PL216385B1 - Sposób testowania do wykrywania możliwości wystąpienia lub skłonności do choroby niedokrwiennej serca lub udaru - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób testowania do wykrywania możliwości wystąpienia lub skłonności do choroby niedokrwiennej serca lub udaru u człowieka lub zwierzęcia, zwłaszcza ssaka, a zwłaszcza metody oznaczania, która może być stosowana do wykrywania możliwości wystąpienia lub skłonności do określonych powyżej chorób przed pojawieniem się objawów zauważalnych dla pacjenta.

Choroby sercowo-naczyniowe (CVD), do których należy choroba niedokrwienna serca (CAD), a także udar są głównym źródłem złego stanu zdrowia populacji ludzkiej. W 1998 prawie 40% wszystkich zgonów w świecie zachodnim było skutkiem CVD (tj. 1 z każdych 2,5 zgonów). W 2002 roku, szacuje się, że w USA ponad jeden milion ludzi będzie cierpiało z powodu nowego albo powtórnego zawału serca (ataku choroby wieńcowej) i więcej niż 40% ludzi cierpiących na te ataki umrze. Wielu z tych ludzi umrze nagle, bez jakiejkolwiek hospitalizacji albo leczenia. Wielu nie uświadomi sobie, że byli podatni na CVD.

Jednak wczesne lub wyprzedzające leczenie, takie jak zmiana diety, zmniejszenie lub przerwanie palenia, stosowanie intensywnych ćwiczeń, zmniejszanie masy ciała, itd., ma duży udział w sukcesie zapobiegania CVD albo zmniejszenia skłonności do CVD. Zatem, jeśli można wykryć CVD lub możliwość bądź skłonność do CVD, dostępne jest skuteczne leczenie.

Potrzebne są sposoby, które można zastosować do wykrywania CVD, a zwłaszcza możliwości lub skłonności do CVD, zanim choroba posunęła się poza etap, w którym leczenie rutynowe (tj. zmiana stylu życia i/lub zwyczaju) jest pomyślne. Szczególnie, potrzebne są sposoby, które można zastosować do wykrywania CVD we wczesnych stadiach, gdy objawy nie są oczywiste dla pacjenta albo dla osób trzecich, np. lekarza, tj. potrzebne są sposoby do testowania pacjentów „wolnych od objawów”.

Takie sposoby mogą być stosowane do przeszukania całej populacji (tj. w masowych badaniach przesiewowych) lub w grupach ryzyka w obrębie populacji np. mężczyzn powyżej 40 roku życia, pracowników zatrudnionych przy pracach o dużym nasileniu stresu, osobników stosujących niezdrową dietę, osobników cierpiących na kliniczną otyłość, palaczy itp. W przypadkach, gdy możliwość CVD lub skłonność do CVD jest zdiagnozowana, można zalecić wyprzedzające (zapobiegawcze) leczenie i/lub można zachęcić pacjenta do dostosowania stylu życia i zwyczaju.

Podobnie, gdy wykrywa się możliwość lub skłonność do CVD można poddać pacjenta dalszemu badaniu np. z użyciem droższych albo bardziej czasochłonnych technik, takich jak EKG, z i bez aktywności fizycznej, radioizotopowe obrazowanie perfuzji mięśnia sercowego, angiografia mięśnia sercowego promieniowaniem rentgena (np. CT), angiografia MR mięśnia sercowego albo obrazowanie perfuzji itp. Zatem przez potwierdzanie możIiwej obecności CVD lub możliwości, bądź skłonności do CVD przez zastosowanie w stadium początkowym taniego i łatwego sposobu testowania według wynalazku (np. masowe badania przesiewowe zdrowych pacjentów „bez objawów”) wzrasta prawdopodobieństwo wykrycia albo zidentyfikowania nie wykrytego CVD, lub możliwości CVD, przed powstaniem nieodwracalnego uszczerbku na zdrowiu, tym samym, ogranicza się niepotrzebne użycie drogich i czasochłonnych testów.

Przez „CVD” rozumie się każdy stan serca, tętnic, albo żył, który zakłóca dostarczanie tlenu do przestrzeni ciała podtrzymujących życie, takich jak mózg, serce itp. Przykładami CVD są arterioskleroza, ostry zawał mięśnia sercowego, dusznica bolesna, niedokrwienna choroba serca, choroba naczyniowo-mózgowa, udar, krwotok podpajęczynówkowy, krwotok wewnątrzmózgowy, mózgowy zawał, zastoinowa niewydolność serca, napad sercowej dusznicy bolesnej, zatrzymanie akcji serca i arytmia.

Niniejszy wynalazek opiera się na zadziwiającym stwierdzeniu, że białko kalprotektyna jest przydatnym „wskaźnikiem” inaczej „markerem” możliwości wystąpienia CAD i udaru albo skłonności do CAD i udaru przed początkiem CAD i przed udarem (tj. u pacjentów bez objawów). Szczególnie zaskakujące jest stwierdzenie, że nienormalnie wysokie poziomy kalprotektyny w różnych płynach ustrojowych wskazują na podatność na CAD, zanim początkowe symptomy CAD są oczywiste dla pacjenta albo dla strony trzeciej (np. lekarza).

Dla uniknięcia wątpliwości, określenie „kalprotektyna” stosuje się tutaj jako synonim terminów „białko L1”, „MRP 8/14”, „antygen (towarzyszący) zwłóknieniu torbielowatemu (CFA)” i „kalgranulina”.

Kalprotektyna istnieje zarówno w formie dimerycznej jak i trimerycznej. Jako dimer, kalprotektyna obejmuje łańcuchy polipeptydowe S100A8 i S100A9. Jako trimer, kalprotektyna jest 36 kDa

PL 216 385 B1 białkiem heterotrimerycznym z dwoma ciężkimi (14 kD) i jednym lekkim łańcuchem (8 kD) połączonymi niekowalencyjnie.

Kalprotektyna jest białkiem wiążącym wapń i gdy jest związana z wapniem, jest odporna na ciepło i proteolizę. To może umożliwić zastosowanie szerokiego zakresu technik testowych i warunków.

Odwzorowanie (mapowanie) epitopu kalprotektyny wykazuje, że można wytworzyć przeciwciała o specyficzności dla jej złożonych i/lub pojedynczych łańcuchów białkowych. Wykazano, że na kompleksie kalprotektyny istnieją co najmniej cztery oddzielne miejsca immunogenne. Niektóre przeciwciała rozpoznają albo ciężki albo lekki łańcuch, podczas gdy inne rozpoznają obydwa.

Kalprotektynę znajduje się w komórkach, tkankach i płynach we wszystkich częściach organizmu ludzkiego i w przeważającej mierze pochodzi ona z neutrofili i monocytów. Prawdopodobnie kalprotektyna jest obecna u wszystkich osobników, ponieważ wśród ponad 5000 przetestowanych osobników nie znaleziono żadnego wolnego od kalprotektyny. Kalprotektynę znaleziono również u szczurów, myszy, królików owiec, bydła i świń. Dlatego jest to wszechobecna cząsteczka.

In vivo, kalprotektyna jest włączona w liczne biologiczne działania obejmujące transdukcję wewnątrzkomórkowego sygnału transdukcji, aktywację neutrofili, zahamowanie wewnątrzkomórkowych enzymów włączonych w proliferację komórek, aktywność antymikrobiologiczną i w obronie neutrofilowej. Kalprotektyna jest też białkiem regulatorowym w reakcjach zapalnych i w tej roli może działać, w celu pobudzenia wytwarzania immunoglobulin, aktywności czynnika chemotaktycznego i czynnika unieruchamiającego neutrofile.

Podczas gdy płyny ustrojowe prawdopodobnie zawsze zawierają kalprotektynę, stwierdzono, że stężenie kalprotektyny w różnych płynach ustrojowych zmienia się, na przykład, zwiększa się w wielu stanach chorobowych (np. w chorobach zapalnych, zakaźnych i złośliwych). Zatem pomiar stężenia kalprotektyny w płynie ustrojowym od pacjentów cierpiących na takie stany chorobowe (tj. od osobników wykazujących objawy zauważalne dla pacjenta i/lub dla osób trzecich) i porównanie określonego stężenia kalprotektyny z tym stężeniem w płynie ustrojowym, na przykład od zdrowego (tj. nie chorego) osobnika, można zastosować jako sposób diagnozowania takich chorób.

Przykładowo, gdy objawy zakażeń bateryjnych i wirusowych są bardzo podobne, a diagnoza na podstawie samych tych objawów może być trudna, stężenie kalprotektyny w osoczu/surowicy zakażonych pacjentów wzrasta w przybliżeniu 1 do 2 razy przy zakażeniach wirusowych, ale około 1 do 18 razy przy infekcjach bakteryjnych. Zatem pacjentowi mającemu zauważalne objawy zakażenia można zmierzyć stężenie kalprotektyny w jego płynie ustrojowym i można zdiagnozować zakażenie i odpowiednio leczyć.

Inne choroby, w których można stosować kalprotektynę jako test diagnostyczny obejmują: choroby reumatyczne (np. reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń układowy), syndrom Sjogrens'a, śródgałkowe stany zapalne, zwłóknienie torbielowate, ostrą i przewlekłą chorobę płucną, nowotwór złośliwy płuca (komórki łuskowate), raki płuc, raka jelita grubego, zapalną chorobę jelit, raka żołądka, gruczolaka lub raka jelita grubego, chorobę Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, zapalenie śluzówki żołądkowo-jelitowej, kamienie moczowe, alkoholową chorobę wątroby, zapalenie śluzówki jamy ustnej, zapalną chorobę OUN (np. stwardnienie rozsiane i ostre zapalenie mózgu), infekcję HIV, wtórne infekcje OUN u pacjentów zakażonych HIV, infekcje układu moczowego, zapalenie dróg moczowych, odmiedniczkowe zapalenie nerek, wewnątrzpochodne zapalenie błony naczyniowej tylnego odcinka oka, stany hematologiczne (np. białaczkę), stany gorączkowe (zakaźne i niezakaźne), ostry zawał mięśnia sercowego i aferezę.

Stwierdzono, że stężenie kalprotektyny w osoczu wzrasta również podczas operacji na otwartym sercu (Semb, A. G. i wsp., Eur. J. Cardio-thorac Surg. (1991) 5:36 363-367, Saatvedt, K. I wsp., Scand. J. Thor. Cardiovasc. Surg. (1996) 30: 53-60, Moen, O. i wsp., Perfusion (1994) 9:109-117). Bardziej konkretnie Saatvedt i wsp. donoszą, że stężenie kalprotektyny wzrasta na początku operacji bajpasów sercowo-płucnych i ma pik w 48 godzin po operacji.

