PL218313B1 - Kompetytywna metoda otrzymywania preparatów bakteriofagowych - Google Patents
Kompetytywna metoda otrzymywania preparatów bakteriofagowychInfo
- Publication number
- PL218313B1 PL218313B1 PL392774A PL39277410A PL218313B1 PL 218313 B1 PL218313 B1 PL 218313B1 PL 392774 A PL392774 A PL 392774A PL 39277410 A PL39277410 A PL 39277410A PL 218313 B1 PL218313 B1 PL 218313B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacteriophage
- phage
- protein
- lysate
- affinity
- Prior art date
Links
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 title description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 238000002823 phage display Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 22
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 12
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 abstract description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 abstract description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 abstract description 9
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 abstract 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 28
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 16
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 13
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 101150099050 WAC gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 101100484977 Danio rerio waca gene Proteins 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 2
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102100037373 DNA-(apurinic or apyrimidinic site) endonuclease Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088570 Flagellar hook-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/00051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania bakteriofagów prezentujących na swojej powierzchni obce peptydy lub białka bez konieczności ingerencji w genom fagowy i bez konieczności zastosowania szczepów fagowych defektywnych pod względem wybranych genów (metoda nie wymaga użycia szczepów modyfikowanych genetycznie). Uzyskane preparaty bakteriofagowe mogą znaleźć liczne zastosowania, zwłaszcza w oczyszczaniu bakteriofagów w celu wytwarzania produktów wymagających wysokiej czystości takich jak produkty lecznicze, oraz w wytwarzaniu bakteriofagów prezentujących wybrane peptydy lub białka w innych celach, np. w produkcji szczepionek.
W cyklu litycznym w trakcie terapii bakterie zostają zniszczone przez namnażające się w nich bakteriofagi. Do środowiska uwalniane są potomne, zwielokrotnione w liczbie cząsteczki bakteriofagów, które lizują następne populacje bakterii.
W przypadku produkcji lizatów bakteriofagowych do celów biotechnologicznych znaczenie ma nie tylko liczba potomnych cząsteczek fagowych ale i uwalniane do środowiska elementy budulcowe bakterii, takie jak kwasy nukleinowe, białka i składniki ściany komórkowej. Ściana bakterii Gram ujemnych zbudowana jest z w istotnym ułamku (nawet do 70%) z lipopolisacharydów (nazywanych pirogenami, endotoksynami), peptydoglikanów i białek.
Efektywne usunięcie pirogenów a także aktywnych białek z lizatów bakteryjnych jest kluczowym wymogiem otrzymywania preparatów bakteriofagowych dedykowanych terapii zakażeń bakteryjnych. Endotoksyny są silnymi stymulatorami układu immunologicznego indukując produkcję interleukin, TNF, NO, itd.
Procedury usuwania lub izolacji endotoksyn bazują na ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi jak na przykład wodnym roztworem fenolu Westphal O., Lueritz O., Bister F. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol/wasser. Z. Naturforsch. 7: 148-155, 1952), mieszaniną kwasów i amin alifatycznych (Patent application Publicatiom US 2007/0020292A1), metodami ekstrakcyjnymi i chromatograficznymi (Patent Application publication US 2007/0031447A1). Oczyszczanie preparatów biologicznych z endotoksyn przeprowadzano wykorzystując interakcje jonów metali z białkami (patent US 6,942,802 B2 Sep. 13, 2005; WO02083710A1; WO04003215A1), przez precypitację endotoksyn alkoholem i dwuwartościowymi przeciwjonami (US 5039610). Zastosowanie dwuwartościowych jonów w kombinacji z alkoholami, żywicami i detergentami jest przedmiotem wielu patentów na przykład EPO 407037B1. Do usuwania endotoksyn wykorzystywano białka izolowane z limfy kraba (US 5760177). Opisano wiele metod chromatografii kolumnowej. Wykorzystuje się w nich powinowactwo lipopolisacharydu do zasadowych haptenów takich jak polimysksyna (Petsch D, Beeskow TC, Anspach FB, Deckwer WD, (1997) Membrane adsorbers for selective removal of bacterial endotoxin. J. Chromatogr B Biomed Sei Appl. 693(1):79-91), złoże oparte na krzemianie wapnia (Hang JP, Wang Q, Smith TR, Hurst WE, Sulpizio T, (2005) Endotoxin removal using a synthetic adsorbent of crystalline calcium silicate hydrate. Biotechnol Prog. 21(4):1220-5), polimery syntetyczne (Hirayama Ch, Sakata M, (2002) Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles. Journal of Chromatography B, 781:419-432) lub złoża polianionowe (Boratyński J, Syper D, Weber-Dąbrowska B, Łusiak-Szelachowska M, Poźniak G, Górski A. Preparation of endotoxin-free bacteriophages Cell Mol Biol Lett. 2004; 9(2):253-9).
