PL219321B1 - Adenowirus, kodujący go kwas nukleinowy, zawierający je układ replikacyjny, wektor, komórka i organizm, ich zastosowanie oraz środek farmaceutyczny - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy adenowirusów eksprymujących pierwsze białko wybrane spośród białka E1B i białka E4, przed drugim białkiem wybranym spośród białka E1A.

Description

Wynalazek dotyczy adenowirusa, kodującego go kwasu nukleinowego, zawierającego je układu replikacyjnego, wektora, komórki i organizmu, ich zastosowania, w szczególności do wytwarzania leku do leczenia nowotworów oraz środka farmaceutycznego.

Kilka rozwiązań terapeutycznych obecnie stosuje się w leczeniu nowotworów. Oprócz stosowania chirurgii, dominującymi metodami są chemioterapia i radioterapia. Jednakże techniki te związane są ze znacznymi skutkami ubocznymi. Zastosowanie wybiórczych względem replikacji wirusów onkolitycznych dostarcza nową platformę do leczenia nowotworów. W związku z tym, inicjowana jest selektywna wewnątrznowotworowa replikacja składnika wirusowego, która wywołuje replikację wirusa, lizę zakażonej komórki nowotworowej oraz rozprzestrzenienie wirusa do sąsiednich komórek nowotworowych. Ponieważ zdolność do replikacji wirusa jest ograniczona tylko do komórek nowotworowych, normalna tkanka jest wolna od replikacji, a zatem Iizy przez wirusa.

Dotychczas kilka układów wirusowych poddano próbom klinicznym mającym na celu lizę nowotworu. Jednym z przykładów takich adenowirusów jest dl1520 (Onyx-015), który skutecznie stosowano w badaniach fazy klinicznej I i II (Khuri, F. i in., Nature Medicine 6, 879-885, 2000). Onyx-015 jest adenowirusem mającym całkowicie wydeletowany gen E1B-55kDa. Całkowita delecja białka E1B55kDa adenowirusa jest oparta na odkryciu, że możliwa jest replikacja adenowirusowego wektora, a zatem Iiza komórek z deficytem p53 (Kirn, D. i in., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17, 391a, 1998), przy czym normalne komórki nie są uszkadzane. W szczególności, produkt genu E1B-55kDa uczestniczy w hamowaniu p53, transporcie wirusowego mRNA oraz wyłączaniu syntezy białek komórki gospodarza. Hamowanie p53 zachodzi przez wytwarzanie kompleksu składającego się z p53 oraz kodowanego przez adenowirus białka E1B-55kDa i/lub kompleksu składającego się z E1B-55kDa i E4orf6. p53, kodowany przez TP53, jest punktem wyjściowym złożonych mechanizmów regulacyjnych (Zambetti, G.P. i in., FASEB J. 7, 855-865, 1993), które powodują, między innymi, skuteczne hamowanie replikacji w komórce wirusów, takich jak adenowirus. Gen TP 53 jest wydeletowany lub zmutowany w około 50% wszystkich ludzkich nowotworów, co powoduje brak wymaganej apoptozy wynikającej z chemioterapii lub radioterapii, co powoduje zazwyczaj nieskuteczne leczenie nowotworu.

Dalsze rozwiązanie dotyczące adenowirusów wywołujących lizę nowotworu jest oparte na odkryciu, że jeżeli białko E1A jest obecne w specyficznej postaci z delecją lub zawiera jedną lub większą liczbę mutacji, które nie wpływają na wiązanie Rb/E2F i/lub p107/E2F i/lub p130/E2F, to taki adenowirus nie będzie indukować wchodzenia zakażonych komórek do fazy S i nie będzie zdolny do replikacji w komórkach nowotworowych, które nie mają funkcjonalnego białka Rb. Ponadto, białko E1A może mieć delecję na N-końcu i może zawierać jedną lub większą liczbę mutacji w regionie obejmującym pozycje aminokwasowe 1 - 76 białek E1A, w celu zahamowania wiązania E1A z p300, a zatem zapewnienia bardziej selektywnej replikacji w komórkach nowotworowych. Rozwiązania te pisano przykładowo w EP 0931830. Przykładami takich wirusów są AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07 i CB016 (Howe, J. A. i in., Molecular Therapy 2, 485-495, 2000; Fueyo, J. i in., Oncogene 19, 2-12, 2000; Hei-se, C. i in., Nature Medicine 6, 1134-1139, 2001; Balague, C. i in., J. Virol. 75, 7602-7611, 2001). Zatem te znane ze stanu techniki układy adenowirusowe do onkolizy zawierają różne delecje w białku E1A, przy czym delecje te wprowadzono przyjmując hipotezę, że nienaruszone białko Rb oraz kompleksy zawierające odpowiednio nienaruszone białko Rb i E2F, blokują wydajną replikację in vivo i zapewniają replikację adenowirusa in vivo tylko w komórkach Rb-ujemnych/zmutowanych. Te układy adnowirusowe, według stanu techniki, są oparte na E1A w celu kontrolowania replikacji in vivo przez wczesny promotor E2 i wolne E2F (Dyson, N. Genes & Development, 12, 2245-2262, 1998).

Dalsza postać układów wirusowych wywołujących lizę nowotworu jest oparta na zastosowaniu selektywnych promotorów do specyficznej ekspresji wirusowego onkogenu E1A, który zapewnia selektywną replikację w komórkach nowotworowych (Rodriguez, R. i in., Cancer Res. 57, 2559-2563, 1997).

Jak opisano powyżej, wybór tła komórkowego, które jest odpowiednie koncepcji leżącej u podstaw sposobu działania, jest istotne z punktu widzenia różnych rozwiązań dotyczących adenowirusowych wirusów wywołujących lizę nowotworu. Innymi słowy, różne obecnie znane układy adenowirusowe można stosować tylko gdy zrealizuje się różne warunki wstępne biologii molekularnej. Ogranicza to zastosowanie tych układów do konkretnych grup pacjentów.

Szczególny problem w leczeniu chorób nowotworowych wynika z faktu rozwijania się u pacjenta tak zwanej oporności wielolekowej (MDR), która stanowi szczególnie dobrze zbadaną postać opornoPL 219 321 B1 ści nowotworów na cytostatyki (Gottesman i Pastan, Annu. Rev. Biochem. 62, 385-427, 1993). Jest ona oparta na nadekspresji związanego z błoną białka transportowego, glikoproteiny P, która należy do tak zwanych transporterów ABC (Stein, U. i in., JBC 276, 28562-69, 2001, J. Wijnholds, Novartis Found Symp., 243, 69-79, 2002). Bargou, R. C. i in. oraz Oda, Y. i in. (Bargou, R. C. i in., Nature Medicine 3, 447-450, 1997; Clin. Cancer Res. 4, 2273-2277, 1998) byli w stanie wykazać, że jądrowa lokalizacja ludzkiego czynnika transkrypcyjnego YB-1 jest bezpośrednio związana z aktywacją ekspresji glikoproteiny P. Dalsze badania potwierdziły, że YB-1 jest transportowany do jądra dzięki różnym warunkom stresowym, takim jak naświetlanie UV, podanie cytostatyków (Koike, K. i in., FEBS Lett 17, 390-394, 1997) oraz hipertermia (Stein, U. i in., JBC 276, 28562-69, 2001). Dalsze badania potwierdziły, że jądrowa lokalizacja YB-1 ma wpływ na jeden kolejny transporter ABC. Ten transporter ABC jest nazywany MRP (białko związane z opornością wielolekową) i uczestniczy on w tworzeniu tak zwanej nietypowej nie zależnej od glikoproteiny oporności wielolekowej P (Stein, U. i in., JBC 276, 28562-69, 2001).

Problemem leżącym u podstaw wynalazku jest dostarczenie wskazówek technicznych, a w szczególności środków umożliwiających leczenie organizmu, w szczególności odpowiednio organizmu człowieka i grupy pacjentów, specyficznie środkami aktywnymi w wywoływaniu Iizy nowotworu. Dalszym problemem leżącym u podstaw wynalazku jest dostarczenie środków, które są odpowiednie do wywołania Iizy nowotworu u pacjentów z chorobami nowotworowymi, które są oporne na cytostatyki, w szczególności tymi, które wykazują oporność wielolekową. Na koniec problemem leżącym u podstaw wynalazku jest dostarczenie adenowirusa, który jest odpowiedni do Iizy komórek.

Wynalazek dotyczy adenowirusa eksprymującego pierwsze białko, wybrane z grupy obejmującej białko E1B i białko E4, przed drugim białkiem, które jest wybrane z grupy obejmującej białka E1A, przy czym ten adenowirus zawiera co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący białko E1A, przy czym ekspresja białka E1A jest pod kontrolą promotora, który jest inny niż promotor kontrolujący ekspresję tego białka w adenowirusie typu dzikiego, a ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotor adenowirusowy jest różny od promotora E1A.

Korzystny jest adenowirus, w którym pierwszym białkiem jest białko E1B, korzystnie białko E1B55kD.

Korzystny jest również adenowirus, w którym pierwszym białkiem jest białko E4, korzystnie białko E4orf6.

Korzystny jest także adenowirus, w którym pierwsze białko stanowi połączenie białka E1B i białka E4, korzystnie połączenie białka E1B55kD i białka E4orf6.

Korzystny jest adenowirus, w którym białkiem E1A jest białko E1A12S.

Korzystny jest adenowirus, w którym co najmniej jedno białko jest białkiem E1A12S.

Korzystny jest adenowirus, w którym co najmniej jedno białko stanowi połączenie białka E1B i białka E1A, korzystnie połączenie białka E1B55kD i białka E1A12S.

Korzystny jest adenowirus, w którym co najmniej jedno białko stanowi połączenie białka E4 i białka E1A, korzystnie połączenie białka E4orf6 i białka E1A12S.

Korzystny jest adenowirus, w którym co najmniej jedno białko stanowi połączenie białka E1B, białka E4 i białka E1A, korzystnie połączenie białka E1B55kD, białka E4orf6 i białka E1A12S.

Korzystny jest adenowirus, w którym ekspresja białka E1B jest kontrolowana przez promotor, przy czym ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotor adenowirusowy jest różny od promotora E1B.

Korzystny jest adenowirus, w którym ekspresja białka E4 jest kontrolowana przez promotor, przy czym ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotor adenowirusowy jest różny od promotora E4.

Korzystnie promotorem adenowirusowym jest promotor E1A.

Korzystny jest adenowirus, w którym promotor kontrolujący ekspresję białka E1A jest kontrolowany przez YB-1 lub może być regulowany przez YB-1.

Korzystny jest adenowirus, w którym promotor kontrolujący ekspresję białka E1A jest adenowirusowym późnym promotorem E2.

PL 219 321 B1

Korzystny jest adenowirus, w którym białko E4, korzystnie białko E4orf6, oraz białko E1B, korzystnie białko E1B55kD, są pod kontrolą tego samego lub wspólnego promotora.

Korzystny jest adenowirus, który dostarcza YB-1 do jądra przez co najmniej jedno białko adenowirusowe lub dostarczanie YB-1 do jądra jest pośredniczone przez co najmniej jedno białko adenowirusowe, przy czym korzystnie to białko adenowirusowe jest różne od E1A.

Korzystny jest adenowirus, który dostarcza YB-1 do replikacji adenowirusa przez co najmniej jedno białko adenowirusowe lub pośredniczy w dostarczeniu YB-1 do replikacji adenowirusa przez co najmniej jedno białko adenowirusowe, przy czym korzystnie to białko adenowirusowe jest różne od E1A.

Korzystnie to białko adenowirusowe stanowi kompleks E4orf6 i E1B55kD.

Korzystny jest adenowirus, w którym kwas nukleinowy adenowirusa zawiera co najmniej jeden funkcjonalnie nieaktywny region adenowirusowy, przy czym ten region jest wybrany z grupy obejmującej region E1, region E3, region E4 oraz ich połączenia.

Korzystnie tym regionem jest region E1.

Również korzystnie tym regionem jest region E3.

Korzystnie także tym regionem jest region E4.

Najkorzystniej ten region zawiera region E1, region E3 i region E4.

Korzystny jest adenowirus, który zawiera co najmniej jedną kasetę ekspresyjną, przy czym ta kaseta ekspresyjna zawiera co najmniej jeden promotor i kwas nukleinowy kodujący białko adenowirusowe, przy czym białkiem adenowirusowym jest białko E1B, korzystnie białko E1B55kD.

Korzystnie ten promotor jest inny niż promotor E1B.

Korzystnie ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotor jest różny od promotora E1B.

Korzystny jest adenowirus, który zawiera co najmniej jedną kasetę ekspresyjną, przy czym ta kaseta ekspresyjna zawiera co najmniej jeden promotor i kwas nukleinowy kodujący białko adenowirusowe, przy czym białkiem adenowirusowym jest białko E4, korzystnie białko E4orf6.

Korzystnie ten promotor jest różny od promotora E4.

Korzystnie ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotory adenowirusowe są różne od promotora E4.

Korzystnie tym promotorem jest promotor E1A.

Korzystny jest adenowirus, który zawiera co najmniej jedną kasetę ekspresyjną, przy czym ta kaseta ekspresyjna zawiera co najmniej jeden promotor i kwas nukleinowy kodujący białko adenowirusowe, przy czym białkiem adenowirusowym jest białko E1A, korzystnie białko E1A12S.

Korzystnie ten promotor jest różny od promotora E1A.

Korzystnie ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe.

Korzystny jest adenowirus, który zawiera kwas nukleinowy, który to kwas nukleinowy koduje YB-1.

Korzystnie kwas nukleinowy kodujący YB-1 jest pod kontrolą promotora, przy czym promotorem korzystnie jest późny promotor E2.

Korzystnie kwas nukleinowy kodujący YB-1 jest pod kontrolą promotora, który to promotor jest zależny od YB-1 lub kontrolowany przez YB-1.

Korzystnie kwas nukleinowy kodujący YB-1 stanowi część kasety ekspresyjnej zawierającej kwas nukleinowy kodujący białko E1A, korzystnie kwas nukleinowy kodujący białko E1A12S.

Korzystnie kwas nukleinowy kodujący białko E1A jest oddzielony od kwasu nukleinowego kodującego YB-1 przez sekwencję IRES.

