PL217837B1

PL217837B1 - Rekombinowana molekuła DNA, kaseta ekspresyjna, wektor DNA, plazmid binarny, komórka roślinna, sposób otrzymywania polipeptydu w eukariotycznym gospodarzu oraz zastosowanie rekombinowanej molekuły DNA

Info

Publication number: PL217837B1
Application number: PL392772A
Authority: PL
Inventors: Katarzyna Zientara-Rytter; Grzegorz Moniuszko; Anna Wawrzyńska; Jolanta Łukomska; Agnieszka Sirko
Original assignee: Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2010-10-27
Publication date: 2014-08-29
Also published as: WO2012057640A1; US20140259214A1; PL392772A1; CA2816281A1; BR112013010563A2; CN103403156B; CN103403156A; EP2633044A1; EP2633044B1; CA2816281C; US9534229B2

Description

Przedmiotami wynalazku są rekombinowana molekuła DNA, kaseta ekspresyjna, wektor DNA, plazmid binarny, komórka roślinna, sposób otrzymywania polipeptydu w eukariotycznym gospodarzu oraz zastosowanie rekombinowanej molekuły DNA. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy sposobu otrzymywania roślin o korzystnych cechach hodowlanych, ze szczególnym wskazaniem na zwiększenie oporności roślin na abiotyczne stresy, takie jak niedobór związków mineralnych czy szok cieplny, poprzez zastosowanie metod inżynierii genetycznej. Uzyskiwane sposobem według wynalazku transgeniczne rośliny nadprodukujące białko z rodziny JOKA2/p62 albo białko z rodziny JOKA2/p62 w fuzji z białkiem fluorescencyjnym mogą znaleźć zastosowanie między innymi w rolnictwie, poprzez zwiększenie oporności uprawianych roślin na abiotyczne czynniki stresowe i lepszą produkcję biomasy ze specjalnym wskazaniem na nadziemną część roślin.

Autofagia jest powszechnym procesem katabolicznym w komórkach eukariotycznych. Pomimo tego, że została po raz pierwszy opisana około 40 lat temu, dopiero przed dekadą zaczęto rozumieć podstawy molekularne tego zjawiska (Klionsky, 2007; Klionsky et al., 2010). Jest kilka rodzajów autofagii, spośród których najpowszechniej znana jest makroautofagia, podczas której powstają autofagosomy, struktury otoczone podwójną błoną, której pochodzenie jest niejasne. Do autofagosomów kierowany jest „ładunek” (organelle komórkowe, białka, agregaty białkowe) przeznaczony do degradacji. W kolejnych etapach procesu autofagii, autofagosom wchłaniany zostaje do wakuoli, gdzie pozostaje otoczony jedynie wewnętrzną błoną (zewnętrzna błona autofagosomu łączy się z błoną wakuoli), materiał przeznaczony do degradacji jest trawiony a składniki możliwe do powtórnego wykorzystania uwolnione i włączone w metabolizm komórki.

Dotychczas zidentyfikowano co najmniej 34 białka, które w sposób przejściowy kolejno zaangażowane są w powstawanie autofagosomu. Geny kodujące te białka były po raz pierwszy charakteryzowane w drożdżach (Nakatogawa et al., 2009). Zarówno proces autofagii, jak i jego poszczególne elementy są konserwowane ewolucyjnie (Yang and Klionsky, 2010), wydaje się jednak, że wyższe eukarionty wymagają elementów, które nie występują u drożdży.

Niedawno wykazano, że proces autofagii ma olbrzymi wpływ na homeostazę białek u ludzi (Behrends et al., 2010). Jest on niezbędny do właściwej reakcji na niedobór pokarmu, rozwój odpowiedzi immunologicznej oraz do prawidłowego przebiegu programowanej śmierci komórki. Nieprawidłowe funkcjonowanie autofagii jest przyczyną wielu zaobserwowanych wcześniej chorób ludzkich, w tym nowotworów, różnych chorób neurodegeneracyjnych, immunologicznych oraz nadwrażliwości na infekcje (Jo, 2010; Moreau et al., 2010; Walsh and Edinger, 2010). Proces autofagii jest istotnym elementem rozwoju zwierząt, zarówno ssaków, jak i bezkręgowców (nicienie, owady) (Melendez and Neufeld, 2008).

Badania na komórkach ludzkich wykazały, że co najmniej dwa białka, p62 (zwane także sekwestosomem 1) oraz NBRl mogą dostarczać do autofagosomów agregaty białek przeznaczonych do degradacji. Białka te bywają określane receptorami selektywnej autofagii, ponieważ rozpoznanie białek przeznaczonych do degradacji odbywa się w sposób specyficzny (Kirkin et al., 2009a; Kirkin et al., 2009b; Komatsu et al., 2007; Pankiv et al., 2007). Dane literaturowe dotyczą głównie ludzkiego białka p62, które samo jest także degradowane w procesie autofagii (Komatsu and Ichimura, 2010; Komatsu et al., 2010). Białko to znajdowane jest w ciałkach wewnątrzkomórkowych, gdzie tworzy agregaty z ubikwitynowanymi białkami, które gromadzą się w różnych chronicznych, toksycznych i degeneracyjnych chorobach (Du et al., 2009a; Du et al., 2009b; Komatsu et al., 2010; Mathew et al., 2009). Wykazano, że białko p62 ułatwia usuwanie agregatów ubikwitynylowanych białek w procesie autofagii.

- Autofagia jest procesem bardzo intensywnie badanym u ludzi, natomiast dopiero od niedawna wykazano, że funkcjonuje ona także w roślinach. Badanie autofagii u roślin jest ułatwione z powodu bardzo silnej ewolucyjnej konserwacji tego procesu oraz białek w nim uczestniczących (Reumann et al., 2010), (Diaz-Troya et al., 2008; Yoshimoto et al., 2010). Charakterystyka wielu mutantów w genach atg (związanych z autofagią) wykazała, że autofagia jest ważnym procesem także w roślinach, ponieważ wiele z tych mutantów starzeje się wcześniej oraz jest nadwrażliwych na niedobór azotu i węgla (Doelling et al., 2002; Phillips et al., 2008; Thompson et al., 2005; Thompson and Vierstra, 2005; Yoshimoto et al., 2004). Autofagiajest indukowana w roślinach poprzez traktowanie środkami wywołującymi stres oksydacyjny (Xiong et al., 2007), a w warunkach niedoboru azotu proces autofagii zaangażowany jest w degradację zarówno Rubisco jak i całych chloroplastów (Ishida et al., 2008; Wada et al., 2009). Generalnie, uważa się, że proces autofagii działa jako mechanizm

PL 217 837 B1 zapewniający przeżycie w warunkach głodzenia poprzez recykling składników komórkowych. Autofagia ma jednakże znacznie większą rolę w roślinach. Jest niezbędna w warunkach normalnego wzrostu (Inoue et al., 2006; Moriyasu et al., 2003) oraz podczas odpowiedzi na stresy biologiczne, takie jak odpowiedź na patogeny (Liu et al., 2005; Patel and Dinesh-Kumar, 2008); (Yoshimoto et al., 2009).

