PL216143B1 - Sposób wytwarzania dilauroilofluoresceiny - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania dilauroilofluoresceiny (DLF) umożliwiający uzyskanie produktu o wysokiej czystości, wymaganej dla składników testów medycznych w obszarze szybkiej diagnostyki.

DLF jest bezbarwną substancją, która ulega hydrolizie pod wpływem enzymów z grupy hydrolaz (esterazy, proteazy). W wyniku tej reakcji powstaje fluoresceina - związek barwny, fluoryzujący, wykazujący maksimum pochłaniania światła przy długości fali λ=490 nm i emisji światła przy λ=514 nm. Szybkość uwalniania fluoresceiny jest wprost proporcjonalna do stężenia esteraz w próbie, a więc również do ilości i żywotności drobnoustrojów wytwarzających te enzymy.

DLF stosowana jest głównie w diagnostyce medycznej, przy przewlekłych zapaleniach trzustki. Chorobę tą diagnozuje się przy pomocy tzw. testu PLT (Pancreolauryl test). Jest to nieinwazyjny test trzustkowy, bardzo czuły i dający pewne wyniki diagnozowanego schorzenia. Enzymy trzustki hydrolizują DLF do fluoresceiny i na tej podstawie przeprowadza się pomiar jej fluorescencji w moczu, a w konsekwencji zdolność trzustki do hydrolizy estrów.

Z opisu zgłoszeniowego WO 92/01478 znane jest użycie DLF w teście służącym do diagnozowania niedoczynności trzustki. Pacjentowi podaje się doustnie emulsję typu olej w wodzie. Fazę rozproszoną stanowi olejek kokosowy z rozpuszczoną uprzednio substancją czynną. Prawidłowość czynności trzustki określa się na podstawie spektrofotometrycznego pomiaru stężenia wolnej fluoresceiny w moczu pacjenta.

Z artykułu zamieszczonego w czasopiśmie Dyes and Pigments 72 (2007) s. 322 + 326 znana jest, nie ujawniająca stechiometrii reagentów, metoda otrzymywania czystej DLF, polegająca na reakcji estryfikacji fluoresceiny chlorkiem lauroilu w temperaturze 70°C w środowisku chloroformu, wobec pirydyny jako katalizatora. Po całkowitym przereagowaniu roztwór poreakcyjny jest następnie zatężany, a czysty produkt wydziela się za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: octan etylu/eter naftowy 10:1), Rf = 0,80. Wydajność reakcji 81%.

Według innego sposobu opisanego w czasopiśmie Revista de Chimie 61 (2010) s. 372 + 376 reakcję estryfikacji fluoresceiny chlorkiem Iauroilu prowadzi się w środowisku pirydyny. Do mieszaniny zawierającej 16,6 g (0,05 mola) fluoresceiny i 75 ml pirydyny wkrapla się 24,06 g (0,11 mola) chlorku lauroilu, po czym mieszaninę reakcyjną utrzymuje w temperaturze 115 + 125°C w ciągu 24 godzin. Po stwierdzeniu zakończenia reakcji i wystudzeniu do temperatury pokojowej oleistą masę poreakcyjną wylewa się na wodę i koryguje pH do wartości 3 za pomocą kwasu solnego. Otrzymana żelowata pasta jest przemywana wodą do zaniku zapachu pirydyny. Produkt oczyszcza się poprzez rozpuszczenie pasty w octanie etylu i wytrącenie eterem naftowym. Osad jest filtrowany, suszony, a następnie rozpuszczany w toluenie do stężenia około 25% i w tej postaci może być stosowany jako znacznik produktów petrochemicznych. Wydajność reakcji 80%.

W scharakteryzowanych metodach otrzymywania DLF sposób jej wydzielania o wysokiej czystości jest uciążliwy, pracochłonny i trudny do realizacji w warunkach przemysłowych.

Opisane w dostępnych źródłach publikacyjnych metody syntezy DLF z racji pracochłonnych warunków wydzielania nie mają znaczenia praktycznego.

Sposób wytwarzania dilauroilofluoresceiny według wynalazku polegający na ogrzewaniu fluoresceiny i chlorku lauroilu w środowisku chloroformu wobec pirydyny charakteryzuje się tym, że do 350 - 450 części wagowych, korzystnie 400 części wagowych chloroformu dodaje się 12 - 20 części wagowych, korzystnie 16 części wagowych pirydyny i 60 - 70 części wagowych, korzystnie około 66 części wagowych fluoresceiny. Do tak sporządzonej zawiesiny powoli wkrapla się 88 - 135 części wagowych, korzystnie około 109 części wagowych chlorku lauroilu. Następnie tak otrzymaną masę reakcyjną ogrzewa się do temperatury wrzenia i prowadzi się reakcję korzystnie w czasie nie krótszym niż 8 godzin do całkowitego przereagowania fluoresceiny. Tak otrzymaną masę poreakcyjną zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem poprzez oddestylowanie chloroformu. Nieoczekiwanie okazało się, że na tym etapie procesu możliwe jest wytrącenie czystej dilauroilofluoresceiny za pomocą alkoholu etylowego. Do pozostałości po oddestylowaniu chloroformu wprowadza się 320 - 480 części wagowych, korzystnie 400 części wagowych alkoholu etylowego, zawiesinę miesza się w czasie 0,5 - 1,5 godziny, korzystnie przez około 1 godzinę, następnie filtruje się. Tak otrzymany osad przemywa się w 120 - 200 części wagowych, korzystnie w 160 części wagowych etanolu i ponownie sporządza się zawiesinę w 150 - 250 części wagowych, korzystnie 200 części wagowych etanolu. Po dokładnym wymieszaniu

