PL217148B1 - Sposób zwiększania efektywności adsorpcyjnej białka do powierzchni polistyrenu - Google Patents

Description

Polistyren (PS) jest tworzywem wykorzystywanym szeroko w wielu zastosowaniach biomedycznych i przemysłowych. PS wykazuje silną absorbcję światła UV o długości fali 280 nm i niższej, przypisywany przejściu s₀ - s₁ do w pierścieniu benzenu PS. Występującą absorbcję fal dłuższych (> 300 nm) tłumaczy się obecnością śladowych ilości zanieczyszczeń, wad materiałowych lub two rzeniem kompleksów z przeniesieniem ładunku [1,2].

Istnieje szereg doniesień związanych z degradację fotochemiczną PS [3,4] pod wpływem promieniowania ultrafioletowego (UV) (295-400 nm), zwłaszcza w warunkach tlenowych, który zachodzi poprzez mechanizm reakcji rodnikowych z udziałem reaktywnych form tlenu [5,6].

Dla szeregu zastosowań, foto-degradacja oksydacyjna przeprowadzana jest w sposób kontrolowany w celu modyfikacji powierzchni PS. Proces zwiększa hydrofilowość polimeru, wpływając na adhezję cząsteczek do powierzchni PS, jej zwilżalność, stan naładowania i biokompatybilność. Metody modyfikacji powierzchni PS obejmują procesy obróbki chemicznej w warunkach zarówno suchych jak i mokrych. Pierwsze z nich obejmują wykorzystanie wyładowań plazmowych (jony, 10-30 eV), elektronów (0-10 eV) i promieniowania UV (3-40 eV) [7,8] lub napromieniania ciężkimi jonami (> 70 MeV) [18,19]. Procesy te wprowadzają zmiany chemiczne w strukturze PS: podziały łańcucha polimeru, sieciowanie, tworzenie wolnych rodników, wprowadzanie grup polarnych (C-O, C=O, C=O), przy czym zmiany te nie są trwałe [9,10]. Procesy w warunkach mokrych, na przykład proces sulfonacji [11,12], wymagają starannej kontroli przebiegu reakcji z uwagi na szereg zmian zachodzących w objętości modyfikowanego polimeru [13].

W przypadku polimerów hydrofobowych, dla których zwilżanie powierzchni w środowisku wodnym jest ograniczone, wstępna modyfikacja chemiczna może być ograniczona tylko do lokalnych miejsc aktywnych, takich jak nienasycone wiązania, zniekształcenia strukturalne, nanopory lub pęknięcia. Po pierwszym etapie degradacji, wprowadzenie grup zjonizowanych może doprowadzić do rozsunięcia łańcuchów polimerowych z powodu oddziaływań elektrostatycznych.

W niektórych polimerach hydrofobowych końce łańcuchów polimerowych są modyfikowane poprzez ugrupowania hydrofilowe lub inicjatory reakcji w celu umożliwienia modyfikacji i degradacji polimeru [14,15]. Modyfikowane polimery tego typu mogą być wykorzystane w biologii i medycynie. PS jest również polimerem intensywnie badanym ze względu na brak właściwości immunogennych i niską cytotoksyczność [16,17], jednak fizykochemiczne procesy zachodzące w polimerze PS w roztworach wodnych są słabo zbadane.

Zgodnie z naszymi badaniami, w powierzchni cienkich warstw PS zachodzą chemiczne i strukturalne zmiany, występujące po działaniu na polimer w temperaturze pokojowej czynników w rodzaju buforu fosforanowego (PBS, pH 7,4) i wodnych roztworów szeregu soli nieorganicznych. Obserwowane chemiczne modyfikacje warstw PS występują głównie na powierzchni w wyniku redukcji lub utleniania pod wpływem światła, chemicznej degradacji lub procesu zwiększania objętości pod wpływem wody.