Nadal istnieje zapotrzebowanie na dostarczenie sposobu oczyszczania lizatów bakteriofagowych, zwłaszcza z endotoksyn, który mógłby być wykorzystany do przemysłowej produkcji preparatów bakteriofagowych przeznaczonych do stosowania w leczeniu zakażeń bakteryjnych występujących u ludzi.
Wyjściowe miana nieoczyszczonych lizatów mogą zawierać LPS o aktywności 104-105. Pomimo mnogości opisanych metod oczyszczania lizatów bakteriofagowych, nie spełniają one w stopniu dostatecznym wymogów stawianych przed sposobami przemysłowej produkcji preparatów o wskazanym powyżej przeznaczeniu.
Metoda prezentacji dowolnych białek lub peptydów na kapsydzie bakteriofagowym: phagedisplay opiera się na (i) wprowadzaniu genów kodujących te białka lub peptydy do genomu bakteriofagowego (tworzenie GMO) lub (i) wykorzystaniu szczepu bakteriofagowego defektywnego pod względem wybranego genu kodującego białko nieesencjonalne dla bakteriofaga a następnie suplementacji tego braku z użyciem rekombinowanych białek ekspresjonowanych z konstrukcji wektorowych, zwykle w systemie bakteryjnym (tworzenie szczepu z delecją wybranego genu). W obu przypadkach prezentacja białek lub peptydów wymaga wcześniejszych modyfikacji genetycznych szczepu stanowiącego platformę prezentującą.
PL 218 313 B1
Nieoczekiwanie sposób spełniający wymogi stawiane przed sposobami przemysłowej produkcji oczyszczonych preparatów fagowych w celach leczniczych, a jednocześnie umożliwiający prezentację obcych peptydów lub białek na kapsydzie fagowym bez wprowadzania zmian do genomu fagowego (także na fagu dzikim) został zaproponowany w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania bakteriofagów charakteryzujący się tym, że: a) prowadzi się hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego w odpowiedniej dla niego pożywce, hodowlę zaszczepia się bakteriofagami i uzyskuje się lizat bakteriofagowy, do dalszego oczyszczania lub innych zastosowań
b) prowadzi się oczyszczanie lizatu bakteriofagowego techniką chromatografii powinowactwa,
d) z uzyskanego przesączu przygotowuje się oczyszczony preparat bakteriofagowy, przy czym w etapie a) jako szczep gospodarza bakteryjnego wykorzystuje się komórki bakteryjne zawierające sekwencję kodującą fuzję białka wchodzącego w skład kapsydu bakteriofaga obecnego w otrzymywanym lizacie z (i) polipeptydem posiadającym powinowactwo do złoża chromatograficznego wykorzystywanego w etapie b), jeśli celem jest uzyskanie oczyszczonego preparatu bakteriofaga lub (i) innym polipeptydem o wymaganej aktywności, jeśli celem jest prezentacja innych motywów aktywnych.
Korzystnie szczep bakteriofagowy modyfikowany i/lub oczyszczany tą metoda może być dowolnym szczepem dzikim, niemodyfikowanym genetycznie. Szczególnie korzystnie hodowlę zaszczepia się szczepem bakteriofaga niemodyfikowanym genetycznie w celu prezentacji metodą phage-display, tj. bakteriofagiem dzikim lub modyfikowanym w innym celu, a bakteriofag ten prezentuje na swojej powierzchni wybrane obce polipeptydy.
Korzystnie polipeptyd umożliwiający oczyszczenie bakteriofaga, posiadający powinowactwo do złoża chromatograficznego jest wybrany z grupy obejmującej HisTag oraz GST. Przykładowy polipeptyd pochodzący z fagowego białka strukturalnego jest kodowany przez sekwencję kodującą białko gp23* tj. dojrzałą postać głównej proteiny kapsydowej gp23* (po cięciu proteolitycznym w etapie dojrzewania główki), sekwencja ta przedstawiona jest na figurze 1.
