PL213879B1 - Nowy zwiazek oraz jego zastosowania - Google Patents

Nowy zwiazek oraz jego zastosowania

Info

Publication number
PL213879B1
PL213879B1 PL383211A PL38321107A PL213879B1 PL 213879 B1 PL213879 B1 PL 213879B1 PL 383211 A PL383211 A PL 383211A PL 38321107 A PL38321107 A PL 38321107A PL 213879 B1 PL213879 B1 PL 213879B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
inhibitor
peptidase
solution
activity
inhibition
Prior art date
Application number
PL383211A
Other languages
English (en)
Other versions
PL383211A1 (pl
Inventor
Jolanta Solecka
Lech Kozerski
Original Assignee
Inst Chemii Organicznej Pan
Panstwowy Zaklad Higieny
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Chemii Organicznej Pan, Panstwowy Zaklad Higieny filed Critical Inst Chemii Organicznej Pan
Priority to PL383211A priority Critical patent/PL213879B1/pl
Priority to US12/675,348 priority patent/US8344146B2/en
Priority to EP08828485A priority patent/EP2222641A1/en
Priority to PCT/PL2008/050013 priority patent/WO2009028972A1/en
Publication of PL383211A1 publication Critical patent/PL383211A1/pl
Publication of PL213879B1 publication Critical patent/PL213879B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/22—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C07D217/26—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis wynalazku
W związku z narastającą opornością drobnoustrojów na dotychczas stosowane chemioterapeutyki istnieje pilna potrzeba poszukiwania nowych antybiotyków o odmiennych strukturach chemicznych. Antybiotyki β-laktamowe stanowią grupę najczęściej stosowanych związków w walce z chorobami bakteryjnymi. Wiąże się to z ich szerokim spektrum aktywności przeciwbakteryjnej oraz brakiem ich chemoreceptorów w organizmach Eucaryotae. W badaniach zastosowano zewnątrzkomórkową DD-karboksypeptydazę/transpeptydazę 64-575 II (DD-peptydazę 64-575 II). DD-peptydazy biorą udział w końcowym etapie syntezy ściany komórkowej bakterii i zarazem wiążą antybiotyki β-laktamowe. Enzymy związane z antybiotykiem tracą swoje właściwości katalityczne co prowadzi do śmierci komórki bakteryjnej na skutek zahamowania syntezy ściany komórkowej.
Celem wynalazku jest dostarczenie nowych związków aktywnych, które będąc inhibitorami DD-peptydaz mogą być wykorzystane do otrzymywania preparatów farmaceutycznych, w szczególności antybiotyków lub leków przeciwnowotworowych.
Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie dogodnej metody uzyskiwania takich związków.
Nieoczekiwanie cel ten został zrealizowany w prezentowanym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze:
lub jego farmaceutycznie dopuszczalna pochodna, zwłaszcza sól albo hydrat.
Korzystnie związkiem według wynalazku jest kwas 7-hydroksy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związków według wynalazku zdefiniowanych powyżej do wytwarzania leku.
Korzystnie, wytwarzanym lekiem jest antybiotyk albo lek przeciwnowotworowy.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepu Streptomyces sp. zdeponowanego w PCM pod numerem dostępu B/00017 do wytwarzania związku według wynalazku.
Poznanie struktury nowego aktywnego związku, hamującego działanie DD-peptydaz, wykazującego stabilność wobec działania β-laktamaz, o aktywności przeciwbakteryjnej może być bardzo ważne dla antybiotykoterapii.
Figura 1 prezentuje układ zawiesin bakteryjnych nanoszonych na płytkę natomiast figura 2 ukazuje wynik testu aktywności przeciwbakteryjnej substancji antybiotycznej według wynalazku w stężeniu 0,2 mg/ml podłoża: A - próba właściwa; B - próba kontrolna (bez substancji antybiotycznej).
W dalszej części opisu zaprezentowano szczegółowe przykłady realizacji ujawnionego rozwiązania, które nie powinny być jednak utożsamiane z zakresem przedmiotowego wynalazku zdefiniowanym w załączonych zastrzeżeniach.
P r z y k ł a d y
W celu uzyskania naturalnego inhibitora DD-peptydaz, związku o właściwościach przeciwbakteryjnych prowadzono hodowlę promieniowca Streptomyces sp. 8812. Szczep ten wyodrębniono z próbki ziemi pochodzącej z Brazylii. Szczep ten został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem B/00017.
