PL217740B1

PL217740B1 - Preparaty do traktowania gleby i nasion roślin zawierające żywe mikroorganizmy lub mikroorganizmy zdolne do rozmnażania się w glebach, sposób wytwarzania produktów do traktowania gleby i nasion roślin, mikroorganizmy, sposób wytwarzania mikroorganizmów oraz sposób traktowania gleby i nasion roślin preparatami

Info

Publication number: PL217740B1
Application number: PL369237A
Authority: PL
Inventors: György Botond Kiss; István Ott
Original assignee: Agro Bio Hungary Kft
Priority date: 2001-08-13
Filing date: 2002-08-12
Publication date: 2014-08-29
Also published as: ZA200401142B; US20050060930A1; EP2233458A3; CO5560603A2; EA009126B1; AU2009200523A1; US7842494B2; MXPA04001383A; YU14004A; JP2005500413A; HUP0103294A2; ES2451341T3; EP2233458A2; AU2009200523B2; WO2003016241A1; KR100940615B1; HU230555B1; PL369237A1; HRP20040126B1; UA86178C2

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy preparatów do traktowania gleby i nasion roślin zawierających żywe mikroorganizmy lub mikroorganizmy zdolne do rozmnażania się w glebach, sposobu wytwarzania produktów do traktowania gleby i nasion roślin, mikroorganizmów, sposobu wytwarzania mikroorganizmów oraz sposobu traktowania gleby i nasion roślin preparatami.

W szczególności wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania powyższych produktów z dowolnego wymienionego poniżej mikroorganizmu lub z ich mieszaniny.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania kultur mikroorganizmów przeznaczonych do stosowania. Przedmiotem wynalazku są również same mikroorganizmy.

W szczególności wynalazek dotyczy sposobu traktowania gleby i roślin produktem zawierającym co najmniej jeden z następujących mikroorganizmów: Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293), Azotobacter vinelandii spp. M657 (NCAIM /P/ B 0012 91), Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291), Microccus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294), Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 0013 02) i Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301), a ponadto rozmnażających się i istniejących w otoczeniu danej rośliny produktów zawierających powyższe mikroorganizmy oraz sposobu ich otrzymywania.

Środowisko naturalne gleby stanowi samoregulujący się ekosystem obejmujący rośliny i mikroorganizmy w warunkach naturalnych, przy czym istnienie jednych stanowi o istnieniu drugich. Odchylenia od ustalonego w toku ewolucji stanu równowagi, spowodowane działaniami człowieka (takimi jak głęboka orka, stosowanie nawozów naturalnych i sztucznych, środków ochrony roślin itp.) mogą doprowadzić do takich zmian jego struktury i sposobu funkcjonowania, których skutki trudno przewidzieć. Rozwój populacji mikroorganizmów niezbędnych w optymalnej uprawie danej rośliny, na różnych typach gleb i w różnych warunkach klimatycznych wymaga wieloletniej selekcji. Jednak najważniejsze mikroorganizmy występujące w korzystnej populacji można wprowadzić do gleby w ciągu 1-2 dni, stwarzając w ten sposób warunki wymagane do optymalnej uprawy. W wyniku takiego postępowania osiąga się wyższy plon bez naruszania w niekorzystny sposób naturalnego ekosystemu. Użyteczne mikroorganizmy dominujące w otoczeniu danej rośliny ważnej z ekonomicznego punktu widzenia można określić drogą badań laboratoryjnych, po czym selektywnie rozmnożyć, wyprodukować metodami przemysłowymi i ponownie wprowadzić do gleby w odpowiedniej proporcji.

W ekosystemie obejmującym glebę i mikroorganizmy można zaobserwować istotne, regularnie powtarzające się zjawiska. W bezpośrednim otoczeniu systemu korzeniowego rosnących roślin (ryzosferze) oraz kiełkujących nasion (spermatosferze) oznacza się inną liczbę mikroorganizmów i inne ich gatunki niż w miejscach bardziej od nich oddalonych. Na rozprzestrzenianie się bakterii w strefie korzeniowej wpływa wiele czynników. Zależą one od regionu, jakości gleby, składu populacji mikroorganizmów oraz od warunków klimatycznych.

Węgiel występujący w glebie jest przede wszystkim i w zdecydowanej większości wynikiem procesu fotosyntezy z wykorzystaniem energii słonecznej.

Cykl azotu jest bardziej skomplikowany niż cykl węgla. Na przemianę azotu wpływają procesy biologiczne i chemiczne. W przyrodzie przeważa azot gazowy w tzw. stanie obojętnym, a tzw. azot związany (w postaci azotanu, azotynu, amoniaku) występuje jedynie w ograniczonej ilości.

Za mineralizację gazowego azotu odpowiedzialny jest przede wszystkim proces biologicznego wiązania azotu. Ponieważ ilość cząsteczkowego azotu występującego nad powierzchnią jednego hektara wynosi 6-7 x 10⁸ ton, jest to niewyczerpane źródło związanego azotu. Zainteresowanie ekspertów kieruje się ku żywym organizmom zdolnym do wiązania azotu, które są w stanie zredukować cząsteczkowy azot do amoniaku, gdyż poznanie mikroorganizmów tego typu i odpowiednie wykorzystanie ich właściwości może m. in. doprowadzić do zmniejszenia występowania głodu na świecie, w sposób przyjazny dla środowiska.

Niektóre bakterie zdolne do wiązania azotu wykazują tę cechę w stanie wolnym; ale liczne bakterie są zdolne do wiązania azotu jedynie we współpracy z innymi, wyższymi roślinami.

Przeciwnie do cyklu azotu, cykl przemian fosforu jest w warunkach naturalnych praktycznie procesem zamkniętym. Ilość dostarczanego i oddawanego fosforu jest taka sama, przepływ jest bardzo nieznaczny, a powietrze nie ulega zanieczyszczeniu fosforem. W końcowym etapie pierwiastek ten gromadzi się w wodach, morzach, a jedynie niewielka ilość wraca do gleby (np. w postaci guano).

PL 217 740 B1

W żywych komórkach w glebie fosfor podlega akumulacji w postaci związków organicznych, których ₂ mineralizacja przebiega z dużą szybkością (3-8 g/m²/rok). Powstające związki fosforu różnią się rozpuszczalnością, a więc i dostępnością dla roślin; z 400-1200 mg fosforu znajdowanego w 1 kg przeciętnej gleby dostępne jest jedynie 5%. Cykl przemiany niektórych związków fosforu trwa 500-2000 lat.

Wprowadzenie do gleby niektórych grup mikroorganizmów zdolnych do przetwarzania fosforu pozwala na przeprowadzenie do roztworu złożonych związków fosforowych, niedostępnych dla roślin. Jeżeli mikroorganizmy wprowadzone do gleby rozpoczną działalność, to przy zadowalającym składzie mineralnym gleby nie ma potrzeby stosowania nawozów fosforowych lub też można znacznie obniżyć ich ilość.

Do wzrostu rośliny wymagają znacznych ilości potasu, zwłaszcza w okresie dojrzewania zbiorów. Hodowcy roślin dostarczają potas do gleby w postaci zawierającego go nawozu sztucznego. Z obecnych w nim mineralnych związków potasu mikroorganizmy uwalniają jony potasu, co czyni go przyswajalnym dla roślin.

Z punktu widzenia roślin rozmnażające się w glebie mikroorganizmy prowadzą biosyntezę fizjologicznie aktywnych związków, z których najważniejsze są: fitohormony, auksyny (kwas 3-indolilooctowy), etylen, gibereliny, kinetyny itp. Niektóre grupy Pseudomonas w obecności niewielkich ilości żelaza wytwarzają tzw. syderofory, które wykazują zdolność akumulowania żelaza. Efekt ten prowadzi do spowolnienia wzrostu fitopatologicznych bakterii i grzybów, które nie wykazują zdolności do wykorzystywania żelaza występującego w syderoforach, a niekorzystnie odczuwają jego brak; z drugiej strony obecność syderoforów w glebie, w której brakuje żelaza, znacząco stymuluje wzrost roślin, gdyż dzięki wiązaniu żelaza mogą je bezpośrednio dostarczać roślinom.

Dla rozwiązania powyższego zagadnienia opracowano kilka wariantów technicznych; kilka mikroorganizmów opisano szczegółowo w literaturze specjalistycznej.

Wynalazcy węgierscy ujawnili preparat zawierający sproszkowane kultury mikroorganizmów wykazujących zdolność do nitryfikacji (węgierski opis patentowy HU 143391), kultury Azobacter chroococcum i Rhizobium meliloti (węgierski opis patentowy HU 188434), kultury glonów (węgierski opis patentowy HU 195068) i ponownie kultury Azotobacter chroococcum, jak również sposób otrzymywania kultur mikroorganizmów Bacillus megaterium (węgierski opis patentowy HU 207751). Azotobacter chroococcum zdeponowano pod numerem 00238, Bacillus megaterium pod numerem seryjnym NCAIM /P/ B 1140. W szczególności, w węgierskich opisach patentowych HU 188434 i HU 207751 opisano fermentację prowadzącą do mieszaniny powyższych mikroorganizmów. Według węgierskiego opisu patentowego HU 213163 uzupełnia się kulturę mikroorganizmów opisanych w HU 207751 dodatkiem karboksymetylocelulozy. W HU 1671/96 opisano kultury zawierające mikroorganizmy Azospirillum lipoferum ssp., Azobacter vinelandi sp., Pseudomonas fluorescens ssp. i Bacillus megaterium ssp.

Zastosowanie oraz działanie wywierane przez powyżej opisane mikroorganizmy oraz sposoby ich wykorzystania są ograniczone z uwagi na fakt ich krótkiego czasu przetrwania w różnych warunkach uprawy, w glebach o różnym składzie i w różnych warunkach klimatycznych, a środowisko i ryzosfera różnych roślin nie zawsze stwarzają ku temu optymalne warunki.

