PL215886B1 - Zastosowanie ekstraktu z odtluszczonych nasion wiesiolka - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie ekstraktu z odtłuszczonych nasion wiesiołka do wytwarzania środka do zapobiegania uszkodzeniu lub ograniczenia uszkodzenia mięśnia sercowego i naczyń wieńcowych. Korzystnie stosuje się ekstrakt z odtłuszczonych nasion wiesiołka dziwnego (Oenothera paradoxa).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowe zastosowanie ekstraktu z odtłuszczonych nasion wiesiołka (Oenothera), zwłaszcza wiesiołka dziwnego (Oenolhera paradoxa).

Od wielu lat przedmiotem licznych badań jest kardioprotekcja mięśnia sercowego, definiowana jako ograniczenie uszkodzenia lub zapobieganie uszkodzeniu mięśnia sercowego i naczyń wieńcowych poprzez mechanizmy endogenne lub przez działanie leków. Jednym z problemów, które zaobserwowano jest to, że po przywróceniu krążenia wieńcowego do niedokrwionego uprzednio obszaru powrót czynności skurczowej komórek zachodzi w wyraźnym opóźnieniem. Zapewnienie więc odpowiedniej perfuzji i dotlenienia komórek mięśnia sercowego, mimo zachowanej ich żywotności, może nie być wystarczające dla osiągnięcia ponownej sprawności mechanicznej serca. Reperfuzja, czyli przywrócenie dopływu krwi do niedokrwionego obszaru, zamiast ratować żywe jeszcze komórki serca, może gwałtownie nasilić proces ich uszkodzenia. Omawiany proces uszkodzenia niedokrwiennoreperfuzyjnego był i jest przedmiotem wielu badań.

Działanie kardioprotekcyjne wykazują inhibitory enzymu konwertazy angiotensyny (inhibitory ACE) - leki standardowo stosowane w nadciśnieniu tętniczym i niewydolności serca. Istotną część kardioprotekcyjnych działań inhibitorów ACE można przypisać hamowaniu powstawania angiotensyny II. Jest to substancja silnie naczyniokurcząca oraz obdarzona działaniem mitogennym, co może przemawiać za jej istotną rolą w patogenezie miażdżycy. Inhibitory ACE, poza mechanizmem polegającym na hamowaniu konwersji angiotensyny I do angiotensyny II, wykazują także działanie polegające na hamowaniu szlaku bradykininowego. Bradykinina to peptydowy hormon tkankowy, który poprzez pobudzanie śródbłonkowych receptorów ma zdolność uwalniania do światła naczyń substancji rozkurczających, co obniża ciśnienie krwi. Bradykinina uwalnia też inne ważne dla naczyń substancje ochraniające, np. prostanoidy i tlenek azotu, zatem jej podwyższone stężenie wiąże się z efektem kardioprotekcyjnym. Korzystny wpływ na gospodarkę lipidową i węglowodanową organizmu, obserwowany przy przewlekłym podawaniu inhibitorów ACE, również stanowi element działania kardioprotekcyjnego.

Przy poszukiwaniu nowych terapii układu krążenia szczególną uwagę poświęca się obecnie związkom łączącym w sobie właściwości blokady enzymu przekształcającego angiotensynę i inhibitora obojętnej endopeptydazy, unieczynniającej przedsionkowy peptyd natriuretyczny (ANP). Związki te określane są mianem wazopeptydaz. Korzyści tego kierunku leczenia wynikają z jednoczesnego zahamowania angiotensyny II i wzrostu stężenia ANP, wykazującego własności diuretyczne, natriuretyczne i hipotensyjne. Najbardziej znany spośród omawianych połączeń - omalaprylat - jest obecnie oceniany w wieloośrodkowych badaniach znanych pod akronimem OPERA (Omalaprilal in Persons with Enhanced Risk of Alherosclerolic evenis), obejmujących ponad 12 500 osób w około 1100 ośrodkach klinicznych [Kostis J.B., Cobbe S., Johnston C. i wsp.: Design of the Omalaprilat in Persons with Enhanced Risk of Atherosclerotic events (OPERA) trial. Am. J. Hypertens., 2002; 15: 193-198]. Dotychczasowe badania wykazały dużą skuteczność hipotensyjną tego leku i jego korzystny wpływ u chorych z niewydolnością serca. Trzeba jednak dodać, że jednym z niepożądanych objawów był obrzęk naczynioruchowy.

Zważywszy, że niewydolność serca jest jedną z głównych i coraz częstszych przyczyn zgonów i niesprawności, istotne jest poszukiwanie metod pogłębiających naturalne ustrojowe procesy obronne związane z niedokrwieniem. Wśród tych metod szczególne znaczenie mają takie, które oparte są wykorzystaniu substancji naturalnych.