Korzystny jest adenowirus, w którym kwas nukleinowy kodujący białko E4, korzystnie białko E4orf6, oraz kwas nukleinowy kodujący białko E1B, korzystnie białko E1B55kD, znajdują się w kasecie ekspresyjnej, przy czym korzystnie te dwie sekwencje kodujące są rozdzielone sekwencją IRES.

Korzystnie promotor kasety ekspresyjnej jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotory adenowirusowe są różne od promotora E4 oraz różne od promotora E1B, korzystnie są różne od promotora E4 typu dzikiego oraz różne od promotora E1B typu dzikiego.

PL 219 321 B1

Korzystny jest adenowirus, który zawiera kasetę ekspresyjną zawierającą promotor oraz sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmującej aptamery, rybozymy, aptazymy, cząsteczki antysensowne i siRNA.

Korzystny jest także adenowirus, który zawiera kasetę ekspresyjną zawierającą promotor oraz sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym tę sekwencję kwasu nukleinowego stanowi kodujący kwas nukleinowy, przy czym ten kwas nukleinowy koduje cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej peptydy, polipeptydy, białka, antykaliny, przeciwciała i fragmenty przeciwciał.

Korzystny jest również adenowirus, który zawiera kasetę ekspresyjną, przy czym ta kaseta ekspresyjna zawiera promotor i sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym ta sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmującej geny wywołujące apoptozę, geny proleków, inhibitory proteaz, geny supresory nowotworów, cytokiny oraz inhibitory angiogenezy.

Korzystnie adenowirus jest rekombinowanym adenowirusem.

Korzystnie adenowirus jest mutantem adenowirusa.

Korzystny jest adenowirus, który jest defektywny replikacyjnie.

Korzystnie adenowirus jest zdolny do replikacji w komórkach zawierających rozregulowany YB-1 lub zawierających YB-1 w jądrze.

Korzystnie te komórki zawierają YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego.

Wynalazek dotyczy ponadto kwasu nukleinowego kodującego adenowirus zdefiniowany powyżej.

Wynalazek dotyczy także układu replikacyjnego zawierającego kwas nukleinowy zdefiniowany powyżej oraz kwas nukleinowy wirusa pomocniczego, przy czym kwas nukleinowy wirusa pomocniczego zawiera jedną lub większą liczbę kaset ekspresyjnych adenowirusa zdefiniowanego powyżej.

Korzystny jest układ replikacyjny, w którym ten adenowirus lub kodujący go kwas nukleinowy nie zawiera kasety ekspresyjnej zawartej w wirusie pomocniczym.

Wynalazek dotyczy również wektora zawierającego kwas nukleinowy zdefiniowany powyżej i/lub układ replikacyjny zdefiniowany powyżej.

Korzystny jest wektor, który jest wektorem ekspresyjnym.

Wynalazek dotyczy także komórki zawierającej adenowirus zdefiniowany powyżej i/lub kwas nukleinowy zdefiniowany powyżej i/lub układ replikacyjny zdefiniowany powyżej i/lub wektor zdefiniowany powyżej.

Korzystna jest komórka, która jest komórką eukariotyczną, korzystnie komórką zwierzęcą, najkorzystniej komórką ssaczą.

Korzystnie komórka ssacza jest komórką wybraną z grupy obejmującej komórki mysie, szczurze, świnek morskich, świńskie, owcze, kozie, bydlęce, końskie, psie, kocie i ludzkie.

Wynalazek dotyczy ponadto organizmu zawierającego adenowirus zdefniowany powyżej, kwas nukleinowy zdefniowany powyżej, układ replikacyjny zdefniowany powyżej, wektor zdefniowany powyżej lub komórkę zdefniowaną powyżej, przy czym ten organizm jest wybrany z grupy obejmującej myszy, szczury, świnki morskie, świnie, owce, kozy, bydło, konie, psy i koty.

Wynalazek dotyczy także zastosowania adenowirusa zdefniowanego powyżej, kwasu nukleinowego zdefniowanego powyżej, układu replikacyjnego zdefniowanego powyżej, wektora zdefniowanego powyżej lub komórki zdefniowanej powyżej do replikacji adenowirusa in vitro.

Korzystne jest zastosowanie adenowirusa zdefniowanego powyżej, kwasu nukleinowego zdefniowanego powyżej, układu replikacyjnego zdefniowanego powyżej, wektora zdefniowanego powyżej lub komórki zdefniowanej powyżej, do wytwarzania adenowirusa in vitro.

Wynalazek dotyczy również zastosowania in vitro adenowirusa zdefniowanego powyżej, kwasu nukleinowego zdefniowanego powyżej, układu replikacyjnego zdefniowanego powyżej, wektora zdefniowanego powyżej lub komórki zdefniowanej powyżej, do ekspresji genów, korzystnie genów, które wywołują lizę komórki, korzystnie lizę komórki podczas replikacji adenowirusa i/lub wywołują lizę komórki za pomocą adenowirusa.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania adenowirusa zdefniowanego powyżej, kwasu nukleinowego zdefniowanego powyżej, układu replikacyjnego zdefniowanego powyżej, wektora zdefniowanego powyżej lub komórki zdefniowanej powyżej, do wytwarzania leku.

Korzystne jest zastosowanie, w którym komórka, w której replikuje się adenowirus, zawiera YB-1 w swoim jądrze, korzystnie zawiera YB-1 w swoim jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego.

Korzystne jest zastosowanie, w którym komórka, w której replikuje się adenowirus, zawiera rozregulowany YB-1.

PL 219 321 B1

Korzystne jest zastosowanie, w którym lek przeznaczony jest do leczenia chorób nowotworowych.

Korzystne jest zastosowanie, w przypadku gdy choroba nowotworowa jest wybrana z grupy obejmującej nowotwory złośliwe, raka, choroby rakowe oraz guzy.

Korzystne jest zastosowanie, w przypadku gdy nowotwory są wybrane z grupy obejmującej guzy lite, nielite, złośliwe i łagodne.

Korzystne jest zastosowanie, w przypadku gdy co najmniej część komórek tworzących nowotwór zawiera YB-1 w jądrze, korzystnie zawiera YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego.

Korzystne jest zastosowanie, w przypadku gdy co najmniej część komórek tworzących nowotwór zawiera rozregulowany YB-1.

Korzystne jest zastosowanie, w przypadku gdy co najmniej część komórek tworzących nowotwór stanowią komórki Rb-dodatnie lub Rb-ujemne.

Korzystne jest zastosowanie, w przypadku gdy co najmniej część komórek tworzących nowotwór wykazuje oporność, korzystnie oporność wielokrotną w stosunku do środków farmaceutycznie czynnych.

Korzystne jest zastosowanie, w przypadku gdy ta oporność jest opornością wielokrotną.

Korzystne jest zastosowanie, w przypadku gdy ta oporność jest opornością przeciw środkom przeciwnowotworowym, korzystnie cytostatykom i/lub że ta oporność jest wywołana przez naświetlanie.

Korzystne jest zastosowanie, w którym pacjent, któremu podaje się lek, zawiera wiele komórek, przy czym komórki te są komórkami takimi jak opisane powyżej.

Korzystne jest zastosowanie, w którym lek zawiera co najmniej jeden kolejny środek farmaceutycznie czynny.

Korzystne jest zastosowanie, w którym lek podaje się razem ze środkiem farmaceutycznie czynnym lub jest do tego przeznaczony.

Korzystne jest zastosowanie, w którym kolejny środek farmaceutycznie czynny jest wybrany z grupy obejmującej cytokiny, inhibitory metaloproteinaz, inhibitory angiogenezy, cytostatyki, inhibitory kinazy tyrozynowej oraz inhibitory cyklu komórkowego.

Korzystne jest zastosowanie, w którym lek podaje się przed, podczas lub po naświetleniu.

Korzystne jest zastosowanie, w którym promieniowanie stosuje się w celu leczenia nowotworu.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczoną komórkę lub organizm poddaje się działaniu środka, przy czym ten środek jest wybrany z grupy obejmującej naświetlanie, podanie cytostatyków oraz hipertermię.

Korzystne jest zastosowanie, w którym środek stosuje się miejscowo lub ogólnoustrojowo.

Korzystne jest zastosowanie, w którym przy naświetlaniu stosuje się promieniowanie o wysokiej energii, korzystnie jakiekolwiek naświetlanie stosowane w leczeniu chorób nowotworowych.

Wynalazek dotyczy także zastosowania adenowirusa zdefniowanego powyżej, kwasu nukleinowego zdefniowanego powyżej, układu replikacyjnego zdefniowanego powyżej, wektora zdefniowanego powyżej lub komórki zdefniowanej powyżej, do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych, przy czym choroba nowotworowa jest wybrana z grupy obejmującej nowotwory sutka, nowotwory kości, nowotwory żołądka, nowotwory jelita, nowotwory pęcherzyka żółciowego, nowotwory trzustki, nowotwory wątroby, nowotwory nerek, nowotwory mózgu, nowotwory jajników, nowotwory skóry, nowotwory przydatków skórnych, nowotwory głowy i szyi, nowotwory macicy, nowotwory maziówkowe, nowotwory krtani, nowotwory przełyku, nowotwory języka oraz nowotwory prostaty, przy czym korzystnie jedna z powyższych chorób nowotworowych wykazuje cechy opisane w powyższych zastrzeżeniach.

Wynalazek dotyczy również zastosowania adenowirusa zdefniowanego powyżej, kwasu nukleinowego zdefniowanego powyżej, układu replikacyjnego zdefniowanego powyżej, wektora zdefniowanego powyżej lub komórki zdefniowanej powyżej, do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych, przy czym promotor nowotworowo-specyficzny jest promotorem, który jest specyficzny względem nowotworu dla którego stosuje się ten lek.

Wynalazek dotyczy także środka farmaceutycznego, który zawiera adenowirus zdefniowany powyżej, kwas nukleinowy zdefniowany powyżej, układ replikacyjny zdefniowany powyżej, wektor zdefniowany powyżej lub komórkę zdefniowaną powyżej oraz ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Ujawnione powyżej adenowirusy według wynalazku nazywa się tutaj także adenowirusami grupy I, a adenowirusy zawierające transaktywujące białko onkogenu, takie jak np. E1A, i/lub te, które

PL 219 321 B1 określa się tutaj jako stosowane według wynalazku, nazywa się także tutaj adenowirusami grupy II.

Adenowirusy grupy I i adenowirusy grupy II zbiorczo nazywa się tutaj adenowirusami lub adenowirusami według wynalazku lub wirusami według wynalazku.

Wynalazek jest oparty na zaskakującym odkryciu, że odwrócenie sekwencji ekspresji genów adenowirusowych powoduje wydajną replikację i w ostateczności lizę komórki zakażonej przez adenowirusa. W odniesieniu do chronologicznie zmienionej ekspresji genów adenowirusowych szczególny nacisk należy położyć na białko E1B i białko E4, które także nazywa się tutaj samodzielnie lub łącznie, pierwszym białkiem, które jest eksprymowane przed drugim białkiem. Drugie białko jest wybrane z grupy obejmującej białka E1A. Ta sekwencja ekspresji, która jest odwrócona w porównaniu z adenowirusami typu dzikiego, w którym eksprymowane jest najpierw białko E1A dopiero następnie białko E1B i białko E4, zapewnia aktywację czynników transkrypcyjnych, np. ich transport do jądra zakażonej komórki, a tam wpływa na dalszą aktywność replikacyjną adenowirusów. Kinetykę transkryptów adenowirusowych w adenowirusach typu dzikiego opisano w, np. Glenn G. M. i Ricciardi R.

P. Virus Research 1988, 9, 73-91, gdzie opisano, że u transkrypty E1A typu dzikiego, tj. transkrypt E1A12S oraz transkrypt E1A13S, są zazwyczaj wykrywalne przed transkryptami lub produktami translacji E4orf6 i E1B55k. W danym przypadku białkiem E1B jest, również zasadniczo, o ile nie zaznaczono tego inaczej, korzystnie białko E1B-55kD. W danym przypadku białkiem E4 jest, również zasadniczo, o ile nie zaznaczono tego inaczej, korzystnie białko E4orf6. W danym przypadku białkiem E1A jest, również zasadniczo, o ile nie zaznaczono tego inaczej, korzystnie białko E1A12SD lub takie białko E1A jak opisano w odniesieniu do E1A-modyfikowanych adenowirusów.

Wynalazkiem objęte jest to, że białko E1A, w szczególności białko E1A12S, zasadniczo może być podstawione. Takie podstawione białka E1A lub białka E1A12S, nazywa się tutaj białkiem E1A lub białkiem E1A12S, lub uznaje się je za objęte tym określeniem, chyba że wskazano inaczej. Zamiast białka E1A12S, można stosować także białko E1A, które posiada funkcję supresora nowotworów, tak jak np. opisano w Dickopp A, Esche H, Swart G, Seeber S, Kirch HG, Opalka B. Cancer Gene Ther. 2000, lipiec; 1(7): 1043-50. Dalsze pochodne białek E1A, w szczególności białka E1A12S, w stosowanym tutaj znaczeniu i/lub jak tutaj się je nazywa, są także takimi białkami, które są zdolne do uwalniania czynnika E2F z kompleksu Rb/E2F. Są nimi, między innymi, antygen nowotworowy wirusa małpiego 40 (duży antygen T SV40), białko E7 wirusa brodawczaka (HPV E7), jak opisano w Chellappan

S. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 4549-4533.

Wynalazkiem objęta jest także możliwość stosowania pochodnych E4orf6 i E1B55k, przy czym termin E4orf6 i E1B55k, w zastosowanym tutaj znaczeniu, obejmuje takie pochodne. Pochodne takie opisano w, np. Shen Y i in., J. of Virology 2001, 75, 4297-4307; Querido E. i in., J. of Virology 2001, 75, 699-709.

Zgodnie z wynalazkiem białko E1B jest eksprymowane przed białkiem E1A lub białko E4 jest eksprymowane przed białkiem E1A albo zarówno białko E1B, jak i białko E4 są eksprymowane przed białkiem E1A, z których każde opisano powyżej.

