PL217229B1 - Transgeniczne komórki roślinne produkujące białko antygenowe M-HBsAg oraz ich zastosowanie do wytwarzania szczepionki - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy transgenicznych komórek roślinnych i otrzymywania szczepionki zawierającej średni antygen powierzchniowy HBV - M-HBsAg, skierowanej przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B (wzw B), aplikowanej doustnie w formie utrwalonego materiału roślinnego oraz aplikowanej parenteralnie lub donosowo w formie oczyszczonego preparatu ekstrahowanego z materiału roślinnego.

Otrzymanie rekombinowanej szczepionki przeciwko hepatitis B, tj. wirusowemu zapaleniu wątroby typu B (wzw B) na początku lat ‘80 XX wieku było znaczącym sukcesem medycyny i wakcynologii, gdyż umożliwiło masowe szczepienia przeciwko wzw B. Pomimo wysokiej skuteczności szczepionki, sięgającej 90 - 95%, globalna liczba osób przewlekle chorych w następstwie zakażenia HBV (ang. Hepatitis B Virus) corocznie wzrasta i obecnie wynosi ponad 400 mln. Ocenia się, że blisko 100 mln spośród tych chorych może umrzeć z powodu chorób i innych powikłań, np. marskości lub raka pierwotnego wątroby. Jednocześnie, populacja chronicznych nosicieli wzw B stanowi wielki rezerwuar dla nowych infekcji. Z danych epidemiologicznych wynika, że blisko 1/3 światowej populacji przebyła zakażenie wirusem żółtaczki typu B. O ile w krajach wysoko rozwiniętych zapadalność na wzw B jest raczej niska - mniej niż 0,5%, to w krajach rozwijających się i w Chinach wskaźnik zachorowań wynosi od 5 do 50% (Hollinger 1996, Young 2001). Zapadalność na wzw B była i pozostaje poważnym problemem epidemiologicznym także w krajach rozwiniętych, gdzie do 20% populacji wykazuje markery zainfekowania HBV. W Polsce spośród chorób wątroby o etiologii wirusowej, ponad 50% wywoływanych jest przez HBV (Walewska-Zielecka 1996).

Liczba osób przewlekle chorych i nosicieli HBV wzrasta pomimo wprowadzenia rekombinowanych szczepionek (np. Engerix-B®. Huvax B®) opartych na małej podjednostce S antygenu powierzchniowego (HBsAg, Hepatitis B surface Antigen), w skrócie tzw. małym antygenie powierzchniowym wirusa, tj. S-HBsAg, produkowanym w komórkach rekombinowanych drożdży (rHBsAg). Szczepionki te, jakkolwiek umożliwiły masowe szczepienia, nie zapewniają jednak wystarczającej ochrony. Stwierdzono bowiem, że u pewnej liczby szczepionych osób dochodzi do zakażenia i replikacji wirusa w następstwie pojawienia się zmutowanych szczepów HBV. Szczepy te charakteryzują się zmienioną sekwencją aminokwasów w obrębie epitopu „a” antygenu S-HBs, neutralizującego dla wszystkich opisanych dotychczas podtypów wirusa. Przypuszcza się, że w wyniku presji selekcyjnej jaką stwarzają przeciwciała powstałe w wyniku szczepienia, pojawiają się zmutowane warianty epitopu „a”, na które organizm szczepionego nie wytwarza neutralizujących przeciwciał. Wobec braku wystarczającej ochrony immunologicznej dochodzi do rozwoju przewlekłego schorzenia, pomimo wcześniejszej odpowiedzi na poziomie >10 mlU/ml przeciwciał anty-HBs, w większości krajów uznawanym za wystarczający dla zapewnienia ochrony immunologicznej przed zakażeniem wirusem (Cooreman 2001, Huang 2004).

Ponadto, część pacjentów po aplikacji parenteralnej szczepionki zawierającej mały antygen powierzchniowy S-HBsAg nie wykształca odpowiedzi immunologicznej lub jest ona niewystarczająca. Szczególnie ludzie starsi, palący, otyli, mężczyźni, osoby zakażone wirusami obniżającymi immunokompetencję (np. HIV), bądź cierpiące na niedobory immunologiczne o innym podłożu oraz pacjenci z niewydolnością nerek zdecydowanie gorzej reagują na klasyczną szczepionkę. W skrajnych przypadkach efektywność szczepienia w tych grupach sięga zaledwie kilku procent pomimo wielokrotnego szczepienia zwiększonymi dawkami preparatu (Singh 2003). W konsekwencji, osoby te pozostają podatne na rozwój choroby. W związku z powyższym, od pewnego czasu prowadzone są badania nad opracowaniem nowej szczepionki, tzw. trzeciej generacji, przeciwko wzw B, zawierającej S-HBsAg i jeden lub dwa pozostałe antygeny powierzchniowe HBV, tj. średni (ang. medium) M-HBsAg oraz duży (ang. large) L - HBsAg (Madaliński 2002, Yamada 2001, Young 2001). Wymienione antygeny są wysoce immunogenne, co powoduje, że szczepionki III generacji (np. Hepacare®, Bio-Hep-B™), wywołują powstawanie znacznie większego spektrum przeciwciał anty-wirusowych w porównaniu ze szczepionkami zawierającymi wyłącznie S-HBsAg. Badania kliniczne prowadzone zarówno z udziałem osób dorosłych, jak i dzieci oraz noworodków potwierdzają silne właściwości immunostymulujące preparatów zawierających pełen zestaw antygenów powierzchniowych HBV. Miano przeciwciał anty-HBV po dwukrotnej immunizacji takim preparatem było do trzech razy wyższe w porównaniu z wynikami osiągniętymi po trzykrotnym zaaplikowaniu klasycznej szczepionki, zawierającej tylko antygen S-HBs. Co ważniejsze, preparat ten wywoływał odpowiedź immunologiczną u zdecydowanie większego odsetka pacjentów gorzej odpowiadających na szczepionki przeciw hepatitis B: starszych, mężczyzn,

PL 217 229 B1 palaczy oraz osób z nadwagą (Young 2001). W innych doświadczeniach wykazano, że osoby, które pierwotnie nie odpowiedziały na szczepionkę zawierającą tylko mały antygen powierzchniowy, wykształciły odpowiednie przeciwciała po podaniu preparatu, w którym obecne były również antygeny średni M-HBs i duży L-HBs. Po pojedynczej dawce prawie 70% (Zuckerman 1997), natomiast po dwukrotnym zaaplikowaniu specyfiku blisko 80% pacjentów uległo serokonwersji (Yap 1996). Większą skuteczność szczepionki zawierającej wszystkie antygeny otoczki potwierdzają również badania, w których użycie kilkukrotnie mniejszej dawki takiego preparatu (2,5 μg) od standardowej dawki szczepionki opartej na antygenie S-HBs, wywoływało powstanie odpowiednich przeciwciał u 100% szczepionych dzieci (Madaliński 2002).

Oprócz prac nad otrzymaniem udoskonalonej szczepionki profilaktycznej przeciwko wzw B, podejmowane są działania zmierzające do opracowania specyfików służących terapii chronicznej postaci choroby, na którą zapada do 10% dorosłych, do 40% dzieci i aż 90% noworodków. Obecnie stosowana terapia interferonem przynosi umiarkowanie pozytywne efekty u około 30 - 50% pacjentów (Juszczyk 2000, Martin-Vivaldi 2000), a znaczny odsetek osób odczuwa silne skutki uboczne (Deres 2003). Wobec tych problemów, zainteresowanie wzbudza podejście oparte na próbach modulacji odpowiedzi immunologicznej za pomocą preparatów zawierających wszystkie antygeny powierzchniowe otoczki HBV i/lub antygen rdzeniowy, tj. HBcAg (Hepatitis B core Antygen). Dotychczasowe próby immunoterapii przewlekłego wzw B realizowane za pomocą preparatu antygenów powierzchniowych S-, Μi L-HBsAg dały obiecujące wyniki, ponieważ uzyskano stukrotnie podwyższoną immunogenność w stosunku do szczepionki standardowej (Yuen 2001) lub stwierdzono indukcję humoralnej odpowiedzi immunologicznej względem antygenu HBs oraz pewną odpowiedź cytotoksyczną u 50% chronicznych nosicieli HBV (Couillin 1999, Pol 1998). Oprócz białek otoczki, ważną rolę w przyszłej szczepionce terapeutycznej przypisuje się antygenowi rdzeniowemu HBcAg, z którego zbudowany jest kapsyd wirusa hepatitis B. Antygen HBc jest silnym immunogenem zarówno zależnym od limfocytów T, jak też T- niezależnym i z tego powodu jest doskonałym kandydatem do konstruowania szczepionek terapeutycznych indukując zarówno silną odpowiedź cytotoksyczną, jak również humoralną odpowiedź przeciwciał anty-HBc (Heathcote 1999, Bocher 2001).

Wzrastająca liczba nosicieli HBV, konieczność masowych szczepień, jak również niewystarczająca efektywność dotychczasowych preparatów powodują, że opracowanie tanich szczepionek profilaktycznych o podwyższonej skuteczności oraz szczepionek terapeutycznych przeciwko wzw B jest powszechnie oczekiwane.

Opierając się na dotychczasowych danych można założyć, że immunogenność preparatu zawierającego wszystkie antygeny otoczki, tj. S-, M- i L-HBsAg i/lub antygen rdzeniowy HBcAg, będzie bardzo podobna do wywoływanej przez kompletne wiriony HBV, tzw. cząstki Dane'a. Preparat taki, będący „szczepionkowym analogiem” pełnego wirusa, indukowałby silną odpowiedź immunologiczną poprzez elicytację przeciwciał przeciwko wszystkim antygenom wirusa. Szczepienie tego rodzaju preparatem stwarzałoby sytuację zbliżoną do immunizacji natywnym wirusem, jednakże bezpieczną, ponieważ preparat ten jako pozbawiony materiału genetycznego i stąd nieinfekcyjny, nie wywoływałby objawów chorobowych. Wytworzenie panelu roślin transgenicznych produkujących komplet antygenów HBV pochodzących z różnych szczepów wirusa, pozwoli na opracowanie alternatywnej szczepionki pochodzenia roślinnego, zarówno profilaktycznej i terapeutycznej przeciwko wielu szczepom (podtypom, serotypom) HBV.

