PL219255B1

PL219255B1 - Polimerowa nanokapsuła oraz sposób jej wytwarzania

Info

Publication number: PL219255B1
Application number: PL394825A
Authority: PL
Inventors: Kazimiera A. Wilk; Katarzyna Zielińska; Andrzej Gamian
Original assignee: Wrocławskie Ct Badań Eit & Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialności&
Priority date: 2011-05-10
Filing date: 2011-05-10
Publication date: 2015-03-31
Also published as: PL394825A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe polimerowe nanokapsuły z poli(cyjanoakrylanu n-butylu) otrzymywane w wyniku polimeryzacji międzyfazowej z wykorzystaniem mikroemulsji olej-w-wodzie stabilizowanych przez surfaktanty cukrowe typu dicefalik oraz typu gemini zdolne do enkapsułowania substancji o charakterze hydrofilowym. Nanokapsuły przeznaczone są do stosowania w formulacjach farmaceutycznych jako nośniki substancji aktywnych w diagnostyce nowotworów i terapiach antynowotworowych.

Wynalazek związany jest także z transparentnymi, termodynamicznymi, trwałymi i temperaturowo niezależnymi układami mikroemulsyjnymi stabilizowanymi związkami powierzchniowo czynnymi należącymi do grupy surfaktantów cukrowych o strukturze typu dicefalik -N-dodecylo-N,N-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]-amina (C12-DGHA) oraz typu gemini N,N'-bisdodecylo-N,N'-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]etylenodiamina (bis(C12-GHA)); opis syntezy odpowiednio w K. A. Wilk,

L. Syper, B. Barczyk, A. Sokołowski, B.W. Domagalska, J. Surf. Deterg. 3 (2000) 185-192 i K. A. Wilk, L. Syper, B.W. Domagalska, U. Komorek, I. Maliszewska, R. Gancarz, J. Surfact. Deterg. 5 (2002) 235-244.

Jednym z zadań nowoczesnej technologii chemicznej jest poszukiwanie takich nośników leków i systemów transportu związków biologicznie czynnych na poziomie nano- i mikroskopowym, które działałyby w sposób selektywny i ukierunkowany, ograniczałyby działania uboczne leku, a jednocześnie wykazywałyby maksymalny efekt terapeutyczny i zapewniały większą stabilność biologiczną [R.C. Pinto, R.J. Neufeld, A.J. Ribeiro, F. Veiga, Nanomedicine; Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 8-21]. Zadanie takie mogą spełniać nanocząstki: nonosfery i nanokapsuły. Na szczególną uwagę zasługują drugie z wymienionych nośników, gdyż mają one dużą pojemność załadunkową, pozwalają długo przechowywać związek enkapsułowany oraz umożliwiają jego większe nagromadzenie w miejscu docelowym minimalizując tym samym skutki uboczne stosowanej terapii.

Do głównych metod otrzymywania nanokapsuł należą metody wykorzystujące procesy templatowania, w których nośniki leków preparuje się w oparciu o szablony, którymi są najczęściej różnego typu agregaty micelarne, takie jak micele, emulsje, nanoemulsje, liotropowe ciekłe kryształy, liposomy itd. [T. Liua, Ch. Burgerb, B. Chu B., Prog. Polym. Sci. 28 (2003) 5-26]. Szczególnie interesujące ze względów aplikacyjnych, jest wykorzystanie mikroemulsji: transparentnych, termodynamicznie trwałych mieszanin dwóch niemieszających się cieczy (polarnej i niepolarnej) stabilizowanymi surfaktantem bądź mieszaniną surfaktantów (lub surfaktantem i kosurfaktantem). Jednym z przykładów procesów templatowania prowadzącym do otrzymywania nanokapsuł jest polimeryzacja międzyfazowa [H. Huang, E.E. Remsen, T. Kowalewski, K.L. Wooley, J. Am. Chem. Soc. 121 (1999) 3805-3806], która przebiega na granicy dwóch niemieszających się faz [S.K. Karode, S.S. Kulkami A.K. Suresh, R.A. Mashelkar, Chem Eng. Sci. 53 (1998) 2649-2663, V.V. Yashin, A.C. Balazs, J. Chem. Physics 121 (2004) 11440-11454]. Obok wykorzystywanej do otrzymywania włókien sztucznych polimeryzacji międzyfazowej „bez mieszania” (ang. unstirred interfacial polymerization), można przeprowadzić podobny proces przebiegający na granicy międzyfazowej kropel jednej cieczy zdyspergowanej w innej (ang. stirred interfacial polymerization) [W. Rempp, P. Merrill, Polymer Synthesis, Huthig and Wepf; (1991) str. 280-287]. W ten sposób otrzymuje się mikro- i nanocząstki wykorzystywane jako nośniki katalizatorów, pestycydów, barwników czy jako nośniki leków [J. Ji, R.F. Childs, M. Mehta, J. Membrane Sci. 192 (2001) 55-70]. Niezwykle ważne podczas otrzymywania nanokapsuł zagadnienia to rozmiar otrzymywanych cząstek oraz ich nietoksyczność i łatwa biodegradacja.

Otrzymywanie nanokapsuł z polistyrenu przy wykorzystaniu templatu nanoemulsyjnego opisuje Chen i inni [Y. Chen, H. Liu, Z. Zhang, S. Wang, European Polymer Journal 43 (2007) 2848-2855]. Niestety, zastosowanie tego typu nanokapsuł jako nośników leków jest niemożliwe ze względu na toksyczność polistyrenu.