Wykonano następujące etapy prac:
1. Hodowla promieniowca Streptomyces sp. 8812.
2. Oczyszczanie zewnątrzkomórkowego inhibitora DD-karboksypeptydazy/DD-transpeptydazy
64-575 II wytwarzanego przez szczep Streptomyces sp. 8812;
a. Odbiałczanie supernatantu hodowli;
b. Oczyszczanie metodą chromatografii cieczowej na kolumnie anionowymiennej (IRA-400, Supelco) w gradiencie pH;
c. Oczyszczanie metodą średniociśnieniowej chromatografii cieczowej, w gradiencie, kolumna semipreparatywna, zmodyfikowana dC18, Atlantis (Waters);
PL 213 879 B1
d. Oczyszczanie metodą średniociśnieniowej chromatografii cieczowej, kolumna analityczna, zmodyfikowana dC18 (Atlantis, Waters) (metoda gradientowa, lub izokratyczna);
e. Oczyszczanie metodą HPLC, kolumna analityczna dC18 (Atlantis, Waters).
3. Analiza: HPLC-MS, HR-MS.
4. Analizy NMR.
5. Określenie struktury chemicznej inhibitora.
6. Badanie aktywności mikrobiologicznej inhibitora.
7. Zastosowanie (badanie) związku czynnego jako inhibitora DD-peptydaz.
8. Charakterystyka inhibitora.
Hodowla drobnoustroju i podłoża hodowlane
1. Hodowla na podłożu sporulacyjnym.
W celu namnożenia zarodników drobnoustroju skosy z podłożem drożdżowo-słodowym zaszczepiono zarodnikami Streptomyces sp. 8812 i inkubowano przez 14 dni w temp. 28°C.
3
Skład podłoża sporulacyjnego drożdżowo-słodowego (g/dm3):
Wyciąg drożdżowy (Difco) 4,0
Wyciąg słodowy (Difco) 10,0
Glukoza 4,0
Agar (Difco) 20,0
Składniki podłoża oprócz glukozy rozpuszczono w wodzie destylowanej, doprowadzono pH do 7,3, następnie dodano glukozę i sterylizowano 20 min. w temp. 117°C.
2. Hodowla na podłożu płynnym, produkcyjnym.
3
Skład płynnego podłoża produkcyjnego (g/dm3):
Trypton (Difco) 17,0
Pepton (Difco) 4,0
Ekstrakt drożdżowy (Difco) 5,0
Wyciąg namokowy kukurydzy (Cerestar, Włochy) 10,0
Laktoza 10,0
CaCO3 3,0
K2HPO4 4,0
KH2PO4 2,0
MgSO4 x 7H2O 0,5
Składniki rozpuszczono w wodzie wodociągowej, gotowano przez 10 min., doprowadzono pH do 6,7 i przefiltrowano. Podłoże rozlano do kolb o pojemności 500 cm3, po 40 cm3. Sterylizowano w temp. 121 °C przez 30 min.
Hodowlę prowadzono w kolbach o pojemności 500 cm3 zawierających po 40 cm3 podłoża płyn39 nego. Podłoże zaszczepiono 1 cm3 zawiesiny zarodników (109) pobranych ze skosów. Inkubację prowadzono 48 godzin w temp. 28°C na wytrząsarce Series 25 Incubator Shaker (New Brunswick Scientific, Edison, New Jersey, USA) przy 240 rpm. Wzrost grzybni obserwowano przy użyciu mikroskopu fazowo-kontrastowego Docuval Carl-Zeiss (Jena, RFN). Po 20, 24 i 48 godzinach inkubacji pobierano próbki hodowli w celu wykonania oznaczenia inhibicji DD-peptydazy.
Test na inhibicję DD-peptydazy 64-575 II
Podczas hodowli Streptomyces sp. 8812 oraz w kolejnych etapach oczyszczania inhibitora stosowano test enzymatyczny na inhibicję DD-peptydazy 64-575 II. W ten sposób oceniano postęp w biosyntezie inhibitorów, a także wybierano frakcje o najwyższej aktywności inhibicji (która przekłada się na znalezienie związków o najwyższej aktywności przeciwbakteryjnej).
Zewnątrzkomórkową DD-karboksypeptydazę/DD-transpeptydazę 64-575 II wytwarzaną przez szczep Saccharopolyspora erythraea PZH 64-575 II, otrzymano w Samodzielnej Pracowni Promieniowców i Grzybów Niedoskonałych Państwowego Zakładu Higieny. Enzym oczyszczono do jednej proteiny oraz zbadano jego właściwości fizyko-chemiczne w Centrum Inżynierii Białek i Laboratorium Enzymologii Uniwersytetu w Liege. Aktywność właściwa enzymu wynosi 50 lU/mg.
Oznaczanie aktywności DD-karboksypeptydazy 64-575 II przeprowadzono wg Frere i współprac. 19761.
