(ab)2, przeciwciałem jednołańcuchowym lub przeciwciałem multimerycznym. Przeciwciało lub fragment przeciwciała, lub przeciwciało chimeryczne, lub cząsteczka immunoglobuliny według niniejszego wynalazku mogą być cząsteczką IgM, IgD, IgG, IgA lub IgE.

W niniejszym wynalazku ujawniono przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, lub przeciwciała chimerycznego, lub cząsteczki immunoglobuliny zawierających przynajmniej jedną z sekwencji o numerach identyfikacyjnych (SEQ ID NOs): 1, 2, 9, 11, 13, 15, 17 lub 19.

W niniejszym wynalazku ujawniono również sekwencje nukleotydowe kodujące sekwencje aminokwasowe według niniejszego wynalazku, takie jak SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 11, 13, 15, 17 lub 19. Dlatego też, w niniejszym wynalazku przedstawiono sekwencję DNA kodujące przeciwciało lub fragment przeciwciała, lub przeciwciało chimeryczne, lub cząsteczkę immunoglobuliny według niniejszego wynalazku. Takie sekwencje DNA zawierają przynajmniej jedną sekwencję lub podsekwencję DNA wybraną spośród SEQ ID NO: 3, 4, 10, 21, 14, 16, 18 lub 20.

Kolejna część wynalazku jest poświęcona oczyszczonej cząsteczce kwasu nukleinowego kodującej przeciwciało lub fragment przeciwciała, lub przeciwciało chimeryczne, lub cząsteczkę immunoglobuliny będącą produktem niniejszego wynalazku. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca immunoglobulinowy produkt wynalazku może zostać otrzymana z użyciem technik standardowych. Na przykład, oligonukleotydy mogą być syntetyzowane z użyciem syntetyzatorów oligonukleotydów i łączone razem tak, aby tworzyły funkcjonalną otwartą ramkę odczytu kodującą immunoglobulinowy produkt niniejszego wynalazku. Zsyntetyzowana cząsteczka kwasu nukleinowego może być wprowadzana do wektora DNA. Wektory DNA, takie jak plazmid, kosmid, fagemid, plazmid drożdżowy, wektory fagowe, plazmid TI i tym podobne, są znane w dziedzinie. Wektor może być wektorem ekspresyjnym. Wektory ekspresyjne i systemy ekspresyjne są komercyjnie dostępne u dostawców takich jak Stratagene (La Jolla, Kalif.).

Kolejna część wynalazku jest poświęcona komórce zawierającej kwas nukleinowy według wynalazku. Komórka może być otrzymana poprzez transfekcję. Metody transfekcji są znane, a zestawy do transfekcji komórek prokariotycznych i eukariotycznych mogą być uzyskane ze źródeł komercyjnych (np. Stratagene, La Jolla, Kalif.).

Kolejna część wynalazku jest poświęcona zastosowaniu przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, lub przeciwciała chimerycznego, lub immunoglobulinowego produktu wynalazku jako środka używanego w wykrywaniu lub diagnozowaniu zaburzeń, obejmującym etapy kontaktu próbki tkanki pacjenta z wyżej wymienionymi w warunkach, w których możliwe jest utworzenie kompleksu pomiędzy wzmiankowanym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała, lub przeciwciałem chimerycznym, lub produktem immunoglobulinowym a antygenem tenascyny oraz oznaczania powstania wspomnianego kompleksu.

Kolejna część wynalazku jest poświęcona zastosowaniu przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, lub przeciwciała chimerycznego, lub immunoglobulinowego produktu wynalazku lub kwasu nukleinowego według wynalazku do otrzymywania leku stosowanego w terapii chorób powodujących wytwarzanie tenascyny, w szczególności nowotworów. Metody immunoterapii nowotworów są znane. Patrz na przykład Old, L. J. Immunotherapy for Cancer, Scientific American, September 1996.

Kolejna część wynalazku jest poświęcona zestawowi terapeutycznemu zawierającemu przeciwciało lub fragment przeciwciała, lub przeciwciało chimeryczne, lub immunoglobulinowy produkt wynalazku.

PL 213 216 B1

Immunoglobulinowe produkty wynalazku mogą być dostarczane w formie zestawu zawierającego przeciwciało lub fragment przeciwciała, lub przeciwciało chimeryczne, lub produkt immunoglobulinowy oraz farmaceutycznie dostępny nośnik lub rozcieńczalnik. Zestaw terapeutyczny może być używany do leczenia zaburzeń u ssaków takich jak człowiek. Lek powinien być podawany ssakowi w terapeutycznie skutecznej dla niego dawce przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, lub przeciwciała chimerycznego, lub immunoglobulinowego produktu wynalazku.

W ramach ich zastosowania w charakterze czynników terapeutycznych, przeciwciało lub fragment przeciwciała, lub przeciwciało chimeryczne, lub immunoglobulinowy produkt wynalazku mogą być połączone z substancją aktywną. Połączenie może mieć postać wiązań kowalencyjnych lub wiązań przeciwciało-epitop. Na przykład, przeciwciało lub fragment przeciwciała, lub przeciwciało chimeryczne, lub produkt immunoglobulinowy mogą być połączone krzyżowo z drugim przeciwciałem, przy czym drugie przeciwciało może wykazywać powinowactwo do czynnika aktywnego. Substancja aktywna może być środkiem cytotoksycznym. W znaczeniu tu używanym, określenie „środek cytotoksyczny” odnosi się do substancji, która hamuje lub zapobiega funkcjonowaniu komórek i/lub powoduje ich rozpad. Termin ten ma w zamierzeniu obejmować izotopy radioaktywne (np. I, Y, Pr), czynniki chemoterapeutyczne, toksyny, takie jak enzymatycznie aktywne toksyny pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, lub ich fragmenty. Substancja aktywna może być czynnikiem chemoterapeutycznym. Czynnik chemoterapeutyczny jest związkiem chemicznym stosowanym w leczeniu nowotworów. Do przykładowych czynników chemoterapeutycznych należą: Adriamycyna, Doksorubicyna, 5-Fluorouracyl, Arabinozyd cytozyny („Ara-C”), Cyklofosfamid, Tiotepa, Busulfan, Cytoksan, Taksol, Metotreksat, Cisplatyna, Melfalan, Winblastyna, Bleomycyna, Etopozyd, Ifosfamid, Mitomycyna C, Mitoksantron, Winkrystyna, Winorelbina, Karboplatyna, Tenipozyd, Daunomycyna, Karminomycyna, Aminopteryna, Daktynomycyna, Mitomycyny, Esperamycyny (patrz U.S. Pat. No. 4,675,187), Melfalan i tym podobne iperyty azotowe. Substancja aktywna może być cytokiną. Termin cytokina jest ogólnym określeniem białek uwalnianych przez pewną populację komórek, które oddziałują na inną komórkę jako przekaźniki międzykomórkowe. Przykładowymi cytokinami tego typu są limfokiny, monokiny oraz tradycyjne hormony polipeptydowe. Do cytokin zalicza się hormony wzrostu, takie jak: ludzki hormon wzrostu, N-metionylowany ludzki hormon wzrostu, bydlęcy hormon wzrostu; hormon przytarczyc; tyroksyna; insulina; proinsulina; relaksyna; prorelaksyna; hormony glikoproteinowe, takie jak: hormon folikulotropowy (FSH), tyreotropina (TSH), hormon luteinizujący (LH); wątrobowy czynnik wzrostu; czynnik wzrostu fibroblastów; prolaktyna; laktogen łożyskowy; czynnik martwicy nowotworów; substancja hamująca Mullera; mysi peptyd związany z gonadotropiną; inhibina; aktywina; naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu; integryna; trombopoetyna (TPO); czynniki wzrostu nerwów, takie jak NGF; płytkowy czynnik wzrostu; transformujące czynniki wzrostu (czynniki TGF); insulinopodobne czynniki wzrostu I i II; erytropoetyna (EPO); czynniki osteoinduktywne; interferony, takie jak: interferon-alfa, -beta i -gamma, czynniki pobudzające powstawanie kolonii (czynniki CSF); granulocytarno-makrofagowy CSF (GM-CSF) oraz granulocytarny CSF (G-CSF); interleukiny (IL), takie jak IL-1, IL-1.alfa., IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, czynnik martwicy nowotworów oraz inne czynniki polipeptydowe, włączając LIF oraz zestaw ligandu (KL). W stosowanym w niniejszym opisie znaczeniu, określenie cytokina obejmuje białka pochodzące ze źródła naturalnego lub z rekombinowanych kultur komórkowych oraz biologicznie aktywne odpowiedniki cytokin o sekwencji natywnej.

