PL215163B1 - Sposób wykrywania drobnoustroju w próbce, biosensor do wykrywania drobnoustroju w próbce i zestaw do wykrywania zakazenia rany - Google Patents
Sposób wykrywania drobnoustroju w próbce, biosensor do wykrywania drobnoustroju w próbce i zestaw do wykrywania zakazenia ranyInfo
- Publication number
- PL215163B1 PL215163B1 PL378052A PL37805204A PL215163B1 PL 215163 B1 PL215163 B1 PL 215163B1 PL 378052 A PL378052 A PL 378052A PL 37805204 A PL37805204 A PL 37805204A PL 215163 B1 PL215163 B1 PL 215163B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- peptide
- sample
- microorganism
- enzyme
- wound
- Prior art date
Links
- 102000014133 Antimicrobial Cationic Peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 108010050820 Antimicrobial Cationic Peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims abstract description 56
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims abstract description 56
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 53
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 23
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 27
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 27
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 20
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 19
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 18
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 13
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 7
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 6
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 claims description 5
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 claims description 5
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 5
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 claims description 5
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 68
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 58
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 37
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- POIUWJQBRNEFGX-XAMSXPGMSA-N cathelicidin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C1=CC=CC=C1 POIUWJQBRNEFGX-XAMSXPGMSA-N 0.000 description 11
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 10
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000741320 Homo sapiens Cathelicidin antimicrobial peptide Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 102100038608 Cathelicidin antimicrobial peptide Human genes 0.000 description 7
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 description 7
- 102000000541 Defensins Human genes 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 6
- -1 complement Proteins 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 5-(2-aminoethylamino)naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1S(O)(=O)=O SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 4
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 102000014509 cathelicidin Human genes 0.000 description 3
- 108060001132 cathelicidin Proteins 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 108700022109 ropocamptide Proteins 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N Gly-Lys-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- DMEYUTSDVRCWRS-ULQDDVLXSA-N Phe-Lys-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DMEYUTSDVRCWRS-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 102000018568 alpha-Defensin Human genes 0.000 description 2
- 108050007802 alpha-defensin Proteins 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 102000012265 beta-defensin Human genes 0.000 description 2
- 108050002883 beta-defensin Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical group OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSKWDEYBJACPBB-UHFFFAOYSA-N 5-(aziridin-1-ylsulfonyl)-n,n-dimethylnaphthalen-1-amine Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(=O)(=O)N1CC1 LSKWDEYBJACPBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- BVBKBQRPOJFCQM-DCAQKATOSA-N Arg-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BVBKBQRPOJFCQM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LKDHUGLXOHYINY-XUXIUFHCSA-N Arg-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N LKDHUGLXOHYINY-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- LLUGJARLJCGLAR-CYDGBPFRSA-N Arg-Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N LLUGJARLJCGLAR-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- LTCKTLYKRMCFOC-KKUMJFAQSA-N Asp-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LTCKTLYKRMCFOC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- UCHSVZYJKJLPHF-BZSNNMDCSA-N Asp-Phe-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O UCHSVZYJKJLPHF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 1
- 102100038326 Beta-defensin 4A Human genes 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108050006947 CXC Chemokine Proteins 0.000 description 1
- 102000019388 CXC chemokine Human genes 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N Caprylic acid Natural products CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N Glu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- ZIYGTCDTJJCDDP-JYJNAYRXSA-N Glu-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZIYGTCDTJJCDDP-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101000884714 Homo sapiens Beta-defensin 4A Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- PDTMWFVVNZYWTR-NHCYSSNCSA-N Ile-Gly-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PDTMWFVVNZYWTR-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIJVAFLRMVBHMU-KKUMJFAQSA-N Lys-Asp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O QIJVAFLRMVBHMU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IMAKMJCBYCSMHM-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IMAKMJCBYCSMHM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N Pro-Arg-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 102000006270 Proton Pumps Human genes 0.000 description 1
- 108010083204 Proton Pumps Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000012084 abdominal surgery Methods 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 108010051873 alkaline protease Proteins 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 102000007362 alpha-Crystallins Human genes 0.000 description 1
- 108010007908 alpha-Crystallins Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000011203 antimicrobial therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004082 barrier epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N benzyl(trichloro)silane Chemical compound Cl[Si](Cl)(Cl)CC1=CC=CC=C1 GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010007004 cathelin Proteins 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000004040 defense response to microbe Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000005003 food packaging material Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical class NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N n,n-dichlorotriazin-4-amine Chemical compound ClN(Cl)C1=CC=NN=N1 ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N n-hexanoic acid Natural products CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=C1 PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000003134 paneth cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002446 thrombocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności lub braku obecności jednego, lub więcej, drobnoustrojów w próbce, biosensor do wykrywania obecności lub braku obecności drobnoustroju w próbce i zestaw do wykrywania zakażenia rany zawierający taki biosensor.
Tło wynalazku
Zakażenie ran jest głównym źródłem wydatków na opiekę zdrowotną w Stanach Zjednoczonych. Około 5% wszystkich ran chirurgicznych zostaje zakażonych drobnoustrojami, a liczba ta jest znacząco wyższa (10-20%) dla pacjentów, u których przeprowadzano zabiegi chirurgiczne brzucha. Częstość kolonizacji bakteryjnej jest znacząco większa w środowisku szpitalnym, zarówno wśród pracowników jak i pacjentów. Co więcej, organizmy kolonizujące w środowisku szpitalnym są prawdopodobnie oporne na wiele rodzajów terapii przeciwbakteryjnej, co wiąże się z silną presją selekcyjną środowiska szpitalnego, gdzie antybiotyki są często stosowane. Na przykład gronkowce są zazwyczaj przenoszone jako nieszkodliwe komensale, jednakże w przypadku przerwania naskórka mogą powodować poważne zakażenie, nawet zakażenie zagrażające życiu gospodarza ludzkiego.
Przeciwbakteryjne peptydy obronne gospodarza rozpoznano jako cząsteczki efektorowe wrodzonego układu odpornościowego, które są uważane za integralne dla pierwszej linii obrony do zwalczania zakażenia drobnoustrojami. Takie peptydy przeciwdrobnoustrojowe są szeroko rozpowszechnione pomiędzy gatunkami. Te peptydy charakteryzują się własnościami kationowymi, które ułatwiają interakcje z fosfolipidami o ujemnym ładunku elektrycznym znajdującymi się w błonie drobnoustrojów. Wykazano, że peptydy przeciwdrobnoustrojowe zabijają poprzez permeabilizację błony organizmów drobnoustrojów. Na przykład, wykazano, że cząsteczki peptydów obronnych mogą agregować i tworzyć w podwójnej warstwie lipidowej kanały zależne od napięcia, powodując permeabilizację zarówno wewnętrznej jak i zewnętrznej błony drobnoustroju (Lehrer, R.I., J. Clin. Investigation., 84:553(1989)). Amfifilowy charakter tych cząsteczek ułatwia insercję reszt hydrofobowych do podwójnej warstwy lipidowej przez przyciąganie elektrostatyczne, podczas gdy reszty polarne sterczą w i ponad błonę.
Oporność na peptydy przeciwdrobnoustrojowe jest jednym z głównych czynników wirulencji dobrego patogenu. Drobnoustroje patogenne rozwinęły kilka mechanizmów, za pomocą których zwalczają działanie przeciwdrobnoustrojowe tych peptydów. Obejmują one (i) kowalencyjne przekształcenia cząsteczek anionowych w celu zredukowania ujemnego ładunku elektrycznego otoczki komórki bakteryjnej, (ii) wypływ peptydów przeciwdrobnoustrojowych przez pompy protonowe zależne od ruchu protonów, (iii) zmiana płynności błony i (iv) inaktywacja peptydów przeciwdrobnoustrojowych przez trawienie proteolityczne. Te mechanizmy oporności V peptydów prowadzą do powstania zakażenia w organizmie gospodarza.
Najczęstszą drogą zapobiegania takiemu zakażeniu jest profilaktyczne podawanie antybiotyków. Podczas gdy ta strategia jest zasadniczo efektywna, wywołuje ona niezamierzony efekt w postaci hodowania opornych szczepów bakterii. Należy unikać rutynowego stosowania antybiotyków w celach profilaktycznych z tego właśnie powodu, że pobudzają one wzrost opornych szczepów.
Zamiast rutynowego stosowania profilaktyki, lepiej jest raczej stosować zasady dobrej praktyki postępowania z ranami, tj. chronić przed bakteriami przed, w czasie i po zabiegach chirurgicznych obszary, które mogą zostać zakażone i uważnie monitorować pod kątem zakażenia miejsce rany. Zwykłe sposoby monitorowania obejmują ścisłą obserwację miejsca rany pod kątem powolnego gojenia się, objawów stanu zapalnego i ropy, jak równie mierzenie temperatury pacjenta pod kątem objawów gorączki. Niestety, wiele objawów staje się oczywistych dopiero wtedy, gdy zakażenie jest już rozwinięte. Co więcej, po wypisaniu pacjenta ze szpitala, staje się on odpowiedzialny za monitorowanie swojej opieki zdrowotnej a objawy zakażenia mogą być niewidoczne dla niewykwalifikowanego pacjenta.
System lub biosensor, który może wykrywać wczesne stadia zakażenia, zanim rozwiną się objawy, byłby korzystny zarówno dla pacjentów jak i pracowników opieki zdrowotnej. Jeżeli pacjent może po wypisie ściśle kontrolować stan rany, wtedy można rozpocząć odpowiednią terapię przeciwbakteryjną wystarczająco wcześnie, żeby zapobiec poważniejszemu zakażeniu.