Jedną z szeroko wykorzystywanych roślin o właściwościach leczniczych jest wiesiołek (Oenothera). Olej wiesiołkowy, otrzymywany z nasion tej rośliny, charakteryzuje się wysoką zawartością niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych, zwłaszcza kwasu γ-linolenowego. Niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe wspomagają funkcjonowanie układu sercowo -naczyniowego, korzystnie wpływają na gospodarkę cholesterolu i trójglicerydów i wspomagają naturalną odporność organizmu.

W procesie wytwarzania oleju z nasion wiesiołka jako produkt uboczny powstają wytłoki, czyli częściowo odtłuszczone nasiona. Stwierdzono, że wytłoki z wiesiołka są cennym źródłem polifenoli, stąd rosnące zainteresowanie ich wykorzystaniem w przemyśle farmaceutycznym.

Znane jest prozdrowotne działanie polifenoli i ich szczególne znaczenie w zapobieganiu miażdżycy i chorobom serca. Zawarte w czerwonym winie polifenole, z których najważniejszą rolę pełnią kwercetyna, resweratol, katechina i epigalokatechina wykazują szerokie spektrum działania w obrębie układu sercowo-naczyniowego: zmniejszają tworzenie się skrzepów, hamują procesy zapalne w naPL 215 886 B1 czyniach krwionośnych, zwiększają ich rozkurcz oraz usprawniają przepływ krwi i zaopatrywanie serca w tlen. Jednocześnie hamują niebezpieczne reakcje wolnorodnikowe. Polifenole zawarte w czerwonym winie mogą zmniejszać utlenianie cholesterolu LDL i tym samym zapobiegać niekorzystnym reakcjom miażdżycowym. Z kolei ekstrakty głogu wykazują działanie zbliżone do inhibitorów fosfodiesterazy III lub glikozydów nasercowych, działanie rozkurczające na przepływ wieńcowy i obwodowy, ale bez działania arytmogennego. Dodatkowo wykazują działanie przeciwutleniające i przeciwzapalne. Kwiatostany głogu, które wraz z liśćmi stanowią surowiec farmaceutyczny, zawierają takie polifenole, jak flawonoidy, a także oligomeryczne procjanidyny, głownie dimeryczną procjanidynę B2, trimeryczną procjanidynę C1 i towarzyszącą im katechinę i epikatechinę. Skład wyciągów z głogu (suchych) może się między sobą różnić, ale najczęściej zawierają one 2,2% flawonoidów i do około 19% procjanidyn. Znanym źródłem polifenoli roślinnych jest także ekstrakt z kory sosny śródziemnomorskiej, zawierający całą klasę flawonoidów, pochodnych flawan-3-oli. Ekstrakt zawiera katechinę, epikatechinę, taksyfolinę, jak również procjanidyny. Wiele z wyżej wymienionych związków polifenolowych stwierdza się także w innych roślinach, takich jak owoce jagodowe i herbata, zwłaszcza zielona.

Roślinne ekstrakty zawierające związki polifenolowe mogą różnić się od siebie istotnie, ze względu na odmienny skład komponentu polifenolowego. Zazwyczaj zawierają pewną podstawową grupę związków polifenolowych, ale są także między nimi istotne różnice, mające znaczenie dla właściwości ekstraktów. Aktywność tych związków zależy od ich biodostępności, a ta wiąże się ściśle z budową chemiczną - na przykład działanie antyoksydacyjne polifenoli zawartych w herbacie przypisuje się głównie katechinom, a w czerwonym winie - reserwatrolowi. Różne są zatem proponowane zastosowania polifenoli pochodzących z różnych roślin, aczkolwiek zastosowania w zakresie związanym z chorobami układu krążenia są generalnie oparte na ich właściwościach przeciwutleniających.

Przeciwutleniające zastosowanie ekstraktu z odtłuszczonych nasion wiesiołka jest znane z opisu zgłoszenia patentowego WO 0018416. Z serii zgłoszeń patentowych należących do przedsiębiorstwa Oriza, znane jest zastosowanie ekstraktu jako: środka indukującego apoptozę komórek (JP 20010105658), inhibitora absorpcji tłuszczów (EP 13 12374), środka zwalczającego Helicobacter pylori (JP 20030151745), inhibitora ureazy (JP 20030339266), środka do leczenia owrzodzeń (JP20040118419). W polskim zgłoszeniu patentowym P-370446 zaproponowano zastosowanie polifenoli z wiesiołka do leczenia i zapobiegania osteoporozie. We wszystkich wyżej wymienionych zastosowaniach wykorzystuje się produkt otrzymany w wyniku ekstrakcji odtłuszczonych nasion wiesiołka za pomocą alkoholi alifatycznych, acetonu, wody lub mieszaninami tych rozpuszczalników.