Adenowirus zaprojektowany w taki sposób jest zdolny do replikowania się na wyjątkowo wysokim poziomie po zakażeniu komórki, która eksprymuje YB-1 w jądrze, korzystnie eksprymuje YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego lub która ma rozregulowany YB-1, korzystnie w cytoplazmie. Nie mając na celu ograniczania się przez poniższe stwierdzenie, przyjmuje się, że odpowiednio kompleks składający się z białka E1B i/lub białka E4 lub każde z tych białek samodzielnie, jest/są w stanie transportować rozregulowany YB-1 do jądra komórkowego i jest/są w stanie inicjować tam replikację adenowirusa pod wpływem białka E1B i/lub białka E4 eksprymowanych przed białkiem E1A. Gdy YB-1 znajdzie się w jądrze komórkowym lub jest tam obecny w aktywowanej postaci, może, jak tutaj opisano, w szczególności przy pomocy późnego promotora E2, wydajnie prowadzić replikację. Zatem chronologicznie wczesna ekspresja białka E1B i/lub białka E4 zapobiega wystąpieniu kaskady obserwowanej u typu dzikiego równolegle z początkową ekspresją białka E1A. W korzystnej postaci białko E1A jest białkiem E1A, które w szczególności nie transaktywuje, lub transaktywuje w bardzo niewielkim stopniu, białka E1B i/lub białka E4. Korzystnie, ta transaktywacja jest niewystarczająca do zapewnienia wydajnej replikacji, ani też nie jest wystarczająca do zapewnienia replikacji w komórkach, które nie zawierają YB-1 w jądrze. Korzystne jest aby ta transaktywacja nie występowała w komórkach, które nie zawierają YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego, lub, które nie zawierają rozregulowanego YB-1.

Wynalazek jest ponadto oparty na zaskakującym odkryciu, że adenowirus jest zdolny do replikowania się w szczególnie wydajny sposób, jeżeli zawiera co najmniej jeden kwas nukleinowy kodują8

PL 219 321 B1 cy białko, które to białko jest wybrane z grupy obejmującej białka E1B, białka E4 i białka E1A, i co najmniej jedno z tych białek jest pod kontrolą promotora, który różni się od promotora kontrolującego ekspresję odpowiedniego białka w adenowirusie typu dzikiego. Taka replikacja jest szczególnie wydajna i zazwyczaj powoduje lizę nowotworu w przypadku gdy komórki zawierają YB-1 w jądrze, w szczególności zawierają YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego, lub w przypadku gdy komórki zawierają rozregulowany YB-1, w szczególności zawierają rozregulowany YB-1 w cytoplazmie. To co wcześniej stwierdzono odnośnie białka E1B, białka E4 i białka E1A, ma także zastosowanie tutaj. W adenowirusach typu dzikiego białko E1B jest kontrolowane przez promotor E1B, białko E4 jest kontrolowane przez promotor E4, a białko E1A jest kontrolowane przez promotor E1A. Przez wybór promotorów różniących się od tych, które kontrolują ekspresję wspomnianych powyżej białek w adenowirusach typu dzikiego, zmieniona zostaje ekspresja wspomnianych powyżej białek, a zatem wzajemna zależność regulacyjna poszczególnych kwasów nukleinowych i białek adenowirusa. Przez wybór promotorów można stworzyć wzór ekspresji o innej chronologii, który, nie mając na celu ograniczania się przez poniższe stwierdzenie, wywołuje obserwowaną replikację w komórkach, przy czym mechanizm ten może być taki jak wcześniej opisano w odniesieniu do chronologicznie różnej ekspresji adenowirusowych białek E1B, E4 i E1A. Przykład specyficznego projektu mającego na celu kontrolowanie wspomnianych białek przez promotory inne niż promotory kontrolujące ekspresję odpowiednich białek adenowirusie typu dzikiego, można znaleźć w części dotyczącej przykładów, gdzie w szczególności reprezentatywne są wirusy nazwane tam XVirPSJL1 i XVirPSJL2. Korzystnie, białkiem E1B jest białko E1B55kD, białkiem E4 jest białko E4orf6, a białkiem E1A jest białko E1A12S.

Promotory, które korzystnie kontrolują białko E1B, a także białko E4, są wybrane z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, pod warunkiem, że gdy stosuje się promotory adenowirusowe, różnią się one od promotora E1B w przypadku kontrolowania ekspresji białka E1B, oraz różnią się od promotora E4 w przypadku kontrolowania ekspresji białka E4. Zastosowanie promotora E1A do kontrolowania ekspresji białka E1B i/lub białka E4 jest szczególnie korzystne. Promotor E1A opisano, np. w Boulanger P. A. i Blair, G. E. Biochem. J. 1991, 275, 281-299. Ponadto, możliwe jest także zastosowanie jakiegokolwiek innego heterologicznego prom otora, tzn. promotora, który różni się od promotora kontrolującego ekspresję odpowiedniego białka w adenowirusie typu dzikiego. Reprezentatywnym przykładem jest tutaj promotor CMV, przy czym inne promotory, które można zastosować będą oczywiste dla specjalistów.

Promotor, który stosuje się do kontrolowania białka E1A, można także wybrać z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, pod warunkiem, że promotor adenowirusowy różni się od promotora E1A. Wynalazkiem objęte jest to, że jedno lub kilka z powyżej wspomnianych białek, tzn. białko E1B, białko E4 lub białko E1A, jest pod kontrolą tego samego promotora, przy czym jednakże korzystne jest aby konkretnie białko E1B i białko E4 były pod kontrolą tego samego promotora. Szczególnie korzystne jest aby ekspresja białka E1A była kontrolowana przez promotor kierowany YB-1 lub przez promotor, który jest regulowany przez YB-1. Takie promotory ujawniono w związku z innymi aspektami wynalazku. Zastosowanie adenowirusowego późnego promotora E2 jest szczególnie korzystne do kierowania ekspresji promotora E1A, gdyż po pierwsze może być on regulowany przez YB-1, a po drugie wykazuje tylko niewielką transkrypcję przy braku YB-1, którą można w zasadzie pominąć, tak że zapewniona jest bardzo dobra kontrola ekspresji kwasu nukleinowego, który jest pod kontrolą późnego promotora E2. Znacznie zwiększa to biologiczne bezpieczeństwo, w szczególności przy stosowaniu w dziedzinie medycyny.

Ponadto stwierdzono, że adenowirusy będą szczególnie dobrze ulegać replikacji w komórkach, które zawierają YB-1 w jądrze, w szczególności zawierają YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego i/lub zawierają rozregulowany YB-1, korzystnie zawierają rozregulowany YB-1 w cytoplazmie, jeżeli YB-1 jest dostarczony do replikacji bezpośrednio lub pośrednio w szczególności w jądrze komórkowym lub gdy dostarczenie YB-1 jest bezpośrednio lub pośrednio kierowane przez białko adenowirusowe, przy czym takie białko adenowirusowe jest różne od E1A. Ten aspekt różni się od ujawnionego także tutaj aspektu, w którym zastosowanie transaktywujących, E1A-zmodyfikowanych adenowirusów, umożliwia replikację tych wirusów w komórkach nowotworowych z YB-1-dodatnim jądrem, w szczególności w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem, które są YB-1-dodatnie niezależnie od fazy cyklu komórkowego, oraz w komórkach, które mają rozregulowany YB-1, w szczególności w cytoplazmie, pod tym względem, że cechy transaktywujące białka E1A, w szczególności białka

PL 219 321 B1

E1A13S, tzn. w odniesieniu do adenowirusów grupy I, nie są tutaj wykorzystywane, ale raczej w korzystnej postaci białko E1A13S jest funkcjonalnie nieaktywne, a zatem nie jest dalej zdolne do transaktywacji E4orf6 i E1B55kD, które uczestniczą w transporcie lub dostarczeniu YB-1 do jądra bezpośrednio lub pośrednio, tak że nie jest możliwa wydajna replikacja adenowirusa zgodnie z pierwszym aspektem wynalazku. Na tyle na ile jest to możliwe, dostarczenie YB-1 do jądra lub dostarczenie YB-1 do replikacji adenowirusów nie jest już pod kontrolą bezpośredniego lub pośredniego wpływu białka E1A, ale zachodzi przez ekspresję białka E1B, w szczególności białka E1B55kD, i/lub białka E4, w szczególności białka E4orf6, która nie jest kontrolowana przez E1A.

Tą postać adenowirusa można także dostarczyć przy pomocy jednego z opisanych powyżej środków, np. przez przyspieszenie chronologicznej ekspresji białka E1B i/lub białka E4 w porównaniu z ekspresją białka E1A, lub umieszczenie jednego lub kilku z białek E1B, białek E4 i białek E1A pod kontrolą promotora, który różni się od promotora kontrolującego ekspresję odpowiedniego białka w adenowirusie typu dzikiego.

Na koniec, wychodzi się od zaskakującego odkrycia, że wydajna aktywna replikacja adenowirusa może także zachodzić, w szczególności w komórkach, które zawierają YB-1 w jądrze, w szczególności zawierają YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego lub w komórkach, które zawierają rozregulowany YB-1, korzystnie w cytoplazmie, w przypadku gdy co najmniej jedno z białek E1B, białek E4 i białek E1A, w szczególności ich korzystne postaci, jest eksprymowane w kasecie ekspresji pod kontrolą promotora. W jednej postaci wynalazku zasadniczo dostarcza się trzy kasety ekspresyjne, z których każda zawiera jedno wspomniane białko. W alternatywnej postaci kaseta ekspresyjna może także zawierać dwa lub większą liczbę białek E1B, E4 i E1A lub ich pochodnych i możliwych składników, w szczególności w przypadku E1A12S. To co wcześniej wspomniano w odniesieniu do aspektu, w którym adenowirusy zawierają kwasy nukleinowe związane z białkami E1B, E4 i E1A, ma zasadniczo zastosowanie się także do zaprojektowania różnych białek i odpowiednio stosowanych promotorów. Przy stosowaniu takich kaset ekspresyjnych korzystne jest aby białka lub kodujące je kwasy nukleinowe w genomie adenowirusa typu dzikiego, które odpowiadają odpowiednim białkom kaset ekspresyjnych, były całkowicie lub częściowo wydeletowane, aby sprawić by wirus był stabilny i zapobiec rekombinacjom, co najmniej w większym stopniu.

Kasety ekspresyjne można zasadniczo wklonować do każdego regionu lub w każde miejsce adenowirusa, przy czym korzystnie jedna lub większa liczba kaset jest wstawiona, indywidualnie lub w połączeniu ze sobą, w region E1, region E3 i/lub region E4 wirusa. Możliwe jest aby kwasy nukleinowe regionu E1, E3 i E4 były całkowicie wydeletowane, częściowo wydeletowane lub w ogóle nie wydeletowane, przy czym korzystne jest w odniesieniu do adenowirusów według wynalazku, żeby kwas nukleinowy kodujący gen E1A13S był inaktywowany lub wydeletowany, tak aby wirus nie dostarczał jakiegokolwiek transaktywującego białka E1A. Zakres takiej delecji w jednym lub kilku regionach E1, E3 i E4 jest wyznaczany przez stosowaną kasetę ekspresyjną oraz, ewentualnie, wprowadzone dodatkowo obce geny lub transgeny albo zawierające je dalsze kasety ekspresyjne, czyli geny, które są inne niż geny adenowirusowe, co najmniej inne w takim znaczeniu, że nie są one dostarczone w kontekście regulatorowym adenowirusowego kwasu nukleinowego, który przeważa w adenowirusie typu dzikiego, lub nie są dostarczone w adenowirusowych sekwencjach kwasów nukleinowych adenowirusów typu dzikiego w takim miejscu. Możliwe jest także to, że kwas(-y) nukleinowy(-e) znajdujący(-e) się w jednej lub kilku kasetach ekspresyjnych kodujących białko E1B, białko E4 i/lub białko E1A, jest/są częściowo lub całkowicie wydeletowany(-e) w genomie adenowirusów. W jednej postaci, np. w adenowirusie według wynalazku XvirPSJL 1 lub 2, adenowirusowy kwas nukleinowy kodujący E4orf6 jest częściowo wydeletowany, jednakże kodujący je kwas nukleinowy pełnej długości znajduje się w kasecie ekspresyjnej. Korzystnie, można to także zrealizować dla białka E1B55k (nazywanego także E1 55Kd) i/lub białka E1A12S. W korzystnych postaciach zasięg delecji wybiera się tak aby osiągnąć maksymalną pakowaną wielkość wynoszącą 103% maksymalnej pakowanej wielkości adenowirusów typu dzikiego, jednakże granica ta jest jedynie korzystną granicą. Możliwe delecje, które można wprowadzić do genomu adenowirusa są tylko ograniczane, w korzystnych postaciach, tym aby zapewnić nadal wytwarzanie nadal zakaźnych i pakowanych cząstek. Dokładny zasięg delecji może wyznaczyć specjalista na podstawie ujawnienia w połączeniu ze standardowymi testami.

Jako punkt wyjściowy do konstrukcji opisanych tutaj adenowirusów, można zastosować jakikolwiek adenowirus typu dzikiego, jednakże można zastosować także inne adenowirusy, pod warunkiem, że konstruuje się je zgodnie ze wskazówkami technicznymi wynalazku. Szczególnie korzystne jest

PL 219 321 B1 zastosowanie adenowirusów podgrupy C oraz, z kolei w obrębie tej grupy, adenowirusa 2 i adenowirusa 5.

Określenia białko E1B i białka E1B, białko E4 i białka E4, a także białko E1A i białka E1 stosuje się tutaj jako oznaczające synonimy, chyba że wskazano inaczej.

W stosowanym tutaj znaczeniu, termin „rozregulowany” YB-1 dotyczy cząsteczki YB-1 lub białka YB-1, jak tutaj opisano, które jest obecne w postaci, która jest ilościowo i/lub jakościowo inna niż postać YB-1 normalnie obecna w komórkach, korzystnie komórkach nienowotworowych. Rozregulowany YB-1 można scharakteryzować i zidentyfikować jako taki przez konkretne wirusy, które są w stanie replikować się w obecności rozregulowanego YB-1, w tle komórkowym zawierającym taki rozregulowany YB-1. Związanymi z tym konkretnymi wirusami są te, których białko E1A jest zmutowane i wykazuje funkcję transaktywującą. Przykładami tych konkretnych wirusów są AD delta 24, dl922947, E1 Ad/01/07 i CB 016 i/lub te które opisano w von Howe, J. A i in., Molecular Therapy 2, 485495, 2000; Fueyo J. i in., Oncogene 19, 2-12, 2000; Heise C. i in., Nature Medicine 6, 1134-1139, 2001; Balague, C i in., J. Virol. 75, 7602-7611, 2001; Bautista, D.S. i in., Virology 1991, 182, 578-596; Jelsma T.N. i in., Virology 1988, 163, 494-502; Wong, H. K. i Ziff E.B., J. of Virology 1994, 68, 49104920]. Taką komórkę lub komórkę zawierającą takie tło można zastosować do replikacji adenowirusów grupy I i/lub adenowirusów grupy II. Ponadto, nowotwory zawierające takie komórki mogą być zlizowane przez adenowirusy według wynalazku.