Głównym założeniem otrzymania szczepionki profilaktycznej o podwyższonej efektywności i terapeutycznej przeciwko wzw B aplikowanej doustnie, parenteralnie lub donosowo jest ekspresja i wydajna produkcja wysoce immunogennych podjednostek antygenu powierzchniowego S-HBs, M-HBs i L-HBs oraz antygenu rdzeniowego HBc różnych szczepów HBV w transgenicznej roślinie jadalnej w przypadku szczepionki doustnej lub cechującej się szybkim wzrostem, dużą biomasą i łatwością ekstrakcji w przypadku szczepionki parenteralnej lub donosowej. Prace nad tym zagadnieniem prowadzono przez szereg lat w kilku grupach badawczych (patrz cytowana literatura) na całym świecie. Dotychczas otrzymywane rośliny transgeniczne lub kultury tkanek/komórek charakteryzowały się w każdym przypadku opornością na antybiotyki, głównie kanamycynę. Jednocześnie, poziom ekspresji białek HBsAg był niewysoki i dla S-HBsAg oscylował w granicach 1 - 3 μg/gram świeżej masy (ang. g of fresh weight, g FW), a sporadycznie wynosił maksymalnie 16 μg/g FW, dla M-HBsAg 0,01-1 μg/g FW, a dla L-HBsAg w 0,01 μg/g FW. Ponadto, w badaniach nad immunizacją doustną zwierząt, ewentualnie ochotników, wykorzystywano wyłącznie świeży nieprzetworzony, tj. surowy materiał roślinny.

PL 217 229 B1

Założeniem wynalazku jest uzyskanie alternatywnej doustnej oraz parenteralnej lub donosowej profilaktycznej oraz terapeutycznej szczepionki III generacji przeciwko wzw B, opracowanej z wykorzystaniem roślin transgenicznych.

W szczególności, pierwszym celem wynalazku jest wydajna ekspresja średniego antygenu powierzchniowego M-HBsAg, należącego do różnych podtypów HBV, w jadalnych roślinach transgenicznych, np. w sałacie, umożliwiająca opracowanie szczepionki aplikowanej doustnie, np. w formie zawiesiny, syropu, granulatu, tabletki bądź kapsułki. Szczepionka doustna w tej postaci byłaby istotnie łatwiejsza do zastosowania na szeroką skalę, zarówno jako szczepionka pierwotna, jak i jako szczepionka przypominająca dla osób uprzednio szczepionych, u których miano przeciwciał anty-HBs obniżyło się, względnie przeciwciała anty-HBs nie są już wykrywalne.

W szczególności, drugim celem wynalazku jest wydajna ekspresja średniego antygenu powierzchniowego M-HBsAg, należącego do różnych podtypów HBV, w tytoniu jako gatunku cechującym się szybkim wzrostem i dużą biomasą, pozwalająca na efektywną ekstrakcję i oczyszczenie antygenów jako podstawowych składników szczepionki aplikowanej parenteralnie w formie zastrzyku lub donosowo w formie aerozolu lub kropel. Zastosowanie roślin transgenicznych do produkcji komponentów szczepionki byłoby w założeniu istotnie tańsze od stosowanych obecnie przemysłowych metod produkcji mikrobiologicznej.

Nieoczekiwanie, opisane powyżej cele zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku. Kolejne przedmioty wynalazku zostały zdefiniowane w załączonych zastrzeżeniach patentowych.

Przedmiotem wynalazku jest transgeniczna komórka roślinna zdolna do ekspresji średniego antygenu powierzchniowego M-HBsAg wirusa HBV szczepu ayw4 lub adwA na poziomie > 4 μg/g św. m., przy czym zawiera ona cząsteczkę T-DNA składającą się z sekwencji granicznych T-DNA oraz umieszczonych pomiędzy nimi dwóch kaset ekspresyjnych:

- pierwszej kasety ekspresyjnej składającej się z sekwencji kodującej białko M-HBsAg wirusa HBV szczepu aywA lub adw4 oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji promotora 35S RNA CaMV z pojedynczym enhancerem i terminatora transkrypcji syntazynopalinowej (NOSt), korzystnie zawierającą co najmniej jedną spośród sekwencji: SEQ ID No. 4 i SEQ ID No. 5, oraz

- drugiej kasety ekspresyjnej składającej się z sekwencji kodującej gen oporności na herbicydy fosfinotricynowe , korzystnie genu bar, oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji regulatorowych, korzystnie sekwencji promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora transkrypcji g7t, korzystnie zawierającą sekwencję SEQ ID No. 16.

Komórka według wynalazku jest korzystnie komórką sałaty albo tytoniu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie komórki roślinnej według wynalazku do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.

Zastosowanie według wynalazku, charakteryzuje się tym, że stosowane komórki roślinne korzystnie mają postać biomasy roślinnej, zwłaszcza liofilizowanego materiału roślinnego, korzystnie sałaty.

Korzystnie, zastosowanie według wynalazku, charakteryzuje się tym, że wytwarzana szczepionka ma postać wybraną spośród: zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek, kapsułek.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie komórki roślinnej według wynalazku do wytwarzania aplikowanej parenteralnie lub donosowo szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.

W jednej z realizacji, stosowane komórki roślinne według wynalazku, korzystnie tytoniu, wytwarzają białka średniego antygenu powierzchniowego M-HBsAg wirusa HBV, które mogą być ekstrahowane i oczyszczone.

W kolejnej realizacji wynalazku, wytwarzana szczepionka korzystnie ma postać wybraną spośród zastrzyku podawanego na drodze iniekcji parenteralnej lub podawanych donosowo aerozolu lub kropel.

Szczegółowy opis wynalazku

Ujawniona została transgeniczna komórka roślinna i zregenerowane oraz potomne rośliny kolejnych pokoleń sałaty i tytoniu, jak również ich klony wegetatywne, posiadające oporność na fosfinotricynę i pochodne herbicydy i zdolne do ekspresji białka M-HBsAg wirusa HBV szczepu ayw4 lub adw4 na poziomie > 4 μg/g św. m. (FW), przy czym komórki zawierają pochodzącą z wektora ekspresyjnego cząsteczkę T-DNA złożoną z sekwencji granicznych i umieszczonych między nimi dwóch kaset ekspresyjnych:

PL 217 229 B1

- Pierwszej, składającej się z sekwencji kodującej średnią podjednostkę antygenu powierzchniowego (M-HBsAg) wirusa HBV szczepu ayw4 lub adw4 oraz kontrolujących ich ekspresję sekwencji regulatorowych, korzystnie promotora 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) oraz terminatora syntazy nopalinowej (NOSt). Korzystnie posiadają one sekwencje przedstawione jako SEQ ID No. 4. SEQ ID No. 5.

- Drugiej, składającej się z sekwencji kodującej gen oporności na fosfinotricynę, korzystnie gen bar, oraz kontrolujących jej ekspresję sekwencji regulatorowych, korzystnie sekwencji promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora transkrypcji g7t, przedstawionej jako SEQ ID No. 16.

Pochodzący z sałaty materiał roślinny może być zastosowany jako szczepionka doustna przeciwko HBV i w konsekwencji przeciwko wzw B. Materiał roślinny według wynalazku po odwodnieniu na drodze liofilizacji w warunkach głębokiego zamrożenia, zachowuje w temperaturze pokojowej natywną strukturę białka antygenowego M-HBsAg i immunogenność przez okres co najmniej 12 miesięcy i może być zastosowany do otrzymania szczepionki doustnej przeciwko wzw B w formie zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek lub kapsułek. Pochodzący z tytoniu materiał roślinny może być zastosowany jako surowiec do ekstrakcji i oczyszczenia antygenu M-HBsAg jako komponentu szczepionki przeciwko HBV i w konsekwencji przeciwko wzw B, zarówno parenteralnej w formie zastrzyku domięśniowego lub dootrzewnowego lub podskórnego, bądź szczepionki donosowej w formie aerozolu lub kropel.

Ponadto, ujawniono zastosowanie komórki roślinnej sałaty według wynalazku do wytwarzania doustnej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B. Liofilizowany materiał roślinny zawierający antygen S-HBsAg podany per os w formie zawiesiny zwierzętom doświadczalnym wywoływał odpowiedź immunologiczną błon śluzowych charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał klasy IgA anty-HBs oraz odpowiedź ogólnoustrojową charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał IgA i IgG anty-SHBs. W szczególności, liofilizowany materiał roślinny według wynalazku podany per os jednokrotnie uprzednio immunizowanym per os zwierzętom doświadczalnym wywołuje wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej błon śluzowych charakteryzującej się wytwarzaniem przeciwciał klasy IgA anty-HBs oraz wzmocnienie odpowiedzi ogólnoustrojowej charakteryzującej się wytwarzaniem przeciwciał IgA i IgG anty-HBs. Z wysokim prawdopodobieństwem można założyć, że podobny efekt immunizacyjny zachodzić będzie dla materiału roślinnego zawierającego M-HBsAg ayw4/adw4.

Korzystnie, wytwarzana szczepionka doustna ma postać wybraną spośród: zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek i kapsułek. Korzystnie, granulat, tabletki oraz kapsułki uformowane ze sproszkowanego liofilizatu transgenicznej sałaty według wynalazku zachowują w temperaturze pokojowej natywną strukturę białka antygenowego M-HBsAg i immunogenność przez okres co najmniej 12 miesięcy.

Ujawniono również zastosowanie komórki roślinnej tytoniu według wynalazku do wytwarzania parenteralnej lub donosowej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.

Na podstawie obecnego stanu wiedzy, z wysokim prawdopodobieństwem można założyć, że antygen M-HBsAg poddany ekstrakcji i oczyszczaniu, korzystnie z materiału roślinnego według wynalazku, podany na drodze iniekcji parenteralnej (domięśniowej, dootrzewnowej, podskórnej) będzie wywoływać ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał anty-HBs, głównie z klasy IgG oraz pozostałych klas, jak również antygen ten podany na drodze donosowej w postaci aerozolu lub kropel przez błonę śluzową jamy nosowej będzie wywoływać odpowiedź immunologiczną błon śluzowych charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał klasy IgA anty-HBs oraz odpowiedź ogólnoustrojową charakteryzującą się wytwarzaniem przeciwciał anty-HBs, głównie klasy IgG oraz pozostałych klas.