3
Mieszanina reakcyjna do oznaczania aktywności DD-peptydaz składała się z: 60 mm3 roztworu 3 zawierającego 0,05 mg-cm dinukleotydu flawinoadeninowego (Sigma) w 0,1 M buforze Tris-HCl o pH
3 -1
8,0; 10 mm3 roztworu zawierającego 0,05 mg-cm3 peroksydazy chrzanowej o aktywności 1230 j.-mg-1
-3 (Sigma) w wodzie dest., 5 mm3 roztworu zawierającego 5 mg-cm-3 chlorku o-dianizydyny (Sigma)
PL 213 879 B1
-3 w wodzie dest., 2 mm roztworu zawierającego 11,77 mg-cm- oksydazy D-aminokwasów wyodręb-1 nionej z nerek wieprzowych (Sigma) o aktywności 6,7 j.-mg-1 w 0,1 M buforze Tris-HCl o pH 8,0.
3
Próbki do oznaczania aktywności DD-karboksypeptydaz (a) składały się z: 10 mm3 roztworu enzymu o stężeniu 50 μΜ, 20 mm3 roztworu zawierającego 4,52 mg-cm-3 tripeptydu N“ NEAc2-L-Lys-D-Ala-D-Ala w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 8,0. Próbki standardowe (b) zawierały zamiast roztwo3 -3 ru substratu 20 mm3 roztworu zawierającego 0,089 mg-cm-3 D-alaniny (Sigma). Próbka ślepa (c) za3 wierała zamiast roztworu substratu 20 mm3 0,1 M buforu fosforanowego o pH 8,0. Wszystkie próbki (a), (b), (c) przygotowywano w temp. 4°C, następnie inkubowano 30 min. w temp. 37°C, po czym umieszczano na 2 min. w łaźni wodnej o temp. 100°C. Po ochłodzeniu do próbek (a), (b) i (c) doda3 wano po 77 mm3 mieszaniny reakcyjnej, a następnie inkubowano je 10 min. w temp. 37°C. Do każdej 3 próbki dodawano 0,350 cm3 mieszaniny zawierającej metanol, wodę destylowaną i stężony kwas siarkowy w stosunku objętościowym 5:5:6. Ekstynkcję mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 540 nm na spektrofotometrze Spekol 11 (Carl Zeis Jena, RFN). Ilość uwalnianej D-Ala odczytywano z krzywej wzorcowej.
Oznaczanie inhibicji DD-peptydazy 64-575 II mm3 roztworu DD-peptydazy 64-575 II o stężeniu 50 μΜ, 10 (20) mm3 roztworu oczyszcza3 nego inhibitora inkubowano 30 min. w temperaturze 37°C. Następnie dodawano 20 mm3 roztworu substratu - tripeptydu i dalej postępowano jak opisano wyżej.
Absorbancja próby kontrolnej enzymu (Aen) wynosiła 0,350-0,370, absorbancja prób inhibitora (Apr) wynosiła 0,05-0,10. Wartości inhibicji obliczano w % zahamowania aktywności DD-peptydazy.
[%] = 100% - ( Apr x 100%/Aen)·
Do badań inhibicji stosowano także zewnątrzkomórkową DD-peptydazę R39 wytwarzaną przez szczep Actinomadura sp. R39 oraz DD-peptydazę R61 wytwarzaną przez szczep Streptomyces sp. R61 otrzymane od profesora Jean-Maria Ghuysena. Oznaczenia wykonywano analogicznie, używając enzymów o stężeniu odpowiednio 0,05 mg/ml i 7,5 μg/ml.
Oznaczanie inhibicji aktywności β-laktamaz metodą nitrocefinową (O'Callaghan i współprac. 1972)2
Odczynniki użyte do badań: 0,1 mM roztwór nitrocefiny przygotowywany z: 0,5 mg nitrocefiny 3 (Glaxo), 0,5 cm dimetylosulfotlenku (Fluka), 9,5 cm3 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,0; β-laktamaza klasy A (penicylinaza, Penase, 5 x 106 IU/ml, Bacto).
Do 20 mm3 roztworu badanego inhibitora w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,0 dodawano 10 mm3 3 β-laktamazy, inkubowano 30 min. w temp. 37°C. Następnie dodawano 30 mm 0,1 mM roztworu nitro3 cefiny, 430 mm3 0,1 M buforu fosforanowego pH 7,0. Próbki inkubowano 10 min. w temperaturze 37°C i oznaczano spektrofotometrycznie przy długości fali 482 nm. Molowy współczynnik ekstynkcji wynosi 15000 M-1-cm-1.
Nie zaobserwowano różnicy absorbancji, porównując próbę kontrolną (inkubacja β-laktamazy z nitrocefiną) do próby z inhibitorem. Badany inhibitor nie wykazywał inhibicji β-laktamazy klasy A.
Oznaczanie stabilności inhibitora w środowisku β-laktamaz
Opracowano metodę badania stabilności inhibitora wykorzystując kombinację dwóch wyżej opisanych metod. Przeprowadzono wstępną inkubację inhibitora z β-laktamazą następnie dodano odczynniki do oznaczania inhibicji DD-peptydazy. Absorbancja próby badanej wynosiła 0,05, próby kontrolnej (DD-peptydazy) wynosiła 0,35. Okazało się, że po inkubacji z β-laktamazą inhibitor zachowuje swoje właściwości inhibicji DD-peptydazy 64-575 II, tzn. jest stabilny w środowisku β-laktamaz (nie jest hydrolizowany przez β-laktamazy).