PL 216 143 B1 osad filtruje się i ponownie przemywa się w 30 - 50 części wagowych, korzystnie 40 części wagowych etanolu, po czym suszy się korzystnie w temperaturze 35°C.

Metoda otrzymywania DLF według wynalazku jest znacznie prostsza niż te znane dotychczas, mniej czasochłonna i nie wymaga specjalistycznej aparatury, a uzyskany produkt charakteryzuje się wysoką czystością.

Stwierdzono, że metoda jest bezpieczna, a proces syntezy powtarzalny i pozwala na uzyskanie produktu o wysokich parametrach jakościowych. Opracowany sposób według wynalazku umożliwia niezawodność technologiczną i właściwą mu efektywność.

Wynalazek zobrazowano na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat reakcji wytwarzanej dilauroilofluoresceiny (DLF) tym sposobem, przy czym:

A - oznacza fluoresceinę,

B - oznacza chlorek lauroilu,

C - oznacza dilauroilofluoresceinę, zaś fig. 2 przedstawia widmo masowe struktury otrzymanej DLF.

Przedmiot wynalazku ilustruje przedstawiony poniżej przykład, nie ograniczając jego zakresu.

P r z y k ł a d

Do zawiesiny 66,4 części wagowych fluoresceiny w 400 częściach wagowych chloroformu i 16 częściach wagowych pirydyny powoli wkroplono w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny 109,2 części wagowych chlorku lauroilu. Mieszaninę reakcyjną następnie ogrzewano w łagodnym wrzeniu w temperaturze 70°C mieszając w ciągu 11 godzin. Postęp reakcji kontrolowano metodą TLC w eluentach cykloheksan : aceton 8:6 (ocena stopnia przereagowania fluoresceiny) i octan etylu : eter naftowy 10:1 (ocena jakości DLF). Po zakończeniu masę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej (otoczenia) i przeprowadzono filtrację klarującą. Z przesączu w wyparce obrotowej oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem chloroform, a do oleistej pozostałości dodano 400 części wagowych etanolu i mieszano przez 1 godzinę. Wytworzony biały osad DLF odsączono i przemyto na filtrze 160 częściami wagowymi zimnego etanolu. Produkt zawieszono w 200 częściach wagowych zimnego etanolu, odfiltrowano, przemyto 40 częściami wagowymi alkoholu etylowego i suszono w suszarce próżniowej w temperaturze 35°C.

Otrzymany biały, krystaliczny proszek topi się w temp. 66 - 67°C, jest jednorodny chromatograficznie i nie fluoryzuje.

Wynalazek przedstawiono jako przykładowe możliwości realizacji, jednakże obejmuje on również wszelkie odmiany i modyfikacje mieszczące się w ramach zastrzeżenia patentowego.

Claims (1)

1. Sposób wytwarzania dilauroilofluoresceiny polegający na ogrzewaniu fluoresceiny i chlorku lauroilu w środowisku chloroformu wobec pirydyny, znamienny tym, że do 350 - 450 części wagowych, korzystnie 400 części wagowych chloroformu dodaje się 12-20 części wagowych, korzystnie 16 części wagowych pirydyny i 60 - 70 części wagowych, korzystnie około 66 części wagowych fluoresceiny, po czym do tak sporządzonej zawiesiny wkrapla się 88 - 135 części wagowych, korzystnie około 109 części wagowych chlorku lauroilu, następnie tak otrzymaną masę reakcyjną ogrzewa się do temperatury wrzenia w przedziale od 68 - 70°C i prowadzi się reakcję korzystnie w czasie nie krótszym niż 8 godzin do całkowitego przereagowania fluoresceiny, następnie masę poreakcyjną zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem poprzez oddestylowanie chloroformu, po czym wprowadza się 320 - 480 części wagowych, korzystnie 400 części wagowych alkoholu etylowego, zawiesinę miesza się w czasie 0,5 - 1,5 godziny, korzystnie przez około 1 godzinę, następnie filtruje się, zaś tak otrzymany osad przemywa się w 120 - 200 części wagowych, korzystnie w 160 części wagowych etanolu i ponownie sporządza się zawiesinę w 150 - 250 części wagowych, korzystnie 200 części wagowych etanolu, następnie po dokładnym wymieszaniu osad filtruje się i ponownie przemywa się w 30 - 50 części wagowych, korzystnie 40 części wagowych etanolu, po czym suszy się korzystnie w temperaturze 35°C.