Dalej, wynalazek jest oparty na zaskakującym odkryciu, że replikacja DNA E1A-zmodyfikowanych adenowirusów w komórkach nowotworowych z YB-1-dodatnim jądrem jest oparta na aktywacji późnego promotora E2. E1A-zmodyfikowane adenowirusy należy rozumieć jako te, które (a) wykazują, w komórkach z YB-1-ujemnym jądrem, obniżoną replikację lub brak replikacji w porównaniu z typem dzikim, korzystnie silnie obniżoną replikację, (b) wykazują aktywność transaktywującą względem co najmniej jednego genu wirusowego, przy czym gen ten jest w szczególności wybrany z grupy obejmującej E1B-55kDa, E4orf6, E4orf3 i E3ADP, i/lub (c) nie powodują przenoszenia komórkowego YB-1 do jądra przez adenowirus. Ewentualnie, adenowirusy stosowane w wynalazku mają dalsze cechy, takie że wiązanie białka E1A kodowanego przez adenowirus wpływa na wiązanie E2F z RB lub jest w stanie rozłożyć odpowiedni kompleks składający się z E2F i Rb. Adenowirusy, które wykazują jedną lub kilka z wspomnianych powyżej cech a) do c), korzystnie wszystkie cechy od a) do c), są defektywne replikacyjnie w komórkach, które nie zawierają YB-1 w jądrze.

W jednej postaci silnie obniżona replikacja, w szczególności oznacza replikację, która jest obniżona w porównaniu z typem dzikim dwukrotnie, korzystnie pięciokrotnie, korzystniej dziesięciokrotnie, a najkorzystniej stukrotnie. W korzystnej postaci porównanie replikacji przeprowadza się przy zastosowaniu takich samych lub podobnych linii komórkowych, identycznych lub podobnych mian wirusów do zakażenia (krotności zakażenia, MOI lub jednostek tworzących łysinki, pfu) i/lub w identycznych lub podobnych ogólnych warunkach doświadczalnych. Replikacja w szczególności oznacza tworzenie cząstek. W dalszych postaciach miarą replikacji może być poziom syntezy kwasu nukleinowego wirusa. Sposoby określania poziomu syntezy kwasu nukleinowego wirusa oraz sposoby określania tworzenia cząstek są znane specjalistom.

Opisane tu stwierdzenia, czyli sposoby, zastosowania oraz kwasy nukleinowe, białka, układy replikacyjne itp. nie koniecznie są ograniczone do adenowirusów. Ogólnie, takie układy występują także w innych wirusach, które są także objęte w załączeniu.

Stosowanie wirusów według wynalazku lub stosowanie opisanych tutaj wirusów zgodnych z wynalazkiem, może wywołać replikację porównywalną z wirusami typu dzikiego, gdy stosuje się poziom zakażenia 1 do 10 pfu/komórkę, w porównaniu z 10 do 100 pfu/komórkę według stanu techniki.

Komórkowym YB-1 powinien być jakikolwiek YB-1, który jest kodowany i jest, korzystnie, także eksprymowany przez komórkę, przy czym YB-1 jest obecny w komórce w szczególności przed zakażeniem odpowiedniej komórki przez adenowirus, korzystnie adenowirus i/lub wirus pomocniczy, jak tutaj opisano. Jednakże, wynalazek obejmuje także YB-1, który jest także YB-1 wprowadzonym do komórki lub wytwarzanym przez komórkę tylko gdy zastosuje się egzogenne czynniki, takie jak zakażenie wirusem, korzystnie adenowirusem.

Bez zamiaru ograniczania się przez poniższe stwierdzenia, wynalazca przypuszcza, że promotor E2-wczesny, tj. wczesny promotor E2, nie jest włączany przy pomocy ludzkiego komórkowego czynnika transkrypcyjnego E2F w związku z replikacją wirusów stosowanych według wynalazku oraz w związku z zastosowaniem według wynalazku adenowirusów według wynalazku. W takich warunkach start replikacji jest niezależny od stanu Rb komórek, tzn. komórki nowotworowe, które są zakaPL 219 321 B1 żone przez zastosowanie ujawnionych tutaj wirusów i które w następstwie tego korzystnie ulegają lizie, mogą zawierać funkcjonalne, a także nieaktywne białka Rb. Ponadto, ujawniona tutaj replikacja adenowirusowa z zastosowaniem ujawnionych tutaj adenowirusów lub z zastosowaniem ujawnionych tutaj warunków, nie wymaga jakiegokolwiek funkcjonalnego białka p53, ani też jego obecność nie wpływa na nią negatywnie. Zatem, ten opis techniczny nie stosuje się do zasad leżących u podstaw stosowania onkolitycznych i wywołujących lizę nowotworu adenowirusów typu AdΔ24, dl922947, E1Ad/01/07, CB016 lub adenowirusów opisanych np. w europejskim opisie patentowym EP0931830, do których wprowadzono jedną i/lub większą liczbę delecji w białku E1A, przy założeniu, że nienaruszone funkcjonalne białka Rb będą utrudniać wydajną replikację in vivo, a zatem replikacja adenowirusów in vivo możliwa jest tylko w komórkach Rb-ujemnych lub Rb-zmutowanych. Te układy adenowirusowe ze stanu techniki są oparte na E1A kontrolującym replikację adenowirusów in vivo za pomocą wczesnego promotora E2 (promotor E2-wczesny) oraz „wolnego E2F”. Jednakże, te wirusy ze stanu techniki można stosować zgodnie z wynalazkiem do replikacji w komórkach zawierających YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego lub w komórkach zawierających rozregulowany YB-1.

Adenowirusy opisane we wspomnianym europejskim opisie patentowym EP0931830, można stosować zgodnie z wynalazkiem. W szczególności, wirusy opisane w niniejszym patencie są wirusami defektywnymi replikacyjnie oraz takimi, w których brak jest eksprymowanej onkoproteiny, która jest zdolna do wiązania funkcjonalnego produktu genu supresora nowotworów Rb. Adenowirus może być, w szczególności, jakimkolwiek adenowirusem, w którym brak jest eksprymowanej wirusowej onkoproteiny E1A, która jest zdolna do wiązania funkcjonalnego produktu genu supresora nowotworów, w szczególności Rb. Wirusowa onkoproteina E1A może zawierać inaktywującą mutację, np. w domenie CR1 w pozycjach aminokwasowych 30 do 85 adenowirusa Ad5, który nazywany jest tutaj także Ad5, Ad 5, którym odpowiadają pozycje nukleotydów 697-790, i/lub domenie CR2 w pozycjach aminokwasów 120 do 130 Ad 5, którym odpowiadają pozycje nukleotydów 920 do 967, które uczestniczą w wiązaniu białka p105 Rb, p130 i białka p107. Jednakże w wynalazku adenowirusem jest typu 2 dl 312 lub typu 5 NT dl 1010.

W odniesieniu do zastosowania adenowirusów, według wynalazku, do wytwarzania leku, w szczególności do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych oraz innych ujawnionych tutaj chorób, oraz w odniesieniu do zastosowania adenowirusów według wynalazku, a także zastosowania adenowirusów, według wynalazku, do replikacji w komórkach, które zawierają YB-1 w jądrze, korzystnie zawierają YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego lub które zawierają rozregulowany YB-1, korzystnie w cytoplazmie, replikacja ostatecznie zachodzi w tych komórkach, które zawierają YB-1 w jądrze, korzystnie niezależnie od fazy cyklu komórkowego, innymi słowy które zawierają jądro YB-1-dodatnie, lub w komórkach, które zawierają rozregulowany YB-1. W szczególności należy przyznać, że adenowirusy jako takie nie replikują się lub replikują się tylko na znacząco obniżonym poziomie w komórkach, które nie zawierają YB-1 w jądrze, ale zawierają YB-1 zasadniczo tylko w cytoplazmie, lub w komórkach, które nie zawierają rozregulowanego YB-1. W związku z tym, do skutecznej replikacji tych wirusów konieczne jest, aby YB-1 był obecny w jądrze, korzystnie niezależnie od fazy cyklu komórkowego, lub był obecny rozregulowany YB-1. Jak zostanie także poniżej wyjaśnione, można to osiągnąć, np. przez zastosowanie do komórek warunków, które wywołają ekspresję lub obecność YB-1, korzystnie niezależnie od fazy cyklu komórkowego, lub rozregulowanego YB-1 w jądrze lub ekspresję rozregulowanego YB-1. Odpowiednim środkiem może tu być, np. zastosowanie odpowiednio kodowania lub ekspresji YB-1 przez adenowirusy, które są stosowane według wynalazku lub które są przedmiotem wynalazku, które dodatkowo oprócz genów adenowirusowych niosą także informację genetyczną kodującą YB-1, a szczególnie dla ich ekspresji. Innymi środkami, które wywołują transport, indukcję lub ekspresję YB-1 w jądrze komórkowym, są warunki stresowe, takie jak zastosowanie do komórki lub organizmu zawierającemu taką komórkę cytostatyków, naświetlania, hipertermii itp. w korzystnej postaci naświetleniem jest np. naświetlenie, które stosuje się do leczenia chorób nowotworowych.

Adenowirusy stosowane według wynalazku, w szczególności do Iizy nowotworu, a także adenowirusy według wynalazku charakteryzują się, w korzystnych postaciach, tym, że nie replikują się w komórkach, które nie zawierają YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego, a zatem posiadają jądra YB-1-ujemne lub które nie zawierają jakiegokolwiek rozregulowanego YB-1.

Dalszą cechą części adenowirusów stosowanych według wynalazku, które różnią się od adenowirusów według wynalazku, jest fakt, że kodują wirusowy onkogen, który jest także tutaj nazywany białkiem onkogenu, przy czym białkiem onkogenu jest E1A oraz przy czym białko onkogenu jest zdol12

PL 219 321 B1 ne do aktywacji co najmniej jednego genu wirusowego, który wpływa na replikację wirusa i/lub lizę komórki zakażonej przez wspomnianego wirusa. Korzystnie, wpływa na replikację w taki sposób, że wirus replikuje się lepiej w obecności białka onkogenu w porównaniu ze scenariuszem, gdy brak jest białka onkogenu danego wirusa. Proces ten jest także nazywany tutaj transaktywacją, a w szczególności transaktywacją przez E1A w przypadku gdy transaktywacja zachodzi za pośrednictwem E1A. Termin „transaktywować” lub „transaktywacja” korzystnie opisuje proces, w którym odpowiednia wirusowa onkoproteina wpływa na ekspresję i/lub transkrypcję jednego lub kilku innych genów, które różnią się od genu kodującego samo wirusowe białko onkogenu, tj. korzystnie kontroluje ich ekspresję i/lub translację, a w szczególności je aktywuje. Takimi genami wirusowymi są korzystnie E1B55kDa, E4orf6, E4orG i E3ADP, a także jakiekolwiek połączenie wspomnianych powyżej odpowiednio genów i produktów genów.

Dalszą, jakkolwiek korzystnie ewentualną, cechą adenowirusów stosowanych według wynalazku, a także adenowirusów według wynalazku, jest charakterystyka ich wiązania lub wiązania konkretnych, kodowanych przez nie białek przez lub z supresorem nowotworów Rb. Zasadniczo, wynalazek obejmuje adenowirusy stosowane według wynalazku, które mogą, ale nie muszą wiązać Rb. Zastosowanie którejkolwiek z tych dwóch alternatywnych postaci adenowirusów jest niezależne od stanu Rb traktowanych komórek lub komórek, które mają być traktowane.

Aby nadać E1A zdolność wiązania z Rb, można wprowadzić następujące delecje w onkoproteinie E1A: delecję w regionie CR1 (pozycje aminokwasowe 30-85 w Ad5) oraz delecję w regionie CR2 (pozycje aminokwasowe 120-139 w Ad5). Przez wprowadzenie takich delecji zachowywany jest region CR3 i może on wykonywać swoją funkcję transaktywującą względem wczesnych genów wirusowych.

Aby nadać E1A zdolność do wiązania Rb, ogólnie możliwe są poniższe delecje w onkoproteinie E1A: delecja regionu CR3 (pozycje aminokwasów 140-185); delecja N-końca (pozycje aminokwasów 1-29); delecja pozycji aminokwasowych 85-119; oraz delecja C-końca (pozycje aminokwasowe 186-289). Wymienione powyżej regiony nie wpływają na wiązane E2F z Rb. Funkcja transaktywująca pozostaje nienaruszona, jednakże jest obniżona w porównaniu z Ad5 typu dzikiego.

W szczególności w odniesieniu do adenowirusów według wynalazku, białko E1A, w szczególności białko E1A12S, może być tak zaprojektowane, że w jednej postaci, jest zdolne do wiązania Rb, a w innej postaci, nie jest zdolne do wiązania Rb, przy czym takie białko E1A jest białkiem E1A12S, a w szczególności białkiem E1A12S w znaczeniu według wynalazku, które jest jednakże w stanie techniki czasami nazywane zmodyfikowanym E1A12S. Odpowiedni projekt białka E1A12S może być przygotowany przez specjalistę, w szczególności w odniesieniu do powyżej wspomnianych delecji białka E1A, które jest także tutaj prosto nazywane E1A.

Takie adenowirusy, które są już ogólnie znane w stanie techniki i które nie wykazują jakiejkolwiek transaktywcji, ogólnie uważa się za defektywne replikacyjnie. Jednakże, zasługą wynalazcy jest fakt, że stwierdził on, że jednakże są one zdolne do replikacji w odpowiednim tle, w szczególności w tle komórkowym. Takie odpowiednie tło komórkowe jest wywoływane lub dostarczane przez obecność YB-1 w jądrze, korzystnie obecność YB-1 w jądrze niezależną od fazy cyklu komórkowego, lub przez rozregulowany YB-1. Termin komórki lub układy komórkowe, stosowany tutaj łącznie z każdym poszczególnym aspektem wynalazku, obejmuje fragmenty lub frakcje ekstraktów komórkowych, a także komórki obecne in vitro, in vivo lub in situ. Jakkolwiek, termin układy komórkowe lub komórki także obejmuje komórki, które są obecne w hodowli komórkowej, hodowli tkankowej, hodowli narządu lub w jakiejkolwiek tkance lub narządzie in vivo lub in situ, w postaci izolowanej, w grupach lub jako część tkanek, narządów lub organizmów, które mogą być także obecne jako takie w korzystnie żywym organizmie. Organizm ten jest jakimkolwiek organizmem kręgowca, a w szczególności ssaka. Korzystniej, organizm ten jest organizmem człowieka. Innymi korzystnymi organizmami są te, które ujawniono w związku z różnymi aspektami wynalazku.

