PL216895B1 - Sposób otrzymywania fibrynogenu, zwłaszcza do otrzymywania kleju tkankowego oraz sposób jego wytwarzania - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fibrynogenu, zwłaszcza do otrzymywania dwuskładnikowego kleju tkankowego oraz sposób jego wytwarzania.

Znany jest z polskiego opisu patentowego nr 54174 postępowanie równoczesnego wyodrębniania z ludzkiej krwi środka antyhemofilowego (AHF) i fibrynogenu.

Materiałem wyjściowym jest krew konserwowana pobierana na płyn konserwujący ACD- B. Zaraz po pobraniu, krew wiruje się w temperaturze +4°C przez okres 15 minut i przy 2000 obrotach na minutę i odprowadza w warunkach jałowych osocze, które poddaje się powtórnemu wirowaniu przez 10-15 minut w temperaturze 0°C. Otrzymane osocze w ilości 400 - 450 ml ochładza się natychmiast do temperatury 0°C. Po tym osocze stale i powoli mieszając zadaje się alkoholem etylowym uprzednio sączonym przez filtr Seitza oraz wymrożonym do temperatury -20°C w ilości 9 ml na 100 ml osocza otrzymując końcowe stężenie 8% objętościowych alkoholu.

Całość odstawia się na okres 24 godzin w temperaturze -3°C. Po 24 godzinnym okresie przechowywania w tej temperaturze, całość poddaje się wirowaniu przez okres 10 minut przy 2000 obrotach na minutę w temperaturze - 3°C, otrzymując w ten sposób osad pierwszej frakcji Cohn'a zawierający środek antyhemofilowy AHF oraz fibrynogen jak i supernatant (S) z którego można otrzymać przy dalszej obróbce trombinę to jest środek hemostatyczny do stosowania zewnętrznego. Otrzymany osad I frakcji Cohn'a najpierw rozpuszcza się w temperaturze +30°C w ciągu 1-2 minut w wodnym roztworze zawierającym 0,9% NaCl i 1% glikozy wziętym w ilości 1/5 osocza wyjściowego. Otrzymany lekko opalizujący roztwór (AHF + fibrynogen) jako materiał wyjściowy do dalszego frakcjonowania termicznego poddaje się najpierw inkubacji w temperaturze 0°C przez okres 45 minut, a następnie odwirowaniu w temperaturze 0°C przez 15 minut i przy 1800-2000 obrotach na minutę, po czym sączeniu w temperaturze 0°C przez zestawy silikonowe. Przesącz poddaje się natychmiast zamrożeniu do temperatury -40°C i liofilizowaniu, w wyniku czego otrzymuje się czysty środek antyhemofilowy AHF.

Sposób otrzymywania fibrynogenu z polskiego opisu patentowego nr 54175 polega na tym, że przy frakcjonowaniu osocza metodą przytaczaną w opisie patentowym nr 54174 ze stałej pozostałości uzyskuje się fibrynogen. Pozostałość tę uzyskaną przez rozpuszczenie osadu z I frakcji Cohn'a w roztworze wodnym zawierającym 0,9% NaCl i 1% glikozy, zastosowanym w ilości odpowiadającej 1/5 objętości osocza wyjściowego, w czasie 1-2 minut, w temperaturze 30°C, następną inkubację i odwirowanie w temperaturze 0°C, rozpuszcza się mieszając w temperaturze 30°C w roztworze wodnym stabilizatora, zawierającym w 1000 ml 6,72 g dwuwodnego cytrynianu trójsodowego, 3,4 g NaCl i 13 g glukozy, zakwaszonym stężonym kwasem solnym do pH = 6,3, po czym otrzymany roztwór natychmiast zamraża się do temperatury -40°C i liofilizuje. Do rozpuszczania pozostałości uzyskanej z 400-450 ml osocza wyjściowego stosuje się 75 ml roztworu stabilizatora. Otrzymany po liofilizacji czysty fibrynogen rozpuszcza się przed stosowaniem leczniczym bezpirogenną wodą destylowaną.