Nasze badania wykazały, że ekstrakt z odtłuszczonych nasion wiesiołka wykazuje działanie inhibitora ACE i, jednocześnie, inhibitora obojętnej endopeptydazy.

Istotą wynalazku jest zastosowanie ekstraktu z odtłuszczonych nasion wiesiołka do wytwarzania środka do zapobiegania uszkodzeniu lub ograniczenia uszkodzenia mięśnia sercowego i naczyń wieńcowych.

Szczególnie korzystne jest zastosowanie ekstraktu z wiesiołka do wytwarzania preparatu do zapobiegania procesowi lub ograniczenia procesu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego.

Korzystnie stosuje się ekstrakt z odtłuszczonych nasion wiesiołka dziwnego (Oenothera paradoxa).

Korzystnie całkowity udział związków polifenolowych w ekstrakcie wynosi nie mniej niż 40% w przeliczeniu na katechinę.

Korzystnie całkowity udział proantocjanidyn w ekstrakcie wynosi co najmniej 30%, w przeliczeniu na chlorek cyjanidyny.

W zastosowaniu według wynalazku ekstrakt z odtłuszczonych nasion wiesiołka jest podawany w formie preparatu farmaceutycznego lub preparatu dietetycznego, zawierającego, poza ekstraktem, także substancje pomocnicze dopuszczalne farmaceutycznie i/lub jako dodatki do żywności. Preparat może mieć postać odpowiednią do podawania drogą doustną, w szczególności postać tabletki, pigułki, drażetki, kapsułki, proszku, granulek, zawiesiny.

Preparat przeznaczony do zastosowania według wynalazku może zawierać dodatkowo inne substancje aktywne stosowane w kardioprotekcji mięśnia sercowego i naczyń wieńcowych.

Badania składu ekstraktów z odtłuszczonych nasion wiesiołka dziwnego wykazują, że zawierają one m. in. kwas elagowy, kwas galusowy, katechinę, galusan epikatechiny i procyjanidyny, (m. in.

proantocjanidynę B3), oenoteinę B i penta-O-galoilo^-D-glukozę (PGG). PGG, obok procjanidyn

PL 215 886 B1 o różnym stopniu polimeryzacji, jest związkiem dominującym w ekstrakcie z odtłuszczonych nasion wiesiołka dziwnego i pełni istotną rolę w jego aktywności terapeutycznej.

Podwójne działanie ekstraktu z nasion wiesiołka, jako inhibitorów ACE i inhibitorów obojętnej endopeptydazy, podwyższa poziom peptydów natriuretycznych (sodopędnych) i peptydów rozszerzających naczynia i, jednocześnie, inhibituje system renina-angiotensyna-aldosteron. Hamowanie rozkładu bradykininy pozwala na utrzymywanie jej stężenia na takim poziomie, który zapewnia kardioprotekcyjne działanie na mięsień sercowy i naczynia wieńcowe.

Ekstrakt z nasion wiesiołka otrzymuje się z odtłuszczonych lub częściowo odtłuszczonych nasion. Efekt odtłuszczenia uzyskuje się poddając dojrzałe nasiona wytłaczaniu w prasach hydraulicznych, pod ciśnieniem kilkuset atmosfer. W tym procesie usuwa się około 60% oleju oraz uszkadza się łupinę nasienną, stwarzając w ten sposób korzystne warunki do penetracji wnętrza łupiny przez rozpuszczalnik w procesie ekstrakcji. Proces ten odbywa się w temperaturze nie przekraczającej 40°C. Odtłuszczone nasiona poddaje się następnie procesowi ekstrakcji za pomocą alkoholu alifatycznego, korzystnie etanolu, korzystnie w mieszaninie z wodą. Uzyskane ekstrakty zatęża się, filtruje i suszy metodą rozpyłową. Uzyskuje się preparat w postaci proszku.