Korzystnie w trakcie etapu a) jako szczep gospodarza bakteryjnego stosuje się szczep bakteryjny wrażliwy na lityczne działanie namnażanego bakteriofaga.
Korzystnie w trakcie etapu a) uzyskany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 μιτι.
Chromatografia powinowactwa jest ustaloną, bardzo wydajną strategią oczyszczania pojedynczych białek różnego pochodzenia. Nieoczekiwanie zastosowanie tej metody w sposobie według wynalazku do izolowania całych kapsydów bakteriofagowych, stanowiących złożone i rozbudowane przestrzennie struktury białkowe, pozwoliło na zachowanie aktywności przeciwbakteryjnej izolowanych bakteriofagów, mimo iż ich kapsydy zostały istotnie zmodyfikowane w celu umożliwienia stosowania chromatografii powinowactwa. W przykładowej realizacji wykorzystano technikę phage display do wprowadzenia motywów wiążących do kapsydu fagowego, a następnie oparto się na wiązaniu tak zmodyfikowanych bakteriofagów do złoża powinowactwa odpowiedniego dla wybranego motywu wiążącego.
Opis uzupełniono następującymi figurami:
Na figurze 1 przedstawiona została sekwencja fragmentu genu 23 kodującego dojrzałą postać głównej proteiny kapsydowej gp23* (po cięciu proteolitycznym);
Na figurze 2 przedstawiona została kaseta ekspresyjna - białko gp23* w fuzji z GST - oczekiwana masa produktu 23*GST : 78 kDa; wytłuszczeniem zaznaczono sekwencje pochodzące z wektora pDEST15 Invitrogen, podkreślając charakterystyczne dla wektora pDEST15 miejsca rekombinacji, zwykłą czcionką opisano pozostałe elementy operatorowe, dodatkowo oznaczając je następująco: pojedyncze podkreślenie: promotor T7, podwójne podkreślenie: RBS, przerywane podkreślenie: GST, podkreślenie zygzakiem: terminator T7; czcionką pochyłą zaznaczono zawierający gen 23* konstrukt obejmujący m. cięcia dla AcTev (pojedyncze podkreślenie), 3xSer (podwójne podkreślenie), gen 23* (przerywane podkreślenie).
Na figurze 3 przedstawiona została kaseta ekspresyjna - białko 23* w fuzji z Histag - oczekiwana masa produktu 23*Histag : 50 kDa; Wytłuszczeniem zaznaczono sekwencje pochodzące z wektora pDEST15 Invitrogenu, podkreślając charakterystyczne dla wektora pDEST15 miejsca rekombinacji, zwykłą czcionką opisano pozostałe elementy operatorowe, dodatkowo oznaczając je następująco: pojedyncze podkreślenie: promotor T7, podwójne podkreślenie: RBS, przerywane podkreślenie: Histag, podkreślenie zygzakiem: terminator T7; czcionką pochyłą zaznaczono zawierający gen 23* konstrukt obejmujący m. cięcia dla AcTev (pojedyncze podkreślenie), 3xSer (podwójne podkreślenie), gen 23* (przerywane podkreślenie);
PL 218 313 B1
Na figurze 4 przedstawiona została ekspresja białek gp23* i gpWac w fuzji z GST i Histag w komórkach E. coli Rosetta (panel A, B, C, D), Panel A - zdjęcie żelu po elektroforezie - profil białkowy po lizie komórek ekspresjonujących białko 23* w fuzji z Histag :1- Marker masy (Fermentas SM0661), 2, 3, 4- nie dotyczy, 5-23*Histag 3h po indukcji IPTG (produkt zaznaczono strzałką), Panel B - zdjęcie żelu po elektroforezie - profil białkowy po lizie komórek ekspresjonujących białko Wac w fuzji z Histag : 1- Marker masy (Fermentas SM0661), 2, 3, 4, 5- nie dotyczy, 6-WacHistag 3h po indukcji IPTG (produkt zaznaczono strzałką), Panel C - zdjęcie żelu po elektroforezie - profil białkowy po lizie komórek ekspresjonujących białko Wac w fuzji z GST :1- Marker masy (Fermentas SM0661), 2, 3, 4-nie dotyczy, 5-WacGST 3h po indukcji IPTG (produkt zaznaczono strzałką), Panel D - zdjęcie żelu po elektroforezie - profil białkowy po lizie komórek ekspresjonujących białko gp23* w fuzji z GST :1-Marker masy (Fermentas SM0661), 2, 3- nie dotyczy, 4-23*GST 3h po indukcji IPTG (produkt zaznaczono strzałką).