Znany fibrynowy klej tkankowy z pracy zbiorowej pod redakcją P.D. Mintz: Leczenie krwią, Zasady postępowania klinicznego, Warszawa 2001r., str. 221-235, zawiera pierwotnie dwa składniki: fibrynogen i trombinę, które mają naśladować końcowy etap naturalnego procesu krzepnięcia. Proces ten polega na tym, że fibryna w obecności czynnika III i chlorku wapnia miesza się tworząc włóknik o właściwościach klejących. Fibrynoliza powoduje biodegradację wytworzonego włóknika.

Znana jest z polskiego opisu patentowego nr 194316 mieszanina do otrzymywania dwuskładnikowego kleju tkankowego oraz dwuskładnikowy klej tkankowy.

Mieszanina do otrzymywania dwuskładnikowego kleju tkankowego zawiera kwas 4-(aminometylo-)cykloheksanokarboksylowy, zwany kwasem traneksamowym, argininę, lizynę lub ich połączenia, przy czym ilość kwasu traneksamowego wynosi 1% do 20% wagowo w stosunku do mieszaniny, a ilość argininy lub lizyny w postaci chlorowodorku wynosi 0,1% do 4% wagowo w stosunku do mieszaniny.

Dwuskładnikowy klej tkankowy, który zawiera oddzielnie składniki A i B. Składnik A zawiera fibrynogen, kwas 4-(aminometylo-)cykloheksanokarboksylowy (kwas traneksamowy), argininę, lizynę lub ich mieszaniny, przy czym ilość kwasu traneksamowego wynosi 1% do 20% wagowo w stosunku do mieszaniny, a ilość argininy lub lizyny w postaci chlorowodorku wynosi 0,1% do 4% wagowo w stosunku do mieszaniny do otrzymywania dwuskładnikowego kleju tkankowego. Składnik B jest roztworem enzymu proteolitycznego, przekształcającego fibrynogen w fibrynę.

PL 216 895 B1

Zagadnieniem wymagającym rozwiązania jest ulepszenie sposobu otrzymywania fibrynogenu dla wytwarzania kleju tkankowego oraz ulepszenie sposobu wytwarzania z wyprodukowanego fibrynogenu dwuskładnikowego kleju tkankowego.

Wytyczone zagadnienie techniczne rozwiązuje sposób otrzymywania fibrynogenu, zwłaszcza do otrzymywania kleju tkankowego, złożony z pobrania donacji krwi do potrójnego worka, wirowania pobranej krwi, oddzielania osocza od elementów komórkowych oraz dwukrotnego zamrażania i rozmrażania z ludzkiej krwi osocza, charakteryzujący się tym, że oddzielone osocze przelewa się do pojemnika transferowego pustego, poddaje się zamrażaniu w temperaturze -30°C, przechowuje w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin a następnie z zamrażarki przenosi się do łaźni wodnej i rozmraża się w temperaturze +4°C w ciągu do 2 godzin, po czym osocze ponownie zamraża się w temperaturze -30°C i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin, po tej operacji pojemnik z osoczem wyciąga się z zamrażarki i łączy się z pustym pojemnikiem transferowym, dren zabezpiecza się zaciskiem a następnie zanurza się w medium płynnym o temperaturze +4°C, po czym pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu a po odwirowaniu pojemnik umieszcza się w prasie ręcznej i szybko oddziela się nasącz od osadu, zwalniając zacisk usuwa się płyn znad osadu, pojemnik z osadem fibrynogenu przenosi się do zamrażarki i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C. Krew po pobraniu od dawcy poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g w ciągu do 15 minut. Rozdzielenie osocza od reszty zestawu przeprowadza się za pomocą zgrzewarki dielektrycznej. Pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g w ciągu 15 minut w temperaturze +4°C. Fibrynogen otrzymuje się z pojedynczych donacji allogenicznych, starannie wyselekcjonowanych po karencji lub inaktacji wirusów, lub autologicznej donacji krwi.