W stosunku do znanych ze stanu techniki wyników wynalazek reprezentuje istotne nowości i zasadniczo innowacyjne podejście do otrzymania doustnej, parenteralnej lub donosowej szczepionki III generacji przeciwko wzw B, obejmujące następujące elementy:

- transgeniczne rośliny sałaty wytwarzające M-HBsAg na poziomie przekraczającym 4 μg MHBsAg/g FW i dochodzącym do 35 μg/g FW oraz nie zawierające markerowych genów oporności na antybiotyki lecz oporne na herbicydy fosfinotricynowe, np. Basta, przez co nie stwarzają zagrożenia potencjalnego poszerzenia antybiotykooporności mikroflory ustroju człowieka

- metoda wegetatywnego rozmnażania transgenicznych roślin sałaty wytwarzających szczepionkowe białko M-HBsAg w sposób zapewniający powtarzalne i wielokrotne uzyskiwanie klonów roślinnych, u których dla co najmniej 80% różnice w zawartości szczepionkowego białka nie przekraczają 20%, a ponadto dla co najmniej 80% klonów zawartość białek HBV nie zmienia się w porównaniu z rośliną wyjściową. Uzyskane klony wegetatywne cechują się zatem statystycznie wyrów6

PL 217 229 B1 naną zawartością białek szczepionkowych, co umożliwia przemysłową produkcję roślin o wysokiej i stałej zawartości białka M-HBsAg jako materiału dla potrzeb wytwarzania szczepionki doustnej

- otrzymanie z sałaty transgenicznej wytwarzającej M-HBsAg po raz pierwszy prototypu szczepionki doustnej w skondensowanej formie liofilizatu, wyjściowego półproduktu dla postaci doustnej szczepionki jak: zawiesina liofilizatu, syrop, granulat, tabletki lub kapsułki

- transgeniczne rośliny tytoniu wytwarzające M-HBsAg na poziomie przekraczającym 4 pg M-HBsAg/g FW i dochodzącym do 35 μg/g FW, co stanowi podstawę do wydajnego uzyskiwania na skalę przemysłową antygenu M-HBsAg na drodze ekstrakcji i oczyszczania dla potrzeb szczepionki parenteralnej lub donosowej, a jednocześnie oporne na herbicydy fosfinotricynowe, np. Basta, co umożliwia ich uprawę w warunkach polowych.

Jedną z korzystnych realizacji wynalazku są wektory pKHBMBAR i pKHBMadwBAR [Fig. 1] do otrzymywania roślin opornych na herbicydy fosfionotricynowe, np. Basta i jednocześnie eksprymujących heterologiczne białko M-HBsAg w sposób konstytutywny, głównie w liściach.

Ważną cechą wektorów jest T-DNA zawierający dwie kasety ekspresyjne, determinujące ekspresję immunogennego białka podjednostki M antygenu powierzchniowego HBs (podtypu ayw4/adw4) wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) oraz acetylotransferazy fosfinotricyny, warunkującej oporność na fosfinotricynę, która jest składnikiem niektórych herbicydów o nieselektywnym działaniu, np. Basta. W skład pierwszej kasety wchodzi sekwencja kodująca antygenowe białko M-HBsAg pod kontrolą sekwencji regulatorowych: promotora 35S RNA CaMV z pojedynczym enhancerem i terminatora transkrypcji syntazy nopalinowej (NOSt). W skład drugiej kasety wchodzi sekwencja kodująca genu bar pod kontrolą promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora transkrypcji g7t. Kolejną istotną cechą skonstruowanego T-DNA jest występowanie wymienionych sekwencji kodujących lub regulatorowych wyłącznie w jednej kopii i w określonej orientacji względem siebie [Fig. 1]. Brak powtórzeń motywów sekwencyjnych powoduje wyeliminowanie rekombinacji w obrębie wprowadzonego T-DNA oraz zrównoważoną transkrypcję poszczególnych transgenów. Cechy konstrukcyjne T-DNA przyczyniają się zatem do ograniczenia zjawiska wyciszania genów, a tym samym do większej stabilności T-DNA w obrębie genomu roślin transgenicznych, co jest szczególnie istotne w odniesieniu do sałaty, której genom jest stosunkowo zmienny i ulegający rearanżacjom (McCabe 1999). W konsekwencji, cechy konstrukcyjne T-DNA przyczyniają się do stabilnej ekspresji transgenów M-HBs oraz bar w komórkach roślinnych.

W wynalazku ujawniono transformowane komórki sałaty i tytoniu i zregenerowane z nich rośliny oraz rośliny kolejnych pokoleń generatywnych i/lub wegetatywnych charakteryzujące się jednoczesną ekspresją podjednostkowego białka antygenu powierzchniowego - M-HBsAg wirusa HBV ayw4/adw4 oraz opornością na herbicydy fosfinotricynowe. Oporność roślin na herbicydy umożliwia wykorzystanie takiego produktu jako materiału wyjściowego do otrzymania szczepionki doustnej bądź uprawę roślin w warunkach polowych zgodnie z obowiązującymi wymogami i zaleceniami. Transformowanie sałaty i tytoniu za pomocą wektorów opisanych w wynalazku [Fig. 1] zapewnia otrzymanie linii roślin transgenicznych [Fig. 2], których znamienną cechą jest oporność na herbicydy fosfinotricynowe, np. Basta oraz ekspresja białka M-HBsAg na poziomie 1 4 μg/g FW do 35 μg/g FW [Fig. 3 - 5]. Cechy te utrzymują się zarówno w pierwotnych regenerantach (pokolenie T0) oraz w pierwszym (T1) i w kolejnych pokoleniach generatywnych jak i w klonach roślin sałaty [Fig. 5, Tab. 1] rozmnażanych wegetatywnie według opracowanej metody [Fig. 5]. Linie transgenicznych roślin analizowano metodą PCR w celu wstępnego potwierdzenia obecności sekwencji transgenu w DNA genomowym, jak również w celu określenia/potwierdzenia mendlowskiego mechanizmu 3:1 dziedziczenia transgenu roślin transgenicznych [Fig. 2A]. Następnie genomowy DNA roślin z poszczególnych linii poddano hybrydyzacji z sondą komplementarną do sekwencji transgenu M-HBs według metody Southern blot [Fig. 2B] w celu określenia liczby miejsc integracji T-DNA zawierającego transgeny. Rośliny pokolenia T0 i T1 oraz ich klony wegetatywne badano również pod kątem ekspresji podjednostkowego białka M antygenu powierzchniowego HBs za pomocą jakościowego i ilościowego kanapkowego testu immunoenzymatycznego czyli sandwich ELISA z użyciem specyficznych przeciwciał firmy Biodesign oraz specjalistycznego zestawu firmy Abbott [Fig. 3], a także przy użyciu metody Western-blot [Fig. 4]. Wytwarzane w roślinach białko antygenowe M-HBsAg charakteryzuje się natywną strukturą, zdolnością do glikozylacji oraz zachowuje zdolność do składania się w wysoce immunogenne cząstki subwiralne, inaczej wirusopodobne (ang. Virus-Like Particles, VLPs), bądź mniejsze agregaty, o czym świadczą wyniki ELISA, w tym za pomocą zestawu firmy Abbott, ukierunkowanego na wykrywanie epitopu „a” białek HBsAg ustrukturalizowanych w cząstki VLPs/agregaty. Z kolei wśród obserwowanych w Western-blot

PL 217 229 B1 prążków odpowiadających różnym formom białka M-HBsAg, znajdują się również formy glikozylowane oraz dimery, które są pierwszym etapem w procesie składania się cząstek VLPs. Cząstki takie obserwowano również za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEM1200EXII firmy Jeol bezpośrednio w komórkach mezofilu liści tytoniu [Fig. 6], przygotowanych za pomocą standardowych technik seryjnych skrawków i kontrastowania z niewielkimi modyfikacjami (Kocjan 1996).

Aspektem wynalazku jest również sposób wegetatywnego rozmnażania (mikrorozmnażania, namnażania) w kulturze in vitro transgenicznych roślin sałaty zapewniający powtarzalne i wielokrotne uzyskiwanie roślin z wysoką wydajnością, tj. 8 - 13 roślin potomnych uzyskiwanych z jednej rośliny wyjściowej [Fig. 5]. W uzyskanych klonach poziom ekspresji białka M-HBsAg jest wyrównany, tj. z odchyleniami nieistotnymi statystycznie lub różnice w zawartości szczepionkowego białka nie przekraczają 20% [Tab. 1], a ponadto dla co najmniej 80% klonów poziom białek HBV jest porównywalny z rośliną wyjściową oraz z roślinami otrzymanymi z nasion [Fig. 5, Tab. 1]. Sposób mikrorozmnażania według wynalazku umożliwia przemysłowe namnażanie roślin charakteryzujących się pożądanym wysokim poziomem ekspresji, zapewniając co najmniej kilkudziesięciokrotne zwiększenie ilości materiału o wysokiej, a jednocześnie stałej statystycznie ilości białek antygenowych, jako surowca wyjściowego do produkcji szczepionki doustnej przeciwko wzw B.

Ponadto, w wynalazku ujawniono zastosowanie transgenicznej sałaty, opornej na fosfinotricynę i wytwarzającej białko antygenowe M-HBsAg jako komponentu do otrzymania profilaktycznej i terapeutycznej doustnej szczepionki III generacji przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B, tj. zawierającej pełen zestaw białek strukturalnych HBV. Sałata (Lactuca sativa L.) jest gatunkiem, który w odróżnieniu od wykorzystywanych dotychczas gatunków roślin charakteryzuje się właściwościami istotnymi dla otrzymywania szczepionki podawanej na drodze doustnej. Liście sałaty, odmiennie niż zdecydowana większość roślin uprawnych, nadają się do bezpośredniego spożycia bez potrzeby uzdatniania, przede wszystkim obróbki termicznej. Nie zawierają też żadnych substancji antyżywieniowych lub wywołujących alergię, których obecność mogłaby stanowić czynnik limitujący spożycie. Znamienną cechą transgenicznej sałaty wytwarzającej M-HBsAg i jednocześnie opornej na herbicyd jest przydatność i dogodność jej wykorzystania jako materiału wyjściowego dla wytworzenia szczepionki przeciwko wzw B aplikowanej na drodze doustnej.

W wynalazku ujawniono również zliofilizowany materiał roślinny, jego zastosowanie do otrzymania szczepionki doustnej III generacji w formie pochodnych: zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek i kapsułek zawierających m.in. białko szczepionkowe M-HBsAg, a także wymienione formy pochodne liofilizatu i sposób ich przygotowania z materiału roślinnego.