Na Figurze 5 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gpWac i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa wstępna, frakcja 2).
Na Figurze 6 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gpWac i oczyszczaniu na złożu glutationowym (brak dializy, frakcja 1).
Na Figurze 7 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa wstępna, frakcja 1).
Na Figurze 8 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (brak dializy, frakcja 1).
Na Figurze 9 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego dzięki trawieniu proteolitycznemu (1 doba), po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa).
Na Figurze 10 zaprezentowano wyniki otrzymane dla preparatu bakteriofaga T4 uzyskanego po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu niklowo-agarozowym NiNTA (brak dializy, frakcja 1)
P r z y k ł a d 1.
Procedura zakłada przygotowanie i wykorzystanie szczepu bakteriofaga macierzystego bez zmian genetycznych. W roli gospodarza dla bakteriofaga T4 wykorzystano szczepy ekspresyjne Escherichia coli transformowane ekspresyjnymi plazmidami zawierającymi poprawny gen 23* lub poprawny gen wac w fuzji z sekwencją kodującą wybrany motyw peptydowy przewidziany do prezentacji na kapsydzie. W tak prowadzonej hodowli bakteriofag ma możliwość kompetytywnego włączania białka rekombinowanego ekspresjonowanego jednocześnie w komórce bakteryjnej z ekspresyjnego plazmidu: gp23* w fuzji z motywem wiążącym lub gpWac w fuzji z motywem wiążącym. Powstają stabilne struktury kapsydowe zawierające rekombinowane białko, a zatem zawierające i prezentujące na powierzchni motywy o silnym powinowactwie do złóż wiążących.
Mogą być zastosowane dwa alternatywne sposoby uwalniania bakteriofagów ze złoża: (i) elucja kompetytywna, tj. wypieranie za pomocą związków zdolnych do oddziaływania z motywami wiążącymi na kapsydach i/lub złożem wiążącym (glutation, imidazol), lub (ii) uwalnianie proteolityczne za pomocą proteazy rozpoznającej rzadkie motywy aminokwasowe. Druga strategia wymaga wprowadzenia na etapie projektowania ekspresyjnej konstrukcji plazmidowej przewidzianej do produkcji w komórce rekombinowanego białka, sekwencji rozpoznawanej przez odpowiednią proteazę. W wypadku uwalniania proteolitycznego kapsyd bakteriofagowy jest pozbawiany motywów wiążących.
Szczegółowy przykład realizacji sposobu według wynalazku podano poniżej.
Komórki gospodarza bakteryjnego uzyskano stosując szczepy ekspresyjne Escherichia coli, które transformowano ekspresyjnymi plazmidami zawierającymi poprawny gen 23* lub wac w fuzji z sekwencją kodującą wybrany motyw wiążący. W przykładowej realizacji wykorzystano plazmid pDEST15 (Invitrogen), który zawierał kasetę ekspresyjną pozwalającą uzyskać białko zawierające gp23* lub gpWac w fuzji z GST (figura 2) lub kasetę ekspresyjną kodującą białko zawierające gp23* lub gpWac w fuzji z Histag (figura 3).
Skuteczność transformacji komórek E. coli Rosetta badano obserwując ekspresję białka gp23* lub gpWac w fuzji z tagami GST i Histag (figura 4).
PL 218 313 B1
Rekombinowane komórki gospodarza bakteryjnego hodowano w temp. 37°C do OD600 0,7 na medium LB (LB-Broth, high salt) o składzie: enzymatyczny hydrolizat kazeiny 10g/l, ekstrakt drożdżowy 5g/l, chlorek sodu 10g/l, pH 7,5. Następnie komórki przenoszono do świeżego LB (w stosunku 1:100 względem LB) opcjonalnie: prowadzono hodowlę do OD600=0,1, następnie dodawano IPTG do 0,0025 M oraz 1:100 objętości lizatu faga HAPl (~3x109 pfu/ml). Indukcja ekspresji oraz infekcja miały zatem miejsce jednocześnie. Zainfekowane komórki hodowano w 37°C przy 160 rpm przez 8-12 godzin.