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności lub braku obecności jednego, lub więcej, drobnoustrojów w próbce, gdzie jeden, lub więcej, drobnoustrojów wytwarza i/lub wydziela enzym, polegający na tym, że:
PL 215 163 B1
a) kontaktuje się próbkę ze znakowanym w wykrywalny sposób kationowym peptydem przeciwdrobnoustrojowym, przy czym kationowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy zawiera sekwencję oznaczoną NR ID. SEKW.: 1 albo NR ID. SEKW.: 2, i przy czym peptyd jest degradowalny przez enzym wytwarzany i/lub wydzielany przez drobnoustrój, w warunkach, które powodują degradację peptydu przez enzym; i
b) wykrywa się degradację lub brak degradacji peptydu, przy czym degradacja peptydu wskazuje na obecność drobnoustroju w próbce, i przy czym brak degradacji peptydu wskazuje na brak drobnoustroju w próbce;
przy czym drobnoustrój stanowią bakterie wybrane z grupy składającej się ze: Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis i Proteus mirabilis;
i przy czym jako próbkę stosuje się próbkę wybraną z grupy składającej się z płynu z rany i płynu ustrojowego.
Korzystnie kationowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy zawiera sekwencję oznaczoną NR ID. SEKW.: 3.
Korzystnie enzym jest wybrany z grupy składającej się z proteinazy, elastazy, proteazy i żelatynazy.
Korzystnie jako znakowany w wykrywalny sposób kationowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy stosuje się peptyd na podłożu stałym.
Korzystniej stosuje się podłoże stałe obejmujące materiał, który ma być wolny od zanieczyszczeń drobnoustrojami.
Korzystniej stosuje się podłoże stałe wybrane z grupy składającej się z opatrunku rany, pojemnika do przechowywania płynów ustrojowych, dysku, scope, sączka, soczewki, gąbki, materiału, papieru, szwu i tamponu.
Jeszcze korzystniej stosuje się pojemnik do przechowywania płynu ustrojowego wybrany z grupy składającej się z torebki do zbierania moczu, torebki do zbierania krwi, torebki do zbierania osocza, probówki, cewnika i studzienki mikropłytki.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto biosensor do wykrywania obecności lub braku obecności drobnoustroju w próbce, charakteryzujący się tym, że biosensor zawiera podłoże stałe wolne od zanieczyszczeń drobnoustrojowych i znakowany w wykrywalny sposób kationowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy, przy czym kationowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy zawiera sekwencję oznaczoną NR ID. SEKW.: 1 albo NR ID. SEKW.: 2, i przy czym peptyd ten jest przyłączony do podłoża stałego, i przy czym peptyd ten jest kowalencyjnie przyłączony do znacznika, który dostarcza wykrywalnego sygnału po degradacji tego peptydu przez enzym wydzielany przez ten drobnoustrój;
przy czym drobnoustrój stanowią bakterie wybrane z grupy składającej się ze: Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis i Proteus mirabilis;
i przy czym próbka wybrana jest z grupy składającej się z płynu z rany i płynu ustrojowego.
Korzystnie podłoże stałe jest wybrane z grupy składającej się z opatrunku rany, pojemnika do przechowywania płynów ustrojowych, dysku, scope, sączka, soczewki, gąbki, materiału, papieru, szwu i tamponu.
Korzystnie j pojemnik do przechowywania płynu ustrojowego jest wybrany z grupy składającej się z torebki do zbierania moczu, torebki do zbierania krwi, torebki do zbierania osocza, probówki, cewnika i studzienki mikropłytki.
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do wykrywania zakażenia rany, znamienny tym, że składa się z:
i) biosensora określonego w zastrz. 8, lub 9, lub 10 do wykrywania enzymu wytwarzanego i/lub wydzielanego przez drobnoustrój powodujący zakażenia; oraz ii) jednego lub więcej odczynników.
Niniejszy wynalazek obejmuje specyficzne i szerokie spektrum oznaczeń i biosensorów do wykrywania drobnoustrojów, np. patogennych bakterii w próbce. Kationowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe (ang. cationic anti-microbial peptides, CAMP) są cząsteczkami, które ulegają degradacji lub cięciu przez cząsteczki, np. enzymy takie jak proteinazy, które są wydzielane przez drobnoustroje, takie jak bakterie lub grzyby lub takie, które ulegają ekspresji na powierzchni komórek drobnoustrojów. Degradacja, lub cięcie jednego lub więcej CAMP (co prowadzi do inaktywacji CAMP), jak tutaj opisano, może służyć, jako marker do wykrywania obecności lub braku obecności drobnoustroju w próbce, na przykład w ranie lub płynie ustrojowym. Zgodnie z tym niniejszy wynalazek przedstawia sposób wykrywania obecności lub braku obecności jednego lub więcej drobnoustrojów w próbce przez wykrywanie obecności lub braku obecności degradacji jednego lub więcej CAMP przez enzym obecny w próbce, np. przez
PL 215 163 B1 proteinazę. W jednym aspekcie przedstawiono sposób wykrywania obecności lub braku obecności jednego lub więcej drobnoustrojów w próbce biologicznej, obejmujący etapy kontaktowania próbki ze znakowanym w wykrywalny sposób kationowym peptydem przeciwdrobnoustrojowym, który jest przekształcany (np. strukturalnie zmieniany), na przykład przez cięcie, opisany tutaj również jako peptyd ulegający degradacji, przez enzym wytwarzany i/lub wydzielany przez drobnoustrój, w warunkach, które powodują przekształcenie CAMP przez enzym i wykrywanie przekształcenia lub braku przekształcenia CAMP. W stosowanym tu znaczeniu termin przekształcenie oznacza degradację lub cięcie, przy czym CAMP jest degradowany (np. inaktywowany) z nietkniętego peptydu o charakterystycznej długości (np. określonej przez ustaloną dla tego CAMP liczbę reszt aminokwasowych) do dwóch lub więcej mniejszych fragmentów aminokwasowych. W wyniku degradacji CAMP na mniejsze fragmenty powstaje wykrywalny sygnał. Przekształcenie CAMP i wykrywanie sygnału wskazuje na obecność jednego lub więcej drobnoustrojów w próbce, a brak obecności degradacji CAMP (brak produkcji wykrywalnego sygnału) wskazuje na brak obecności drobnoustroju w próbce i/lub brak obecności enzymu, który jest specyficzny dla cięcia peptydu. Enzymy opisane zgodnie z wynalazkiem są zazwyczaj proteinazami, proteazami, elastazami, żelatynazami i innymi enzymami zaangażowanymi w degradację proteolityczną CAMP.
Należy zauważyć, że wiele różnorodnych organizmów może inaktywować (degradować) ten sam, lub zasadniczo podobny, CAMP. Tak, więc w szczególnym aspekcie bierze się pod uwagę szerokie spektrum oznaczeń, w których można wykrywać różne drobnoustroje przez degradację tylko jednego CAMP. Alternatywnie, można oznaczyć konsensusową sekwencję aminokwasową, która stymuluje sekwencję dwóch lub więcej CAMP, i działa zatem jak substrat dla więcej niż jednego drobnoustroju.
W innym aspekcie opisano zgodnie z wynalazkiem sposób diagnozowania obecności lub braku obecności zakażenia rany u podmiotu, obejmujący etapy a) kontaktowania próbki otrzymanej z rany podmiotu z jednym, lub większą liczbą znakowanych w wykrywalny sposób CAMP, które mogą ulec degradacji (są degradowalne) przez enzym wytwarzany i/lub wydzielany przez drobnoustrój w warunkach, które powodują przekształcenie CAMP przez enzym, i b) wykrywania przekształcenia lub braku przekształcenia CAMP. Przekształcenie CAMP wskazuje na obecność zakażenia rany u podmiotu, a brak przekształcenia CAMP wskazuje na brak zakażenia rany u podmiotu.
W innym aspekcie wynalazek obejmuje biosensor do wykrywania obecności lub braku obecności drobnoustroju w próbce, obejmujący podłoże stałe i jeden, lub więcej, znakowanych w wykrywalny CAMP, które mogą być degradowane przez enzym wytwarzany i/lub wydzielany przez drobnoustrój, w którym CAMP jest przyłączony do podłoża stałego. Przyłączanie może być osiągnięte na wiele sposobów przyłączania peptydów do podłóż stałych, znanych specjalistom w dziedzinie. Co istotne, przyłączanie musi nadal utrzymywać peptyd w konformacji, która jest odpowiednia do detekcji, tj. po degradacji generowany jest wykrywalny sygnał.
W jeszcze innym aspekcie, niniejszy wynalazek obejmuje zestaw do wykrywania zakażenia rany, obejmujący biosensor do wykrywania obecności lub braku obecności drobnoustroju w próbce i jeden lub więcej odczynników do wykrywania obecności drobnoustroju, które wywołują zakażenia ran. Na przykład, odczynnik może być stosowany do wykrywania enzymu wydzielanego przez drobnoustrój. W szczególności odczynnik może być stosowany do wykrywania przekształcenia CAMP biosensora.
CAMP (kationowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe) są zazwyczaj obecne w ranie i dlatego obecność drobnoustrojów patogennych, zdolnych do degradowania tych peptydów, może być stosowana jako marker zakażenia.
Krótki opis figur
Fig. 1A przedstawia względne pozycje miejsc cięcia w peptydzie LL-37 (NR ID. SEKW. 3). Przypuszczalny region przeciwbakteryjny peptydu LL-37 jest podkreślony (z Schmidtchen A. i wsp., 2002).
Fig. 1B i 1C pokazują sekwencję aminokwasów substratów peptydowych LL 1 i LL 2 (NR ID. SEKW. 4-5) stosowanych w oznaczeniach.