Stwierdzono nieoczekiwanie, że możliwość wystąpienia albo skłonność do choroby niedokrwiennej serca i udaru u pacjenta można ocenić przez określenie stężenia kalprotektyny w zawierającej kalprotektynę próbce pobranej od pacjenta. Innymi słowy, stwierdzono, że oznaczanie stężenia kalprotektyny w zawierającej kalprotektynę próbce pobranej od pacjenta można stosować do przew idywania, przed początkiem objawów, które są widoczne dla pacjenta albo dla osób trzecich (np. lekarza), czy lub z jakim prawdopodobieństwem pacjent jest zagrożony chorobą niedokrwienną serca lub udarem.

PL 216 385 B1

Przez „możliwość wystąpienia” lub „skłonność do” rozumie się prawdopodobieństwo albo zagrożenie, że badany pacjent, aktualnie wolny od objawów, w przyszłości będzie cierpiał na określone powyżej choroby.

Mogłoby to przyjąć postać indeksu, stosunku, procentu albo podobnej liczby odzwierciedlającej względne ryzyko wystąpienia tych chorób w przyszłości (np. w następnych 1-2 latach, co najmniej w następnych 6 miesiącach).

Zatem, sposób testowania do wykrywania możliwości wystąpienia lub skłonności do choroby niedokrwiennej serca lub udaru u człowieka lub zwierzęcia według wynalazku obejmuje:

(a) oznaczenie stężenia kalprotektyny w zawierającej kalprotektynę próbce krwi, surowicy lub próbce osocza pobranej od pacjenta;

(b) uznanie stężenia kalprotektyny powyżej wartości progowej 0,45 mg/l jako wskazującego na możliwość wystąpienia choroby niedokrwiennej serca lub udaru lub skłonności do choroby niedokrwiennej serca lub udaru.

Przez „oszacowanie” rozumie się określenie ilościowej albo pół-ilościowej wartości dla stężenia kalprotektyny. To może być wartość stężenia w testowanej próbce, np. po traktowaniu w celu usunięcia komórek lub innych niepodlegających oznaczaniu składników próbki lub w celu do zatężenia lub rozcieńczenia próbki albo w celu przeniesienia kalprotektyny do oddzielnego ośrodka, np. na stałe podłoże.

Wskaźnikowa wartość stężenia kalprotektyny określona lub „oszacowana” zgodnie ze sposobem według wynalazku może być bezwzględnym stężeniem kalprotektyny, albo może być alternatywnie wskaźnikiem, stosunkiem, procentem albo podobną liczbą odzwierciedlającą stężenia kalprotektyny.

Próbka ustrojowa wykorzystywana w sposobie oznaczania według wynalazku jest próbką krwi, surowicy lub osocza. Próbka użyta do analizy jest korzystnie pozbawiona komórek (np. surowica lub osocze).

Próbka może być poddana obróbce przed użyciem w sposobie oznaczania według wynalazku. Zatem próbkę można traktować w celu usunięcia komórek i/lub składników próbki niepodlegających oznaczaniu. Próbkę można również traktować w celu jej zatężenia lub rozcieńczenia lub do przeniesienia kalprotektyny do oddzielnego ośrodka, np. na stałe podłoże. Przykładowo próbkę można rozcieńczyć przez dodawanie buforu albo innego wodnego ośrodka. Alternatywnie, próbka, zwłaszcza próbka osocza lub surowicy, może być użyta bezpośrednio.

Przed zastosowaniem w sposobie oznaczania według wynalazku próbkę ewentualnie traktuje się wapniem albo naśladowcą wapnia (np. jonami innego metalu ziem alkalicznych). Wapń albo naśladowca wapnia może być w dowolnej postaci, która dostarcza jonów Ca²⁺ (np. CaCl2). Jeżeli stosuje się wapń, wtedy korzystnie dodaje się do próbki wystarczającą ilość wapnia albo naśladowcy wapnia, by nasycić miejsca wiążące wapń w kalprotektynie. Na przykład, można dodać dziesięciomolowy nadmiar źródła wapnia, bardziej korzystnie, pięciomolowy, a zwłaszcza korzystnie trzymolowy nadmiar.

Chociaż oznaczenia kalprotektyny są znane i mogą być stosowane w sposobie według wynalazku, nie było poprzednio żadnych sugestii, że kalprotektyna jest wskaźnikiem (markerem) możliwości wystąpienia albo skłonności do choroby niedokrwiennej serca i udaru. Innymi słowy, nie było żadnych sugestii, że stężenie kalprotektyny u pacjentów pozbawionych objawów mogłoby być wykorzystane jako wskaźnik (marker) możliwości wystąpienia lub skłonności do tych chorób, a szczególnie, nie było żadnej sugestii, że stężenie kalprotektyny mogłoby zostać użyte jako wskaźnik (marker) w sposobie oznaczania odpowiednim dla masowego badania przesiewowego zdrowych osobników (tj. bez objawów).

W sposobie oznaczania według wynalazku można zastosować dowolną znaną metodę oznaczania kalprotektyny. Zatem, na przykład, sposób ujawniony w US-A-4833074 (Fagerhol i wsp.) do izolowania kalprotektyny i do dalszego wytwarzania monospecyficznych surowic odpornościowych do tego może być stosowany do wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko kalprotektynie do zastosowania w dowolnym konwencjonalnym sposobie oznaczania. Wytworzone przeciwciała skierowane przeciwko kalprotektynie można zastosować na przykład w testach immunoenzymatycznych lub radioimmunologicznych.

Można również na przykład zastosować formułę testu immunologicznego dla kalprotektyny

NycoCard® (Axis-Shield PoC, Oslo, Norwegia). W tym teście stosuje się fazę stałą, postać kanapki, w którym urządzenie testowe obejmuje błonę pokrytą unieruchomionymi przeciwciałami przeciw

PL 216 385 B1 kalprotektynie. Zatem próbkę (ewentualnie rozcieńczoną) wprowadza się do urządzenia i gdy próbka przepływa przez błonę, zostaje wychwycona obecna kalprotektyna. Następnie unieruchomioną na błonie kalprotektynę traktuje się koniugatem przeciwciało-złoto, który wiąże się z kompleksem kalprotektyna-przeciwciało, a intensywność zabarwienia (z powodu perełek ze złota), jak określono przez absorbancję światła czerwonego, jest proporcjonalna do ilości kalprotektyny. Zatem stężenie kalprotektyny można obliczyć z krzywej kalibracyjnej uzyskanej w konwencjonalny sposób.

Alternatywnie, można zastosować test handlowy (Calprest®) na kalprotektynę. W tym oznaczeniu stosuje się przeciwciało poliklonalne przeciwko kalprotektynie w teście immunoenzymatycznym fazy stałej. Kalprotektyna obecna w próbce pobranej od pacjenta wiąże się z przeciwciałem, które adsorbuje się do powierzchni plastikowej studzienki. Następnie dodaje się substrat dla enzymu i intensywność wytworzonego zabarwionego produktu jest proporcjonalna do ilości enzymu, a tym samym do ilości kalprotektyny. Zatem można z krzywej kalibracyjnej uzyskanej w konwencjonalny sposób obliczyć stężenie kalprotektyny.

Rzeczywiście, w handlu są dostępne zarówno mono- jak i poliklonalne przeciwciała przeciwko kalprotektynie. Przeciwciała poliklonalne pochodzące z jaja i przeciwciała królicze są dostępne na przykład od odpowiednio Norwegia Antibodies AS ind Axis-Shield Diagnostics, podczas gdy monoklonalne mysie przeciwciało można otrzymać od Dako A/S Dania. W sposobie według wynalazku do oznaczania stężenia kalprotektyny można zastosować dowolne przeciwciało przeciwko kalprotektynie otrzymane, na przykład, dowolną konwencjonalną techniką wytwarzania przeciwciał. Na przykład, przeciwciało królicze przeciwko kalprotektynie, jak również przeciwciała monoklonalne można wytworzyć według protokołu opisanego w Harlow i Lane (1988), Antibodies, Manual Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY.

Alternatywnie, można wytworzyć przeciwciała przeciwko kalprotektynie przez regularne wstrzyknięcia kurom roztworu zawierającego kalprotektynę, a następnie zebranie żółtek jaj kurzych. Zatem poliklonalne przeciwciało pochodzące z jaja kurzego można wyizolować według konwencjonalnych technik i oczyścić przez chromatografię powinowactwa.

Korzystnie, sposób według wynalazku nadaje się do stosowania w masowych badaniach przesiewowych zdrowych (tj. wolnych od objawów) pacjentów. Gdy wykrywa się możliwość wystąpienia albo skłonność do wskazanych powyżej chorób, można poddać pacjenta dalszemu testowaniu (np. używając bardziej kosztownych technik specyficznych dla tych chorób) w celu potwierdzenia ich obecności albo nieobecności.

Na ogół, przy przeprowadzaniu sposobu oznaczania oprócz próbki badanej będą oznaczane również próbki kalibracyjne o znanej zawartości kalprotektyny. Takie ustalenia mogą być użyte do wykreślenia krzywej kalibracyjnej, z której można wyznaczyć zawartość kalprotektyny w badanej próbce.

Rodzaj próbek kalibracyjnych i wybór czynników konwersji lub dostosowania stosowanych w oznaczaniu kalprotektyny może zmieniać się zależnie, na przykład, od sposobu, w którym kalprotektyna jest wykrywana w aktualnie stosowanej technice oznaczania i od innych aspektów sposobu, które oddziałują na wynik oznaczenia, na przykład od składu buforu, warunków oznaczania etc.

Typowo będą stosowane próbki kalibracyjne mające zawartość kalprotektyny od 0 do 5000 mg/l. Zakres odniesienia, w obrębie którego zwykle znajdują się wartości stężenia ka lprotektyny, wynosi od 0,1 do 10 mg/l.

Na ogół, stężenie kalprotektyny w surowicy i osoczu ludzi z małą możliwością wystąpienia choroby niedokrwiennej serca lub udaru albo skłonności do tych chorób bądź z brakiem takiej możliwości lub skłonności, będzie w zakresie 0,01-0,45 mg/l. Bardziej konkretnie, stężenie kalprotektyny w surowicy i osoczu takich ludzi będzie w zakresie 0,05-0,45 mg/l, nawet bardziej konkretnie 0,10-0,45 mg/l, na przykład, w zakresie 0,15-0,45 mg/l. Na przykład, stężenie kalprotektyny w surowicy albo w osoczu kobiety z małą możliwością wystąpienia albo bez możliwości wystąpienia albo skłonności do choroby niedokrwiennej serca lub udaru będzie w zakresie 0,09-0,45 mg/l, na przykład, około 0,31 mg/l albo 0,30 mg/l. Stężenie kalprotektyny w surowicy albo w osoczu mężczyzny z małą możliwością wystąpienia albo bez możliwości wystąpienia tych chorób albo skłonności do tych chorób będzie w zakresie 0,12-0,45 mg/l, na przykład, 0,30-0,39 mg/l, zwłaszcza 0,31 mg/l.