W zgłoszeniu patentowym WO0233051 (opubl. 2002-04-25) opisano gen roślinny związany z procesem autofagii. Rozwiązanie dostarcza zrekombinowane białka roślinne działające jako regulatory autofagii, takie jak białka AUTl, podobnie jak sekwencje nukleotydowe kodujące te białka. Ponadto w wynalazku opisano rekombinowane wektory komórki gospodarza, rośliny transgeniczne oraz sposoby wykorzystania cząsteczek kwasu nukleinowego i białek według wynalazku.

W zgłoszeniu patentowym WO2007126850 (opubl. 2007-11-08) opisano wpływ fotoperiodu na różnicowanie się kwiatów w kwiatostanie i plonowanie roślin. W wynalazku zaprezentowano sposób poprawy wydajności plonowania roślin oraz sposoby zastosowania technik inżynierii genetycznej w celu transformacji roślin poprzez wprowadzenie kaset ekspresyjnych wpływających pozytywnie lub negatywnie na ekspresję genów zaangażowanych w kontrolę fotoperiodyczną różnicowania i zamierania kwiatów. Metody te służą zwiększeniu wydajności plonowania roślin w porównaniu do roślin typu dzikiego.

W zgłoszeniu patentowym CA2701871 (opubl. 2009-03-26) przedstawiono rośliny o zwiększonej wydajności plonowania. Wynalazek ten dotyczy ogólnie komórki roślinnej o zwiększonej wydajności przyswajania azotu i/lub podwyższonej wydajności produkcji biomasy w porównaniu do nietransformowanych komórek roślinnych typu dzikiego poprzez podwyższenie lub generowanie jednej lub więcej aktywności, za które odpowiadają polipeptydy związane ze zwiększoną wydajnością przyswajania azotu w roślinach.

W zgłoszeniu patentowym W02010071995 (opubl. 2010-07-01) opisano białka TIPS oddziałujące z białkami TOR i geny je kodujące. W rozwiązaniu wynalazku zastosowano liczne narzędzia eksperymentalne, które obejmują biochemiczną molekularną genomikę rozwoju oraz podejścia transgeniczne umożliwiające nabycie lub stratę funkcji w celu wpływania na szlak sygnalizacyjny TOR w roślinach, zwłaszcza z wykorzystaniem systemu modelowego Arabidopsis i rośliny uprawnej Brassica napus. W tym celu zidentyfikowano potencjalne białka oddziałujące z TOR (TIPs) oraz analizowano funkcje tych spośród nich, które zaangażowane są w różne procesy rozwojowe i biochemiczne. Badanie funkcji obejmujące nadekspresję oraz wyciszenie TIPs wykazały szereg fenotypów, między innymi wydajność wykorzystania związków mineralnych, zmieniony pokrój roślin i oporność na stresy transgenicznych linii Arabidopsis i Brassica. Niektóre spośród tych fenotypów są związane z istotnymi szlakami rozwoju ważnymi dla wydajności plonowania rzepaku.

W zgłoszeniu patentowym US20060090219 (opubl. 2006-04-27) opisano sposoby wytwarzania roślin o poprawionym przyroście w warunkach ograniczonej dostępności azotu. W wynalazku przedstawiono sposób wytwarzania rośliny, którą cechuje poprawiony lepszy wzrost i/lub plonowanie w warunkach ograniczonej dostępności azotu, to znaczy w warunkach uprawy, w których zawartość azotu jest obniżona w porównaniu do zwykłych warunków uprawy, poprzez podwyższenie zawartości 2-OG w roślinach. W szczególności, wynalazek dostarcza sposób wytwarzania roślin o lepszym wzroście i/lub plonowaniu w warunkach, w których zawartość azotu jest obniżona w porównaniu do zwykłych warunków uprawy, poprzez wprowadzenie genu GDH lub genu ECASPC do roślin i ekspresję transgenu GDH lub ECAPS w roślinach, co prowadzi do podwyższenia 2-OG lub poprzez opryskiwanie liści roślin proliną w celu podwyższenia zawartości 2-OG, poprawiając w ten sposób przyswajanie azotu lub aktywność metaboliczną w roślinach. Rozwiązanie dostarcza także sposób hodowli takich roślin w warunkach ograniczonej dostępności azotu.

Dostępne dane literaturowe sugerują, że jedynie podstawowe elementy procesu autofagii istnieją w roślinach, natomiast nie ma w nich receptorów selektywnej autofagii (Yoshimoto et al., 2010). Nieoczekiwanie, okazało się, że białko JOKA2 jest roślinnym ortologiem ludzkiego białka p62 czyli receptora selektywnej autofagii. Domeny białkowe charakterystyczne dla białka p62 występują w białku JOKA2. Ponadto, rośliny ze zwiększonym poziomem białka JOKA2, z powodu nadprodukcji białka fuzyjnego JOKA2::YFP lub JOKA2::CFP wykazują się mniejszą wrażliwością na niedobór substancji odżywczych oraz na podwyższoną temperaturę. Białko JOKA2 w formie fuzji z białkami fluorescencyjnymi może być także wykorzystywane jako marker autofagosomów oraz system reporterowy do monitorowania autofagii w roślinach. Podobne zastosowanie białka p62 w odniesieniu do komórek ssaczych było wcześniej opisane (Larsen et al., 2010). Użycie białka JOKA2 w odniesieniu do komórek

PL 217 837 B1 roślinnych nie wynikało z dotychczasowego stanu techniki, gdyż nie było oczywiste, że JOKA2 jest ortologiem p62.

Pomimo istniejącego stanu techniki istnieje ciągła potrzeba uzyskania roślin, które byłyby odporniejsze na stresy środowiskowe. Stresy środowiskowe, które obejmują także deficyt związków mineralnych ograniczają produkcję chlorofilu oraz proces fotosyntezy, co skutkuje chlorozą liści. Proces autofagii odpowiedzialny jest za recykling składników komórkowych i lepsze wykorzystanie dostępnych składników komórkowych w warunkach stresu. Wydajne funkcjonowanie autofagii niezbędne jest do prawidłowego rozwoju roślin oraz oporności na stresy. Dostępne dane literaturowe sugerują, że jedynie podstawowe elementy procesu autofagii istnieją w roślinach, natomiast nie ma w nich receptorów selektywnej autofagii (Yoshimoto et al., 2010). Nieoczekiwanie, okazało się, że białko JOKA2 jest roślinnym funkcjonalnym i strukturalnym homologiem ludzkiego białka p62. Domeny białkowe charakterystyczne dla białka p62 występują w białku JOKA2. Ponadto, rośliny ze zwiększonym poziomem białka JOKA2, z powodu nadprodukcji białka fuzyjnego JOKA2::YFP, wykazują się mniejszą wrażliwością na niedobór substancji odżywczych oraz na podwyższoną temperaturę niż rośliny rodzicielskie.

Celem niniejszego wynalazku jest uzyskanie transgenicznych roślin nadprodukujących białko z rodziny JOKA2/p62 lub białko z rodziny JOKA2/p62 w fuzji z innym białkiem, na przykład białkiem fluorescencyjnym, które mogłyby znaleźć zastosowanie między innymi w rolnictwie poprzez zwiększenie oporności uprawianych roślin na abiotyczne czynniki stresowe i lepszą produkcję biomasy ze specjalnym wskazaniem na nadziemną część roślin lub do monitorowania procesu autofagii w roślinach.