Fig. 2 jest wykresem pokazującym wyniki oznaczenia z zastosowaniem peptydu LL 1.
Fig. 3 jest wykresem pokazującym wyniki oznaczenia z zastosowaniem peptydu LL 2, który wydaje się być swoisty dla S. pyogenes.
Fig. 4 jest wykresem pokazującym wyniki oznaczenia z zastosowaniem peptydu LL 2 w płynie rany.
PL 215 163 B1
Szczegółowy opis wynalazku
U ludzi zidentyfikowano trzy typy peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Peptydy te są przywoływane tutaj jako kationowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe, lub CAMP.
Defensyny lub antybiotyki endogenne Defensyny są największą i najlepiej poznaną klasą peptydów przeciwdrobnoustrojowych wydzielanych przez komórki ssaków (neutrofile, jelitowe komórki Panetha i barierowe komórki nabłonka). Przeciwdziałają one zakażeniom bakteryjnym, grzybiczym, jak również wirusowym (Cole, A.M. i wsp. Biotechniques, 4:822(2000)) i dlatego służą jako pierwsza linia obrony przeciw patogenom inwazyjnym. Co więcej, uważa się, że poza obroną gospodarza defensyny odgrywają także rolę w chorobach zapalnych, gojeniu się ran i pobudzaniu adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej (Wetering V.S., i wsp., J. Allergy Clin. Immunol. 104:1131-1138 (1994)). Te kationowe białka/polipeptydy są bogate w argininę i mają sześć reszt cysteiny, które tworzą trzy wewnątrzcząsteczkowe mostki disiarczkowe - cecha charakterystyczna defensyn (Tang, Y.Q. i wsp., Science 286:498-502 (1999) i Lenova, L. i wsp., Proct. Natl. Acad. Sci., 99:1813 (2001)). Dotychczas w oparciu o rozmieszczenie reszt cysteiny, przyrównanie mostków disiarczkowych, zidentyfikowano trzy grupy defensyn ssaczych, które obejmują podrodzinę (i) a (ludzki peptyd neutrofilowy, ang. human heutrophil peptide, HNP), (ii) β (ludzkie beta-defensyny, ang. human beta-defensins, hBD-2) i (iii) ©(kolisty, lub 'theta' minidefensyna) (Tang, Y.Q. i wsp., Science 286:498-502 (1999)). Rola defensyn jako potencjalnego czynnika terapeutycznego została potwierdzona przez ostatnie dane Tanga i wsp., który wykazał bezpośrednie zaangażowanie α-defensyn w spowalnianie postępu zakażenia HIV u zakażonych osobników. Defensyny odgrywają także istotna rolę w zwalczaniu zakażenia E. coli.
Katelicydyny
Katelicydyny są grupą peptydów przeciwdrobnoustrojowych kodowanych wyłącznie w ssakach. Są dwuczęściowymi cząsteczkami z N-końcową domeną kateliny i C-końcową domeną przeciwdrobnoustrojową (LL-37). Katelicydyna u ludzi jest kodowana przez gen hCAP-18. Proteaza serynowa, proteinaza 3, ułatwia cięcie aktywnego peptydu LL-37 (przeciwdrobnoustrojowa domena hCAP-18), który wykazuje następnie aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko zarówno bakteriom Gramdodatnim, jak i bakteriom Gram-ujemnym (Sorensen, O.E. i wsp. Blood, 97:3951-3959 (2001)). Ostatnie badania wykazały, że przy eliminacji zakażeń bakteryjnych LL-37 może współdziałać z dobrze opisanym peptydem przeciwdrobnoustrojowym - α-defensyną. Oprócz obrony gospodarza, ta klasa kodowanych przez geny antybiotyków zaangażowana jest w dodatkowe funkcje, które obejmują aktywność chemotaktyczn ą, litogenezę i angiogenezę (Lehrer, R.I., i wsp., Curr. Opin. Immunol., 14:96 (2002) i Lehrer, R.I., i wsp., Curr. Opin. Hematol., 9:18-22(2002)). Ze względu na zaangażowanie tych peptydów w różnorodne funkcje, są one także nazywane wielofunkcyjnymi cząsteczkami efektorowymi.
Trombocydyny (trombocytowe białka bakteriobójcze)
Trombocydyny to skrócone wersje (delecje karboksykońcowe) chemokin CXC, które są uwalniane w czasie aktywacji płytek krwi, dlatego nazywają się trombocydynami (Zaat. i wsp. 1994). Poprzednio wykazano, że w modelach doświadczalnych in vitro eliminują one zakażenia paciorkowcowe, gronkowcowe i Candida (Dankert, J., i wsp., Infect. Immun., 63:663- 671 (1995)).
Degradacja CAMP przez proteinazy bakterii patogennych jest dość dobrze opisana. Wykazano wcześniej, że bakterie patogenne wydzielają proteinazy, takie jak elastazy, proteazy cysteinowe i proteinazy alkaliczne, które zmieniają odpowiedzi gospodarza podobnie jak kalikreiny, czynniki koagulacyjne, dopełniacz, cytokiny i antyproteinazy (Travis, J., Trends Microbiol., 3:405-407(1995)). Co interesujące, analizy płynów z ran wykazały obfitość produktów degradacji wyżej wymienionych czynników gospodarza. Wyniki te sugerują bezpośrednią rolę proteinaz w modulacji czynników gospodarza, co prowadzi do zwiększenia przeżywalności i proliferacji patogenu. Fakt, że proteinazy odgrywają znaczącą rolę w wirulencji drobnoustroju został ponadto potwierdzony przez ostatnie odkrycia in vitro, w których proteinazy wydzielane przez Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis i Streptococcus pyogenes degradują przeciwbakteryjne peptydy, w szczególności LL-37 (Schmidtchen, A., i wsp., Mol. Microbiol., 46:157-168(2002)). Ponadto płyn z rany z przewlekłego wrzodu u pacjenta zakażonego P. aeruginosa powodował zupełną degradację LL-37, podczas gdy płyn ze sterylnej rany nie wykazywał takiego efektu (Schmidtchen, A., i wsp., Mol. Microbiol., 46:157-168(2002)).
Na podstawie wiedzy na temat miejsc cięcia różnych proteinaz w LL-37 (figura 1A), wraz ze zrozumieniem, że wiele ludzkich patogenów może ciąć ten peptyd przeciwdrobnoustrojowy, stworzono
PL 215 163 B1 dwa warianty LL-37 (fig. 1B i C) i stosowano je jako substraty kandydujące do oznaczenia do wykrywania bakterii (np. S. pyogenes).
Enzymy opisane zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą przekształcać substraty przez cięcie, na przykład mogą przekształcać białka lub polipeptydy (np. CAMP) i takie przekształcenie można wykrywać w celu stwierdzenia obecności lub nieobecności patogenu w próbce. Jednym ze sposobów wykrywania przekształcenia substratu przez enzym jest znakowanie substratu za pomocą dwóch różnych barwników, z których jeden służy do wygaszania fluorescencji drugiego (zjawisko transferu energii rezonansu fluorescencji lub FRET), kiedy cząsteczki, na przykład, barwniki lub substancje kolorymetryczne są w bezpośredniej bliskości i są mierzone przez fluorescencję.
FRET to proces interakcji stanu pobudzenia zależny od odległości, w którym emisja jednej cząsteczki fluorescencyjnej jest sprzężona z pobudzeniem innej. Typowa para akceptor i donor przenosząca energię rezonansu składa się z kwasu 4-[[-(dimetyloamino)fenyl]azo]benzoesowego (Dabcyl) i kwasu 5-[(2-aminoetyloamino]naftalenosulfonowego (Edans). EDANS jest pobudzany przez naświetlanie światłem o długości 336 nm i emituje foton o długości fali 490 nm. Jeśli cząsteczka DABCYL znajduje się w obrębie 20 angstremów względem EDANS, to ten foton będzie wydajnie absorbowany. DABCYL i EDANS zostaną dołączone do przeciwnych końców substratu peptydowego. Jeśli substrat jest nienaruszony, to FRET będzie bardzo wydajny. Jeśli peptyd został przecięty przez enzym, dwa barwniki nie będą już w bezpośredniej bliskości i FRET stanie się niewydajny. Reakcję trawienia można obserwować poprzez albo obniżenie fluorescencji DABCYL, albo wzrost fluorescencji EDANS (utrata wygaszania).
Jeśli substrat, który ma być przekształcany jest białkiem, peptydem lub polipeptydem, substrat może być wytwarzany za pomocą standardowych technik rekombinacji białek (patrz, na przykład Ausubel i wsp., „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, (1998)). Ponadto, enzym opisany zgodnie z niniejszym wynalazkiem może być także wytwarzany za pomocą technik rekombinacji lub syntezy. Poprzez obszerne dostarczenie enzymów lub ich substratów można ustalić dokładne miejsce przekształcenia i jeśli zajdzie taka potrzeba można określić bardziej swoisty substrat enzymu. Ten substrat może być także stosowany w oznaczeniach na obecność bakterii patogennych.