Do celów diagnostycznych, przeciwciało lub fragment przeciwciała, lub przeciwciało chimeryczne, lub produkt immunoglobulinowy według wynalazku, mogą być połączone ze znacznikiem, takim jak wykrywalny związek lub zestawienie sprzężone bezpośrednio lub pośrednio z przeciwciałem. Znacznik może być wykrywalny jako taki (np. znaczniki radioizotopowe lub fluorescencyjne) lub, w przypadku znacznika enzymatycznego, może katalizować wykrywalną chemiczną modyfikację związku lub kompozycji stanowiących substrat.

Wynalazek dotyczy również wytwarzania mutantów przedstawionych regionów CDR poprzez wymianę jednego lub więcej aminokwasów w sekwencji regionów CDR. Wiadomo, że podstawienie pojedynczego aminokwasu w odpowiednim miejscu regionu CDR może być wystarczające do zwiększenia powinowactwa. Techniką ukierunkowanej mutagenezy uzyskano około 10-krotny przyrost powinowactwa niektórych produktów immunoglobulinowych. Opisana metoda zwiększania lub zmniejszania powinowactwa przeciwciał za pomocą wprowadzania mutacji w regionach CDR jest powszechnie znana (patrz np.: Rozdział 23, Paul, W. E., Fundamental Immunology, Raven Press, NY, N.Y. 1993). Stąd też wymiana, usunięcie lub wprowadzenie aminokwasów w regionach CDR według wynalazku,

PL 213 216 B1 mające na celu zwiększenie lub zmniejszenie powinowactwa lub specyficzności oddziaływania, objęte jest również zakresem niniejszego wynalazku. Kolejnym aspektem niniejszego wynalazku jest zapewnienie środka służącego do leczenia osobnika cierpiącego na nowotwór taki jak: nowotwory torbielowate mózgu, glejaki, nowotwory sutka, płuc, włókniakomięsaki oraz nowotwory płaskokomórkowe, obejmujące podawanie podmiotowi ludzkiemu dotkniętemu nowotworem, takim jak nowotwór torbielowaty mózgu (np. wytwarzający tenascynę), przeciwciała, fragmentu przeciwciała, przeciwciała chimerycznego lub immunoglobulinowego produktu niniejszego wynalazku, które wiąże się z tenascyną w ilości skutecznej terapeutycznie. Etap podawania może być przeprowadzony poprzez umieszczenie przeciwciała w jamie nowotworu.

Niniejszy wynalazek dotyczy również metody leczenia guza litego, obejmującej w pierwszym etapie usunięcie guza litego (np. wytwarzającego tenascynę) ze zbudowanego z tkanki litej organu (np. mózgu) podmiotu ludzkiego dotkniętego nowotworem; następnie utworzenie w organie podmiotu ograniczonej jamy po resekcji w miejscu, z którego usunięto guz lity; a następnie podawanie podmiotowi czynnika przeciwnowotworowego, takiego jak przeciwciało, fragment przeciwciała, przeciwciało chimeryczne lub immunoglobulinowy produkt niniejszego wynalazku (np. przeciwciało wiążące się do tenascyny), który jest w ilości terapeutycznie skutecznej selektywnie toksyczny dla komórek guza litego. W jednej z postaci niniejszego wynalazku etap podawania przeprowadza się poprzez umieszczenie czynnika przeciwnowotworowego w jamie resekcyjnej.

Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku są fragmenty proteolityczne wspomnianego przeciwciała wiążące się z epitopem antygenowym należącym do powtórzeń typu EGF ludzkiej tenascyny C. W ramach opisu niniejszego wynalazku, fragmentami przeciwciała określa się fragmenty wiążące się z epitopem antygenowym należącym do powtórzeń typu EGF ludzkiej tenascyny C.

W kolejnej realizacji niniejszego wynalazku przeciwciało i jego fragmenty mogą również zawierać dodatkowe znaczniki i/lub czynniki diagnostyczne. Wzmiankowane znaczniki i/lub czynniki diagnostyczne są dobrze znane specjaliście w dziedzinie, której poświęcony jest niniejszy wynalazek.

W korzystnej realizacji niniejszego wynalazku wspomniane przeciwciało lub jego proteolityczne fragmenty są biotynylowane.

Innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest linia komórek hybrydoma, nazywana tu cST2146, wytwarzająca wspomniane przeciwciała.

Linię komórek hybrydoma zdeponowano w Centrum Zaawansowanych Biotechnologii, L.go Rosanna Benzi, 10 16132 w Genui, we Włoszech w dniu 29 stycznia 2002 r. na mocy postanowień Traktatu Budapeszteńskiego i uzyskała ona numer dostępu PD02003.

Niniejszy wynalazek obejmuje również DNA kodujący przeciwciało lub jego fragmenty, specyficzne regiony CDR oraz białka zawierające lub składające się z regionów CDR, wektory zawierające wspomniany DNA oraz komórki gospodarza zawierające wspomniane wektory.

Innym przedmiotem niniejszego wynalazku są rekombinowane pochodne wspomnianego przeciwciała. W szczególności, korzystnymi rekombinowanymi pochodnymi są te, w których mysi region stały został zastąpiony odpowiednikiem ludzkim (Ferrer C. et al., J. Biotechnol. 52: 51-60, 1996) lub te, w których mysi region stały został zastąpiony cząsteczką o aktywności biologicznej, taką jak na przykład białko z rodziny awidyny (Manuel L. et al., J. Immunol., 163, 4421-4426, 1999), czynnik wzrostu używany do stymulowania efektorów immunologicznych skierowanych przeciw nowotworowi (taki jak, na przykład G-CSF, GM-CSF), lub takich, w których mysi region stały został zastąpiony cząsteczką o aktywności farmakologicznej, taką jak na przykład toksyna, superantygen, cytokina lub jakiekolwiek inne białko stosowane do zwiększania skuteczności terapii przeciwnowotworowej (Di Massimo A.M. et al, British J. Cancer 75(6):822-828, 1997; Parente D. et al, Anticancer Research 17(6A):4073-4074, 1997). Metody otrzymywania wspomnianych pochodnych rekombinowanych są dobrze znane w dziedzinie.

Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku są sprzężone pochodne (koniugaty) wspomnianego przeciwciała.

W szczególności, korzystnymi pochodnymi sprzężonymi są takie, w których cząsteczka biologicznie aktywna jest połączona z przeciwciałem za pomocą standardowych metod. Przykładowymi cząsteczkami biologicznie aktywnymi są: białko z rodziny awidyny, czynnik wzrostu używany do stymulowania efektorów immunologicznych skierowanych przeciw nowotworowi (taki jak np. G-CSF, GM-CSF), cząsteczki farmakologicznie aktywne, takie jak na przykład toksyna, superantygen, cytokina lub jakiekolwiek inne białko stosowane do zwiększania skuteczności terapii przeciwnowotworowej, leki przeciwnowotworowe, radioizotopy.

PL 213 216 B1

Według niniejszego wynalazku, rekombinowane lub sprzężone pochodne monoklonalnego przeciwciała przeciwko ludzkiej tenascynie lub jego fragmentów są również określane jako „pochodne”.

W szczególnie korzystnej realizacji niniejszego wynalazku, obok przeciwciała i jego fragmentów, również ich pochodne są biotynylowane.

Dalszym przedmiotem niniejszego wynalazku jest linia komórek hybrydoma wytwarzająca zdefiniowane wyżej przeciwciało. Wspomniana linia hybrydoma została zdeponowana w Centrum Zaawansowanych Biotechnologii, L.go Rosanna Benzi, 10 16132, w Genui, we Włoszech, w dniu 29 stycznia 2002 r. na mocy postanowień Traktatu Budapeszteńskiego, pod numerem dostępu PD02003.