Ekstrakt z odtłuszczonych nasion wiesiołka został poddany badaniu aktywności w stosunku do enzymów konwertazy angiotensynowej ACE i obojętnej endopeptydazy NEP. W tym celu z ekstraktu przygotowano wyciągi, które następnie podzielono na frakcje, a z najaktywniejszych frakcji wyizolowano związki. Badaniu poddano frakcje, wyciągi i związki. Biadania wykazały wyraźną inhibicję wazopeptydaz w sposób zależny od stężenia. Badania HPLC wykazały podobny skład jakościowy aktywnych wyciągów, stwierdzono tylko pewne różnice ilościowe w sumie związków polifenolowych. Najaktywniejszymi związkami okazały się być oenoteina B, procjanidyna B3, penta-O-galoilo-3-D-glukoza (PGG) oraz w mniejszym stopniu galusan metylu. W jednej z najaktywniejszej frakcji stwierdzono obecność procjanidyn, których monomerami są katechina i galusan epikatechiny. Procjanidyn i PGG w dużej mierze warunkują działanie całego wyciągu, a obecne inne związki polifenolowych mogą działać synergistycznie.

Przedmiot wynalazku i przeprowadzone badania potwierdzające aktywność ekstraktów z wiesiołka w zastosowaniu według wynalazku zostały bliżej przedstawione w przykładach wykonania.

P r z y k ł a d 1

Przygotowanie surowego ekstraktu.

Dojrzałe nasiona wiesiołka dziwnego wytłacza się w prasie hydraulicznej, w temperaturze nie przekraczającej 40°C. Odtłuszczone nasiona umieszcza się w ekstraktorze, a następnie zalewa się je 60% etanolem o temperaturze 25-30°C, w ilości 2-2,5 objętości nasion. Zawartość ekstraktora pozostawia się na okres 1 godziny bez mieszania, a następnie od dołu aparatu spuszcza się ekstrakt alkoholowy. Do ekstraktora wlewa się ponownie I objętość wody o temperaturze 25-30°C i pozostawia na okres 1 godziny, następnie od dołu aparatu spuszcza się ekstrakt wodny. Ekstrakcję przy pomocy wody powtarza się czterokrotnie. Ekstrakty wodne łączy się i poddaje dalszej obróbce. Pozostałą w ekstraktorze masę poekstrakcyjną usuwa się z aparatu i przekazuje do utylizacji.

W wyniku procesu ekstrakcji uzyskuje się około 1 objętości ekstraktu alkoholowego i około 4 objętości ekstraktów wodnych. Następnym etapem procesu jest usunięcie alkoholu z ekstraktów i zatężenie roztworu polifenoli. Proces ten przeprowadza się w wyparce próżniowej. Ekstrakt alkoholowy destyluje się oddzielnie, nie mieszając go z ekstraktami wodnymi. Ekstrakt alkoholowy zatęża się dwukrotnie, natomiast ekstrakty wodne 3-4 krotnie. Uzyskane podczas procesu destylaty alkoholowe poddaje się standaryzacji i ponownie używa do ekstrakcji nowej porcji nasion. Uzyskane podczas destylacji ekstraktów wywary pozostawia się do ostygnięcia, a następnie oczyszcza się je z osadów przy pomocy wirowania ewentualnie filtracji. Klarowne roztwory polifenoli suszy się metodą rozpyłową.

W wyniku opisanego procesu otrzymuje się ekstrakt polifenolowy w postaci proszku, zawierający co najmniej 40% polifenoli, w przeliczeniu na katechinę, o następującym składzie: procjanidyny, w tym procjanidyna B3, 1,2, 3, 4, 6-O-penta-O-galoilo-3-D-glukoza, katechina, epikatechina, galusan epikatechiny, kwas galusowy, galusan metylu, kwas elagowy, kwas kawowy, kwercetyna, glukuronid kwercetyny, oenoteina B. Całkowita zawartość polifenoli była wyższa niż 40%, a całkowita zawartość procjanidyn była wyższa niż 30%.

P r z y k ł a d 2

Przygotowanie wyciągów i frakcji.

g ekstraktu polifenolowego z Oenothera paradoxa w postaci proszku, otrzymanego zgodnie z przykładem 1, ekstrahowano: (a) wodą (2x100 mL), (b) 60% etanolem (v/v, 2x100 mL), (c) izopropaPL 215 886 B1 nolem (2x100 mL), (d) 30% izopropanolem (v/v, 2x100 mL), przez 60 minut, w temperaturze pokojowej. Po wysuszeniu roztworu izopropanolowego (c) pod próżnią, w 40°C, otrzymano 2,36 g pozostałości. Roztwór wodny (a) i pozostałości wodne po odparowaniu rozpuszczalników w roztworach (b) i (d) organicznych) zostały poddane liofilizacji. Otrzymano 1,93 g produktu dla roztworu (a), 2,58 g produktu dla roztworu (b) i 2,05 g produktu dla roztworu (d).

g 30%-owego roztworu izopropanolowego rozpuszczono w wodzie (200 mL) i ekstrahowano octanem etylu (3x200 mL). Połączone ekstrakty zostały wysuszone pod próżnią w 45°C, dając pozostałość 3,2 g. Pozostały roztwór wodny został poddany liofilizacji dając 16,2 g produktu.