Oczyszczanie inhibitora
Pierwszy etap oczyszczania inhibitora DD-peptydazy 64-575 II
Około 10 dm3 brzeczki fermentacyjnej odwirowywano 60 min przy 8000 obr./min. (wirówka Model J-21C Centrifuge, Beckman, USA). Otrzymany supernatant odbiałczano dodając aceton do osiągnięcia stężenia 70% i wytrząsano w temp. pokojowej przez około godzinę. Wytrącone białka odwirowywano w temp. 5°C przy 8000 obr./min. (Model J-21C Centrifuge; Beckman, USA). Następnie aceton odparowano na wyparce próżniowej (Unipan, Polska). Całość liofilizowano przez 24 godz. (aparat Beta 1-8 Christ, RFN). Otrzymany liofilizat poddano testowi na inhibicję DD-peptydazy.
Drugi etap oczyszczania inhibitora DD-peptydazy 64-575 II
Odbiałczony liofilizat supernatantu hodowli szczepu 8812 nanoszono porcjami (po 1,7g w 20 ml wody) na przekształcaną w formę octanową żywicę anionowymienną IRA 400 (Supelco). Żywicę umieszczono w kolumnie 1,5 cm x 22 cm. Do badań stosowano średniociśnieniowy chromatograf
PL 213 879 B1 cieczowy BioLogic System (Bio-Rad, USA) wyposażony w detektor UV-VIS i kolektor frakcji. Naniesiony liofilizat przemywano wodą destylowaną, do momentu uzyskania zerowej absorbancji przy długości fali 254 nm. Rozdział wykonano w gradiencie pH, stosując kolejno: 0,5 M kw. octowy (0,61 - frakcje 1-77), 1 M kwas octowy (0,51 - frakcje 78-117) i 2 M kw. octowy (0,31- frakcje 118-119). Zbierano 8 ml frakcje, które zamrażano, liofilizowano, a następnie oznaczano aktywność inhibicji. Wysoką aktywność inhibicji uzyskano w frakcjach 0,5 M i 1 M kwasu octowego, a także niewielką aktywność w frakcjach 2 M kwasu octowego. Rozdziały wykonywano wielokrotnie i gromadzono aktywne frakcje do dalszych etapów oczyszczania.
T a b e l a 1
Oznaczenie inhibicji DD-karboksypeptydazy/DD-transpeptydazy 64-575 II we frakcjach po rozdziale na żywicy anionowymiennej Amberlite IRA-400
Numer frakcji Inhibicja [%]*
3, 4, 5 13,85
6, 7, 8 19,9
9, 10, 11 25,7
12, 13, 14 51,9
18, 19, 20 49,0
30, 31, 32 27,5
36, 37, 38 42,7
53, 54, 55 56,6
59, 60, 61 60,2
68, 69, 70 9,8
78, 79, 80 19,2
* Do oznaczenia wzięto 0,05 mg liofilizatu frakcji.
Trzeci etap oczyszczania inhibitora DD-peptydazy 64-575 II
Wybrane frakcje 53-61 (po oczyszczaniu na żywicy anionowymiennej) o najwyższej aktywności inhibicji enzymu R61 oczyszczano na kolumnie semipreparatywnej do HPLC ze zmodyfikowaną odwróconą fazą dC18 (Atlantis, 10 μm, 1,0 cm x 25 cm, Waters) metodą chromatografii średniociśnieniowej (Bio-Logic System, Bio Rad), długość fali 214 nm. Na kolumnę nanoszono 25-30 mg liofilizatu w 100 μl 0,05% TFA. Program do oczyszczania inhibitorów DD-peptydazy układano komputerowo (program BioLogic, Bio-Rad, USA). Zaprojektowaną metodą posługiwano się wielokrotnie. Przepływ rozpuszczalnika wynosił 4,7 ml/min. Zbierano frakcje o objętości 6 ml. Fazą ruchomą był 0,05 % TFA (roztwór A) oraz 30% acetonitryl plus 70% TFA (0,1%) (roztwór B). Stosowano kombinację rozdziału izokratyczno-gradientowego: 10 ml roztworu A, następnie liniowy gradient od 0% do 19% roztworu B w objętości 175 ml. Zebrane frakcje liofilizowano i badano na obecność inhibitora (hamowanie aktywności DD-peptydazy 64-575 II). Wykryto inhibicję w kilku frakcjach, przy różnym % roztworu B. Prawdopodobnie rozdzielono kilka inhibitorów. Maksimum inhibicji (95-100%) wykazywały frakcje (13-15), które były eluowane z kolumny przy 9-11% roztworu B. Z frakcji 13-15 otrzymywano po ok. 0,5-1,0 mg aktywnej substancji. Rozdziały na kolumnie Atlantis wykonywano wielokrotnie i gromadzono aktywne frakcje do dalszego oczyszczania.
