PL217290B1 - Sposób przygotowania protez biologicznych, zwłaszcza zastawek serca - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania protez biologicznych, zwłaszcza zastawek serca, który umożliwia ich zasiedlenie komórkami w układzie in vitro lub in vivo gwarantujące ich regenerację i wzrost po wszczepieniu do ciała biorcy.

W medycynie powszechnie wykorzystuje się pobrany od dawców materiał biologiczny pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego do wszczepienia biorcom. Pobrany od dawcy materiał biologiczny, przykładowo zastawkę serca lub łatę na serce, należy odpowiednio przygotować przed jego zasiedleniem komórkami biorcy. Proces przygotowania znany jest między innymi z publikacji S. Neuenschwander, S.P. Hoerstrup Heart valve tissue engineering Transplant Immunology, 12 359-365 z 2004 roku czy też z publikacji A. Lichtenberg, A. Haverich Cell seeded engineered cardiac valves based on allograft and xenograft scaffolds, Progress in Pediatric Cardiology, 21 211-217 z 2006 roku. W szczególności proces ten obejmuje przeprowadzenie sterylizacji tkanki, następnie usunięcie komórek dawcy przy jednoczesnym zachowaniu struktury macierzy zewnątrzkomórkowej oraz w ostatniej kolejności modyfikację chemiczną tkanki z użyciem nisko toksycznych związków sieciujących.

Wynikiem tych procesów przygotowawczych powinien być materiał biologiczny możliwy do trwałego zasiedlenia komórkami biorcy, gwarantującego jego regenerację i/lub wzrost.

Sterylizacja materiału wyjściowego, przykładowo zastawek serca pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego odbywa się zazwyczaj w kąpieli antybiotykowej zawierającej przykładowo penicylinę, streptomycynę i środek przeciwgrzybiczny, na przykład amfoterycynę.

Znanych jest wiele sposobów usuwania komórek dawcy, który to proces nazywany jest odkomórczaniem albo acelularyzacją materiału biologicznego. Najprostsze sposoby fizyczne, które polegają na cyklicznym zamrażaniu i rozmrażaniu tkanki, sonifikacji czy mechanicznym uszkadzaniu komórek, okazały się mało efektywne oraz prowadziły do uszkodzenia włókien kolagenowych. Obecnie stosowane są sposoby detergentowe, enzymatyczne i mieszane. Powszechnie wykorzystywanymi detergentami są na przykład glikol 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy, dostępny pod handlową nazwą Triton X-100 czy też sól sodowa siarczanu dodecylu znana jako SDS ( R.W. Grauss, M.C. DeRuiter, Decellularization of rat aortic allografts reduces leafleat destruction and extracellular matrix remodeling, The Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery, 126 2003-2010, z 2003 roku). Ponadto w celu acelularyzacji używa się deoksycholanu sodu (E. Rieder, G. Weigel, Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to recellularization with human vascular cells, The Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery, 127 399-405 z 2004 roku albo lauroilosarkozynianu sodu ( A. Ketchedjian, R. Hopkins, Recellularization of decellularized allograft scaffolds in ovine great vessels reconstruction, Ann Thorac Surg, 79 888-896 z 2005 roku).

Ponadto znany jest też sposób oparty na niszczeniu komórek wskutek szoku hipotonicznego w połączeniu z niejonowym detergentem, przykładowo Tritonem X-100 ( A. Lichtenberg, A. Haverich, In vitro re-endothelialization of detergent decellularized heart valves under simulated physiological dynamic conditions, Biomaterials 27 4221-4229 z 2006 roku).

W sposobach enzymatycznych stosuje się głównie trypsynę w połączeniu z kwasem wersetowymi czyli EDTA.

Sposoby mieszane proponują stosowanie trypsyny razem z SD S lub Tritonem X-100. W celu pełnej degradacji materiału genetycznego w każdym z powyżej wymienionych sposobów acelularyzacji można dodatkowo zastosować nukleazy, przykładowo dezoksyrybonukleazę i rybonukleazę (R.W. Grauss, M.C. DeRuiter, Decellularization of rat aortic allografts reduces leafleat destruction and extracellular matrix remodeling, The Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery, 126 2003-2010, z 2003 roku).

W przypadku wyżej wymienionych sposobów acelularyzacji autorzy obserwują wysoką skuteczność w usuwaniu komórek zarówno z płatków zastawki jak i naczyń bez znaczącego wpływu na składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, jednak doświadczenia własne wskazują, że najlepsze efekty acelularyzacji całych zastawek daje układ mieszany z zastosowaniem trypsyny z EDTA oraz z SDS.