W literaturze znaleźć można opis otrzymywania nanocząstek poIi(cyjanoakrylanów alkilu) [US 4,329,332, US 4,489,055] przydatnych do enkapsułowania substancji hydrofilowych, niewiele jest natomiast doniesień dotyczących nośników tego typu do enkapsułowania związków hydrofobowych. Watnasirichaikul i inni [S. Watnasirichaikul, T. Rades, I.G. Tucker, N.M. Davies, Int. J. Pharmaceutics 235 (2002) 237-246] opisuje sposób wytwarzania nanokapsuł opartych o mikroemulsję woda-w-oleju stabilizowanych polisorbatem 80 oraz monooleinianem sorbitanu (3:2 wag./wag.), gdzie jako fazę olejową stosowano mieszaninę mono-, di- i triglicerydów. Otrzymane nanocząstki zbudowane są z nietoksycznych i łatwo degradowanych policyjanoakrylanów. Nanokapsuły do zamykania hydrofiloPL 219 255 B1 wej insuliny opisano w [A. Graf, E. Ablinger, S. Peters, A. Zimmer, S. Hook, T. Rades, Int. J. Pharm. 350 (2008) 351-360]. Nanocząstki otrzymano w wyniku polimeryzacji międzyfazowej cyjanoakrylanu etylu lub butylu z wykorzystaniem jako templatu mikroemulsji woda-w-oleju zawierającej lecytynę oraz mirystynian izopropylu.

Z literatury patentowej znane są nanocząstki policyjanoakrylowe otrzymane na bazie emulsji zawierającej esencję różaną i stabilizowanej polioksyetylenowany monolaurynian sorbitanu - patent CN 101816911. Nanocząstki otrzymywane są w wyniku polimeryzacji międzyfazowej trwającej około 5 godzin, monomer dodawany jest w ilości od 0,6 do 1,6% wagowych w stosunku do emulsji. Otrzymane w ten sposób kapsuły mają rozmiar ok. 100 nm i mogą być wykorzystane w kosmetykach lub w środkach zapachowych do tkanin.

W innym patencie - CN 101092499 - ujawniono sposób otrzymywania nanocząstek zawierających substancje aktywne rozpuszczalne w wodzie, takie jak witamina C i B, kwas hialuronowy i jego pochodne. Nanocząstki z poli(cyjanoakrylanu) etylu lub butylu miały rozmiar od 100 do 500 nm a enkapsułowany materiał wykazywał wysoką biokompatybilność i możliwość wykorzystania w kosmetyce.

Z amerykańskiego opisu patentowego US 2008182776 znane są nanocząstki poli(cyjanoakryloalkilowe). Otrzymywane są one w wyniku polimeryzacji nanoemulsji stabilizowanej niejonowymi surfaktantami pluronic F127 lub F68. Nanocząstki te, w porównaniu z tymi otrzymywanymi w wyniku polimeryzacji emulsji, charakteryzowały się wyższym stopniem załadowania i enkapsulacji zamykanej substancji aktywnej.

W zgłoszeniu międzynarodowym WO 2005/020933 opisano sposób otrzymywania polimerowych nanocząstek o rozmiarach poniżej 1000 nm, korzystnie od 1 do 400 nm. Cząstki te są syntezowane w wyniku polimeryzacji w emulsji.

Mikroemulsje to mikroheterofazowe, transparentne, termodynamicznie trwałe mieszaniny dwóch niemieszających się cieczy (polarnej i niepolarnej), stabilizowane surfaktantem bądź mieszaniną surfaktantów (lub surfaktantem i kosurfaktantem). Składniki mikroemulsji po dysocjacji zachowują swoją chemiczną i fizyczną odrębność a rozmiar kropel fazy rozproszonej (5-100 nm) zapewnia trwałość układu. Zgodnie z wynalazkiem, do wytwarzania nowych układów mikroemulsyjnych wykorzystuje się niejonowe, cukrowe związki powierzchniowo czynne, wytwarzane na drodze prostych syntez z wykorzystaniem surowców odnawialnych. Surfaktanty te ulegają biodegradacji, spełniają wymogi zielonej chemii i są bardziej przyjazne środowisku niż konwencjonalne związki powierzchniowo czynne. Proponowane mikroemulsje mogą znaleźć zastosowanie do solubilizowania zarówno związków o charakterze hydrofilowym (w przypadku mikroemulsji typu woda-w-oleju, w/o), i hydrofobowym (mikroemulsje typu olej-w-wodzie, o/w), jak i amfifilowym (mikroemulsje dwuciągłe). Mogą znaleźć zastosowanie w formulacjach farmaceutycznych, kosmetycznych. W przemyśle spożywczym, jako medium w reakcji polimeryzacji, w ochronie środowiska, np. do remediacji zanieczyszczonej gleby oraz do otrzymywania polimerowych nanokapsuł.

W literaturze naukowej i patentowej pojawiły się doniesienia o wytwarzaniu i zastosowaniu różnych typów mikroemulsji.