Czwarty etap - oczyszczanie wybranego inhibitora DD-peptydazy 64-575 II
Do dalszego oczyszczania metodą chromatografii średniociśnieniowej (Bio-Logic System, Bio Rad) użyto kolumny analitycznej ze zmodyfikowaną, odwróconą fazą (Atlantis, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm, Waters), długość fali 214 nm, Na kolumnę nanoszono 0,2 (0,15) mg próbki rozpuszczonej w 50 μl 0,05% (obj.) roztworu TFA. Próbkę stanowił liofilizat aktywnych frakcji 13-15 (eluowanych przy 9-11% roztworu B) po rozdziale chromatograficznym na kolumnie semipreparatywnej Atlantis dC18.
Stosowano następujące eluenty: roztwór A - 0,05% TFA, roztwór B - 20% acetonitryl plus 80% TFA (0,1%). Otrzymano mikrogramowe ilości oczyszczanego inhibitora, który był wymywany z kolumny przy stężeniu 2% roztworu B (elucja izokratyczna) po 35,5 min.
PL 213 879 B1
Piąty etap - całkowite oczyszczenie inhibitora DD-peptvdazy 64-575 II
Inhibitor oczyszczano powtarzając procedurę opisaną w czwartym etapie. Analiza widm NMR i MS potwierdza całkowite oczyszczenie inhibitora.
T a b e l a 2
Wydajność uzyskania oczyszczanego inhibitora z materiału wyjściowego
Etapy prac Ilość uzyskanego materiału po każdym etapie Stosunek ilościowy materiału po każdym etapie oczyszczania do odbiałczanego liofilizatu [%]
Brzeczka fermentacyjna 1148 cm3 -
Supernatant hodowli 840 cm3 -
1. etap oczyszczania; odbiałczony liofilizat 22 g 100
2. etap oczyszczania; BioLogic, żywica anionowymienna 0,15 g 0,68
3. etap oczyszczania; BioLogic, kolumna dC18 semiprep. 10 mg 0,045
4. etap oczyszczania; BioLogic, kolumna analit. dC18 3 mg 0,014
5. etap oczyszczania; HPLC kolumna analit. dC-is, pojedynczy inhibitor 2,0 mg 0,009
Analizy
1. Określenie masy cząsteczkowej inhibitora metodą spektrometrii mas
a) Wykonano analizę HPLC-MS (HPLC-Hewlett Packard 1100, MS - API 365 Turbo Ionspray firmy PE SCIEX). Stosowano kolumnę analityczną dC18, Atlantis (Waters). Jako fazę ruchomą użyto 0,05% kwas octowy i acetonitryl 98:2; przepływ 1 ml/min; nastrzyk 20 pl; długość fali 214 nm. Warunki MS: potencjał deklasteringu 20 V, potencjał ogniskujący 200 V. W trybie jonów dodatnich uzyskano pik molekularny o masie 208,1 m/z, w trybie jonów ujemnych pik molekularny o masie 206,1 m/z. Wyliczona masa cząsteczkowa badanego inhibitora wynosi 207,1 Da.
b) Przeprowadzono fragmentację inhibitora (MS/MS) przy użyciu spektrometru mas API 365 Turbo Ionspray firmy PE SCIEX. Otrzymano następujące fragmenty: 162,2 (fragmentacja świadcząca o obecności grupy karboksylowej); 134,1; 116,0; 59,1 m/z.
c) Wykonano dokładny pomiar masy (HR - MS) inhibitora przy użyciu aparatu Bruker APEX-Q (9.4T) oraz metody jonizacji ESI w trybie jonów dodatnich. Warunki: napięcie na igle wynosiło 3500 V, Napięcie shield 3000 V, temperatura igły 200°C, próbkę rozpuszczono w roztworze kw. octowego i dodano metanol. Zastosowano kalibrację zewnętrzną.
Zaproponowany wzór sumaryczny wynikający z dokładnego pomiaru masy jest następujący: masa jonu molekularnego (M+H)+ otrzymana z pomiaru wynosi 208,06040 m/z, natomiast masa wyliczona wynosi 208,06043 m/z. Program komputerowy zaproponował wzór inhibitora, który przedstawia się następująco: C10H10NO4 (dla m/z). W związku z tym można zaproponować następujący wzór sumaryczny: C10H9NO4. Masa cząsteczkowa oczyszczonego inhibitora wynosi 207,05258 Da.
2. Analiza IR
Uzyskano widmo inhibitora w podczerwieni (Perkin Elmer Spectrum 2000). Próbkę przygotowano poprzez ucieranie w KBr.