Ponadto, wynalazkiem objęty jest także fakt, że na podstawie zamieszczonych tutaj wskazówek technicznych, wytwarza się nowe wirusy, które wykazują zachowanie replikacyjne adenowirusów tutaj opisanych oraz tych, które są znane ze stanu techniki, w takich komórkach, które zawierają YB-1-dodatnie jądra, korzystnie YB-1-dodatnie jądra niezależnie od fazy cyklu komórkowego lub które zawierają rozregulowany YB-1. Innymi słowy, a w szczególności rozpoczynając od już znanych adenowirusów, można skonstruować dalsze wirusy, które wykazują zdefiniowane tutaj cechy, które są odpowiednie do zastosowania według wynalazku.

PL 219 321 B1

W połączeniu z wynalazkiem zmodyfikowana onkoproteina E1A różnych adenowirusów stosowanych zgodnie z wynalazkiem, w odróżnieniu od wirusów według wynalazku, jest zdolna do transaktywowania wczesnych genów wirusowych, takich jak E1B55K, E4orf3, E4orf6, E3ADP w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem lub komórkach zawierających rozregulowany YB-1. Korzystnie nie wprowadza się zmian w genomie wirusa oraz odpowiedni adenowirus może w ten sposób inaczej odpowiadać adenowirusowi typu dzikiego lub jego pochodnej.

Ujawnione tutaj wirusy, które kodują lub zawierają transaktywujące białko onkogenu, w znaczeniu wynalazku, obejmują, np. adenowirusy AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01707, CB106 i/lub adenowirusy opisane w europejskim opisie patentowym EP0931830, które są zdolne do transaktywacji wczesnych genów, takich jak E1B, E2, E3 i/lub E4 oraz, które są porównywalne z adenowirusami typu dzikiego, w szczególności Ad5 typu dzikiego. W tych przypadkach, osobny region białka E1A jest odpowiedzialny za transaktywację. Wśród różnych serotypów adenowirusów w białku E1A występują trzy wysoce konserwatywne regiony. Region CR1 obejmujący pozycje aminokwasowe 41-80, CR2 obejmujący pozycje aminokwasowe 120-139 i CR3 obejmujący pozycje aminokwasowe 140-188. Funkcja transaktywacji jest głównie oparta na obecności regionu CR3 w białku E1A. Sekwencja aminokwasowa CR3 jest obecna w niezmienionej postaci we wspomnianych powyżej adenowirusach. Powoduje to transaktywację wczesnych genów E1B, E2, E3 i E4 niezależnie od tego czy YB-1 jest obecny w jądrze czy w cytoplazmie.

W odróżnieniu od tego, region CR3 wydeletowano w rekombinowanym adenowirusie dl520. Zatem, dl520 eksprymuje tak zwane białko E1A12S, które nie zawiera sekwencji aminokwasowej regionu CR3, w konsekwencji, dl520 może wykazywać tylko bardzo słabą funkcję transaktywującą, w szczególności w regionie E2, a zatem nie replikuje się w komórkach z jądrem YB-1-ujemnym. W komórkach z jądrem YB-1-dodatnim, YB-1 jest odpowiedzialny za transaktywację regionu E2, a zatem umożliwia wydajną replikację dl520. Zastosowanie układów takich jak dl520 lub układów z nich wyprowadzonych jest na tym oparte. Dalsza istotna różnica pomiędzy dwoma wcześniej opisanymi grupami adenowirusów takich jak np. delta 24 (nazywanym tutaj także AdΔ24) oraz, np. dl520, oparta jest na fakcie, że wczesne geny E1B, E3 i E4 są lepiej aktywowane w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem niezależnie od fazy cyklu komórkowego lub w komórkach zawierających rozregulowany YB-1, w porównaniu z komórkami z YB-1-ujemnym jądrem lub komórkami, które nie zawierają rozregulowanego YB-1. W odróżnieniu od tego, brak jest różnic lub istnieją tylko niewielkie różnice w delta 24. Jednakże transaktywacja dl520, a dokładniej białka E1A12S jest znacznie obniżona w porównaniu z adenowirusem typu dzikiego. Jednakże ta transaktywacja jest wystarczająca by zapewnić wydajną replikację w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem, co także pokazano w przykładzie 10. Projekt białka E1A, jak tutaj opisano, a w szczególności jak opisano w tym połączeniu, lub kodującego je kwasu nukleinowego w postaci, takiej że białko E1A zawiera, w porównaniu z białkiem onkogenu E1A typu dzikiego, jedną lub większą liczbę delecji i/lub mutacji, przy czym korzystną delecją jest taka, która jest wybrana z grupy obejmującej delecje regionu CR3 oraz delecje N-końca i delecje C-końca, włącznie z oraz w szczególności z tymi projektami białka E1A, które opisano w połączeniu z dl520 lub AdΔ24, dl922 do 947, E1Ad/01/07, CB106 i/lub adenowirusami opisanymi w europejskim opisie patentowym EP0931830, tworzy postacie wirusów, a w szczególności adenowirusów, których replikacja jest kontrolowana, korzystnie głównie kontrolowana przez aktywację późnego promotora E2. Dalsze postacie białka E1A, które umożliwiają taki typ replikacji adenowirusów, może wytworzyć specjalista w oparciu o zamieszczone tutaj ujawnienie. Postać białka E1A, jak wcześniej opisano, jest postacią, która może być stosowana łącznie z adenowirusami według wynalazku.

Adenowirusy według wynalazku, w szczególności adenowirusy grupy I, które także nazywa się tutaj pochodnymi i które można stosować według wynalazku, zazwyczaj zawierają delecję E1, delecję E1/E3 i/lub delecję E4, tj. odpowiednie adenowirusy nie są zdolne do wytwarzania funkcjonalnie aktywnych produktów ekspresji E1 i/lub E3 i/lub E4 lub odpowiadających im produktów. Innymi słowy te adenowirusy są zdolne tylko do wytwarzania funkcjonalnie nieaktywnych produktów ekspresji E1, E3 i/lub E4, przy czym funkcjonalnie nieaktywny produkt ekspresji E1, E3 i/lub E4 jest produktem ekspresji, który albo w ogóle nie jest obecny jako produkt ekspresji, na poziomie transkrypcji i/lub translacji, lub też jest obecny w postaci, w której nie wykazuje jednej z funkcji przypisywanych mu w adenowirusie typu dzikiego. Ta/te funkcja(-e) właściwa(-e) produktowi ekspresji w adenowirusie typu dzikiego jest/są znane specjalistom oraz, np. opisano je w Russell, W. C., Journal of Virology, 81, 2573-2604, 2000. Russell (jak wyżej) opisuje także zasady projektowania adenowirusów i wektorów adenowirusowych, które wprowadza się tutaj jako odnośniki. Wynalazek umożliwia także to, że zmodyfikowana

PL 219 321 B1 onkoproteina E1A, tj. białko E1A nie wykazujące już właściwości transaktywujących, takie jak np. E1A12S, E1B-55K, E4orf6 i/lub E3ADP (adenowirusowe białko śmierci (ADP)) (Tollefson, A. i in.,

J. Virology, 70, 2296-2306, 1996) jest eksprymowana w takim wektorze samodzielnie lub w połączeniu. Poszczególne wspomniane geny, a także ujawnione tutaj transgeny mogą być, niezależnie od siebie, wklonowane w regonie E1 i/lub E3 i/lub Ε4 oraz eksprymowane przy pomocy odpowiedniego promotora lub pod kontrolą odpowiedniego promotora. Ogólnie, każdy z regionów E1, E3 i E4 jest odpowiedni jako miejsce klonowania w kwasie nukleinowym adenowirusa. W niektórych postaciach odpowiednimi promotorami są te, które ujawniono tutaj w połączeniu z kontrolą lub ekspresją E1A, korzystnie zmodyfikowanego E1A.

Ostatecznie, w jednej postaci, adenowirusy grupy II stosowane według wynalazku zawierają niesprawne E1B, w szczególności zawierają niesprawne E1B 19 kDa. Termin „zawierają niesprawne” w ogólnie stosowanym tutaj znaczeniu odnosi się do stanu, w którym E1B nie wykazuje wcale cech E1B typu dzikiego, a co najmniej brak mu jednej z tych cech.

Co najmniej niektóre z postaci adenowirusów z grupy II, w znaczeniu stosowanym zgodnie z ujawnionym w wynalazku, są jako takie znane w stanie techniki. Adenowirusy stosowane według wynalazku są korzystnie rekombinowanymi adenowirusami, w szczególności także jeżeli, w porównaniu z typem dzikim, wprowadzono zmianę w znaczeniu zamieszczonych tutaj wskazówek technicznych. Specjaliści są w stanie wydeletować lub zmutować adenowirusowe sekwencje kwasu nukleinowego, które nie mają związku z wynalazkiem. Takie delecje mogą być związane z, np. częścią kwasów nukleinowych kodujących E3 i E4, jak także tutaj opisano. Delecja E4 jest szczególnie korzystna, pod warunkiem, że taka delecja nie obejmuje białka E4orf6, innymi słowy adenowirus stosowany zgodnie z wynalazkiem koduje E4orf6. W korzystnych postaciach, te kwasy nukleinowe adenowirusów mogą być nadal upakowane do kapsydów wirusowych, a zatem tworzą zakaźne cząstki. Jest to także prawdą w przypadku zastosowania kwasów nukleinowych według wynalazku. Ogólnie uznaje się także, że układy adenowirusowe mogą być pozbawione jednego lub większej liczby produktów ekspresji. W związku z tym należy rozważyć aby to, w połączeniu zarówno z adenowirusami grupy I, jak i adenowirusami grupy II, mogło być spowodowane przez mutację lub delecję kwasu nukleinowego kodującego produkt ekspresji, przy czym taka mutacja lub delecja, jest albo całkowita albo wprowadzona w takim stopniu, że nie jest już tworzony produkt ekspresji albo brak jest elementów regulatorowych lub elementów kontrolujących ekspresję, takich jak promotory lub czynniki transkrypcyjne, albo są one aktywne w sposób inny niż w formie typu dzikiego, odpowiednio na poziomie kwasu nukleinowego (brak promotora; elementów cis) lub na poziomie układu translacji lub transkrypcyji (elementy trans). W szczególności ostatni aspekt może zależeć od odpowiedniego tła komórkowego.

Oprócz stosowania adenowirusów, które są znane już jako takie, zgodnie z wynalazkiem także nowe adenowirusy, takie jak adenowirusy grupy II, można stosować do celów już ujawnionych dla innych opisanych tutaj adenowirusów. Nowe adenowirusy według wynalazku wynikają z zamieszczonych tutaj wskazówek technicznych. Szczególnie korzystnymi ich przykładami są, np. wirusy Xvir03

Xvir03/01, które przedstawiono na fig. 16 i 17, których zasady zaprojektowania dalej zilustrowano w przykładach 11 i 12.

W przypadku wektora Xvir03 promotor CMV wklonowano w region E1, który kontroluje kwasy nukleinowe dla E1B 55k i E4orf6, które są rozdzielone przez sekwencję IRES. Ze względu na wklonowanie tych dwóch genów do wirusa lub ze względu na to, że tworzone są z nich produkty genów, uzyskano wynik wydajności replikacyjnej, który faktycznie odpowiada wydajności wirusów typu dzikiego, przy czym wybiórcza replikacja w komórkach, korzystnie w komórkach nowotworowych, jest utrzymywana tak długo jak replikacja zachodzi w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem, a w szczególności w komórkach, które zawierają rozregulowany YB-1, w rozumieniu niniejszego opisu. Komórki, w których obecny jest rozregulowany YB-1 są, w jednej postaci, komórkami wykazującymi podwyższoną ekspresję YB-1, korzystnie niezależną od przedziału komórki ekspresję YB-1, w porównaniu z normalnymi lub nienowotworowymi komórkami.

Dalszym udoskonaleniem wirusa Xvir03 jest wirus Xvir03/01, do którego, w korzystnej postaci, wklonowano terapeutyczne geny lub transgeny pod kontrolą specyficznego promotora, w szczególności promotora nowotworowo-specyficznego lub tkankowo-specyficznego. W związku z takim wirusem także region E4 jest funkcjonalnie nieaktywny, korzystnie wydeletowany. Opisane tutaj transgeny można także wklonować w region E4, przy czym można to przeprowadzić alternatywnie lub dodatkowo do wklonowania transgenów w region E3.

PL 219 321 B1

Transgeny tutaj opisane, a w szczególności opisane tutaj poniżej, mogą być także eksprymowane łącznie z lub przez adenowirusy według wynalazku, tj. przez adenowirusy grupy I lub ich kwasy nukleinowe, albo układy replikacyjne, a w ten sposób znajdują się w połączeniu z kasetą ekspresyjną zawierającą promotor oraz sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym taka sekwencja kwasu nukleinowego koduje jeden lub kilka ze wspomnianych transgenów. Regiony E1, E3 i/lub E4 są szczególnie korzystne jako miejsca klonowania w genomie adenowirusa, jednakże miejsca klonowania nie są do nich ograniczone.

Takimi genami terapeutycznymi mogą być geny proleków, geny cytokin, geny wywołujące apoptozę, geny supresory nowotworów, geny inhibitorów metaloproteinazy i/lub inhibitorów angiogenezy oraz inhibitorów kinazy tyrozynowej. Ponadto można eksprymować, siRNA, aptamery, cząsteczki antysensowne i rybozymy, które są korzystnie skierowane przeciw cząsteczkom docelowym związanym z rakiem. Korzystnie, jedną lub większą liczbę cząsteczek docelowych wybiera się z grupy obejmującej czynniki związane z opornością, czynniki przeciw apoptotyczne, onkogeny, czynniki angiogenezy, enzymy syntezy DNA, enzymy naprawy DNA, czynniki wzrostu i ich receptory, czynniki transkrypcyjne, metaloproteinazy, w szczególności metaloproteinazy macierzowe oraz aktywator plazminogenu typu urokinazy. Ich korzystnymi postaciami są te, które już tutaj ujawniono w związku z innymi aspektami wynalazku.