Podstawowym celem wynalazku jest wytworzenie kultur mikroorganizmów glebowych, które z punktu widzenia uprawy roślin oraz wymogów ekonomicznych wykazują korzystne działanie, a jednocześnie są zdolne do przetrwania, rozmnażania się i korzystnego oddziaływania w glebach różnego typu i na różne rodzaje roślin, w zróżnicowanych warunkach klimatycznych i przy różnych warunkach uprawy.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że zdolność do rozmnażania się i przetrwania wykazywana przez wyhodowane w warunkach laboratoryjnych mikroorganizmy, które korzystnie oddziałują na rozwój roślin, są zdolne do wiązania azotu, udostępniania roślinom jonów fosforanowych, pobudzenia wzrostu roślin oraz poprawy struktury gleby, zmienia się zależnie od rodzaju gleby, warunków cieplnych oraz roślin występujących w bezpośrednim otoczeniu roślin uprawnych. Różne grupy mikroorganizmów wykazują aktywność w czarnoziemach, w glebach o niskiej zawartości próchnicy, w lessach lub glebach gliniastych. Podczas badań nieoczekiwanie stwierdzono, że różne grupy mikroorganizmów są zdolne do rozmnażania się w ryzosferze różnych roślin lub w jej bezpośrednim sąsiedztwie, wywierając przy tym swój wpływ przez dłuższy okres czasu.

Z tego powodu przeprowadzono doświadczenia w celu wyizolowania mikroorganizmów korzystnie oddziaływujących w środowisku danej rośliny ważnej z ekonomicznego punktu widzenia, w sposób istotny dla jej uprawy. Dodatkowo przeprowadzono doświadczenia w celu wyizolowania mikroorganizmów zdolnych do udostępnienia roślinom jonów potasu oraz otrzymania takich mikroor4

PL 217 740 B1 ganizmów - wyizolowanych z gleby i zmienionych laboratoryjnie w procesach mutacji - które mogą rozwijać się po wprowadzeniu do gleby, w niskiej temperaturze, a przy tym zdolnych do korzystnego oddziaływania na rośliny uprawne, co jest zaskakujące nawet dla specjalistów.

Ponadto podczas badań nieoczekiwanie stwierdzono, że niektóre mikroorganizmy wytwarzające polisacharydy korzystnie zmieniają strukturę gleby z rolniczego punktu widzenia, zwiększając w ten sposób jej odporność na suszę.

W podsumowaniu prac doświadczalnych ich celem było wyizolowanie mikroorganizmów zdolnych do dostarczania roślinom azotu, fosforu, potasu, do biosyntezy roślinnych hormonów wzrostu i polisacharydów poprawiających strukturę gleby, zdolnych do rozwoju w okresie zasiewów oraz w krajach o chłodniejszym klimacie, wywierających wpływ na gleby rozmaitego typu oraz na różne rośliny. Ponadto celem było otrzymanie preparatów zawierających mikroorganizmy, które w danym środowisku roślinnym, w ryzosferze lub pomiędzy komórkami rośliny stymulują rozwój roślin lub rodziny roślin dzięki swej zdolności do wiązania i udostępniania roślinom ważnych pierwiastków, jak również dzięki wytwarzaniu związków stymulujących wzrost roślin oraz polisacharydów. Pozwala to na oszczędności w stosowaniu nawozów, w sposób sprzyjający ochronie środowiska.

Wynalazek dotyczy dziedziny hodowli wyżej wymienionych mikroorganizmów, zawierających je preparatów, a także zastosowania preparatu lub preparatów zawierających mikroorganizm(y) oraz samych mikroorganizmów.

Wynalazek dotyczy preparatów do traktowania gleby i nasion roślin zawierające żywe mikroorganizmy lub mikroorganizmy zdolne do rozmnażania się w glebach różnego typu w otoczeniu roślin,

11 7 10 przy czym te preparaty zawierają, w ilości 5 x 10⁶ - 10¹¹, korzystnie 10⁷ - 10¹⁰ komórek/g, kulturę Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291) oraz jeden lub większą liczbę mikroorganizmów spośród

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 0012 95),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294),

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302), i

Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301), jako mikroorganizmów zdolnych do rozmnażania się również w niskiej temperaturze, korzystnie poniżej 20°C, jak również w glebach o niskiej wartości pH, korzystnie poniżej 5, zdeponowanych w Krajowej Kolekcji Mikroorganizmów do Użytku w Rolnictwie i Przemyśle, Budapeszt, Węgry, oraz mokre lub suche nośniki dopuszczalne w uprawach rolniczych i nietoksyczne dla mikroorganizmów.

Korzystne są preparaty, które jako nośnik zawierają wodę i/lub mączkę sojową i/lub skrobię i/lub celulozę i/lub glukozę.

Korzystne są preparaty, które jako mikroorganizm zawierają

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295), oraz

Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301).

Korzystne są preparaty, które jako mikroorganizm zawierają

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294),

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302), oraz

Streptomycees albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301).

Korzystne są preparaty, które jako mikroorganizm zawierają

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

PL 217 740 B1

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294), i

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302).

Korzystne są preparaty, które jako mikroorganizm zawierają

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294), i

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302).

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania produktów do traktowania gleby i nasion roślin i/lub preparatów zawierających żywe mikroorganizmy lub mikroorganizmy zdolne do rozmnażania się w otoczeniu roślin w glebach różnego typu, również w niskiej temperaturze, korzystnie poniżej 20°C i przy niskiej wartości pH, korzystnie poniżej 5, w którym hoduje się osobno lub w mieszaninie, na pożywce zawierającej źródło węgla i azotu oraz sole nieorganiczne, mikroorganizm Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291), oraz ewentualnie, osobno lub w mieszaninie, jeden lub większą liczbę spośród mikroorganizmów

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 0012 95),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294),

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302), i

Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301), zdeponowanych w Krajowej Kolekcji Mikroorganizmów do Użytku w Rolnictwie i Przemyśle, do osiągnięcia liczby komórek 5 x 10⁷ - 5 x 10⁹ na ml, ewentualnie otrzymaną kulturę lub kultury miesza się w określonym stosunku lub nanosi się ją (lub je) na nośnik lub miesza z nim i ewentualnie poddaje liofilizacji w znany sposób.

Korzystny jest sposób, w którym jako źródło węgla stosuje się glukozę i/lub sacharozę i/lub melasę, jako źródło azotu stosuje się chlorek amonu i/lub azotan amonu i/lub siarczan amonu i/lub wyciąg namokowy z kukurydzy i/lub hydrolizat kazeiny, a jako sól nieorganiczną stosuje się węglan wapnia i sole uwalniające w wyniku dysocjacji jony sodu, potasu, magnezu, wapnia, żelaza, jony azotanowe, chlorkowe, siarczanowe, węglanowe, fosforanowe, oraz stosuje się dodatek pierwiastków śladowych.

Wynalazek dotyczy również mikroorganizmów, korzystnie zdolnych do rozmnażania się również w temperaturze poniżej 20°C i przy niskiej wartości pH, zdeponowanych w Krajowej Kolekcji Mikroorganizmów do Użytku w Rolnictwie i Przemyśle, Budapeszt, Węgry, pod następującymi numerami:

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294),

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302) i

Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301).

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania mikroorganizmów zdefiniowanych powyżej, w którym z otoczenia roślin pobiera się próbkę gleby z wierzchniej (górnej) warstwy o grubości 40 cm, identyfikuje się wybrane mikroorganizmy, poddaje działaniu środków mutagennych i izoluje się odmiany rozmnażające się również w niskiej temperaturze.

Wynalazek dotyczy także sposobu traktowania gleby preparatami zdefiniowanymi powyżej, 10 14 w którym nanosi się preparaty zawierające komórki mikroorganizmów w liczbie 10¹⁰ - 10¹⁴, korzystnie 11 12

10¹¹ - 10¹² na hektar, na powierzchnię lub do wnętrza gleby, w porze roku, w której nie występuje spadek temperatury poniżej 0°C.

Wynalazek dotyczy także sposobu traktowania nasion roślin preparatami zdefiniowanymi powyżej, w którym traktuje się nasiona produktem w postaci ciekłej, zawierającym co najmniej jeden z mikroorganizmów lub ich mieszaninę.

Wynalazek opiera się na ustaleniu, że do uzyskania docelowych preparatów najdogodniej stosuje się następujące mikroorganizmy: Azospirilium brasilense ssp. SW51 (NCAIM / P/ B 001293),

PL 217 740 B1

Azobacter vinelandi ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292), Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294), Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302) i Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301), zdolne do rozmnażania się w niskiej temperaturze w okresie zasiewów, które dostarczają roślinom azot, udostępniają fosfor i potas, prowadzą biosyntezę hormonów wzrostu i polisacharydów. Z tego powodu wyizolowano je i opracowano sposób ich hodowli.

W związku z tym w latach 1998-1999 wyizolowano mikroorganizmy z europejskich gleb oraz z otoczenia systemów korzeniowych wybranych roślin, zbadano in vitro ich zdolność do wiązania azotu, zdolność do zwiększania rozpuszczalności fosforanów i potasu, wytwarzania polisacharydów i biosyntezy hormonów roślinnych; identyfikowano pod względem systematyki wybrane mikroorganizmy, drogą mutacji wytworzono takie odmiany, które są zdolne do intensywnego rozmnażania się również w temperaturze poniżej 20°C, opracowano sposób ich hodowli, z kultur tych mikroorganizmów wykonano preparaty i wykazano ich wpływ na rozwój roślin oraz wydajność uprawy, zarówno w warunkach upraw cieplarnianych, jak i polowych.

Wyizolowano gatunki i podgatunki Azospirillum, Azobacter, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces i Micrococcus.

Najmniej znane gatunki Azospirillum to bakterie Gram-ujemne o zróżnicowanej kolorystyce, żyjące w glebie, które w warunkach mikroaerofilowych (w obecności 1-2% tlenu), w ścisłym związku z systemem korzeniowym roślin wykazują zdolność do redukowania azotu z powietrza do amoniaku, po czym przenoszą go do roślin. Niektóre grupy wytwarzają także hormony roślinne drogą biosyntezy.

Grupy Azospirillum wyizolowano ze środowiska systemów korzeniowych kukurydzy, pszenicy, jęczmienia i ryżu uprawianych na różnych ziemiach uprawnych Europy, na glebach różnego typu, a także traw łąkowych. Zawiesinę bakterii pochodzących z próbki gleby rozpraszano na pożywce Nfb(II) i pożywce (MM), o składzie podanym w dalszej części opisu, po czym hodowano w warunkach mikroaerofilowych. Po 72 godzinach zidentyfikowano kultury Azospirillum. Kultury te, w odróżnieniu od kultur innych małych bakterii i grzybów, osiągają rozmiar około 3 mm.