Na ogół stężenie kalprotektyny w surowicy albo w osoczu większe niż 0,45 mg/l będzie bardzo silnie wskazywało na możliwość wystąpienia albo skłonności do choroby niedokrwiennej serca lub udaru. Zatem wartość progowa, powyżej której można przewidywać możliwość wystąpienia

PL 216 385 B1 albo skłonności do tych chorób, może na ogół wynosić, na przykład około 0,67 mg/l, zwłaszcza około

0,70 mg/l, szczególnie około 0,76 mg/l.

Wartości progowe oblicza się z oznaczeń kalprotektyny stosując te same techniki oznaczania dla tego samego rodzaju próbki płynu ustrojowego od szeregu pacjentów tego samego rodzaju (wiek, płeć, waga, gatunek etc.) od zdrowych poprzez wczesne stadium choroby niedokrwiennej serca do poważnego stadium. Nawet bardziej korzystnie, wartości progowe będą określone dla tego samego pacjenta we wcześniejszym, zdrowym stanie. W ten sposób, szczególnie u pacjentów o wysokim stopniu ryzyka, można byłoby monitorować poziomy kalprotektyny na podstawie rutynowych badań (np. co 6 miesięcy do 1 roku) w masowych programach badań przesiewowych.

Sposób oznaczania według niniejszego wynalazku, korzystnie obejmuje dodatkowo oznaczenie stężenia drugiego wskaźnika możliwości wystąpienia lub skłonności do choroby niedokrwiennej serca i udaru w próbce pobranej od pacjenta. Przykładami odpowiednich wskaźników mogą być homocysteina, aktywowany czynnik XII, cholesterol, stosunek cholesterol:HDL, fibrynogen, aktywator plazminogenu typu tkankowego, czynniki V, VII i VIII, lipoproteina (a), antygen czynnika von Willebrand'a, kompleks plazmina-a2 antyplazmina, fragment 1+2 protrombiny, kompleks trombina - antytrombina III, fibrynopeptyd A, produkty degradacji włóknika, dimer-D, aktywowane białko C-odporne, czynnik VIIc i VIla, trombina, surowiczy amyloid A, cząsteczki przylegania naczyniowego i wapń wieńcowy.

Korzystnie drugi wskaźnik jest wybrany spośród homocysteiny i białka C-reaktywnego, bardziej korzystnie jest nim białko C-reaktywne (CRP).

Korzystnie, stężenie CRP oznacza się równocześnie z oznaczeniem kalprotektyny albo kolejno.

Pomiar CRP można wykonać stosując dowolną standardową technikę testu immunologicznego (np. ELISA, RIA etc.) albo można określić przez NycoCard ® (dostępny od Axis - Shield PoC, Oslo, Norwegia).

Stężenie kalprotektyny w surowicy albo w osoczu większe niż 0,75 mg/l w połączeniu ze stężeniem CRP większym niż 1,75 mg/l na ogół będzie bardzo silnie wskazywało na możliwość wystąpienia albo skłonności do choroby niedokrwiennej serca lub udaru.

Korzystnie, obecność wyżej wymienionych stężeń silnie wskazuje na możliwość wystąpienia albo skłonności do tych chorób niż samo stężenie kalprotektyny albo CRP.

Zatem wartości progowe kalprotektyny i CRP, powyżej których oznaczenie będzie nadawać się do przewidywania możliwości wystąpienia albo skłonności do choroby niedokrwiennej serca lub udaru mogą na ogół wynosić odpowiednio 0,32-0,77 mg/l i 1,70 mg/l, bardziej korzystnie odpowiednio około 0,67 mg/l i 1,75 mg/l, jeszcze bardziej korzystnie odpowiednio około 0,70 mg/l i 2,00 mg/l, a zwłaszcza odpowiednio około 0,76 mg/l i 2,25 mg/l. Zwłaszcza wartości progowe, powyżej których oznaczenie może nadawać się do przewidywania możliwości wystąpienia lub skłonności do tych chorób, są odpowiednio w zakresie 0,30-0,50 mg/l i 0,75 mg/l, a nawet jeszcze bardziej odpowiednie wartości są w zakresie 0,32-0,47 mg/l i 0,75 mg /I odpowiednio, na przykład około 0,45 mg/l i 0,75 mg/l.

Szczególnie korzystnym sposobem oznaczania dla oszacowania stężenia kalprotektyny w sposobie według niniejszego wynalazku jest test immunologiczny oparty na cząstkach. Jest to czuła technika, oparta na turbidymetrycznym wykrywaniu stężenia kalprotektyny. Czułość oznaczenia korzystnie pozwala na wykrycie, przy dużym poziomie precyzji, stosunkowo niskich stężeń kalprotektyny w próbkach płynu ustrojowego (np. osocza lub surowicy). W tym samym czasie można dokładnie zmierzyć stosunkowo wysokie stężenia kalprotektyny.

Określanie turbidymetryczne również ma tę zaletę, że nie wymaga w oznaczeniu żadnej stałej powierzchni do fizycznego oddzielania i nie wymaga etapów wielokrotnych płukań i/lub oddzielania. Zatem porównując z technikami wcześniejszego stanu techniki (np. ELISA), homogeniczne turbidymetryczne oznaczanie kalprotektyny jest szybkie i łatwe do przeprowadzenia i może na przykład zostać zautomatyzowane. W porównaniu z automatyzacją niehomogenicznych technik obejmujących, na przykład powierzchnię stałą, automatyzacja oznaczenia opartego na turbidymetrii jest stosunkowo łatwa. Również zautomatyzowany homogeniczny proces jest często mniej podatny, na przykład na zepsucie się.

Zautomatyzowane oznaczenie turbidymetryczne jest również szybkie, uwzględniając wysoką przepustowość próbek, i stosunkowo tanie w realizacji. Typowo można je wykonać stosując dostępny w handlu robot, np. Cobas Mira albo Hitachi 711, oba dostępne od Roche Diagnostics. Takie zautomatyzowane oznaczenie jest szczególnie atrakcyjne, gdy przewiduje się rutynowe testowanie osobników na możliwość lub skłonność do CVD.

PL 216 385 B1

Próbką dla turbidymetrycznego oznaczania stężenia kalprotektyny jest krew albo próbka krwiopochodna, surowica albo osocze, wolna od komórek.

Próbkę można zatem traktować w celu usunięcia dowolnych komórek i/lub nieoznaczanych składników próbki. Próbkę można również traktować w celu jej zatężania lub rozcieńczania lub w celu przeniesienia kalprotektyny do oddzielnego ośrodka np. na stałe podłoże. Na przykład, próbkę można rozcieńczyć przez dodawanie wody, buforu albo innego wodnego ośrodka. Alternatywnie, próbkę, szczególnie próbkę surowicy albo osocza, można stosować bezpośrednio. Przed zastosowaniem w sposobie oznaczania próbkę, ewentualnie traktuje się wapniem albo naśladowcą wapnia. Wapń albo naśladowca wapnia może być w dowolnej postaci, która dostarcza jonów Ca²⁺ (np. CaCl2). Jeśli stosuje się wapń, wtedy korzystnie do próbki dodawana jest wystarczająca ilość wapnia lub jego naśladowcy, aby nasycić miejsce wiązania wapnia w kalprotektynie. Na przykład, można dodać dziesięciomolowy nadmiar źródła wapnia, bardziej korzystnie, pięciomolowy nadmiar a zwłaszcza korzystnie trójmoIowy nadmiar.

Zmętnienie, dla turbidymetrycznego określania stężenia kalprotektyny, na ogół będzie wytworzone przez skontaktowanie próbki zawierającej kalprotektynę, albo jej wodnego roztworu z przeciwciałem przeciwko kalprotektynie, fragmentem przeciwciała albo mieszaniną przeciwciał przeciwko kalprotektynie (np. mieszaniną przeciwciał monoklonalnych). Do wytworzenia zmętnienia może, na przykład, być stosowane przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej kalprotektynie pochodzące z jaja dostępne w handlu od Norwegian Antibodies AS. W sposobie według wynalazku do oznaczania stężenia kalprotektyny można zastosować dowolne przeciwciało przeciwko kalprotektynie otrzymane, na przykład, dowolną konwencjonalną techniką wytwarzania przeciwciał.

Przeciwciała, albo fragmenty przeciwciał, które są stosowane do turbidymetrycznego oznaczania stężenia kalprotektyny, korzystnie nie wykazują albo wykazują słabe reakcje krzyżowe z innymi białkami krwi, które mogą być obecne w eluacie. Zastosowana ilość przeciwciała, albo fragmentu przeciwciała, powinna oczywiście być zoptymalizowana w stosunku do próbek standardowych zawierających kalprotektynę, ponieważ zmętnienie powstaje z „efektu połączenia”, zgodnie z którym wielokrotne wiązanie kalprotektyny wytwarza centra zmętnienia. Kalprotektyna, jak wspomniano powyżej, ma liczne miejsca wiążące przeciwciało i jest szczególnie odpowiednia dla wykrywania w takim oznaczeniu.

W jednym korzystnym wykonaniu, przeciwciało przeciwko kalprotektynie albo fragment przeciwciała, mogą być unieruchomione przez związanie się albo sprzężenie zarówno bezpośrednie albo pośrednie, z jakimś dobrze znanym stałym podłożem albo matrycą, która jest powszechnie stosowana do unieruchamiania.

Korzystnie stałe podłoże albo matryca przyjmuje postać cząstek, korzystnie nanocząstek. Dogodnie stałe podłoże może być wykonane ze szkła, krzemionki, lateksu, metalu (np. złota) albo materiału polimerowego (np. polietylenu).

Korzystnie stałe podłoże wytwarza się z materiału polimerowego, takiego jak polietylen.

Wiązanie albo unieruchomienie przeciwciała przeciwko kalprotektynie albo fragmentu przeciwciała można osiągnąć stosując konwencjonalne techniki. Na przykład, awidyna (dostępna od Pierce Company Chemical) może być unieruchomiona na nanocząstkach polistyrenowych aktywowanych chlorometylem (dostępne od Interfacial Dynamic Corporation, USA) przez wstrząsanie w buforze (np. w temperaturze pokojowej przez 24 godziny), a następnie stosowana w połączeniu ze znakowanym biotyną przeciwciałem przeciwko kalprotektynie (wytworzonym zgodnie z konwencjonalnymi technikami w dziedzinie). W ten sposób, na przykład, osocze pobrane od pacjenta badanego na możliwość wystąpienia lub skłonność do choroby niedokrwiennej serca i udaru dodaje się do roztworu nanocząstek powleczonych awidyną w kwarcowej kuwecie spektrofotometru, a następnie dodaje się wyznakowane biotyną przeciwciało przeciwko kalprotektynie. Następnie dokonuje się odczytów turbidymetrycznych.