W biochemii i immunologii często wykorzystywaną cechą polistyrenu jest jego zdolność do niekowalencyjnego wiązania cząsteczek białkowych na zasadzie fizykochemicznej adsorbcji do łańcuchów polimeru. W celu zwiększenia wydajności adsorpcji lub dostosowania powierzchni do adsorpcji specyficznych lub niestandardowych białek, przeprowadza się opisane wyżej modyfikacje powierzchni polimerów uzyskując produkty o podwyższonej zdolności wiązania białek o niskim bądź wysokim punkcie izoelektrycznym (pl). Tworzy się też uniwersalne powierzchnie mieszane. (MaxiSorp) silnie wiążące białka zarówno i niskim jak i wysokim pi. Opisana właściwość polistyrenu wykorzystywana jest w testach biochemicznych na przykład testach ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) stosowanych szeroko w diagnostyce, badaniach biomedycznych czy immunologicznych. W testach tego typu do powierzchni płytek mikrotestowych lub mikrosfer polistyren owych wiązane są cząsteczki przeciwciał lub innych białek wiążących antygen, w dalszej kolejności powierzchnię ze związanymi przeciwciałami zanurza się w mieszaninie zawierającej poszukiwany antygen, który wiąże się selektywnie z immobilizowanymi przeciwciałami. W innym typie analizy powierzchnię polistyrenową opłaszczać można bądź cząsteczkami samego antygenu dla wykrywania w próbie specyficznych przeciwciał, np. w testach wykrywających wczesne zakażenia bakteryjne lub wirusowe, bądź bezpośrednio mieszaniną zawierającą poszukiwaną substancję, na przykład surowicą, w testach wykrywania w surowicy antygenów bakteryjnych. Antygen związany bezpośrednio do powierzchni polistyrenowej, lub pośrednio poprzez immobilizowane przeciwciała, wykrywać można specyficznymi przeciwciałami na przykład

PL 217 148 B1 skoniugowanymi z enzymem lub izotopem radioaktywnym, które umożliwiają wykrycie i ilościową ocenę stopnia wiązania.

Celem wynalazku jest uzyskanie sposobu zapewniającego zwiększony stopień wiązania cząsteczek naładowanych, zwłaszcza białek, do powierzchni polistyrenu.

Nieoczekiwanie efekt taki osiągnięto w sposobie według wynalazku.

Sposób obejmuje etap zwiększania stopnia adsorpcji białka do powierzchni polistyrenowej w wyniku zmiany właściwości warstwy powierzchniowej polimeru poprzez inkubację polimeru w roztworze soli nieorganicznych i wprowadzenie w wyniku oddziaływania polimeru z tym roztworem zjonizowanych grup chemicznych na jego powierzchnię. Taka modyfikacja powierzchni polimeru, poprzedzająca proces właściwej adsorpcji białka do powierzchni, znacząco zwiększa stopień adsorpcji, powodując wzrost wydajności procesu i tym samym osiągnięcie większej aktywności biochemicznej otrzymanej powierzchni.

Wynalazek dotyczy prostej procedury zwiększania wydajności wiązania białek do powierzchni polistyrenowych. Proces ten związany jest ze zmianami struktury polistyrenu pod wpływem działania wodnego roztworu soli kwasu fosforowego. Wykazano, że w hydrofobowym łańcuchu polimeru polistyrenu, pod wpływem działania wymienionych czynników dochodzi do wprowadzenia zjonizowanych grup chemicznych w rodzaju ugrupowań karboksylowych lub ketonowych, które zwiększają adsorbcję naładowanych białek do powierzchni oraz prawdopodobnie powodują lokalne, przypowierzchniowe zwiększenie objętości polimeru na skutek wprowadzenia sił odpychających powstałych grup zjonizowanych w miejsce sił Van der Vaalsa wiążących hydrofobowe łańcuchy polimeru pomiędzy sobą w polimerze nie poddanym działaniu czynników aktywujących.