2,5 g otrzymanego wyżej wyciągu octanu etylu (EA) rozpuszczono w 10 mL metanolu, i zaabsorbowano na 5 g poliamidu, i podano na kolumnę (średnica 5 cm, wysokość 8 cm), wypełnioną poliamidem 6 (rozmiar cząstek 0.05-0.16 mm, Carl Roth) i eluowano metanolem (zbierano frakcje po 50 mL) i roztworem aceton-woda (7:3; zbierano frakcje po 50 mL). Zebrano 100 frakcji, które połączono w główne frakcje 1-6A według ich składu polifenolowego ocenionego metodą chromatografii cienkowarstwowej TLC. Wszystkie frakcje zostały poddane liofilizacji.

7.5 g pozostałości wodnej (AR) po ekstrakcji octanem etylu rozpuszczono w 40 mL mieszaniny metanol-woda (7:3), podano na kolumnę (o średnicy 4 cm i wysokości 40 cm) wypełnioną Sephadex LH-20 (rozmiar cząstek 0.025-0.100 mm, Pharmacia, Uppsala, Sweden) i eluowano roztworem metanol-woda (7:3; zbierano frakcje po 50 mL). Zebrano 40 frakcji, które połączono w główne frakcje 1-5B według ich składu polifenolowego ocenionego metodą chromatografii cienkowarstwowej TLC. Wszystkie frakcje zostały poddane liofilizacji.

Wyciągi i frakcje przechowywano w temperaturze -18°C.

Uzyskane frakcje poddano badaniu aktywności biologicznej. Wynik przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia badanie roztworu w octanie etylu i frakcji 1-6 A, a fig. 2 przedstawia badanie pozostałości wodnej i frakcji 1-5 B.

P r z y k ł a d 3

Oznaczanie zawartości związków polifenolowych i proantocjanidyn w wyciągach otrzymanych zgodnie z przykładem 2.

Całkowitą zawartość związków polifenolowych oznaczono metodą Folin-Ciocalteu w przeliczeniu na katechinę. Po 0.05 g każdego wyciągu rozpuszczono w 25 mL roztworu metanol-woda (7:3), a następnie 0.2 mL każdego wyciągu zmieszano z 0.5 ml odczynnika Folina-Ciocalteu i 10 mL 10% roztworu Na2CO3 i dopełniono wodą do 50 mL. Mieszaninę pozostawiono ciemności na 30 min. Absorbancje mierzono spektrofotometrycznie przy 700 nm.

Całkowitą zawartość proantocjanidyn oznaczono zgodnie z IV Farmakopeą Europejską jako chlorek cyjanidyny. Po 0.2 g każdego wyciągu rozpuszczono w 30 mL roztworu metanol-woda (7:3) i ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 80 min z 15 mL 25% HCl. Po ochłodzenie, ekstrakty zostały przefiltrowane i dopełnione roztworem metanol-woda (7:3) do 250 mL. 50 mL każdego roztworu odparowano do około 3 mL i dodano 15 mL wody. Roztwór następnie ekstrahowano butanolem (3x15 mL). Warstwy organiczne zostały przeniesione do kolbki miarowej I dopełnione butanolem to 100 mL. Absorbancje mierzono spektrofotometrycznie przy 545 nm.

Całkowitą zawartość polifenoli i proantocjanidyn w badanych wyciągach przedstawiono w Tabeli 1.

P r z y k ł a d 4

Oznaczenie aktywności konwertazy angiotensynowej (ACE) i obojętnej endopeptydazy (NEP) wyciągów otrzymanych zgodnie z przykładem 2.

Oznaczenie aktywności konwertazy angiotensynowej (ACE)

Reakcja enzymatyczna polegała na przecięciu przez enzym ACE dodanego substratu Hip-L-His-L-Leu (hipurylo-histydylo-leucyny) i powstaniu produktu (histydylo-leucyny), a następnie utworzeniu z aldehydem-o-ftalowym fluoryzującego kompleksu His-Leu-o-ftalidylu, który jest oznaczany spektrofluorymetrycznie.