Jako kolejny przedmiot niniejszego wynalazku przedstawiono proces otrzymywania przeciwciała monoklonalnego, który to proces obejmuje hodowlę powyższej linii komórek hybrydoma oraz izolację przeciwciał.

Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie monoklonalnych przeciwciał przeciw ludzkiej tenascynie do otrzymywania środka używanego w terapii choroby powodującej wytwarzanie tenascyny, w szczególności nowotworu.

Lista przykładowych, ale nie wyłącznych, chorób powodujących wytwarzanie tenascyny obejmuje: glejaki, nowotwory sutka i płuc, wlókniakomięsaki oraz nowotwory płaskokomórkowe.

Dalszym aspektem niniejszego wynalazku jest środek używany w radioimmunoterapii nowotworów, który jest podawany podmiotowi cierpiącemu na nowotwór wytwarzający tenascynę i zawiera wspomniane przeciwciało monoklonalne lub jego fragmenty proteolityczne, lub pochodne. W korzystnej realizacji, wspomniane przeciwciało monoklonalne lub jego fragmenty proteolityczne, lub pochodne są biotynylowane, w bardziej korzystnej postaci środek jest właściwy do radioimmunoterapii, w szczególności do zastosowania w metodzie trzyetapowego wstępnego ukierunkowania, jak opisano w pracach z tej dziedziny, na przykład w EP 0 496 074, European Journal od Nuclear Medicine Vol.26, No 4; April 1999; 348-357 oraz US 5,968,405. W tej ostatniej postaci, środek według niniejszego wynalazku powinien mieć postać zestawu, przy czym wspomniany zestaw składa się z 5 ampułek, z których pierwsza ampułka zawiera biotynylowane przeciwciało lub jego fragment, lub pochodną, druga ampułka zawiera awidynę, trzecia ampułka zawiera biotynylowaną albuminę, czwarta ampułka zawiera streptawidynę, piąta ampułka zawiera znakowaną izotopowo biotynę lub pochodną biotyny. Przykładowy zestaw tego typu przedstawiono w European Journal of Nuclear Medicine Vol.26, No 4; April 1999; 348-357. Termin awidyna obejmuje awidynę, streptawidynę, PEG-awidynę, PEG-streptawidynę, di- lub poliawidynę, bądź też di- lub polistreptawidynę. Znakowana izotopowo biotyna zawiera nuklid promieniotwórczy, taki jak opisane w EP 0 496 074, w korzystnej postaci ⁹⁰Y. Pochodne biotyny opisane zostały na przykład w WO 02/066075. Zestaw tego typu ujawniono w European Journal of Nuclear Medicine Vol.26, nr 4; kwiecień 1999; 348-357. W korzystnej postaci, fiolki są odpowiednie do podawania zastrzyków ludziom.

Rekombinowane pochodne przeciwciała według niniejszego wynalazku, jak również ich koniugaty, są także konwencjonalnie stosowane w terapii przeciwnowotworowej. Mimo iż przeciwciało według niniejszego wynalazku, jak również jego fragmenty, pochodne i koniugaty, są odpowiednie do zastosowania w leczeniu nowotworów związanych z tenascyną, w szczególności do immunoterapii, korzystną realizacją niniejszego wynalazku jest radioimmunoterapia.

Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest specjalny pojemnik, w korzystnej realizacji w postaci fiolki odpowiedniej do zastrzyków, zawierającej przeciwciało lub jego fragmenty w formie biotynylowanej.

W innej postaci niniejszego wynalazku, biotynylowane przeciwciało w zestawie terapeutycznym jest w kombinacji z innymi przeciwciałami specyficznymi wobec tenascyny, w korzystnej realizacji skierowanymi przeciwko fragmentowi A-D. Alternatywnie, biotynylowane przeciwciało jest w kombinacji z innymi przeciwciałami specyficznymi wobec nowotworów. Ogólnych wiadomości na temat tego typu zestawów dostarczono w EP 0 496 074, European Journal od Nuclear Medicine Vol.26. nr 4; kwiecień 1999; 348-357 oraz US 5,968,405.

W szczególności, niniejszy wynalazek obejmuje również pojemnik, opcjonalnie podzielony na wiele części, zawierający biotynylowane przeciwciało lub jego fragmenty, lub pochodne, bufory oraz odczynniki odpowiednie do zastosowania w zestawie terapeutycznym do trzyetapowej metody wstępnego ukierunkowania.

Innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie wspomnianego przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentów, lub rekombinowanych pochodnych, lub koniugatów, lub ich biotyPL 213 216 B1 nylowanych pochodnych do otrzymywania środków diagnostycznych do wykrywania chorób powodujących wytwarzanie tenascyny, w szczególności do obrazowania nowotworów in vivo.

W szczególnej postaci niniejszego wynalazku, wspomniane przeciwciało monoklonalne lub jego fragmenty lub pochodne są stosowane w zestawieniu z drugim przeciwciałem specyficznym wobec tenascyny w teście podwójnego wiązania (ang. sandwich assay) do otrzymywania zestawu diagnostycznego do określania poziomu pozostającej w obiegu tenascyny. Testem podwójnego wiązania jest na przykład test ELISA in vitro w warunkach, w których wspomniane drugie przeciwciało wiąże się z drugim epitopem antygenowym tenascyny, przy czym wspomniany test ELISA in vitro może być stosowany do określania poziomu pozostającej w obiegu tenascyny.

Zestawy diagnostyczne i terapeutyczne zawierające przeciwciało lub jego fragmenty, lub pochodne są kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku.

Te i inne aspekty niniejszego wynalazku wyjaśniono szczegółowo w poniższym opisie, jak również w przykładach i na figurach.

Krótki opis figur

Figura 1: przedstawiono schematyczny obraz ludzkiej tenascyny C, rekombinowanych fragmentów antygenowych i odpowiadających im reagentów, jak również procedury zastosowanej do otrzymywania przeciwciała typu BC-4.

Figura 2: przedstawiono potwierdzenie zmienności łańcucha ciężkiego o glikozydowym charakterze ST2146 poprzez trawienie przeciwciała przy pomocy neuraminidazy.

Figura 3: przedstawiono ogólną homogenność ST2146 w stosunku do BC4.

Figura 4: przedstawiono wyniki techniki Western blot wiązania ST2146 z epitopem ludzkiej tenascyny porównanym z epitopem antygenowym BC4 (ścieżka D jest pusta).

Figura 5: przedstawiono kompetycyjny test ELISA, w którym ST2146 silnie konkuruje z BC4 podczas wiązania ludzkiej tenascyny, natomiast ST2077 wykazuje jedynie częściową kompetycyjność. ST2077 jest przeciwciałem monoklonalnym swoistym wobec tenascyny uzyskanym metodą otrzymywania ST2146. ST2077 wykazuje swoistość podobną do ST2146 (region powtórzeń typu EGF ludzkiej tenascyny), ale jest skierowane przeciwko epitopowi antygenowemu, który jedynie częściowo nakłada się z epitopem BC4/ST2146.

Figura 6: przedstawiono immunoreaktywność ST2146 w teście ELISA, w porównaniu z pikiem BC4 dla pełnej aktywności.

Figura 7: przedstawiono protokół analizy biodystrybucji ST2146.

Figura 8: przestawiono biodystrybucję ST2146 w porównaniu z BC4 (biot=biotynylowany; IR= Immunoreaktywność wyrażona jako ilość przeciwciała do otrzymania 1.0 O.D. w teście ELISA).

Figura 9: przedstawiono rozkład nowotwór/tkanka nienowotworowa dla ST2146 w porównaniu z BC4.