Skuteczna szczepionka doustna III generacji przeciwko wzw B, w przeciwieństwie do stosowanych dotychczas rozwiązań [patrz cytowana literatura] posiada skondensowaną formę sproszkowanego liofilizatu aplikowaną w formie zawiesiny, syropu oraz granulatu i tabletek lub kapsułek. Materiałem wyjściowym do otrzymania kondensatu są liście poszczególnych linii sałaty, zawierające białka antygenowe, w tym M-HBsAg, które są poddawane liofilizacji. Materiał pochodzący z poszczególnych linii jest mielony na proszek, a następnie może być komponowany do preparatu zawierającego określone ilości białek antygenowych, w tym M-HBsAg, rożnych podtypów HBV. odpowiednie dla wywołania pożądanej odpowiedzi immunologicznej. Preparat ten przy użyciu roztworu soli fizjologicznej lub podobnego buforu, np. PBS, bądź po dodaniu substancji pomocniczych może być przeprowadzany do formy zawiesiny lub syropu, granulatu, tabletek lub kapsułek [Fig. 6A]. Sproszkowany, liolifizowany materiał roślinny oraz forma zawiesinowa/syropowa lub granulatowa/tabletkowa/kapsułkowa szczepionki doustnej III generacji przeciwko wzw B [Fig. 6A], w przeciwieństwie do surowego materiału roślinnego, charakteryzują się znamiennymi cechami umożliwiającymi:

- utrwalenie materiału roślinnego z zachowaniem wysokiej zawartości szczepionkowego białka M-HBsAg różnych podtypów,

- skoncentrowanie dawki czynnika szczepionkowego, tj. białka M-HBsAg różnych podtypów do poziomu wystarczającego do immunizacji na drodze doustnej,

- podawanie stałej wystandaryzowanej dawki M-HBsAg dzięki a) kontroli poziomu białka antygenowego na poszczególnych etapach przygotowania półproduktu - liofilizatu zawierającego antygen, b) kontroli poziomu białka antygenowego na etapie sporządzania zawiesiny lub syropu oraz granulatu i tabletek lub kapsułek oraz c) doborowi odpowiednich materiałów wyjściowych i komponentów wypełniających,

PL 217 229 B1

- ustalenie odpowiednich proporcji M-HBsAg różnych podtypów dla uzyskania odpowiedniego poziomu zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej, bądź dla uzyskania odpowiedniego efektu terapeutycznego chronicznej postaci wzw B, wywoływanej przez najczęściej występujące szczepy HBV,

- ustalenie skutecznego protokołu szczepienia poprzez kontrolowanie dawki i reżimu czasowego immunizacji,

- łatwe przechowywanie sproszkowanego liofilizatu oraz granulatu i tabletek lub kapsułek w temperaturze pokojowej z zachowaniem trwałości M-HBsAg przez okres co najmniej 12 miesięcy,

- prosty sposób szczepienia na drodze doustnej poprzez wypicie lub połknięcie.

W wynalazku ujawniono ponadto zastosowanie transgenicznego tytoniu opornego na fosfinotricynę i wytwarzającego białko antygenowe M-HBsAg do otrzymania profilaktycznej i terapeutycznej parenteralnej lub donosowej szczepionki III generacji przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B. Tytoń (Nicotiana tabacum L.) jest gatunkiem rośliny, która charakteryzuje się właściwościami istotnymi dla wytwarzania białek. Produkcja białek heterologicznych w tytoniu opornym na herbicydy cechuje się wysoką opłacalnością, co wynika z niskich kosztów uprawy w warunkach zarówno szklarniowych jak i polowych, szybkiego wzrostu, dużej biomasy oraz stałości i wydajności poziomu ekspresji białek heterologicznych. Antygenowe białka HBV, w tym M-HBsAg, tworzące cząstki VLPs lub agregaty w liściach tytoniu [Fig. 6B] mogą być ekstrahowane i oczyszczane z materiału roślinnego z użyciem standardowych metod fizycznych, np. wirowania i fizykochemicznych, np. chromatografii powinowactwa. Oczyszczony antygen M-HBsAg różnych podtypów może następnie być wykorzystany do przygotowania preparatu zawierającego określone proporcje poszczególnych antygenów dla uzyskania odpowiedniego poziomu odpowiedzi immunologicznej zabezpieczającej przed wzw B, bądź dla uzyskania odpowiedniego efektu terapeutycznego chronicznej postaci wzw B. Preparat białek szczepionkowych, po dodaniu adiuwantów, stabilizatorów i innych substancji może być użyty do szczepień według stosowanych procedur na drodze iniekcji parenteralnej (domięśniowej, dootrzewnowej, podskórnej) bądź przez błony śluzowe w formie aerozolu lub kropel aplikowanych donosowo [Fig. 6B]. Znamienną cechą transgenicznego tytoniu wytwarzającego M-HBsAg i jednocześnie opornego na herbicydy jest przydatność i dogodność jego wykorzystania jako materiału wyjściowego dla wytworzenia profilaktycznej i terapeutycznej szczepionki III generacji przeciwko wzw B zawierającej oczyszczone antygeny i aplikowanej na drodze parenteralnej lub donosowej.

Uzyskane zgodnie z wynalazkiem szczepionki III generacji mogą być wykorzystane do szczepienia przeciwko wzw B na drodze doustnej za pomocą zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek lub kapsułek wytworzonych ze sproszkowanego liofilizatu pochodzącego z sałaty zawierającego antygen M-HBsAg, bądź na drodze parenteralnej za pomocą zastrzyków lub donosowej za pomocą aerozolu lub kropel zawierających ekstrahowany i oczyszczony z tkanek tytoniu antygen M-HBsAg. Uzyskane preparaty mogą być również wykorzystane w kombinowanej immunizacji doustno-parenteralnej lub doustno-donosowej lub donosowo-parenteralnej.

Antygen powierzchniowy M-HBsAg i pozostałe antygeny wirusa HBV są silnymi immunogenami, które wywołują odpowiedź immunologiczną u szeregu gatunków ssaków, w tym u myszy, szympansa oraz człowieka. Odpowiedź immunologiczna może być typu komórkowego obejmującego powstawanie specyficznych limfocytów cytotoksycznych lub typu humoralnego polegającego na powstawaniu specyficznych przeciwciał. Przyjmuje się, że u człowieka i szympansa zaindukowana na odpowiednim poziomie odpowiedź humoralna jest wystarczająca do ochrony przed zachorowaniem po ekspozycji na wirusa. W zależności od sposobu podania immunogenu, reakcja immunologiczna na antygeny HBV obejmuje powstawanie przeciwciał głównie klasy IgG oraz innych klas przy immunizacji parenteralnej (iniekcja domięśniowa, dootrzewnowa lub podskórna) oraz IgG i IgA przy immunizacji poprzez błony śluzowe przewodu pokarmowego, tj. metodą doustną (za pomocą zawiesiny, syropu, granulatu, tabletek lub kapsułek) oraz poprzez nabłonek dróg oddechowych, tj. metodą donosową (za pomocą aerozolu lub kropli), ewentualnie także na drodze waginalnej, rektalnej lub poprzez skórę.

Istotnym elementem sposobu szczepienia antygenem M-HBsAg produkowanym w roślinach zgodnie z wynalazkiem jest immunizacja poprzez błony śluzowe - jelita w przypadku szczepionki doustnej wytworzonej z sałaty lub śluzówkę nosa w przypadku szczepionki donosowej wytworzonej na bazie antygenu ekstrahowanego i oczyszczanego z tytoniu.

Według dostępnej wiedzy (Mowat i Viney 1997, Langridge 2000, Mowat 2003, Poonam 2007), białka antygenowe znajdujące się w kontakcie z błonami śluzowymi indukują lokalnie zasocjowane komórki układu immunologicznego, w tym GALT (Gut Associated Lyphoid Tissue) w jelicie, NALT (Nasal Associated Lymphoid Tissue) w śluzówce nosa i BALT (Bronchus Associated Lymhoid Tissue)

PL 217 229 B1 dalszych dróg oddechowych oraz inne. W strukturze GALT, NALT lub BALT znajdują się wyspecjalizowane komórki (np. komórki M w kępkach Peyera w śluzówce jelita), które od strony środowiska zewnętrznego, tj. światła jelita lub jamy nosa i dalszych dróg oddechowych pobierają zdegradowane i kompletne białka antygenowe oraz wirusy, bakterie lub pierwotniaki. Antygeny lub drobnoustroje są następnie transportowane do komórek układu immunologicznego, w tym komórek prezentujących antygen (APC - Antigen Presenting Cells), tj. komórek dendrytycznych i makrofagów oraz limfocytów T i B, zarówno lokalnie w obrębie błon śluzowych, jak i do obwodowych organów limfatycznych w wyniku cyrkulacji ogólnoustrojowej. W wyniku prezentacji antygenów limfocytom Th obecnym w śluzówce jelita lub dróg oddechowych dochodzi do lokalnej humoralnej odpowiedzi immunologicznej poprzez aktywację limfocytów Th, wydzielania cytokin i następującej aktywacji limfocytów B objawiającej się wydzielaniem przez błony śluzowe antygenowo-specyficznych przeciwciał klasy IgA. W kolejnych etapach limfocyty Th przechodzą do krwi i po dotarciu do obwodowych organów układu immunologicznego wywołują na podobnej drodze aktywacji ogólnoustrojową odpowiedź humoralną w klasie przeciwciał IgG i pozostałych klas (IgM, IgA) oraz ewentualnie odpowiedź komórkową objawiającą się wykształceniem subpopulacji limfocytów cytotoksycznych Tc aktywowanych antygenem, a także pamięci immunologicznej.

Jak wykazano uprzednio, antygen S-HBsAg jest immunogenny dla myszy po uprzednim utrwaleniu materiału roślinnego sałaty zawierającego S-HBsAg na drodze liofilizacji i przeprowadzeniu bezpośrednio przed podaniem w formę zawiesiny. Odpowiedź immunologiczna na antygen S-HBsAg powstaje w wyniku pierwotnego doustnego podania antygenu (priming), a następnie w efekcie powtarzanych jednej lub więcej immunizacji, których rezultatem jest odpowiedź wtórna (boosting). Można z wysokim prawdopodobieństwem założyć, że podobną odpowiedź immunologiczną po podaniu doustnym będzie wywoływał preparat szczepionkowy III generacji, czyli zawierający antygen S-HBsAg i pozostałe antygeny HBV, w tym M-HBsAg. Przesłanką takiego założenia jest pokrewieństwo strukturalne antygenów powierzchniowych HBsAg, objawiające się zdolnością do tworzenia struktur wyższego rzędu, tj. cząstek VLPs lub agregatów, w tym formowanych przez M-HBsAg. Podobieństwo mechanizmów śluzówkowej odpowiedzi immunologicznej w obrębie GALT i NALT/BALT (Brandtzaeg 2007, Poonam 2007) pozwala z kolei przyjąć, że donosowo podany preparat szczepionkowy III generacji zawierający oczyszczone M-HBsAg i pozostałe antygeny HBV będzie indukować lokalną i ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną.

Wytworzony w roślinach według wynalazku i oczyszczony antygen M-HBsAg będzie mógł być również użyty jako składnik standardowo aplikowanych szczepionek, tj. na drodze iniekcji parenteralnej według stosowanych procedur. Istotnym dla tej metody szczepień jest alternatywny sposób produkcji szczepionkowych antygenów w roślinach. Produkcja antygenu M-HBsAg różnych podtypów w odrębnych liniach roślin transgenicznych według wynalazku pozwala na optymalne ustalenie i wystandaryzowanie proporcji poszczególnych immunogenów szczepionki dla potrzeb wysoce skutecznej profilaktycznej i terapeutycznej szczepionki III generacji przeciwko wzw B, zarówno doustnej, jak i donosowej lub parenteralnej. Możliwość użycia M-HBsAg i pozostałych antygenów, dwóch najczęściej (ayw4, adw4) lub innych spotykanych szczepów HBV pozwoli na ustalenie optymalnych parametrów efektywnej immunizacji, tj. liczby i wysokości dawek antygenu, okresów pomiędzy poszczególnymi immunizacjami, użycia adiuwantów itp. W kolejnym etapie wystandaryzowanie szczepionki odbywać się będzie poprzez odpowiedni dobór proporcji antygenu M-HBsAg i pozostałych, oczyszczonych w przypadku szczepionki donosowej lub parenteralnej lub w przypadku szczepionki doustnej obecnych w utrwalonych materiałach roślinnych, tj. sproszkowanych liofilizatach zawierających określone ilości antygenów.