Do próbówek Eppendorfa dodawano 50 μΐ roztworu testowego (roztwór liofilizowanego wyciągu/związku w buforze fosforanowym), 30 μΐ buforu fosforanowego (pH=8,3), 150 μΐ roztworu enzymu (1:300 spermy knurzej) oraz 20 μl substratu (Hip-L-His-L-leu 24 mM) Mieszaninę reakcyjną inkubowano 30 min. w temp.37°C, reakcje hamowano dodając 1000 μΙ 0,4M NaOH po czym dodawano 100 μΙ 2% metanolowego roztworu dialdehydu-o-ftalowego i pozostawiano w ciemnym miejscu na 10 min do powstania fluoryzującego kompleksu Następnie dodawano 300 μl 2M HCl i pozostawiano na 30 min w ciemnym miejscu.

PL 215 886 B1

Fluorescencje powstałego produktu mierzono spektrofluorymetrycznie przy X_wzb=365 nm i X_emis=500 nm przy szerokości szczeliny 3 nm.

Wykonywano próbę kontrolą bez enzymu w celu wyeliminowania fluorescencji, jaką może wykazywać sam roztwór badany, a także próbę kontrolną pozytywną bez dodatku inhibitora.

Oznaczenie aktywności obojętnej endopeptydazy (NEP).

Badanie na aktywność NEP wykonywano dwustopniowo. Reakcja enzymatyczna pierwszego etapu polegała na przecięciu przez enzym substratu SAAP-AMC (sukcynylo-alanilo-alanilofenyloalanilo-7-amido-4-metylokumaryny) i powstaniu fenyloalanilo-7-amido-4-metylokumaryny (P-AMC). W drugim etapie reakcji dodany enzym APN (aminopeptydaza N) odcina fenyloalaninę uwalniając związek wykazujący fluorescencję.

Do probówek Eppendorfa dodawano 50 μΐ roztworu testowego (roztwór liofilizowanego wyciągu/związku w buforze HEPES), 50 μl 8 μΜ lizynoprilu (w celu zahamowania aktywności ACE), 50 μl substratu (400 μΜ), 350 μl buforu HEPES ρΗ=7,4 oraz 150 μl roztworu enzymu (1:1000 spermy knurzej). Mieszaninę reakcyjną inkubowano 1 godz. w temp. 37°C, reakcje hamowano dodając 50 μl fosforamidonu (50 μΜ). Następnie dodawano 20 μl roztworu APN (1:235), mieszaninę inkubowano 1 godz. w temp. 56°C, reakcję hamowano 800 μl acetonu. Fluorescencję powstałego produktu mierzono spektrofluorymetrycznie przy X_wzb=367 nm i X_emis=440 nm przy szerokości szczeliny 3 nm.

Wykonywano próbę kontrolą bez enzymu w celu wyeliminowania fluorescencji, jaką może wykazywać roztwór badany, oraz kontrolę w celu wyeliminowania wpływu inhibitora na APN, a także kontrolę pozytywną bez dodatku inhibitora.

Analiza statystyczna.

Oznaczenie dla każdego stężenia było wykonywane trzykrotnie w dwóch powtórzeniach, wyniki przedstawiono jako wartość średnia ± odchylenie standardowe (SD). Wartości IC50, czyli stężenie wyciągu, przy którym następuje zahamowanie aktywności enzymu w 50%, odczytano z krzywej zależności stężenie-procent inhibicji.

Wyniki badania aktywności przedstawiono w Tabeli 1.

P r z y k ł a d 5

Izolacja związków czynnych

Frakcję octanu etylu 5A (225 mg) podano na kolumnę (średnica 2,5 cm, wysokość 35 cm) wypełnioną Toyopearl HW-40, (Tosoh, Tokyo, Japan) i eluowano roztworem aceton-woda (7:3) (zbierano frakcje po 10 mL). Frakcje 7-9 (5A) rozdzielono ponownie na takiej samej kolumnie, wymywając roztworem aceton-woda (4:6) (10 mL każdy). Otrzymano 53 g 1,2, 3, 4, 6-O-penta-O-galoiloó-D-glukozy (związek 1).

Wodną frakcje 2B (70 mg) podano na kolumnę (średnica 2,5 cm, wysokość 20 cm) wypełnioną Toyopearl HW-40, (Tosoh) i eluowano roztworem metanol-woda (7:3) (zbierano frakcje po 10 mL). Otrzymano 10 mg galusanu metylu (związek 2).

Wodną frakcję 4B (150 mg) podano na kolumnę (średnica 2,5 cm, wysokość 20 cm) wypełnioną Toyopearl HW-40, (Tosoh) i eluowano roztworem metanol-woda (7:3) (zbierano frakcje po 10 mL). Otrzymano 31 mg (+)-katechina (4a>8)-(+)-katechina (Procjanidyna B3, związek 3).