Figura 10: przedstawiono sekwencję części zmiennej łańcucha lekkiego (VL) ST2146 (SEQ ID NO: 1 (aminokwasową pełnej długości), 3 (DNA kodującego sekwencję aminokwasową), 9 (aminokwasową CDR1 łańcucha lekkiego), 10 (DNA CDR1 łańcucha lekkiego), 11 (aminokwasową CDR2 łańcucha lekkiego), 12 (DNA CDR2 łańcucha lekkiego). 13 (aminokwasową CDR3 łańcucha lekkiego), 14 (DNA CDR3 łańcucha lekkiego), 21 (DNA pełnej długości)).

Figura 11: przedstawiono sekwencję części zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) ST2146 (SEQ ID NO: 2 (aminokwasową pełnej długości), 4 (DNA kodującego sekwencję aminokwasową), 15 (aminokwasową CDR1 łańcucha ciężkiego), 16 (DNA CDR1 łańcucha ciężkiego), 17 (aminokwasową CDR2 łańcucha ciężkiego), 18 (DNA CDR2 łańcucha ciężkiego), 19 (aminokwasową CDR3 łańcucha ciężkiego), 20 (DNA CDR3 łańcucha ciężkiego), 22 (DNA pełnej długości)).

Szczegółowy opis wynalazku

ST2146 jest otrzymywane z odpowiedniego klonu komórek hybrydoma cST2146, jak przedstawiono szczegółowo w poniższym przykładzie.

Odnośnie przemysłowych aspektów niniejszego wynalazku, przeciwciało przedstawione w niniejszym wynalazku powinno być odpowiednio przygotowane w kompozycjach farmaceutycznych lub zestawach diagnostycznych, jakie zazwyczaj stosuje się w dziedzinie.

Kompozycje farmaceutyczne są konwencjonalnie stosowane w dziedzinie i mogą być otrzymane przez specjalistę w oparciu o wiedzę ogólną. Przykłady kompozycji farmaceutycznych ujawniono w odnośnikach wspomnianych w niniejszym wynalazku. To samo stosuje się do zestawów diagnostycznych. Szczególnie korzystny zestaw do radioimmunoterapii nowotworów przedstawiono we wspomnianych powyżej pracach Paganellego et al. oraz EP 0 496 074.

PL 213 216 B1

Kompozycje farmaceutyczne zawierające przeciwciało i/lub jego fragment i/lub rekombinowaną pochodną i/lub jego koniugat z domieszką przynajmniej jednej farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbki lub nośnika włączone są w zakres niniejszego wynalazku.

W poniższym przykładzie szerzej zilustrowano niniejszy wynalazek.

P r z y k ł a d 1

W celu otrzymania nowego klonu komórek hybrydoma wykazujących specyficzność BC4, ale nie ekspresjonujących niefunkcjonalnego łańcucha lekkiego, myszy Balb/c immunizowano lizatem fagów pTn28 E. coli. pTn28 jest rekombinowanym klonem Xgt11 kodującym fragment powtórzenia typu EGF ludzkiej tenascyny zawierającym, jak uprzednio wykazano, epitop BC4 (Balza E. et al., 1993). Schematyczny obraz ludzkiej tenascyny C, rekombinowanych fragmentów antygenowych i odpowiadających im reagentów, jak również procedury używanej do otrzymywania przeciwciał typu BC-4 przedstawiono na figurze 1. Limfocyty śledzionowe immunizowane pTn28 poddawano fuzji z nieproduktywnymi komórkami szpiczakowymi Sp2/0Ag14 za pomocą standardowych metod (Cianfriglia M. et al.. Methods Enzymol. 121:193210, 1986), a populację komórek hybrydoma przeszukiwano stosując test ELISA z użyciem tenascyny oczyszczonej z SK-MEL-28 (linia ludzkich komórek czerniaka). Komórki hybrydoma swoiste wobec tenascyny namnażano metodą ograniczających rozcieńczeń dwa razy w pożywce zawierającej FCS i trzy razy w pożywce pozbawionej białka (Pożywka Wol_R na od Składników Pochodzenia Zwierzęcego, HyClone, HyQ^R Perbio). Do otrzymania Banku Komórek Macierzystych (MCB) oraz Banku Komórek Roboczych (WCB) cST2146 wybrano ostatecznie podklon cST2146/D3d/F6e.

Materiał odnośnikowy ST2146 otrzymywano w wyniku hodowli komórek hybrydoma cST2146 w Bioreaktorze 2L, a stabilność Poprodukcyjnego Banku Komórek cST2146 (PPCB) potwierdzono za pomocą analizy FACS oraz ograniczających rozcieńczeń.

ST2146 jest mysią immunoglobuliną o izotypie IgG2b/k.

ST2146 okazało się być homogenne pod względem składu łańcucha lekkiego, co wykazano za pomocą analizy SDS-PAGE w warunkach redukujących, która wykazała również pewien stopień heterogenności łańcucha ciężkiego. Obserwacja ta była zgodna ze zmiennością O-glikozylacji, opisaną wcześniej dla mysiego izotypu IgG2b (Kim H. et al, J. Biol. Chem. 269(16): 12345-12350, 1994). Układ prążków łańcucha ciężkiego ST2146 był zgodny dla trzech różnych partii otrzymanych z pożywki hodowlanej zawierającej FCS lub pożywki pozbawionej białka. Potwierdzenie glikozydowego charakteru zmienności łańcucha ciężkiego ST2146 uzyskano poprzez trawienie przeciwciała z użyciem neuraminidazy. Bufor zawierający ST2146 wymieniono na 10 mM bufor fosforanowy zawierający 150 mM NaCl, pH 6.4 za pomocą kolumny odsalającej HiTrap (Amersham-Pharmacia). Mab zagęszczono z użyciem filtrów Centricon 100 000 MWCO (Millipore) do ostatecznego stężenia około 1 mg/ml i trawiono stosując 1.5 U/ml neuraminidazy (Sigma) przez 24 godziny w 37°C. Próbki poddawano elektroforezie w 12% żelu poliakrylamidowym. Barwienie żelu wykonywano przy pomocy Coomasie Brilliant Blue. Zgodnie z przypuszczeniami, trawienie prowadziło do eliminacji prążka o wyższej masie molowej (Figura 2). Ogólną homogenność ST2146 potwierdzono również przy użyciu chromatografii hydroksyapatytowej, która wykazała obecność pojedynczego piku dla ST2146, w odróżnieniu od trzech pików obserwowanych dla BC4 (Figura 3, pik 3 odpowiada w pełni funkcjonalnemu BC4).

ST2146 wiąże się z epitopem ludzkiej tenascyny bardzo bliskim, jeżeli nie identycznym z antygenowym epitopem BC4, co wykazano przy pomocy techniki Western Blot (Figura 4) oraz testu kompetycyjnego ELISA (Figura 5). Na Figurze 5 przedstawiono doświadczenie, w którym biotynylowane BC4 mieszano z dodawanymi we wzrastającym stężeniu BC4, ST2077 lub ST2146 w charakterze związków kompetycyjnych i nakładano na płytki opłaszczone tenascyną. Oddziaływanie mierzono po dodaniu HRP-streptawidyny i odpowiedniego substratu do reakcji barwnej. ST2077 jest przeciwciałem rozpoznającym epitop tenascyny należący do powtórzeń typu EGF, nakładający się częściowo z epitopem BC4.

Immunoreaktywność ST2146 określano przy pomocy testu ELISA w porównaniu ze pikiem dla w pełni aktywnego BC4 (pik 3). Wyniki na Figurze 6 dowodzą, że ilość ST2146 niezbędna do otrzymania 1.0 OD w teście ELISA przy optymalnym stężeniu antygenu (wykres A) jest około 20 razy niższa niż ilość w pełni reaktywnego BC4 (pik 3) i około 100 razy niższa niż ilość BC4. Różnica ta bardzo znacznie wzrasta w warunkach ograniczonego dostępu antygenu, jak widać na wykresie B, na którym jedynie ST2146 zachowuje dobrą immunoreaktywność.

PL 213 216 B1

Powinowactwo ST2146 określano przy pomocy BIAcore. Wartość KD dla ST2146 wynosiła

1.4x10^-9 (Ka 3.0x10⁵; kd 4.1x10^-4). Powinowactwo ST2146 porównano z BC4, który wykazuje KD równą 4.9x10^-9 (Ka 1.9x10⁵; kd 9.3x10^-4).