W pracach Otto Glatter i inni, Sugar-Ester Nonionic Microemulsion: Structural Characterization, J. Colloid Interface Sci. 241 (2001) 215-225 oraz Monzer Faun, Properties of microemulsions with sugar surfactants and peppermint oil, Colloid Polym Sci. 287 (2009) 899-910 ujawniono, że surfaktanty cukrowe mogą tworzyć mikroemulsje w układzie surfaktant/kosurfaktant/olej/woda.

Z literatury patentowej znane są mikroemulsje typu olej w wodzie lub mikroemulsje dwuciągłe, zawierające mieszaninę związków powierzchniowo czynnych (w ilości do 15% wagowych) przydatne jako nośnik do podawania związków czynnych o słabej rozpuszczalności w wodzie (takich jak lecytyna, sfingolipidy i galaktolipidy) - zgłoszenie patentowe nr P325825.

Z innego zgłoszenia patentowego z 1999 roku (PCT/AUS99/17319) znana jest zawierająca środek zapachowy mikroemulsja wody w oleju, która jest możliwa do zmieszania z wodną kompozycją podstawową do zmiękczania tkanin, użyteczna do dostarczenia środka zapachowego.

W patencie polskim 201177 (P363307) ujawniono jadalną mikroemulsję typu woda-w-oleju, która zawiera olej, środek powierzchniowo czynny, kosurfaktant oraz fazę wodną zawierającą wodę i ewentualnie rozpuszczalne w wodzie składniki. Zawartość fazy olejowej w prezentowanym układzie wynosi od 25 do 97% wagowych diglicerydów a stosunek molowy fazy wodnej do środka powierzchniowo czynnego mieści się w zakresie od 5 do 70. W patencie ujawniono także sposób wytwarzania takiej mikroemulsji.

PL 219 255 B1

W patencie nr GB 2297759 opisano mikroemulsje, które mogą być wykorzystywane w przemyśle spożywczym. Stabilizowane są one estrami poligliceroli nienasyconych kwasów tłuszczowych zawierających od 12 do 24 atomów węgla w łańcuchu hydrofobowym. Stosunek wagowy surfaktantu do wody wynosi mniej niż 5:1, korzystna ilość wody w mikroemulsji nie przekracza 2% wagowych, co powoduje, że układy te nie są zbyt efektywne jeśli chodzi o solubilizowanie wody.

Z kolei patent nr US 2007003581 dotyczy mikroemulsji o potencjalnym zastosowaniu jako formulacje kosmetyczne i farmaceutyczne, które nie podrażniają skóry i nie wykazują toksyczności. Opisywane mikroemulsje mogą być wykorzystane do przenoszenia związków aktywnych (np. witamin, przeciwutleniaczy). Układy te są tworzone z udziałem kosurfaktantów, takich jak poliglicerole lub różne monoestry, stabilizowane są przy pomocy emulgatorów opartych na glikolu polietylenowym. W przywoływanym patencie przedstawiono pseudotrójskładnikowy diagram fazowy, który jest pomocny do wyznaczania obszarów występowania mikroemulsji.

Z literatury patentowej znane są także mikroemulsje typu w/o służące do transportowania związków smakowych i zapachowych w produktach spożywczych (zgłoszenie międzynarodowe WO 9962357). W korzystnych układach stosunek molowy wody do surfaktantu jest niższy niż 10.

W literaturze przedmiotu nie są znane sposoby wytwarzania polimerowych nanokapsuł otrzymywanych w wyniku polimeryzacji międzyfazowej z wykorzystaniem mikroemulsji olej-w-wodzie (o/w), stabilizowanej surfaktantem cukrowym typu dicefalik Iub typu gemini.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest polimerowa nanokapsuła z poli(alkilo cyjanoakrylanu) zawierająca ciekły rdzeń mikroemulsji typu olej-w-wodzie, charakteryzująca tym, że jest stabilizowana surfaktantem cukrowym wybranym z grupy obejmującej: N-dodecylo-N,N-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]aminę lub N,N‘-bisdodecy N,N'-bis[(3-D-glukoheptonylo amido)propylo]etylenodiaminę.

Korzystnie, nanokapsuła według wynalazku zawiera ponadto substancję aktywną, zwłaszcza przeciwnowotworową.

Innym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania powyższej nanokapsuły z poIi(alkilo cyjanoakrylanowych) charakteryzujący się tym, że:

a. uzyskuje się emulgator poprzez zmieszanie surfaktantu cukrowego i izo-butanolu w stosunku wagowym 1:1, przy czym stosuje się surfaktant cukrowy wybrany z grupy obejmującej: N-dodecyloN,N'-bis[(3-D-gIukoheptonyloamido)propyIo]aminę lub N,N'-bisdodecylo-N,N'-bis[(3-D-gIukoheptonyIo amido)propylo] etylenodiaminę,

b. do uzyskanego emulgatora dodaje się od 1 do 70% wagowych fazy olejowej,

c. do uzyskanej mieszaniny dodaje się fazę wodną, w ilości od 1 do 99% wagowych i pozostawia się w temperaturze od 20 do 50°C do utworzenia mikroemulsji,

d. uzyskane templaty mikroemulsyjne miesza się z roztworem cyjanoakrylanu alkilu w chloroformie w stosunku objętościowym 1:3 i otrzymuje się stabihie nanokapsuły.