1, 2, 3. 4, 6-O-penta-O-galoilo-p-D-glukoza (związek 1): proszek w kolorze złamanej bieli; UV, Xmax 281 nm; ESI-MS (jony dodatnie) m/z 963.1 [M + Na]+; ¹H NMR (MD3OD) Fragment glukozy: δ 6.46 (1H, d, J=8Hz, H-1), 6.20 (1H, t, H-3), 5.85 (1H, m, H-4), 4.78 (1H, m, H-5), 4.51 (1H, m, H-6). Fragment galoilowy: δ 7.16, 7.18, 7.23, 7.25, 7.32 (each 2H, s). ¹³C NMR (MD3OD) fragment glukozy: 93.85 (C-1), 74.45 (C-5), 74.13 (C-3), 72.21 (C-4), 69.82 (C-2), 63.15 (C-6). Fragment galoilowy: 167.99, 167.35, 167.08, 166.98, 166.28 (sygnały grupy karbonylowej), 146.63, 146.53, 146.50, 146.44, 146.34 (C-3, C-5), 141.00, 140.53, 140.48, 140.27, 140.14 (C-4), 121.00, 120.31, 120.17, 120.13, 119.62 (C-1), 110.63, 110.48, 110.42, 110.40, 110.35 (C-2, C-6).

Galusan metylu (związek 2): proszek w kolorze jasnobrązowym; UV, Xmax 273 nm; ESI- MS (jony dodatnie) m/z 207.0 [M + Na]⁺; ¹H NMR (MD3OD): δ 6.96, (2H, s, H-2, H-6), 3.75 (3H, s, -OCH3). ¹³C NMR (MD3OD): 169.2 (-COOH), 144.8 (C-3, C-5), 138.5 (C-4), 120.7 (C-1), 110.0 (C-2, C-6), 52.7 (-OCH3).

(+)-katechina (4a >8)-(+)-katechina (Procjanidyna B3) (związek 3): proszek w kolorze jasnobrązowym; UV, Xmax 236 nm, 279 nm; ESI-MS (jony dodatnie) m/z 601.1 [M + Na]+; tioliza wykazuje obecność (+)-katechiny i tioeteru (+)-katechiny; ¹³C NMR (MD3OD): 157.9-156.9 (C-5u, C-5t, C-7u, C-7t), 146.29, 145.96, 145.89, 145.58 (C-3'u, C-3't, C-4'u, C-4't), 132.28 (C-1'u, C-1't), 120.09 (C-6'u), 119.43 (C-6't), 116.13, 1 15.94, 115.39, 115.31 (C-2'u, C-2't, C-5'u, C-5't), 110.09 (C-8t), 100.87

PL 215 886 B1 (C-10u, C-10t), 96.35 (C-6t), 95.90 (C-6u), 95.56 (C-8u), 82.91 (C-3u), 77.13 (C-2u), 73.19 (C-2t), 68.86 (C-3t), 37.21 (C-4t), 28.57 (C-4u).

Analiza związków czynnych została przeprowadzona przy pomocy następujących metod.

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC).

Chromatografia cienkowarstwowa TLC została przeprowadzona na żelu krzemowym 60 F254 (grubość warstwy 0.25 mm) i na poliamidzie 11 F254 (Merck KgaA), Chromatogramy rozwijano w komorach poziomych (Chromdes, Lublin, Poland).

Wykrywanie polifenoli: Badania TLC wykonano na poliamidzie, stosując 60% CH3COOH jako eluent lub na żelu krzemionkowym stosując CHCl3-EtOAc-HCOOH (5:4:1) jako eluent. Plamy odpowiadające związkom wykrywano za pomocą światła UV254, 366 i poprzez spryskanie chromatogramów 5% metanolowym roztworem FeCl3 (granatowe plamy) lub 1% roztworem waniliny w H2SO4 (różowe plamy).

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC).

Skład polifenoli poszczególnych wyciągów i frakcji był oceniany metodą HPLC z detektorem diodowym. Rozdział prowadzono na kolumnie Luna C-18, 25x4.6 mm, 5 μm (Phenomenex, Torrance, CA). Fazę ruchomą stanowił: (A) 2,5%CH3COOH i (B) CH3CN + 2,5%CH3COOH (80:20). Do rozdziału związków zastosowano następujący gradient: 7-20%B (45'); 20-40%B (70'); 40-100%B (75'); 100%B (80'). Szybkość przepływu wynosiła 1 mL/min. Widma UV rejestrowano przy długości fali od 200 do 400 nm, chromatogramy rejestrowano przy długościach fali 280 i 350 nm.

Próbki rozpuszczano w mieszaninie MeOH + 2,5%CH3COOH (1:1) do stężeń 10; 5 lub 2,5 mg mL^-1.

Tioliza.