Zachowywanie immunoreaktywności po biotynylacji jest podstawową cechą przeciwciała monoklonalnego, które ma być stosowane do wstępnego ukierunkowania. W celu określenia właściwości biotynylowanego ST2146, testowano różne wartości stosunku przeciwciało:biotyna, a immunoreaktywność biotynylowanego przeciwciała mierzono przy pomocy testu ELISA w porównaniu do BC4 i ST1897, z których to ostatnie jest monoklonalnym przeciwciałem specyficznym wobec tenascyny o niższym powinowactwie. Wyniki przedstawione w tabeli 1 dowodzą, iż niski poziom biotynylacji (2-3 biotyn/mol) nieznacznie wpływa na immunoreaktywność przeciwciał monoklonalnych niezależnie od ich powinowactwa. Wyższy stopień biotynylacji, do 20 biotyn/mol, jest związany ze spadkiem immunoreaktywności. Ten spadek jest tym wyższy im niższe jest powinowactwo przeciwciała.

T a b e l a 1

Analiza biotynylacji ST2146

% Immunoreaktywności Liczba mol biotyny/przeciwciała
Mab	Powinowactwo (nM)	2-3	3.5-5	7-10	15-20
ST1897	10	84.8+/-1.3	62.3+/-12.4	26.65+/-13.8	9.45+/-9.26
BC4	4.9	82.4+/-11.5	74.4+/-9.3	67.2+/-12.3	12.6
ST2146	1.4	100	89.6+/-4.39	77.63+/-8.59	52.37+/-3.95

% immunoreaktywności jest średnią z 2-3 niezależnych eksperymentów +/- odchylenie standardowe.

Powinowactwo biotynylowanego ST2146 mierzono przy pomocy BIAcore i było ono w znacznym stopniu zachowane niezależnie od ilości przyłączonych cząsteczek biotyny. Immunohistochemia różnych nowotworów (piersi, gleju, okrężnicy) wykazała podobną selektywność BC4 i ST2146.

Analiza farmakologicznego zachowania biotynylowanego ST2146 miała na celu określenie jego zdolności do lokalizowania nowotworu. Badania biodystrybucji biotynylowanych przeciwciał ST2146 125 oraz BC4 znakowanych ¹²⁵I, przeprowadzano u nagich myszy, którym wszczepiano ludzki nowotwór wytwarzający tenascynę, według protokołu przedstawionego na Figurze 7. Myszom podawano podskórnie 4x10⁶ komórek ludzkiego nowotworu okrężnicy HT29 w 0.1 ml sterylnego roztworu. Po 15 dniach, kiedy masa nowotworu wynosiła około 100 mg, grupie 5 myszy podawano dożylnie znakowa125 ne przy pomocy ¹²⁵I BC4, ST2146 lub normalne mysie przeciwciała (nMIg), w stężeniach 10, 2, 0.5 lub

0.1 μg/mysz w 0.1 ml sterylnego PBS. Wszystkie przeciwciała były biotynylowane (7-10 biotyny/mol), przy czym zarówno biotynylowane przeciwciała monoklonalne (Mabs) ST2146, jak i BC4 wykazywały immunoreaktywność wynoszącą około 80%.

Każde ze zwierząt otrzymało następującą ilość CPM:

Dawka	BC4	ST2146	NMIg
10 μg		632.000	570.000	577.000
2 μg		555.000	639.000	624.000
0.5 μg		310.000	401.000	382.000
0.1 μg		186.000	211.000	174.000

Wyniki przedstawione na Figurze 8 wskazują, że zarówno BC4, jak i ST2146 specyficznie lokalizują masę nowotworu. Ilość obu przeciwciał w miejscu nowotworu (wyrażana jako % wstrzykiwanej dawki/gram tkanki) jest zależna od dawki, z tendencją do wyższej akumulacji ST2146. Co więcej, ST2146 wykazuje lepszy niż BC4 rozkład nowotwór/tkanka nienowotworowa, co przedstawiono na

Figurze 9.

Region zmienny łańcucha lekkiego kappa powielano z cyklizowanego cDNA przy użyciu dwóch starterów (5'-TGTCAAGAGCTTCAACAGGA (SEQ ID NO:5), 5'-AAGATGGATACAGTTGGTGC (SEQ ID NO:6)), które łączą się z rejonem stałym przeciwciała jak opisano w M Sassano et al. Nucl. Ac. Res. (1994) 22, 1768-1769.

PL 213 216 B1

Region zmienny łańcucha ciężkiego gamma powielano z cyklizowanego cDNA przy użyciu następujących starterów: mysi oligonukleotyd _Y2bCH1 GTCACTGACTCAGGGAAGTAGCC (SEQ ID NO:7), mysi oligonukleotyd _Y2bCH3 GCAACGTGAGACACGAGGGTCTG (SEQ ID NO:8), które łączą się z rejonem stałym przeciwciała jak opisano w M. Sassano et al. Nucl Ac. Res. (1994) 22, 1768-1769.

PCR prowadzono w następujących warunkach: 1 min w 94°C, 1.5 min w 60°C, 2 min, w 72°C, w 30 cyklach.

Powielone fragmenty wprowadzano bezpośrednio do plazmidu pUC18 trawionego za pomocą Smal. Dwa klony zawierające regiony zmienne łańcucha lekkiego kappa i cztery klony zawierające regiony zmienne łańcucha ciężkiego gamma poddano sekwencjonowaniu.

Sekwencjonowanie wykonano w MWG Biotech, Niemcy. Zsekwencjonowano obie nici.

Nie stwierdzono żadnych niejednoznaczności.

Na Figurze 10 przedstawiono sekwencję części zmiennej łańcucha lekkiego (VL) ST2146

Na Figurze 11 przedstawiono sekwencję części zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) ST2146

Ogólna analiza porównawcza ST2146 w odniesieniu do BC4 wskazuje, iż ST2146 posiada następującą charakterystykę:

- przeciwciało monoklonalne typu BC4 pod względem specyficzności epitopowej;

- homogenne pod względem składu łańcucha ciężkiego i lekkiego;

- heterogenne pod względem glikozylacji łańcucha ciężkiego;

- przewyższa BC4 pod względem immunoreaktywności, jak przewidywano na podstawie heterogenności BC4;

- przewyższa BC4 w przybliżeniu trzykrotnie pod względem powinowactwa;

- przewyższa BC4 pod względem zachowywania immunoreaktywności po biotynylacji;

- podobne do BC4 pod względem selektywności i immunohistochemii;

- przewyższa BC4 pod względem zdolności do lokalizowania nowotworu.

LISTA ODNOŚNIKÓW LITERATUROWYCH

Balza E., Siri A., Ponassi M., Caocci F., Linnala A., Virtanen I., Zardi L. Production and characterization of monoclonal antibodies specific for different epitopes of human tenascin. FEBS 332:39-43, 1993.

Chinol M., Casalini P., Maggiolo M., Canevari S., Omodeo E.S., Caliceti P., Veronese F.M., Cremonesi M., Chiolerio F., Nardone E., Siccardi A.G., Paganelli G. Biochemical modifications of avidin improve pharmacokinetics and biodistribution, and reduce immunogenicity. British Journal of Cancer 78(2): 189-197, 1998.

Cianfriglia M., Mariani M., Armellini D., Massone A., Lafata M., Presentini L. and Antoni G. Methods for high frequency production of soluble antigen-specific hybridomas; specificities and affinities of monoclonal antibodies obtained. Methods Enzymol 121:193210, 1986.

Cremonesi M., Ferrari M., Chinol M., Stabin M. G., Grana C., Prisco G., Robertson C., Tosi G., Paganelli G. Three-step radioimmunotherapy with yttrium-90 biotin: dosimetry and pharmacokinetics in cancer patients. Eur J Nucl Med 26(2): 110-120, 1999.