Zdefiniowane cele i rozwiązanie problemów związanych z ich osiągnięciem, to znaczy, uzyskanie nowych transgenicznych roślin o korzystnych cechach hodowlanych ze szczególnym wskazaniem na zwiększenie oporności roślin na abiotyczne stresy jak niedobór związków mineralnych czy szok cieplny, zostały osiągnięte w tym wynalazku poprzez uzyskanie metodami inżynierii genetycznej roślin nadprodukujących białko JOKA2 w fuzji z białkiem fluorescencyjnym.

Przedmiotem wynalazku jest rekombinowana molekuła DNA, zawierająca cząsteczkę kwasu nukleinowego, określonego sekwencją SEQ. ID nr 1, kodująca białko z rodziny JOKA2/p62 lub jego charakterystyczne domeny.

Korzystnie, gdy kodowane przez nią białko z rodziny JOKA2/p62 stanowi białkowy czynnik wybrany spośród grupy obejmującej czynniki wprowadzające zwiększoną oporność na niekorzystne warunki abiotyczne i/lub na niedobór związków odżywczych względem roślin rodzicielskich.

Korzystnie, gdy sekwencja kodująca białko z rodziny JOKA2/p62 określona sekwencją SEQ. ID nr 1 jest połączona funkcjonalnie z sekwencją nukleotydową kodującą białko markerowe, wybrane korzystnie z grupy białek fluorescencyjnych.

Korzystnie, gdy rekombinowana molekuła uzupełniona jest o dodatkowy marker połączony funkcjonalnie z białkiem z rodziny JOKA2/p62, który zapewnia przyżyciowe monitorowanie produkcji i lokalizacji białka z rodziny JOKA2/p62.

Korzystnie, gdy grupę białek fluorescencyjnych stanowią białka YFP lub CFP.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kaseta ekspresyjna zawierająca rekombinowaną molekułę określoną powyżej funkcjonalnie połączoną z elementami regulatorowymi, które zapewniają stabilną lub przejściową ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego w komórce roślinnej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor DNA, plazmidowy lub wirusowy, zawierający kasetę ekspresyjną zawierającą co najmniej jedną rekombinowaną molekułę DNA określoną powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest plazmid binarny zawierający kasetę ekspresyjną zawierającą co najmniej jedną rekombinowaną molekułę DNA określoną powyżej, charakteryzujący się tym, że zawiera marker, korzystnie z grupy markerów warunkujących oporność na antybiotyk, który zapewnia pozytywną selekcję komórek roślinnych posiadających wbudowaną do genomu rekombinowaną molekułę DNA.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka roślinna zawierająca rekombinowaną molekułę określoną powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania polipeptydu w eukariotycznym gospodarzu charakteryzujący się tym, że do genomu rośliny - gospodarza, wprowadza się materiał genetyczny stanowiący rekombinowaną molekułę DNA określoną powyżej.

Korzystnie, gdy prowadzi się izolację i namnożenie cząsteczki DNA kodującej białko z rodziny JOKA2/p62, a następnie wprowadza się ją do plazmidu przejściowego, po czym przenosi się sekwencję joka2 do plazmidu binarnego zawierającego pozostałe składniki roślinnej kasety ekspresyjnej, następnie przenosi się roślinną kasetę ekspresyjną z wektora plazmidowego do genomu wybranej

PL 217 837 B1 rośliny, po czym regeneruje się i selekcjonuje transgeniczne rośliny zdolne do produkcji białka z rodziny JOKA2/p62 w fuzji z białkiem markerowym lub bez białka markerowego.

Korzystnie, gdy stosuje się materiał genetyczny w postaci plazmidu binarnego, korzystnie uzupełniony o marker, który zapewnia pozytywną selekcję komórek roślinnych posiadających wbudowaną do genomu rekombinowaną molekułę DNA. Korzystnie, gdy plazmid uzupełnia się o dodatkowy marker połączony funkcjonalnie z białkiem z rodziny JOKA2/p62, który zapewnia przyżyciowe monitorowanie produkcji i lokalizacji białka z rodziny JOKA2/p62.

Korzystnie, gdy do wprowadzenia rekombinowanej molekuły DNA stosuje się dowolną znaną metodę wprowadzania materiału genetycznego do komórek roślinnych i uzależnia się go od gatunku rośliny - gospodarza, przy czym zapewnia się stabilną integrację fragmentu DNA do genomu gospodarza.

Korzystnie, gdy do wprowadzenia rekombinowanej molekuły DNA stosuje się dowolną znaną metodę wprowadzania materiału genetycznego do komórek roślinnych i uzależnia się go od gatunku rośliny - gospodarza, przy czym zapewnia się przejściową ekspresję kasety ekspresyjnej określonej powyżej.

Korzystnie, gdy uzyskuje się transgeniczne rośliny o zwiększonej wydajności przyswajania związków mineralnych, lepszym wzroście i zwiększonej oporności na niedobór związków mineralnych i inne stresy abiotyczne względem roślin rodzicielskich (dzikiego typu).

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rekombinowanej molekuły DNA określonej powyżej do konstrukcji wektora, który zapewnia produkcję białka z rodziny JOKA2/p62 w komórce roślinnej.

Korzystnie, gdy otrzymane rośliny nadprodukują białko z rodziny JOKA2/p62 jako białko fuzyjne lub niefuzyjne i wskazują zwiększoną wydajność przyswajania związków mineralnych, lepszy wzrost i zwiększoną oporność na niedobór związków mineralnych i inne stresy abiotyczne względem roślin rodzicielskich (dzikiego typu). Korzystnie, gdy otrzymane rośliny nadprodukują białko fuzyjne lub niefuzyjne i posiadają zwiększony poziom białka z rodziny JOKA2/p62, które mogą zostać użyte do wyznakowania autofagosomów oraz do monitorowania procesu autofagii.

Rozwiązanie przedstawiono na rysunku, gdzie:

figura 1 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego kodującą białko z rodziny JOKA2/p62, określone dalej jako sekwencja nr 1;

figura 2 przedstawia schemat skonstruowanych kaset ekspresyjnych;

figura 3 przedstawia sygnał fluorescencji obserwowany w jądrze komórkowym i w kwaśnych cytoplazmatycznych strukturach globularnych przypominających autofagosomy. Panel A wskazuje na lokalizację białka JOKA2::YFP w autofagosomach a panel B na lokalizację w jądrze komórkowym;

figura 4 przedstawia lokalizację białka JOKA2::YFP w linii J4-1, jako typową i reprezentacyjną lokalizację białka fuzyjnego w komórkach roślinnych charakterystyczną dla wszystkich badanych linii J4 i J5;

figura 5 przedstawia obserwacje pokolenia T1 (potomstwa pierwotnych transformatów), które ujawniły występowanie różnic fenotypowych między transformatami zawierającymi białko fuzyjne JOKA2::YFP lub JOKA2::CFP, a roślinami kontrolnymi, czyli linią rodzicielską LA Burley 21 lub też transformatami produkującymi wolne białko fluorescencyjne EGFP, linia AB5;

figura 6 przedstawia różnice w zawartości chlorofilu spowodowane chlorozą liści wywołaną stresem, które potwierdzono poprzez zbadanie poziomu chlorofilu a i b ekstrahowanego za pomocą 96% etanolu u dwutygodniowych siewek;

figura 7 przedstawia fenotyp roślin rosnących przez 5 dni w podwyższonej temperaturze.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku poniżej przedstawiono przykładowe wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d y

Sposób według wynalazku polega na tym, że do genomu rośliny (gospodarza) wprowadza się materiał genetyczny będący roślinną kasetą ekspresyjną kodującą otwartą ramkę odczytu genu joka2 pochodzącą z rośliny Nicotiana tabacum, przy czym uzyskuje się materiał roślinny w znany sposób.