Substraty są znakowane wykrywalnym znacznikiem i są stosowane do obserwacji interakcji pomiędzy enzymem a substratem oraz wykrywania każdego przekształcenia substratu, na przykład cięcia substratu lub znakowania wynikającego z takich interakcji. Przykłady wykrywalnych znaczników obejmują różne barwniki, które mogą być włączane do substratów, na przykład tych opisanych tutaj, znaczniki spinu, znaczniki antygenowe lub epitopowe, haptenowe, znaczniki enzymatyczne, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały chemiluminescencyjne, materiały bioluminescencyjne i materiały radioaktywne. Przykłady odpowiednich znaczników enzymatycznych obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, β-galaktozydazę i acetylocholinoesterazę; przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują umbelliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazinylamino fluoresceinę, chlorek dansylu i fikoerytrynę; przykład materiału chemiluminescencyjnego obejmuje luminol, przykłady materiałów bioluminescencyjnych obejmują lucyferazę, lucyferynę i ekworynę i przykłady odpowiednich materiałów radioaktywnych i OR ΊΟΊ OR O obejmują 125I, 131I, 35S i 3H. Inne przykłady wykrywalnych znaczników obejmują Biodipy, Pyrene, Texas Red, EDANS, Dansyl Aziridine, IATR i fluoresceinę. Estry sukcimidylowe, izotiocyjaniany i jodoacetamidy tych znaczników są również dostępne w handlu. Kiedy nie są stosowane wykrywalne znaczniki, aktywność enzymatyczna można określać przy użyciu innych odpowiednich sposobów, na przykład wykrywania miejsca cięcia substratu przy użyciu analizy elektroforetycznej lub innych sposobów znanych specjalistom w dziedzinie.
Jednym z przykładów wykrywalnego znacznika jest barwnik chromogenny, który pozwala obserwować hydrolizę substratu przez enzym bakteryjny. Przykładem takiego barwnika jest paranitrofenol. Barwnik sprzężony do cząsteczki substratu będzie bezbarwny aż do przekształcenia substratu przez wydzielany enzym, w którym to punkcie zmieni się na żółty. Postęp oddziaływań enzym-substrat może być monitorowany przez pomiar absorbancji na spektrofotometrze przy 415 nm. Specjalistom w tej dziedzinie znane są inne barwniki, które wytwarzają wykrywalne przekształcenia, np. widoczną zmianę koloru.
Próbką, w której jest wykrywana obecność lub brak obecności bakterii lub diagnozowane jest zakażenie rany może być na przykład rana, płyn ustrojowy taki jak krew, mocz, plwocina lub płyn z rany (na przykład ropa wytwarzana w miejscu rany). Próbką może być także cokolwiek, co może
PL 215 163 B1 zawierać bakterię na powierzchni i/lub wewnątrz, na przykład, opatrunek rany, cewnik, torebka na mocz, torebka na krew, torebka na osocze, dysk, scope, sączek, soczewka, gąbka, materiał, papier, szew, tampon, probówka, studzienka mikropłytki, płyn do soczewek kontaktowych, materiał, w który była zapakowana żywność lub wymaz z powierzchni pokoju lub budynku, na przykład badanego pokoju lub sali operacyjnej w zespole opieki zdrowotnej, łazienki, kuchni lub zakładu przetwarzającego lub wytwarzającego.
Niniejszy wynalazek dostarcza biosensora do wykrywania jednego lub więcej drobnoustrojów przez ich degradację jednego lub więcej CAMP jak tutaj opisano i do powiadamiania odbiorcy o obecności drobnoustrojów. Dostarczony jest także biosensor do zastosowania w zakładach opieki zdrowotnej, lub do zastosowania domowego, do wykrywania zakażonych ran, zawierający (jeden lub więcej) CAMP, który jest przyłączony do podłoża stałego od strony proksymalnej rany lub innego płynu ustrojowego, obserwowanego w celu monitorowania zanieczyszczenia bakteriami. Dogodnie CAMP jest związany kowalencyjnie ze znacznikiem, a zatem ma sygnał do wykrywania, który po degradacji znacznika substratu lub wewnętrznego wiązania substratu wskazuje na obecność drobnoustrojów.
Biosensor jest wytwarzany najpierw przez określenie CAMP, który ma być degradowany przez swoisty enzym charakterystyczny dla drobnoustroju, który ma być wykryty. Określony CAMP jest znakowany za pomocą jednego lub więcej, a dogodnie wielu, wykrywalnych znaczników, na przykład chromatogennymi lub fluorescencyjnymi grupami opuszczającymi. Na przykład, grupa znakująca dostarcza utajony sygnał, który jest aktywowany tylko wtedy, kiedy sygnał jest odłączony proteolitycznie od substratu lub jest hydrolizowany wewnątrz substratu. Chromatogenne grupy opuszczające obejmują, na przykład, grupy para-nitroanalidowe. Jeżeli CAMP wejdzie w kontakt z enzymem wydzielanym przez bakterie do rany lub innego płynu ustrojowego lub obecnym na powierzchni komórki bakteryjnej, enzym ten przekształca substraty w taki sposób, który powoduje wykrycie takiego przekształcenia, na przykład zmianę w absorbancji, która może być wykryta wzrokowo, jako zmiana koloru (na przykład na podłożu stałym takim jak opatrunek rany) lub za pomocą standardowych technik spektrofotometrycznych znanych w dziedzinie.
Biosensor jest podłożem stałym, na przykład opatrunkiem rany (takim jak bandaż lub gaza), dowolnym materiałem, który powinien być sterylny lub wolny od zanieczyszczenia drobnoustrojami, na przykład dyskiem, scope, sączkiem, soczewką, gąbką, materiałem, papierem lub szwem lub artykułem, który zawiera lub zbiera próbki (takim jak torebka na mocz, torebka na krew lub osocze, probówka, cewnik, tampon (gazik) lub studzienka mikropłytki).
Jeśli podłoże bezpośrednio kontaktuje się z raną lub próbką, to zazwyczaj podłoże stałe jest wytworzone z materiałów odpowiednich do sterylizacji. W jednej postaci realizacji biosensor bezpośrednio kontaktuje się z raną. W niektórych przypadkach stosowane jest sterylne pokrycie lub warstwa, by zapobiec zanieczyszczeniu rany lub płynu ustrojowego po takim bezpośrednim kontakcie. Jeśli stosuje się takie sterylne pokrycia, będą one miały takie własności, które pozwolą na ich sterylizację, jednak nie przeszkodzą w interakcji enzym/substrat. Dogodnie część biosensora, która wchodzi w kontakt z raną jest także nieprzylegająca po to, by pozwolić na łatwe usunięcie biosensora z powierzchni próbki. Na przykład, jeśli biosensor zawiera opatrunek rany, opatrunek kontaktuje się z raną przez wystarczający czas, by substrat enzymu wszedł w reakcję, następnie opatrunek zdejmuje się z rany bez powodowania dalszych uszkodzeń rany lub otaczającej ją tkanki.
Odpowiednio wyznakowane wykrywalnymi znacznikami CAMP, na przykład za pomocą barwnika chromogennego, i przyłączone lub włączone do aparatu z czujnikiem mogą działać, jako wskaźniki obecności lub braku obecności bakterii patogennych, które wydzielają wyżej wymienione enzymy. Kiedy stosowany jest więcej niż jeden CAMP, każdy może być znakowany tak, aby odróżnić go od innych (na przykład stosując różne wykrywalne znaczniki) i/lub każdy może być zlokalizowany w szczególnym regionie podłoża stałego.
CAMP z hydrofobowymi grupami opuszczającymi może być związany nie-kowalencyjnie z powierzchnią hydrofobową. Alternatywnie substraty hydrofilowe lub hydrofobowe mogą być sprzęgane z powierzchniami przez disiarczek lub aminę pierwszorzędową, grupy karboksylowe lub hydroksylowe. Sposoby sprzęgania substratów z podłożem stałym są znane w dziedzinie. Na przykład substraty fluorescencyjne i chromogenne mogą być sprzęgane z substratami stałymi z zastosowaniem nieistotnych zakończeń reaktywnych, takich jak wolne aminy, kwasy karboksylowe lub grupy SH, które nie mają wpływu na reakcję z patogenami rany. Wolne aminy mogą być sprzęgane z grupami karboksylowymi substratu przy zastosowaniu, na przykład, 10-krotnego molowego nadmiaru albo chlorowodorku N-etylo-N'-(3dimetyloaminopropylo)-karbodiimidu (EDC), albosulfonianu N-cykloheksylo-N'-2-(4'metylomorfolino) etylo
PL 215 163 B1 karbodiimidu-p-toluenu (CMC) na 2 godziny w 4°C w destylowanej wodzie doprowadzonej do pH 4,5, żeby stymulować reakcję kondensacji do utworzenia wiązania peptydowego. Grupy SH mogą być redukowane za pomocą DTT lub TCEP i wtedy sprzęgane do wolnej grupy aminowej na powierzchni przy użyciu kwasu N-e-maleimido heksanowego (Griffith, i wsp., Febs Lett., 134:261-263 (1981)).
Przykładami CAMP, które można zastosować zgodnie z wynalazkie to polipeptydy zawierające lub zasadniczo składające się z sekwencji aminokwasowych o NR ID. SEKW.: 1 EKIGKEFKRIVQ; NR ID. SEKW.: 2 VQRIKDFLRNLV i NR ID. SEKW.: 3 LLGDFFRKSKEKIGKE FKRIVQRIKDFLRNLVPRTES lub polipeptydy mające co najmniej 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% lub 99% identyczność sekwencji z NR ID. SEKW. 1-3, jak ustalono stosując program porównywania sekwencji i parametrów znanych specjalistom w dziedzinie.