Di Massimo AM., Di Loreto M., Pacilli A., Raucci G., D'Alatri L., Mele A., Bolognesi A., Polito L., Stirpe F. and De Santis R. Immunoconjugates made of an anti EGF-receptor Monoclonal Antibody and Type 1 RIPs from Saponaria ocymoides or Vaccaria pyramidata. British J. Cancer 75(6):822-828, 1997

Parente D., D'Alatri L., Di Massimo AM., Saccinto MP., Novelli S., Pacilli A., Mele A. and De Santis R. Production and in vitro characterization of a recombinant immunotoxin made of a single chain anti-EGF receptor antibody and a type ribosome-inactivating protein (RIP) from filamentous fungus Aspergillus clavatus. Anticancer Research 17(6A):4073-4074, 1997

Kim H, Yamaguchi Y, Masuda K, Matsunage C, Yamamoto K, Irimura T, Takahashi N, Kato K, Arata Y. O-glycosylation in hinge region of mouse immunoglobulin G2b. J Biol Chem 269(16):12345 -12350, 1994.

Ferrer C., Anastasi A.M., Di Massimo A.M., Bullo A., Di Loreto M., Raucci G., Pacilli A., Rotondaro L., Mauro S., Mele A., De Santis R. Expression and characterization of a mouse/human chimeric antibody specific for EGF receptor. J. Biotechnol. 52: 51-60, 1996

Manuel L. Penichet,* Young-Sook Kang, | William M. Pardridge, φ Sherie L. Morrison,* and Seung-Uon Shin. An Antibody-Avidin Fusion Protein Specific for the Transferrin Receptor serves as a

PL 213 216 B1

Delivery Vehicle for Effective Brain Targeting: Initial Applications in Anti-HIV Antisense Drug Delivery to the Brain 1. J Immunol 163: 4421-4426, 1999.

Paganelli G., Grana C., Chinol M., Cremonesi M., De Cicco C., De Braud F., Robertson C., Zurrida S., Casadio C., Zoboli S., Siccardi A. G., Veronesi U. Antibody-guided three step therapy for high grade glioma with yttrium-90 biotin. Eur J Nucl Med 26(4):348-357, 1999.

Paganelli G., Bartolomei M., Ferrari M., Cremonesi M., Broggi G., Maira G., Sturiale C., Grana C., Prisco G., Gatti M., Caliceti P., Chinol M. Pre-targeted locoregional radioimmunotherapy with 90Y-biotin in glioma patients: Phase I study and preliminary therapeutic results. Cancer Biother & Radiopharm 16(3): 227-235, 2001.

Parente D., D'Alatri L., Di Massimo AM., Saccinto MP., Novelli S., Pacilli A., Mele A. and De Santis R. Production and in vitro characterization of a recombinant immunotoxin made of a single chain anti-EGF receptor antibody and a type ribosome-inactivating protein (RIP) from filamentous fungus Aspergillus clavatus. Anticancer Research 17(6A):4073-4074, 1997

Ramos D.M. Chen B, Regezi J, Zardi L, Pytela R Tenascin-C matrix assembly in oral squamous cell carcinoma. Int J Cancer 75:680-687, 1998.

Siri A., Carnemolla B., Saginati M., Leprini A., Casari G., Baralle F. and Zardi L. Human tenascin: primary structure, pre-mRNA splicing patterns and localization of the epitope recognized by two monoclonal antibodies. Nucl Acid Res 19(3):525-531, 1991.

Wszystkie odnośniki, które zostały zacytowane lub na które się powoływano w niniejszym opisie, włączono tytułem odniesienia w całości.

PL 213 216 B1

Wykaz sekwencji <110> DE SANTIS, RITA

ANASTASI, ANNA MARIA <120> Przeciwciało monokionalne, sposób jego wytwarzania, jego zastosowanie, wytwarzające je iinie komórek hybrydoma, pojemnik je zawierający, zestaw terapeutyczny, DNA kodujący przeciwciało, wektor zawieraja.cy DNA, komórki gospodarza zawierające wc-ktor i kompozycja farmaceutyczna <130> 2818-141 <140>

<141>

<150> SO/359,299 <151> 2002-02-26 <160> 22 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 142 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ST2146 sekwencja regionu zmiennego łańcucha lekkiego

<400> 1

Phe

Leu

Gly

Leu 10

Leu

Vai

Leu

Trp

Ile 15

Pro

Met 1

Arg

Cys

Leu

Ala 5

Glu

Gly

Ala

Ile

Gly

Asp

ile

Val

Met

Thr

Gin

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Pro

20

25

30

Val

Thr

Pro

Gly

Glu

Ser

Val

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

35

40

45

Leu

ajGU.

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Trp

Phe

Leu

Gln

Arg

50

55

60

Pro

Gly

Gln

Ser

Pro

Gln

Leu

Leu

Ile

Tyr

Arg

Met

Ser

Asn

Leu

Ala

65

70

75

80

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

ciy

Thr

Ala

Phe

85

90

95

Thr

Leu

Arg

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

100

105

110

Cys

Met

Gln

His

Leu

Glu

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Al s

ciy

Th r

Lys

115

120

125

Leu

Glu

Leu

Lys

Arg

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Val

Ser

Ile

130

135

140

<210>	2
<211>	120
<232>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji	: syntetyczna

PL 213 216 B1

ST2146 sekwencja regionu zmiennego łańcucha ciężkiego <400> 2

Lys Val

Lys

Leu

Gin

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Val

Lys

Pro

Gly

Al a

1

5

10

15

Ser Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Al a

Ser

Giy

Tyr

Ala

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

Asn Met

Tyr

Trp

Vai

Lys

Gin

Ser

His

Gly

Lys

Ser

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

4 5

Gly Tyr

Ile

Asp

Pro

Tyr

Asn

Gly

Val

Thr

Ser

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

50

55

€0

Lys Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met His

Leu

Asn

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

a

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Gly

Giy

Gly

Ser

Ile

Tyr

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

100

105

110

Gly Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 3

<211> 426

<212> DNA

<213> Sekwencja

sztuczna

<220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ST2146 sekwencja cDNA regionu zmiennego łańcucha lekkiego <220>

<221> CD3 <222> (1)..(4263 <400> 3 atg agg tgc eta get gag ttc ctg ggg ctg ctt gtg ctc tgg atc cct 48

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

5 10 15 gga gee att ggg gat att gtg atg act cag get gca ccc tet gta cct 36

Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gin Ala Ala Pro Ser Val Pro

25 30 gtc act cct gga gag tea gta tcc atc tcc tgc agg tet agt aag agt 144

Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

40 45 ctc ctg cat agt aat ggc aac act tac ttg tat tgg ttc eta cag agg 192

Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg

55 60 cca ggc cag tet cct cag ctc ctg ata tat cgg atg tcc aac ctt gee 240

Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala

70 75 S0 tea gga gtc cca gac agg ttc agt ggc agt ggg tea gga act get ttc 288

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe

PL 213 216 B1

90 95 aca ctg aga atc agt aga gtg gag gct gag gat gtg ggt gtt tat tac 336

Thr Len Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Vai Tyr Tyr

100 105 110 tgt atg caa cat eta gaa tat ccg etc acg ttc ggt gct ggg acc aag 384

Cys Met Gin His Leu Giu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

115 120 125 ctg gag ctg saa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc 426

Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile

130 135 140 <210> 4 <211> 360 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ST2146 sekwencja cDNA regionu <220>