Przedmiotem wynalazku jest sposób traktowania powierzchni polistyrenowej roztworem wodnym soli nieorganicznych mający na celu wprowadzenie zmian chemicznych na powierzchni polimeru prowadzących do zwiększenia jego zdolności adsorpcyjnej w stosunku do cząsteczek naładowanych, zwłaszcza białek, który został zdefiniowany w załączonych zastrzeżeniach.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniona jest metoda opierająca się na traktowaniu powierzchni polistyrenowej roztworem soli nieorganicznych. Po stosunkowo krótkim czasie kontaktu z wodnym roztworem w temperaturze pokojowej, zmiany zachodzące na powierzchni polimeru promują wiązanie cząsteczek białka do powierzchni. Po inkubacji wstępnie traktowanej powierzchni PS w roztworze białek, na przykład immunoglobulin typu G, następuje ich immobilizacja na powierzchni polimeru, jednocześnie w przypadku inkubacji powierzchni PS, nie traktowanej wstępnie samym roztworem soli, w roztworze cząsteczek białkowych, na przykład immunoglobulin typu G, prowadzi do niższej wydajności immobilizacji białka na powierzchni polimeru.

Korzystnie roztwór soli nieorganicznych jest roztworem soli sodowej i potasowej kwasu solnego.

Korzystnie roztwór soli buforowany jest mieszaniną kwaśnych soli sodowych i potasowych kwasu fosforowego.

Zgodnie z wynalazkiem, powierzchnię polistyrenową poddaje się inkubacji wstępnej z roztworem chlorku sodowego i potasowego buforowanego sodowymi i potasowymi solami fosforanowymi. Wydajność immobilizacji białka do tak przygotowanej powierzchni polistyrenowej jest wyższa niż w przypadku immobilizacji do powierzchni nie traktowanej procesem inkubacji wstępnej. pH roztworu do wstępnej inkubacji powierzchni polistyrenowej dobierane jest w zależności od pH roztworu użytego do immobilizacji, który z kolei zależy od punktu izoelektrycznego immobilizowanego białka.

Opisana metoda może znaleźć zastosowanie przy immobilizacji cząsteczek biologicznych na powierzchniach płytek mikrotestowych czy mikrosfer polistyrenowych wykorzystywanych w diagnostyce, przemyśle farmaceutycznym, chemicznym czy w badaniach biomedycznych.

Poniżej opisano przykłady reakcji immunosorbcji związanej z enzymem (ELISA) w której wykorzystano opisaną procedurę preinkubacji.

Dodatkowo przykładowa realizacja została zilustrowana załączoną figurą, prezentującą wynik eksperymentu z przykładu 1. Pary słupków obrazują immobilizację IgG na dołkach poddanych i nie poddanych preinkubacji z PBS o pH = 7,39. Słupki ciemne obrazują wynik immobilizacji IgG do polistyrenu w PBS o pH = 7,39, podczas gdy słupki jasne obrazują wynik immobilizacji IgG do polistyrenu w PBS o pH = 9,60

P r z y k ł a d 1.

Powierzchnie studzienek mikropłytki testowej Nunclon Surface (NUNC) poddano preinkubacji w roztworach PBS o składzie: Na2HPO4 6,5 mM, KH2PO4 1,5 mM, NaCI 137 mM, KCl 2,7 mM o pH wynoszącym 4,25, 7,39 oraz 9,6; pH roztworu doprowadzano odpowiednio 1M roztworem HCl lub