Kultury Azospirillum sp. rosnące wykładniczo na ciekłych pożywkach agarowych MM i Nb(II) o składzie podanym w dalszej części opisu, wykazują charakterystykę morfologiczną typową dla komórek Azospirillum. Komórki mają kształt przecinków lub litery S, o wymiarach 1-2 x 2-4 μm. Do wzrostu potrzebują biotyny. Na podstawie obserwacji pod mikroskopem można stwierdzić, że poruszają się szybko. Ruchliwość ich przypisuje się obecności biegunowych witek. W swoich komórkach gromadzą ziarna poli^hydroksymaślanu) i karotenu. Czerwonawe zabarwienie można wyjaśnić starzeniem się kultur. Do swojego wzrostu mogą wykorzystać kwasy organiczne, także jak kwas jabłkowy, mlekowy, pirogronowy i butanodiowy. Wiązanie azotu z powietrza przebiega w warunkach mikroaerofilowych. W warunkach ekstremalnych, jak np. podczas suszy, przy niskich lub wysokich wartościach pH, przy braku źródła azotu lub węgla, komórki przekształcają się w cysty pozbawione witek, ale zawierające ziarna poli^hydroksymaślanu) i są otoczone powłoczką polisacharydową. Źródło węgla wykorzystywane przez mikroorganizmy zmienia się zależnie od gatunku: A. Amazonense glukoza + sacharoza + inozytol, A. Brasilense glukoza + sacharoza i inozytol, A. Irakense wykorzystuje glukozę (+) i sacharozę (+), ale nie wykorzystuje inozytolu (-), A. Lipoferum tylko glukozę. W środowisku pozbawionym azotu źródła przyswajanego węgla są bardziej zróżnicowane, co pozwala odróżnić powyższe cztery gatunki. Źródła węgla przyswajanego przez wyizolowane przez nas mikroorganizmy różnią się częściowo od nowego typu ATCC 29.731 A. Lipoferum, A. Amazonense, A. Brasiliense i A. Irakense (Holt, J. G. i współpracownicy, Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, wyd. 9, 1994). W przeciwieństwie do typowych grup, wzrastają one prawidłowo w obecności 3,5% chlorku sodu; na miękkiej pożywce agarowej (opisanej w dalszej części) ich obrazy mikroskopowe uzyskane na różnych etapach hodowli są różne, a wytwarzanie pigmentu jest bardziej intensywne w przypadku stosowania agaru z dodatkiem ekstraktu z ziemniaków.

Niektóre wyizolowane szczepy Azospirillum są zbliżone do gatunków Azospirillum lipoferum, Azospirillum amazonense, Azospirillum brasilense i Azospirillum irakense; wykonywano badania z ich użyciem wybierając jedną z grup Azospirillum brasilense.

Z powyżej opisanych próbek gleby wyizolowano mikroorganizmy Azotobacter drogą selektywnej hodowli na miękkiej pożywce agarowej Nfb(II), następnie na pożywce MM i pożywce Fjodorova przez rozproszenie i wybór jednego z podgatunków ze względu na jego zdolność do wiązania azotu; podgatunek ten zachowano do dalszych badań. Komórki w grupie są plejomorficzne, w kształcie ziarenek. W obecności tlenu przemieszczają się szybko. Są Gram-ujemne. Na pozbawionej azotu pożywce

PL 217 740 B1 wytwarzają fluorescencyjny, żółtozielony pigment, we właściwy sposób wykorzystują ramnozę i mezoinozytol.

Jak wiadomo, mikroorganizmy Rhizobium tworzą brodawki na korzeniach roślin motylkowych, a następnie, po dotarciu pomiędzy komórki roślinne przenoszą związany azot bezpośrednio do rośliny. Różne gatunki Rhizobium wiążą się z różnymi gatunkami roślin motylkowych; z soją wiążą się mikroorganizmy z grupy Bradyrhizobium. Ponieważ jest to jedyny gatunek spośród Rhizobiumr który umiera po zebraniu zbiorów, nie pozostając w glebie w znaczącej ilości, zaleca się poddawanie gleby działaniu tej grupy mikroorganizmów. Grupę Bradyrhizobium wyizolowano 13 lipca z plantacji soi w Subasa w pobliżu Szeged-Kiskundorozsma. Spośród roślin rosnących na glebie lessowej wybrano dobrze rozwiniętą roślinę i z jej korzeni pobrano dobrze wykształcone brodawki. Psychrofilna odmiana mikroorganizmu wyizolowanego sposobem opisanym w przykładzie została zdeponowana.

W zebranych próbkach gleby szukano mikroorganizmów zdolnych do udostępnienia fosforanów i badano właściwości wybranych bakterii z punktu widzenia systematyki. Okazało się, że część mikroorganizmów jest przedstawicielem gatunku Pseudomonas, a część - Bacillus.

Bakterie Pseudomonas są Gram-ujemnymi, aerobowymi komórkami w postaci cienkiej pałeczki; na większości pożywek wytwarzają fluorescencyjny pigment i są saprofitami. Nie zaobserwowano wytwarzania karotenu i bakterie nie rosną w temperaturze przekraczającej 40°C. Na galaretowatych pożywkach agarowych można zaobserwować upłynnianie. Grupa ta przyswaja glukozę, ale nie przyswaja skrobi. Mimo że odmiany grup bakterii Pseudomonas wytwarzających fluorescencyjny pigment stanowią pokrewne jednostki systematyczne, obserwuje się pewne różnice systematyczne pomiędzy wybranym przez nas mikroorganizmem a typowymi grupami: wybrane przez nas mikroorganizmy - co charakterystyczne dla Pseudomonas - we właściwy sposób przyswajają glukozę, galaktozę, kwas octowy, maltozę, glicerynę i kwas pirogronowy. Nie przyswajają fruktozy, D- arabinozy, maltozy, laktozy, skrobi i inuliny. W przeciwieństwie jednak do typowych grup mogą wzrastać na ksylozie, sacharozie i do pewnego stopnia na sorbitolu. Mogą wykorzystywać glicynę jako jedyne źródło węgla.

Biorąc powyższe pod uwagę jeden z wyizolowanych mikroorganizmów zidentyfikowano jako gatunek Pseudomonas fluorescens i stwierdzono jego bliskie pokrewieństwo z odmianami należącymi do III grupy Biovar. Grupę tę nazwano Pseudomonas fluorescens ssp.

Biorąc pod uwagę charakterystykę systematyczną okazało się, że spośród komórek Bacillus zdolnych do rozpuszczania nierozpuszczalnych fosforanów część należy do gatunku Bacillus polymyxa, a część - do Bacillus megaterium. Niektóre grupy wybrano do dalszych badań.

Aby wyizolować mikroorganizmy zdolne do udostępnienia potasu w postaci jonu potasowego, wyizolowano mikroorganizmy występujące na powierzchni minerałów zawierających potas, jak skaleń i muskowit, po czym poddano je badaniom sposobem opisanym w przykładach, na stałej pożywce pozbawionej potasu, w celu udowodnienia zjawiska udostępniania potasu. Zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w przykładach drogą obróbki połączonej z mutacją uzyskano i zdeponowano mikroorganizm zidentyfikowany jako Streptomyces psychrophilic.

Wyizolowaliśmy również mikroorganizm, którym po systematycznych badaniach morfologicznych i badaniu rybozomalnego DNA okazał się Micrococcus roseus; podczas badań na roślinach wykazał się nadzwyczaj korzystnym oddziaływaniem. Po transformacji laboratoryjnej jedną z grup mikroorganizmu zdeponowano.

Wynalazek opiera się również na obserwacji, że po wprowadzeniu do gleby mikroorganizmy korzystnie oddziaływujące na rośliny mogą rozmnażać się bardzo szybko zarówno we wstępnej fazie zasiewów, jak i w warunkach klimatycznych występujących jesienią i wczesną wiosną, także w krajach o chłodniejszym klimacie. W związku z tym mikroorganizmy poddano obróbce, wyizolowano i hodowano zgodnie z opisem podanym w przykładzie 4. Znanymi sposobami wyizolowano mutanty i odmiany rozmnażające się w niskiej temperaturze, po czym zdeponowano je w Krajowym Zbiorze Mikroorganizmów do Użytku w Rolnictwie i Przemyśle.

Wynalazek dotyczy takich preparatów i sposobów postępowania, których stosowanie zapewnia zwiększenie plonu upraw roślinnych. Otrzymywanie ich polega na hodowli mikroorganizmów o zbadanych właściwościach, wyizolowanych z różnego typu ziem ornych, z otoczenia różnych roślin, występujących w otoczeniu danej rodziny roślin przez dłuższy okres czasu, zdolnych do rozmnażania się w niskiej temperaturze, w glebach różnego typu; zawierający kulturę preparat nanosi się następnie na wybrane rośliny, nasiona lub ziemię orną. Preparaty według wynalazku stosuje się do traktowania gleby, roślin lub nasion, przy czym zawiera on co najmniej jeden z następujących mikroorganizmów: Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293), Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292), Pseudomonas

PL 217 740 B1 fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B

001294), Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 0012..) i Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 0012..).

W wyniku takiego postępowania rozwój roślin ulega przyspieszeniu, zwiększa się ich odporność na patogeny i zmiany ilości wody w strukturze gleby, wzrasta jakość roślin oraz osiąga się wysoki plon upraw, nawet przy zmniejszonym nawożeniu lub przy jego całkowitym braku.

Jedną z najważniejszych zalet sposobu według wynalazku stanowi to, że zastosowanie go podczas uprawy roślin pozwala w praktyce na rezygnację ze stosowania nawozów azotowych, fosforowych i potasowych, bądź na znaczne ograniczenie ich stosowania. Zanieczyszczenie środowiska spowodowane używaniem nawozów sztucznych jest powszechnie znane. Związki wytwarzane drogą biosyntezy w komórkach mikroorganizmów stymulują rozwój roślin, przyspieszają wzrost poddawanych ich działaniu roślin oraz ich systemu korzeniowego, a jednocześnie poprawiają zaopatrzenie roślin w wodę; wprowadzone mikroorganizmy hamują rozwój mikroorganizmów fitopatologicznych, polisacharydy wytwarzane drogą biosyntezy w komórkach niektórych mikroorganizmów według wynalazku w szczególnie korzystny sposób poprawiają strukturę gleby, jej bilans wodny i długość życia. W przeciwieństwie do znanych preparatów stosowanych w tym samym celu i w ten sam sposób oraz sposobów ich otrzymywania, preparaty według wynalazku, sposób ich otrzymywania i stosowania wykorzystuje mikroorganizmy o zróżnicowanym działaniu, wyizolowane z gleb różnego typu, wywierające określony wpływ na dane rośliny uprawne o znaczeniu gospodarczym, przy czym mikroorganizmy te zdolne są do rozmnażania się w niskich temperaturach występujących jesienią i wczesną wiosną, również w rejonach o chłodniejszym klimacie.