Polipeptydy opisane zgodnie z wynalazkiem obejmują także fragmenty i warianty sekwencji opisanych wyżej polipeptydów i także warianty NR ID. SEKW.: 1, 2 lub 3. Warianty obejmują zasadniczo homologiczne polipeptydy kodowane przez to samo genetyczne lokus w organizmie, to znaczy wariant alleliczny, jak również inne warianty. Warianty obejmują także polipeptydy pochodzące z innych Ioci genetycznych w organizmie, ale mające istotną homologię do polipeptydu o NR ID. SEKW.: 1, 2 lub 3. Warianty obejmują także polipeptydy istotnie homologiczne lub identyczne z tymi polipeptydami, ale pochodzące z innego organizmu, to znaczy ortologi. Warianty obejmują także polipeptydy, które są istotnie homologiczne lub identyczne z tymi polipeptydami, które są wytwarzane za pomocą syntezy chemicznej. Warianty obejmują także polipeptydy, które są istotnie homologiczne lub identyczne z tymi polipeptydami, które są wytwarzane metodami rekombinacji.
Procent identyczności dwóch sekwencji aminokwasowych można oznaczać przez dopasowanie sekwencji w celu optymalnego porównania (np. można wprowadzić przerwy w sekwencji pierwszej sekwencji). Następnie porównywane są aminokwasy w odpowiadających pozycjach a procent identyczności między dwiema sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji w tych sekwencjach (tj. % identyczności = # identycznych pozycji/całkowitą # pozycji x 100). W pewnych postaciach, długość przyrównanej w celu porównywania sekwencji stanowi przynamniej 30%, dogodniej przynamniej 40%, jeszcze dogodniej przynamniej 60% a nawet jeszcze dogodniej przynamniej 70%, 80%, 90% lub 100% długości sekwencji odniesienia. Rzeczywiste porównanie dwóch sekwencji można zrealizować dobrze znanymi sposobami, na przykład przy użyciu algorytmu matematycznego. Zalecany nieograniczaj ący przykład takiego algorytmu matematycznego jest opisany w Karlin, i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993). Taki algorytm jest włączony do programu BLAST (wersja 2,2) jak opisano w Schaffer, i wsp., Nucleic Acids Res. 29:2994-3005 (2001). Podczas używania programów BLAST i Gapped BLAST można stosować parametry domyślne poszczególnych programów. W pewnej realizacji przeszukiwana baza danych jest bazą danych bez redundancji (NR), a parametry do porównania sekwencji można ustawić następująco: bez filtrów; wartość oczekiwana 10; wielkość słowa 3; macierz BLOSUM62 i kara za przerwę 11 i kara za wydłużenie 1.
W innej postaci procent identyczności między dwiema sekwencjami aminokwasowymi można oznaczyć przy użyciu programu GAP w pakiecie oprogramowania GCG (Accelrys Inc., San Diego California) stosując albo macierze Blossom 63 albo macierze PAM250 i wagi przerw 12, 10, 8, 6 lub 4 i wagi długości 2, 3 lub 4. W jeszcze innej postaci procent identyczności między dwiema sekwencjami kwasu nukleinowego można określić przy użyciu programu GAP w pakiecie oprogramowania GCG (dostępne na http://www.cgc.com), stosując wagi przerw 50 i wagi długości 3.
Opisano tu także peptydy mające mały stopień identyczności, ale mające wystarczające podobieństwo, żeby spełniać jedną lub więcej tych samych funkcji spełnianych przez polipeptyd, np. zdolność działania jako CAMP. Podobieństwo jest zdeterminowane przez konserwatywne podstawienia aminokwasów. Takie podstawienia są tymi, które podstawiają dany aminokwas w polipeptydzie innym aminokwasem o podobnej charakterystyce. Podstawienia konserwatywne prawdopodobnie są fenotypowo milczące. Jako podstawienia konserwatywne typowo traktowane są zastąpienia, jeden za drugi, między aminokwasami alifatycznymi Ala, Val, Leu i Ile; wzajemna zamiana reszt hydroksylowych aminokwasów Ser i Thr; wymiana reszt kwasowych aminokwsów Asp i Glu; podstawienie między resztami aminokwasów amidowych Asn i Gin; wymiana reszt aminokwasów zasadowych Lys i Arg i zamiana między resztami aminokwasów aromatycznych Phe i Tyr. Wskazówki dotyczące kwestii, które zmiany aminokwasów są prawdopodobnie fenotypowo milczące podane są w Bowie i wsp., Science 247: 1306-1310, 1990).
Warianty funkcjonalne mogą także zawierać podstawienia podobnych aminokwasów, w wyniku których nie powstają zmiany lub powstają tylko nieistotne zmiany funkcji. Alternatywnie, takie podstawienia
PL 215 163 B1 mogą do pewnego stopnia, pozytywnie lub negatywnie, zmieniać funkcje. Warianty inne niż funkcjonalne typowo zawierają jedno lub więcej niekonserwatywnych podstawień aminokwasów, delecji, insercji, inwersji lub cięć lub podstawień, insercji, inwersji lub delecji w krytycznych resztach lub krytycznych regionach. Takie krytyczne regiony obejmują miejsca cięcia CAMP.
Aminokwasy w polipeptydzie tu opisanym, które są istotne dla cięcia przez enzym, a zatem degradacji, mogą być identyfikowane sposobami znanymi w tej dziedzinie, takimi jak miejscowo ukierunkowana mutageneza lub skaningowa mutageneza alaninowa (Cunningham i wsp., Science, 244: 1081-1085, 1989). Ta ostatnia procedura wprowadza pojedynczą mutację alaniny w każdej reszcie w cząsteczce (jedna mutacja na cząsteczkę).
Opisano tu także fragmenty polipeptydowe o sekwencji aminokwasowej o NR ID. SEKW.: 1, 2 lub 3 lub ich funkcjonalne warianty. Fragmenty mogą pochodzić z polipeptydów obejmujących NR ID. SEKW. 1, 2 lub 3, w których te fragmenty zawierają co najmniej jedno miejsce reakcji enzymatycznej (np. miejsce enzymatycznego cięcia przez proteinazę). Opisano tu także fragmenty wariantów opisanych tutaj polipeptydów. Użyteczne fragmenty obejmują te, które zachowały zdolność do działania jako substraty dla enzymu mającego zdolność degradowania CAMP. Fragmenty mogą być oddzielne (nieprzyłączone do innych aminokwasów lub polipeptydów) lub mogą być wewnątrz większego polipeptydu. Ponadto, kilka fragmentów może być zawartych wewnątrz pojedynczego większego polipeptydu. W pewnej realizacji fragment zaprojektowany do ekspresji w gospodarzu może mieć heterologiczne pre i pro polipeptydowe regiony przyłączone do końca aminowego fragmentu polipeptydowego i dodatkowo region przyłączony do końca karboksylowego fragmentu polipeptydu.
Biosensory będące przedmiotem niniejszego - wynalazku mogą być zastosowane w jakiejkolwiek sytuacji, gdy pożądane jest wykrycie obecności lub braku obecności bakterii, w szczególności bakterii patogennych, wirusów i grzybów. Na przykład bakterie, które zbierają się na powierzchniach do pracy w budynkach opieki zdrowotnej, a w szczególności w salach operacyjnych, jak opisano tutaj, mogą być wykrywane za pomocą opisanego tu biosensora. CAMP, lub więcej niż jeden CAMP, który może być przekształcany przez enzym wydzielany przez bakterie lub obecny na powierzchni bakterii jest znakowany i związany kowalencyjnie z substratem zbierającym, takim jak włókno bawełniane na końcu tamponu. Kiedy jest stosowany więcej niż jeden CAMP, każdy może być znakowany, tak by odróżnić go od innych (na przykład stosując różne wykrywalne znaczniki) i/lub każdy może być zlokalizowany w konkretnym regionie podłoża stałego. Koniec tamponu jest używany do wycierania powierzchni podejrzewanej o skażenie bakteriami. Koniec tamponu jest umieszczany w pożywce i inkubowany w warunkach, które pozwalają na przekształcenia znakowanych CAMP, jeśli jest obecny enzym swoisty dla związanego znakowanego CAMP.
Niniejszy wynalazek dotyczy także zestawu do wykrywania opisanych tutaj bakterii swoistych dla ran. Zestaw może zawierać podłoże stałe, na przykład mające wiele studzienek (np. płytka do mikromiareczkowania), do którego jest przyłączony, sprzężony lub przymocowany wykrywalny, znakowany substrat. Dostarczane są środki do dostarczania jednego lub więcej roztworów buforów. Dostarczane są także kontrola ujemna i/lub kontrola dodatnia. Odpowiednie kontrole mogą być łatwo wywiedzione przez specjalistę w tej dziedzinie. Opisana tutaj próbka, podejrzana o skażenie patogenem, jest przygotowywana przy użyciu roztworu(roztworów) buforu. Porcje próbki, kontroli ujemnej i dodatniej są umieszczane w oddzielnych studzienkach, żeby reagowały. Te studzienki, w których obserwuje się przekształcenie substratu, na przykład zmianę koloru, są oznaczane, że zawierają patogen bakteryjny. Taki zestaw jest szczególnie użyteczny do wykrywania zakażenia rany u podmiotu.
Niniejszy wynalazek dotyczy także zestawu, który zawiera biosensor, taki jak zapakowany sterylny opatrunek rany lub sensor do materiału do pakowania żywności, i wszystkie dodatkowe odczynniki niezbędne do wykonania oznaczenia detekcji.
Sposób przeprowadzania oznaczania wykrywania drobnoustroju patogennego, który wytwarza co najmniej jeden enzym, który jest wydzielany przez komórkę lub jest obecny na powierzchni komórki i jest w stanie degradować CAMP oraz sposób stosowania oznaczenia do wykrywania drobnoustrojów wytwarzających enzym (enzymy) są następujące:
Etap 1) oznaczanie sekwencji aminokwasowej, która unikalnie identyfikuje drobnoustrój prokariotyczny, będący przedmiotem zainteresowania. Alternatywnie, można oznaczać (jedną lub więcej) sekwencję aminokwasową, która jest unikalna dla specyficznej grupy patogenów swoistych dla zakażenia rany.