Rodzaj szczepionki według wynalazku, tj. doustna w formie zawiesiny, syropu, granulatu, tabletki, kapsułki, bądź donosowa w formie aerozolu lub kropel, bądź parenteralna w formie zastrzyku umożliwia szerokie spektrum metod immunizacji w zależności od wieku immunizowanych zwierząt i ludzi, ogólnej kondycji oraz immunokompetencji, płci, wagi ciała i innych parametrów mających wpływ na odpowiedź immunologiczną. Zróżnicowanie typów szczepionki według wynalazku umożliwia ponadto stosowanie jednej metody lub kombinacji różnych metod immunizacji, tj. doustno-donosowa, doustno-parenteralna, donosowo-parenteralna itp. w celu uzyskania maksymalnego poziomu lub zakresu humoralnej odpowiedzi immunologicznej, tj. elicytacji przeciwciał klasy IgG bądź IgG i IgA, bądź też odpowiedzi komórkowej. Ponieważ zakłada się, że wertykalna transmisja HBV obejmować może błony śluzowe jako wrota zakażenia, kombinacja metod immunizacji łącząca drogę jelitowo-śluzówkową, oddechowo-śluzówkową i parenteralną za pomocą różnych form szczepionki profilaktycznej

PL 217 229 B1 i terapeutycznej III generacji według wynalazku stanowić będzie potencjalnie bardziej szczelną ochronę immunologiczną w rodzinach osób zakażonych HBV lub u przewlekłych nosicieli HBV, gdzie może dochodzić do wertykalnej transmisji zakażenia.

Dla lepszego zilustrowania istoty wynalazku niniejszy opis wzbogacono o wykaz sekwencji i figury.

Sekwencja nr 4 (SEQ ID No. 4) prezentuje sekwencję nukleotydową kasety ekspresyjnej P35S-MHBsayw4-NOSt znajdującą się w opisanym w przykładach wektorze binarnym pKHBMBAR przeznaczonym do transformacji roślin.

Sekwencja nr 5 (SEQ ID No. 5) prezentuje sekwencję nukleotydową kasety ekspresyjnej P35S-MHBsadw4-NOSt znajdującą się w opisanym w przykładach wektorze binarnym pKHBMadwBAR przeznaczonym do transformacji roślin.

Sekwencja nr 16 (SEQ ID No. 16) prezentuje sekwencję nukleotydową kasety ekspresyjnej PNOS-bar-g7t znajdującą się w opisanych w przykładach wektorach binarnych pKHBMBAR i pKHBMadwBAR.

₂

W Tabeli 1 przedstawiono wyniki analizy (test χ , test F) istotności zmian poziomu białka M-HBsAg w roślinach-klonach wegetatywnych otrzymanych podczas namnażania (mikrorozmnażania, mikropropagacji) oraz wyniki analizy zmienności poziomu M-HBsAg w klonach i roślinach kontrolnych o naturalnym cyklu rozwojowym. Wyniki analizowano statystycznie (po przekształceniu logarytmicznym, oddzielnie dla każdej z linii rodzicielskiej) poprzez analizę wariancji według modelu mieszanego uwzględniającego stałe efekty namnażanych roślin potomnych (pokolenia T1) oraz losowe efekty klonów wegetatywnych i dopuszczającego niejednorodność wariancji pomiędzy klonami.

Na figurze 1 przedstawiono schemat konstrukcji wektora pKHBMBAR i pKHBMadwBAR użytych do transformacji sałaty i tytoniu zawierających sekwencję kodującą M-HBs średniego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) szczepu ayw4 lub adw4, pod kontrolą konstytutywnego promotora 35S RNA CaMV (P35S) i terminatora syntazy nopalinowej (NOSt) oraz sekwencję genu bar kodującą acetylotransferazę fosfinotricyny pod kontrolą promotora syntazy nopalinowej (PNOS) i terminatora g7t, determinującą oporność roślin transgenicznych na herbicydy fosfinotricynowe.

Oznaczenia: M-HBs, M-HBsAg - sekwencja kodująca średni antygen powierzchniowy HBV ayw4 lub adw4, P35S - promotor 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), NOSt - terminator genu syntazy nopalinowej, BAR - sekwencja kodująca genu bar - acetylotransferazy fosfinotricyny, PNOS promotor genu syntazy nopalinowej, g7t - terminator g7, RB, LB - prawa i lewa sekwencja graniczna T-DNA, NPT III - gen fosfotransferazy neomycynowej, GUS - sekwencja kodująca β-glukuronidazy, GUS-INT - sekwencja kodująca β-glukuronidazy z intronem; (ayw/adw) - identyczna konstrukcja plazmidu z sekwencją kodującą antygen HBV szczepu ayw4 i adw4, nazwa wektora binarnego bez indeksu - wektor zawiera sekwencję kodującą antygen HBV szczepu ayw4, nazwa wektora binarnego z indeksem „adw”- wektor zawiera sekwencję kodującą antygen HBV szczepu adw4.

Na figurze 2 przedstawiono wyniki analizy obecności transgenów zawierających sekwencje kodujące antygen M-HBsAg w DNA genomowym potomnych transformantów sałaty (pokolenie T1) oraz tytoniu za pomocą metody PCR z użyciem starterów specyficznych do danej sekwencji kodującej oraz za pomocą metody Southern-blot z użyciem sond specyficznych wobec poszczególnych sekwencji kodujących.

A - elektroforegram produktów reakcji amplifikacji transgenu M-HBs w roślinach sałaty linii

LT9A-16B.

Oznaczenia ścieżek elektroforegramu: M - marker wielkości fragmentów DNA (200 bp DNA Ladder, MBI Fermentas), 1 - 27 - analizowane rośliny, N - kontrola negatywna - DNA rośliny nietransgenicznej, P - kontrola pozytywna - plazmid pKHBMBAR.

B - wynik analizy Southern-blot linii tytoniu Tt8 dla transgenu M-HBs.

Oznaczenia ścieżek blotu: 8-4/1 - 8-9/15 - analizowane rośliny, N - kontrola negatywna - DNA rośliny nietransgenicznej, P - kontrola pozytywna - plazmid pKHBMBAR traw. EcoR I oraz EcoR I i Kpn I.

Na figurze 3 przedstawiono wykres analizy zawartości białka antygenowego M-HBsAg za pomocą immunoenzymatycznego testu ELISA w liściach potomnych transformantów sałaty (pokolenie T1) linii LT9A-16B (A) i tytoniu linii Tt8 (B) zawierających sekwencję kodującą M-HBsAg pod kontrolą konstytutywnego promotora 35S. Zawartość białka wyrażono w μg/g świeżej masy jako średnią arytmetyczną wraz z odchyleniem standardowym z 3 oznaczeń.

PL 217 229 B1

Objaśnienia: T0 - zawartość antygenu dla rośliny pokolenia T0 (rodzicielskiej), T1 - średnia arytmetyczna zawartości antygenu HBV dla roślin pokolenia T1 (potomnych).

Na figurze 4 przedstawiono wynik analizy form białka antygenowego M-HBsAg w liściach potomnych transformantów sałaty (A) i tytoniu (B) za pomocą metody Western-blot z użyciem specyficznych króliczych poliklonalnych przeciwciał.

A - Analiza Western-blot białka M-HBsAg w ekstraktach z liści potomnych roślin sałaty (1E/4 - 18A/8) z użyciem mysiego monoklonalnego przeciwciała Mab C86600 (Biodesign), specyficznego wobec domeny S białek HBsAg.

B - Analiza Western-blot białka M-HBsAg w ekstraktach z liści roślin tytoniu (8-4/1 - 8-9/19) za pomocą króliczego poliklonalnego przeciwciała Pab B65811R (Biodesign), specyficznego wobec domeny S białek HBsAg.

Oznaczenia ścieżek blotów: M - wzorzec masy białek (MBI Fermentas), N - roślina nietransgeniczna - kontrola negatywna, P - antygen M/L-HBs uzyskany od prof. R. Schirmbeck'a z Uniwersytetu w Ulm, Niemcy - kontrola pozytywna

Formy białka M-HBsAg:

p31 - monomer nieglikozylowanego białka M-HBs o masie 31 kDa gp33 - monomer glikozylowanego białka M-HBs o masie 33 kDa

Na figurze 5 przedstawiono proces i wydajność rozmnażania wegetatywnego w kulturze in vitro oraz poziom produkcji białka M-HBsAg w transgenicznej sałacie dla potrzeb przemysłowego namnażania roślin jako wyjściowych materiałów szczepionkowych.

A - rozmnażanie wegetatywne transgenicznej sałaty w kulturze in vitro: strona lewa - kultura na pożywce LRM2, w środku - pojedyncza wieloroślinka, strona prawa - ukorzenione klony wegetatywne.

B - wydajność rozmnażania wegetatywnego w kulturze in vitro linii transgenicznej sałaty wytwarzających M-HBsAg.

Oznaczenia dla B: średnia - średnia arytmetyczna dla danego pasażu kultury, MG - średnia geometryczna dla wszystkich pasaży kultury, kontrola - średnia geometryczna dla sałaty nietransgenicznej.

C - zawartość białka antygenowego M-HBsAg, wyrażona w μg/g świeżej masy jako średnia arytmetyczna wraz z odchyleniem standardowym z 3 oznaczeń, wykonanych za pomocą immunoenzymatycznego testu ELISA w liściach rozmnażanych wegetatywnie potomnych transformantów sałaty linii LT9A-15E.

Na figurze 6 zilustrowano zastosowanie roślin transgenicznych wytwarzających białko antygenowe M-HBsAg do otrzymywania pochodnych profilaktycznych i terapeutycznych szczepionek III generacji przeciwko wzw B.

A - zastosowanie transgenicznej sałaty do otrzymywania sproszkowanego liofilizatu jako półfabrykatu do produkcji doustnej szczepionki w postaci zawiesiny lub syropu oraz w upostaciowanej formie granulatu, tabletek lub kapsułek

B - zastosowanie cząstek subwiralnych (VLPs) wytwarzanych w komórkach mezofilu liści tytoniu, które po ekstrakcji i oczyszczeniu oraz dodaniu substancji pomocniczych mogą być użyte w postaci preparatu podawanego na drodze iniekcji parenteralnej lub w postaci preparatu donosowego aplikowanego w formie aerozolu lub kropel. W komórkach roślinnych cząstki subwiralne gromadzą się w pęcherzykach, zamykanych następnie w cysternach retikulum endoplazmatycznego - ER. Mikrografie wykonano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEM 1200 EXII firmy Jeol.