Mikroorganizmy według wynalazku można hodować na pożywce zawierającej jako źródło węgla np. glukozę, skrobię, sacharozę lub melasę; jako źródło azotu wyciąg namokowy z kukurydzy, kazeinę, ekstrakt drożdżowy lub sole amonowe; ponadto inne sole nieorganiczne i sole uwalniające podczas dysocjacji jony pierwiastków śladowych; ale, co jest oczywiste dla specjalistów, można stosować dowolne źródło przyswajalnego węgla i azotu, sole nieorganiczne, umożliwiające rozmnażanie się bakterii według wynalazku.

Kulturę mikroorganizmów według wynalazku można wprowadzać bezpośrednio do zaprawianej gleby lub roślin wraz z pożywką stosowaną do jej hodowli, bądź w postaci preparatów zachowujących potencjał biotyczny mikroorganizmu, w tym preparatów zawierających nośniki zapewniające przyleganie bakterii do nasion dzięki siłom adhezji. Liczba wprowadzanych do gleby bakterii może się wahać ή ή ή Ε ή Q ή Ο od 5 x 10¹¹ do 5 x l0¹⁵ komórek na hektar, korzystnie liczba komórek wynosi 10¹² - 10¹³.

Zgodnie z Porozumieniem Budapesztańskim zidentyfikowane mikroorganizmy wyizolowane z różnych środowisk roślinnych, zdolne do rozmnażania się również w niskiej temperaturze, zostały zdeponowane w Krajowej Kolekcji Mikroorganizmów do Użytku w Rolnictwie i Przemyśle, w którym zarejestrowano je pod następującymi numerami depozytowymi:

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294),

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302) i Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301).

Zakres ochrony rozciąga się również na zdeponowane grupy oraz ich sztuczne i naturalne mutanty, odmiany i linie grup powyższych mikroorganizmów otrzymanych dowolnym znanym sposobem.

Wynalazek zilustrowano poniżej w przykładach.

O ile nie podano inaczej, w przykładach procenty oznaczają procenty wagowe.

Najlepszy sposób realizacji wynalazku

PL 217 740 B1

P r z y k ł a d 1

Izolowanie mikroorganizmów zdolnych do wiązania azotu z powietrza, z gleb różnego typu i otoczenia różnych roślin oraz potwierdzenie ich zdolności do wiązania azotu

Gatunek Azospirillum to bakterie Gram-ujemne o zmiennym zabarwieniu, zdolne do redukcji zawartego w powietrzu azotu do amoniaku w warunkach mikroaerofilowych (w obecności 1-2% tlenu) oraz udostępnienia go roślinom.

Gatunek Azospirillum wyizolowano z próbek różnych gleb (próchnicznych, lessowych, o dużej zawartości sodu, gleby brunatnej, czarnoziemu itp.), z otoczenia systemów korzeniowych różnych roślin (zbóż, słonecznika, kukurydzy, traw itp.). Chemiczne atraktanty, takie jak kwasy organiczne i cukry przyciągają grupy Azospirillum dzięki chemotaksji. Wspomagane przez witki, bakterie przemieszczają się w stronę korzeni, po dotarciu do których zakładają kolonie.

Przygotowane próbki gleb rozcieńczono 10-, 100-, 1000- i 10000-krotnie jałową wodą destylowaną; zawiesiny 100-100 μΐ posiano na płytkach Petriego z pożywkami MM i Nfb(II) z miękkim agarem. Skład pożywki MM jest następujący:

K2HPO4	1,65 g/l
KH2PO4	0,87 g/l
MgSO₄ x 7H₂O	0,29 g/l
NaCl	0,18 g/l
CaCl2 x 2H2O	0,07 g/l
FeCl3 x 6H2O	0,01 g/l
NaMoO4 x 2H2O	0,005 g/l
MnSO₄ x H₂O	0,00014 g/l
ZnSO4 x 7H2O	0,007 g/l
CuSO₄ x 5H₂O	0,000125 g/l
CoSO₄ x 7H₂O	0,00014 g/l
H3BO3	0,00003 g/l
Glukoza	5,0 g/l
Sacharoza	5,0 g/l
Bacto agar	20,0 g/l
Glukozę wyjałowiono oddzielnie od innych składników pożywki MM, w autoklawie (121°C, 30

minut), po czym wymieszano z nimi po ochłodzeniu do temperatury 60°C. Odczyn jałowej pożywki doprowadzono do pH 7,4 z użyciem jałowego 1N roztworu NaOH.

Skład pożywki Nfb(II) jest następujący:

Kwas L-jabłkowy 5,0 g

Wodorofosforan dipotasowy 0,5 g

Siarczan magnezu x 7H2O 0,2 g

Chlorek sodu 0,1 g

Chlorek wapnia 0,02 g

Roztwór pierwiastków śladowych* 2,0 ml

Błękit bromotymolowy (wodny roztwór 0,5% substancji rozpuszczonej w 0,2N KOH) 2,0 ml

1,564% roztwór Fe-EDTA 4,0 ml

Roztwór witamin** 1,0 ml

Agar 1,75 g

Odczyn pożywki doprowadzono do pH 6,8 z użyciem 1N wodnego roztworu KOH.

*Skład roztworu pierwiastków śladowych:

Siarczan żelaza(II) x 7H2O 200 mg

Chlorek żelaza(III) x 6H2O 10 mg

Siarczan manganu x H2O 1 mg

Siarczan miedziowy x 5H2O 2 mg

NaMoO4 x 2H2O 1 mg

Chlorek kobaltu x 6H2O 2 mg

Siarczan cynku x 7H2O 2 mg

Tetraboran sodu x 10H2O 1 mg

Ρ2Ο5 x 24WO3 x H2O 0,5 mg

Azotan bizmutu x 5H2O 0,1 mg

PL 217 740 B1

Chlorek cyny	0,01 mg
Chlorek selenu	0,01 mg
Jodek potasu	1 mg
Kwas cytrynowy	100 mg
Woda destylowana	1000 ml
**Skład roztworu witamin:
Witamina C	50 mg
Witamina B1	5 mg
Witamina E	2 mg
Witamina A	2 mg
Biotyna	4 mg
Woda destylowana	100 ml

Bakterie wprowadzone na płytki z pożywką MM umieszczono w termostatach pozbawionych tlenu, w których powietrze zastąpiono azotem; następnie wprowadzono tlen w ilości potrzebnej do uzyskania stężenia 1,6% przez przepłukiwanie odpowiednią ilością powietrza. Płytki inkubowano w temperaturze 32°C, po czym po upływie 72 godzin zidentyfikowano organizmy Azospirillum. Zależnie od stopnia rozcieńczenia próbki na płytkach pokrytych zawiesiną o 10-krotnym rozcieńczeniu rozwinęła się ciągła murawa bakteryjna, podczas gdy przy rozcieńczeniu 10000-krotnym rozwijało się zazwyczaj 30-50 kultur. W przeciwieństwie do kultur innych małych bakterii oraz grzybów, kultury Azospirillum osiągnęły rozmiar około 3 mm. Spośród otrzymanych kultur kilka wykazywało morfologiczne podobieństwo do kultur Azospirillum. Niektóre z nich poddano dalszym badaniom.

Kultury wyhodowane na pożywce Nfb(II) z miękkim agarem umieszczono w termostacie aerobowym, na powyżej opisanej pożywce i w powyżej opisanych warunkach hodowli, w których kultury Azospirillum przede wszystkim rozmnażają się, w charakterystyczny morfologicznie, łatwo rozpoznawalny sposób.

Różne grupy bakterii Azospirillum uzyskane na pożywkach MM i Nfb(II) hodowano dalej znanym w mikrobiologii sposobem, przez dwukrotny posiew pierwotnej kultury bakterii na pojedynczej kulturze, na kompletnej pożywce Tag. Grupy bakterii Azospirillum oczyszczono przez dwukrotny posiew na pojedynczej kulturze w środowisku ciekłej pożywki Tag i przechowywano jako kulturę grupową. Za kulturę grupową uznano zawiesinę bakterii przechowywaną w temperaturze -80°C; tak określona kultura grupowa stanowiła punkt wyjściowy we wszystkich doświadczeniach.

Skład pożywki Tag:

Bacto trypton (Difco) 1,0%

Ekstrakt drożdżowy (Difco) 0,1%

NaCl 0,5%

Agar 2,5%

Po sterylizacji dodano wodne roztwory następujących związków, o podanym stężeniu końcowym:

0,1% 0,1M CaCl2 x 6H2O

0,1% 0,1M MgCl2 x 6H2O

0,2% glukozy (wyjałowionej oddzielnie).

Po sterylizacji odczyn pożywki doprowadzono do pH 7,0-7,2.

Proste doświadczenie pozwala na stwierdzenie obecności kolonii na korzeniach roślin. Na korzeniach kukurydzy i pszenicy potraktowanych bakteriami Azospirillum, wysianych w jałowym perlicie, 10 w doniczkach o średnicy 15 cm, do których wprowadzono takie same ilości komórek (1 x 10¹⁰ komórek na doniczkę) zliczono pod mikroskopem liczbę komórek Azospirillum; wykryto ich zasadniczo więcej niż w próbkach kontrolnych. Tworzenie kolonii w układzie korzeniowym opiera się na specyficznym mechanizmie rozpoznawania. Podczas kolonizacji komórki Azospirillum wnikają do wnętrza korzeni i tam - dzięki aktywnemu wiązaniu azotu - pokrywają część zapotrzebowania rośliny na azot (asocjacyjne wiązanie azotu). Świadczy o tym zwiększony przyrost masy zielonej kukurydzy i pszenicy zaszczepionych podczas badań laboratoryjnych grupami Azospirillum; wyniki te będą szczegółowo omówione w dalszej części opisu. Bakterie Azospirillum wytwarzają ponadto hormony roślinne i substancje stymulujące wzrost; wytwarzanie tych substancji i ich korzystne oddziaływanie na roślinę główną przejawia się zwiększoną zdolnością do kiełkowania i bardziej intensywnym wzrostem roślin, co zaobserwowano w warunkach laboratoryjnych.