Uzyskano następujące maksima: 3436 cm-1 (grupa hydroksylowa, hydroksylowa pochodząca od grupy karboksylowej); 1681 cm-1, 1636 cm-1 (układ -C=C-N-, -C=C-O-); 1075 cm-1, 1131 cm-1 (układ -C-O-H), 724 cm-1, 804 cm-1, 894 cm-1, 986 cm-1 (układ -C=C-).·
3. Analizy NMR
Wykonano analizę 1H-NMR (400 MHz, Varian) oraz 13C NMR (700 MHz,).
Próbki rozpuszczono w H2O/D2O, 9:1 1H NMR H2O/D2O (90:10 vol.%) pH 7.4 Na2HPO4 δ, ppm; 3.03 (dd, 2J=17.1, 3J=9.3); 3.15 (dd, 2J=17.1, 3J =7.3); 4.27 (dd, 3J=7.3, 3J=9.3); 6.42 (s); 6.92 (s); 8.12 (s);
13C NMR δ, ppm; 29.2, 55.6, 110.6, 117.1, 117.2, 135.0, 146.6, 159.5, 168.8, 175.1.
PL 213 879 B1
Określenie struktury cząsteczki
W bazie danych Beilstein (2006 r) znaleziono ok. 640 struktur odpowiadających wzorowi sumarycznemu C10H9NO4. Analiza widm NMR pozwoliła na określenie struktury analizowanego inhibitora. Jest to kwas 7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy.
Nie znaleziono przedstawionego związku w bazach danych Beilstein oraz Chemical Abstracts. Związek ten jest nową, poznaną strukturą.
Wytwarzany jest na drodze biosyntezy przez szczep Streptomyces sp. 8812 w podłożu płynnym zawierającym organiczne źródło węgla i azotu.
Wykazuje właściwości przeciwbakteryjne. Bardzo interesujące jest hamowanie wzrostu Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637, bakterii która dostarcza wielu problemów klinicznych (wytwarza trzy rodzaje β-laktamaz w tym metalo-e-laktamazę klasy B).
Badania hamowania aktywności DD-peptydaz R61, R39 przez oczyszczany inhibitor, alkaloid izochinoliny
Inhibicję DD-peptydaz wyrażano wartością ID50(M) określającą molowe stężenie inhibitora, który hamuje aktywność enzymu o 50%.
1) Powinowactwo DD-peptydazy R39 do kwasu 7-hydroxy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino3-karboksylowego wyrażone wartością ID50(M) wynosi ID50(M)=4,5 x 10-4M.
2) Powinowactwo DD-peptydazy R61 do badanego inhibitora wynosi ID50(M)=6,75 x 10-4M.
Oznaczono także czas trwania kompleksu inhibitor-enzym.
Przeprowadzano inkubację od kilku do kilkudziesięciu godzin roztworu każdego enzymu z inhibitorem i substratem (analogicznie jak opisano wyżej). Następnie dodawano mieszaninę reakcyjną i dalej przeprowadzano oznaczanie.
1. Czas trwania kompleksu inhibitor-DD-peptydaza R39 wynosi 3,5 godz.
2. Czas trwania kompleksu inhibitor-DD-peptydaza R61 wynosi ok. 33 godz.
Kompleks DD-peptydaza R61-inhibitor jest znacznie bardziej stabilny niż enzymu R39. Czas trwania kompleksu DD-peptydaza R61-inhibitor wynosi kilkadziesiąt godz. Jest to wartość zbliżona do trwałości kompleksów DD-peptydaz z antybiotykami β-laktamowymi. Ma to znaczenie dla aktywności przeciwbakteryjnej.
Badania mikrobiologiczne
Aktywność przeciwbakteryjną badanego związku oznaczano metodą kolejnych seryjnych rozcieńczeń substancji w podłożu stałym (określenie wartości MIC) oraz metodą krążkowo-dyfuzyjną. Badano frakcje inhibitora po oczyszczaniu na kolumnie anionowymiennej (o najwyższej aktywności inhibicji DD-peptydazy po 0,5M kwasie octowym).
Wzorcowe szczepy bakterii stosowane w badaniu:
1. Enterococcus faecalis ATCC 29219,
2. Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637
3. Burkholderia cepacia ATCC 25416
4. Acinetobacter baumanii ATCC 19606
5. Bordetella bronchiseptica ATCC 4617
6. Escherichia coli ATCC 25922
7. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
8. Escherichia coli NCTC 8196
9. Proteus vulgaris NCTC 4635
10. Staphylococcus aureus ATCC 6538P
11. Staphylococcus aureus NCTC 4163
Na płytkę Petriego wylewano po 0,25 ml badanej próbki (rozpuszczonej w wodzie) i dopełniano podłożem agarowym MH II (Muller Hinton II) do objętości 5 ml. Stężenie substancji antybiotycznej wynosiło 0,2 mg/ml podłoża. Dodatkowo wykonano kontrolę bez substancji antybiotycznej zawierającą 5 ml podłoża MH II. Przy użyciu densytometru sporządzono zawiesiny bakterii w roztworze chlorku sodu o gęstości 0,5 McF (108 CFU/ml) a następnie wykonano ich rozcieńczenia.