W powyższym sposobie, związek powierzchniowo czynny stosuje się korzystnie w ilości 1-60% wag., fazę olejową ilości 0,1-20% wag., bardziej korzystnie stosuje się 0,1-5% wag. oleju i 1-5% surfaktantu, zgodnie z diagramami pseudotrójskładnikowymi.

W sposobie według wynalazku, korzystnie jako fazę olejową stosuje się eter monoetylowy glikolu dietylowego.

W sposobie według wynalazku, korzystnie po wymieszaniu wszystkich składników próbkę poddaje się równowagowaniu przez co najmniej 24 h w temp. pokojowej.

W sposobie według wynalazku, korzystnie jako monomer stosuje się cyjanoakrylan alkilu, bardziej korzystnie etylu lub n-butylu.

W sposobie według wynalazku, korzystnie monomer stosuje się w ilości od 1 do 10 μΐ na ml mikroemulsji, bardziej korzystnie od 5 do 8 μΐ monomeru na ml mikroemulsji.

W sposobie według wynalazku, korzystnie proces polimeryzacji międzyfazowej prowadzi się w temperaturze poniżej 10°C, bardziej korzystnie 5°C.

W sposobie według wynalazku, korzystnie proces polimeryzacji międzyfazowej prowadzi się przez co najmniej 6 h, bardziej bardziej korzystnie 4 h.

Proces polimeryzacji międzyfazowej prowadzi się korzystnie przy ciągłym mieszaniu, przy prędkości mieszania wynoszącej od 500 do 1200 obrotów na minutę, bardziej korzystnie 1200 obrotów na minutę.

Przedmiot wynalazku objaśniony jest w przykładach wytwarzania nanokapsuł na szablonach mikroemulsji stabilizowanych surfaktantem cukrowym N-dodecylo-N,N-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]aminą lub N,N'-bisdodecylo-N,N'-bis[(3-D-glukoheptonylo amido)propylo]etylenodiaminą oraz

PL 219 255 B1 na rysunku, na którym na figurze 1 przedstawiono pseudotrójskładnikowe diagramy fazowe, na podstawie, których wyznacza się obszary występowania mikroemulsji i gdzie: ME - mikroemulsja, o/w - olej-w-wodzie. w/o - woda-w-oleju, bc - układ dwuciągły. Na figurach 2, 3, 4 przedstawiono odpowiednio: pomiary średnicy hydrodynamicznej kapsuł, uzyskane techniką dynamicznego rozpraszania światła (ang. Dynamie Light Scattering - DLS) oraz morfologię nanonośników uzyskaną przy zastosowaniu skaningowego mikroskopu elektronowego, SEM i mikroskopu sił atomowych, AFM.

Na figurach 5 i 6 oraz w Tabeli 4 pokazano medyczny potencjał wynalazku (przykładowe wyniki dla nanokapsuł). Nanokapsuły polimeryzowalne na bazie mikroemulsji zawierających surfaktanty cukrowe wykazują niską aktywność hemolityczną. Nie ma na to wpływu obecność fotouczulacza.

Puste nanokapsuły wykazują małą cytotoksyczność: przeżywalność nienaświetlanych komórek MCF-7 wt wynosi 96.6%, 84% i 76.4%, odpowiednio, tzn. efekt „dark toxicity” jest mały.

Po naświetleniu komórek inkubowanych z pustym nanonośnikiem przeżywalność MCF-7 Wt zmalała do 23% i ok. 4% w obecności pustych nośników, jak i tych załadowanych cyjaninami. Otrzymane nanonośniki mogą być użyteczne w przenoszeniu w układzie krążenia hydrofobowych czynników fotouczulających.

Wyniki badań przeprowadzonych za pomocą cytofluorymetrii przepływowej (FACS) po inkubacji komórek MCF-7WT, pokazane na fig. 8, dowodzą, że nanokapsuły będące przedmiotem wynalazku dużo wydajniej dostarczają cyjaninę do komórek (fig. 8 d), w porównaniu z wolnym lekiem (fig. 8 b i 8c). Na fig. 8a przedstawiono kontrolę negatywną - populację komórek MCF-7/WT bez nanokapsuł. Na fig. 8d - 9g pokazano także również histogramy ze średnią intensywnością fluorescencji w komórkach inkubowanych z wolną cyjaniną (fig. 8d), kapsułami zawierającymi cyjaninę IR-780 (8e) oraz IR-786 (fig. 8f) oraz nanokapsułami bez cyjaniny (fig. 8g).

P r z y k ł a d I

Miesza się 0,25 g N-dodecylo-N,N-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]aminy oraz 0,25 g izo-butanolu. Do tak przygotowanego emulgatora dodaje się 0,5 g eteru monoetyloweo glikolu dietylowego (DGME) oraz 9,0 g wody. Całość pozostawia się w 25°C na 24 godziny, W celu równowagowania. Po tym czasie otrzymuje się transparentną, termodynamicznie trwałą mikroemulsję typu o/w o zawartości oleju równej 5% oraz zawartości emulgatora równej 5% i o średnicy kropel równej 6,8 nm. Mikroemulsję schładza się do temperatury 5°C, i wprowadza się do niej cyjanoakrylan n-butylu rozpuszczony w chloroformie (w stosunku 1:3, v/v) w takiej ilości, aby na każdy mililitr mikroemulsji przypadało 5 pl monomeru. Otrzymuje się nanokapsuły o średnicy 340,7 nm, indeksie polidyspersyjności 0,127 i potencjale zeta równym -29,5 mV.