Do transformacji stosuje się plazmid w skład, którego wchodzi oprócz sekwencji kodującej JOKA2, promotor wirusa mozaiki kalafiora „CaMV 35S”, o którym wiadomo, że zapewnia inicjację transkrypcji w komórkach roślinnych, a także terminator zapewniający poprawne zakończenie procesu transkrypcji za sekwencją nukleotydów kodującą białko fluorescencyjne funkcjonalnie połączone z sekwencją joka2.

PL 217 837 B1

Białka z rodziny JOKA2/p62 charakteryzują się stosunkowo niskim stopniem zawartości identycznych aminokwasów, jeśli porównujemy kompletne sekwencje białek pełnej długości. Procentowa zawartość aminokwasów identycznych pomiędzy białkiem JOKA2 z Nicotiana tabacum a jego homologami z innych organizmów jest następująca: 34.9% Zea mays, 35.1% Triticum aestivum, 37.9% Oryza sativa, 42% Vitis vinifera, 45% Populus trichocarpa, 49.4% Arabidopsis thaliana, 30.3% Homo sapiens. Przynależność poszczególnych białek do rodziny JOKA2/p62 nie jest oczywista jeśli poszukujemy białek jedynie poprzez analizę całkowitej homologii. Jednakże, w białkach z rodziny JOKA2/p62 konserwowane są wszystkie charakterystyczne domeny białkowe, które są niezbędne dla funkcjonowania tych białek jako receptorów selektywnej autofagii.

W sposobie według wynalazku prowadzi się:

1) izolację i namnożenie cząsteczki DNA kodującej joka2 a następnie wprowadzenie jej do plazmidu przejściowego;

2) przeniesienie sekwencji joka2 do plazmidu binarnego zawierającego pozostałe składniki roślinnej kasety ekspresyjnej to jest promotor, terminator i sekwencję kodującą białko fluorescencyjne;

3) przeniesienie roślinnej kasety ekspresyjnej z wektora plazmidowego do genomu wybranej rośliny;

4) regenerację i selekcję transgenicznych roślin zdolnych do produkcji białka JOKA2 w fuzji z białkiem fluorescencyjnym (lub bez fuzji).

W wyniku zastosowania sposobu według wynalazku otrzymane rośliny nadprodukują białko fuzyjne, przez co posiadają zwiększony poziom białka z rodziny JOKA2/p62 i wskazują zwiększoną oporność na niekorzystne warunki abiotyczne.

W sposobie według wynalazku do transformacji roślin stosuje się materiał genetyczny w postaci plazmidu binarnego korzystnie uzupełniony o marker umożliwiający pozytywną selekcję komórek roślinnych posiadających wbudowaną do genomu kasetę ekspresyjną poprzez selekcję na antybiotyk, przykładowo kanamycynę, gdzie marker ten warunkuje oporność. Ponadto plazmid korzystnie uzupełniony jest także o dodatkowy marker połączony funkcjonalnie z białkiem z rodziny JOKA2/p62 umożliwiający przyżyciowo i na bieżąco monitorowanie produkcji i lokalizacji białka z rodziny JOKA2/p62.

Do wprowadzenia wyżej opisanej roślinnej kasety ekspresyjnej stosować można dowolną znaną metodę wprowadzania materiału genetycznego do komórek roślinnych. Wybór metody uzależniony jest od gatunku rośliny-gospodarza i powinien zapewniać stabilną integrację fragmentu DNA do genomu gospodarza, co zapewnia dziedziczenie w kolejnych pokoleniach wprowadzonej modyfikacji genetycznej i utrzymanie pożądanej cechy. Przykładem może być transformacja komórek roślinnych z wykorzystaniem Agrobacterium.

Sposobem według wynalazku uzyskuje się transgeniczne rośliny o lepszym wzroście i zwiększonej oporności na niedobór minerałów i inne stresy abiotyczne względem roślin macierzystych (dzikiego typu).

Prawdopodobne jest, że uzyskane rośliny mogą lepiej wykorzystywać dostępne związki mineralne i związki organiczne dzięki procesowi odzyskiwania (recyklingu) niepotrzebnych substancji na drodze selektywnej autofagii. Proces ten jest ułatwiony (przebiega sprawniej i szybciej) w roślinach posiadających zwiększony poziom białka z rodziny JOKA2/p62.

P r z y k ł a d I. Konstrukcja kasety ekspresyjnej zawierającej rekombinowaną molekułę DNA z genem Nicotiana tabacum w fuzji z białkiem fluorescencyjnym.

Plazmidowy wektor DNA został zaprojektowany w celu ekspresji otwartej ramki odczytu genu joka2 z Nicotiana tabacum w fuzji z sekwencją kodującą białko fluorescencyjne YFP lub CFP w komórkach roślinnych. Aby pozyskać sekwencję kodującą genu Ntjoka2 całkowita pula RNA została wyizolowana z roślin tytoniu poddanych dwudniowemu głodzeniu siarkowemu. Izolację przeprowadzono metodą fenolową (Linthorst et al., 1993). Pozyskane całkowite RNA stanowiło źródło poliadenylowanego matrycowego RNA (mRNA), które zostało następnie wykorzystane do konstrukcji biblioteki cDNA za pomocą techniki odwrotnej transkrypcji a następnie łańcuchowej reakcji polimeryzacji (RT-PCR). Reakcję przeprowadzono przy użyciu komercyjnego zestawu „SuperScriptII Reverse Transcriptase”, z zastosowaniem startera oligo(dT) firmy Invitrogen.

PL 217 837 B1

Na matrycy powstałego cDNA namnożono sekwencję kodującą genu joka2 przy pomocy łańcuchowej reakcji polimeryzacji stosując startery 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggctatggagtctgctat-3' i 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctgctctccagcaataagatc-3' i rekombinowaną polimerazę Taq firmy Fermentas. Produkt reakcji PCR wklonowano następnie do wektora przejściowego pDEST221 (Invitrogen) wprowadzono do komórek bakteryjnych Escherichia coli i wyselekcjonowano klon zawierający poprawną sekwencję molekuły DNA. Plazmid pDEST221 wzbogacony o sekwencję joka2 umożliwił następnie na drodze rekombinacji homologicznej wprowadzenie wyżej opisanej cząsteczki DNA do roślinnych plazmidów binarnych pH7YWG2 i pK7CWG2 (Karimi et al., 2002) oraz uzyskanie plazmidów pJ4 i pJ5 zawierających, odpowiednio, fuzje translacyjne joka2::yfp i joka2::cfp. Na figurze 1 zilustrowano schemat skonstruowanych kaset ekspresyjnych.