Poniższe przykłady realizacji wynalazku zostały umieszczone jedynie w celu lepszego wyjaśnienia poszczególnych aspektów wynalazku i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach patentowych.

P r z y k ł a d 1. Konstrukcja wektorów pKHBMBAR i pKHBMadwBAR do transformacji sałaty i tytoniu

Przygotowanie wektorów zawierających sekwencje kodujące białko antygenowe M-HBsAg podtypów HBV ayw4 i adw4 pod kontrolą promotora 35S obejmowało następujące etapy:

Za pomocą metody PCR na matrycy całkowitego DNA Agrobacterium tumefaciens nopalinowego szczepu C58 namnożono terminator syntazy nopalinowej (NOSt) (Croy 1993). Do sekwencji NOSt wprowadzono jednocześnie sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Pst I, Xho I od końca 5' oraz Hind III od końca 3'. Terminator wklonowano następnie do plazmidu pUC18 (MBI Fermentas, Yanisch-Perron 1985, Genebank L09136) otrzymując p18PNOSt, a następnie zsekwencjonowano.

PL 217 229 B1

Adaptowano wcześniej sklonowany promotor 35S CaMV (P35S) z wektora p35SGUS-INT (Vannaceyt 1990) w plazmidzie pBluescript KS (Stratagene, Alting-Mees i Short 1989, Genebank X52327) usuwając miejsce restrykcyjne Pst I przy końcu 5' promotora poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym Pst I, degradację 3' wystających lepkich końców za pomocą T4 DNA polimerazy, a następnie religację - otrzymano ostatecznie plazmid pKSP35SGI.

Przeklonowano promotor 35S z plazmidu pKSP35SGI do p18PNOSt - otrzymując wektor pMG2A.

Za pomocą metody PCR namnożono sekwencję kodującą M-HBs (poz. 3173 - 837) na matrycy wcześniej otrzymanego plazmidu pHBV312, zawierającego kompletny genom polskiego izolatu wirusa HBV ayw4 (Płucienniczak 1994a). Podobnie namnożono sekwencję kodującą M-HBs szczepu adw4 (Płucienniczak 1994b) - M-HBsadw (poz. 3212 - 837). Jednocześnie, za pomocą odpowiednich oligonukleotydów, dokonano substytucji niektórych nukleotydów usuwając w ten sposób zlokalizowane wewnątrz sekwencji motywy rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne EcoR I, BamH I oraz Pst I, zachowując natomiast oryginalny układ kodonów dla aminokwasów. Do sekwencji kodujących antygen poszczególnych podtypów wprowadzono jednocześnie miejsca restrykcyjne BamH I od końca 5' i Pst I od końca 3'. Zmodyfikowane sekwencje wklonowano do pGEM-T (Promega, Marcus 1996) otrzymując pGTHBM i pGTHB-Madw, a następnie zsekwencjonowano.

Do wektora pMG2A przeklonowano sekwencje kodujące antygen poszczególnych podtypów z pGTHBM i pGTHBMadw, otrzymując odpowiednio pMG2AHBM i pMG2AHBMadw.

Gotowe kasety ekspresyjne: P35S-MHBsayw-NOSt i P35S-MHBsadw-NOSt, przeniesiono do wektora pGPTV-BAR (Becker 1992) usuwając jednocześnie fragment GUS-NOSt, otrzymując wektory pKHBMBAR i pKHBMadwBAR do transformowania roślin.

Wektory do transformowania roślin przygotowano z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych, Taq DNA polimerazy i innych odczynników firmy MBI Fermentas. Schemat konstrukcji wektorów binarnych według wynalazku przedstawiono szczegółowo na schemacie [Fig. 1].

Przygotowane wektory binarne wprowadzono do komórek Agrobacterium tumefaciens szczepów LBA4404 i EHA105. Obecność plazmidu w klonach Agrobacterium sprawdzono za pomocą metody PCR z użyciem starterów specyficznych do sekwencji kodujących poszczególne podtypy białka M-HBsAg.

P r z y k ł a d 2. Oznaczanie antygenu M-HBsAg w transgenicznych roślinach sałaty i tytoniu metodą ELISA

Zawartość antygenu M-HBsAg w tkankach roślinnych oznaczano metodą ELISA za pomocą opracowanych testów z wykorzystaniem: I-rzędowego przeciwciała monoklonalnego (Mab) anty-preS2 C8A031M (Biodesign) i I-rzędowego przeciwciała poliklonalnego (Pab) anty-HBs B65811R (Biodesign). Opracowany test umożliwia oznaczenie w badanym materiale całkowitego poziomu białka M-HBsAg zarówno upostaciowanego w cząstki VLP bądź kilku-kilkudziesięciocząsteczkowe agregaty, jak i również pojedyncze podjednostki.

W celu oznaczenia M-HBsAg w roślinach transgenicznych przygotowywano ekstrakty przez roztarcie próbek liści w stopniowo dodawanym buforze w objętości równej pięćdziesięciokrotności masy próbki (1 mg = 50 μΐ buforu). Do ekstrakcji zastosowano bufor o następującym składzie: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 10,3 mM Na2SO3, 2% PVP40000, 0,2% BSA, 1% Tween® 20, pH = 7,4. Roztarte próbki zwirowywano przez 5 min przy 10000 obr./min w temperaturze pokojowej. Z supernatantu pobierano 20 μl ekstraktu do oznaczeń.

Testy ELISA wykonywano na płytkach Nunc-Immuno Plate F96 Maxisorb firmy NUNC™ z użyciem płuczki Model 1575 firmy Bio-Rad. Płytkę opłaszczano przez noc w temp. 4°C przeciwciałem monoklonalnym C8A031M w buforze węglanowym w stężeniu 0,5 μg/ml. Płytkę płukano 3 razy w buforze PBST, a następnie blokowano przez 60 - 90 minut w temp. 25°C za pomocą 5% roztworu odtłuszczonego mleka w buforze PBS. Płytkę płukano jak wyżej i nanoszono próbki ekstraktów roślinnych, które następnie rozcieńczano w buforze PBS w stosunku 1/1 do uzyskania odpowiednio 50-, 100-, 200- i 400-krotnego rozcieńczenia. Płytkę inkubowano przez 45 min w temp. pok. na wytrząsarce przy 400 obr./min. Po usunięciu reagentów i trzykrotnym płukaniu jw. nanoszono Pab B65811R anty-HBs rozcieńczone 5000x w PBS i inkubowano przez 45 min w temp. pok. 400 obr./min. Po usunięciu reagentów i trzykrotnym płukaniu jw., na płytkę nanoszono biotynylowane przeciwciało monoklonalne anty-Fc królicze (Sigma) rozcieńczone 20000x w PBS i inkubowano przez 45 min w temp. pok. 400 obr./min. Po usunięciu reagentów i trzykrotnym płukaniu jw., na płytkę nanoszono ekstrawidynę sprzężoną z alkaliczną fosfatazą (Sigma) rozcieńczoną 4000x w buforze PBS i Inkubowano przez 45 min

PL 217 229 B1 w temp. pok. 400 obr./min. Po usunięciu reagentów i trzykrotnym płukaniu naniesiono substrat dla alkalicznej fosfatazy, tj. fosforan p-nitrofenylu (pNPP, Sigma). Większość reagentów nakładano w objętości 100 μl/dołek, za wyjątkiem etapu blokowania i płukania gdzie nanoszono objętość 400 pi. Po upływie 1 h i zatrzymaniu reakcji odczytywano absorbancję przy długości 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek Model 680 firmy Bio-Rad. Absorbancję przeliczano na zawartość danego białka antygenowego według wzoru krzywej kalibracyjnej wykonywanej dla każdego oznaczenia z użyciem odpowiedniego standardu, tj. preparatu M/L-HBsAg uzyskanego od prof. R. Schirmbeck'a z Uniwersytetu w Ulm w Niemczech.

Zawartość białek antygenowych M-HBsAg oznaczano co najmniej trzykrotnie podczas rozwoju roślin w warunkach ex vitro. Średni poziom danego białka obliczano jako średnią arytmetyczną wraz z odchyleniem standardowym z oznaczeń cząstkowych [Fig. 3, 5].

Odczynniki do analiz, pochodziły, poza wymienionymi przeciwciałami, z firm POCh i Sigma.

P r z y k ł a d 3. Wykrywanie antygenu M-HBsAg w transgenicznej sałacie i tytoniu metodą Western-blot

Białko antygenowe M-HBsAg wykrywano w roślinach transgenicznych metodą Western-blot z użyciem specyficznych przeciwciał. Białko M-HBsAg wykrywano za pomocą przeciwciała monoklonalnego (Mab) C86600M oraz przeciwciała poliklonalnego (Pab) B65811R (Biodesign).

W celu wykonania analizy Western-blot przygotowywano ekstrakty roślinne przez roztarcie próbek liści sałaty w pięciokrotnej objętości (1 mg = 5 pi) bufom PBS z 0,5% dodatkiem detergentu Tween® 20. Do roztartych tkanek dodawano denaturujący bufor do próbek (Laemmli 1970) z 50 mM dodatkiem DTT i inkubowano przez 15 min w temp. 65°C. Próbki ekstraktów wraz z wzorcem białka M/LHBsAg (otrzymanego od prof. R. Schirmbeck'a, Uniwersytet w Ulm, Niemcy) oraz markerem wielkości białek (MBI Fermentas) nanoszono na 12,5% denaturujący żel poliakrylamidowy i prowadzono eiektroforezę w buforze Laemmli. Białka przenoszono z żelu na membranę nitrocelulozową metodą „mokrego” elektrotransferu w aparacie firmy Bio-Rad. Po trzykrotnym przemyciu w buforze TBST (bufor TBS z 0,05% dodatkiem Tween® 20), membranę z przeniesionymi białkami blokowano za pomocą 3% roztworu BSA w buforze

TBS. Po trzykrotnym przemyciu w TBST, membranę inkubowano w roztworze przeciwciał w TBS: 1 pg/ml Mab iub 0,5 pg/ml Pab. Po trzykrotnym przemyciu w TBST, membranę inkubowano w roztworze II-rzędowych przeciwciał znakowanych biotyną w buforze TBS: 10000x rozcieńczonych mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-Fc króliczego (Sigma) lub 10000x rozcieńczonych kozich poiikionainych przeciwciał anty-króliczych typu „whole molecule” (Sigma) iub 10000x rozcieńczonych kozich poliklonalnych przeciwciał anty-mysich typu „whole molecule” (Sigma). Po trzykrotnym przemyciu w TBST, membranę inkubowano w roztworze 4000x rozcieńczonej ekstrawidyny znakowanej peroksydazą chrzanową lub alkaliczną fosfatazą (Sigma). Po pięciokrotnym przemyciu w TBST, membranę inkubowano z diaminobenzidyną (DAB, Sigma), tj. substratem dla peroksydazy lub 5-bromo-4-chioro-3-indolilofosforanem/błękitem nitro tetrazolium (BCIP/NBT, Sigma), tj. substratem dia aikaiicznej fosfatazy. Wszystkie inkubacje z przeciwciałami oraz przemycia membrany prowadzono z wytrząsaniem ok. 100 obr./min.

