PL218076B1 - Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych - Google Patents

Abstract

Sposób polega na tym, że immunoglobulinę Y, poddaje się dializie wobec buforu fosforanowego, po czym dializat klaruje się i zagęszcza na membranie o przepuszczalności granicznej poniżej 3 kDa, a otrzymany retentat poddaje się chromatografii sitowo-molekularnej zbierając grupę niskocząsteczkowych białek oddzielonych od immunoglobuliny Y, zwaną Yolkiną. Alternatywnie dializat poddaje się ultrafiltracji przez membrany o przepuszczalności granicznej poniżej 50 kDa, po czym permeat zagęszcza się ultrafiltrując przez membrany o przepuszczalności granicznej poniżej 3 kDa. Następnie frakcje białek zwolnione z kompleksu z IgY, poddaje się dializie do wody przez błony o przepuszczalności granicznej poniżej 3 kDa w temperaturze w warunkach chłodniczych przez okres co najmniej 24 godzin z kilkukrotną zmianą wody. Alternatywnie frakcje białek odsala się z użyciem modułów ultrafiltracyjnych o przepuszczalności granicznej 1 kDa i poddaje suszeniu, uzyskując preparat o właściwościach immunoregulatorowych. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym, do produkcji nutraceutyków i produktów farmakologicznych.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny.

Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym.

Z opisu patentowego nr PL 185442, znany jest sposób otrzymywania polipteptydu Colostrinin, wykazującego właściwości immunoregulatorowe. Polega on na wydzieleniu peptydu z siary owiec. Otrzymaną siarę, po odwirowaniu przy 35 000 x g, traktowano DEAE Sephadex'em, w celu izolacji immunoglobulin IgG2. W metodzie tej, do oczyszczenia, wymagane jest stosowanie chromatografii powinowactwa na Sepharose, skoniugowanej z przeciwciałem anty IgG2 owiec. Metoda ta jest droga i czasochłonna.

Istotą sposobu według wynalazku jest to że, Immunoglobuline, którą jest immunoglobulina Y, poddaje się dializie wobec buforu fosforanowego o stężeniu nie niższym niż 50 mM, o pH od 7,0 do 7,4, z kilkukrotną zmianą buforu, przez co najmniej 48 godzin, po czym dializat klaruje się i zagęszcza na membranie o przepuszczalności granicznej poniżej 3 kDa. Otrzymany retentat poddaje się chromatografii sitowo-molekularnej, zbierając grupę niskocząsteczkowych białek oddzielonych od immunoglobuliny Y, będących fragmentami C-końcowej domeny głównego białka żółtka - witellogeniny. Tę grupę białek nazwano Yolkiną. Alternatywnie dializat poddaje się ultrafiltracji przez membrany o przepuszczalności granicznej poniżej 50 kDa, po czym permeat zagęszcza się ultrafiltrując przez membrany o przepuszczalności granicznej poniżej 3 kDa. Następnie frakcje białek (Yolkina) zwolnione z kompleksu z IgY, poddaje się dializie do wody przez błony o przepuszczalności granicznej poniżej 3 kDa w temperaturze w warunkach chłodniczych przez okres co najmniej 24 godzin z kilkukrotną zmianą wody. Alternatywnie frakcje białek odsala się z użyciem modułów ultrafiltracyjnych o przepuszczalności granicznej 1 kDa i poddaje suszeniu, uzyskując preparat o właściwościach immunoregulatorowych.

Korzystnie jest gdy stężenie buforu fosforanowego wynosi 100 mM.

Dodatkowo, korzystnie jest gdy pH buforu wynosi 7,2.

Aby zwiększyć efekt związany z dializą, korzystnie jest gdy temperatura wody lub buforu fosforanowego wynosi 273-277 K.

Korzystnie także jest gdy frakcje białek suszy się poprzez liofilizację.

Frakcje białek, otrzymane sposobem według wynalazku, wykazują właściwości immunoregulatorowe i są mocnym induktorem wydzielania kluczowych dla układu immunologicznego cytokin.

Do wykazania immunotropowej aktywności frakcji białkowych otrzymanych sposobem według wynalazku wykorzystano model ex vivo, w którym na pełnej krwi obwodowej przebadano jego wpływ na poziom wydzielanych przez komórki wybranych cytokin.