P r z y k ł a d II. Transformacja roślin tytoniu rekombinowaną molekułą DNA przy użyciu Agrobacterium tumefaciens.

Tytoń (Nicotiana tabacum) został wybrany, jako modelowa roślina do stabilnej transformacji ze względu na homologiczny układ transgen-roślina oraz ze względu na łatwość przeprowadzania procesu transformacji genetycznej tego gatunku.

Do transformacji użyto linii tytoniu o niskiej zawartości alkaloidów LA Burley 21 (Legg et al., 1970), z którego pozyskano sekwencję kodującą genu joka2. Nasiona (ofiarowane przez G.Collins, dostępne również z U.S. Department of Agriculture) zostały powierzchniowo wysterylizowane za pomocą wybielacza i skiełkowane in vitro na pożywce Murashige i Skoog'a (Murashige and Skoog, 1962). Po 2-3 tygodniach od wysiania nasion siewki transformowano zawiesiną bakterii Agrobacterium tumefaciens szczepu LBA 4404 zawierających plazmid pJ4 lub pJ5, które zostały uprzednio wprowadzone na drodze elektroporacji do komórek bakteryjnych. Zregenerowane transformaty oporne na antybiotyk kanamycynę lub hygromycynę przeanalizowano pod względem produkcji białka fuzyjnego JOKA2::YFP lub białka fuzyjnego JOKA2::CFP. Rośliny, w których zaobserwowano obecność białka za pomocą techniki western blot przeniesiono do warunków in vivo i hodowano w warunkach szklarniowych aż do pozyskania nasion poprzez samozapylenie. Obecność wprowadzonego konstruktu potwierdzano poprzez obserwację mikroskopową fluorescencji białka YFP lub CFP oraz za pomocą techniki western blot.

P r z y k ł a d III. Analiza lokalizacji subkomórkowej fuzji białkowej JOKA2::YFP w transgenicznych liniach tytoniu zawierających rekombinowaną molekułę DNA.

Spośród uzyskanych transformantów do dalszych analiz mikroskopowych wybrano linie J4-1 J4-2, J4-10, J5-1, J5-2, J5-3, J5-6. Nasiona linii J4 i J5 oraz linii kontrolnych, rodzicielskiej linii LA Burley 21 i linii AB5, produkującej wolne białko fluorescencyjne EGFP, wysiano do kolb zawierających demineralizowaną wodę, zbilansowaną pożywkę 0,5xHoagland lub pożywkę 0,5xHoagland pozbawioną jonów siarczanowych, w której zastąpiono MgSO4 równoważną molarną ilością MgCl2. Rośliny hodowano w ściśle określonych warunkach stosując cykl dnia długiego (16 h dzień/8 h noc) i temperaturę 24°C. Siewki poddawano analizie z wykorzystaniem mikroskopu konfokalnego Eclipse TE2000-E firmy Nicon po dziesiątym, siedemnastym i trzydziestym trzecim dniu od wysiania. Badania wskazują na występowanie białka JOKA2::YFP oraz białka JOKA2::CFP w dwóch kompartymentach komórkowych. Sygnał fluorescencji obserwowano w jądrze komórkowym i w kwaśnych cytoplazmatycznych strukturach globularnych przypominających autofagosomy (fig. 2). Lokalizację białka JOKA2::YFP w autofagosomach (panel A) oraz w jądrze komórkowym (panel B) potwierdzano stosując dwa barwniki fluorescencyjne lokalizujące się w wyżej podanych strukturach komórkowych i obserwując koIokaIizację sygnału fluorescencji pochodzącego z białka fuzyjnego i poszczególnych barwników fluorescencyjnych. Do wybarwienia jądra komórkowego zastosowano barwnik DAPI rozpuszczony w DMSO w stężeniu 0,1 μg/ml.

Do wybarwienia kwaśnych struktur wykorzystano Oranż Akrydyny (AO) rozpuszczony w wodzie w stężeniu 1 μg/ml, znany w literaturze, jako barwnik służący do identyfikacji autofagosomów w komórkach zwierzęcych. Barwienie przeprowadzano przez 15 minut w całkowitej ciemności, po czym siewki trzykrotnie płukano w destylowanej wodzie w celu obniżenia tła fluorescencji. Kwaśne struktury wybarwiane AO obserwowano tylko w siewkach produkujących białka fuzyjne, w przeciwieństwie do siewek linii kontrolnych. Na fig. 3 przedstawiono lokalizację białka JOKA2::YFP w linii J4-1, jako typową i reprezentacyjną lokalizację białka fuzyjnego w komórkach roślinnych charakterystyczną dla wszystkich badanych linii J4 i J5. Niezależnie od warunków i wieku siewek nie zaobserwowano zmian w lokalizacji fluorescencji w częściach nadziemnych. W korzeniu natomiast przeciwnie, w zależności od wieku siewek i stosowanej pożywki lokalizacja JOKA2::YFP lub JOKA2::CFP ulegała zmianie. Sygnał fluorescencyjny początkowo był obserwowany w postaci licznych i drobnych punktów rozsianych

PL 217 837 B1 w cytoplazmie komórki, następnie lokalizowany był w jednej bądź dwóch większych strukturach globularnych by ostatecznie w najstarszych siewkach wniknąć do jądra komórkowego.

P r z y k ł a d IV. Szybszy wzrost w warunkach optymalnych oraz mniejsza wrażliwość transformantów tytoniu produkujących fuzję białkową JOKA2::YFP na niedobór związków mineralnych.

Dokładne obserwacje pokolenia T1 (potomstwa pierwotnych transformantów) ujawniły występowanie różnic fenotypowych między transformantami zawierającymi białko fuzyjne JOKA2::YFP lub JOKA2::CFP, a roślinami kontrolnymi, czyli linią rodzicielską LA Burley 21 lub też transformantami produkującymi wolne białko fluorescencyjne EGFP, linia AB5. Rośliny transgeniczne produkujące białko fuzyjne cechowały się w optymalnym podłożu (na przykład Murashige i Skoog'a) lepszym wzrostem niż siewki kontrolne, na przykład nietransformowane lub produkujące wolne EGFP. Różnice te szczególnie widoczne były w części naziemnej siewek co przedstawiono na fig. 4. Ponadto kiełkowanie wyżej opisanych roślin w wodzie bez dodatku soli mineralnych dodatkowo ujawniło widoczne różnice w szybkości zachodzenia procesu chlorozy. Różnice te potwierdzono poprzez zbadanie poziomu chlorofilu a i b ekstrahowanego za pomocą 96% etanolu u dwutygodniowych siewek (fig. 5) skiełkowanych w sterylnej demineralizowanej wodzie w warunkach opisanych w przykładzie III. Wyniki wskazują na zdecydowanie mniejszą wrażliwość roślin produkujących białka JOKA2::YFP lub JOKA2::CFP na niedobór składników mineralnych w porównaniu z roślinami kontrolnymi. Ponadto określono masę 200 nasion roślin dzikich i transgenicznych w celu wyeliminowania wpływu zawartości składników zapasowych w nasionach na ich zdolność kiełkowania i wzrostu siewek. Uzyskane wartości, które wynoszą 14,87±0,23 mg dla linii rodzicielskiej LA Burley 21, 14,±0,66 mg dla linii kontrolnej AB5 oraz, przykładowo, 14,17±1,83 dla linii J4-1 nie wskazują na to aby rośliny zawierające białko fuzyjne posiadały zwiększoną ilość materiału zapasowego, co mogłoby wpływać na lepszy wzrost siewek.