<221> CDS <222> ;i) - - (360) <400> 4 zmiennego łańcucha ciężkiego

aag	gtg	a a a	ctg	cag	cag	tet	gga	cct
Lys	Vai	Lys	Leu	Gin 5	Gin	Ser	Gly	Pro
tes	gtg	aag	gta	tcc	tgc	aag	gct	tet
Ser	Val	Lys	Val 20	Ser	Cys	Lys	Ala	Ser 25
ęl Ϊ3, L3	atg	tac	tgg	gtg	aag	cag	age	cat
Asn	Met	Tyr 35	Trp	Val	Lys	Gin	Ser 40	His
gga	tat	att	gat	cct	tac	aat	ggt	gtt
Gly	Tyr 50	11 e	Asp	Pro	Tyr	Asn 55	Gly	Val
aag	ggc	aag	gee	aca	ttg	act	gtt	gac
Lys 65	Gly	Lys	Ala	Thr	Leu 70	Thr	Val	Asp
atg	cat	ctc	aac	age	ctg	aca	tet	gag
Met	His	Leu	Asn	Ser 85	Leu	Thr	Ser	Glu
gca	aga	ggg	ggc	ggt	agt	atc	tac	tat
Ala	Arg	Gly	Gly 100	Gly	Ser	Ile	Tyr	Tyr 105
ggg	acc	acg	gtc	acc	gtc	tcc	tea
Gly Thr Thr 115 <210> 5 <211> 20	Val	Thr	Val	Ser	Ser 120

gag Glu 10	ctg Leu	gtg Val	aag Lys	cct Pro	ggg Gly 15	gct Ala	48
ggt	tat	gca	ttc	act	age	tac	96
Gly	Tyr	Al a	Phe	Thr 30	Ser	Tyr
gga	aag	age	ctt	gag	tgg	att	144
Gly	Lys	Ser	Leu 45	Glu	Trp	Ile
act	age	tac	aac	cag	aag	ttc	192
Thr	Ser	Tyr 60	Asn	Gin	Lys	Phe
aag	tcc	tcc	age	aca	qcc	™ 3.C	240
Lys	Ser 75	Ser	Ser	Thr	Ala	Tyr 80
gac	tet	gca	gtc	tat	tac	tgt	288
Asp 90	Ser	Ala	Val	Tyr	Tyr 95	Cys
gct	atg	gac	tac	tgg	ggc	caa	336
Al a	Met	Asp	Tyr	Trp 110	Gly	Gin

360

PL 213 216 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer <400> 5 tgtcaagagc ttcaacagga <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer <400> 6 aagatggata cagttggtgc <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer <400> 7 gtcactgact cagggaagta gcc <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer <400> 8 gcaacgtgag acacgagggt ctg <210> 9 <2il> 16 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ST2146 łańcuch lekki region zmienny CDR1 sekwencja białkowa <400> 9

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Len Tyr 15 10 15 <21Q> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 213 216 B1 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ST2146 łańcuch lekki region zmienny CDR1 sekwencja nukłeotydowa <220>

<221> CDS <222> (1) .. <48) <400> 10 agg tct agt aag agt ctc ctg cat agt aat ggc aac act tac ttg tat 48

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr

5 10 15 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ST2146 łańcuch lekki region zmienny CDR2 sekwencja białkowa <400> 11

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

5 <2I0> 12 <2U> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ST2146 łańcuch lekki region zmienny CDR2 sekwencja nukłeotydowa <220>

<221> CDS <222> (il..{21?

<400> 12 cgg atg tcc aac ctt gcc tca 2i

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

5 <210> 13 <2I1> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ST2146 łańcuch lekki region zmienny CDR3 sekwencja białkowa <400> 13

Met Gin His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5 <2ł0> 14 <2łł> 27 <212> DNA

PL 213 216 B1

<213>	Sekwencja sztuczna
<220
<22 3>	Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna
	ST2146 łańcuch lekki region zmienny CDR3 sekwencja nukleotydowa
<220
<221>	CDS
<222>	(1)..(27)
<400>	14

atg caa cat eta gaa tat ccg etc acg Met Gin His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr

5 <210 15 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 .

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ST2146 łańcuch ciężki region zmienny CDR1 sekwencja białkowa <400> 15

Ser Tyr Asn Met Tyr 1 5

<210> <210 <212> <213>	16 15 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna
	ST2146 łańcuch ciężki region zmienny CDR1 sekwencja nukleotydowa
<220 <22 0 CDS <222> (1).,(15) <400 16 age tac aac atg tac 15

Ser Tyr Asn Met Tyr ł 5 <210 17 <210 17 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna . <

ST2146 łańcuch ciężki region zmienny CDR2 sekwencja białkowa <400> 17 _

Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gin Lys riie Lys 'i 5 10 15

Gly

PL 213 216 B1 <21C> 18 <211> 51 <212> DMA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ST2146 łańcuch ciężki region zmienny CDR2 sekwencja nukleotydowa <220>

<221> CDS <222> (1).. {51} <400> 18 tat att gat cct tac aat ggt gtt act. agc tac aac cag aag ttc aag 48

Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gin. Lys Phe Lys

5 10 15 ggc 51

Gly <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

3T2146 łańcuch ciężki region zmienny CDR3 sekwencja białkowa <400> 19

Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <2I0> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ST2146 łańcuch ciężki region zmienny CDR3 sekwencja nukleotydowa <220>

<221> COS <222> ¢1} . . ¢33) <400> 20 ggg ggc ggt agt atc tac tat gct atg gac tac 33

Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

5 10 <210> 21 <211> 773 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

ΞΤ2146 łańcuch lekki, region zmienny sekwencja nukleotydowa

PL 213 216 B1 <220> <221> CDS

<222> ¢292)	. . (717)
<400> 21 cgaggatccc	ctgtcaagag	cttcaacagg	aatgagtgtt	agagacaaag	gtcctgagac	60
gccaccacca	ąctccccagc	tccatcctat	cttcccttct	aaggtcttgg	aggcttcccc	120
acaagcgacc	taccactgtt	gcggtgctcc	aaacctcctc	cccacctcct	tctcct.cctc	180
ctccctttcc	ttggctttta	tcatgctaat	atttgcagaa	aatattcaat	aaagtgagtc	240
tctgcaaaaa		aaaataaccc	cttgataagg	sagttctcag	a atg agg	297

Met Arą

tgc Cys

eta Leu

get Al a 5

gag

ttc Phe

ctg Leu

ggg Gly

ctg Leu 10

ctt Leu

gtg Val

ctc Leu

tgg Trp

atc Ile 15

cct Pro

gga Gly

gcc Ala

345

att

ggg

gat

att

gtg

atg

act

cag

get

gca

ccc

tet

gta

cct

gtc

act

393

Ile

Gly

As 0

Ile

Val

Met

Thr

Gin

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Pro

Val

Thr

20

25

30

cct

gga

gag

tea

gta

tcc

atc

tcc

tgc

agg

tet

aqt

aag

agt

ctc

ctg

441

Pro

Gly

Glu

Ser

Val

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

by s

Ser

Lc u

35

40

4 5

50

cat

agt

aat

ggc

aac

act.