Alternatywnie, przeciwciała znakowane biotyną można dodać wcześniej przed dodaniem osocza lub surowicy. Innymi słowy, podczas gdy te same odczynniki typowo są stosowane bez względu na instrument użyty do wykrywania zmętnienia, szczegółowa kolejność, w której różne odczynniki są dodane, może się zmienić. Ogólnie, kolejność stosowania powinna być zgodna z instrukcjami załączonymi do stosowanego spektrofotometru (np. spektrofotometru UV-160 Shimadzu).

Przeprowadza się odczyty turbidymetryczne (tj. mierzy się absorpcję światła przy odpowiedniej długości fali w regularnych odstępach) i określa się absorpcję światła w stosunku do odniesienia. W celu dokonania odczytów turbidymetrycznych można ewentualnie stosować instrumenty o wielo8

PL 216 385 B1 krotnej długości fali i można dostarczyć dokładniejsze wyniki. Odpowiednie instrumenty dla przeprowadzenia odczytów turbidymetrycznych obejmują Cobas Mira, Roche Integra and Merck Turbiquant.

W alternatywnym doświadczalnym zestawie, przeciwciało przeciwko kalprotektynie, albo fragment przeciwciała, może być unieruchomione bezpośrednio na nanocząstkach aktywowanych chlorometylem (dostępnych od Interfacial Dynamic Corporation, USA). Na przykład, przeciwciało przeciwko kalprotektynie (np. przeciwciało poliklonalne pochodzące z jaja dostępne od Norwegian Antibodies AS) można zmieszać z wyżej wymienionymi aktywowanymi cząstkami w buforze (10 mM boranu, 15 mM chlorku sodu, pH 9,0) i wstrząsać (np. w temperaturze pokojowej przez 24 godziny), aby uzyskać nanocząstki pokryte przeciwciałami przeciw kalprotektynie. Takie nanocząstki można zastosować do turbidymetrycznego określania stężenia kalprotektyny przez dodawanie ich do próbki osocza lub surowicy pobranej od pacjenta poddanego badaniu na możliwość wystąpienia albo skłonność do choroby niedokrwiennej serca i udaru w buforze i dokonanie odczytów turbidymetrycznych w trybie kinetycznym.

Alternatywnie, osocze albo surowicę można dodać do nanocząstek pokrytych przeciwciałami przeciwko kalprotektynie. Inaczej mówiąc, podczas gdy te same odczynniki są typowo stosowane bez względu na instrument użyty do wykrywania zmętnienia, dokładna kolejność, w której różne odczynniki są dodawane, może się zmienić. Ogólnie, kolejność stosowania powinna być zgodna z instrukcjami załączonymi do używanego spektrofotometru (np. spektrofotometru Shimadzu UV-160).

Przykłady zautomatyzowanych robotów, które są odpowiednie, do przeprowadzania odczytów turbidymetrycznych zgodnie z metodą oznaczenia według wynalazku, obejmują Cobas Mira i Hitachi 711, oba są dostępnie od Roche Diagnostics.

Cząstki, z którymi przeciwciało, albo fragment przeciwciała, może być związany, są typowo kuliste. Wielkość cząstek stosowanych w oznaczeniu może wpływać na precyzję, z którą mierzy się stężenie kalprotektyny. Podczas gdy większe cząstki umożliwiają wykrycie niższych stężeń kalprotektyny, ich zmniejszona powierzchnia właściwa oznacza, że mają one niższą zdolność wiązania. Na przykład, podwajając średnicę cząstek, zmniejsza się o połowę zdolność wiązania jednostki masowej cząstek.

Dodatkowo zwiększająca się średnica cząstki zwiększa poziom absorpcji światła tła i zawiesiny świetlnej przy długościach fali typowo stosowanych w takich oznaczeniach (np. 330 do 600 nm). Zatem, podczas gdy większe cząstki zwiększają czułość oznaczenia, może temu towarzyszyć pewna utrata dokładności, a w szczególności, wzrost liczby otrzymanych fałszywych ujemnych wyników. To jest szczególnie prawdopodobne w przypadku próbek zawierających stosunkowo wysokie stężenia kalprotektyny (tj. próbek otrzymanych od osób z wysoką możliwością albo skłonnością do choroby niedokrwiennej serca i udaru, w których miejsca wiążące związanych nanocząstek mogą zostać nasycone bez związania całej kalprotektyny.

Te przeciwnie działające efekty towarzyszące zmianie wielkości cząstki (np. zwiększenie rozmiaru cząstki zwiększa czułość, ale zmniejsza dokładność) przedstawiają znaczący problem do przezwyciężenia przy zwiększaniu czułości oznaczenia do wykrywania zakresu poziomów kalprotektyny obecnych w płynach ustrojowych.

W sposobie według wynalazku w etapie oznaczania korzystne jest również, aby zastosowane cząstki pozwalały na precyzyjne wykrywanie szerokiego zakresu stężeń kalprotektyny. To może oznaczać, że wysoki poziom ufności może być przypisany zarówno do wyników ujemnych (tj. stężenia spadającego poniżej wartości progowej) jak i wyników dodatnich. Jest to szczególnie korzystne w sposobie według wynalazku, że można zmierzyć próbki mające stężenie kalprotektyny w zakresie 0,5-50 mg/l (np. 1-40 mg/l).

Cząstki, z którymi przeciwciało, albo fragment przeciwciała, mogą wiązać się, są typowo kuliste o średnicy 1-150 nm, na przykład 10-90 nm albo 15-60 nm, na przykład, 44 nm.

W szczególnie korzystnym sposobie oznaczania, cząstki z którymi wiąże się przeciwciało albo fragmenty przeciwciała, mają średnicę 55-140 nm, bardziej korzystnie 65-110 nm, na przykład, 70-90 nm.

Alternatywnie, można zmierzyć średnicę cząstek, gdy tylko przeciwciała albo fragmenty przeciwciał zwiążą się z ich powierzchnią. W tym przypadku, średnica cząstek opłaszczonych przeciwciałem albo fragmentem przeciwciała wynosi korzystnie 65-140 nm, bardziej korzystnie 75-120 nm, jeszcze bardziej korzystnie 80-100 nm. Opłaszczone cząstki o tych rozmiarach są zwłaszcza korzystne, gdy badaną próbką jest osocze.

Cząstki, w stanach zarówno „gołym” jak i opłaszczonym, korzystnie mają średnicę, która nie pozwala na absorpcję długości fali światła użytego do określania spektrofotometrycznego. Zatem zawiesina pokrytych nanocząstek jest w przybliżeniu (np. zasadniczo) przezroczysta, dopóki nie pojawi się

PL 216 385 B1 zaindukowane kalprotektyną tworzenie się agregatu skutkujące tworzeniem się agregatów mających większą średnicę. Takie agregaty mają zdolność do absorbowania długości fali światła użytego przez spektrofotometr.

Dalej, zasadniczo wszystkie cząstki są korzystnie tej samej wielkości, bardziej konkretnie, wszystkie mają tę samą średnicę. Korzystnie, stosowane są metal monodyspersyjny (np. złoto) albo cząstki polimeru. Cząstki polimeru monodyspersyjnego są dostępne od Dynal Biotech AS,

Oslo, Norwegia.

Nie wiążąc się z teorią, może być, że zastosowanie unieruchomionego przeciwciała albo fragmentów przeciwciała zwiększa czułość oznaczenia przez zwiększenie rozmiaru miejsc generujących zmętnienie pochodzące od kalprotektyny a zatem i ilości światła rozpraszanego.

Być może, że przez zastosowanie podłoża stałego albo matrycy (np. nanocząstek), które mają zasadniczo ten sam rozmiar, czułość oznaczenia turbidymetrycznego dalej wzrasta.

Jak w rutynowych oznaczeniach turbidymetrycznych, korzystnie do eluatu dodawany jest polimerowy wzmacniacz zmętnienia, taki jak glikol polietylenowy.

Zanim wykona się oznaczenie turbidymetryczne, frakcję przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, korzystnie związaną z nanocząstką i ewentualnie wzmacniacz, można inkubować przez krótki czas, np. 5 minut do godziny, korzystnie około 10 minut, w temperaturze pokojowej. Ewentualnie, w określaniu stężenia kalprotektyny przy użyciu techniki turbidymetrycznej, można zastosować kinetyczny tryb odczytywania.

Światło stosowane do określania zmętnienia powinno mieć odpowiednią długość fali, na przykład, 300-600 nm. Stwierdzono, że użycie filtra 300-450 nm, korzystnie filtr 340 nm albo 405 nm, daje dobre rezultaty. Użycie filtra 560 nm może również dać szczególnie dobre wyniki.

Na ogół, w dodatku do badanej próbki będą również oznaczane próbki kalibracyjne o znanych zawartościach kalprotektyny. Takie wyznaczenia można zastosować do wykreślenia krzywej kalibracyjnej, z której można określić zawartość kalprotektyny w badanej próbce.

Korzystnie próbki kalibracyjne mają zawartości kalprotektyny aż do 5000 mg/l (np. 1500, 1000, 750, 250, 100) albo do 100 mg/l (np. 75, 50, 25, 5, 1,0 i 0,5 mg/l). Bardziej korzystnie próbki do kalibracji mają zawartość kalprotektyny do 10 mg/I (np. 10, 8, 6, 4, 2 mg/l), jeszcze korzystniej do 5 mg/l (5; 4,5; 4; 3,5; 3; 2,5; 2;1,5; 1; 0,5 mg/l).

Powyżej opisane turbidymetryczne oznaczenie do określania stężenia kalprotektyny jest zaskakująco godne zaufania, szybkie, tanie, łatwe i odpowiednie do automatyzacji. W przeciwieństwie do aktualnie dostępnych sposobów oznaczania, które są stosunkowo złożone i nie są bezpośrednio przydatne do zautomatyzowanych wielozadaniowych maszyn diagnostycznych zwykle używanych przez laboratoria diagnostyczne.

Automatyzacja jest szczególnie pożądana, gdy włączone są liczne etapy mieszania, dodawania i/lub rozcieńczenia ponieważ można je osiągnąć z wyższym stopniem dokładności. Roboty mogą też zaoferować wyższy poziom wiarygodności i/lub powtarzalności. Automatyzacja powiększa też przepustowość.