P r z y k ł a d V. Mniejsza wrażliwość transformantów tytoniu produkujących fuzję białkową JOKA2::YFP na niekorzystne warunki środowiskowe.

Rosnące w ziemi w warunkach długiego dnia (23°C/19°C; 16/8 h; światło/ciemność) 3-tygodniowe rośliny linii J4-1 oraz dwóch linii kontrolnych, czyli linii rodzicielskiej LA Burley 21 przeniesiono do podwyższonej temperatury 42-45°C (16/8 h; światło/ciemność). Po kilku dniach zaobserwowano, że liście transgenicznych roślin produkujących białko JOKA2::YFP (linia J4-1) były bardziej zielone (wykazywały mniej objawów starzenia się) niż liście roślin kontrolnych. Na fig. 6 pokazano fenotyp roślin rosnących przez 5 dni w podwyższonej temperaturze.

PL 217 837 B1

LITERATURA

Behrends C, Sowa ME, Gygi SP, Harper JW. 2010. NetWork organization of the human autophagy system. Nature 466, 68-76.

Diaz-Troya S, Perez-Perez ME, Florencio FJ, Crespo JL. 2008. The role of TOR in autophagy regulation from yeast to plants and mammals, Autophagy 4, 851-865.

Doelling JH, Walker JM, Friedman EM, Thompson AR, Vierstra RD. 2002. The APG8/12-activating enzyme APG7 is required for proper nutrient recycling and senescence in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 277, 33105-33114.

Du Y, Wooten MC, Gearing M, Wooten MW. 2009a. Age-associated oxidative damage to the p62 promoter: implications for Alzheimer disease. Free Radie Biol Med 46, 492-501.

Du Y, Wooten MC, Wooten MW. 2009b. Oxidative damage to the promoter region of SQSTMl/p62 is common to neurodegenerative disease. Neurobiol Dis 35, 302-310.

Inoue Y, Suzuki T, Hattori M, Yoshimoto K, Obsumi Y, Moriyasu Y, 2006. AtATG genes, homologs of yeast autophagy genes, are involved in constitutive autophagy in Arabidopsis root tip cells. Plant Celi Physiol 47,1641-1652.

Ishida H, Yoshimoto K, Izumi M, Reisen D, Yano Y, Makino A, Ohsumi Y, Hanson MR, Mae T.

2008. Mobilization of rubisco and stroma-localized fluorescent proteins of chloroplasts to the vacuole by an ATG gene-dependent autophagic process. Plant Physiol 148, 142-155.

Jo EK. 2010. innate immunity to mycobacteria: vitamin D and autophagy. Celi Microbiol 12, 1026-1035. Karimi M, Inze D, Depicker A. 2002. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci 7, 193-195.

Kirkin V, Lamark T, Johansen T, Dikic I. 2009a. NBR1 cooperates with p62 in selective autophagy of ubiquitinated targets. Autophagy 5, 732-733.

Kirkin V, McEwan DG, Novak I, Dikic I. 2009b. A role for ubiquitin in selective autophagy. Mol Celi 34, 259-269.

Klionsky DJ. 2007. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat Rev Mol Celi Biol 8, 931-937.

Klionsky DJ, Codogno P, Cuervo AM, Deretic V, Elazar Z, Fueyo-Margareto J, Gewirtz DA, Kroemer G, Levine B, Mizushima N, Rubinsztein DC, Thumm M, Tooze SA. 2010. A comprehensive glossary of autophagy-related molecules and processes. Autophagy 6.

Komatsu M, Ichimura Y. 2010. Physiological significance of selective degradation of p62 by autophagy. FEBSLett 584, 1374-1378.

Komatsu M, Kurokawa H, Waguri S, Taguchi K, Kobayashi A, Ichimura Y, Sou YS, Ueno 1, Sakamoto A, Tong KI, Kim M, Nishito Y, lemura S,· Natsume T, (Jeno T, Kominami E, Motohashi H, Tanaka K, Yamamoto M. 2010. The selective autophagy substrate p62 activates the stress responsive transcription factor Nrf2 through inactivation of Keapl. Nat Celi Biol 12, 213-223. .

Komatsu M, Waguri S, Koike M, Sou YS, Ueno T, Hara T, Mizushima N, Iwata J, Ezaki J, Murata S, Hamazaki J, Nishito Y, lemura S, Natsume T, Yanagawa T, Uwayama J, Warabi E, Yoshida H, Ishii T, Kobayashi A, Yamamoto M, Yue Z, Uchiyama Y, Kominami E, Tanaka K. 2007. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagydeficient mice. Celi 131, 1149-1163.

Larsen KB, Lamark T, Overvatn A, Harneshaug I, Johansen T, Bjorkoy G. 2010. A reporter celi system to monitor autophagy based on p62/SQSTM I. Autophagy 6, 784-793.

Legg PD, Collins GB, Litton CC. 1970. Registration of LA Burley 21 tobacco germplasm. Crop Sci 10, 212.

Linthorst HJ, Brederode FT, van der Does C, Boi JF. 1993. Tobacco proteinase inhibitor 1 genes are locally, but not systemically induced by stress. Plant Mol Biol 21,985-992.

Liu Y, Schiff M, Czymmek K, Talloczy Z, Levine B, Dinesh-Kumar SP. 2^)05. Autophagy regulates programmed celi death during the plant innate immune response. Celi 121, 567-577.

PL 217 837 B1

Mathew R, Karp CM, Beaudoin B, Vuong N, Chen G, Chen HY, Bray K, Reddy A, Bhanot G, Gelinas C, Dipaola RS, Karantza-Wadsworth V, White E. 2009. Autophagy suppresses tumorigenesis through elimination of p62. Celi 137, 1062-1075.

Melendez A, Neufeld TP. 2008. The celi biology of autophagy in metazoans: a developing story. Development 135, 2347-2360.

Moreau K, Luo S, Rubinsztein DC. 2010. Cytoprotective roles for autophagy. Curr Opin Celi Biol 22, 206-211.

Moriyasu Y, Hattori M, Jauh GY, Rogers JC. 2003. Alpha tonoplast intrinsic protein is specificaily associated with vacuole membranę involved in an autophagic process. Plant Celi Physiol 44, 795802.

Murashige T, Skoog F. 1962, A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15,473-493.