Kolejnym etapem w przygotowaniu materiału biologicznego jest sieciowanie, którego celem jest obniżenie antygenowości materiału, poprawa jego wytrzymałości, opóźnienie procesu kalcyfikacji i poprawa odporności na degradację enzymatyczną. Ponieważ ostatecznie materiał biologiczny, przykładowo pozbawiona komórek czyli acelularna matryca zastawki serca będzie zasiedlona komórkami, związki sieciujące powinny wykazywać jak najniższą cytotoksyczność oraz nie powinny w znaczący sposób zmieniać natywnej struktury przestrzennej kolagenu, składnika matrycy zastawkowej. Próba wykoPL 217 290 B1 rzystania tradycyjnych związków sieciujących, głównie aldehydu glutarowego nie przyniosła dobrych efektów ze względu na wysoką cytotoksyczność tego związku i problemy z jego wypłukiwaniem z tkanki. Wśród nisko toksycznych związków pochodzenia naturalnego jako czynnik sieciujący stosowano: genipinę ( H-C Liang, H-W Sung, Effect of crosslinking degree of an acellular biological lissue on its tissue regeneration pattern, Biomaterials 25 3541-3552 z 2004 roku), proantocyjanidyny (PA) (W. Zhai, J. Chang Crosslinking of decellularized porcine heart valve matrix by procyjanidins, Biomaterials, 27 3684-3690 z 2006 roku), galusan epigalokatechiny (EGCG) (H. C. Goo, Y-S. Hwang Development of collagenase-resistant collagen and its interaction with adult human dermal fibroblasts, Biomaterials, 24 5099-5113 z 2003 roku) oraz kwercetynę (Z. Wanyin, L. Xiqin, Quercetin-crosslinked porcine heart valve matrix: Mechanical properties, stability, antycalcification and cytocompatibility, Acta Biomaterialia, 6 389-395 z 2010 roku). W przypadku każdego z wymienionych związków sieciujących uzyskiwano poprawę właściwości mechanicznych usieciowanych tkanek, opóźnienie kalcyfikacji, wzrost odporności na degradację enzymatyczną, a usieciowany materiał ulegał zasiedleniu komórkami. Jednakże nie są one pozbawione wad - kwas taninowy rozkłada się w organizmie do kwasu galusowego, który jest hepatotoksyczny, PA oraz EGCG mają bardzo wysoką cenę, a zastosowanie kwercetyny ze względu na jej niską rozpuszczalność w wodzie wymaga użycia kosolwenta - DMSO, czyli dimetylosulfotlenku, który usztywnia tkankę i może niekorzystnie wpływać na komórki.

Wynalazek dotyczy sposobu przygotowania protez biologicznych, zwłaszcza zastawek serca, w którym pobrany materiał biologiczny pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego poddaje się sterylizacji, a następnie acelularyzacji i sieciowaniu. Istota wynalazku polega na tym, że sieciowanie przeprowadza się w roztworze soli sodowej kwasu moryno-5'-sulfonowego.

W korzystnym wykonaniu wykorzystuje się 0,1%-5% roztwór soli sodowej kwasu moryno-5'-sulfonowego.

Ponadto zasadnym jest, gdy sieciowanie przeprowadza się w roztworze sieciującym o pH wybranym z przedziału od 5 do 8, korzystnie z wykorzystaniem buforu fosforanowego.

Celowym jest także, gdy sieciowanie przeprowadza się w temperaturze wybranej z przedziału od 5°C do 50°C.

Również korzystnym jest, gdy sieciowanie przeprowadza się przez okres wybrany z przedziału 24 h do 168 h.

Wynalazek dotyczy sposobu przygotowania protez biologicznych, zwłaszcza zastawek serca, który umożliwia ich zasiedlenie komórkami w układzie in vitro lub in vivo z wykorzystaniem sieciowania chemicznego. Sieciowanie chemiczne jest oparte o zastosowanie niskotoksycznych związków sieciujących, a jego celem jest zmniejszenie antygenowości materiału biologicznego, zwłaszcza pochodzenia zwierzęcego, poprawienie jego właściwości mechanicznych, opóźnienie procesu kalcyfikacji oraz zapewnienie odporności na enzymatyczną degradację. Ze względu na kolejny etap tworzenia zastawki autologicznej, polegający na obsadzeniu matrycy zastawkowej komórkami, czynniki sieciujące powinny wykazywać jak najniższą cytotoksyczność oraz nie powinny w znaczący sposób zmieniać natywnej struktury przestrzennej kolagenu, składnika matrycy zastawkowej. Wszystkie wyżej wymienione cechy posiada sól sodowa kwasu moryno-5'-sulfonowego, rozpuszczalna w wodzie pochodna moryny.

Wynalazek został bliżej opisany w poniższym przykładzie wykonania.