Przygotowano szereg rozcieńczeń uzyskując następujące stężenia:
- 104 CFU/ml NaCl dla szczepów: 6, 7, 8, 9
- 105 CFU/ml NaCl dla szczepów: 1, 2, 3, 4, 5, 10, 11
Po zestaleniu podłoża nanoszono na płytkę po 2 μl zawiesiny bakteryjnej każdego szczepu otrzymując tym samym stężenia 102 CFU/ml dla szczepów: 6, 7, 8, 9 oraz 103 CFU/ml dla szczepów
PL 213 879 B1
1, 2, 3, 4, 5, 10, 11. Zawiesiny bakteryjne nanoszono na każdą płytkę w dwóch powtórzeniach. Inkubację prowadzono 16 godz. w temperaturze 35°C.
Stwierdzono aktywność inhibitora wobec szczepów wzorcowych: Proteus vulgaris NCTC 4635, wartość MIC 0,2 mg/ml; Bordetella bronchiseptica ATCC 4617, wartość MIC 0,2 mg/ml, Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637, wartość MIC 0,2 mg/ml. Dla pozostałych szczepów wartości MIC badanych próbek wynosiły >0,2 mg/ml.
Oznaczono aktywność inhibitora wobec bakterii metodą krążkowo-dyfuzyjną.
Do badań użyto szczepów: Proteus vulgaris NCTC 4635, Bordetella bronehiseptica ATCC 4617, Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637. Z 24 godz. hodowli bakterii sporządzono zawiesinę bakterii o gęstości 0,2 McF, którą następnie rozcieńczono stukrotnie. 0,1 ml tak przygotowanej zawiesiny bakterii posiano na płytkę z podłożem Muller-Hintona. Naniesiono krążki z badanymi frakcjami inhibitora i inkubowano w 35°C. Wynik odczytano po 15 i 18 godz.
Uzyskano następujące strefy zahamowania wzrostu przy stężeniu inhibitora 0,4 mg/krążek):
Proteus vulgaris NCTC 4635 - 20 mm (po 15 godz.), 19 mm (po 18 godz.);
Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 - 19 mm (po 15 godz.), 19 mm (po 18 godz.)
Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637 - 16 mm (po 15 godz.), 15 mm (po 18 godz.) Badanie aktywności przeciwgrzybiczej
Badano frakcje inhibitora po 2 etapie oczyszczania na kolumnie anionowymiennej, wykazujące wysoki procent zahamowania aktywności DD-peptydazy 64-575 II. Na płytce Petriego z podłożem stałym Sabouranda z 4% roztworem glukozy rozprowadzono zawiesinę Candida albicans ATCC 10231 o gęstości 0,02 McF. Następnie naniesiono krążki bibuły nasączone roztworem inhibitora (1 mg). Inkubację prowadzono w temp. 35°C przez 24 h. Inhibitor nie wykazuje aktywności przeciwgrzybiczej wobec Candida albicans ATCC 10231.
Charakterystyka inhibitora
1) Ciało stałe, barwa żółta.
2) Rozpuszczalność inhibitora.
Inhibitor jest rozpuszczalny w buforze fosforanowym o pH 7,2-8,0; rozpuszczalny w środowisku wodnym z niewielkim dodatkiem jonów K+, Na+. Rozpuszcza się także w metanolu, DMSO, ale w rozpuszczalnikach tych ulega degradacji. Nie jest rozpuszczalny w octanie etylu, chlorku metylenu, chloroformie, octanie amylu, acetonitrylu.
3) Stabilność inhibitora wobec β-laktamazy klasy A: inhibitor po 24 godz. inkubacji z β-laktamazą w temp. pokojowej wykazywał całkowitą stabilność inhibicji DD-peptydaz.
Literatura
1) Frere J.-M., et al. Exocellular DD-carboxypeptidases-transpeptidases from Streptomyces. Methods Enzymol., 1976, 45, 610-636.
2) O'Callaghan C.H., et al Novel method for detection of β-lactamase by using a chromogenic cephalosporin substrate. Antimicrob. Agents Chemother., 1972, 1, 283-288.

Claims (5)

1. Związek o wzorze:
lub jego farmaceutycznie dopuszczalna pochodna, zwłaszcza sól albo hydrat.
PL 213 879 B1
2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest to kwas 7-hydroksy-6-oxo-2,3,4,6-tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy.