PL 217 148 B1

NaOH. Preinkubację prowadzono przez 60 min po czym studzienki płytki mikrotestowej poddane uprzednio preinkubacji, opłaszczano roztworami króliczych immunoglobulin typu G (SIGMA) o stężeniu 1 ąg/ml w PBS o składzie jak podano wyżej i pH wynoszącym 4,25, 7,39 oraz 9,6. Opłaszczanie prowadzono przez 30 min. Jednocześnie, jako kontrolę, opłaszczano powyższymi roztworami immunoglobulin króliczych studzienki mikropłytki testowej nie poddane preinkubacji. Po opłaszczaniu dołki blokowano roztworem blokującym: 1% BSA (Sigma-Aldrich) w PBS o pH = 7,2 o składzie jak podano wyżej przez 50 min. Po tym czasie studzienki pięciokrotnie płukano roztworem płuczącym: PBS pH = 7,2 z dodatkiem 0,05% roztworu TWEEN-20), następnie inkubowano z roztworem (0,9 mg białka/ml) koniugatu: kozie IgG anty-lgG królicze skoniugowane z peroksydazą chrzanową (HRP) (Sigma-Aldrich), rozcieńczonego 1:1000 PBS o składzie jak podano wyżej pH = 7,2 przez 60 min. Po inkubacji studzienki płukano siedmiokrotnie roztworem płuczącym, następnie dodawano roztworu substratów dla enzymu HRP o składzie: 0,3% ortofenylodiaminy, 5% MeOH, 0,1% H2O2. Reakcję enzymatyczną prowadzono przez 5 min, następnie reakcję blokowano poprzez dodanie do każdej studzienki 50 ąl H2SO4 i badano absorbancję roztworu przy długości fali 450 nm i 570 nm (A450 i A570). Od A450 odejmowano absorbancję tła A570 oraz absorbancję próby ślepej, którą stanowiła studzienka nie poddana preinkubacji, w której etap immobilizacji IgG króliczych zastąpiono inkubacją roztworu PBS o pH=7,2 przez 30 min, pozostałe kroki inkubacji przebiegały jak dla studzienek właściwych.

Wynik eksperymentu przedstawiono na ryc. 1. Najsilniejszy efekt obserwowano dla układu w którym preinkubację prowadzono w pH = 7,39, natomiast immobilizację IgG w PBS o pH = 9,60.

Bibliografia:

1. N.S. Allen. Why do polymers degrade in sunlight? Trends Polym. Sci., 2 (1994) 366 - 375.

2. J. Pospisil, Z. Horak, Z. Krulis, S. Nespurek. The origin and role of structure inhomogeneities and impurities in material recycling of plactics. Macromol. Symp., 135 (1998) 247 - 263.

3. F.A. Bottino, A.R. Cinquegrani, G.D. Pasquale, L. Leonardi, A. Pollicino. Chemical modifications, mechanical properties and surface photo-oxidation of films of polystyrene. Polym. Test, 23 (2004) 405 - 411.

4. A. Marek, L. Kapralkova, P. Schmidt, J. Pfleger, J. Humlicek, J. Popisil, J. Pilar. Spatial resolution of degradation in stabilized polystyrene and polypropylene plaques exposed to accelerated photodegradation or heat aging. Polym. Degrad, Stabil., 91 (2006) 444 - 458.

5. J.F. Rabek. Polymer photodegradation: mechanisms and experimental methods. London, Champman & Hall, 1995.

6. R.K. Wells, A. Royston, J.P.S. Badyal. Direct evidence for the generation of phenyl radicals and cross-linking during the photolysis of polystyrene film. Macromolecules, 27 (1994) 7465 - 7468.

7. E.H. Lock, D.Y. Petrovykh, P. Mack, T. Carney, R.G. White, S.G. Walton, R. Fernsler. Surface composition, chemistry, and structure of polystyrene modified by electron-beam-generated plasma, Langmuir, 26, (2010), 8857 - 8868.

8. M. Dhayal, K.L. Parry, R.D. Short, J.W. Bradley. Investigating the plasma surface modification of polystyrene at low ion power densities. J. Phys. Chem. B, 108 (2004) 14000 - 14004.

9. L. Larrieu, B. Held, H. Martinez, Y. Tison. Ageing of atactic and isotactic polystyrene thin film treated by oxygen DC pulsed plasma. Surf. Coat. Technol., 200 (2005) 2310 - 2316.