Możliwymi genami proleków, które mogą być stosowane w korzystnych postaciach są, np. deaminaza cytozyny, kinaza tymidynowa, karboksypeptydaza, fosforybozylotransferaza uracylu; lub fosforylaza nukleozydów purynowych (PNP); [Kirn i in., Trends in Molecular Medicine, tom 8, nr 4 (suplement), 2002; Wybranietz W.A. i in., Gene Therapy, 8, 1654-1664, 2001; Niculescu-Duvaz i in., Curr. Opin. Mol. Therapy, 1, 480-486, 1999; Koyama i in., Cancer Gene Therapy, 7, 1015-1022, 2000; Rogers i in., Human Gene Therapy, 1, 2235-2245, 1996; Lockett i in., Clinical Cancer Res., 3, 2075-2080, 1997; Vijayakrishna i in., J. Pharmacol. And Exp. Therapeutics, 304, 1280-1284, 2003].

Możliwymi cytokinami, które mogą być stosowane w korzystnych postaciach są, np. GM-CSF, TNF -a, Il-12, Il-2, Il-6, CSF lub interferon-γ; [Gene Therapy, Advances in Pharmacology, tom 40, red.:

J. Thomas August, Academic Press; Zhang i Degroot, Endocrinology, 144, 1393-1398, 2003; Descamps i in., J. Mol. Med., 74, 183-189, 1996; Majumdar i in., Cancer Gene Therapy, 7, 10861099, 2000].

Możliwymi genami wywołującymi apoptozę, które mogą być stosowane w korzystnych postaciach są, np. dekoryna [Tralhao i in., FASEB J, 17, 464-466, 2003]; retinoblastoma 94 [Zhang i in., Cancer Res., 63, 760-765, 2003]; Bax i Bad [Zhang i in., Hum. Gene Ther., 20, 2051-2064, 2002]; apoptyna [Noteborn i Pietersen, Adv. Exp. Med. Biol., 465, 153-161, 2000] ADP [Toth i in., Cancer Gene Therapy, 10, 193-200, 2003] bcl-xs [Sumantran i in., Cancer Res, 55, 2507-2512, 1995]; E4orf4 [Braithwaite i Russell, Apoptosis, 6, 359-370, 2001]; FasL, Apo-1 i Trail [Boehringer Manheim, Guide to Apoptotic Pathways, Arai i in., PNAC, 94, 13862-13867, 1997]; Bims [Yamaguchi i in., Gene Therapy, 10, 375-385, 2003; GNR163: Oncology News, 17 czerwca 2000 r.].

Możliwymi genami supresorami nowotworów, które mogą być stosowane w korzystnych postaciach są, np. E1A, p53, p16, p21, p27 lub MDA-7 [Opalka i in., Cell Tissues Organs, 172, 126-132, 2002, Ji i in., Cancer Res., 59, 3333-3339, 1999, Su i in., Oncogene, 22, 1164-1180, 2003].

Możliwymi inhibitorami angiogenezy, które mogą być stosowane w korzystnych postaciach są, np. endostatyna lub angiostatyna [Hajitou i in., FASEB J., 16, 1802-1804, 2002], oraz przeciwciała przeciw VEGF [Ferrara, N., Semin Oncol 2002 grudzień; 29 (6 suplement 16): 10-4].

Możliwymi inhibitorami metaloproteinaz, które mogą być stosowane w korzystnych postaciach są, np. Timp-3 [Ahonen i in., MoI Therapy, 5, 705-715, 2002]; PAI-1 [Soff i in., J. Clin. Invest, 96, 2593-2600, 1995]; Timp-1 [Brandt K. Curr. Gene Therapy, 2, 255-271, 2002].

Dalszymi transgenami, w znaczeniu według wynalazku, które mogą być eksprymowane przez zarówno adenowirusy z grupy I, jak i adenowirusy z grupy II są inhibitory kinazy tyrozynowej. Przykładowymi kinazami tyrozynowymi są EGFR (receptor czynnika wzrostowego nabłonka) [Onkologie, Entstehung und Progression maligner Tumoren; autor: Christoph Wagner, Georg Thietne Verlag, Stuttgart, 1999]. Korzystnym inhibitorem kinazy tyrozynowej jest herceptyna [Zhang H i in., Cancer Biol Ther. 2003, lipiec-sierpień; 2 (4 suplement 1): S122-6].

SiRNA (krótki interferujący RNA) składa się z dwóch, korzystnie osobnych nici RNA, które hybrydyzują ze sobą ze względu na komplementarność zasad, która oznacza, że są one obecne zasadniczo w postaci ze sparowanymi zasadami, oraz korzystnie mają długość do 50 nukleotydów, korzystnie pomiędzy 18 a 30 nukleotydów, korzystniej mniej niż 25 nukleotydów oraz najkorzystniej 21, 22 lub

PL 219 321 B1 nukleotydów, przy czym cyfry te odnoszą się do długości pojedynczej nici siRNA, w szczególności do długości odcinka pojedynczej nici, który hybrydyzuje z lub paruje z jedną, a dokładnie drugą pojedynczą nicią. siRNA specyficznie wywołuje lub kieruje rozkładem mRNA. Wymagana do tego specyficzność jest określana przez sekwencję siRNA, a zatem miejsce jego wiązania. Docelowa sekwencja, która ma być rozłożona jest zasadniczo komplementarna z pierwszą lub drugą z nici tworzących siRNA. Jakkolwiek dokładny sposób działania nie jest do końca wyjaśniony, uważa się, że siRNA jest biologiczną strategią komórek służącą do hamowania różnych alleli podczas rozwoju oraz do chronienia samych siebie przed wirusami. Interferencję RNA za pośrednictwem siRNA stosuje się jako sposób do specyficznej supresji lub całkowitego wyeliminowania ekspresji białka przez wprowadzenie dwuniciowego RNA specyficznego względem genu. U organizmów wyższych siRNA zawierające 19 do 23 nukleotydów są, jak na razie, szczególnie korzystne, gdyż nie powodują one aktywacji nie specyficznej reakcji obronnej, takiej jak odpowiedź interleukin. Bezpośrednia transfekcja dwuniciowego RNA o długości 21 nukleotydów, zawierającego dwunukleotydowe 3' wiszące końce była odpowiednia do kierowania interferencją RNA w komórkach ssaczych i jest ona wysoce wydajna w porównaniu z innymi technologiami, takimi jak rybozymy i cząsteczki antysensowne (Elbashir, S. Harborth J. Lendeckel W. Yalvcin, A. Weber K, Tuschl T: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001, 411:494-498). Tak niewiele jak kilka cząsteczek siRNA wystarcza do supresji ekspresji docelowego genu. Aby zapobiec ograniczeniom egzogennie dodawanego siRNA, które w szczególności polegają na przejściowej naturze zjawiska interferencji oraz specyficznym dostarczaniu (podawaniu) cząsteczek siRNA, w dziedzinie wynalazku stosuje się wektory, które umożliwiają endogenną ekspresję siRNA. Do takich celów, do wektora wprowadza się np. oligonukleotydy o długości 64 nukleotydów, które zawierają sekwencję docelową o długości 19 nukleotydów zarówno w sensownej, jak i antysensownej orientacji, które są rozdzielone przez, np. 9-nukleotydową sekwencję łącznikową. Powstały transkrypt zwija się w strukturę szpilki do włosów ze strukturą łodygi (łodygą) o długości, np. 19 par zasad. Pętla jest szybko rozkładana w komórce, tak, że wytwarzana jest funkcjonalna cząsteczka siRNA (Brummelkamp i in., Science, 296, 550-553, 2002).

Kwas nukleinowy kodujący YB-1, który może być częścią adenowirusów w jednej postaci adenowirusów stosowanych zgodnie z wynalazkiem, w szczególności adenowirusów grupy II, ale także adenowirusów według wynalazku, tj. adenowirusów grupy I, może zawierać sekwencję kwasu nukleinowego, która kieruje transportem YB-1 do jądra. Kwasy nukleinowe, adenowirusy oraz układy adenowirusowe według wynalazku, a także adenowirusy znane ze stanu techniki takie jak np. Onyx-15, AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01707, CB016, dl520 oraz adenowirusy opisane w opisie patentowym EP0931830, można stosować jako adenowirusy lub układy adenowirusowe, oraz odpowiadające im kwasy nukleinowe, w połączeniu z kwasami nukleinowymi według wynalazku. Odpowiednie sekwencje kwasu nukleinowego uczestniczące w transporcie do jądra są znane specjalistom i opisane w, np. Whittaker, G.R. i in., Virology, 246, 1-23, 1998; Friedberg, E.C., TIBS 17, 347, 1992; Jans, D.A. i in., Bioassays 2000 czerwiec; 22(6): 532-44; Yoneda, Y., J. Biochem. (Tokyo) 1997 maj; 121(5): 811-7; Boulikas, T., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1993; 3 (3):193-227; Lyons RH, Mol. Cell Biol, 7 24512456, 1987). Sekwencje kwasu nukleinowego uczestniczące w transporcie do jądra mogą realizować różne zasady. Jedną z takich zasad jest to, że YB-1 tworzy białko fuzyjne z peptydem sygnałowym lub jest wyposażone w taki peptyd i jest przenoszone do jądra komórkowego ze względu na ten peptyd, gdy pojawi się po replikacji adenowirusów według wynalazku.

Dalszą zasadę, którą można zastosować do zaprojektowania adenowirusów stosowanych w wynalazku, w szczególności adenowirusów grupy II, ale także adenowirusów według wynalazku, tj. adenowirusów grupy I, jest dostarczenie YB-1 z sekwencją transportową, która powoduje przeniesienie lub translokację YB-1 do jądra komórkowego, korzystnie rozpoczynając od syntezy w cytoplazmie, oraz doprowadza tam do replikacji wirusa. Przykładem szczególnie skutecznej sekwencji kwasu nukleinowego uczestniczącej w transporcie do jądra, jest sekwencja TAT HIV, która jest, np. opisana razem z innymi odpowiednimi sekwencjami kwasu nukleinowego tego typu w Efthymiadis, A., Briggs, LJ, Jans, DA., JBC 273, 1623-1628, 1998. Wynalazkiem objęte są także adenowirusy stosowane zgodnie z wynalazkiem, w szczególności adenowirusy grupy II, ale także adenowirusy według wynalazku, tj. adenowirusy grupy I, zawierające sekwencje kwasu nukleinowego, które kodują peptydy, które uczestniczą w transporcie do jądra.

Wynalazkiem objęte jest także to, że YB-1 jest obecne w pełnej swojej długości, w szczególności w postaci, która odpowiada YB-1 typu dzikiego. Ponadto wynalazkiem objęte jest to, że YB-1 jest stosowany lub obecny jako pochodna, np. w skróconej lub przyciętej postaci. Pochodną YB-1, która

PL 219 321 B1 może być stosowana lub obecna w odniesieniu do wynalazku, jest taka, która jest korzystnie zdolna do wiązania późnego promotora E2, a zatem aktywuje ekspresję adenowirusowego regionu E2. Takie pochodne w szczególności obejmują ujawnione tutaj pochodne YB-1. Dalsze pochodne można wytwarzać przez delecję jednego lub kilku aminokwasów z N-końca, C-końca lub ze środka sekwencji aminokwasowej. Wynalazkiem objęte jest także to, że fragmenty YB-1 są stosowane jako białka YB-1 w znaczeniu według wynalazku. W publikacji Jurchott K i in. [JBC 2003, 278, 27988-27996] opisano różne fragmenty YB-1, które charakteryzują się delecjami na C- oraz N-końcu. Rozmieszczenie różnych fragmentów YB-1 wykazało, że zarówno domena szoku zimna (CSD), jak i C-końce są odpowiednie do regulowanego cyklem komórkowym transportu YB-1 do jądra komórkowego. Zatem wynalazkiem objęte jest YB-1 (nazywany tutaj także białkiem YB-1) w połączeniu z ekspresją E1B55k i E4orf6 według wynalazku, lepiej migrujące do jądra, a zatem indukujące silniejszy efekt cytopatyczny (CPE) bez konieczności lepszego wiązania się z późnym promotorem E2, w porównaniu natywnym YB-1, zgodnie z czym nie można wykluczyć, że także skrócony YB-1 lepiej migruje do jądra i wywołuje obydwa efekty, tj. indukuje CPE i wiąże późny promotor E2. Ostatecznie, takie skrócone fragmenty YB-1 mogą także lepiej migrować do jądra i bardziej wydajnie wiązać późny promotor E2 bez indukowania lepszego CPE. Wynalazkiem objęte są także to, że skrócone białka lub fragmenty YB-1 zawierają dalsze sekwencje, jak tutaj ujawniono w odniesieniu do pełnej długości YB-1, w szczególności komórkowe sekwencje lokalizacji (NLS) itp.

W odniesieniu do wspomnianych powyżej różnych dalszych genów i produktów genów, kodowanych lub eksprymowanych przez adenowirusa, ogólnie możliwe jest aby były one kodowane lub eksprymowane w połączeniu.

Wynalazek obejmuje także terminy adenowirus i układy adenowirusowe rozumiane jako posiadające zasadniczo takie samo znaczenie. Termin adenowirus powinno się w szczególności rozumieć jako odnoszący się do kompletnej cząstki wirusa zawierającej kapsyd i kwas nukleinowy. Termin układ adenowirusowy w szczególności skupia się na fakcie, że kwas nukleinowy jest zmieniony w porównaniu z typem dzikim. Korzystnie, takie zmiany obejmują zmiany w organizacji genomu adenowirusa, wynikające z wydeletowania i/lub dodania i/lub zmutowania promotorów, sekwencji regulatorowych i/lub sekwencji kodujących, takich jak ramki odczytu. Termin układ adenowirusowy jest dodatkowo w szczególności stosowany tak, że oznacza wektor, który może być, np. stosowany w terapii genowej.

Powyższe uwagi, włącznie z którymikolwiek uwagami dotyczącymi zastosowania i zaprojektowania adenowirusów lub układów adenowirusowych, stosują się do kodujących je kwasów nukleinowych i na odwrót.