P r z y k ł a d II

Miesza się 0,5 g N-dodecylo-N,N-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]aminy oraz 0,5 g izobutanolu. Do tak przygotowanego emulgatora dodaje się 0,5 g eteru monoetyloweo glikolu dietylowego (DGME) oraz 8,5 g wody. Całość pozostawia się w 25°C na 24 godziny, w celu równowagowania. Po tym czasie otrzymuje się transparentną, termodynamicznie trwałą mikroemulsję typu o/w o zawartości oleju równej 5% oraz zawartości emulgatora równej 10% i o średnicy kropel równej 7,0 nm. Mikroemulsję schładza się do temperatury 5°C, i wprowadza się do niej cyjanoakrylan n-butylu rozpuszczony w chloroformie (w stosunku 1:3, v/v) w takiej ilości, aby na każdy mililitr mikroemulsji przypadało 5 pl monomeru. Otrzymuje się nanokapsuły o średnicy 352,4 nm, indeksie polidyspersyjności 0,108 i potencjale zeta równym -29,3 mV.

P r z y k ł a d III

Miesza się 0,25 g N-dodecylo-N,N-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]aminy oraz 0,25 g izobutanolu. Do tak przygotowanego emulgatora dodaje się 0,5 g eteru monoetyloweo glikolu dietylowego (DGME) oraz 9,0 g wody. Całość pozostawia się w 25°C na 24 godziny, w celu równowagowania. Po tym czasie otrzymuje się transparentną, termodynamicznie trwałą mikroemulsję typu o/w o zawartości oleju równej 5% oraz zawartości emulgatora równej 5% i o średnicy kropel równej 6,8 nm. Mikroemulsję schładza się do temperatury 5°C, i wprowadza się do niej cyjanoakrylan n-butylu rozpuszczony w chloroformie (w stosunku 1:3, v/v) W takiej ilości, aby na każdy mililitr mikroemulsji przypadało 8 pl monomeru. Otrzymuje się nanokapsuły o średnicy 352,5 nm, indeksie polidyspersyjności 0,118 i potencjale zeta równym -29,8 mV.

P r z y k ł a d IV

Miesza się 0,25 g N,N‘-bisdodecylo-N,N'-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]-etylenodiaminy oraz 0,25 g izo-butanolu. Do tak przygotowanego emulgatora dodaje się 0,5 g eteru monoetylowego glikolu dietylowego (DGME) oraz 9,0 g wody. Całość pozostawia się W 25°C na 24 godziny, w celu

PL 219 255 B1 równowagowania. Po tym czasie otrzymuje się transparentną, termodynamicznie trwałą mikroemulsję typu o/w o zawartości oleju równej 5% oraz zawartości emulgatora równej 5% i o średnicy kropel równej 3,9 nm. Mikroemulsję schładza się do temperatury 5°C, i wprowadza się do niej cyjanoakrylan n-butylu rozpuszczony w chloroformie (w stosunku 1:3, v/v) w takiej ilości, aby na każdy mililitr mikroemulsji przypadało 5 μΐ monomeru. Otrzymuje się nanokapsuły o średnicy 214,8 nm, indeksie polidyspersyjności 0,147 i potencjale zeta równym -31,2 mV.

P r z y k ł a d V

Miesza się 0,25 g N-dodecylo-N,N-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]aminy oraz 0,25 g izo-butanolu. Do tak przygotowanego emulgatora dodaje się 0,5 g eteru monoetyloweo glikolu dietylowego (DGME) oraz 9,0 g wody. Całość pozostawia się w 25°C na 24 godziny, w celu równowagowania. Po tym czasie otrzymuje się transparentną, termodynamicznie trwałą mikroemulsję typu o/w o zawartości oleju równej 5% oraz zawartości emulgatora równej 5% i o średnicy kropel równej 6,8 nm. Mikroemulsję schładza się do temperatury 5°C, i wprowadza się do niej cyjanoakrylan etylu rozpuszczony w chloroformie (w stosunku 1:3, v/v) w takiej ilości, aby na każdy mililitr mikroemulsji przypadało 5 μΐ monomeru. Otrzymuje się nanokapsuły o średnicy 321,0 nm, indeksie polidyspersyjności 0,113 i potencjale zeta równym -26,3 mV.

P r z y k ł a d VI

Miesza się 0,25 g W,W’-bisdodecylo-W,W’-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]-etylenodiaminy oraz 0,25 g izo-butanolu. Do tak przygotowanego emulgatora dodaje się 0,5 g eteru monoetyloweo glikolu dietylowego (DGME) oraz 9,0 g wody. Całość pozostawia się W 25°C na 24 godziny, w celu równowagowania. Po tym czasie otrzymuje się transparentną, termodynamicznie trwałą mikroemulsję typu o/w o zawartości oleju równej 5% oraz zawartości emulgatora równej 5% i o średnicy kropel równej 3,9 nm. Mikroemulsję schładza się do temperatury 5°C, i wprowadza się do niej cyjanoakrylan etylu rozpuszczony w chloroformie (w stosunku 1:3, v/v) w takiej ilości, aby na każdy mililitr mikroemulsji przypadało 5 μl monomeru. Otrzymuje się nanokapsuły o średnicy 198,2 nm, indeksie polidyspersyjności 0,109 i potencjale zeta równym -27,5 mV.