Aktualnie dostępne sposoby oznaczania, które mogą zaoferować sensowne poziomy dokładności (np. ELISA) są jednakże trudne do zautomatyzowania. Przynajmniej częściowo tak jest, ponieważ typowo obejmują liczne płukania i etapy rozdzielania (np. przyleganie do powierzchni stałej) i automatyzacja procesów niejednorodnych jest często problematyczna. Procesy te typowo obejmują również stosunkowo dużą liczbę etapów, które powiększają złożoność dowolnego zautomatyzowanego procesu. Inne konwencjonalne techniki do oznaczania kalprotektyny (np. nefelometria) oferują wysoką precyzję, ale wymagają, specjalnego wyposażenia koniecznego do przeprowadzenia pomiarów. Typowo wyspecjalizowane wyposażenie nie jest łatwe do włączenia do zautomatyzowanego protokołu.

Rzeczywiście, istnieje ustawiczna potrzeba tanich, godnych zaufania, szybkich i łatwych sposobów oznaczania kalprotektyny do stosowania w technikach diagnostycznych.

Wynalazek będzie teraz dalej opisany w odniesieniu do następujących nieograniczających go przykładów i towarzyszących figur, w których:

PL 216 385 B1

Figura 1 jest krzywą rozkładu dla kalprotektyny u 200 badanych pacjentów.

Statystyki podsumowania dla Figury 1: Test normalności Anderson-Darling'a

A 2:	8,160
Wartość P:	0,000
Wartość średnia	0,403
Odchylenie standardowe	0,238
Wariancja	0,057
Współczynnik asymetrii (skośności)	1,679
Współczynnik koncentracji (kurtoza)	3,302
N	199
Minimum	0,070
1-kwartyl	0,240
Mediana	0,340
3-kwartyl	0,500
Maksimum	1,370
95% granicy ufności dla Mu	0,370 0,436
95% granica ufności dla Sigma	0,217 0,264
95% granica ufności dla Mediany	0,310 0,370

Figura 2 jest krzywą rozkładu dla zawartości wapnia u 200 badanych pacjentów.

Podsumowanie statystyczne dla Figury 2: Test normalności Anderson-Darling'a

A 2:	25,037
Wartość P	0,000
Wartość średnia	217,060
Odchylenie standardowe	399,000
Wariancja	159201
Współczynnik asymetrii	3,462
Współczynnik kumulacji (kurtoza)	15,341
N	200
Minimum	0,00
1-kwartyl	0,00
Mediana	78,00
3-kwartyl	259,25
Maksimum	2794,00
95% Granica ufności dla Mu	161,2 272,70
95% Granica ufności dla Sigma	363,35 442,46
95% Granica ufności dla mediany	0,00 117,33

Figura 3 jest krzywą rozkładu dla hsCRP u 200 badanych pacjentów
Podsumowanie statystyczne dla Figury 3
Test normalności Anderson-Darling'a A 2:	21,221
Wartość P	0,000
Wartość średnia	2,331
Odchylenie standardowe	2,970
Wariancja	8,819
Współczynnik asymetrii (skośności)	2,243
Współczynnik kumulacji (kurtoza)	5,103
N	197
Minimum	0,150

PL 216 385 B1

1-kwartyl

Mediana

3-kwartyl

Maksimum

95% granica ufności dla Mu

95% granica ufności dla Sigma

95% granica ufności dla mediany

0,540 1,150 2,580 16,30 1,913 2,748 2,703 3,296 0,933 1,375

Figura 4 jest krzywą rozkładu dla homocysteiny u 200 badanych pacjentów.

Podsumowanie statystyczne dla figury 4:

Test normalności Anderson-Darling'a

A²: 2,535

Wartość P: 0,000

Wartość średnia 8,391

Odchylenie standardowe 1,966

Wariancja 3,867

Współczynnik asymetrii(skośności) 0,875

Współczynnik koncentracji (kurtoza) 0,730

N 199

Minimum 5,100

1-kwartyl 7,100

Mediana 8,100

3-kwartyl 9,600

Maksimum 15,300

95% granica ufności dla Mu 8,117

8,666

95% granica ufności dla Sigma 1,790

2,181

95% granica ufności dla mediany 7,620

8,400

Figura 5 jest wykresem kropkowym dla rozkładu kalprotektyny między dodatnimi a ujemnymi wynikami wapnia; i Figury 6 i 7 są krzywymi ROC dla kalprotektyn i hsCRP dla wszystkich 200 testowanych pacjentów i odpowiednio dla badanych pacjentów rodzaju męskiego.

P r z y k ł a d 1

Przeciwciało przeciwko-kalprotektynie (a) Izolowanie kalprotektyny

Kalprotektynę można wyizolować według sposobów opisanych w Przykładach 1 i 2 z US-A4/833,074 (Fagerhol). Kalprotektynę można alternatywnie oczyścić z „kożuszka - górnej jaśniejszej warstwy skrzepu zawierającej osocze i krwinki białe. Zawiesinę komórkową w 2,5 mM EDTA sporządza się przez dodanie EDTA (50 mM, pH 7) do komórek. Następnie komórki płucze się w 160 mM chlorku amonu/10 mM kwaśnym węglanie sodu przez 3 minuty i wiruje (160 x g) przez 10 minut w 4°C. Otrzymany osad płucze się w EDTA (2,5 mM)/ NaCl (150 mM) i odwirowuje (55 x g) przez dalsze 10 minut w 4°C. Następnie osad zawiesza się ponownie w 0,625 mM EDTA /18,75 mM Diemal, pH 7,4 i zamraża w -70°C przez co najmniej 24 godziny.

Po rozmrożeniu otrzymany materiał wiruje się (przy 3700 xg) przez 30 minut, następnie supernatant usuwa się i filtruje (filtrem 0,45 μm dostępnym od Millipore), następnie nakłada się na jonowymienną kolumnę z (dietylaminoetylo) sefarozą DEAE/(dostępną od Pharmacia), wstępnie przygotowaną z zastosowaniem buforu wiążącego (np. 0,63 mM EDTA / 18,75 mM Diemal, pH 7,4). Dowolny niezwiązany materiał przechodzi przez kolumnę i jest eluowany. Jednocześnie cały niezwiązany materiał jest eluowany z kolumny, czystą kalprotektynę eluuje się stosując zawierający wapń bufor do wymywania (np. 75 mM buforem Diemal/10 mM CaCl2). Otrzymuje się około 25 mg kalprotektyny na „kożuszek”.

PL 216 385 B1 (b) Przygotowanie przeciwciał przeciwko kalprotektynie

Przeciwciała przeciwko kalprotektynie można przygotować według sposobu opisanego w Przykładzie 3 z USA-4,833,074 (Fagerhol).

Alternatywnie można przygotować przeciwciało poliklonalne pochodzące z jaja kury. Roztwór obejmujący kalprotektynę (0,5 mg/ml) i adiuwant Freunda wstrzykuje się kurze co 14 dni czterokrotnie (albo przez dwa miesiące), a następnie jednorazowo każdego miesiąca. Po 12 tygodniach, można zebrać jajka kur ze wstrzykniętą kalprotektyną, a ich żółtka usunąć (bez błony). Po rozcieńczeniu w HCl (5 mM), żółtko wiruje się i zbiera supernatant. Następnie filtruje się supernatant i traktuje nasyconym siarczanem amonu do końcowego stężenia 3,8 M. Mieszaninę wiruje się, a wytworzony osad zbiera i rozpuszcza w buforze (0,11 octanu sodu M, 0,15 M NaCl, pH 7,4). Uzyskany roztwór w końcu dializuje się przez błonę o wielkości oczek 10000 kD, a następnie oczyszcza stosując chromatografię powinowactwa.

Kolumna stosowana zazwyczaj do chromatografii powinowactwa obejmuje aktywowaną matrycę z aktywowaną sukcynoimidem sefarozą (aktywowany HiTrap NHS dostępny od Amersham Pharmacia), która jest odpowiednia do unieruchamiania kalprotektyny. Bardziej konkretnie, aktywowana żywica reaguje spontanicznie, w pH 7-8, z wolnymi aminami w kalprotektynie. Do celów chromatografii dializowany roztwór zwykle rozcieńcza się do stężenia około 3 mg/ml w PBS przed użyciem go na kolumnie. Później przeciwciała przeciwko kalprotektynie eluuje się stosując 6 M mocznik w oziębionym lodem PBS lub 0,1 M roztworze cytrynianu sodu, pH 3,0.

Korzystnie stosuje się 0,1 M roztwór cytrynianu sodu. Po elucji, frakcje zawierające przeciwciało przeciwko kalprotektynie natychmiast rozcieńcza się i dializuje w PBS.

P r z y k ł a d 2

Turbidymetryczne oznaczanie kalprotektyny (a) Przygotowanie nanocząstek opłaszczonych awidyną

600 μm 4,2% wag./obj. nanocząstek aktywowanych chlorometylem (średnica 44 nm) dostępnych od Interfacial Dynamic Corporation, US dializuje się z wodą stosując błonę o wielkości porów 10000 kD. Dodaje się i miesza 0,5 ml roztworu boranu (10 mM) i chlorku sodu (15 mM) o pH 9,0. Dodaje się 10 mg awidyny, rozpuszczonej w 0,5 ml roztworu 10 mM boranu i 15 mM NaCl o pH 9 (dostępny od Pierce Chemical Company) i porusza się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie dodaje się 40 μl roztworu glicyny (2M, pH 9,0) i mieszaninę miesza się przez dalsze 4 godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie cząstki rozcieńcza się do objętości 100 ml i diafiltruje, po pierwsze w 500 ml roztworu 10 mM boranu i 15 mM chlorku sodu o pH 9,0, a po drugie w roztworze 25 mM Tris, 150 mM chlorku sodu i 0,01% Tween® 20 w pH 7,4 (dostępnym od Sigma USA) stosując Filtr Pellicon, XL ( odcina 300,000) i System skali roboczej TTP (dostępny od Millipore) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi od dostawców przyrządów. W końcu przez wirowanie i ponowne zawieszenie cząstek w roztworze 25 mM TRIS, 150 mM chlorku sodu i 0,01% Tween® 20 otrzymuje się pożądane stężenie nanocząstek opłaszczonych awidyną. Wszelkie agregaty tworzone podczas tej procedury przygotowania mogą być usunięte przez powolne wirowanie.