Pełna procedura przygotowania usieciowanej acelularnej zastawki serca pobranej od dawcy polega na tym, że wypreparowane zastawki serca są poddane sterylizacji w kąpieli antybiotykowej, następnie odkomórczeniu czyli acelularyzacji za pomocą roztworu trypsyna/EDTA i roztworu SDS. Resztki detergentu wymywane są kilkakrotnie za pomocą płynu Ringera. Użyty płyn Ringera zawiera 8,6 g/l NaCl, 0,3 g/l KCl oraz 0,48 g/l CaCl2 x 6 H2O. Kolejny etap - sieciowanie acelularnych matryc zastawkowych przebiega w 0,1-5% roztworze soli sodowej kwasu moryno-5'-sulfonowego, przy pH 5-8, w temperaturze 5-50°C przez 24-168 h. Sieciowanie korzystnie odbywa się z wykorzystaniem buforu fosforanowego, zawierającego przykładowo 0,1 M NaH2PO4 x 2 H2O w 95 ml wody destylowanej oraz 0,1 M NaH2PO4 x 12 H2O w 405 ml wody destylowanej. Słabo związane i nie związane resztki czynnika sieciującego są wymywane w medium do hodowli komórek z dodatkiem antybiotyków. W efekcie uzyskuje się matrycę zastawkową o zdecydowanie lepszych właściwościach mechanicznych w porównaniu z zastawką acelularną. W szczególności pierwszy etap przygotowania zastawki serca, czyli jej sterylizacja polega na tym, że wypreparowane zastawki, przykładowo zastawki świńskie płucne i aortalne, wypłukane w płynie Ringera umieszcza się, każdą osobno, w płynie sterylizującym, który zawiera: 500 ml płynu Ringera, 0,5 ml ciprinolu, 0,5 ml diflucanu oraz 5ml streptomycyny/penicyliny. Proces sterylizacji prowadzi się w temperaturze 4°C przez 24 h.

PL 217 290 B1

Kolejno przystępuje się do odkomórczenia zastawek serca czyli acelularyzacji. W tym celu wysterylizowane zastawki umieszcza się, każdą osobno, w roztworze Trypsyna/EDTA i inkubuje w temperaturze 37°C przez 48 h w warunkach ciągłego wytrząsania. Po 24 h wymienia się trypsynę na świeżą, a następnie inkubuje kolejne 24h w tych samych warunkach. Każda z zastawek powinna być zanurzona w 250 ml roztworu Trypsyna/EDTA. Po upływie 48 h zastawki przepłukuje się kilkakrotnie w płynie Ringera. Następnie zastawki umieszcza się w 0,5% roztworze SDS i inkubuje przez 30 minut w temperaturze 22°C. Na jedną zastawkę powinno przypadać 250 ml roztworu SDS.

Po inkubacji w detergencie zastawki intensywnie wypłukuje się w płynie Ringera, a następnie umieszcza każdą z zastawek w 250 ml płynu Ringera i płucze się przez około 90 minut. Co 30 min płyn wymienia się na świeży, a płukanie przeprowadza się na wytrząsarce.

Kolejnym etapem przygotowanie zastawek jest sieciowanie. W tym celu przygotowuje się 1% roztwór czynnika sieciującego czyli soli sodowej kwasu moryno-5'-sulfonowego w buforze fosforanowym pH 7,4. Roztwór sieciujący przesącza się przez filtr antybakteryjny. Acelularne świńskie zastawki, każdą osobno, umieszcza się w 250 ml 1% roztworu sieciującego z dodatkiem środka przeciwgrzybicznego, przykładowo diflucan 0.5 ml na 250 ml roztworu sieciującego. Sieciowanie prowadzi się w temperaturze pokojowej 22°C z wytrząsaniem, przez 72 h.

Usieciowany materiał przechowuje się w roztworze sieciującym lub kąpieli antybiotykowej w lodówce.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób przygotowania protez biologicznych, zwłaszcza zastawek serca, w którym pobrany materiał biologiczny pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego poddaje się sterylizacji, a następnie acelularyzacji i sieciowaniu, znamienny tym, że sieciowanie przeprowadza się w roztworze soli sodowej kwasu moryno-5 '-sulfonowego.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wykorzystuje się 0,1 - 5% roztwór soli sodowej kwasu moryno-5'-sulfonowego.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że sieciowanie przeprowadza się w roztworze sieciującym o pH wybranym z przedziału od 5 do 8.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że sieciowanie przeprowadza się w buforze fosforanowym.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że sieciowanie przeprowadza się w temperaturze wybranej z przedziału 5 - 50°C.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że sieciowanie przeprowadza się przez okres wybrany z przedziału 24 h do 168 h.