W odniesieniu do wynalazku możliwe jest aby adenowirusy, stosowane zgodnie z wynalazkiem, w szczególności adenowirusy grupy II, ale także adenowirusy grupy I lub kodujące je kwasy nukleinowe, stanowiły odpowiedni adenowirusowy kwas nukleinowy, który jako taki lub w połączeniu z dalszymi sekwencjami kwasu nukleinowego wywołuje wystąpienie replikacji. Możliwe jest, jak tutaj wyjaśniono, że sekwencje i/lub produkty genów wymagane do replikacji są dostarczone przez wirusy pomocnicze. W stopniu, w jakim odnosi się to do kodujących sekwencji kwasu nukleinowego oraz wspomnianych sekwencji nukleinowych, które są znanymi sekwencjami nukleinowymi, wynalazek obejmuje stosowanie nie tylko identycznej sekwencji, ale także sekwencji z niej wyprowadzonych. Tutaj, termin wyprowadzone sekwencje powinien oznaczać w szczególności jakiekolwiek sekwencje, które nadal powodują powstanie produktu genu, kwasu nukleinowego lub polipeptydu, który ma funkcję odpowiadającą funkcji sekwencji, z której je wyprowadzono. Można to sprawdzić przy pomocy sta ndardowych testów. Przykładem takich wyprowadzonych sekwencji kwasu nukleinowego są te sekwencje kwasu nukleinowego, które kodują taki sam produkt genu, w szczególności sekwencję aminokwasową, która, jednakże, może być kodowana przez różne sekwencje zasad ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego.

Możliwe jest, że adenowirusowy kwas nukleinowy nie wykazuje ekspresji białka onkogenu, w szczególności nie zawiera białka E1A, tj. nie koduje białka 12S E1A (nazywanego tutaj także białkiem E1A12S) lub białka 13S E1A (nazywanego tutaj także białkiem E1A13S) lub nie koduje zarówno białka 12S E1A, jak i białka 13S E1A, lub jest zmodyfikowany, jak tutaj opisano, chyba, że wskazano inaczej, a adenowirusowy układ replikacyjny zawiera ponadto kwas nukleinowy wirusa pomocniczego, przy czym kwas nukleinowy wirusa pomocniczego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą białko onkogenu, w szczególności białko E1A, który wykazuje poniższe cechy lub nadaje poniższe cechy adenowirusowi, takie że: korzystnie nie replikuje się w komórkach z YB-1-ujemnym jądrem, ale replikuje się w komórkach, które niezależnie od fazy cyklu komórkowego zawierają YB-1-dodatnie

PL 219 321 B1 jądro lub w komórkach zawierających rozregulowany YB-1, transaktywuje co najmniej jeden gen wirusowy, w szczególności E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 i/lub E3ADP, w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem i/lub nie przenosi komórkowego YB-1 do jądra. Opisane tutaj transgeny mogą być samodzielnie lub zbiorczo kodowane i/lub ekspryraowane przez wirus pomocniczy. Stosuje się to do wirusów pomocniczych dla zarówno adenowirusów grupy I, jak i adenowirusów grupy II.

Ponadto, w jednej postaci takiego adenowirusowego układu replikacyjnego, zgodnie z wynalazkiem, adenowirusowy kwas nukleinowy i/lub kwas nukleinowy wirusa pomocniczego jest/są obecny(-e) w mogącym replikować się wektorze.

Dalej wynalazek obejmuje kwas(-y) nukleinowy(-e) kodujący(-e) adenowirusy grupy I i/lub adenowirusy(-e) grupy II, który(-e) korzystnie jest/są w wektorze ekspresyjnym oraz ten wektor ekspresyjny jest stosowany zgodnie z wynalazkiem.

Można także zastosować grupę wektorów zawierającą co najmniej dwa wektory, przy czym grupa wektorów zawiera ogólnie adenowirusowy układ replikacyjny dla adenowirusów grupy I i/lub adenowirusów grupy II, jak tutaj opisano, oraz grupa wektorów jest stosowana zgodnie z wynalazkiem. W jednej postaci każdy składnik adenowirusowego układu replikacyjnego jest zorganizowany na osobnym wektorze, korzystnie wektorze ekspresyjnym.

Ostatecznie, wynalazek w dalszym aspekcie dotyczy zastosowania komórki, która zawiera jeden lub większą liczbę kwasów nukleinowych kodujących adenowirusy grupy I i/lub adenowirusy grupy II, które korzystnie stosuje się zgodnie z wynalazkiem, i/lub odpowiedniego adenowirusowego układu replikacyjnego i/lub odpowiedniego wektora i/lub grupy wektorów według wynalazku, do tego samego celu, jak tutaj opisano dla różnych adenowirusów.

Opisane powyżej konstrukty adenowirusów, a w szczególności ich kwasy nukleinowe lub kodujące je kwasy nukleinowe, można także wprowadzać w częściach do komórki, szczególnie komórki nowotworowej, gdzie ze względu na obecność różnych pojedynczych składników, działają one razem tak jakby te pojedyncze składniki pochodziły z pojedynczego kwasu nukleinowego lub jednego lub większej liczby adenowirusów.

Kwasy nukleinowe, które są stosowane zgodnie z wynalazkiem i kodują adenowirusy grupy I i/lub adenowirusy grupy II, odpowiadające układy adenowirusowe lub ich części, mogą być także obecne w postaci wektorów. Korzystnie wektory te są wektorami wirusowymi. W przypadku gdy kwasy nukleinowe obejmują adenowirusowe kwasy nukleinowe, korzystnie cząstka wirusa jest wektorem. Jednakże wynalazek obejmuje także wspomniane kwasy nukleinowe obecne w wektorze plazmidowym. W każdym przypadku wektor zawiera elementy umożliwiające oraz kontrolujące namnażanie wstawionego kwasu nukleinowego, tj. replikację oraz ewentualną ekspresję wstawionego kwasu nukleinowego. Odpowiednie wektory, korzystnie wektory ekspresyjne, oraz odpowiednie elementy są znane specjalistom oraz, np. opisano je w Grunhaus, A., Horwitz, M.S., 1994, Adenoviruses as cloning vectors, w Rice, C., red., Seminars in Virology, London: Saunders Scientific Publications.

Aspekt dotyczący grup wektorów uwzględnia opisaną powyżej postać, taką że różne elementy wspomnianego kwasu nukleinowego nie koniecznie znajdują się tylko w pojedynczym wektorze. Zgodnie z tym grupa wektorów składa się z co najmniej dwóch wektorów. Oprócz tego jakiekolwiek stwierdzenia dotyczące wektorów stosują się także do wektorów lub grup wektorów.

Adenowirusy grupy I i/lub adenowirusy grupy II charakteryzują się różnymi ujawnionymi tutaj kwasami nukleinowymi lub produktami genów, oraz mogą inaczej zawierać wszystkie te elementy znane specjalistom oraz takimi, które są właściwe adenowirusom typu dzikiego (Shenk, T.: Adenoviridae: The virus and their replication. Fields Virology, tom 3, red. Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M. i in., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, rozdział 67).

Poniżej omówiono replikację adenowirusów jedynie w celu jej zilustrowania, ale nie ogranicza to zakresu wynalazku.

Replikacja adenowirusów jest bardzo złożonym procesem i zazwyczaj jest oparta na ludzkim czynniku transkrypcyjnym E2F. Podczas zakażenia wirusowego najpierw eksprymowane są „geny wczesne” E1, E2, E3 i E4. Grupa „genów późnych” jest odpowiedzialna za syntezę strukturalnych białek wirusa. Region E1 składający się z dwóch jednostek transkrypcyjnych E1A i E1B, które kodują różne białka E1A i E1B, odgrywa zasadniczą rolę w aktywacji zarówno wczesnych, jak i późnych genów, gdyż indukują one transkrypcję genów E2, E3 i E4 (Nevins, J. R., Cell 26, 213-220, 1981). Ponadto, białka E1A mogą inicjować syntezę DNA w komórkach spoczynkowych, a zatem wywołać ich przejście do fazy S (jak wyżej, Boulanger i Blair, 1991). Ponadto, oddziałują one z supresorami nowotworów klasy Rb (Whyte, P. i in., Nature 334, 124-127, 1988). W ten sposób uwalniany jest czynnik

PL 219 321 B1 transkrypcyjny E2F. Następnie czynniki E2F mogą wiązać się z odpowiednimi regionami promotorowymi zarówno genów komórkowych, jak i wirusowych (w szczególności z adenowirusowym wczesnym promotorem E2) i inicjować transkrypcję, a zatem replikację (Nevins, J. R., Science 258, 424-429, 1992). Aktywność pRb lub E2F jest regulowana przez fosforylację. Hipofosforylowana forma pRb występuje głównie w fazie G1 i M. W odróżnieniu od tego hiperfosforylowana forma pRb jest obecna w fazie S i G2. Przez fosforylację pRb uwalniany jest E2F z kompleksu składającego się z E2F i hipofosforylowanego pRb. Uwolnienie E2F z tego kompleksu E2F i hipofosforylowanego pRb wywołuje transkrypcję genów zależnych od E2F. Białko E1A wiąże się tylko z hipofosforylowaną formą pRb, przy czym wiązanie E1A z pRb głównie zachodzi w regionie CR2 białka E1A. Ponadto, wiąże się ono także w regionie CR1, jednakże z niższym powinowactwem (Ben-Israel i Kleiberger, Frontiers in Bioscience, 7, 1369-1395, 2002; Halt i Galloway, Carcinogenesis, 24, 159-169, 2003).

Produkty genów regionu E2 są szczególnie wymagane do inicjacji i zakończenia replikacji, gdyż kodują one trzy niezbędne białka. Transkrypcja białka E2 jest kontrolowana przez dwa promotory, promotor „wczesny E2 zależny od E2”, który jest także tutaj nazywany wczesnym-E2 promotorem lub wczesnym promotorem E2, oraz promotor „późny E2” (Swaminathan i Thimmapaya, The Molecular Repertoire of Adenoviruses III: Current Topics in Microbiology and Immunology, tom 199, 177-194, Springer Verlag 1995). Ponadto, produkty regionu E4 razem z białkami E1A i E1B-55kDa odgrywają kluczową rolę dla aktywności E2F lub stabilności p53. Przykładowo, promotor E2 jest nawet bardziej transaktywowany przez bezpośrednie oddziaływanie białka E4orf6/7, kodowanego przez region E4, z heterodimerem składającym się z E2F i DP1 (Swaminathan i Thimmapaya, JBC 258, 736-746, 1996). Ponadto, kompleks składający się z E1B-55kDa i E4orf6 jest inaktywowany przez p53 (Steegenga, W. T. i in., Oncogene 16, 349-357, 1998), aby zakończyć udany lityczny cykl zakażenia. Ponadto, E1B-55kDa odgrywa dalszą istotną funkcję o tyle, że pobudza, przez oddziaływanie z białkiem E4orf6, eksport wirusowego RNA z jądra komórkowego, przy czym komórkowe RNA są zatrzymywane w jądrze (Bridge i Ketner, Virology 174, 345-353, 1990). Dalszą istotną obserwacją jest to, że kompleks białkowy zawierający E1B-55kDa/E4orf6 jest umiejscowiony w tak zwanych „wirusowych ciałkach wtrętowych”. Przypuszcza się, że te struktury są miejscami replikacji i transkrypcji (Ornelles i Shenk, J. Virology 65, 424-429, 1991).

Region E3 jest innym regionem istotnym dla replikacji, a w szczególności dla uwalniania adenowirusów. Bardziej precyzyjnie, region E3 zawiera informację genetyczną dla wielu stosunkowo niewielkich białek, które nie są istotne w cyklu zakaźnym adenowirusa in vitro, tj. w hodowli komórkowej. Jednakże, odgrywają one istotną rolę w przeżyciu wirusa podczas ostrej i/lub utajonej fazy zakażenia in vivo, gdyż wykazują one, między innymi, regulatorowe funkcje immunologiczne oraz apoptotyczne (Marshall S. Horwitz, Virologie, 279, 1-8, 2001; Russell, jak wyżej). Można wykazać, że białko wielkości około 11,6 kDa indukuje śmierć komórki. Białko to nazwano, ze względu na jego funkcję, ADP - od angielskiego terminu „adenovirus death protein” - adenowirusowe białko śmierci (Tollefson, J. Virology, 70, 2296-2306, 1996). Białko to jest tworzone głównie w późnej fazie cyklu zakażenia. Ponadto, nadekspresja tego białka wywołuje lepszą lizę zakażonych komórek (Doronin i in., J. Virology, 74, 6147-6155, 2000).

Ponadto, wynalazca zdaje sobie sprawę, że wirusy z wydeIetowanym E1A, tj. w szczególności te wirusy, które nie eksprymują jakiegokolwiek białka 12S E1A, ani też białka 13S E1A, mogą się replikować bardzo wydajnie do wyższych MOI (Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981), co, jednakże, nie może być realizowane w zastosowaniach klinicznych. Zjawisko to nazwano w literaturze „aktywnością typu E1A. Ponadto, wiadomo, że z pięciu białek kodowanych przez E1A, dwa białka, a dokładnie białko 12S i 13S, kontrolują lub indukują ekspresję innych genów adenowirusowych (Nevins, J. R., Cell 26, 213-220, 1981; Boulanger, P. i Blair, E.; Biochem. J. 275, 281-299, 1991). Stało się oczywiste, że w szczególności region CR3 białka 13S wykazuje funkcję transaktywującą (Wong HK i Ziff EB., J Virol., 68, 4910-20, 1994). Adenowirusy zawierające różne delecje w regionie CR1 i/lub regionie CR2 i/lub regionie CR3 białka 13S, są zasadniczo defektywne replikacyjnie, jednakże nadal transaktywują w innych liniach komórkowych geny lub promotory wirusowe, a w szczególności region E2 (Wong HK, Ziff EB., J Virol. 68, 4910-20, 1994; Mymryk, J. S. i Bayley, S. T., Virus Research 33, 89-97, 1994).