Wytyczone zagadnienie rozwiązuje również sposób wytwarzania dwuskładnikowego kleju tkankowego złożony z postępowania otrzymywania fibrynogenu z pobranej donacji krwi oraz trombiny liofilizowanej korzystnie ludzkiej w roztworze chlorku wapnia, składniki pierwotne oddzielone od siebie - fibrynogen w roztworze aprotyniny miesza się z trombiną w obecności chlorku wapnia, charakteryzujący się tym, że z pobranej krwi oddziela się osocze, które przelewa się do pojemnika transferowego pustego, poddaje się zamrażaniu w temperaturze -30°C, przechowuje w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin a następnie z zamrażarki przenosi się do łaźni wodnej i rozmraża się w temperaturze +4°C w ciągu do 2 godzin, po czym osocze ponownie zamraża się w temperaturze -30°C i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin, po tej operacji pojemnik z osoczem wyciąga się z zamrażarki i łączy się z pustym pojemnikiem transferowym, dren zabezpiecza się zaciskiem a następnie zanurza się w medium płynnym o temperaturze +4°C, po czym pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu a po odwirowaniu pojemnik umieszcza się w prasie ręcznej i szybko oddziela się nasącz od osadu, zwalniając zacisk usuwa się płyn znad osadu, pojemnik z osadem fibrynogenu przenosi się do zamrażarki i przechowuje się w temperaturze poniżej - 25°C. Krew po pobraniu od dawcy poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g w ciągu do 15 minut. Rozdzielenie osocza od reszty zestawu przeprowadza się za pomocą zgrzewarki dielektrycznej. Pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g w ciągu 15 minut w temperaturze +4°C. Zamrożony w temperaturze poniżej -25°C fibrynogen rozmraża się temperaturze +37°C przez około 15 minut, następnie przenosi się do fiolek szklanych, po czym fiolki z fibrynogenem zamraża się w temperaturze -40°C przez okres 12-48 godzin, po czym poddaje się liofilizacji przez okres 24-48 godzin przy 20-40 Pa i temperaturze od -30°C do 0°C.

Sposób otrzymywania fibrynogenu według wynalazku umożliwia produkcję fibrynogenu w postaci mrożonej przechowywanej w temperaturze poniżej -25°C oraz liofilizowanej przechowywanej w temperaturze od +2°C do +8°C, co determinuje także okres przechowywania. Sposób ten dokonuje się w układzie zamkniętym co zabezpiecza produkt przed zanieczyszczeniem, co daje w efekcie brak kontaminacji bakteryjnej. Korzystne jest otrzymywanie fibrynogenu z pojedynczych donacji starannie wyselekcjonowanych allogenicznych po karencji lub inaktacji wirusów. Fibrynogen otrzymany sposobem według wynalazku ogranicza do minimum ryzyko zakażenia pacjenta w czasie prowadzenia zabiegu. Ponadto w samym procesie otrzymywania precypitacja jest procesem krótkim, do 2 godzin.

Sposób wytwarzania dwuskładnikowego kleju tkankowego przy użyciu fibrynogenu otrzymanego sposobem według wynalazku daje nieoczekiwanie, że utworzony skrzep ma dużą wytrzymałość chemiczną i jest odporny na odkształcenia mechaniczne.

Sposób otrzymywania fibrynogenu, zwłaszcza do otrzymywania kleju tkankowego jest bliżej przedstawiony w przykładzie wykonania.