3. Zastosowanie związku według zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania leku.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że wytwarzanym lekiem jest antybiotyk albo lek przeciwnowotworowy.
5. Zastosowanie szczepu Streptomyces sp. zdeponowanego w PCM pod numerem dostępu B/00017 do wytwarzania związku według zastrz. 1-2.
PL383211A 2007-08-28 2007-08-28 Nowy zwiazek oraz jego zastosowania PL213879B1 (pl)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL383211A PL213879B1 (pl) 2007-08-28 2007-08-28 Nowy zwiazek oraz jego zastosowania
US12/675,348 US8344146B2 (en) 2007-08-28 2008-08-27 Inhibitor of DD-peptidase and its use as antibiotic or anticancer drug
EP08828485A EP2222641A1 (en) 2007-08-28 2008-08-27 A new inhibitor of dd-peptidase and its use as antibiotic or anticancer drug
PCT/PL2008/050013 WO2009028972A1 (en) 2007-08-28 2008-08-27 A new inhibitor of dd-peptidase and its use as antibiotic or anticancer drug

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL383211A PL213879B1 (pl) 2007-08-28 2007-08-28 Nowy zwiazek oraz jego zastosowania

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL383211A1 PL383211A1 (pl) 2009-03-02
PL213879B1 true PL213879B1 (pl) 2013-05-31

Family

ID=40262300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL383211A PL213879B1 (pl) 2007-08-28 2007-08-28 Nowy zwiazek oraz jego zastosowania

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8344146B2 (pl)
EP (1) EP2222641A1 (pl)
PL (1) PL213879B1 (pl)
WO (1) WO2009028972A1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
EP2222641A1 (en) 2010-09-01
WO2009028972A1 (en) 2009-03-05
US20100286196A1 (en) 2010-11-11
US8344146B2 (en) 2013-01-01
PL383211A1 (pl) 2009-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUGHES et al. On the mode of action of pseudomonic acid: inhibition of protein synthesis in Staphylococcus aureus
Chandrakar et al. Actinomycin-producing endophytic Streptomyces parvulus associated with root of aloe vera and optimization of conditions for antibiotic production
Khebizi et al. Oligomycins A and E, major bioactive secondary metabolites produced by Streptomyces sp. strain HG29 isolated from a Saharan soil
KR20020082484A (ko) 세포분열 저해제 및 그의 제조방법
Sugie et al. CJ-21, 058, a new SecA inhibitor isolated from a fungus
JPH0794469B2 (ja) Ｎ−アシル化シクロヘキサペプチド化合物
CN107721972A (zh) 一类海洋真菌来源的二苯甲酮类衍生物及其制备方法和在制备抗结核药物中的应用
JP2002529478A (ja) 全ての微生物を検出するためのニトロクマリン
Ashraf et al. Production of a broad spectrum streptothricin like antibiotic from halotolerant Streptomyces fimbriatus isolate G1 associated with marine sediments
Chandrakar et al. Studies on the production of broad spectrum antimicrobial compound polypeptide (actinomycins) and lipopeptide (fengycin) from Streptomyces sp. K-R1 associated with root of Abutilon indicum against multidrug resistant human pathogens
Wang et al. The sucrose non-fermenting-1 kinase Snf1 is involved in fludioxonil resistance via interacting with the high osmolarity glycerol MAPK kinase Hog1 in Fusarium
Gerlach et al. Enzymatic synthesis of cyclopeptine intermediates in Penicillium cyclopium
NOBLE et al. G2201-C, a new cyclopentenedione antibiotic, isolated from the fermentation broth of Streptomyces cattleya
JPH0368570A (ja) 抗真菌薬
Schlumbohm et al. Chromophore activating enzyme involved in the biosynthesis of the mikamycin B antibiotic etamycin from Streptomyces griseoviridus.
Werner Uptake of indolmycin in gram-positive bacteria
Zhang et al. Efficient production of valinomycin by the soil bacterium, Streptomyces sp. ZJUT-IFE-354
PL213879B1 (pl) Nowy zwiazek oraz jego zastosowania
NOBLE et al. G7063-2, a new nitrogen-containing antibiotic of the epoxydon group, isolated from the fermentation broth of a species of Streptomyces
Solecka et al. A novel isoquinoline alkaloid, DD-carboxypeptidase inhibitor, with antibacterial activity isolated from Streptomyces sp. 8812. Part I: Taxonomy, fermentation, isolation and biological activities
Furukawa et al. FR258900, a Novel Glycogen Phosphorylase Inhibitor Isolated from Fungus No. 138354
Binod et al. Production of antibiotics by filamentous fungi
US5994543A (en) Antibiotic bravomicins
Li et al. Unveiling the role of diffusible signal factor-family quorum sensing signals in regulating behavior of Xanthomonas and Lysobacter
JP2001502182A (ja) 真核細胞過程のインヒビターを同定するための方法および培養細胞