10. B. Held, N. Soulem, H. Martinez, F. Clement. A study on the ageing process of polystyrene thin films treated under DC pulsed discharges conditions in oxygen and argon-oxygen mistures. Eur. Phys. J. AP, 21 (2003) 59 - 66.

11. Damien Baigl, Thomas A. P. Seery, Claudine E. Williams. Preparation and characterization of hydrosoluble, partially charged poly(styrenesulfonate)s of various controlled charge fractions and chain lengths. Macromolecules, 35 (2002) 2318 - 2326.

12. Antonio J. F. Carvalho, Antonio A. S. Curvelo. Effect of sulfonation level on solubility and viscosity behavior of low to medium charged sulfonated polystyrenes. Macromolecules, 2003, 36, 5304 - 5310.

13. S. Hurrell, R.E. Cameron. The effect of buffer concentration, pH and buffer ions on the degradation and drug release from polyglycolide. Polymer International, 52 (2003) 358 - 366.

14. J.-T. Ma, R.-H. Huang, L. Zhao, X. Zhang. Solution properties of ionic hydrophobically associating Polyacrylamide with an arylalkyl group. J. Appl. Polym. Sci., 97 (2005) 316 - 321.

15. S. Liu, T. Hu, H. Liang, M. Jiang, C. Wu. Self-assembly of narrowly distributed carboxyterminated linear polystyrene chains in water via microphase inversion. Macromolecule, 33 (2000) 8640 - 8643.

PL 217 148 B1

16. T.G. van Kooten, H.T. Spijker, H.J. Busscher. Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions. Biomaterials, 25 (2004) 1735 - 1747.

17. P. Menei, A. Croue, V. Daniel, A. Pauplard-Barthelaix, J.P. Benoit. Fate and biocompatibility of three types of microspheres implanted into the brain. J. Biomed. Mater. Res., 28 (1994) 1079 - 1085.

18. L. Singh, K.S. Samra, R. Singh. Opto-chemical response of CR-39 and polystyrene to swift heavy ion irradiation. Nucl. Inst. Methods Phys. Res. B, 255 (2007) 350 - 356.

19. Z. Zhu, Y. Jin, C. Liu, Y. Sun, M, Hou, C. Zhang, Z. Wang, J. Liu, X. Chen, B. Li, Y. Wang. Chemical modifications of polystyrene under swift Ar ion irradiation: A study of the energy loss effects. Nucl. Inst. Methods Phys. Res. B, 169 (2000) 83 - 88.

Claims (3)

1. Sposób wiązania cząsteczek naładowanych, zwłaszcza białek, do powierzchni polistyrenu, znamienny tym, że w celu intensyfikacji adsorbcji powierzchnię polistyrenu kontaktuje się wstępnie z fizjologicznym roztworem NaCI buforowanym fosforanem (PBS), a następnie kontaktuje się z roztworem cząsteczek poddawanych absorpcji.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do intensyfikacji adsorbcji białek stosuje się buforowany roztwór NaCI o pH dostosowanym do typu użytego białka oraz pH roztworu użytego bezpośrednio do adsorpcji białka z roztworu, przy czym białka o niskim pi (punkcie izoelektrycznym), korzystnie adsorbowane są do powierzchni z roztworu o pH wyższym od obojętnego, po preinkubacji powierzchni polistyrenowej w roztworze o pH niższym od obojętnego, natomiast białka o wysokim pl korzystnie adsorbowane są z roztworu o pH niższym od obojętnego po preinkubacji powierzchni polistyrenowej w roztworze o pH wyższym od obojętnego.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że roztwór do preinkubacji zawiera bufor fosforanowy składający się z soli sodowych i potasowych kwasu fosforowego, korzystnie z dodatkiem chlorku potasowego oraz chlorku sodowego.