(b) Oznaczanie kalprotektyny z użyciem nanocząstek opłaszczonych awidyną

Zawiesinę mającą stężenie około 0,30 mg cząstek powyżej opisanych nancząstek opłaszczonych awidyną na ml przygotowuje się przez wirowanie i ponowne zawieszenie powyżej opisanego preparatu w roztworze 25 mM TRIS, 150 mM NaCI, 0,1% Tween® 20 i 2% PEG 6000 o pH 7,4 (dostępnym od Sigma). W kwarcowej kuwecie do odczytu, spektrofotometru transmisyjnego (np. Shimadzu UV-160) miesza się 500 μl tej zawiesiny cząstek z próbką osocza (około 20 μθ pobraną od pacjenta poddawanego badaniu na skłonności do CVD. Po 60 sekundach rejestruje się absorpcję światła monochromatycznego 340 nm, 75 μg przeciwciała przeciwko kalprotektynie znakowanego 0,15 nmol biotyną (np. oczyszczone przez powinowactwo przeciwciało poliklonalne pochodzące z jaja znakowane biotyną nabyte od Antibodies Norwegian AS, Norway), rozpuszczonego w 50 μl roztworu 25 mM TRIS, 150 mM NaCl i 0,1% Tween® 20 o pH 7,4 dodaje się do kwarcowej kuwety i miesza. Natychmiast rejestruje się absorpcję światła monochromatycznego 340 nm stosując kuwetę odnośnikową zawierającą roztwór 25 mM TRIS, 150 mM NaCI i 0,1% Tween® 20 o pH 7,4 i ponownie rejestruje się w regularnych odstępach (np. co 2 minuty) aż do upłynięcia 15 minut. Wzrost absorpcji w każdym punkcie czasowym oblicza się zgodnie ze standardowym odczytem turbidymetrycznym w trybie kinetycznym albo „punkcie końcowym” odczytu. Tak więc wzrost absorpcji światła w każdym

PL 216 385 B1 punkcie czasowym oblicza się w stosunku do odczytu wykonanego przed dodaniem nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem i/albo na końcu zapisu.

Krzywą kalibracyjną konstruuje się przez przeprowadzanie identycznej procedury z wzorcami o znanym stężeniu kalprotektyny. Stężenie kalprotektyny w próbce można następnie obliczyć z krzywej kalibracyjnej.

P r z y k ł a d 3

Alternatywne Turbidymetryczne oznaczanie kalprotektyny (a) Przygotowanie nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem przeciwko kalprotektynie ml 4,2% wag./obj. nanocząstek aktywowanych chlorometylem (średnica 44 nm) dostępnych od Interfacial Dynamic Corporation, US dializuje się ponownie z wodą stosując błonę o wielkości oczka 10,000 kD. Następnie dodaje się roztwór 0,5 ml 10 mM boranu i 15 mM roztworu chlorku sodu o pH 9,0. 27 mg oczyszczonych przeciwciał przeciwko kalprotektynie (np. oczyszczone przez powinowactwo przeciwciała poliklonalne pochodzące z jaja dostępne od Norwegian Antibodies AS, Norway) dializuje się w roztworze 10 mM boranu i 15 mM chlorku sodu o pH 9,0.

Po dodaniu nanocząstek do oczyszczonych przeciwciał przeciwko kalprotektynie mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej 24 godziny. Dodaje się 40 μl roztworu glicyny (2 M o pH 9,0) i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez kolejne 4 godz.

Następnie cząstki rozcieńcza się do całkowitej wielkości 100 ml i diafiltruje z 1000 ml roztworu boranu 10 mM i 15 mM chlorku sodu o pH 9,0, do którego dodaje się 0,1% Tween® 20 i 3 mg/ml albuminy jaja stosując filtr Pellicon, XL (odcina 300,000) i system skalowania TFF (dostępny od Millipore) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi od dostawców przyrządów. W końcu przez odwirowanie i ponowne zawieszenie cząstek w roztworze otrzymuje się żądane stężenie nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem przeciwko kalprotektynie. Dowolne agregaty utworzone podczas tej procedury przygotowania można usunąć poprzez powolne odwirowanie.

(b) Oznaczanie kalprotektyny z użyciem nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem przeciwko kalprotektynie

Przygotowuje się zawiesinę zawierającą 400 μg opisanych powyżej nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem w 50 μl roztworu 10 mM boranu, 15 mM NaCl, 0,1% Tween® 20, 3 g/l albuminy jaja o pH 9,0.

Równocześnie, w kwarcowej kuwecie rejestrującego sekrofotometru (np. Shimadzu UV-160) umieszcza się 20 μl osocza, pobranego od badanego pacjenta na możliwość CVD w 500 μl buforu do oznaczania (25 mM TRIS, 150 mM NaCl, 0,1% Tween® 20 i 2% PEG 6000 o pH 7,4 (dostępny od Sigma) i mierzy się absorpcję światła monochromatycznego o długości fali 340. Po 60s, wspomnianą powyżej zawiesinę zawierającą 400 μg nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem dodaje się i miesza w kuwecie. Natychmiast po dodaniu nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem rejestruje się absorpcję światła i ponownie w regularnych odstępach (np. co 2 minuty) do upływu około 15 minut. Wzrost absorpcji światła w każdym punkcie czasowym oblicza się w stosunku do odczytu wykonanego przed dodaniem nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem i/lub na końcu zapisu. Inaczej mówiąc są wykonane, odczyty turbidymetryczne w trybie kinetycznym albo w „punkcie krańcowym”.

Krzywą kalibracyjną również konstruuje się przez przeprowadzanie identycznej procedury z wzorcami mającymi znane stężenie kalprotektyny. Stężenie kalprotektyny w próbce można wtedy obliczyć na podstawie krzywej.

P r z y k ł a d 4

Turbidymetryczne oznaczanie kalprotektyny a) Przygotowanie nanocząstek opłaszczonych streptawidyną

600 μm 4,2% wag./obj. nanocząstek aktywowanych chlorometylem (średnica 67 nm) dostępnych od Interfacial Dynamic Corporation, US dializuje się z wodą stosując błonę o wielkości oka 10,000 kD. 0,5 ml roztworu buforowego fosforanu (10 mM) i chlorku sodu (150 mM) o pH 7,4 dodaje się razem z 10 mg streptawidyny, rozcieńczonej w 0,5 ml roztworu buforowego 10 mM fosforanu i 150 mM NaCl o pH 7,4 (dostępny od Pierce Company Chemical) i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie 40 μl roztworu glicyny (2M, pH 9,0) dodaje się i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez kolejne 4 godz. Następnie cząstki rozcieńcza się do objętości 100 ml i diafiltruje, po pierwsze w 500 ml roztworu 10 mM boranu i 15 mM chlorku sodu o pH 9,0, a po drugie w 25 mM roztworu Tris, 150 mM chlorku sodu i 0,01% Tween® 20 o pH 7,4 (dostępny od Sigma US) stosując filtr Pellicon XL (odcina 300,000) i system skalowania TTF (dostępny od Millipore) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez dostawców przyrządów. W końcu żądane

PL 216 385 B1 stężenie nanocząstek opłaszczonych awidyną otrzymuje się przez odwirowanie i ponowne zawieszenie cząstek w roztworze 25 mM TRIS, 150 mM chlorku sodu i 0,01% Tween® 20. Wszelkie agregaty utworzone podczas tej procedury przygotowania można usunąć przez powolne odwirowanie.

Średnia wielkość cząstki nanocząstek opłaszczonych streptawidyną zmierzona przez Sinteff AS, Norway, wynosiła 82 nm.

b) Oznaczanie kalprotektyny z zastosowaniem nanocząstek opłaszczonych streptawidyną

Zawiesinę o stężeniu około 0,60 mg cząstek powyżej opisanych nanocząstek opłaszczonych awidyną na ml przygotowuje się przez odwirowanie i ponowne zawieszenie powyżej opisanego preparatu w roztworze 25 mM TRIS, 150 mM NaCl, 0,1% Tween® 20 i 1% PEG 6000 o pH 7,4 (dostępny od Sigma). W kwarcowej kuwecie do odczytu rejestrującego spektrofotometru (np. Shimadzu UV-160) 500 μΐ tej zawiesiny cząstek miesza się z próbką osocza (około 5 μl), pobranego od pacjenta badanego na skłonność do CVD. Rejestruje się absorpcję światła monochromatycznego 560 nm i po 60 s dodaje się 75 μg przeciwciała przeciwko kalprotektynie znakowanego 0,15 nmol biotyny (np. oczys zczone przez powinowactwo znakowane biotyną przeciwciało poliklonalne pochodzące z jaja nabyte od Norwegian Antibodies AS, Norway), rozcieńcza się w 50 μΐ roztworu 25 mM TRIS, 150 mM NaCI i 0,1% Tween® 20 o pH 7,4 i miesza. Stosując kuwetę odniesienia zawierającą roztwór 25 mM TRIS, 150 mM NaCI i 0,1% Tween® 20 o pH 7,4 natychmiast rejestruje się absorpcję światła monochromatycznego 340 nm i ponownie w regularnych odstępach (np. co 2 minuty) aż do około 15 minut. Wzrost absorpcji w każdym punkcie czasowym jest obliczony zgodnie ze standardowym odczytem turbidymetrycznym w trybie kinetycznym albo „punkcie końcowym” odczytów.

Zatem, wzrost absorpcji światła w każdym punkcie czasowym oblicza się w stosunku do odczytu wykonanego przed dodaniem nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem i/lub na końcu zapisu. Krzywą kalibracji buduje się przeprowadzając identyczną procedurę z wzorcami o znanym stężeniu kalprotektyny. Stężenie kalprotektyny w próbce można wtedy obliczyć na podstawie krzywej kalibracji.

P r z y k ł a d 5 (a) Przygotowanie nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem przeciwko kalprotektynie ml 4,2% wag./obj. nanocząstek aktywowanych chlorometylem (średnia średnica 67 nm) dostępnych od Interfacial Dynamic Corporation, US, dializuje się z wodą stosując błonę o wielkości oczka 10000 kD, a następnie rozcieńcza się do 10 ml wodą. 27 mg oczyszczonych przeciwciał poIiklonalnych pochodzących z jaja (np. oczyszczone przez powinowactwo przeciwciała poliklonalne pochodzące z jaja dostępne od Norwegian Antibodies AS, Norway) dializuje się z roztworem buforowym 10 mM boranu i 15 mM chlorku sodu i w końcu rozcieńcza się do 6 ml tym samym roztworem 10 mM boranu i 15 mM chlorku sodu o pH - 9,0.

Podczas poruszania, cząstki miesza się z przeciwciałami i kontynuuje się poruszanie w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie dodaje się 40 μl roztworu glicyny (2 M o pH 9,0) i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez kolejne 4 godziny.

Następnie cząstki rozcieńcza się do całkowitej objętości 100 ml buforem 10 mM boranu, 15 mM chlorku sodu, do którego dodaje się 0,1% Tween® 20 i 3 mg/ml albuminy jaja i diafiltruje z 1000 ml wspomnianego buforu boran/chlorek sodu, do którego dodaje się 0,1% Tween® 20 i 3 mg/ml albuminy jaja, stosując filtr Pellicon XL ( odcina 300000 D) i system skalowania TFF (dostępny od Millipore) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez dostawców przyrządu, a w końcu cząstki zatęża się do objętości od 40 do 100 ml.

Średnia wielkość otrzymanych cząstek, mierzonych przez Sinteff AS Norway wynosi 81 nm.