W opisywanej przykładowej realizacji wynalazku rekombinowane bakterie Escherichia coli zakażano dzikim bakteriofagiem T4 indukując jednocześnie ekspresję białka Hoc, prowadzono jednocześnie lizę fagową i indukcję ekspresji białka rekombinowanego gp23* lub gpWac.
Lizat fagowy filtrowano, opcjonalnie poddawano dializie do buforu fosforanowego identycznego z buforem przewidzianym do płukania kolumn na membranie o porach 300 kDa, po czym inkubowano z odpowiednim złożem agarozowym: sefaroza glutationowa (ang. Glutathione sepharose) lub agarozowym z jonami metali kompleksujących reszty imidazolowi histydyn (np. NiNTA agarowe). Lizaty inkubowano z odpowiednim złożem przez noc w temp. 4°C z lekkim kołysaniem. Po usunięciu niezwiązanej frakcji stosowano typową dla chromatografii powinowactwa procedurę oczyszczania tj. złoże poddano płukaniu 4 I buforu : 50 mM Na2HPO4,300 mM NaCI, pH 7,5 (złoże GST) lub 50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCI, 50-100 mM imidazol, pH 7,5 (złoże niklowe), następnie bakteriofagi eluowano lub zwalniano ze złoża proteolitycznie.
W przypadku złoża GST stosowano dwa sposoby elucji:
elucję kompetytywną, 40 mM zredukowanym glutationem (1 lub 2 frakcja);
- bufor do elucji: 40 mM zredukowany glutation, 50 mM Tris, pH 8.0. Przed zebraniem każdej frakcji, złoże inkubowano z buforem 20 minut; zwalnianie proteolityczne za pomocą proteazy AcTEV;
-zastosowanie zwalniania proteolitycznego wymaga wcześniejszej analizy teoretycznej sekwencji lub empirycznego testu wrażliwości bakteriofaga na działanie proteazy (poprzez kontrolę spadku miana); tu zastosowano analizę teoretyczną opartą na analizie sekwencji zewnętrznych białek kapsydu T4
- bufor dla proteazy: 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 8.0. Enzymu dodawano w ilości μΐ na 1 ml złoża (aktywność - 10 U/μΙ). Proteolizę prowadzono 1 dzień w 4°C
W przypadku złoża NiNTA fagi wypierano imidazolem w gradiencie 100-500 mM (1 lub 2 frakcja) -bufor do elucji: 100-500 mM imidazol (zależnie od frakcji), 50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCI, pH 7,5 Płukanie oraz elucje prowadzono w temperaturze pokojowej.
Metody analizy wyników
Specyficzność bakteriofagów modyfikowanych względem złoża wnioskowano na podstawie porównania profilu elucji fagów T4 modyfikowanych tagiem specyficznym dla danego złoża i tagiem niepasującym do złoża. Profil elucji wyznaczano poprzez ocenę miana fagowego w poszczególnych frakcjach. Kontrolnie oceniano miano fagowe w ostatniej partii buforu płuczącego; eksperyment uznawano za efektywny przy założeniu, że miano w tej partii nie było większe niż 1% miana fagów związanych, wykrywanych w eluowanych następnie frakcjach. Efektywność oczyszczania sprawdzano poprzez oznaczanie poziomu endotoksyn w eluowanych (bądź zwalnianych) frakcjach.
Wyniki
Uzyskane wyniki przedstawiono na zawartych w niniejszym opisie figurach oraz tabeli.
Przedstawione na figurach wykresy zawierają porównanie wybranych frakcji elucji. W przypadku eksperymentów porównawczych, które miały potwierdzić specyficzność fagów do złoża, wyjściowe miana preparatu kontrolnego oraz potencjalnie specyficznego były identyczne. Te same objętości lizatów inkubowano z tą samą ilością złoża, płukano oraz eluowano w tych samych warunkach.