Charakterystyki morfologiczne wyizolowanych gatunków Azospirillum zamieszczono w głównej części opisu.

PL 217 740 B1

Drogą selektywnej hodowli prowadzonej najpierw na miękkim agarze Nfb(II), a następnie na pożywce MM pozbawionej azotu wyizolowano mikroorganizmy Azospirillum z próbek gleby pobranej z ziem ornych. Na podstawie charakterystyki systematycznej i zakresu wykorzystywanych źródeł węgla grupy te zidentyfikowano jako Azospirillum brasilense; dzięki zdolności do wiązania azotu cząsteczkowego z powietrza - w dużej mierze jako odmiana SW5-01-07, następnie, jak opisano poniżej, odmiany rozmnażające się również w niskiej temperaturze i zdolne do biologicznej syntezy polisacharydów wyizolowano i jedną z nich zdeponowano.

W celu wyizolowania grup Azotobacter, poza zastosowaniem pożywek Nfb(II) i MM o składzie opisanym powyżej, próbki gleby poddano dodatkowo hodowli na pożywce Fjodorova, na której bakterie Azotobacter wykazują charakterystyczne cechy morfologiczne. Skład pożywki Fjodorova jest następujący:

Diwodorofosforan potasu	0,03%
Wodorofosforan wapnia	0,02%
Siarczan potasu	0,02%
Siarczan magnezu x 7H2O	0,03%
Węglan wapnia	0,5%
Chlorek sodu	0,05%
Chlorek żelaza III	0,02%
Molibdenian sodu	0,0002%
Mannit	2,0%
Bacto agar	2,0%
Przed sterylizacją odczyn roztworu doprowadzono do pH 7,0 z użyciem roztworu 1N wodoro-

tlenku sodu.

Drogą selektywnej hodowli najpierw na miękkim agarze Nfb(II), a następnie na pozbawionej azotu pożywce MM i pożywce Fjodorova wyizolowano mikroorganizmy Azotobacter z próbek gleby pobranych z ziem ornych. Na podstawie charakterystyki systematycznej i zakresu wykorzystywanych źródeł węgla grupy te zidentyfikowano jako Azotobacter vinelandii; dzięki wiązaniu azotu cząsteczkowego z powietrza w dużej mierze jako odmiana M65-01-34, następnie, jak opisano poniżej, wyizolowano odmiany rozmnażające się również w niskiej temperaturze i jedną z nich zdeponowano.

Zdolność grup Azospirillum i Azobacter do wiązania azotu oznaczono metodą redukcji acetylenu. W sposobie tym (Dilworth M. J., J. Biochem. Biophys. Acta, 27, 285, 1996) acetylen wprowadza się strzykawką do kultury bakterii umieszczonej w zamkniętym naczyniu. Następnie po okresie inkubacji wynoszącym 12 godzin 0,25 ml mieszaniny gazów wprowadza się do kolumny Propak N chromatografu gazowego Perkin-Elmer. Stężenie acetylenu i etylenu w mieszaninie gazów oznacza się przy użyciu detektora jonizacyjnego z płomieniem wodorowym. Wysokość pików odpowiadających acetylenowi i etylenowi pozwala na ostateczne ustalenie złożonej aktywności enzymatycznej nitrogenazy. Grupy Azospirillum i Azotobacter według wynalazku redukowały w ciągu 1 godziny 15 - 85 nmoli acetylenu do etylenu.

Grupę Bradyrhizobium wyizolowano 13 lipca 2000 r. z roślin soi na polu w Subasa, w pobliżu Szeged-Kiskundorozsma. Spośród roślin rosnących w glebie lessowej wybrano dobrze rozwinięty okaz i z jego korzeni pobrano dobrze wykształcone brodawki. Brodawki przemyto następnie sterylną wodą destylowaną, zgnieciono i uzyskane cząstki zdyspergowano w soli fizjologicznej. Z zawiesiny w sterylnych warunkach przygotowano serię rozcieńczeń, które rozprowadzono na kompletnej pożywce. Zdolność do wiązania azotu przez kultury otrzymane w wyniku 48-godzinnej inkubacji w tak zwanym eksperymencie z rośliną symbiotyczną, ustalono w następujący sposób: powierzchnię dostępnych w handlu nasion lucerny siewnej (Medicago sativa) poddano sterylizacji przez obróbkę cieplną prowadzoną przez 2 godziny w temperaturze 72°C i ostrożne przemycie roztworem 20% Hypo, następnie doprowadzono do wykiełkowania na pożywce z wody destylowanej zawierającej 1% agaru. Sadzonki po wykiełkowaniu umieszczono na skośnym 1,5% agarze Gibsona (patrz dalej) i hodowano w cieplarni przez tydzień. Tygodniowe rośliny zaszczepiono komórkami kultur bakterii i hodowano w cieplarni przez osiem następnych tygodni. Spośród grup przypisanych do trzech roślin wyraźnie wykazujących optymalny stopień rozwoju (sucha masa części naziemnych wynosząca 22-26 mg, wobec 3-5 mg wykazywanych przez rośliny kontrolne) wybrano trzy i z uwagi na ich właściwości istotne z morfologicznego i systematycznego punktu widzenia nazwano je Bradyrhizobium japonicum var. PH-2-1-3.

PL 217 740 B1

P r z y k ł a d 2

Izolowanie mikroorganizmów zdolnych do solubilizacji fosforanów i potasu

W różnych częściach świata pobrano próbki gleby, wodne zawiesiny próbek rozprowadzono na pożywce Tag (patrz wyżej), a następnie zbadano wyizolowane kultury Pseudomonas i Bacillus oraz określono ich morfologię komórkową.

Różne grupy Pseudomonas i Bacillus oczyszczono sposobem znanym w mikrobiologii przez kilkakrotne naniesienie pierwotnej kultury bakterii na pojedynczą kulturę, na kompletnej pożywce TAg. Grupy bakterii hodowano na ciekłej i stałej pożywce TAg i przechowywano po oczyszczeniu.

Zdolność mikroorganizmów do udostępniania fosforanów badano na pożywce Nutrient Agar (Oxoid) zawierającej 1% hydroksyapatytu, uzupełnionej zmodyfikowaną pożywką Pikovskaya (HP) oraz 10% roztworem fosforanu triwapniowego i glukozą (0,2%).

Skład pożywek stosowanych w badaniach był następujący:

Zmodyfikowana pożywka Pikovskaya:

Hydroksyapatyt 1,0% (NH4)2SO4 0,05%

NaCl 0,02%

KCl 0,02%

MgSO4 x 7H2O 0,01%

Ekstrakt drożdżowy 0,05%

Agar 1,5%

Glukoza (wyjałowiona oddzielnie) 1,0%

Po sterylizacji do pożywki dodano roztwory następujących związków:

1% 20 mg/100 ml FeSO4 x 7H2O

1% 40 mg/100 ml MnSO4 x H2O

Przed sterylizacją odczyn pożywki doprowadzono do pH 7,2.

Naoxg: Nutrient agar (Oxoid) przygotowany zgodnie z instrukcją producenta + 0,2% glukozy.

Podczas badania zdolności do solubilizacji fosforanu, wykazywanej przez grupy wybrane w trakcie wstępnych doświadczeń na pożywce Pikovskaya (HP) okazało się, że kultury wyhodowane w ciągu 3-4 dni w temperaturze 30°C wykazywały pierścienie rozpuszczonego fosforanu o średnicy 29 i 38 mm. Zawiesinę komórek tych samych grup otrzymaną ze skośnego agaru TAg wraz z dodatkiem 1 ml wody destylowanej wprowadzono w dołki wykonane na płytkach z Naoxg, przy czym do każdego dołka dodano ponadto 10% roztwór fosforanu triwapniowego w ilości 0,1 ml/dołek. Po inkubacji kultur przez 2-3 dni w temperaturze 30°C zaobserwowano wyraźnie widoczne pierścienie roztworu. Przy szczegółowych badaniach prowadzonych na grupach Pseudomonas ich rozmiar wynosił 24 mm, podczas gdy dla grup Bacillus - 26 mm, przeciętnie 34 mm.

Każda z grup Pseudomonas i niektóre z grup Bacillus wykazały bardzo wysoką zdolność do solubilizacji fosforanu. Grupy przeprowadzają obydwie odmiany nieorganicznych fosforanów do roztworu, gdzie łatwo jest je wykryć, należy więc stwierdzić, że ich zdolność do solubilizacji fosforanu jest doskonała.

Na podstawie charakterystyki systematycznej i źródeł przyswajania węgla dla 14 grup mikroorganizmów Pseudomonas i 25 grup mikroorganizmów Bacillus wybranych na podstawie doświadczeń stwierdzono, że należały one do gatunku Pseudomonas fluorescens i Bacillus polymyxa, jak również Bacillus megaterium, oznaczonych kolejno jako SW1-1-14, SW17-1-15 i M32-1-10. Następnie, jak opisano poniżej, wyizolowano i zdeponowano odmiany rozmnażające się w niskiej temperaturze oraz wykazujące zdolność do biosyntezy polisacharydu w znacznych ilościach.

Wyizolowania mikroorganizmów zdolnych do udostępniania jonów potasu dokonano zgodnie z powyższym opisem, z tą tylko różnicą, że w pożywce Pikovskaya (HP) o składzie podanym powyżej pominięto chlorek potasu, a zamiast hydroksyapatytu dodano 1% drobno sproszkowanego skalenia i łupek mikowy.

W otoczeniu kultur mikroorganizmów zdolnych do przeprowadzenia nierozpuszczalnych w wodzie minerałów w całości lub w części do roztworu obserwuje się powstanie przezroczystej strefy.

Wybrane kultury poddano badaniom i na podstawie charakterystyki systematycznej, właściwości morfologicznych i źródeł przyswajania węgla stwierdzono, że były to Bacillus i Streptomyces; 15 badanych grup oznaczono numerem 1-015-0003, a następnie, jak opisano poniżej, wyizolowano odmiany rozmnażające się w niskiej temperaturze i jedną z nich zdeponowano.