P r z y k ł a d VII

Miesza się 0,25 g N-dodecylo-N,N-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]aminy oraz 0,25 g izo-butanolu. Do tak przygotowanego emulgatora dodaje się 0,5 g eteru monoetyloweo glikolu dietylowego (DGME) oraz 9,0 g wody. Całość pozostawia się w 25°C na 24 godziny, w celu równowagowania. Po tym czasie otrzymuje się transparentną, termodynamicznie trwałą mikroemulsję typu o/w o zawartości oleju równej 5% oraz zawartości emulgatora równej 5% i o średnicy kropel równej 6,8 nm. Do tak przygotowanej mikroemulsji dodaje się cyjaninę IR-780 w takiej ilości, aby nie uległa ona całkowitemu rozpuszczeniu, układ miesza się przez 4 godziny. Nadmiar cyjany usuwa się przez na filtrze strzykawkowym o średnicy porów 0,2 μm. Miltroemulsję z zasolubilizowanym fotouczulaczem schładza się do temperatury 5°C, i wprowadza się do niej cyjanoakrylan etylu rozpuszczony w chloroformie (w stosunku 1:3, v/v) w takiej ilości, aby na każdy mililitr mikroemulsji przypadało 5 μl monomeru. Otrzymuje się nanokapsuły załadowane cyjaniną IR-780 o średnicy 333,0 nm, indeksie polidyspersyjności 0,078, potencjale zeta równym -29,6 mV i stopniu enkapsułowania cyjaniny równym 91,9%.

P r z y k ł a d VIII

Miesza się 0,25 g N,N'-bisdodecylo-N,N'-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]-etylenodiaminy oraz 0,25 g izo-butanolu. Do tak przygotowanego emulgatora dodaje się 0,5 g eteru monoetylowego glikolu dietylowego (DGME) oraz 9,0 g wody. Całość pozostawia się w 25°C na 24 godziny, w celu równowagowania. Po tym czasie otrzymuje się transparentną, termodynamicznie trwałą mikroemulsję typu o/w o zawartości oleju równej 5% oraz zawartości emulgatora równej 5% i o średnicy kropel równej 3,9 nm. Do tak przygotowanej mikroemulsji dodaje się cyjaninę IR-780 w takiej ilości aby nie uległa ona całkowitemu rozpuszczeniu, układ miesza się przez 4 godziny. Nadmiar cyjany usuwa się przez na filtrze strzykawkowym o średnicy porów 0,2 μm. Mikroemulsję z zasolubilizowanym fotouczulaczem schładza się do temperatury 5°C, i wprowadza się do niej cyjanoakrylan etylu rozpuszczony w chloroformie (w stosunku 1:3, v/v) w takiej ilości, aby na każdy mililitr mikroemulsji przypadało 5 μl monomeru. Otrzymuje się nanokapsuły załadowane cyjaniną IR-780 o średnicy 234,3 nm, indeksie polidyspersyjności 0,224 potencjale zeta równym -31,0 mV i stopniu enkapsułowania cyjaniny równym 92,6%.

P r z y k ł a d IX

Miesza się 0,25 g N-dodecylo-N,N-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]aminy oraz 0,25 g izo-butanolu. Do tak przygotowanego emulgatora dodaje się 0,5 g eteru monoetyloweo glikolu dietylowego (DGME) oraz 9,0 g wody. Całość pozostawia się w 25°C na 24 godziny, w celu równowagowania.

PL 219 255 B1

Po tym czasie otrzymuje się transparentną, termodynamicznie trwałą mikroemulsję typu o/w o zawartości oleju równej 5% oraz zawartości emulgatora równej 5% i o średnicy kropel równej 6,8 nm. Do tak przygotowanej mikroemulsji dodaje się cyjaninę IR-786 w takiej ilości, aby nie uległa ona całkowitemu rozpuszczeniu, układ miesza się przez 4 godziny. Nadmiar cyjany usuwa się przez na filtrze strzykawkowym o średnicy porów 0,2 μm. Mikroemulsję z zasolubilizowanym fotouczulaczem schładza się do temperatury 5°C i wprowadza się do niej cyjanoakrylan etylu rozpuszczony w chloroformie (w stosunku 1:3, v/v) w takiej ilości, aby na każdy mililitr mikroemulsji przypadało 5 μΐ monomeru. Otrzymuje się nanokapsuły załadowane cyjaniną IR-786 o średnicy 362,3 nm, indeksie polidyspersyjności 0,139 potencjale zeta równym -29,8 mV i stopniu enkapsułowania cyjaniny równym 87,6%.