Fig. 5 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gpWac i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa wstępna, frakcja 2) Powinowactwo do złoża praparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (GST) ponad 15-krotnie przekracza powinowactwo preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (His-tag), co świadczy o specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem GST.
Fig. 6 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gpWac i oczyszczaniu na złożu glutationowym (brak dializy, frakcja 1). Powinowactwo do złoża preparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (GST) 20-krotnie przekracza
PL 218 313 B1 powinowactwo preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (His-tag), co świadczy o specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem GST.
Fig. 7 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa wstępna, frakcja 1). Powinowactwo do złoża preparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (GST) prawie 4,5-krotnie przekracza powinowactwo preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (His-tag), co świadczy o specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem GST.
Fig. 8 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (brak dializy, frakcja 1) Powinowactwo do złoża praparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (GST) prawie 24-krotnie przekracza powinowactwo preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (His-tag), co świadczy o specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem GST.
Fig. 9 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych dzięki trawieniu proteolitycznemu AcTev, po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (dializa). Miano praparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (GST) 10-krotnie przekracza miano preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (His-tag), co świadczy o specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem GST.
Fig. 10 prezentuje porównanie zawartości bakteriofagów w preparatach bakteriofaga T4 uzyskanych po zastosowaniu kompetytywnego phage-display z użyciem szczepu E. coli ekspresjonującego rekombinowane białko gp23* i oczyszczaniu na złożu glutationowym (brak dializy, frakcja 1) Powinowactwo do złoża preparatu modyfikowanego tagiem specyficznym (His-tag) prawie 2-krotnie przekracza powinowactwo preparatu modyfikowanego tagiem niespecyficznym (GST), co świadczy o słabym specyficznym wiązaniu faga modyfikowanego tagiem His-tag.
Tab. 1. Tabela przedstawia uzyskane wartości endotoksyn dla oczyszczanych preparatów fagowych oraz odpowiadające im miana.
| Preparat fagowy | Poziom endotoksyn (EU/ml) |
| Elucja: T4 modyfikowany GST w fuzji z gp23*, lizat | 1000 |
| Elucja: T4 modyfikowany GST w fuzji z gp23*, dializowany | 24 |
| Elucja: T4 modyfikowany GST w fuzji z gpWac, lizat | 88 |
| Elucja: T4 modyfikowany GST w fuzji z gpWac, dializowany | 51 |
| Elucja: T4 modyfikowany Histag w fuzji z gp23*, lizat | 1000 |
| Proteoliza: T4 modyfikowany GST w fuzji z gp23*, dializa | 38 |
Wnioski
Proponowana metoda umożliwia jednoetapowe a zarazem efektywne oczyszczenie preparatów fagowych, pozwala na zachowanie aktywności przeciwbakteryjnej bakteriofagów zarówno w wypadku strategii opartej o wypieranie związanych bakteriofagów ze złoża jak i o uwalnianie proteolityczne. Nie wymaga osobnych kroków podejmowanych dla usuwania zanieczyszczeń białkowych i niebiałkowych (w tym LPS). Modyfikacja białek płaszcza fagowego odpowiednimi motywami wiążącymi może umożliwiać oczyszczenie także innych szczepów bakteriofagowych techniką chromatografii powinowactwa. Proponowana metoda umożliwia prezentację wybranych peptydów lub białek na fagach niemodyfikowanych genetycznie do celów phage-display tj. dzikich, występujących naturalnie, lub innych (laboratoryjnych szczepach różnego zastosowania).