PL 216 895 B1

P r z y k ł a d. Pacjent oddaje jedną jednostkę krwi, którą pobiera się do potrójnego worka - zestawu składającego się z pojemnika macierzystego, w którym jest płyn konserwujący CPD w ilości 63 ml, pojemnika transferowego i pojemnika z roztworem wzbogaconym, Od dawcy pobiera się próbkę krwi, którą bada się na obecność markerów wirusowych: HBV, HIV, HCV metodą serologiczną i metodą biologii molekularnej-NAT. A także odczynu Wassermana i poziomu transaminazy ALT. Krew po pobraniu poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g przez 13 minut. Po odwirowaniu osocze oddziela się od elementów komórkowych. Osocze jest przelewane do pojemnika transferowego pustego. Rozdzielenie osocza od reszty zestawu przeprowadza się za pomocą zgrzewarki dieektrycznej. Pojedynczą jednostkę osocza po oddzieleniu od krwinek czerwonych zamraża się w urządzeniu do szokowego mrożenia w temperaturze -30°C i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin. Z zamrażarki pojemnik z osoczem przenosi się do łaźni wodnej o temperaturze +4°C i rozmraża w ciągu 1,5-2 godzin. W rozmrożonym całkowicie osoczu, bez wyczuwalnych kryształów lodu, pływają pasma nierozpuszczonego białka - precypitat I. Osocze ponownie zamraża się w urządzeniu do szokowego mrożenia osocza, po zamrożeniu osocze przenosi się do zamrażarki i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin. Po tym okresie pojemnik z osoczem wyciąga się z zamrażarki i łączy się z pustym pojemnikiem transferowym za pomocą zgrzewarki do jałowego łączenia drenów, dren zabezpiecza się zaciskiem plastikowym, a następnie pojemnik z osoczem zanurza się w łaźni wodnej o temperaturze +4°C. Osocze całkowicie rozmraża się bez wyczuwalnych kryształów lodu. W osoczu pływają pasma nierozpuszczonego białka, co świadczy, że otrzymuje się precypitat II. Pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g w ciągu 13 minut w temperaturze +4°C.

Po odwirowaniu pojemnik z osoczem umieszcza się w prasie ręcznej i szybko oddziela się nasącz od osadu zwalniając zacisk plastikowy. Całkowicie usuwa się płyn znad osadu. W czasie preparatyki nie dopuszcza się do przeciśnięcia osadu do osocza lub do jego rozpuszczania. W przypadku wysokiej temperatury otoczenia powyżej +20°C prasę manualną schładza się do temperatury +4°C. Pojemnik z osadem - fibrynogenem przenosi się do zamrażarki. Fibrynogen przechowuje się przez 24 miesiące w temperaturze poniżej -25°C.

Fibrynogen po rozmrożeniu w temperaturze +37°C przez 15 minut poddaje się konfekcjonowaniu. Po uzyskaniu całkowitego rozmrożenia, fibrynogen o pojemności od 2 do 10 ml przenosi się do fiolek szklanych. Fiolki z fibrynogenem zamraża się w temperaturze -40°C przez 12-48 godzin. Następnie poddaje się fiolki z zamrożonym fibrynogenem procesowi liofilizacji (suszenie sublimacyjne). Do liofilizacji używa się liofilizatora firmy EVEB Hochvachtum TG5. Proces liofilizacji prowadzi się przez 24-48 godzin przy ciśnieniu 20-40 Pa i temperaturze od -30°C do 0°C.

Otrzymany liofilizat fibrynogenu zamyka się hermetycznie gumowymi korkami z metalowym kapslem i przechowuje się w temperaturze od +2°C do +8°C, do 60 miesięcy.

Sposób wytwarzania dwuskładnikowego kleju tkankowego polega na otrzymywaniu fibrynogenu przedstawionego w przykładzie wykonania powyżej o stężeniu 36-120 g/l oraz otrzymywaniu trombiny ludzkiej o gęstości 400-600 U/ml i roztworu CaCl2 40 mmoI/l. Składniki pierwotne trzyma się oddzielnie w ampułkach i dla wytwarzania kleju tkankowego miesza się fibrynogen przygotowany w roztworze aprotyniny z trombiną w obecności chlorku wapna. Uzyskuje się niezwłocznie skrzep i tym samym ma miejsce przejście rozpuszczalnego fibrynogenu w tworzącą skrzep nierozpuszczalną fibrynę.