PL 217 740 B1

P r z y k ł a d 3

Izolowanie mikroorganizmów wytwarzających syderofory i hormony roślinne

Zdolność grup wyizolowanych sposobami opisanymi w przykładach 1 i 2 do wytwarzania syderoforu i hormonów badano wykorzystując pożywkę King B o następującym składzie:

Pepton 2%

Gliceryna 1%

K2HPO4 0,15%

MgSO4 x 7H2O 0,15%

Agar 2%

Przed sterylizacją odczyn pożywki doprowadzono do pH 7,2 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu.

Grupy Pseudomonas wytwarzające syderofory wykazują zdolność do wiązania jonów żelaza, które przekazują roślinom rosnącym w glebach o niskiej ich zawartości. Ponadto hamują wzrost niektórych mikroorganizmów fitopatologicznych jak Erwinia caratovora, które nie są w stanie wykorzystać żelaza w postaci związanej. Wytwarzanie syderoforu badano hamując wzrost Escherichia coli grupy MC1061. Sporządzono zawiesiny w wodzie destylowanej hodowli dwóch grup wyhodowanych na pożywce agarowej, które hodowano przez 48 godzin na płytce z pożywką King B (30-50 μθ pozbawioną żelaza oraz zawierającą je w ilości 1 μΜ FeCl3 x 7H2O w temperaturze 28°C. Następnie płytkę spryskano hodowlą E. Coli MC1061 otrzymaną na agarze TAg i inkubację kontynuowano przez kolejne 28 godzin w temperaturze 28°C. Wokół hodowli zaobserwowano pojawienie się rozmaitych stref zahamowanego wzrostu. Uśrednione wyniki z 4 doświadczeń zestawiono w tabeli 1. Jako gatunku negatywnego w stosunku do próbki kontrolnej użyto Bacillus megaterium, jako pozytywnego - Pseudomonas fluorescens.

T a b e l a 1

Mikroorganizm	Strefa zahamowanego wzrostu King B	Strefa zahamowanego wzrostu King B + 1 μΜ FeCh
SW1-1-6	++++	_-
SW1-1-12	++	-
P. fluores.	+	-
B. megater.		-

* Stopień zahamowania wzrostu: - brak; + niski; ++ i +++ wysoki i bardzo wysoki

Podczas badania wytwarzania syderoforu z mob4 i pozytywnej grupy kontrolnej zaobserwowano strefę zahamowanego wzrostu o znacznych rozmiarach, która nie występowała w obecności jonów żelaza.

Jak wspomniano wcześniej, niektóre grupy Pseudomonas wytwarzają hormony roślinne. Poddano badaniom wybrane grupy mikroorganizmów celem sprawdzenia ich zdolności do biosyntezy kwasu giberelinowego na pożywce TAg o składzie podanym powyżej. Badania przeprowadzono z użyciem wzorca, kwasu giberelinowego A (Sigma), metodą chromatografii cienkowarstwowej na żelu silikonowym (40 μg/ml, Merck). Kultury wyekstrahowano octanem etylu, następnie roztworem wodorotlenku i węglanu sodu o podwójnej objętości, a następnie ponownie octanem etylu z roztworu o wartości pH 2,5. W pozostałości po odparowaniu ekstraktu w następujących grupach stwierdzono plamki o wartości współczynnika Rf bliskiej wzorcowi:

T a b e l a 2

Grupa	Rf	Rozmiar plamki (mm²)
Wzorzec	0,41	24
SW1-1-6	0,46	17
M32-1-9	0,42	27
P. fluor.	0,49	14
B. megat.	0,57	7

Wybrano grupy oznaczone jako SW1-1-6 i M32-1-9 (wytwarzające w przybliżeniu 3-15 μg hormonu/mm).

Grupy poddano badaniom i zidentyfikowano systematycznie zgodnie z opisem podanym w części ogólnej.

PL 217 740 B1

P r z y k ł a d 4

Izolowanie mikroorganizmów wytwarzających polisacharyd zewnątrzkomórkowy

4A. Selekcja Bradyrhizobium

Grupy Bradyrhizobium PH2-1-3 posiano na pożywce Tag zawierającej 1% glukozy i 1% sacharozy (patrz wyżej) i zbadano ilość polisacharydu (występującego w postaci śluzu) wydzielonego wokół kultur. Wybrano grupy PH2-1-1 i -2 zdolne do biosyntezy polisacharydu.

4B. Wydzielanie Bacillus

Grupy Bacillus M32-1-10 i SW17-1-15 posiano na pożywce Tag zawierającej 1% glukozy i 1% sacharozy (patrz wyżej) i zbadano ilość polisacharydu (występującego w postaci śluzu) wydzielonego wokół kultur. Wybrano grupy M32-1-6,8 i 10 oraz SW17-1-7,11 i 15 zdolne do biosyntezy polisacharydu.

Wydzielonym mikroorganizmem był Micrococcus roseus. Na kompletnej pożywce zawierającej glukozę i sacharozę jest on zdolny do biosyntezy dużych ilości polisacharydu, przekształcając przy tym pożywkę w lepką masę.

Zgodnie z wynikami tych badań wybrane grupy wykazują zdolność do biosyntezy rozpuszczalnych w wodzie polisacharydów typu sukcynoglukanu, o znanej budowie.

P r z y k ł a d 5

Wydzielanie mikroorganizmów odpornych na niskie temperatury

Mikroorganizmy wybrane według kryteriów opisanych w przykładach 1-4 poddano działaniu środka mutagennego oraz promieniowania. Zawiesiny mikroorganizmów przygotowane z dodatkiem wody destylowanej zadawano roztworem nitrozoguanidyny o stężeniu 0,01, 0,1, 1,0, 10 i 100 μg/ml przez 1, 3, 5, 10 i 30 minut. Następnie zawiesinę komórek odwirowano, przemyto dwukrotnie wodą destylowaną, po czym komórki posiano na pożywce TAg. Potem postępowanie powtórzono poddając zawiesinę komórek w wodzie destylowanej, zawierającą 10⁹ mikroorganizmów/mm, działaniu lampy ultrafioletowej o mocy 15 W ustawionej w odległości 10 cm, przez 1, 3, 5, 10 i 30 minut. Zawiesiny komórek posiano na pożywce Tag po seryjnym rozcieńczeniu.

Kultury na pożywce TAg inkubowano w temperaturze 18°C przez 192 godziny, po czym wyizolowano kultury o największych wymiarach wyhodowane na nieprzejrzystej pożywce agarowej TAg podczas inkubacji w temperaturze 18°C.

Poniżej podano, które z wyhodowanych kultur poddano badaniom i zachowano.

Spośród wyizolowanych, wybranych mikroorganizmów odpornych na niskie temperatury wydzielono i zdeponowano następujące:

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294),

P r z y k ł a d 6

Hodowla mikroorganizmów

6A. Hodowla na kompletnej pożywce do kultur:

Z pożywki Tag do hodowli przygotowano skośne kultury agarowe, które inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 30°C. Kultury Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Streptomyces i Micrococcus zaszczepiono na pożywce oznaczonej jako Ta1i o następującym składzie:

Glukoza (wyjałowiona oddzielnie w 50% roztworze wodnym) 0,5%

Melasa 1,5%

Wyciąg namokowy z kukurydzy (50% suchej masy) 1,5%

Ekstrakt drożdżowy Gistex 0,2%

Kazeina kwasowa 0,1%

Siarczan amonu 0,1%

Azotan amonu 0,1%

Węglan wapnia 0,3%

Diwodorofosforan potasu 0,1%

Chlorek sodu 0,1%

PL 217 740 B1

Siarczan magnezu x 7H2O 0,1%

Olej palmowy 0,2%

Porcje 100-100 ml pożywki umieszczono w kolbach Erlen-meyera o pojemności 500 ml i poddano sterylizacji w temperaturze 121°C przez 30 minut. Sterylną pożywkę zaszczepiono mikroorganizmami wyhodowanymi na skośnych kulturach agarowych i kontynuowano hodowlę w temperaturze 25°C, na stole obrotowym, obracającym się z prędkością 260 pełnych obrotów na minutę, przez 36 minut. Wzrost hodowli obserwowano pod mikroskopem, pobierając 5% inokulantów zaszczepionych na pożywce Ta1f do fermentacji o następującym składzie:

Glukoza (wyjałowiona oddzielnie w 50% roztworze wodnym) 1,5%

Melasa 2,5%

Wyciąg namokowy z kukurydzy (50% suchej masy) 1,5%

Ekstrakt drożdżowy Gistex 0,4%

Kazeina kwasowa 0,4%

Siarczan amonu 0,2%

Azotan amonu 0,2%

Węglan wapnia 0,3%

Diwodorofosforan potasu 0,2%

Chlorek sodu 0,1%

Siarczan magnezu x 7H2O 0,2%

Roztwór pierwiastków śladowych* 0,45%

Olej palmowy 0,2% *Skład roztworu pierwiastków śladowych - jak w przykładzie 1.

Porcje pożywek po 100 ml poddano sterylizacji w kolbach Erlenmeyera i w laboratoryjnych kadziach fermentacyjnych o objętości brutto 10 litrów i objętości netto 5 litrów, w powyżej opisanych warunkach.

Hodowle umieszczone w kolbach hodowano na stole obrotowym, natomiast hodowle w kadziach w znany sposób, przez napowietrzanie i stosowanie mieszadła turbinowego o podwójnym wlocie, o prędkości 360 obrotów/minutę, przez 24 godziny, do osiągnięcia liczby komórek na milimetr rzędu 4 x 10⁸- 1,3 x 10⁹ zależnie od gatunku bakterii.

Do otrzymania hodowli w większej ilości przygotowano 10 litrów hodowli na pożywce Ta1i, o wyżej podanym składzie, w warunkach opisanych powyżej. Następnie porcje 100 litrów wyjałowionej pożywki Ta1i i 100 litrów pożywki Ta1f zaszczepiono porcjami kultur, każda o objętości 5 litrów. Hodowlę kontynuowano w powyżej opisanych warunkach przez 24 godziny, po czym kulturę hodowano na pożywce Ta1f w glebie, 50 litrów kultury wyhodowanej na pożywce Ta1i użyto do zaszczepienia 1000 litrów wyjałowionej pożywki Ta1f. Hodowlę kontynuowano w opisanych powyżej warunkach fermentacji przez 24 godziny, po czym po sprawdzeniu stwierdzono, że kultura była gotowa do użycia. W przypadku nadzwyczaj intensywnego pienienia dodawano 0,01% glikolu polipropylenowego jako środka przeciw pienieniu.