Claims (6)
1. Sposób otrzymywania bakteriofagów, znamienny tym, że:
a) prowadzi się hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego w odpowiedniej dla niego pożywce, hodowlę zaszczepia się bakteriofagami i uzyskuje się lizat bakteriofagowy, b) prowadzi się oczyszczanie lizatu bakteriofagowego techniką chromatografii powinowactwa, d) z uzyskanego przesączu przygotowuje się oczyszczony preparat bakteriofagowy, przy czym w etapie a) jako szczep gospodarza bakteryjnego wykorzystuje się komórki bakteryjne zawierające sekwencję kodującą białko fuzyjne zawierające obcy polipeptyd posiadający powinowactwo do złoża chromatograficznego wykorzystywanego w etapie b) oraz polipeptyd pochodzący z fagowego białka strukturalnego bakteriofaga obecnego w otrzymywanym lizacie.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd posiadający powinowactwo do złoża chromatograficznego jest wybrany z grupy obejmującej HisTag oraz GST.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego prowadzi się w bulionie hodowlanym o pH około 7,2 zawierającym wyciąg mięsny, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, hydrolizat drożdży, pepton, NaCI.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) jako szczep gospodarza bakteryjnego stosuje się szczep bakteryjny wrażliwy na lityczne działanie namnażanego bakteriofaga.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) hodowlę zaszczepia się szczepem bakteriofaga niemodyfikowanym genetycznie w celu prezentacji metodą phage-display.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) uzyskany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 μm.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL392774A PL218313B1 (pl) | 2010-10-28 | 2010-10-28 | Kompetytywna metoda otrzymywania preparatów bakteriofagowych |
| US13/881,795 US10160956B2 (en) | 2010-10-28 | 2011-10-28 | Method of producing bacteriophage preparations comprising purification using affinity chromatography |
| EP11802172.4A EP2632940B1 (en) | 2010-10-28 | 2011-10-28 | A method of producing bacteriophage preparations comprising purification using affinity chromatography |
| RU2013123514/10A RU2590609C2 (ru) | 2010-10-28 | 2011-10-28 | Способ очистки бактериофагов |
| PCT/PL2011/050044 WO2012057643A1 (en) | 2010-10-28 | 2011-10-28 | A method of producing bacteriophage preparations comprising purification using affinity chromatography |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL392774A PL218313B1 (pl) | 2010-10-28 | 2010-10-28 | Kompetytywna metoda otrzymywania preparatów bakteriofagowych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL392774A1 PL392774A1 (pl) | 2012-05-07 |
| PL218313B1 true PL218313B1 (pl) | 2014-11-28 |
Family
ID=45418744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL392774A PL218313B1 (pl) | 2010-10-28 | 2010-10-28 | Kompetytywna metoda otrzymywania preparatów bakteriofagowych |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10160956B2 (pl) |
| EP (1) | EP2632940B1 (pl) |
| PL (1) | PL218313B1 (pl) |
| RU (1) | RU2590609C2 (pl) |
| WO (1) | WO2012057643A1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2610178C1 (ru) * | 2015-10-15 | 2017-02-08 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Способ очистки нитчатого бактериофага М13 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69012682T2 (de) | 1989-06-12 | 1995-04-06 | Merck & Co Inc | Verfahren zur Entfernung von bakteriellen Endotoxinen aus gram-negativen Polysacchariden. |
| US5039610A (en) | 1989-06-12 | 1991-08-13 | Merck & Co., Inc. | Process for removing bacterial endotoxin from gram-negative polysaccharides |
| JP3402476B2 (ja) | 1992-08-24 | 2003-05-06 | 生化学工業株式会社 | リポ多糖結合性タンパク質及びその製造法 |
| US20030162223A1 (en) * | 1999-10-22 | 2003-08-28 | Lowery David E. | Drosophila G protein coupled receptors, nucleic acids, and methods related to the same |
| WO2002008371A2 (en) | 2000-02-17 | 2002-01-31 | The Procter & Gamble Company | Cleaning composition |
| US6942802B2 (en) | 2001-04-13 | 2005-09-13 | Wyeth Holdings Corporation | Removal of bacterial endotoxin in a protein solution by immobilized metal affinity chromatography |