Claims (10)

1. Sposób otrzymywania fibrynogenu, zwłaszcza do otrzymywania kleju tkankowego, złożony z pobrania donacji krwi do potrójnego worka, wirowania pobranej krwi, oddzielania osocza od elementów komórkowych oraz dwukrotnego zamrażania i rozmrażania z ludzkiej krwi osocza, znamienny tym, że oddzielone osocze przelewa się do pojemnika transferowego pustego, poddaje się zamrażaniu w temperaturze -30°C, przechowuje w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin a następnie z zamrażarki przenosi się do łaźni wodnej i rozmraża się w temperaturze +4°C w ciągu do 2 godzin, po czym osocze ponownie zamraża się w temperaturze -30°C i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin, po tej operacji pojemnik z osoczem wyciąga się z zamrażarki i łączy się z pustym pojemnikiem transferowym, dren zabezpiecza się zaciskiem a następnie zanurza się w medium płynnym o temperaturze +4°C, po czym pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu a po odwirowaniu pojemnik umieszcza się w prasie ręcznej i szybko oddziela się

PL 216 895 B1 nasącz od osadu, zwalniając zacisk usuwa się płyn znad osadu, pojemnik z osadem fibrynogenu przenosi się do zamrażarki i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że krew po pobraniu od dawcy poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g w ciągu 15 minut.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozdzielenie osocza od reszty zestawu przeprowadza się za pomocą zgrzewarki dielektrycznej.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g w ciągu 15 minut w temperaturze +4°C.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że fibrynogen otrzymuje się z pojedynczych donacji allogenicznych, starannie wyselekcjonowanych po karencji lub inaktywacji wirusów, lub autologicznej donacji krwi.

6. Sposób wytwarzania dwuskładnikowego kleju tkankowego złożony z postępowania otrzymywania fibrynogenu z pobranej donacji krwi oraz trombiny liofilizowanej korzystnie ludzkiej w roztworze chlorku wapnia, składniki pierwotne oddzielone od siebie - fibrynogen w roztworze aprotyniny miesza się z trombiną w obecności chlorku wapnia, znamienny tym, że z pobranej krwi oddziela się osocze, które przelewa się do pojemnika transferowego pustego, poddaje się zamrażaniu w temperaturze -30°C, przechowuje w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin a następnie z zamrażarki przenosi się do łaźni wodnej i rozmraża się w temperaturze +4°C w ciągu do 2 godzin, po czym osocze ponownie zamraża się w temperaturze -30°C i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12-24 godzin, po tej operacji pojemnik z osoczem wyciąga się z zamrażarki i łączy się z pustym pojemnikiem transferowym, dren zabezpiecza się zaciskiem a następnie zanurza się w medium płynnym o temperaturze +4°C, po czym pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu a po odwirowaniu pojemnik umieszcza się w prasie ręcznej i szybko oddziela się nasącz od osadu, zwalniając zacisk usuwa się płyn znad osadu, pojemnik z osadem fibrynogenu przenosi się do zamrażarki i przechowuje się w temperaturze poniżej -25°C.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że krew po pobraniu od dawcy poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g w ciągu 15 minut.

8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że rozdzielenie osocza od reszty zestawu przeprowadza się za pomocą zgrzewarki dielektrycznej.

9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu z szybkością 2300 x g w ciągu 15 minut w temperaturze +4°C.

10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że zamrożony w temperaturze poniżej -25°C fibrynogen rozmraża się temperaturze +37°C przez około 15 minut, następnie przenosi się do fiolek szklanych, po czym fiolki z fibrynogenem zamraża się w temperaturze -40°C przez okres 12-48 godzin, po czym poddaje się liofilizacji przez okres 24-48 godzin przy 20-40 Pa i temperaturze od -30°C do 0°C.