6B. Hodowla na pożywce półminimalnej

Sposób postępowania opisany w przykładzie 6 powtórzono zastępując pożywkę Ta1f pożywką

Ta2f o następującym składzie:

Glukoza (wyjałowiona oddzielnie w 50% roztworze wodnym) 1,5%

Melasa 0,5%

Kazeina kwasowa 0,1%

Siarczan amonu 0,7%

Azotan amonu 0,5%

Węglan wapnia 0,3%

Diwodorofosforan potasu 0,3%

Chlorek sodu 0,1%

Siarczan magnezu x 7H2O 0,2%

Roztwór pierwiastków śladowych* 0,35%

Po zakończeniu hodowli kultury zawierały 1-7 x 10⁸ komórek na milimetr, zależnie od rodzaju bakterii.

PL 217 740 B1

P r z y k ł a d 7

Badania poprawy struktury gleby i uprawy roślin

7A. Badania poprawy struktury gleby

Próbki piaszczystej gleby pobranej nad Dunajem w pobliżu Somlyósziget oraz gliniastej gleby z Esztergom umieszczono na tackach o wymiarach 90 x 90 cm, przy grubości warstwy wynoszącej 25 cm. Każdą tackę z glebą piaszczystą zadano 10 g azotanu amonu i 5 g fosforanu wapnia. Na tackach wysiano kukurydzę, w liczbie 104 nasion na każdą tackę. Przy ocenie wzrostu nie uwzględniano danych dla pięciu największych i pięciu najsłabiej rozwiniętych roślin. Masę korzeni badano po przemyciu wodą destylowaną i suszeniu w temperaturze 45°C przez dwa dni. Tacę nr 1 podlewano obficie wodą, tacę nr 2 podlano obficie jedynie podczas siewów, a później wcale. Tace oznaczone jako „a” zaszczepiono zdolnymi do biosyntezy polisacharydów mikroorganizmami z grup: Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294) i Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 0013 02) zdeponowanymi w Krajowej Kolekcji Mikroorganizmów do Użytku w Rolnictwie i Przemyśle. Kultury przygotowano sposobem opisanym w przykładzie 6, liczba komórek każdego gatunku bakterii wynosiła 10⁸ na 1 m². Tacek oznaczonych jako „b” nie zadawano mikroorganizmami.

W tabeli 3 zestawiono wyniki uzyskane 33-go dnia po posiewach. Wyniki wyrażono w przeliczeniu na wartości średnie na jedną roślinę.

T a b e l a 3

Gleba	Tacka	Sposób postępowania	Wysokość rośliny ^(cm)	Masa systemu korzeniowego ^(mg)
Piaszczysta	Nr 1	A	24	945
		B	17	634
	Nr 2	A	18	866
		B	11	757
Gliniasta	Nr 1	A	27	1095
		B	23	1213
	Nr 2	A	20	1012
		B	19	689

W tabeli 4 przedstawiono stopień kruszenia i spękania niepodlewanych próbek piaszczystej i gliniastej gleby (tace nr 2). Stopień kruszenia gleby oznaczano uwzględniając wymiar większości fragmentów gleby rozrzuconych na arkuszu papieru, które nie uległy dalszemu pokruszeniu podczas lekkiego potrząsania: poniżej 2 mm (-), pomiędzy 2-5 mm ( + ) lub powyżej 5 mm (++). Stopień spękania powierzchni oznaczono w następujący sposób: ++ oznacza brak pęknięć, + oznacza drobne pęknięcia o grubości włosa, podczas gdy - oznacza duże pęknięcia, charakterystyczne dla wysuszonej gleby.

T a b e l a 4

Gleba	Sposób postępowania	Stopień kruszenia	Stopień spękania
Piaszczysta	A	+	+
	B	-	-lub +
Gliniasta	A	++	+
	B	++	++

Jak wynika z danych zestawionych w tabelach 3 i 4 obecność mikroorganizmów zdolnych do biosyntezy polisacharydów wpływa na poprawę wzrostu roślin i struktury gleby.

7B. Próby polowe

Próby prowadzono w 2000 r. w Technicznej Stacji Doskonalenia i Hodowli Roślin Uniwersytetu w Mosonmagyaróvar, na przypadkowo wybranych poletkach powtarzających się czterokrotnie, stosując 10 I mieszanki mikroorganizmów na hektar.

Typ gleby, na jakiej prowadzono badania: pochodząca z rejonu Dunaju, o grubości 120-140 cm, zawartości próchnicy 2,4%; opady: słabe.

PL 217 740 B1

Pszenica jara

Zawartość białka %
Próbka kontrolna	11,80
NPK 200 kg/ha	11,87
BactoFil A	11,96
Zawartość białka w przeliczeniu na suchą masę %
Próbka kontrolna	13,84
NPK 200 kg/ha	13,91
BactoFil A	14,00
Wilgotny gluten %
Próbka kontrolna	32,0
NPK 200 kg/ha	31,1
BactoFil A	31,1
Masa 1000 ziaren (g)
Próbka kontrolna	36,4
NPK 200 kg/ha	36,8
BactoFil A	36,4
Ścieranie %
Próbka kontrolna	50,5
NPK 200 kg/ha	50,0
BactoFil A	49,8
Czas opadania (s)
Próbka kontrolna	278,3
NPK 200 kg/ha	281,5
BactoFil A	272,5
Spłaszczenie glutenu (cm)
Próbka kontrolna	2,75
NPK 200 kg/ha	3,25
BactoFil A	2,75
Wydłużenie glutenu (cm)
Próbka kontrolna	12,5
NPK 200 kg/ha	11,8
BactoFil A	12,3
Wskaźnik Zeleny'ego
Próbka kontrolna	30,0
NPK 200 kg/ha	30,3

PL 217 740 B1

BactoFil A	30,8
Zdolność do absorpcji wody oznaczona przy użyciu walorigrafu (ml)
Próbka kontrolna	31,3
NPK 200 kg/ha	31,6
BactoFil A	31,4
Wartość uzyskana w pomiarach przy użyciu walorigrafu
Próbka kontrolna	57,3
NPK 200 kg/ha	53,1
BactoFil A	48,0
Objętość bochenka (cm³)
Próbka kontrolna	962,5
NPK 200 kg/ha	977,5
BactoFil A	1055,0
Wskaźnik morfologiczny chleba
Próbka kontrolna	2,38
NPK 200 kg/ha	2,46
BactoFil A	2,32
Wydajność białka (kg/ha)
Próbka kontrolna	469,8
NPK 200 kg/ha	498,6
BactoFil A	510,3
Wysokość roślin (cm)
Próbka kontrolna	56,3
NPK 200 kg/ha	57,7
BactoFil A	55,4
Zbiór ziarna w przeliczeniu na 13% wilgotność (g/działkę)
	Zbiór ziarna t/ha	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	3,366	100,0
NPK 200 kg/ha	3,552	105,5
BactoFil A	3,617	107,5
Zbiór ziarna (g/działkę)
	Zbiór ziarna t/ha	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	3,398	100,0
NPK 200 kg/ha	3,584	105,5
BactoFil A	3,646	107,3
Zawartość wilgoci w plonach %
Próbka kontrolna	14,08

PL 217 740 B1

NPK 200 kg/ha	14,00
BactoFil A	13,93
Ciężar badany (kg)
Próbka kontrolna	69,8
NPK 200 kg/ha	70,4

Kukurydza

Zbiór surowych kolb (kg/działkę)
	Zbiór surowych kolb (t/ha)	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	5,725	100,0
NPK 200 kg/ha	6,848	119,6
BactoFil A	6,495	113,4
Zbiór ziarna przy 14% wilgoci (kg/działkę)
	Zbiór ziarna (t/ha)	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	5,496	100,0
NPK 200 kg/ha	6,614	120,3
BactoFil A	6,175	112,3
Zawartość wilgoci w ziarnie (%)
Próbka kontrolna	18,40
NPK 200 kg/ha	17,78
BactoFil A	19,63
Masa łodyg (kg/działkę)
	Masa łodyg (t/ha)	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	2,672	100,0
NPK 200 kg/ha	3,016	112,9
BactoFil A	2,886	108,0
Zawartość wilgoci w łodygach (%)
Próbka kontrolna	26,1
NPK 200 kg/ha	25,6
BactoFil A	25,9
Masa łodyg przy 14% wilgoci (kg/działkę)
	Masa łodyg (t/ha)	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	2,416	100,0
NPK 200 kg/ha	2,740	113,4
BactoFil A	2,613	108,2
Liczba łodyg (w tys. szt./ha)
Próbka kontrolna	38,41

PL 217 740 B1

NPK 200 kg/ha	39,13
BactoFil A	39,86
Liczba kolb na łodydze
Próbka kontrolna	1,04
NPK 200 kg/ha	1,10
BactoFil A	1,05
Liczba kolb (w tys. szt./ha)
Próbka kontrolna	39,86
NPK 200 kg/ha	42,93
BactoFil A	42,03
Masa tysiąca surowych ziaren (g)
Próbka kontrolna	255,2
NPK 200 kg/ha	259,2
BactoFil A	263,3
Masa tysiąca surowych ziaren o wilgotności 14% (g)
Próbka kontrolna	245,6
NPK 200 kg/ha	250,9
BactoFil A	251,0
Masa badany (kg) po zbiorach
Próbka kontrolna	65,9
NPK 200 kg/ha	65,1
BactoFil A	64,6
Masa 1 kolby (kg) przy 14% wilgoci
Próbka kontrolna	0,121
NPK 200 kg/ha	0,136
BactoFil A	0,131
Liczba ziaren w kolbie (db)
Próbka kontrolna	493,5
NPK 200 kg/ha	545,1
BactoFil A	523,1
Zawartość wilgoci w kolbie %
Próbka kontrolna	19,4
NPK 200 kg/ha	20,7
BactoFil A	18,9
Masa kolby (g)
Próbka kontrolna	22,3
NPK 200 kg/ha	22,3

PL 217 740 B1

BactoFil A	22,4
Indeks plonów
Próbka kontrolna	44,1
NPK 200 kg/ha	41,5
BactoFil A	42,3