| RU2260053C2 (ru) | 2002-06-26 | 2005-09-10 | Апарин Петр Геннадьевич | Способ выделения биологически активной фракции (баф), содержащей s-липополисахариды (s-лпс) из грамотрицательных бактерий, баф для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями, производящими эндотоксичные s-лпс, фармацевтическая композиция, способы индукции протективного иммунитета и улучшения состояния пациента при состояниях, требующих повышения иммунного статуса |
| FR2848223B1 (fr) | 2002-12-09 | 2005-02-25 | Centre Nat Rech Scient | Nouveau procede d'isolement des endotoxines. |
| DE102004004043B4 (de) * | 2004-01-27 | 2013-04-18 | Apanovis Biotechnologie Gmbh | Reinigung von hochmolekularen Verbindungen mittels Affinitätsmembranchromatographie |
| WO2007064462A1 (en) * | 2005-11-29 | 2007-06-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Phage particle diagnostic reagents |
| AR059448A1 (es) * | 2006-02-13 | 2008-04-09 | Divergence Inc | Polipeptidos quimericos vegetales de union para el reconocimiento molecular universal |
| US8754013B2 (en) * | 2008-09-11 | 2014-06-17 | University Of Miami | Open-reading-frame (ORF) phage display |
| PL212286B1 (pl) | 2010-06-20 | 2012-09-28 | Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Pan | Sposób otrzymywania bakteriofagów |
-
2010
- 2010-10-28 PL PL392774A patent/PL218313B1/pl unknown
-
2011
- 2011-10-28 RU RU2013123514/10A patent/RU2590609C2/ru active
- 2011-10-28 EP EP11802172.4A patent/EP2632940B1/en active Active
- 2011-10-28 US US13/881,795 patent/US10160956B2/en active Active
- 2011-10-28 WO PCT/PL2011/050044 patent/WO2012057643A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2632940A1 (en) | 2013-09-04 |
| RU2590609C2 (ru) | 2016-07-10 |
| PL392774A1 (pl) | 2012-05-07 |
| EP2632940B1 (en) | 2017-05-10 |
| WO2012057643A1 (en) | 2012-05-03 |
| US20130295647A1 (en) | 2013-11-07 |
| US10160956B2 (en) | 2018-12-25 |
| RU2013123514A (ru) | 2014-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101636415B (zh) | 用于富集、除去和检测革兰氏阳性细菌的方法和手段 | |
| Nariya et al. | Identification and characterization of a putative endolysin encoded by episomal phage phiSM101 of Clostridium perfringens | |
| Stojković et al. | Coliphage N4 N-acetylmuramidase defines a new family of murein hydrolases | |
| US10301607B2 (en) | Methods of generating and screening for lytic chimeric polypeptides | |
| Heselpoth et al. | Enzybiotics: endolysins and bacteriocins | |
| WO2025011106A1 (zh) | 一种广谱抗病毒多肽的生物合成方法 | |
| Zhang et al. | Green algae-derived triple CATH_BRALE multimer protein potently inhibits bacterial growth by permeabilizing the bacterial cell membrane | |
| WO2010012972A2 (en) | Novel bacterial cells and uses thereof | |
| PL218313B1 (pl) | Kompetytywna metoda otrzymywania preparatów bakteriofagowych | |
| EP2582797B1 (en) | A method of producing bacteriophages | |
| Cohen et al. | Multifunctional roles of a bacteriophage ϕ29 morphogenetic factor in assembly and infection | |
| EP3186370A1 (en) | Enzyme with high lytic activity against enterococcus cell and a method of modification of the gene thereof, enabling overproduction of active enzyme in bacterial cells | |
| KR102920159B1 (ko) | 개량된 박테리오파지 Tail Spike Protein(TSP)을 이용한 대장균의 신속 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법 | |
| CN104804074A (zh) | 一种菌丝霉素突变体及其基因、制备方法和应用 | |
| Wong | Analysis of the adaptation mechanism in the type II-A CRISPR-Cas system | |
| Velden | Deciphering Sulfolobus spindle-shaped virus 9.1 toxin B310: Insights in killing phenotype and challenges in recombinant production | |
| RU2496877C2 (ru) | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pHYP С ПОВЫШЕННОЙ СЕГРЕГАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, БАКТЕРИЯ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА | |
| Rajaure | The Role of Spanins in Phage Lysis | |
| WO2005108563A2 (en) | Peptidoglycan-hydrolyzing protein encoded by bacteriophage n4 | |
| CN103804475B (zh) | 一种海豚链球菌细菌素及其应用 | |
| KR20140026781A (ko) | 인간 ＰＤＩｂ´ａ´태그를 이용한 생물학적 활성을 가진 인간 ＬＩＦ 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법 | |
| CN111269296A (zh) | 一种nLsA蛋白及其结构基因和应用 | |
| Da Silva | The Role of Ribonuclease r in Bacterial Adaptation to Cold Shock | |
| Fernandes et al. | STAPHYLOCOCCUS AUREUS | |
| Khan et al. | Exploring the Antibacterial Activity of Endogp25 Lysin from Epsilon15 Phage Against Food Borne Pathogenic Bacteria |