Obserwowane w Western-biot [Fig. 4] prążki odpowiadają różnym formom białka M-HBsAg, tj. giikozyiowanym i niemodyfikowanym monomerom.

Sole do buforów, BSA itp. pochodziły z firm POCh oraz Sigma.

P r z y k ł a d 4. Namnażanie transgenicznej sałaty wytwarzającej białko antygenowe M-HBsAg

W celu uzyskania znaczących ilości wyjściowego szczepionkowego materiału roślinnego wybrane linie sałaty wydajnie wytwarzające antygen powierzchniowy M-HBsAg, rozmnażano wegetatywnie w kuiturze in vitro, a uzyskane kiony uprawiano ex vitro. Po analizie zawartości białka M-HBsAg pozyskiwano materiał do dalszych prac.

Do rozmnażania wegetatywnego (mikrorozmnażania, namnażania) wybrano linie sałaty charakteryzujące się obecnością transgenu w DNA genomowym, potwierdzoną za pomocą metody PCR i Southern-biot [Fig. 2] oraz wydajnie eksprymujące białko antygenowe M-HBsAg [Fig. 3 - 5]. W celu skiełkowania nasiona sałaty masłowej odmiany Syrena z wybranych iinii transgenicznych wytwarzających białko M-HBsAg steryiizowano 12 min w 20% wybieiaczu chiorowym Clorox® z 0,01% dodatkiem detergentu Tween® 20, a następnie płukano 5 - 6 razy w steryinej wodzie dejonizowanej w celu usunięcia resztek czynnika sterylizującego. Nasiona kiełkowano w półcieniu w warunkach 16/8 h fotoperiodu światło/ciemność. Materiał wyjściowy do mikrorozmnażania stanowiły 2-3-dniowe siewki, które wykładano na pożywkę selekcyjną LRM1 o składzie: makro- i mikroelementy według pożywki SH

PL 217 229 B1 (Schenk i Hildebrandt 1972), witaminy według pożywki B5 (Gamborg 1968), sacharoza 3%, kinetyna -1 mgl^- , pH 5,75, agar - 0,8%, z dodatkiem fosfinotricyny (Riedel de Haen), substancji czynnej herbi-1 cydu Basta w stężeniu 2,5 mgl^-1. Siewki i rozwijające się z nich wieloroślinki podczas mikrorozmnażania utrzymywano w temp. ok. 24°C przy fotoperiodzie dzień/noc 16/8 h i oświetleniu ok. 3000 - 4000 lx.

W ciągu ok. 4 - 6 tygodni kultury na pożywce LRMl obserwowano pobudzenie aktywności merystemów bocznych, a następnie rozwój roślinek sałaty - klonów wegetatywnych. Uzyskane wieloroślinki przenoszono wówczas na pożywkę selekcyjną LRM2 o składzie: makro- i mikroelementy według po-1 żywki SH, witaminy B5, sacharoza - 3%, kinetyna - 0,5 mgl^-1, pH 5,75, agar - 0,8%), z fosfinotricyną

- 2,5 mgl^-1. Część rozwijających się roślin odcinano i przenoszono ponownie na pożywkę LRM2 w celu dalszego namnażania, a część przenoszono w celu ukorzenienia na pożywkę selekcyjną 1/2SH zawierającej połowę ilości makroelementów według SH i pełną dawkę mikroelementów według SH, witaminy B5, sacharozę - 3%, pH 5,75, agar - 0,8% z fosfinotricyną jak wyżej. Rośliny transgeniczne ukorzenione na pożywce selekcyjnej 1/2SH przenoszono do warunków ex vitro w szklarni i adaptowano do warunków glebowych, tj. ziemi ogrodniczej w warunkach fitotronu (fotoperiod dzień/noc 16/8 h i temperaturze 22°C, oświetlenie na poziomie roślin ok. 15 - 20 klx). Procedura mikrorozmnażania sałaty, tj. rozmnażania wegetatywnego w kulturze in vitro, umożliwia otrzymanie co najmniej kilkudziesięciu klonów wegetatywnych dla jednej rośliny z danej linii transgenicznej sałaty, co wynika z wysokiej wydajności mnożenia, tj. 8 - 13 klonów z jednego pasażu przy co najmniej 8 pasażach [Fig. 5]. Podczas uprawy w szklarni analizowano zawartość białka M-HBsAg w roślinach za pomocą testu ELISA (por. Przykład 2). Badano zmienność poziomu M-HBsAg w klonach wegetatywnych poszczególnych roślin, pomiędzy klonami kolejnych roślin danej linii oraz istotność różnic poziomu

M-HBsAg pomiędzy roślinami-klonami i kontrolnymi, tj. nie rozmnażanymi wegetatywnie. Powyższe ₂ parametry analizowano statystycznie (test χ , test F) (po przekształceniu logarytmicznym, oddzielnie dla każdej z linii rodzicielskiej) poprzez analizę wariancji według modelu mieszanego uwzględniającego stałe efekty namnażanych roślin potomnych (pokolenia T1) oraz losowe efekty klonów wegetatywnych i dopuszczającego niejednorodność wariancji pomiędzy klonami. Obliczenia wykonywano za pomocą programu GenStat 10® (VSN International Ltd.). Uzyskane klony roślin charakteryzowały się wysokim poziomem białka M-HBsAg, dla co najmniej 80% klonów nie odbiegającym od roślin kontrolnych otrzymanych z nasion i nie przechodzących kultury in vitro i procesu mikrorozmnażania. Ponadto, zawartość białka M-HBsAg w poszczególnych klonach danej rośliny była zbliżona, a obserwowane odchylenia w większości przypadków były nieistotne statystycznie w tym dla 80% lub więcej klonów różnice w zawartości szczepionkowego białka M-HBsAg nie przekraczały 20% [Fig. 5].

Procedura mikrorozmnażania sałaty, tj. rozmnażania wegetatywnego w kulturze in vitro umożliwia namnażanie roślin w skali półprzemysłowej i przemysłowej, zapewniającej otrzymywanie znacznych ilości wyjściowego materiału szczepionkowego o pożądanych właściwościach, tj. wysokiej i wyrównanej zawartości białka antygenowego M-HBsAg. Sole, regulatory wzrostu i rozwoju oraz pozostałe odczynniki do pożywek roślinnych pochodziły z firm POCh i Sigma.

Claims (62)

1. P r z y k ł a d 5. Przygotowanie liofilizatów zawierających antygen szczepionkowy M-HBsAg na bazie liści transgenicznej sałaty

   Rośliny wybranych linii transgenicznej sałaty, charakteryzujących się względnie wysoką zawartością M-HBsAg, tj. pow. 15 μg/g św. masy, były uprawiane w szklarni w warunkach naturalnego fotoperiodu i w temperaturze 20 - 22°C w dzień i 14 - 16°C w nocy. Liście z dobrze rozwiniętych główek zbierano, zamrażano w ciekłym azocie, częściowo rozdrabniając przy tym tkankę, a następnie przechowywano w temperaturze - 80°C. Zamrożony materiał umieszczano w liofilizatorze BETA 1-16 firmy CHRIST® i prowadzono liofilizację przez 24 - 36 h w próżni 0,2 mbar przy temperaturze zamrożenia

   - 80°C i temperaturze półek 55°C, na których umieszczano materiał na metalowych tackach. Zliofilizowany materiał mielono na proszek i przechowywano w szczelnie zamkniętych pojemnikach w obecności desykatora w temperaturze pokojowej jako materiał wyjściowy do przygotowania poszczególnych form szczepionek doustnych [Fig. 6A]. Proces liofilizacji materiału roślinnego kontrolowano przez oznaczanie zawartości antygenu M-HBsAg według procedury opisanej w Przykładzie 2.

   PL 217 229 B1

   L i t e r a t u r a

   1. Alting-Mees MA, Short JM (1989) pBluescript II: gene mapping vectors. Nucleic Acids Res 17: 9494.
2. 2. Becker D, Kemper E, Schell J, Masterson R (1992) New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left T-DNA border. Plant Mol Biol 20: 1195 - 1197.
3. 3. Bocher WO, Dekel B, Schwerin W, Geissler M, Hoffmann S, Rohwer A, Arditti F, Cooper A, Bernhard H, Berrebi A, Rose-John S, Shaul Y, Galle PR, Lohr HF, Reisner Y (2001) Induction of strong hepatitis B virus (HBV) specific T helper cell and cytotoxic T lymphocyte responses by therapeutic vaccination in the trimera mouse model of chronic HBV infection. Eur J Immunol 31: 2071 - 2079.
4. 4. Brandtzaeg P (2007) Induction of secretory immunity and memory at mucosal surfaces. Vaccine 25: 5467 - 5484.
5. 5. Couillin I, Pol S, Mancini M, Driss F, Brechot C, Tiollais P, and Michel ML (1999) Specific vaccine therapy in chronic hepatitis B: induction of T cell proliferative responses specific for envelope antigens. J Infect Dis 180: 15 - 26.
6. 6. Cooreman MP, Leroux-Roels G, Paulij WP (2001) Vaccine and hepatitis B immune globulininduced escape mutations of hepatitis B virus surface antigen. J Biomed Sci 8: 237 - 247.
7. 7. Croy RRD (1993) Plant selectable genes, reporter genes and promoters. W: Plant Molecular Biology Labfax. Wyd. Hames BD, Rockwood D, Croy RRD. Academic Press, Oxford, str. 175 - 178.
8. 8. Deres K, Schroder CH, Paessens A, Goldmann S, Hacker HJ, Weber O, Kramer T, Niewohner U, Pleiss U, Stoltefuss J, Graef E, Koletzki D, Masantschek RN, Reimann A, Jaeger R, Gross R, Beckermann B, Schlemmer KH, Haebich D, Rubsamen-Waigmann H (2003) Inhibition of hepatitis B virus replication by drug-induced depletion of nucleocapsids. Science 299: 893 - 896.
9. 9. Ehsani P, Khabiri A, Domansky NN (1997) Polypeptides of hepatitis B surface antigen produced in transgenic potato. Gene 190: 107 - 111.
10. 10. Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Nutrient requirements for suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res 50: 151 - 158.
11. 11. Genebank, pUC18c cloning vector (beta-galactosidase mRNA on complementary strand),

    Accession No. L09136.
12. 12. Genebank, pBluescript II KS (+) vector DNA, phagemid excised from lambda ZAPII, Accession No. X52327.
13. 13. Heathcote J, McHutchison J, Lee S, Tong M, Benner K, Minuk G, Wright T, Fikes J, Livingston B, Sette A, Chestnut R (1999) A pilot study of the CY-1899 T-cell vaccine in subjects chronically infected with hepatitis B virus. The CY1899 T Cell Vaccine Study Group, Hepatology 30: 531 - 536.
14. 14. Hollinger BF (1996) Hepatitis B Virus. W: Fields Virology, 3rd Edition. Wyd. Fields BN, Knipe DM, Howley PM et al. Lippincott - Raven Publishers, str. 2739 - 2807.
15. 15. Huang X, Lu D, Ji G, Sun Y, Ma L, Chen Z, Zhang L, Huang J, Yu L (2004) Hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced escape mutants of HBV S gene among children from Qidong area, China.