Burak cukrowy

Buraki, sztuki/ha
Próbka kontrolna	79891
NPK 200 kg/ha	81159
BactoFil B	83696
Zbiór liści (kg/działkę)
	Zbiór liści (t/ha)	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	13,41	100,0
NPK 200 kg/ha	13,96	104,1
BactoFil B	15,38	114,7
Zbiór korzeni (kg/działkę)
	Zbiór korzeni (t/ha)	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	30,46	100,0
NPK 200 kg/ha	36,74	120,6
BactoFil B	39,35	129,2
Stosunek liści do korzeni
	Stosunek liści do korzeni	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	0,443	100,0
NPK 200 kg/ha	0,381	85,9
BactoFil B	0,391	88,2
Przeciętna masa korzenia (dag)
	Przeciętna masa korzenia (dag)	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	38,2	100,0
NPK 200 kg/ha	45,3	118,6
BactoFil B	47,1	123,5
Gnicie (%)
	Gnicie (%)	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	11,61	100,0
NPK 200 kg/ha	11,07	95,3
BactoFil B	10,59	91,3

PL 217 740 B1

Zawartość sodu (mg/100 g buraków)
Próbka kontrolna	1,94
NPK 200 kg/ha	2,28
BactoFil B	2,08
Zawartość azotu w grupach α-aminowych (mg/100 g buraków)
Próbka kontrolna	1,20
NPK 200 kg/ha	1,02
BactoFil B	1,02
Zawartość potasu (mg/100 g buraków)
Próbka kontrolna	2,52
NPK 200 kg/ha	1,89
BactoFil B	2,10
Ubytki (%)
Próbka kontrolna	2,95
NPK 200 kg/ha	2,68
BactoFil B	2,68
Zawartość cukru po oczyszczeniu, %
	Zawartość cukru po oczyszczeniu %	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	8,66	100,0
NPK 200 kg/ha	8,39	96,9
BactoFil B	7,92	91,4
Produkcja cukru brutto (t/ha)
	Produkcja cukru brutto (t/ha)	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	3,557	100,0
NPK 200 kg/ha	4,081	114,7
BactoFil B	4,181	117,5
Produkcja cukru netto (t/ha)
	Produkcja cukru netto (t/ha)	% próby kontrolnej
Próbka kontrolna	2,656	100,0
NPK 200 kg/ha	3,091	116,4
BactoFil B	3,125	117,7

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie preparatów zawierających mikroorganizmy według wynalazku

8A. Wytwarzanie mieszaniny mikroorganizmów:

Kultury Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293), Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292), Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294), Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302) i Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301) otrzymane sposobem opisaPL 217 740 B1 nym w przykładzie 6 zmieszano, optymalnie w takich samych proporcjach, po czym użyto do traktowania gleby w ilości od 5 litrów do 50 litrów, optymalnie w ilości 12 litrów/ha, w dowolnej porze roku o temperaturach powyżej 0°C, optymalnie od marca do października.

8B. Preparat do traktowania roślin jednoliściennych

Wytworzono preparat postępując zgodnie ze sposobem podanym przykładzie 6, z tą różnicą, że użyto następujących mikroorganizmów: Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293), Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292), Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291) i Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301).

8C. Preparat do traktowania roślin dwuliściennych

Wytworzono preparat postępując zgodnie ze sposobem podanym przykładzie 6, z tą różnicą, że użyto następujących mikroorganizmów: Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293), Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292), Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294) i Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302, otrzymując preparat według wynalazku.

8D. Wytwarzanie liofilizowanego preparatu litry wodnej zawiesiny mikroorganizmów otrzymanej sposobem podanym w przykładzie 6 poddano liofilizacji w urządzeniu Gelman SP54, zgodnie z instrukcją użytkowania dołączoną przez producenta. Mikroorganizmy w postaci wysuszonego proszku stosowano bez dalszego przetwarzania, bądź zależnie od sposobu użycia po wymieszaniu z węglanem wapnia, skrobią, glukozą lub celulozą w stosunku 1:1 - 1:100, po czym przechowywano w temperaturze 4-10°C aż do użycia.

8E. Wytwarzanie preparatu zawierającego nośnik

Kultury wyhodowane na pożywce sposobem podanym w przykładzie 6 zmieszano, optymalnie w równych ilościach, z nawozem organicznym, mączką sojową (o średnim uziarnieniu 4 mesh), metylocelulozą lub skrobią ziemniaczaną tak, aby preparat zawierał 5 x 10⁸ - 10¹⁰, optymalnie 5 x 10⁹ komórek mikroorganizmów. Następnie wilgotny preparat bądź preparat po wysuszeniu w temperaturze poniżej 40°C zastosowano do traktowania gleby w ilości 2-20 kg/ha, optymalnie 5 kg/ha. Optymalnie do gleby wprowa13 dza się co najmniej 10¹³ komórek mikroorganizmów na hektar.

Wynalazek dotyczy produktów oraz sposobów traktowania gleby bakteriami w celu poprawy wzrostu roślin i zwiększenia plonów; sposobów otrzymywania produktów według wynalazku, opartych na szczepach mikroorganizmów zdolnych do rozmnażania się w niskiej temperaturze i biosyntezy polisacharydów; oraz sposobów wytwarzania mikroorganizmów według wynalazku. Komórki jednego z mikroorganizmów według wynalazku bądź ich mieszaninę wprowadza się do gleby lub zaprawia się nasiona roślin.

Sposób według wynalazku umożliwia wprowadzenie do gleby produktu zawierającego co najmniej jedną z grup bakterii glebowych przetwarzających zawarty w powietrzu azot w związki przyswajalne dla roślin, rozpuszczających mineralne fosforany i związki potasu, zdolnych do biosyntezy substancji poprawiających wzrost roślin, wytwarzania polisacharydów, które optymalnie poprawiają strukturę gleby, wyizolowanych z gleb różnego typu i zmodyfikowanych w warunkach laboratoryjnych, w celu otrzymania zadowalających plonów praktycznie bez stosowania kosztownych nawozów sztucznych.

Claims

1. Preparaty do traktowania gleby i nasion roślin zawierające żywe mikroorganizmy lub mikroorganizmy zdolne do rozmnażania się w glebach różnego typu w otoczeniu roślin, znamienne tym, że zawierają, w ilości 5 x 10⁶ - 10¹¹, korzystnie 10⁷ - 10¹⁰ komórek/g, kulturę Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291) oraz jeden lub większą liczbę mikroorganizmów spośród

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294),

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302), i

Streptomyees albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301),

PL 217 740 B1 jako mikroorganizmów zdolnych do rozmnażania się również w niskiej temperaturze, korzystnie poniżej

20°C, jak również w glebach o niskiej wartości pH, korzystnie poniżej 5, zdeponowanych w Krajowej Kolekcji Mikroorganizmów do Użytku w Rolnictwie i Przemyśle, Budapeszt, Węgry, oraz mokre lub suche nośniki dopuszczalne w uprawach rolniczych i nietoksyczne dla mikroorgani zmów.

2. Preparaty według zastrz. 1, znamienne tym, że jako nośnik zawierają wodę i/lub mączkę sojową i/lub skrobię i/lub celulozę i/lub glukozę.

3. Preparaty według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że jako mikroorganizm zawierają

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295), oraz

Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301).

4. Preparaty według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że jako mikroorganizm zawierają

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294),

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302), oraz

Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301).

5. Preparaty według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że jako mikroorganizm zawierają

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294), i

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302).

6. Preparaty według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że jako mikroorganizm zawierają

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294), i

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302).

7. Sposób wytwarzania produktów do traktowania gleby i nasion roślin i/lub preparatów zawierających żywe mikroorganizmy lub mikroorganizmy zdolne do rozmnażania się w otoczeniu roślin w glebach różnego typu, również w niskiej temperaturze, korzystnie poniżej 20°C i przy niskiej wartości pH, korzystnie poniżej 5, znamienny tym, że hoduje się osobno lub w mieszaninie, na pożywce zawierającej źródło węgla i azotu oraz sole nieorganiczne, mikroorganizm Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291), oraz ewentualnie, osobno lub w mieszaninie, jeden lub większą liczbę spośród mikroorganizmów

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294),

Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302), i

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako źródło węgla stosuje się glukozę i/lub sacharozę i/lub melasę, jako źródło azotu stosuje się chlorek amonu i/lub azotan amonu i/lub siarczan amonu i/lub wyciąg namokowy z kukurydzy i/lub hydrolizat kazeiny, a jako sól nieorganiczną stosuje się węglan

PL 217 740 B1 wapnia i sole uwalniające w wyniku dysocjacji jony sodu, potasu, magnezu, wapnia, żelaza, jony azotanowe, chlorkowe, siarczanowe, węglanowe, fosforanowe, oraz stosuje się dodatek pierwiastków śladowych.

9. Mikroorganizmy, korzystnie zdolne do rozmnażania się również w temperaturze poniżej 20°C i przy niskiej wartości pH, zdeponowane w Krajowej Kolekcji Mikroorganizmów do Użytku w Rolnictwie i Przemyśle, Budapeszt, Węgry, pod następującymi numerami:

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM /P/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM /P/ B 001292),

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM /P/ B 001296),

Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295) ,

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM /P/ B 001294) ,

10. Sposób wytwarzania mikroorganizmów zdefiniowanych w zastrz. 9, znamienny tym, że z otoczenia roślin pobiera się próbkę gleby z wierzchniej (górnej) warstwy o grubości 40 cm, identyfikuje się wybrane mikroorganizmy, poddaje działaniu środków mutagennych i izoluje się odmiany rozmnażające się również w niskiej temperaturze.

11. Sposób traktowania gleby preparatami zdefiniowanymi w zastrz. 1-6, znamienny tym, że

10 14 11 12 nanosi się preparaty zawierające komórki mikroorganizmów w liczbie 10¹⁰ - 10¹⁴, korzystnie 10¹¹ - 10¹²na hektar, na powierzchnię lub do wnętrza gleby, w porze roku, w której nie występuje spadek temperatury poniżej 0°C.

12. Sposób traktowania nasion roślin preparatami zdefiniowanymi w zastrz. 1-6, znamienny tym, że traktuje się nasiona produktem w postaci ciekłej, zawierającym co najmniej jeden z mikroorganizmów lub ich mieszaninę.