Selekcja sekwencji aminokwasowej, na przykład białka, peptydu lub polipeptydu (sekwencja znacznikowa), która unikalnie charakteryzuje lub znakuje obecność będącego przedmiotem zainteresowania
PL 215 163 B1 drobnoustroju lub grupy drobnoustrojów (na przykład patogenów charakterystycznych dla rany). Selekcja może być przeprowadzona, na przykład, przy użyciu podejścia bioinformatycznego jak dokładnie opisano poniżej. Określa się jedną lub więcej sekwencji aminokwasowych, które są unikalne dla specyficznego drobnoustroju prokariotycznego.
Etap 2) Otrzymanie wystarczającej ilości enzymu do oznaczenia warunków ułatwiających optymalne przekształcanie substratu przez enzym.
Izolowanie enzymu ze środowiska pozakomórkowego, w którym rosną bakterie patogenne, które mają być analizowane lub z błony komórkowej bakterii stosując standardowe techniki oczyszczania białka opisane na przykład w Ausubel (powyżej).
Alternatywnie, w przypadku gdy sekwencja genetyczna kodująca enzym lub umiejscowienie sekwencji genetycznej kodującej enzym są nieznane, izolowanie i klonowanie sekwencji genetycznej kodującej znacznikowy aminokwas według etapu 1, lub najpierw oznaczenie sekwencji genetycznej a następnie postępowanie jak poprzednio.
Etap 3) oznaczanie warunków wzrostu organizmu prokariotycznego i wytwarzania enzymu obecnego na powierzchni komórki lub wydzielanego przez komórkę.
Oznaczanie pożywki wymaganej do wzrostu będącego przedmiotem zainteresowania specyficznego drobnoustroju prokariotycznego i do ekspresji jego enzymu o unikalnej aktywności do środowiska. Także oznaczanie czy druga cząsteczka, na przykład enzym, jest wymagana do przekształcenia specyficznego enzymu z formy nieaktywnego prekursora, w formę aktywną. Do oznaczenia czy enzym został wydzielony w formie aktywnej, dostarczana jest próbka hodowli bakteryjnej z wybranymi potencjalnymi substratami i oznaczane jest cięcie tych substratów. Można to przeprowadzić, na przykład, przez łączenie bakterii, która wytwarza enzym z substratem w odpowiedniej pożywce i inkubowanie w 37°C z łagodnym wytrząsaniem. Po upływie ustalonego wcześniej czasu (0,1; 0,3; 1,0; 3,0; 5,0; 24 i 48 godzin) próbki są wirowane w celu osadzenia bakterii na dnie i mała porcja jest przenoszona na próbkę żelu SDS-PAGE. Po upłynięciu czasu, próbki są puszczane w 10-15% gradiencie na miniżelu SDS-PAGE. Następnie białka są przenoszone do Immobilon Pseq (bufor do przenoszenia; 10% CAPS; 10% metanol; pH 11,0; 0,15 V przez 30 minut) używając aparatu Bio-Rad do półsuchego transblottingu. Po przeniesieniu białek, plama jest znakowana Comassie blue R-250 (0,25% Comassie Brillant Blue R250; 50% metanol; 10% kwas octowy) i odbarwiana (silne odbarwianie przez 5 min, 50% metanol; 10% kwas octowy; słabe odbarwianie dopóki nie będzie kompletne, 10% metanol; 10% kwas octowy), po czym następuje sekwencjonowanie od N-końca. Alternatywnie próbki mogą być puszczone na spektrometr masowy w celu mapowania miejsc cięcia proteolitycznego przy użyciu spektrometru Voyager Elite Mass (Perceptive Biosystems).
Etap 4) Identyfikacja każdego specyficznego kationowego, przeciwdrobnoustrojowego substratu peptydowego (substratów peptydowych) aktywnego enzymu. Znakowanie każdego substratu za pomocą wykrywalnych znaczników, na przykład opisanych tutaj wykrywalnych znaczników lub innym wykrywalnym znacznikiem znanym w dziedzinie.
Etap 5) Zwiększanie specyficzności interakcji enzym-substrat (opcjonalnie) przez oznaczanie miejsca aktywnego lub miejsca wiążącego enzymu (na przykład stosując FRET, jak to opisano powyżej), następnie oznaczanie sekwencji genetycznej użytecznej do wytwarzania miejsca aktywnego lub wiążącego i klonowanie określonej sekwencji genetycznej w celu wytworzenia bardziej specyficznego substratu.
Etap 6) Dostarczanie biosensora zawierającego jeden lub więcej zidentyfikowanych powyżej, znakowanych w wykrywalny sposób substratów w celu detekcji proteazy bakterii patogennych, które są przedmiotem zainteresowania.
Substrat może być przymocowany do stałego podłoża, na przykład opatrunku rany lub artykułu, który zawiera enzym i substrat, na przykład torebki lub probówki do zbierania płynów ustrojowych, studzienki mikropłytki lub probówki. Stałe podłoże, jeżeli jest to pożądane, może dostarczać na derywatyzowanych płytkach wielu derywatyzowanych miejsc wiążących do sprzęgania substratu, na przykład miejsca pierwszorzędowej aminy znakowane estrem sukcymidylowym (Xenobind plates, Xenopore).
Opcjonalnie, niezajęte reaktywne miejsca na podłożu stałym są blokowane przez sprzęganie z albuminą surowicy wołowej lub aktywną domeną p26, p26 jest białkiem typu alfa-krystaliny, które w tym przypadku jest stosowane do zmniejszania niespecyficznej agregacji białka. Zdolność białka p26 do ponownego zwijania zdenaturowanej termicznie syntetazy cytrynianowej przed i po sprzęganiu do powierzchni opakowań do żywności jest stosowane jako kontrola do oznaczania aktywności p26. Białka typy alfa-krystaliny były wytwarzane techniką rekombinacji, przy użyciu standardowych technik
PL 215 163 B1 rekombinacji DNA (patrz Ausubel, powyżej). W skrócie, plazmid zawierający domenę rdzeniową naładowanej beta kartki p2 6 jest elektroporowany do komórek elektrokompetentnych BL21(DE3) (Bio-Rad E.coli pulser). Komórki są hodowane do OD600 0,8, następnie indukowane 1 mM IPTG przez 4 godziny. Komórki są wirowane i sonikowane w słabym buforze (10 mM Tris, pH 8,0; 500 mM NaCl; 50 mM Imidazol) w celu zlizowania (Virsonic, Virtis, Gardiner, New York). Lizat jest wirowany przy 13 000 x g przez 10 minut i supernatant jest sączony przez 0,45 i 0,2 μm. Przesącz jest ładowany na kolumnę superose NI-NTA (Qiagen, Valencia, California, cat # 30410). Do eluowania białka używany jest silny bufor (10 mM Tris pH 8,0; 500 mM NaCl, 250 mM imidazol).
Tak jak tutaj opisano, należy pozwolić enzymowi, by wszedł w kontakt z substratem i obserwować reakcję przekształcenia w substracie, który jest znakowany w wykrywalny sposób. Przekształcanie substratu wskazuje, że enzym wytwarzany/wydzielany przez bakterie jest obecny w reakcji. Dodatkowo, nieobecność przekształcenia substratu wskazuje na brak enzymu w próbce. Jeżeli bakterie lub enzym pochodzą z rany, przekształcanie substratu wskazuje, że bakteria jest obecna w ranie i że rana jest zakażona, podczas gdy brak przekształcenia substratu wskazuje, że konkretna bakteria nie jest obecna w ranie i że rana nie jest zakażona tą bakterią.
P r z y k ł a d y
Niniejszy wynalazek będzie teraz zilustrowany następującymi przykładami, których zamiarem nie jest, by były one ograniczające w jakikolwiek sposób.
P r z y k ł a d 1: Oznaczenia do wykrywania
Dwa substraty peptydowe, LL 1 i LL 2, syntetyzowano tak, by zawierały wszystkie miejsca cięcia LL-37 jak pokazano na figurach 1A, 1B i C. Stosowane tutaj substraty peptydowe znakowano za pomocą sondy fluorescencyjnej edans (kwas 5-((2-aminoetylo)amino)naftaleno-1-sulfonowy) i cząsteczek barwnika wygaszającego dabcyl (kwas(4-(4-(dimetylamino)fenylo)azo)benzoesowy).
Bakterie hodowano przez noc w inkubatorze w 37°C w 5 ml pożywek BHI (Brain Heart Infusion). Każdą z powstałych hodowli rozdzielono na dwie próbki. Jedną stosowano od razu, a drugą odwirowano i zebrano supernatant. Oznaczenia przeprowadzono w 20 mM buforze Tris (pH 7,4) z dodatkiem 150 mM NaCl. Reakcję przeprowadzano z użyciem 7 μl hodowli lub supernatantu i 3 μl substratu peptydowego (5 mg/ml w wodzie) w 100 μl całkowitej objętości w 37°C. Po reakcji wykonywano odczyt we fluorymetrycznym czytniku płytek, stosując falę wzbudzenia o długości 355 nm i falę emisji o długości 485 nm.
Pierwszy zestaw doświadczeń przeprowadzono przez dodanie hodowli bakteryjnej (pożywek i komórek) bezpośrednio do roztworu do oznaczenia. Jeśli proteaza jest przyłączona do błony komórkowej, nie należy oczekiwać, że znajdzie się ją wydzieloną do pożywki. Zatem obecność komórek byłaby niezbędna. W oznaczeniu zastosowano peptyd LL 1 jako substrat, a wyniki pokazano na figurze 2.