    Virus Res 99: 63 - 68.
16. 16. Huang Z, Elkin G, Maloney BJ, Buehner N, Amtzen CJ, Thanavala Y, Mason HS (2005) Virus-like particles expression and assembly in plants: hepatitis B and Norwalk viruses. Vaccine 23:

    1851 - 1858.
17. 17. Imani J, Berting A, Nitsche S. Schaefer S, Gerlich WH, Neumann K-H (2002) The integration of a major hepatitis B virus gene into cell-cycle synchronized carrot cell suspension cultures and its expression in regenerated carrot plants. Plant Cell Tiss Org 71: 157 - 164.
18. 18. Joung YH, Youm JW, Jeon JH, Lee BC, Ryu CJ, Hong HJ, Kim HC, Joung H, Kim HS (2004) Expression of the hepatitis B surface S and preS2 antigens in tubers of Solanum tuberosum. Plant Cell Rep 22: 925 - 930.
19. 19. Juszczyk J. (2000) Clinical course and consequences of hepatitis B infection. Vaccine 18:

    23 - 25.
20. 20. Kapusta J, Modelska A, Figlerowicz M. Pniewski T, Letellier M. Lisowa O, Yusibov V, Koprowski H, Płucienniczak A, Legocki AB (1999) A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus. FASEB J 13: 1796 - 1799.
21. 21. Kapusta J, Modelska A, Figlerowicz M, Pniewski T, Lisowa O, Koprowski H, Płucienniczak A, Legocki AB (2000) Plant-based edible vaccine against HBV. Immunology Letters 73: 269.

    PL 217 229 B1
22. 22. Kapusta J, Modelska A, Pniewski T, Figlerowicz M, Jankowski K, Lisowa O, Płucienniczak A, Koprowski H, Legocki AB (2001) Oral immunization of human with transgenic lettuce expressing hepatitis B surface antigen. Adv Exp Med Biol 495: 299 - 303.
23. 23. Kocjan G, Samardakiewicz S, Woźny A (1996) Regions of lead uptake in Lemna minor plants and localization of this metal within selected parts of the root. Biologia Plantarum 38: 107 - 117.
24. 24. Kong Q, Richter L, Yang YF, Arntzen CJ, Mason HS, Thanavala Y (2001) Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants. Proc Natl Acad Sci USA 98: 11539 - 11544.
25. 25. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680 - 685.
26. 26. Lam DM, Arntzen CJ (1996) Vaccines produced and administered through edible plants. US Patent 5 484 719.
27. 27. Langridge WH (2000) Edible vaccines. Sci Am 283: 66-71.
28. 28. Lou X-M, Yao Q-H, Zhang Z, Peng R-H. Xiong A-S, Wang H-K (2007) Expression of the human Hepatitis B Virus large surface antigen gene in transgenic tomato plants. Clinical and Vaccine

    Immunology 14: 464 - 469.
29. 29. Lycett GW, Croy RR, Shirsat AH, Boulter D (1984) The complete nucleotide sequence of a legumin gene from pea (Pisum sativum L.) Nuc Acid Res 12: 4493 - 4506.
30. 30. Madaliński K, Sylvan SP, Hellstrom U, Mikołajewicz J, Zembrzuska-Sadkowska E, Piontek E (2002) Antibody responses to preS components after immunization of children with low doses of BioHepB. Vaccine 20: 92 - 7.
31. 31. Marcus L, Hartnett J, Storts DR (1996) The pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems. Promega Notes Magazine 58: 36.
32. 32. Martin-Vivaldi R. Nogueras F, Vignote ML, Salmeron J, Aguilar J, Romero M, Andrade R, De MM, Moreno JM, Perez J, Garcia G, Lopez H, Gomez F, Palacios A, Otero S, Suarez E, Poyatos A, Quintero D (2000). Multicenter retrospective study of response to interferon in chronic hepatitis B. Rev Esp Enferm Dig 92: 561 - 572.
33. 33. Mason HS, Lam DM-K, Arntzen CJ (1992) Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants. Proc Natl Acad Sci USA 89: 11745 - 11749.
34. 34. Mason HS, Thanavala Y, Arntzen CJ, Richter E (2003) Expression of immunogenic hepatitis B surface antigen in transgenic plants. US patent 6 551 820 B1.
35. 35. McCabe MS, Mohapatra UB, Debnath SC, Power JB, Davey MR (1999) Integration, expression and inheritance of two linked T-DNA marker genes in transgenic lettuce. Molecular Breeding 5: 329 - 344.
36. 36. Mowat AM (2003) Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Rev 3: 331 - 341.
37. 37. Mowat AM, Viney JL (1997) The anatomical basis of intestinal immunity. Immunol Rev 156: 145 - 166.
38. 38. Płucienniczak A (1994a) Molecular cloning and sequencing of two complete genomes of Polish isolates of Human Hepatitis B Virus. Genebank, Accesion No. Z35716.
39. 39. Płucienniczak A (1994b) Molecular cloning and sequencing of two complete genomes of Polish isolates of Human Hepatitis B Virus. Genebank, Accesion No. Z35717.
40. 40. Pniewski T, Kapusta J, Płucienniczak A (2006) Agrobacterium-mediated transformation of yellow lupin to generate callus tissue producing HBV surface antigen in a long-term culture. J Appl Genet 47: 309 - 318.
41. 41. Poonam P (2007) The biology of oral tolerance and issues related to oral vaccine design. Current Pharmaceutical Design 13: 2001 - 2007.
42. 42. Richter LJ, Thanavala Y, Arntzen CJ. Mason HS (2000) Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization. Nature Biotechnology 18: 1167 - 1171.
43. 43. Rukavtsova EB, Zolova OE, Buryanova NYa, Borisova VN, Bykov VA, Buryanov YaI (2003) Analysis of Transgenic Tobacco Plants Carrying the Gene for the Surface Antigen of the Hepatitis B Virus. Russian Journal of Genetics 39: 41 - 45.
44. 44. Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can Journal of Botany 50: 199 - 204.

    PL 217 229 B1
45. 45. Singh NP, Mandal SK, Thakur A, Kapoor D, Anuradha S, Prakash A, Kohli R, Agarwal SK (2003). Efficacy of GM-CSF as an adjuvant to hepatitis B vaccination in patients with chronic renal failure-results of a prospective, randomized trial. Ren Fail 25: 255 - 266.
46. 46. Shulga NYa, Rukavtsova EB, Krymsky MA, Borisova VN, Melnikov VA, Bykov VA, Buryanov YaI (2004) Expression and Characterization of Hepatitis B Surface Antigen in Transgenic Potato Plants. Biochemistry (Moscow) 69: 1158 - 1164.
47. 47. Smith ML, Mason HS, Shuler ML (2002) Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg) Expression in Plant Cell Culture: Kinetics of Antigen Accumulation in Batch Culture and Its Intracellular Form. Biotechnology and Bioengineering 80: 812 - 822.
48. 48. Sojikul P, Buehner N, Mason HS (2003) A plant signal peptide-hepatitis B surface antigen fusion protein with enhanced stability and immunogenicity expressed in plant cells. Proc Natl Acad Sci USA 100: 2209 - 2214.
49. 49. Sunil Kumar GB. Ganapathi TR, Revathi CJ, Prasad KSN, Bapat VA (2003a) Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic banana plants and NT-1 cell line of tobacco. BARC News Lett 237: 85 - 96.
50. 50. Sunil Kumar GB, Ganapathi TR, Revathi CJ, Prasad KSN, Bapat VA (2003b) Expression of hepatitis B surface antigen in tobacco cell suspension cultures. Prot Exp Purif 32: 10 - 17.
51. 51. Sunil Kumar GB, Ganapathi TR, Revathi CJ, Srinivas L, Bapat VA (2005) Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic banana plants. Planta 222: 484 - 493.
52. 52. Sunil Kumar GB, Srinivas L, Ganapathi TR, Bapat VA (2006) Hepatitis B surface expression in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants using four different expression cassettes. Plant Cell Tiss Org 84: 315 - 323.
53. 53. Sunil Kumar GB, Ganapathi TR, Srinivas L, Revathi CJ, Bapat VA (2006) Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Sci 170: 918 - 925.
54. 54. Thanavala Y, Yang Y-F, Lyons P, Mason HS, Amtzen CJ (1995) Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen. Proc Natl Acad Sci USA 92: 3358 - 3361.
55. 55. Vannaceyt G, Schmidt R, O'Connor-Sanchez A, Willmitzer L, Rocha-Sosa M (1990) Construction of an intron-containing marker gene: Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium - mediated plant transformation. Mol Gen Genet 220: 245 - 250.
56. 56. Walewska-Zielecka B, Świderska H, Płucienniczak G, Jończyk M, Nitkiewiez J, Płucienniczak A, Nowosławski A (1996) Etiology of chronic hepatitis as evaluated by liver biopsy and serum samples submitted to the Department of Immunopathology of the National Institute of Hygiene in 1993-1995. Przegląd Epidemiologiczny 50: 353 - 3163.
57. 57. Yamada T, Iwabuki H, Kanno Τ, Tanaka H, Tomoji K, Fukuda H, Kondo A, Seno Μ, Tanizawa K, Kuroda S (2001) Physiochemical and immunological characterization of hepatitis B virus envelope particles exclusively consisting of the entire L (pre-S1 + pre-S2 + S) protein. Vaccine 19: 3154 - 3163.
58. 58. Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33: 103 - 119.
59. 59. Yap I, Chan SH (1996) A new pre-S containing recombinant hepatitis B vaccine and its effect on non-responders: a preliminary observation. Ann Acad Med Singapore. 25: 120 - 2.
60. 60. Young MD, Rosenthal MH, Dickson B, Du W, Maddrey WC (2001) A multi-center controlled study of rapid hepatitis B vaccination using a novel triple antigen recombinant vaccine. Vaccine 19: 3437 - 3443.
61. 61. Yuen MF, Lai CL (2001) Treatment of chronic hepatitis B. The Lancet Infectious Diseases 1: 232 - 241.
62. 62. Zuckerman JN, Sabin C, Craig FM, Williams A, Zuckerman AJ (1997) Immune response to a new hepatitis B vaccine in healthcare workers who had not responded to standard vaccine: randomised double blind dose-response study. BMJ 314: 329 - 33.