(b) Oznaczanie kalprotektyny przy użyciu nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem przeciwko kalprotektynie

Zawiesinę 0,7 mg/ml opisanych powyżej nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem przeciwko kalprotektynie wytwarza się w 0,25 mM TRIS, 0,15 M NaCI i 0,1% Tween o pH 8,0.

μl próbki osocza pobranej od pacjenta testowanego na CVD, rozpuszcza się w buforze testowym (460 pl, 25 mM TRIS, 150 mM NaCI, 0,1% Tween, 1,0% polietylenoglikolu 6000, pH = 7,4) i w kwarcowej kuwecie do odczytu w rejestrującym spektrofotometrze (np. Shimadzu UV-160) mierzy się absorpcję świetlną światła monochromatycznego 560 nm. Po 60 s dodaje się 100 pl powyżej wspomnianej zawiesiny zawierającej 0,7 mg/ml nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem i miesza się w kuwecie. Absorpcję światła rejestruje się przed i natychmiast po dodaniu nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem i ponownie w regularnych odstępach czasu (np. co 20 s), aż do upływu 15 minut. Wzrost absorpcji światła w każdym punkcie czasowym oblicza się w stosunku do odczytu

PL 216 385 B1 wykonanego przed dodaniem nanocząstek opłaszczonych przeciwciałem i na końcu zapisu. Inaczej mówiąc, robi się odczyty turbidymetryczne w trybie kinetycznym i/lub „punkcie końcowym”.

Krzywą kalibracji również konstruuje się przez przeprowadzanie identycznej procedury z wzorcami o znanym stężeniu kalprotektyny. Stężenie kalprotektyny w próbce można obliczyć z krzywej.

P r z y k ł a d 6

Analiza statystyczna

Porównanie kalprotektyny i innych wskaźników do wykrywania możliwości wystąpienia albo skłonności do choroby niedokrwiennej serca i udaru

Wykazano, że zwapnienie wieńcowe jest silnie związane z występowaniem wskazanych chorób zademonstrowano, że również może być przydatną metodą dla przewidywania skłonności do tych chorób (np. udaru mięśnia sercowego).

Zakres zwapnienia wieńcowego jest mierzony ilościowo z zastosowaniem elektronowej tomografii komputerowej (EBCT) i jest reprezentowany przez wskaźnik uwapnienia (CS). Wysoki wskaźnik uwapnienia reprezentuje wysoki poziom zwapnienia i wysokie ryzyko rozwoju CVD.

W następującym badaniu przetestowano CS u 200 pacjentów (100 kontrolnych i mających CS < 100 i 100 chorych mających CS > 100) w wieku 45 lat lub więcej jak również ich poziomy kalprotektyny, CRP i homocysteiny w osoczu lub surowicy. Do testowania stężenia kalprotektyny, CRP i homocysteiny w osoczu lub surowicy wykorzystano pacjentów, którzy albo sami - albo przez lekarza byli uważani jako osobnicy bezobjawowi mający skan tomografii EBCT w okresie poprzednich lat (zwykle w okresie poprzednich 6 miesięcy).

Sposoby

Kalprotektyna

Kalprotektynę zmierzono testem Calprest® (rozprowadzanym przez Eurospital®, Italy) i dane zsumowano dla pacjenta i grupy kontrolnej stosując odchylenie standardowe medianę minimum i maksimum. Przedziały istotności 95% obliczono dla mediany. Jako test normalności zastosowano obliczenie Anderson Darling'a.

Kalprotektynę również podsumowano z uwzględnieniem płci przez zastosowanie takiego samego podsumowania danych.

Współczynnik uwapnienia (CS)

Współczynnik uwapnienia określono przez elektronową tomografię komputerową (EBCT).

Zsumowano dane dla pacjenta i grupy kontrolnej.

Białko C-Reaktywne oznaczane przy użyciu wysoce czułej metody (hsCRP) hsCRP określono przez oznaczenie Dade Behring „N High Sensitivity CRP” (Roberts et al.,

Clinical Chemistry, 2000, 46:4, p 461-468). Dane zsumowano dla pacjenta i grup kontrolnych stosując wartość średnią, odchylenie standardowe, medianę, minimum i maksimum.

Homocysteina (Hyc)

Osoczową Homocysteinę (Hcy) określono metodą Abbott IMx (Shipchandler, M. T. i Moore E. G., Clinical Chemistry, 1995, 41:7, p. 991-994). Dane dla pacjenta i grupy kontrolnej zsumowano stosując odchylenie standardowe, medianę, minimum i maksimum.

Porównanie między CS i kalprotektyną, hsCRP, Hcy (i) Chi-kwadrat

Dla kowariancji między parami wskaźników zastosowano test Chi-kwadrat.

(ii) Iloraz szans

Iloraz szans użyty w tabeli typu 2x2 cross tabulation (tzn. tabeli Chi-kwadrat) jest stosunkiem różnic dwóch testów kowariancji do różnic dwóch testów niezgodności. Dlatego, iloraz szans może być interpretowany jako miara wielkości związku między dwoma testami. Iloraz szans obliczono dla CS w stosunku do odpowiednio kalprotektyny, hsCRP i Hcy.

Porównanie wartości median dla wskaźników (i) Test Mann-Whitney'a

Jest to test nieparametryczny (dane nie muszą mieć rozkładu normalnego), stosowany do testowania czy wartości median dwóch wskaźników są istotnie różne. Minitabela uszeregowuje wszystkie dane z obu zestawów danych w porządku, przydzielając 1 najniższej, aż do 200 dla najwyższej. Następnie oprogramowanie dodaje skale wyników dla dwóch porównywanych grup i informuje o wartości P, która wskazuje szansę, że losowe pobranie próbek, da mediany tak odległe jak te obserwowane w doświadczeniu.

PL 216 385 B1

Wartości mediany dla kalprotektyny, hsCRP i Hcy porównano do CS podzielonego na pacjenta i grupy kontrolne i zastosowano test Mann-Whitney'a dla oznaczenia istotności.

(ii) Krzywe-ROC dla kalprotektyny i współczynnika uwapnienia

Zdolność testu, do rozróżnienia przypadków chorych od zdrowych można ocenić stosując analizę krzywej charakterystyk roboczych (ROC). Analizę krzywej ROC zastosowano zarówno dla kalprotektyny jak i hsCRP jako porównanie tych dwóch wskaźników.

Krzywe ROC wytworzono z użyciem 11 ograniczeń dla obliczenia czułości (oś - y) i 1-swoistości (oś - x). Dane dla grup kontrolnych i grupy pacjentów połączono razem i uszeregowano od wartości najniższej do najwyższej. Analizę przeprowadzono na populacji całkowitej i na populacji męskiej. Powierzchnie pod krzywymi ROC obliczono stosując zasadę trapezoidalną.

Wyniki

Podsumowanie statystyczne dla kalprotektyny

Figura 1 pokazuje krzywą rozkładu dla wszystkich 200 testowanych pacjentów .

Tabela 1 poniżej pokazuje podsumowanie statystyczne dla kalprotektyny w grupach kontrolnej i chorych. Mediana dla stężenia kalprotektyny w grupie kontrolnej wynosi 0,31 mg/l w porównaniu do 0,38 mg/l w grupie chorych. W grupie kontrolnej mediana dla stężenia kalprotektyny wynosi 0,31 mg/l dla mężczyzn i 0,30 mg/l dla kobiet. W grupie chorych średnie stężenie kalprotektyny dla mężczyzn wynosi 0,39 mg/l w porównaniu do 0,31 mg/l dla kobiet.

T a b e l a 1

Podsumowanie statystyczne dla kalprotektyny

Kalprotektyna	Kontrole	Grupy chorych
Wszyscy	Kobiety	Mężczyźni	Wszyscy	Kobiety	Mężczyźni
N	100	59	41	100	15	85
SD	0,228	0,232	0,225	0,503	0,202	0,537
95%CI dla mediany median	0,28-0,34	0,28-0,33	0,27-0,39	0,34-0,43	0,19-0,47	0,34-0,45
Mediana (mg/l)	0,31	0,30	0,31	0,38	0,31	0,39
Min (mg/l)	0,09	0,09	0,11	0,07	0,08	0,07
Max (mg/l)	1,37	1,37	1,36	4,85	0,73	4,85

Podsumowanie statystyczne dla wskaźnika uwapnienia

Na Figurze 2 pokazano, krzywą dystrybucji dla wszystkich 200 testowanych pacjentów.

W Tabeli 2 poniżej pokazano podsumowanie statystyczne dla wskaźnika uwapnienia EBCT w grupach kontrolnych i grupach chorych. Mediana wskaźnika uwapnienia w grupie kontrolnej wynosi 0 w porównaniu z 259 w grupie chorych. Mediana wskaźnika uwapnienia wynosi 0 zarówno dla kobiet jak i mężczyzn w grupie kontrolnej i odpowiednio 315 i 256, w grupie chorych.

T a b e l a 2

Podsumowanie statystyczne dla wskaźnika uwapnienia

Zawartość wapnia	Grupa kontrolna	Grupa chorych
Wszyscy	Kobiety	Mężczyźni	Wszyscy	Kobiety	Mężczyźni
N	100	59	41	100	15	85
SD	5,6	0,7	8,7	474,7	365,1	493,3
95% Cl dla mediany	0-0	0-0	0-0	313,5-215,0	174,8-538,0	300,4-207,5
Mediana	0	0	0	259	315	256
Min	0	0	0	100	100	100
Max	56	5	56	2794	1507	2794

PL 216 385 B1

Podsumowanie statystyczne dla hsCRP

Na Figurze 3 pokazano krzywą dystrybucji dla wszystkich 200 testowanych pacjentów.

W poniższej Tabeli 3 pokazano podsumowanie statystyczne dla hsCRP w grupach kontrolnej i chorych. Mediana dla hsCRP zarówno w grupie kontrolnej jak i chorych wynosi 1,2 mg/l. Mediana dla hsCRP wynosi 1,6 mg/I dla kobiet, 0,7 mg/l dla mężczyzn w grupie kontrolnej i odpowiednio 1,3 mg/l i 1,1 mg/l, w grupie chorych.

T a b e l a 3

Podsumowanie statystyczne dla hsCRP

hsCRP	Grupa kontrolna	Grupa chorych
	Wszyscy	Kobiety	Mężczyźni	Wszyscy	Kobiety	Mężczyźni
N	100	59	41	100	15	85
SD	6,63	8,36	1,53	12,70	3,16	13,71
95% Cl dla mediany	0,79-1,47	1,36-2,74	0,56-0,97	0,94-1,56	0,65-2,53	0,89-1,59
Mediana (mg/l)	1,17	1,59	0,68	1,23	1,28	1,11
Min (mg/l)	0,15	0,15	0,15	0,17	0,34	0,17
Max (mg/l)	62,1	62,1	9,29	120,0	11,9	120,0

Podsumowanie statystyczne dla Hcy

Na Figurze 4 pokazano krzywą dystrybucji dla wszystkich 200 przetestowanych pacjentów.