P r z y k ł a d X

Miesza się 0,25 g N,N'-bisdodecylo-N,N'-bis[(3-D-glu koheptonyloamido)propylo]-etylenodiaminy oraz 0,25 g izo-butanolu. Do tak przygotowanego emulgatora dodaje się 0,5 g eteru monoetyloweo glikolu dietylowego (DGME) oraz 9,0 g wody. Całość pozostawia się w 25°C na 24 godziny, w celu równo wagowania. Po tym czasie otrzymuje się transparentną, termodynamicznie trwałą mikroemulsję typu o/w o zawartości oleju równej 5% oraz zawartości emulgatora równej 5% i o średnicy kropel równej 3,9 nm. Do tak przygotowanej mikroemulsji dodaje się cyjaninę IR-786 w takiej ilości, aby nie uległa ona całkowitemu rozpuszczeniu, układ miesza się przez 4 godziny. Nadmiar cyjany usuwa się przez na filtrze strzykawkowym o średnicy porów 0,2 μm. Mikroemulsję z zasolubilizowanym fotouczulaczem schładza się do temperatury 5°C i wprowadza się do niej cyjanoakrylan etylu rozpuszczony w chloroformie (w stosunku 1:3, v/v) w takiej ilości, aby na każdy mililitr mikroemulsji przypadało 5 μ monomeru. Otrzymuje się nanokapsuły załadowane cyjaniną IR-786 o średnicy 220,7 nm, indeksie polidyspersyjności 0,152 potencjale zeta równym -31,3 mV i stopniu enkapsułowania cyjaniny równym 89,0%.

Charakterystykę mikroemulsji (średnica hydrodynamiczna, DH, współczynnik polidyspersyjności, Pdl, stosunek intensywności piku 1 i 3 we fluorescencyjnym widmie pirenu zasolubilizowanego w mikroemulsjach I1/I3 zebrano w poniższej Tabeli 1.

T a b e l a 1

Wybrane właściwości templatów mikroemulsyjnych powstających w układach: surfaktant cukrowy: izo-butanol/DGME/woda

zawartość procentowa	typ ME^a)	25°C	40°C	55°C
surfaktant+ kosurfaktant	olej	woda	Dh (nm)^b)	Pdl^c)	I1/l3^d)	Dh (nm)^b)	Pdl^c)	Dh (nm)^b)	Pdl^c)
C12-DGHA: izo-butanol/DGME/woda
5	5	90	o/w	6,8	0,163	1,39	6,2	0,251	6,2	0,358
10	5	85	o/w	7,0	0,182	1,38	6,0	0,261	6,1	0,341
15	5	80	o/w	7,4	0,126	1,38	7,1	0,396	6,7	0,452
bis(C12-GHA): izo-butanol/DGME/woda
5	5	90	o/w	3,9	0,113	nb	3,7	0,192	3.5	0,210
10	5	85	o/w	4,5	0,123	nb	4,2	0,211	4,0	0,241
15	5	80	o/w	5,3	0,112	nb	5,1	0,246	4,8	0,341

^a) typ mikroemulsji wyznaczony na podstawie pomiarów konduktometrycznych, ^b) DH - średnica hydrodynamiczna zmierzona techniką DLS, ^c) PdI - indeks polidyspersyjności; nb - nie badano

W Tabeli 2 przedstawiono, w jaki sposób czas reakcji, stężenie monomeru oraz pH wpływały na proces otrzymywania nanokapsuł, zaś w Tabeli 3 przedstawiono charakterystykę otrzymanych nanokapsuł pustych i załadowanych cyjaniną IR-780 oraz cyjaniną IR-786. W Tabeli 4 zaprezentowano medyczny aspekt wynalazku - potencjał hemolityczny otrzymanych nanokapsuł. Jako temlatów w przedstawionych przypadkach użyto mikroemulsji zawierających 5% emulgatora i 5% fazy olejowej.

PL 219 255 B1

T a b e l a 2

Wpływ czasu procesu, stężenia monomeru oraz pH na rozmiar nanokapsuł i wydajność polimeryzacji

mikroemulsja/templat	czas reakcji	ilość monomeru (gl/ml]	PH	Dh [nm]^a)	Dh2 [nm]^a)	Pdl^b)	W [%]
ω Ό o LU O Q o c ro -1—< =3 _Q Ó N < I O Q CM ó	20 minut	5,0	2,5	227,3	2245,1	0,810	-
30 minut	5,0	2,5	250,6	2193,4	0,769	62,1
60 minut	5,0	2,5	274,1	1843,2	0,654	74,7
2 godziny	5,0	2,5	280,6	1695,9	0,421	89,5
3 godziny	5.0	2,5	300,6	-	0,173	92,9
4 godziny	1,0	2,5	272,3	-	0,231	90,3
3,5	2,5	289,4	-	0,198	95,4
5,0	2,5	307,9	-	0,114	98,6
8,0	2,5	352,5	-	0,118	99,0
14,0	2,5	> 1 gm	-	0,983	99,1
5,0	5,0	336,3	-	0,238	98,7
5,0	6,0	382,7	-	0,531	97,6
5,0	7,0	-	-	-	98,5
5,0	8,0	-	-	-	97,9
5 godzin	5,0	2,5	305,5	-	0,136	98,7
6 godzin	5,0	2,5	310,3	-	0,126	99,0
8 godzin	V	2,5	312,8	-	0,129	99,2

^a DH - średnica hydrodynamiczna i ^b PdI - indeks polidyspersyjności otrzymane z pomiarów DLS

W Tabeli 3 przedstawiono parametry kapsuł poli(cyjanoakrylanu n-butylu) pustych i załadowanych fotouczulaczami, otrzymanych z mikroemulsji stabilizowanych surfaktantami cukrowymi