Komórki bakteryjne stosowane w tych oznaczeniach hodowano do fazy stacjonarnej w pożywce Brain Heart Infusion (BHI). W skrócie, 7 μl hodowli bakteryjnej inkubowano z 3 μl substratu peptydowego LL 1 i 92 μl buforu fosforanowego o pH 7,2. Reakcję kontynuowano w 37°C na czytniku do płytek do mikromiareczkowania zawierających 96 studzienek stosując fale wzbudzenia i emisji o długości, odpowiednio, 355 nm i 538 nm. Reakcję monitorowano przez okres 1 godziny i przedstawiono na wykresie za pomocą oprogramowania KaleidaGraph. Bufor 20 mM bufor Tris (pH 7,4) z 150 mM NaCl. Nie było reakcji krzyżowej z Pseudomonas.
Zaobserwowano pewną aktywność proteazy z tym peptydem zarówno dla S. pyogenes, jak i Pseudomonas. Ponadto niewielką część aktywności zaobserwowano także dla Serratia. Reakcję powtórzono z supernatantem bakteryjnym i wyniki były podobne do S. pyogenes, ale reakcja z Pseudomonas była zredukowana po usunięciu komórek z oznaczenia.
Oznaczenie powtórzono stosując identyczne warunki z peptydem LL 2.
Komórki bakteryjne stosowane w tym oznaczeniu hodowano do fazy stacjonarnej w pożywce Brain Heart Infusion (BHI). Oznaczenie przeprowadzono jak opisano wcześniej.
Wyniki otrzymane z LL 2 (pokazane na fig. 3) były podobne do wyników otrzymanych z LL 1, za wyjątkiem tego, że okazało się, że całkowita reaktywność była nieco zredukowana. Oznaczenia prowadzone z komórkami i supernatantem dały podobną krzywą dla S. pyogenes, jednakże aktywność dla Pseudomonas była zredukowana po usunięciu komórek z oznaczenia.
P r z y k ł a d 2: Test z płynem z rany świni
W celu przetestowania reaktywności krzyżowej w ranie, oznaczenia przeprowadzano w odpowiednich warunkach fizjologicznych. Oznaczenia na LL 1 i LL 2 przeprowadzano z zastosowaniem ekstraktu płynu z rany świni zamiast buforu reakcyjnego.
PL 215 163 B1
Natychmiast po operacji, aby stworzyć częściową grubość ran do badania czucia, opatrunek z gazy położono na ranie. Po pewnym czasie opatrunek zdjęto, zapakowano i umieszczono w zamrażalniku w temperaturze -80°C. Wchłonięty płyn rany odzyskano z opatrunku przez inkubację w 10 ml buforu (0,1 M Tris-HCl, pH 7,4 z 0,1% Triton X-100). Opatrunek inkubowano na obu stronach przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i wyciśnięto.
Otrzymany płyn rozdzielono do probówek o jednakowej objętości i zamrożono w temperaturze -20°C.
Bakterie hodowano w inkubatorze przez noc w 37°C w 5 ml pożywek BHI (Brain Heart Infusion). Każdą z otrzymanych hodowli odwirowano i zebrano supernatant. Oznaczenia przeprowadzono na świeżo rozmrożonym płynie z rany. Reakcję przeprowadzono z użyciem 7 μΐ hodowli lub supernatantu i 3 μΐ substratu peptydowego (5 mg/ml w wodzie) w 37°C, przy czym całkowita objętość wynosiła 100 pi. Reakcję kontynuowano na czytniku płytki fluorymetrycznej stosując falę wzbudzenia o długości 355 nm i falę emisji o długości 485 nm.
Oznaczenie proteazy prowadzono stosując peptyd LL 2, wcześniej określony jako substrat dla S. pyogenes i dla Pseudomonas. Wyniki pokazano na fig. 4.
Komórki bakteryjne stosowane w tym oznaczeniu hodowano do fazy stacjonarnej w pożywce Brain Heart Infusion (BHI). W skrócie, 5 μΐ hodowli bakteryjnej inkubowano z 3 μΐ substratu peptydowego LL 2 i 92 μΐ sterylnego płynu z rany. Reakcję kontynuowano w 37°C na czytniku do płytek do mikromiareczkowania o 96 studzienkach, stosując falę wzbudzenia i emisji o długości, odpowiednio, 355 nm 538 nm. Reakcję monitorowano przez okres 1 godziny i przedstawiono na wykresie używając oprogramowania KaleidaGraph.
Oznaczenie na płynie z rany dało podobne wyniki dla S. pyogenes, ale Pseudomonas nie miała żadnej aktywności powyżej tła. Takie same wyniki otrzymano, kiedy oznaczenie powtórzono z supernatantem bakteryjnym.
Chociaż ten wynalazek przedstawiano i opisywano z odnośnikami do korzystnych postaci realizacji tego wynalazku, będzie zrozumiałe dla specjalistów w dziedzinie, że można dokonać różnorodnych zmian w formie i szczegółach tego wynalazku bez odstępstwa od zakresu wynalazku obejmującego dołączone zastrzeżenia.
PL 215 163 B1
Lista sekwencji <110> Expressive Constructs, Inc.
Sanders, Mitchell C.
Colpas, Gerard J.
Sebastian, Shite Ellis-Busby, Dianę L, <120> Sposób wykrywania drobnoustroju w próbce, bioaensor do wykrywania drobnoustroju w próbce i zestaw do wykrywania zakażenia rany <130> 3255.1009002 <150> 60/444,521 <151> 2003-01-31 <160> 5 <17G> FastSEG dla Windows wersja 4.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Nieznana <220>
<223> Sztuczna <400> 1
Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gin 15 10 <210> 2 <211> 12 <2I2> PRT <2l3> Nieznana <22Q>
<223> Sztuczna <400> 2 .
Val Gin Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 15 10 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Nieznana <220>
<223> Sztuczna <400> 3
| Leu | Leu | Gly | Asp | Phe | Phe | Arg | Lys | Ser | Lys | Glu | Lys | Ile | Gly | Lys | Glu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Phe | Lys | Arg | Ile | Val | Gin | Arg | Ile | Lys | Asp | Phe | Leu | Arg | Asn | Leu | Val |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Pro | Arg | Thr | Glu | Ser |
PL 215 163 B1 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Nieznana <220>
<223> Sztuczna <400> 4
Lys Glu X>ys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gin Glu 15 10 <210 5 <211> 14 <212> PRT <213> Nieznana <220 <223> Sztuczna <400 5
Lys Val Gin Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Glu
Claims (11)
1. Sposób wykrywania obecności lub braku obecności jednego, lub więcej, drobnoustrojów w próbce, gdzie jeden, lub więcej, drobnoustrojów wytwarza i/lub wydziela enzym, znamienny tym, że:
a) kontaktuje się próbkę ze znakowanym w wykrywalny sposób kationowym peptydem przeciwdrobnoustrojowym, przy czym kationowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy zawiera sekwencję oznaczoną NR ID. SEKW.: 1 albo NR ID. SEKW. : 2, i przy czym peptyd jest degradowalny przez enzym wytwarzany i/lub wydzielany przez drobnoustrój, w warunkach, które powodują degradację peptydu przez enzym; i
b) wykrywa się degradację lub brak degradacji peptydu, przy czym degradacja peptydu wskazuje na obecność drobnoustroju w próbce, i przy czym brak degradacji peptydu wskazuje na brak drobnoustroju w próbce;
przy czym drobnoustrój stanowią bakterie wybrane z grupy składającej się ze: Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis i Proteus mirabilis;
i przy czym jako próbkę stosuje się próbkę wybraną z grupy składającej się z płynu z rany i płynu ustrojowego.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kationowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy zawiera sekwencję oznaczoną NR ID. SEKW.: 3.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że enzym jest wybrany z grupy składającej się z proteinazy, elastazy, proteazy i żelatynazy.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako znakowany w wykrywalny sposób kationowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy stosuje się peptyd na podłożu stałym.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się podłoże stałe obejmujące materiał, który ma być wolny od zanieczyszczeń drobnoustrojami.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się podłoże stałe wybrane z grupy składającej się z opatrunku rany, pojemnika do przechowywania płynów ustrojowych, dysku, scope, sączka, soczewki, gąbki, materiału, papieru, szwu i tamponu.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się pojemnik do przechowywania płynu ustrojowego wybrany z grupy składającej się z torebki do zbierania moczu, torebki do zbierania krwi, torebki do zbierania osocza, probówki, cewnika i studzienki mikropłytki.
PL 215 163 B1
8. Biosensor do wykrywania obecności lub braku obecności drobnoustroju w próbce, znamienny tym, że biosensor zawiera podłoże stałe wolne od zanieczyszczeń drobnoustrojowych i znakowany w wykrywalny sposób kationowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy, przy czym kationowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy zawiera sekwencję oznaczoną NR ID. SEKW.: 1 albo NR ID. SEKW.: 2, i przy czym peptyd ten jest przyłączony do podłoża stałego, i przy czym peptyd ten jest kowalencyjnie przyłączony do znacznika, który dostarcza wykrywalnego sygnału po degradacji tego peptydu przez enzym wydzielany przez ten drobnoustrój;
przy czym drobnoustrój stanowią bakterie wybrane z grupy składającej się ze: Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis i Proteus mirabilis;
i przy czym próbka wybrana jest z grupy składającej się z płynu z rany i płynu ustrojowego.
9. Biosensor według zastrz. 8, znamienny tym, że podłoże stałe jest wybrane z grupy składającej się z opatrunku rany, pojemnika do przechowywania płynów ustrojowych, dysku, scope, sączka, soczewki, gąbki, materiału, papieru, szwu i tamponu.