W poniższej Tabeli 4 pokazano podsumowanie statystyczne dla Hcy w grupach kontrolnej i chorych. Mediana dla stężenia Hcy w grupie kontrolnej wynosi 7,5 μmol/l w porównaniu do 8,5 μmol/l w grupie chorych. Mediana stężenia Hcy wynosi 7,15 μmol/l dla kobiet i 8,55 μmola/l dla mężczyzn w grupie kontrolnej i odpowiednio 7,35 μmol/l i 8,55 μmol/l w grupie chorych.

T a b e l a 4

Podsumowanie statystyczne dla Hcy

Hcy	Grupa kontrolna	Grupa chorych
Wszyscy	Kobiety	Mężczyźni	Wszyscy	Kobiety	Mężczyźni
N	100	59	41	100	15	85
SD	1,94	1,58	2,18	6,03	2,18	6,46
95% Cl dla mediany	7,7-8,5	7,1-7,9	8,1-9,5	8,1-10,5	6,8-9,2	8,1-10,9
Mediana ^mol/l)	7,5	7,1	8,5	8,5	7,3	8,5
Min. ^mol/l)	5,3	5,3	5,3	5,1	5,1	5,2
Max. ^mol/l)	14,7	11,8	14,7	65,8	12,4	65,8

Porównanie między współczynnikiem uwapnienia i kalprotektyną, hsCRP oraz Hcy (i) test Chi-kwadrat

Stosując Minitabelę wykonano tabele chi-kwadrat (patrz tabela 5 poniżej). Test ten porównuje oczekiwane rozkłady między zestawami danych (zakładając rozkład losowy) i tymi zaobserwowanymi. Wartość istotności jest miarą stopnia, do którego dane nie mają rozkładu losowego. Na przykład, rozważając dane dodatnie dla kalprotektyny oczekiwano by, że byłyby nawet rozsiane między wapniem dodatnim i ujemnym (tj. 30,5 oczekiwanych w obu kolumnach). Jednakże zaobserwowane rozsianie wynosi 22 ujemnych i 39 dodatnich wskazań tendencji dla dodatnich kalprotektyn do współzmiany z dodatnimi wapniami Minitabela dostarcza przeciętnej miary istotności tych różnic (zarówno zgodności jak i niezgodności) i w tym przypadku P wynosi 0,009. Zatem występuje istotna kowariancja wapnia z kalprotektyną.

PL 216 385 B1

T a b e l a 5

Porównanie Chi-kwadrat dla kalprotektyny ze współczynnikiem uwapnienia

Wapń (co 100)
Kalprotektyna (co 0,45 mg/l)		Dodatnia (N)	Ujemna (N)	Całość (N)
Ujemna	Obs.	78	61	139
	Przyk.	69,5	69,5	139
Dodatnia	Obs.	22	39	61
	Przyk.	30,5	30,5	61
Całość	Obs.	100	100	200
	Przyk.	100	100	200

Analogiczne porównanie zostało zrobione między kalprotektyną i hsCRP (patrz Tabela 6 poniżej).

T a b e l a 6

Porównanie Chi-kwadrat kalprotektyny przeciwko hsCRP (P = 0)

	hsCRP (co 1,69 mg/l)
Kalprotektyna (co 0,45mg/l)		Ujemne (N)	Dodatnie (N)	Całość (N)
Ujemna	Obs.	100	39	139
	Przyk.	88,96	50,04	139
Dodatnia	Obs.	28	33	61
	Przyk.	39,04	21,96	61
Całość	Obs.	128	72	200
	Przyk.	128	72	200

(ii) Iloraz szans

Iloraz szans może pochodzić z tabel 5 i 6 i dawać miarę jak daleko wartości obserwowane odchyliły się od oczekiwanych. Jeśli oczekiwane zgodności liczb pomnoży się razem i podzieli przez produkt niezgodności oczekiwanych liczb powinno się otrzymać wartość 1.

Na przykład biorąc dane z Tabeli 6 iloraz szans wartości oczekiwanej wynosi:

1: (88,96 x 21,96) / (50,04 x 39,04) = 1953,64 / 1953,6 = 1.

Obserwowany w tej tabeli iloraz szans wynosi:

(100 x 33) / (39 x 28) = 3300 / 1092 = 3,02.

Ponadto iloraz szans od 1 bardziej orzeka kowariancję; iloraz szans 3 jest istotny.

Wyniki analizy ilorazu szans przeprowadzone na danych kowariancji otrzymanych w badaniu przedstawiono w Tabeli 7.

T a b e l a 7

Podsumowanie ilorazów szans

Znaczniki ryzyka (N1 # dod., N2 # ujemn.)	Iloraz szans
Wapń	Kalprotektyna	CRP
1	2	3	4
Współczynnik uwapnienia (N1=100, N2=100	-	-	-
Kalprotektyna (co 0,45 mg/l) N1=61, N2=139	2,27	-	-
CRP(co 1,69 mg/l) N1=72, N2=128	1,00	3,02	-

PL 216 385 B1 cd. tabeli 7

1	2	3	4
Hcy (co 12 pmol/l) N1=11, N2=189	1,21	1,32	1,52
Hcy (co 10 pmol/l) N1=42, N2=158	1,63	1,55	1,12

Co = odcięcie

Wysoki iloraz szans wskazuje wysoki stopień kowariancji między testami. Można stwierdzić na podstawie Tabeli 7, że test na kalprotektynę daje najwyższy iloraz szans do współczynnika uwapnienia i dlatego to można wydedukować, że kalprotektyna ma wyższy stopień kowariancji ze współczynnikiem uwapnienia z kalprotektyną, CRP i homocysteiną.

Dodatkowo, kalprotektyna daje wysoki iloraz szans z CRP, innym wskaźnikiem dla CVD.

Analiza Chi-kwadrat z użyciem Minitabeli

Test chi-kwadrat na powyższych danych, z użyciem tych samych granic jak test ilorazu szans, wykazywał istotną zgodność (P 0,009) między wynikami współczynnika uwapnienia i kalprotektyny. W przeciwieństwie, ani test dla CRP ani test dla homocysteiny nie wykazywał żadnej istotnej kowariancji ze współczynnikiem uwapnienia.

Istotną zgodność (P 0,000) znaleziono również między kalprotektyną i CRP.

Porównanie wartości median (i) Test Mann-Whitney'a

Figura 5 pokazuje wykres kropkowy dla rozkładu kalprotektyny między wynikami dodatnimi wapnia i ujemnymi.

Wartości median dla dwóch grup wynoszą 0,310 mg/l dla ujemnego wapnia i 0,375 mg/l dla dodatniego wapnia.

Mann-Whitney'a zapewnia, że suma szeregów, dla ujemnego wapnia wynosi 912 i 1108 dla dodatniego wapnia i osiąga wartość P = 0,0113.

Analiza Mann-Whitney'a do testowania istotnych wzrostów w medianach każdego ze stężeń kalprotektyny, CRP i homocysteiny przy wysokim poziomie (CS > 100) i niskim (CS < 100) grupach współczynnika uwapnienia przeprowadzono również na powyższych danych. Wyniki pokazują, że wartości median dla stężenia kalprotektyny i homocysteiny były istotnie podniesione w grupie wysokiego wapnia (odpowiednio P = 0,0112 i 0,0037) podczas gdy CRP nie wykazał żadnej istotnej różnicy w każdej grupie (patrz Tabela 8 poniżej).

T a b e l a 8

Porównanie wartości median dla kalprotektyny i Hcy

	Wartość mediany w grupie niskiego CS	Wartość średnia w grupie wysokiego CS	Wartość P
Kalprotektyna	0,3 mg/l	0,4 mg/I	0,0112
Homocysteina	7,5 pmol/l	8,5 pmol/l	0,0037

(ii) Analizy i krzywe ROC

Figury 6 i 7 pokazują krzywe ROC dla kalprotektyny i hsCRP dla wszystkich pacjentów i populacji męskiej. Tabela 9 poniżej pokazuje powierzchnie pod krzywymi ROC.

T a b e l a 9

Powierzchnie pod krzywymi ROC

Grupa	Kalprotektyna	hsCRP
Wszyscy pacjenci	0,604	0,524
Pacjenci mężczyźni	0,622	0,502

PL 216 385 B1

Stopień zgodności w stosunku do współczynnika uwapnienia

Oszacowano dokładność każdego z testów kalprotektyny, CRP i homocysteiny (Hcy) przy poziomach odcięcia (Hcy co 12 μmol) w Tabeli 7, jako testu na możliwość wystąpienia CVD zakładając, że współczynnik uwapnienia > 100 jest odbiciem wysokiego ryzyka choroby niedokrwiennej serca i udaru. Wyniki analiz są pokazane w Tabeli 10.

T a b e l a 10

Kalprotektyna i CRP niewłaściwe	Kalprotektyna właściwa i CRP niewłaściwe	Kalprotektyna niewłaściwa i CRP właściwe	Kalprotektyna i CRP właściwe
58	42	25	75
29%	21%	12,5%	37,5%
Kalprotektyna i Hcy niewłaściwe	Kalprotektyna właściwa i Hcy niewłaściwe	Kalprotektyna niewłaściwa i Hcy właściwe	Kalprotektyna i Hcy właściwe
59	40	24	77
29,5%	20%	12%	38,5%

Wskaźnik zgodności wapnia w stosunku do kalprotektyny = 58,5% (42+75/200). Wskaźnik zgodności wapnia w stosunku do CRP = 50% (25+75/200).

Wskaźnik zgodności wapnia w stosunku do homocysteiny = 50,5% (24+77/200).

Claims (4)

1. Sposób testowania do wykrywania możliwości wystąpienia lub skłonności do choroby niedokrwiennej serca lub udaru u człowieka lub zwierzęcia, znamienny tym, że obejmuje:

(a) oznaczenie stężenia kalprotektyny w zawierającej kalprotektynę próbce krwi, surowicy lub próbce osocza pobranej od pacjenta;

(b) uznanie stężenia kalprotektyny powyżej wartości progowej 0,45 mg/l jako wskazującego na możliwość wystąpienia choroby niedokrwiennej serca lub udaru lub skłonności do choroby niedokrwiennej serca lub udaru.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje oznaczenie w tej próbce stężenia drugiego wskaźnika (markera) dla wystąpienia choroby niedokrwiennej serca lub udaru.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że drugim wskaźnikiem jest białko C-reaktywne.

4. Sposób według zastrz. 1-3, znamienny tym, że stężenie kalprotektyny określa się przez turbidymetrię.