T a b e l a 3

Rozmiar (DH), polidyspersyjność (PdI) i potencjał zeta (ξ) kapsuł poli(cyjanoakrylanu n-butylu) pustych i załadowanych fotouczulaczami, otrzymanych z mikroemulsji stabilizowanych surfaktantami cukrowymi

mikroemul- sja/templat	Nanokapsuły
puste	załadowane IR-780	załadowane lR-786
układ	Dh [nm]	PdI	ξ [mv]	układ	Dh [nm]	PdI	ξ [mV]	EE %^a	układ	DH [nm]	PdI	ξ [mV]	EE %^a
C12-DGHA: izo-butanol/ DGME/woda	K190	340,7	0,127	-29,5	K193	333,0	0,078	-29,6	91,9	K196	362,3	0,139	-29,8	87,6
bis(C12-GHA): izo-butanol/ DGME/woda	K191	214,8	0,147	-31,2	K194	234,3	0,224	-31,0	92,6	K197	220,7	0,152	-31,3	89,0

^a Stopień enkapsulacji (EE %)

PL 219 255 B1

T a b e l a 4

Potencjał hemolityczny nanokapsuł poli(n-butylocyjanoakrylowych) na bazie mikroemulsji stabilizowanych przez surfaktanty cukrowe (oznaczenia jak w Tabeli 3 powyżej)

Nanokapsuly 0.5 mg/ml	Objętość w próbie (μ!)	PBS μΐ	Stężenie μg/ml	Stopień rozcieńczenia w zawiesinie RBC	A540	H (%)
			PUSTE
	1		49	2	1:250	0.047	2.3
KP*	2.5		47,5	5	1:100	0.050	2.6
	5		45	10	1:50	0.054	3.1
	15		35	30	1:17	0.057	3.5
	20		30	40	1:12.5	0.066	3.8
	40		10	80	1:6.25	0.069	4.2
		PEŁNE - z IR-780
K193	1	49	2	1:250	0.062	4.2
	2.5	47.5	5	1:100	0.068	4.8
	5	45	10	1:50	0.071	5.3
	15	35	30	1:17	0.076	5.9
	20	30	40	1:1:12.5	0.078	6.2
	40	10	80	1:6.25	0.080	6.5
K194	1	49	2	1:250	0.049	2.5
	2.5	47.5	5	1:100	0.052	2.9
	5	45	10	1:50	0.058	3.6
	15	35	30	1:17	0.061	4.1
	20	30	40	1:12.5	0.063	4.4
	40	10	80	1:6.25	0.067	4.8

* KP nanokapsuła pusta - analog K192 bez cyjaniny

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Polimerowa nanokapsuła z poli(alkilo cyjanoakrylanu) zawierająca ciekły rdzeń mikroeraulsji typu olej-w-wodzie, znamienna tym, że jest stabilizowana surfaktantem cukrowym wybranym z grupy obejmującej: N-dodecyIo-N,N-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]aminę lub N,N'-bisdodecylo-N,N'-bis[{3-D-glukoheptonylo amido)propylo]etylenodiaminę.
2. Nanokapsuła według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ponadto substancję aktywną, zwłaszcza przeciwnowotworową.
3. Sposób wytwarzania nanokapsuły z poli(alkilo cyjanoakrylanowych) określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że:

a. uzyskuje się emulgator poprzez zmieszanie surfaktantu cukrowego i izo-butanolu w stosunku wagowym 1:1, przy czym stosuje się surfaktant cukrowy wybrany z grupy obejmującej; N-dodecylo-N,N-bis[(3-D-glukoheptonyloamido)propylo]aminę lub N,N'-bisdodecylo-N,N'-bis[(3-D-glukoheptonylo amido)propylo]etylenodiaminę,

b. do uzyskanego emulgatora dodaje się od 1 do 70% wagowych fazy olejowej,

c. do uzyskanej mieszaniny dodaje się fazę wodną, w ilości od 1 do 99% wagowych i pozostawia się w temperaturze od 20 do 50°C do utworzenia mikroemulsji,

d. uzyskane templaty mikroemulsyjne miesza się z roztworem cyjanoakrylanu alkilu w chloroformie w stosunku objętościowym 1:3 i otrzymuje się stabilne nanokapsuły.

PL 219 255 B1
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że związek powierzchniowo czynny stosuje się w ilości 1 - 60% wag., fazę olejową ilości 0,1 - 20% wag., korzystnie stosuje się 0,1 - 5% wag. oleju i 1 - 5% surfaktantu, zgodnie z diagramami pseudotrójskładnikowymi.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako fazę olejową stosuje się eter monoetylowy glikolu dietylowego.
6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że po wymieszaniu wszystkich składników próbkę poddaje się równowagowaniu przez co najmniej 24 h w temp. pokojowej.
7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako monomer stosuje się cyjanoakrylan alkilu, korzystnie etylu lub n-butylu.
8. Sposób, według zastrz. 3, znamienny tym, że monomer stosuje się w ilości od 1 do 10 μΐ na ml mikroemulsji, korzystnie od 5 do 8 μΐ monomeru na ml mikroemulsji.
9. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że proces polimeryzacji międzyfazowej prowadzi się w temperaturze poniżej 10°C, korzystnie 5°C.
10. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że proces polimeryzacji międzyfazowej prowadzi się przez co najmniej 6 h, korzystnie 4 h.
11. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że proces polimeryzacji międzyfazowej prowadzi się przy ciągłym mieszaniu, przy prędkości mieszania wynoszącej od 500 do 1200 obrotów na minutę, korzystnie przy 1200 obrotów na minutę.