Nakatogawa H, Suzuki K, Kamada Y, Ohsumi Y. 2009. Dynamics and diversity in autophagy mechanisms: lessons from yeast. Nat Rev Mol Celi Biol 10,458-467.

Pankiv S, Clausen TH, Lamark T, Brech A, Bruun JA, Outzen H, Overvatn A, Bjorkoy G, Johansen T. 2007. p62/SQSTMI binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy. J Biol Chem 282, 24131-24145.

Patel S, Dinesh-Kumar SP. 2008. Arabidopsis ATG6 is required to limit the pathogen-associated celi death response. Autophagy 4,20-27.

Phillips AR, Suttangkakul A, Vierstra RD. 2008. The ATG12-conjugating enzyme ATG10 Is essential for autophagic vesicle formation in Arabidopsis thaliana. Genetics 178, 1339-1353.

Reumann S, Voitsekhovskaja O, Lilio C. 2010. From signal transduction to autophagy of plant celi organelles: lessons from yeast and mammals and plant-specific features. Protoplasma.

Thompson AR, Doelling JH, Suttangkakul A, Vierstra RD. 2005. Autophagic nutrient recycling in Arabidopsis directed by the ATG8 and ATG12 conjugation pathways. Plant Physiol 138, 20972110.

Thompson AR, Vierstra RD. 2005. Autophagic recycling: lessons from yeast help define the process in plants. Curr Opin Plant Biol 8, 165-173.

Wada S, Ishida H, Izumi M, Yoshimoto K, Ohsumi Y, Mae T, Makino A. 2009. Autophagy plays a role in chloroplast degradation during senescence in individually darkened leaves. Plant Physiol 149,885-893.

Walsh CM, Edinger AL, 2010. The coniplex interplay between autophagy, apoptosis, and necrotic signals promotes T-cell homeostasis. Immunol Rev 236, 95-109.

Xiong Y, Contento AL, Nguyen PQ, Bassham DC. 2007. Degradation of oxidized proteins by autophagy during oxidative stress in Arabidopsis. Plant Physiol 143,291-299.

Yang Z, Klionsky DJ. 2010. Mammalian autophagy: core molecular machinery and signaling regulation. Curr Opin Celi Biol 22, 124-131.

Yoshimoto K, Hanaoka H, Sato S, Kato T, Tabata S, Noda T, Ohsumi Y. 2004, Processing of ATG8s, ubiquitin-like proteins, and their deconjugation by ATG4s are essential for plant autophagy. Piani Celi 16, 2967-2983.

Yoshimoto K, Jikumaru Y, Kamiya Y, Kusano M, Consonni C, Panstruga R, Ohsumi Y, Shirasu K. 2009. Autophagy negatively regulates celt death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Celi 21, 29142927.

Yoshimoto K, Takano Y, Sakai Y. 2010. Autophagy in plants and phytopathogens. FEBS Lett 584, 1350-1358.

PL 217 837 B1 seq. listing.ST25 . SEQUENCE LISTING <110> instytut Biochemii i Biofizyki pan Zientara-Rytter, Katarzyna Sirko, Agnieszka

Liszewska, Frantz Liszewska, Frantz Łukomska, Jolanta Wawrzyńska, Anna Moniuszko, Grzegorz <120> A recombinant dna molecule, expression cassette, dna vector, binary plasmid, plant celi, a method of polypeptide production in eukaryotic organism and use thereof <130> 11484/10 <140> PCT/PL2011/00000 <141> 2011-10-27 <150> PL392772 <151> 2010-10-27 <160> 1 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 2532 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 1

atggctatgg	agtctgctat	tgtgatcaag	gtcaagtatg	aagagacact	caggcgattc	60
aatgctcgtg	tcatcaatga	gaaacttgat	cttaacatgg	atggattaag	tgacaagatc	120
tttcaacttt	tcaacattgc	tcgtgatgct	gaactcatac	taacatatgt	tgatgaggat	180
ggcgatgtag	ttacacttgt	tgatgatgag	gatctgcagg	acgttatgag	gcaggacctg	240
aatcccttgc	gaatatctgt	gaggttgaat	gctgccgaaa	gaagtagcag	gccttcatct	300
agatctagtg	gaagttctac	tcccttacga	tcacctcggg	ttcagcctcc	atttccaaac	360
ttgaattcca	ctgtttctga	tgctctcaag	tccgtgccag	aacctctgcg	tgaaactgta	420
atgaagctct	attctgacct	gacttcaagg	gcctcatcct	ctgctccaat	ccttgctgag	480
cttgttgatg	gtatctctaa	gatggggcta	tcctactacc	agaatcatcc	ttcagggtct	540
cagcctgtca	aagaaacaag	cttccctagt	ggagcatcta	atgaaaatac	tatggttgct	600
gatggaggca	attcaaatgg	taaaagtggg	gtgccatcca	taaagaagaa	cgagccccac	660
acagccctga	atgatgcagg	gagaacggct	aaagctatag	aatcagaatt	caattatgtg	720
gatgatgcgc	tagatgcctg	ggtcaagcta	agatctaaat	caaatgcttt	ggaagctgat	780
caaactgaaa	ctgcgccatc	gtcatccaaa	ggtcctaatg	ctcacacatt	gctggtaaat	840
agtggggagg	agaaggataa	gaaatttggt	gcttgtcctg	gtggaaagcc	tcttgccttc	900
tcacataata	gtgcctcacc	tgttccacca	gaaaagcctt	ctggggagaa	gcccagcaag	960
aatcattctg	tagctaagcc	cgttgatatg	ggtggctctg	caagttttgg	caaattgaaa	1020
aaatgcatct	gggattcccg	taatgcagat	tccagtggca	gttctatcaa	gatgcctact	1080