tac

ttg

tat

tgg

ttc

eta

cag

agg

cca

ggc

489

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Trp

Phe

Leu

Gin

Arg

Pro

Gly

55

60

65

cag

tet

cct

cag

ctc

ctg

ata

tat

cgg

atg

tcc

aac

ctt

gcc

tea

gga

537

Gin

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

I le

Tyr

Arg

Met

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

70

75

80

gtc

cca

gac

agg

ttc

agt

ggc

agt

ggg

tea

gga

act

get

ttc

aca

ctg

585

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

dy

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ala

Phe

Thr

Lfili

85

90

95

aga

atc

agt

aga

gtg

gag

get

gag

gat

gtg

ggt

CfHt

tat

tac

tgt

atg

633

Arg

Ile

Ser

Arg

Val

-j 1. tu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

100

105

110

caa

cat

eta

ę33

tat

ccg

ctc

acg

ttc

ggt

get

ggg

acc

aag

ctg

gag

681

Gin

His

Leu

Glu

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

115

120

125

130

ctg

aaa

cgg

get

gat

get

gca

cca

act

gta

tcc

atc

ttgggtaccg

727

Leu

Lys

Arg

Ala

Asp

Al 3

J31 a

Pro

Thr

Val

Ser

Ile

135

140

agct.cgaatt cgtaatcatg tcatagctgt

: ttcctgtgtg

aaat

;tg

773

<210> 22 <211> 360 <2Ι2> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna

PL 213 216 B1

ST2146 łańcuch ciężki region zmienny sekwencja nukłeotydowa <220>

<221> CDS <222> (1)..(360) <400> 22

aag Lys 1

gtg Val

aaa Lys

ctg Leu

cag Gin 5

cag Gin

tct Ser

gga Gly

cct Pro

gag Glu 10

ctg Leu

gtg Val

aag Lys

cct Pro

ggg Gly 15

gct Ala

48

tca

gtg

aag

gta

tcc

tgc

aag

gct

tct

ggt

tat

gca

ttc

act

agc

tac

96

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

aac

atg

tac

tgg

gtg

aag

cag

agc

cat

gga

aag

agc

ctt

gag

tgg

att

144

Asn

Met

Tyr

Trp

Val

Lys

Gin

Ser

His

Gly

Lys

Ser

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

gga

tat

att

gat

cct

tac

aat

ggt

gtt

act

agc

tac

aac

cag

aag

ttc

192

Gly

Tyr

Ile

Asp

Pro

Tyr

Asn

Gly

Val

Thr

Ser

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

50

55

60

aag

ggc

aag

gcc

aca

ttg

act

gtt

gac

aag

tcc

tcc

agc

cłCcl

gcc

tac

240

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

atg

cat

ctc

aac

agc

ctg

aca

tct

gag

gac

tct

gca

gtc

tat

tac

tgt

288

Met

His

Leu

Asn

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

gca

aga

ggg

ggc

ggt

agt

a t c

tac

tat

gct

atg

gac

tac

tgg

ggc

caa

336

Ala

Arg

Gly

Gly

Gly

Ser

Ile

Tyr

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

100

105

110

ggg

acc

acg

gtc

acc

gtc

tcc

tca

360

Gly

Thr

Thr

Va 1

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

PL 213 216 B1

Claims (30)

1. Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej tenascynie, znamienne tym, że jego regiony zmienne łańcuchów lekkiego i ciężkiego posiadają sekwencje odpowiednio SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO:2 oraz którego fragmenty proteolityczne wiążą epitop antygenowy w obrębie powtórzenia typu EGF-podobnego ludzkiej tenascyny C.

2. Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej tenascynie C, znamienne tym, że jego zmienny region łańcucha lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 oraz SEQ ID NO: 13 i jego zmienny region łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 17 oraz SEQ ID NO: 19 lub fragment wspomnianego przeciwciała monoklonalnego, przy czym przeciwciało lub jego fragment ulega wiązaniu z epitopem antygenowym w obrębie powtórzenia typu EGF-podobnego ludzkiej tenascyny C.

3. Przeciwciało lub jego fragmenty według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera dodatkowo znaczniki i/lub czynniki diagnostyczne.

4. Przeciwciało lub jego fragmenty według zastrz. 2, znamienne tym, że zawiera dodatkowo znaczniki i/lub czynniki diagnostyczne.

5. Biotynylowane przeciwciało lub jego fragment jak określono w dowolnym z zastrz. od 1 do 4, znamienne tym, że ulega wiązaniu z epitopem antygenowym w obrębie powtórzenia typu EGF-podobnego ludzkiej tenascyny C.

6. Linia komórek hybrydoma wytwarzająca przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej tenascynie ulegającej wiązaniu z epitopem antygenowym w obrębie powtórzenia typu EGF-podobnego ludzkiej tenascyny C, znamienna tym, że zdeponowana na mocy Traktatu Budapesztańskiego w dniu 29 stycznia 2002 r., w Międzynarodowym Organie Depozytowym Centrum Zaawansowanych Biotechnologii, pod numerem dostępu PD02003.

7. Przeciwciało monoklonalne, znamienne tym, że wyprodukowane przez komórki hybrydoma określone w zastrz. 6.

8. Sposób otrzymywania przeciwciała określonego w zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że obejmuje hodowlę komórek hybrydoma określonych w zastrz. 6 oraz izolację wspomnianego przeciwciała.

9. Zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentów określonych w dowolnym z zastrz. od 1 do 4 lub biotynylowanego przeciwciała lub jego fragmentu określonych w zastrz. 5 do wytwarzania środka diagnostycznego do wykrywania chorób związanych z ekspresją tenascyny.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że choroba jest nowotworem.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że nowotwór jest wybrany z grupy składającej się z: nowotworów torbielowatych mózgu, glejaków, nowotworów sutka, płuc, włókniakomięsaków oraz nowotworów płaskokomórkowych.

12. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. od 9 do 11, znamienne tym, że środek diagnostyczny jest stosowany w technikach obrazowania in vivo.

13. Zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentów określonych w dowolnym z zastrz. od 1 do 4 lub biotynylowanego przeciwciała lub jego fragmentu określonych w zastrz. 5 do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych związanych z ekspresją tenascyny.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że nowotwór jest wybrany z grupy składającej się z nowotworów torbielowatych mózgu, glejaków, nowotworów sutka, płuc, włókniakomięsaków oraz nowotworów płaskokomórkowych.

15. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. od 13 do 14, znamienne tym, że lek ma postać zestawu odpowiedniego do przeprowadzenia trzyetapowego wstępnego ukierunkowania.

16. Zestaw terapeutyczny składający się z 5 ampułek, znamienny tym, że pierwsza ampułka zawiera biotynylowane przeciwciało lub jego fragment określone w zastrz. 5, druga ampułka zawiera awidynę, trzecia ampułka zawiera biotynylowaną albuminę, czwarta ampułka zawiera streptawidynę, piąta ampułka zawiera znakowaną izotopowo biotynę lub pochodną biotyny.

17. Zestaw terapeutyczny według zastrz. 16, znamienny tym, że wspomniane ampułki są odpowiednie do podawania w postaci zastrzyków ludziom.

18. DNA kodujący przeciwciało lub jego fragmenty określone w zastrz. 1 albo 2.

19. Białka zawierające regiony wiązania CDR z epitopem antygenowym w obrębie powtórzenia typu EGF-podobnego ludzkiej tenascyny C, znamienne tym, że posiadają sekwencję aminokwasową

PL 213 216 B1

SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11 oraz SEQ ID NO: 13 oraz sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 15,

SEQ ID NO: 17 oraz SEQ ID NO: 19.

20. Wektor zawierający DNA określony w zastrz. 18.

21. Komórki gospodarza zawierające wektor określony w zastrz. 20.

22. Zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentów określonych w dowolnym z zastrz. od 1 do 4, w zestawieniu z drugim przeciwciałem specyficznym wobec tenascyny w teście podwójnego wiązania, do otrzymywania zestawu diagnostycznego do określania poziomu cyrkulującej tenascyny.

23. Zestaw diagnostyczny zawierający przeciwciało lub jego fragmenty określone w dowolnym z zastrz. od 1 do 4.

24. Pojemnik, znamienny tym, że zawiera biotynylowane przeciwciało, lub jego fragmenty określone w zastrz. 5, bufory oraz odczynniki odpowiednie do zastosowania w zestawie terapeutycznym do trzyetapowej metody wstępnego ukierunkowania.

25. Pojemnik według zastrz. 24, znamienny tym, że zawiera wiele przedziałów.

26. Pojemnik według dowolnego z zastrz. od 24 do 25, znamienny tym, że zawiera dodatkowo oddzielne przeciwciało specyficzne wobec tenascyny, korzystnie skierowane przeciwko fragmentowi A-D.

27. Pojemnik według dowolnego z zastrz. od 24 do 25, znamienny tym, że zawiera dodatkowo oddzielne przeciwciało specyficzne wobec nowotworu.

28. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że w zestawieniu z drugim przeciwciałem swoistym wobec tenascyny w teście podwójnego wiązania ELISA in vitro w warunkach, w których wspomniane drugie przeciwciało wiąże się z drugim epitopem antygenowym tenascyny, przy czym wspomniany test ELISA in vitro jest użyteczny do określania poziomu cyrkulującej tenascyny.

29. Przeciwciało według zastrz. 2, znamienne tym, że w zestawieniu z drugim przeciwciałem swoistym wobec tenascyny w teście podwójnego wiązania ELISA in vitro w warunkach, w których wspomniane drugie przeciwciało wiąże się z drugim epitopem antygenowym tenascyny, przy czym wspomniany test ELISA in vitro jest użyteczny do określania poziomu cyrkulującej tenascyny.

30. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało i/lub jego fragment określone w dowolnym z zastrz. od 1 do 4, znamienna tym, że zawiera przynajmniej jedną farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę i/lub nośnik.