10. Biosensor według zastrz. 9, znamienny tym, że pojemnik do przechowywania płynu ustrojowego jest wybrany z grupy składającej się z torebki do zbierania moczu, torebki do zbierania krwi, torebki do zbierania osocza, probówki, cewnika i studzienki mikropłytki.
11. Zestaw do wykrywania zakażenia rany, znamienny tym, że składa się z:
i) biosensora określonego w zastrz. 8, lub 9, lub 10 do wykrywania enzymu wytwarzanego i/lub wydzielanego przez drobnoustrój powodujący zakażenia; oraz ii) jednego lub więcej odczynników.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44452103P | 2003-01-31 | 2003-01-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL378052A1 PL378052A1 (pl) | 2006-02-20 |
| PL215163B1 true PL215163B1 (pl) | 2013-10-31 |
Family
ID=34115256
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL378052A PL215163B1 (pl) | 2003-01-31 | 2004-01-30 | Sposób wykrywania drobnoustroju w próbce, biosensor do wykrywania drobnoustroju w próbce i zestaw do wykrywania zakazenia rany |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8124370B2 (pl) |
| EP (1) | EP1587950A2 (pl) |
| JP (1) | JP4533896B2 (pl) |
| AU (1) | AU2004260926B2 (pl) |
| CA (1) | CA2515077C (pl) |
| PL (1) | PL215163B1 (pl) |
| WO (1) | WO2005012556A2 (pl) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005528887A (ja) | 2002-01-31 | 2005-09-29 | エクスプレッシブ コンストラクツ，インコーポレイテッド | 微生物の検出方法 |
| EP1587950A2 (en) | 2003-01-31 | 2005-10-26 | Ethicon, Inc. | Cationic anti-microbial peptides and methods of use thereof |
| ATE432358T1 (de) * | 2003-11-03 | 2009-06-15 | Ethicon Inc | Kolorimetrische substrate, kolorimetrische sensoren und verwendungsverfahren |
| CN1902494B (zh) | 2003-11-03 | 2010-10-27 | 伊西康公司 | 用于检测广谱细菌的方法、肽和生物传感器 |
| WO2008014487A2 (en) * | 2006-07-28 | 2008-01-31 | Accelerated Pictures, Inc. | Scene organization in computer-assisted filmmaking |
| US7880770B2 (en) * | 2006-07-28 | 2011-02-01 | Accelerated Pictures, Inc. | Camera control |
| WO2009102349A2 (en) * | 2007-10-28 | 2009-08-20 | Eci Biotech Inc. | Sensors for measuring contaminants |
| AU2010251237B2 (en) * | 2009-05-18 | 2015-12-10 | Mega Patent Exploitation Gmbh | Method for detecting a wound infection |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2405301A1 (fr) * | 1977-10-04 | 1979-05-04 | Api Labor | Substrats et procede permettant l'identification rapide de bacteries du genre streptococcus |
| US4242447A (en) * | 1978-11-29 | 1980-12-30 | Bioresearch | Rapid detection of bacteria |
| JPS59220199A (ja) | 1983-03-07 | 1984-12-11 | イ−−ワイ・ラボラトリ−ス・インコ−ポレ−テツド | 吸収剤表面上の酵素基質を含む検査用品及びそれを用いる比色検査方法 |
| US5518894A (en) * | 1987-11-05 | 1996-05-21 | Berg; James D. | Rapid coliform detection system |
| US5236827A (en) * | 1988-06-20 | 1993-08-17 | Becton, Dickinson And Company | Device for enhancing fluorescence and kinetics and methods of using the device |
| CA2029172C (en) | 1989-11-28 | 2002-04-02 | Eric Flam | Dressing including an indicator |
| US5210022A (en) * | 1990-04-20 | 1993-05-11 | Rcr Scientific, Inc. | Method test media and chromogenic compounds for identifying and differentiating general coliforms and Escherichia coli bacteria |
| US5618675A (en) * | 1992-07-16 | 1997-04-08 | Panorama Research, Inc. | Methods and compositions for detecting lipopolysaccharides using CAP18 fragments |
| US5811252A (en) * | 1994-07-07 | 1998-09-22 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | Modified proenzymes as substrates for proteolytic enzymes |
| US20020055101A1 (en) * | 1995-09-11 | 2002-05-09 | Michel G. Bergeron | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US5605809A (en) * | 1994-10-28 | 1997-02-25 | Oncoimmunin, Inc. | Compositions for the detection of proteases in biological samples and methods of use thereof |
| EP1019528B1 (en) * | 1996-01-04 | 2003-10-29 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | Method for assaying proteolytic enzymes using fluorescence-quenched substrates |
| US6803188B1 (en) | 1996-01-31 | 2004-10-12 | The Regents Of The University Of California | Tandem fluorescent protein constructs |
| GB2323166B (en) | 1997-03-12 | 2001-04-11 | Johnson & Johnson Medical | Method and apparatus for mapping the condition of a wound |
| JPH11178567A (ja) | 1997-12-22 | 1999-07-06 | Bml:Kk | 細菌検出装置 |
| FR2774097B1 (fr) * | 1998-01-28 | 2000-09-29 | Bio Merieux | Utilisation de derives d'indolamine dans la detection d'une activite de peptidase ou dans la detection de micro-organismes |
| GB2340235A (en) | 1998-08-05 | 2000-02-16 | Johnson & Johnson Medical Ltd | Monitoring bacterial contamination of a wound involving assay of adenosine triphosphate |
| JP2000093195A (ja) | 1998-09-24 | 2000-04-04 | Nippon Suisan Kaisha Ltd | 大腸菌群の迅速検出法 |
| JP2000217579A (ja) * | 1999-01-28 | 2000-08-08 | Miwa Noriyuki | 新規抗菌性ペプチド |
| JP4472078B2 (ja) | 1999-12-20 | 2010-06-02 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 菌の分離・検出方法 |
| JP4510222B2 (ja) | 2000-04-26 | 2010-07-21 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 細菌の鑑別方法 |
| ES2271078T3 (es) * | 2000-05-03 | 2007-04-16 | Expressive Constructs, Inc. | Metodo para detectar listeria monocytogenes. |
| EP1301797A2 (en) | 2000-07-17 | 2003-04-16 | Hansa Medical AB | Antimicrobial agent |
| CA2418854A1 (en) * | 2000-08-17 | 2002-02-21 | Jorg Fritz | A vaccine which comprises at least one antigen and a cathelididin derived antimicrobial peptide or a derivative thereof |
| WO2002095076A2 (en) * | 2001-05-23 | 2002-11-28 | Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho | Modified polypeptides having protease-resistance and/or protease-sensitivity |
| JP2005528887A (ja) * | 2002-01-31 | 2005-09-29 | エクスプレッシブ コンストラクツ，インコーポレイテッド | 微生物の検出方法 |
| WO2004087942A2 (en) | 2003-01-31 | 2004-10-14 | Ethicon, Inc. | Method for detecting escherichia coli |
| EP1587950A2 (en) | 2003-01-31 | 2005-10-26 | Ethicon, Inc. | Cationic anti-microbial peptides and methods of use thereof |
| CN1902494B (zh) | 2003-11-03 | 2010-10-27 | 伊西康公司 | 用于检测广谱细菌的方法、肽和生物传感器 |
| ATE432358T1 (de) | 2003-11-03 | 2009-06-15 | Ethicon Inc | Kolorimetrische substrate, kolorimetrische sensoren und verwendungsverfahren |
-
2004
- 2004-01-30 EP EP04775750A patent/EP1587950A2/en not_active Withdrawn
- 2004-01-30 CA CA2515077A patent/CA2515077C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-01-30 US US10/543,523 patent/US8124370B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-01-30 AU AU2004260926A patent/AU2004260926B2/en not_active Ceased
- 2004-01-30 JP JP2006532275A patent/JP4533896B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-01-30 WO PCT/US2004/002636 patent/WO2005012556A2/en not_active Ceased
- 2004-01-30 PL PL378052A patent/PL215163B1/pl not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-12-22 US US13/335,369 patent/US8541193B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8124370B2 (en) | 2012-02-28 |
| US20060240507A1 (en) | 2006-10-26 |
| JP2007513605A (ja) | 2007-05-31 |
| US20120135440A1 (en) | 2012-05-31 |
| WO2005012556A2 (en) | 2005-02-10 |
| AU2004260926B2 (en) | 2007-08-16 |
| PL378052A1 (pl) | 2006-02-20 |
| CA2515077C (en) | 2013-01-08 |
| EP1587950A2 (en) | 2005-10-26 |
| AU2004260926A1 (en) | 2005-02-10 |
| WO2005012556A3 (en) | 2005-03-31 |
| CA2515077A1 (en) | 2005-02-10 |
| US8541193B2 (en) | 2013-09-24 |
| JP4533896B2 (ja) | 2010-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8377651B2 (en) | Method for detecting Escherichia coli | |
| CN1902494B (zh) | 用于检测广谱细菌的方法、肽和生物传感器 | |
| US8541193B2 (en) | Cationic anti-microbial peptides and methods of use thereof | |
| JP4767863B2 (ja) | 比色基質、比色センサー、および使用方法 | |
| AU2003212897B2 (en) | Method for detecting microorganisms | |
| US20070128589A1 (en) | Substrates, sensors, and methods for assessing conditions in females | |
| EP2619316B1 (en) | Ultrasensitive detection of beta hemolytic streptococcus | |
| JP2009514524A (ja) | エンドトキシンの分析 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20140130 |