PL 217 837 B1 seq. 1isting.ST25

ttacgcctag	ttccggtccc	tgcgaatgaa	tgtccatttc	cccaggtgcc	aaagaacgct	1140
tcacgtctag	ttcaggttcc	tgcaaatgag	tgtccatttt	ccggggtgcc	aaacgaccct	1200
gtcccacctc	ctcttgaggt	cccacttaaa	aggagtcata	atcacagtga	tgggactggg	1260
actattttcc	acagaggtgt	tcgttgtgat	ggttgtggtg	ttcatccaat	aactggccct	1320
agattcatat	ctaaagtaca	ggagaactat	gatctctgca	gcatatgctt	tgctgaaatg	1380
ggaaatgatg	ctgattacat	cagaatggat	cgtcctttaa	cttaccggca	tcccttgtct	1440
ttcaagggtt	tacatgatct	gcatgctgcg	aggtttcgta	tcccaactgt	tccacatgtc	1500
tctcgaggct	atggggtgaa	accaggtcgg	ccaaagctgg	acagccgctt	catacaggat	1560
gtcaatatcc	tggatggaac	catcatggct	cccttgactc	gatttaccaa	gatctggaga	1620
atgaggaata	atggtaacct	tgtctggcct	caaggaactc	aacttgtttg	gattggggga	1680
gataggttaa	gtgataaatt	ctctgttgaa	ttagagataa	ctacagcttg	cttggctgtt	1740
gacaaggagc	ttgatgtgac	agttgatttt	actgctcctg	tgcatcctgg	taggtacata	1800
tcctactgga	ggatggcttc	gtcttcaggg	cagaaatttg	gccagcgtgt	atgggtgctt	1860
atccaggtcg	atgcttcatc	aaaccttcca	aaaaaggagt	tggtccacga	agcctttcag	1920
gggttaaact	tgaatttacc	tcctgccggc	gatggcgcat	ctggatctga	cattgtcaat	1980
gtgaatccag	aacctcagaa	tgtccttcct	gagcctaaga	gctctagcac	aacgatagag	2040
ttggttgatt	cagtgactga	tgtacaccag	aacaaggagc	aggaggccat	atttcctact	2100
aatgatagct	tgttggttgg	atttggtgac	aagtcaagtt	cttctgctcc	cggttcatca	2160
atttcatate	caattattga	tttgtctgag	gaagcaccag	cagttacttg	tgtggtacca	2220
tccgctgctg	tagatacgca	ggcaccaccc	cagggtgtta	gagggaataa	cgaaattgag	2280
acgtccctcc	tccgtgagct	ggaggaaatg	gggttcaagc	aggtggatct	gaacaaggaa	2340
atcttgagga	agaatgagta	tgacttggag	cagtctgttg	atgatctctg	tggtgttgct	2400
gagtgggatc	ctatcctcga	agagctggag	gaggtgggtt	tctccgacaa	agaaatgaac	2460
aaggagctgc	ttaagaagaa	caaaggaagc	atcaagcgtg	ttgtcatgga	tcttattgct	2520
ggagagcagt	ag					2532

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Rekombinowana molekuła DNA, zawierająca cząsteczkę kwasu nukleinowego, określonego sekwencją SEQ. ID nr 1, kodująca białko z rodziny JOKA2/p62 lub jego charakterystyczne domeny.
2. Rekombinowana molekuła według zastrz. 1, znamienna tym, że kodowane przez nią białko z rodziny JOKA2/p62 stanowi białkowy czynnik wybrany spośród grupy obejmującej czynniki wprowadzające zwiększoną oporność na niekorzystne warunki abiotyczne i/lub na niedobór związków odżywczych względem roślin rodzicielskich.
3. Rekombinowana molekuła według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że sekwencja kodująca białko z rodziny JOKA2/p62 określona sekwencją SEQ. ID nr 1 jest połączona funkcjonalnie z sekwencją nukleotydową kodującą białko markerowe, wybrane korzystnie z grupy białek fluorescencyjnych.

PL 217 837 B1
4. Rekombinowana molekuła według zastrz. 3, znamienna tym, że uzupełniona jest o dodatkowy marker połączony funkcjonalnie z białkiem z rodziny JOKA2/p62, który zapewnia przyżyciowe monitorowanie produkcji i lokalizacji białka z rodziny JOKA2/p62.
5. Rekombinowana molekuła według zastrz. 3, znamienna tym, że grupę białek fluorescencyjnych stanowią białka YFP lub CFP.
6. Kaseta ekspresyjna zawierająca rekombinowaną molekułę określoną zastrzeżeniami 1 do 5 funkcjonalnie połączoną z elementami regulatorowymi, które zapewniają stabilną lub przejściową ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego w komórce roślinnej.
7. Wektor DNA, plazmidowy lub wirusowy, zawierający kasetę ekspresyjną zawierającą co najmniej jedną rekombinowaną molekułę DNA określoną zastrzeżeniami 1 do 5.
8. Plazmid binarny zawierający kasetę ekspresyjną zawierającą co najmniej jedną rekombinowaną molekułę DNA określoną zastrzeżeniami 1 do 5, znamienny tym, że zawiera marker, korzystnie z grupy markerów warunkujących oporność na antybiotyk, który zapewnia pozytywną selekcję komórek roślinnych posiadających wbudowaną do genomu rekombinowaną molekułę DNA.
9. Komórka roślinna zawierająca rekombinowaną molekułę określoną zastrzeżeniami od 1 do 5.
10. Sposób otrzymywania polipeptydu w eukariotycznym gospodarzu, znamienny tym, że do genomu rośliny - gospodarza, wprowadza się materiał genetyczny stanowiący rekombinowaną molekułę DNA określoną zastrzeżeniami 1 do 5.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że prowadzi się izolację i namnożenie cząsteczki DNA kodującej białko z rodziny JOKA2/p62, a następnie wprowadza się ją do plazmidu przejściowego, po czym przenosi się sekwencję joka2 do plazmidu binarnego zawierającego pozostałe składniki roślinnej kasety ekspresyjnej, następnie przenosi się roślinną kasetę ekspresyjną z wektora plazmidowego do genomu wybranej rośliny, po czym regeneruje się i selekcjonuje transgeniczne rośliny zdolne do produkcji białka z rodziny JOKA2/p62 w fuzji z białkiem markerowym lub bez białka markerowego.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się materiał genetyczny w postaci plazmidu binarnego, korzystnie uzupełniony o marker, który zapewnia pozytywną selekcję komórek roślinnych posiadających wbudowaną do genomu rekombinowaną molekułę DNA.
13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że plazmid uzupełnia się o dodatkowy marker połączony funkcjonalnie z białkiem z rodziny JOKA2/p62, który zapewnia przyżyciowe monitorowanie produkcji i lokalizacji białka z rodziny JOKA2/p62.
14. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że do wprowadzenia rekombinowanej molekuły DNA stosuje się dowolną znaną metodę wprowadzania materiału genetycznego do komórek roślinnych i uzależnia się go od gatunku rośliny - gospodarza, przy czym zapewnia się stabilną integrację fragmentu DNA do genomu gospodarza.
15. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że do wprowadzenia rekombinowanej molekuły DNA stosuje się dowolną znaną metodę wprowadzania materiału genetycznego do komórek roślinnych i uzależnia się go od gatunku rośliny - gospodarza, przy czym zapewnia się przejściową ekspresję kasety ekspresyjnej określonej zastrzeżeniem 6.
16. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że uzyskuje się transgeniczne rośliny o zwiększonej wydajności przyswajania związków mineralnych, lepszym wzroście i zwiększonej oporności na niedobór związków mineralnych i inne stresy abiotyczne względem roślin rodzicielskich (dzikiego typu).
17. Zastosowanie rekombinowanej molekuły DNA określonej zastrzeżeniami 1 do 5 do konstrukcji wektora, który zapewnia produkcję białka z rodziny JOKA2/p62 w komórce roślinnej.
18. Zastosowanie według zastrz. 17, w którym otrzymane rośliny nadprodukują białko z rodziny JOKA2/p62 jako białko fuzyjne lub niefuzyjne i wskazują zwiększoną wydajność przyswajania związków mineralnych, lepszy wzrost i zwiększoną oporność na niedobór związków mineralnych i inne stresy abiotyczne względem roślin rodzicielskich (dzikiego typu).
19. Zastosowanie według zastrz. 17, w którym otrzymane rośliny nadprodukują białko fuzyjne lub niefuzyjne i posiadają zwiększony poziom białka z rodziny JOKA2/p62, które mogą zostać użyte do wyznakowania autofagosomów oraz do monitorowania procesu autofagii.