Wykonano tiolizę procjanidyn w celu stwierdzenia składu jakościowego oligomerów i polimerów. Badanie przeprowadzono w następujący sposób: próbki rozpuszczono w metanolu (50 μΐ) i dodano 50 μΐ 3.3% kwasu solnego w metanolu oraz 100 μΙ 5% merkaptanu benzylu w metanolu. Mieszaninę inkubowano w 40°C przez 30 min. Monomeryczne produkty rozpadu procjanidyn badano metodą HPLC.

Wyizolowane związki poddano badaniom aktywności aktywności konwertazy angiotensynowej (ACE) i obojętnej endopeptydazy (NEP) metodami jak w przykładzie 4, z tym, że dla oznaczania aktywności konwertazy angiotensynowej (ACE) przygotowano roztwór związku w buforze fosforanowym, a dla oznaczania obojętnej endopeptydazy przygotowano roztwór związku w buforze HEPES. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2.

T a b e ΐ a 1

Całkowita zawartość polifenoli i procjanidyn w badanych ekstraktach i ich zdolność hamowania aktywności wazopeptydaz w stężeniu 25 μg/ml, wartości IC50 podano w nawiasach.

Ekstrakty	Całkowita zawartość polifenoli [mg/g]	Całkowita zawartość procjanidyn [mg/g]	Inhibicja ACE (IC50 pg/ml)	Inhibicja NEP (IC50 pg/ml)
wodny	459.9±0.1	443.3±2.7	36.9±1.3 (55)	84.0±2.8 (4.7)
60% etanolowy	653.3±0.8	643.4±0.2	33.3±2.3 (37)	84.6±2.5 (4.9)
izopropanolowy	272.1±0.6	402.6±2.5	n.in (130)	70.5±5.4 (15)
30% izopropanolowy	581.3±1.6	518.9±1.6	44.7±2.7 (26)	90.4±2.5 (6.1)
octanu etylu	860.0±3.0	464.1±2.9	46.4±0.6 (32)	85.0±3.1 (9.5)
pozostałość wodna	552.0±3.1	473.9±3.5	16.7±2.9 (73)	90.6±0.6 (7.0)
Lizynopryl	(-)	(-)	IC50 0.0045 μg/ml	(-)
Fosforamidon	(-)	(-)	(-)	IC50 0.0053 μg/ml

n.in. - brak inhibicji (-)- nie badano

PL 215 886 B1

T a b e l a 2

Inhibicja aktywności wazo peptydaz przez polifenole w stężeniu 100 μg/ml, wartości IC50 podano w nawiasach (μΜ).

związki	Inhibicja ACE (IC50 pM)	Inhibicja NEP (IC50 pM)
(+)-Katechina	27.2±4.1 (>350)	12.0±1.0 (>350)
(-)-Epikatechina	47.0±2.2 (>350)	13.0±2.1 (>350)
(-)-galusan epikatechiny	60.8±4.0 (165)	26.4±2.0 (>350)
Kwas galusowy	37.4±4.8 (>500)	41.1±6.5 (480)
Kwas elagowy	57.0±2.0 (400)	26.0±2.0 (>500)
Kwas kawowy	79.0±2.0 (220)	28.0±6.0 (>500)
Oenoteina	27.0±6.0 (250)	70.0±5.0 (20)
Kwercetyna	51.0±4.2 (330)	38.7±1.2 (>350)
Glukuronid kwercetyny	54.0±3.0 (200)	50.0±4.1 (250)
Pentagaloilo glukoza	76.7±0.8 (35)	81.7±2.0 (12.5)
Galusan metylu	52.5±2.8 (500)	80.0±0.5 (65)
Procyanidyna B3	64.1±2.5 (135)	88.0±0.6 (18)
Lizynopryl	IC50 1 nM	(-)
Fosforamidon	(-)	IC50 9 nM

n.in.- brak inhibicji (-)- nie badano

Claims (5)

1. Zastosowanie ekstraktu z odtłuszczonych nasion wiesiołka do wytwarzania środka do zapobiegania uszkodzeniu lub ograniczenia uszkodzenia mięśnia sercowego i naczyń wieńcowych.

2. Zastosowanie według zaostrz. 1, w którym uszkodzenie mięśnia sercowego jest uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że stosuje się ekstrakt z odtłuszczonych nasion wiesiołka dziwnego (Oenothera paradoxa).

4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że całkowity udział związków polifenolowych w ekstrakcie wynosi co najmniej 40%, w przeliczeniu na katechinę.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że całkowity udział proantocjanidyn w ekstrakcie wynosi co najmniej 30%, w przeliczeniu na chlorek cyjanidyny.