Zaletą wynalazku jest prostota i taniość sposobu otrzymywania frakcji białek wykazujących aktywność immunoregulatorową.

Przedmiot wynalazku przedstawiono poniżej w przykładach realizacji, które maja na celu ilustracje wynalazku.

P r z y k ł a d 1 Dokładnie oddzielone od białek żółtka, homogenizuje się przez 15 sekund i uzyskaną masę żółtkową, po schłodzeniu do temperatury 277K, rozcieńcza się zimną wodą destylowaną 10-krotnie, następnie 30% kwasem octowym zakwasza się do pH 5,0 i pozostawia w temperaturze 253K na 24 godziny. Mieszaninę po rozmrożeniu wiruje się przez 30 min. w temperaturze 277K przy 1500 x g. Osad odrzuca się a do supernatantu dodaje się węgla aktywnego do końcowego stężenia 0,01% i po obniżeniu pH do 4,0 delikatnie miesza się przez 30 min. i ponownie wiruje j/w. Supernatant dodatkowo klaruje się sącząc go przez bibułę filtracyjną (Whatman 1). Otrzymany filtrat doprowadza się roztworem 2M NaOH do pH 9,0 i wolno mieszając, wysala do 0,4 nasycenia siarczanem amonu w 277K. Po 16 godzinach osad zbiera się przez wirowanie (1500 x g, 10 min., 277K) i zawiesza w małej objętości wody. Zawiesinę poddaje się dializie wobec 100 mM buforu fosforanowego o pH 7,2 w 277K zmieniając go kilkakrotnie w ciągu 48 godzin. Dializat klaruje się przez wirownie i zagęszcza na membranie o przepuszczalności granicznej poniżej 3 kDa. Otrzymany retentat poddaje się chromatografii sitowo-molekularnej na kolumnie Sephacryl S-100 HR. Frakcje białek niskocząsteczkowych oddzielonych od IgY łączy się, dializuje wobec wody i liofilizuje.

Ze 100 ml żółtek uzyskuje sie 114 mg preparatu Yolkiny.

P r z y k ł a d 2 Postępuje się jak w przykładzie 1, z tym, że dializat uzyskany po dializie wobec 100 mM buforu fosforanowego o pH 7,2, po zagęszczeniu poddaje się ultrafiltracji na Amiconie przez membranę o przepuszczalności granicznej 50 kDa. Białka permeatu odsala się na membranie o przepuszczalności granicznej 1 kDa i liofilizuje.

Ze 100 ml żółtek uzyskuje się około 12,5 mg preparatu Yolkina.

Claims (5)

1. Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych, z immunoglobuliny znamienny tym, że immunoglobuliną jest immunoglobulina Y, którą poddaje się dializie wobec buforu fosforanowego o stężeniu nie niższym niż 50 mM, o pH od 7,0 do 7,4, z kilkukrotną zmianą buforu, przez co najmniej 48 godzin, po czym dializat klaruje się i zagęszcza na membranie o przepuszczalności granicznej poniżej 3 kDa a otrzymany retentat poddaje się chromatografu sitowo-molekularnej zbierając grupę niskocząsteczkowych białek oddzielonych od immunoglobuliny Y, będących fragmentami C-końcowej domeny głównego białka żółtka - witellogeniny, alternatywnie dializat poddaje się ultrafiltracji przez membrany o przepuszczalności granicznej poniżej 50 kDa, po czym permeat zagęszcza się ultrafiltrując przez membrany o przepuszczalności granicznej poniżej 3 kDa a następnie frakcje białek zwolnione z kompleksu z IgY poddaje się dializie do wody przez błony o przepuszczalności granicznej poniżej 3 kDa w temperaturze w warunkach chłodniczych przez okres co najmniej 24 godzin z kilkukrotną zmianą wody, alternatywnie frakcje białek odsala się z użyciem modułów ultrafiltracyjnych o przepuszczalności granicznej 1 kDa i poddaje suszeniu.

2. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się stężenie buforu fosforanowego o wartości 100 mM.

3. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pH buforu na poziomie 7,2.

4. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że dializę przeprowadza się przy temperaturze wody lub buforu fosforanowego od 273 do 277 K.

5. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcje białek suszy się poprzez liofilizację.