Po zakażeniu komórki, zazwyczaj komórki nowotworowej, adenowirusem typu dzikiego, YB-1 jest indukowany w jądrze przez E1A, E1B-55K i E4orf6 oraz ko-lokalizuje się z E1B-55K w wirusowych ciałkach wtrętowych w jądrze, co pozwala na wydajną replikację wirusa w jądrze komórkowym, zarówno in vitro, jak i in vivo. Już wcześniej stwierdzono, że E4orf6 także wiąże się z E1B-55K (Weigel,

PL 219 321 B1

S. i Dobbelstein, M. J. Virology, 74, 764-772, 2000; Keith N. Leppard, Seminars in Virology, 8, 301307, 1998), a zatem uczestniczy w transporcie do jądra lub rozmieszczeniu E1B-55K w jądrze, co zapewnia optymalne wytwarzanie wirusa lub replikację adenowirusa. Przez współpracę E1A, E1B-55K i YB-1, oraz przez kompleks składający się z odpowiednio E1B-55K/E4orf6 i YB-1, oraz ko-lokalizację YB-1 i E1B-55K w jądrze, w tak zwanych wirusowych ciałkach wtrętowych, możliwa jest wydajna replikacja wirusa, zgodnie z wynalazkiem, a zatem zastosowanie wirusów tutaj opisanych do replikacji w komórkach, które mają YB-1-dodatnie jądra, korzystnie komórkach, które zawierają YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego, i/lub komórkach, które zawierają lub wykazują rozregulowany YB-1, lub do wytwarzania leku do leczenia chorób, z którymi związane są komórki z YB-1-dodatnim jądrem, korzystnie komórki zawierające YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego, i/lub komórki, które zawierają lub wykazują rozregulowany YB-1. Zatem replikacja, która jest możliwa w takim tle komórkowym powoduje lizę komórki, uwolnienie wirusa oraz zakażenie i lizę sąsiednich komórek, tak że w przypadku zakażenia odpowiednio komórki nowotworowej lub nowotworu, ostatecznie zachodzi Iiza nowotworu, tj. onkoliza.

YB-1 należy do grupy wysoce konserwowanych czynników, które wiążą się z odwróconą sekwencją CAAT, którą nazywa się kasetą Y. Mogą one działać w sposób regulacyjny zarówno na poziomie transkrypcji, jak i translacji (Wolffa, A. P. Trends in Cell Biology 8, 318-323, 1998). Kasetę Y stwierdza się w coraz większej liczbie genów szlaków regulacyjnych związanych z aktywacją, ale także z hamowaniem wzrostu i apoptozy (Swamynathan, S. K. i in., FASEB J. 12, 515-522, 1998). Przykładowo, YB-1 oddziałuje bezpośrednio z p53 (Okamoto, T. i in., Oncogene 19, 6194-6202, 2000), odgrywa zasadniczą rolę w ekspresji genu Fas (Lasham, A. i in., Gene 252, 1-13, 2000), w ekspresji genów MDR i MRP (Stein, U. i in., JBC 276, 28562-69, 2001; Bargou, R. C. i in., Nature Medicine 3, 447-450, 1997) oraz w aktywacji topoizomeraz i metaloproteinaz (Mertens, P. R. i in., JBC 212, 22905-22912, 1997; Shibao, K. i in., Int. J. Cancer 83, 732-737, 1999). YB-1 uczestniczy także w regulacji stabilności mRNA (Chen, C-Y. i in., Genes & Development 14, 1236-1248, 2000) oraz w procesach naprawy (Ohga, T. i in., Cancer Res. 56, 4224-4228, 1996; Izumi Η. i in., Nucleic Acid Research 2001, 29, 1200-1207; Ise T. i in., Cancer Res., 1999, 59, 342-346).

Jądrowa lokalizacja YB-1 w komórkach nowotworowych, przez YB-1 obecny w jądrze komórkowym niezależnie od fazy cyklu komórkowego lub rozregulowany YB-1 obecny w cytoplazmie, przenoszony do jądra przez adenowirusy grupy I i/lub adenowirusy grupy II, powoduje E1A-niezależną replikację wirusa, podczas której nie jest eksprymowane lub stosowane ani białko 12S E1A, ani też białko 13S E1A (Holm, P.S. i in. JBC 277, 10427-10434, 2002), co wywołuje wielolekową oporność w przypadku nadekspresji białka YB-1. Ponadto wiadomo, że białka adenowirusowe takie jak np. E4orf6 i E1B-55K mają korzystny wpływ na replikację wirusa (Goodrum, F. D. i Ornelles, D. A., J. Virology 73, 7474-7488, 1999), przy czym funkcjonalne białko E1A jest odpowiedzialne za aktywację innych produktów genów wirusowych (takich jak E4orf6, E3ADP i E1B-55K) (Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981). Jednakże nie zachodzi to w przypadku adenowirusów E1A-ujemnych, co do których wiadomo w stanie techniki, że nie zawierają białka 13S E1A. Jądrowa lokalizacja YB-1 w komórkach z wielolekową opornością, które zawierają YB-1 w jądrze, umożliwia replikację lub tworzenie cząstek takich E1A-ujemnych wirusów. Jednakże w połączeniu z tym wydajność replikacji wirusa lub tworzenia cząstek jest wielokrotnie obniżona w porównaniu z Ad5 typu dzikiego. W porównaniu z tym połączenie YB-1 jest układem, który umożliwia bardzo wydajną replikację wirusa lub tworzenie cząstek kierowane przez YB-1, a tym samym onkolizę, niezależnie czy YB-1 jest już obecny w jądrze komórki nowotworowej, co może wynikać z umiejscowienia YB-1 w jądrze komórkowym niezależnie od fazy cyklu komórkowego lub tego, że rozregulowany YB-1 obecny w cytoplazmie jest przenoszony do jądra przez adenowirusy grupy I i/lub adenowirusy grupy II, lub też jest on zaindukowany w jądrze komórkowym przez egzogenne czynniki (np. zastosowanie cytostatyków lub naświetlania lub hipertermii), tj. jest zaindukowany tak, aby był obecny w jądrze komórkowym, w szczególności niezależnie od fazy cyklu komórkowego, lub YB-1 jest wprowadzany jako transgen przez wektor z układem, korzystnie układem adenowirusowym, który włącza geny adenowirusowe, ale nie wykazuje replikacji wirusowej. Stosuje się to także do adenowirusów według wynalazku, tj. adenowirusów grupy I, które są zdolne do wydajnej replikacji ze względu na swoje specyficzne zaprojektowanie oraz zastosowanie białka E1B, korzystnie białka E1B55K i/lub białka E4, korzystnie białka E4orf6, zapewnia skuteczną mobilizację YB-1, korzystnie w jądrze. Odpowiednimi cytostatykami, które można stosować razem z ujawnionymi tutaj adenowirusami łącznie z różnymi aspektami wynalazku są, np. te, które należą do poniższych grup: antracyklin, takich jak np. daunomycyna i adriamycyna; środków alkilujących, takich jak np. cyklofosPL 219 321 B1 famid; alkaloidów, takich jak etopozyd; alkaloidów barwinka, takich jak np. winkrystyna i winblastyna; antymetabolitów, takich jak, np. 5-fIuorouracyl i metrotreksat; pochodnych platyny, takich jak np. cis-platyna; inhibitorów topoizomeraz, takich jak np. kamfotecyna, CPT-11; taksanów, takich jak np. taksol, paklitaksel; inhibitorów deacetylazy histonów, takich jak np. FR901228, MS-27-275, trichostatyna A; modulatorów MDR, takich jak np. MS-209, VX-710 oraz pochodnych geIdanamycyny, takich jak np. 17-AAG. Ujawnione tutaj adenowirusy, w szczególności rekombinowane adenowirusy, które są zdolne do replikacji tylko w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem lub komórkach zawierających rozregulowany YB-1, korzystnie w cytoplazmie, wykazują ograniczoną zdolność transaktywacji genów wirusowych E1B-55K, E4orf6, E4orf6 i E3ADP w porównaniu z odpowiadającą jej zdolnością transaktywującą adenowirusów typu dzikiego, w szczególności Ad5 typu dzikiego. Wynalazca z zaskoczeniem stwierdził, że ta ograniczona zdolność transaktywacji może zostać przezwyciężona przez eksprymowanie odpowiednich genów, a w szczególności E1B-55K i E4orf6, w połączeniu z jądrową lokalizacją YB-1. Jak wykazano tutaj w przykładach, replikacja lub tworzenie cząstek wirusa są w takich warunkach podwyższone do poziomu porównywalnego z aktywnością replikacyjną lub aktywnością tworzenia cząstek adenowirusów typu dzikiego.

Lek, w którym lub do którego wytwarzania można stosować ujawnione tutaj adenowirusy według wynalazku, w zamierzeniu stosuje się zazwyczaj ogólnoustrojowo, jakkolwiek wynalazek obejmuje ogólnie stosowanie go lub podawanie miejscowo. Podanie ma na celu zakażenie adenowirusami w szczególności tych komórek, a szczególnie ma na celu spowodowanie wystąpienia replikacji adenowirusa w tych komórkach, które są związane, korzystnie w standardowy sposób, z powstawaniem stanu, zazwyczaj choroby, do której diagnozy i/lub profilaktyki i/lub leczenia stosuje się lek według wynalazku.

Taki lek służy korzystnie do leczenia nowotworów złośliwych, chorób nowotworowych, chorób rakowych, raków oraz nowotworów, przy czym terminy te stosuje się tutaj zasadniczo jako synonimy, chyba, że wskazano inaczej. Chorobami nowotworowymi są korzystnie te, w których YB-1 jest, ze względu na mechanizm leżący u podstaw choroby nowotworowej, w szczególności ze względu na leżący u podstaw patologiczny mechanizm, już umiejscowione w jądrze, korzystnie niezależnie od fazy cyklu komórkowego lub gdzie obecność YB-1 w jądrze komórkowym jest wywołana przez egozgenne czynniki, przy czym takie czynniki są odpowiednie do przeniesienia YB-1 do jądra komórkowego lub do jego zaindukowania lub eksprymowania w tym miejscu. Termin nowotwór lub choroba nowotworowa powinien obejmować zarówno złośliwe, jak i łagodne nowotwory, guzy lite, jak i nowotwory rozsiane, oraz odpowiadające im choroby. W jednej postaci lek zawiera co najmniej jeden dalszy farmaceutycznie aktywny związek. Natura oraz ilość takiego dalszego farmaceutycznie aktywnego związku będzie zależeć od rodzaju wskazania, w którym stosuje się lek. W przypadku gdy lek stosuje się do leczenia i/lub profilaktyki chorób nowotworowych, stosuje się zazwyczaj cytostatyki, takie jak cis-platyna i taksol, daunoblastyna, daunorubicyna, adriamycyna i/lub mitoksantron lub inne opisane tutaj cytostatyki lub grupy cytostatyków, korzystnie te, które opisano w związku z kierowaną cytostatykami jądrową lokolizacją YB-1.

Lek według wynalazku może być obecny w różnych preparatach, korzystnie w postaci płynnej. Dalej, lek będzie zawierać adiuwanty takie jak stabilizatory, bufory, środki konserwujące itp., które są znane specjalistom.

Wynalazca także z zaskoczeniem stwierdził, że opisane tutaj wynalezione zastosowanie wirusów, korzystnie zastosowanie adenowirusów grupy I i/lub adenowirusów grupy II, można przeprowadzać z dużym sukcesem w połączeniu z takimi nowotworami, lub można je stosować do wytwarzania leków do leczenia takich nowotworów, które mają YB-1 w jądrze komórkowym niezależnie od fazy cyklu komórkowego. Normalnie YB-1 jest zlokalizowany w cytoplazmie, w szczególności w cytoplazmie okołojądrowej. W fazie G1/S cyklu komórkowego YB-1 można znaleźć w jądrze zarówno normalnych, jak i nowotworowych komórek, przy czym część YB-1 pozostaje w cytoplazmie [Jurchott K i in., JBC 2003, 278, 27 988-27 996]. Jednakże nie jest to wystarczające do zapewnienia onkolizy wirusowej przy zastosowaniu modyfikowanych adenowirusów. Porównywalnie słaba wydajność takich atenuowanych adenowirusów, jak opisano w stanie techniki, ostatecznie wynika z ich złego zastosowania. Innymi słowy, takie układy adenowirusowe można w szczególności stosować z wyższą wydajnością w przypadku gdy istnieją molekularne warunki wstępne onkolizy wirusowej, przy zastosowaniu tych atenuowanych lub zmodyfikowanych adenowirusów, jak tutaj opisano, korzystnie przy zastosowaniu adenowirusów grupy I i/lub adenowirusów grupy II. W przypadku opisanych tutaj adenowirusów stosowanych zgodnie z wynalazkiem, takich jak AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB016, dl520 oraz

PL 219 321 B1 rekombinowanych adenowirusów opisanych w europejskim opisie patentowym EP0931830, warunkami wstępnymi dla takich chorób nowotworowych jest występowanie komórek, które wykazują jądrową lokalizację YB-1 niezależnie od fazy cyklu komórkowego. Taki typ lokalizacji jądrowej może być wywołany przez samą naturę nowotworu lub za pomocą środków lub czynniki według wynalazku, jak tutaj opisano. Zatem wynalazek definiuje nową grupę nowotworów lub chorób nowotworowych, a także pacjentów, które/których nadal można skutecznie leczyć przy zastosowaniu wirusów według wynalazku takich jak, korzystnie adenowirusy grupy I i/lub wirusy grupy II, ale także przy zastosowaniu atenuowanych lub zmodyfikowanych adenowirusów opisanych w stanie techniki.

Dalsza grupa pacjentów, których można leczyć zgodnie z wynalazkiem przy zastosowaniu adenowirusów grupy I i/lub adenowirusów grupy II lub adenowirusów stosowanych według wynalazku, które są, jako takie, już częściowo znane w stanie techniki, lub przy zastosowaniu adenowirusów opisanych tutaj po raz pierwszy, oraz korzystnie przy zastosowaniu takich adenowirusów zawierających mutację lub delecję, w białku E1A, która nie wpływa na wiązanie Rb/E2f lub które nie replikują się w komórkach z YB-1-ujemnym jądrem lub wykazują zdefiniowaną tutaj silnie obniżoną replikację, i/lub które zawierają i/lub wykazują delecję onkoproteiny, w szczególności E1A, tak jak w przypadku wirusów AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB106 oraz adenowirusów opisanych w europejskim opisie patentowym EP0931830, obejmuje tych pacjentów dla których istnieje pewność, że przez zastosowanie lub wywołanie specyficznych warunków YB-1 migruje do jądra lub jest tam indukowane lub transportowane, lub jest obecny rozregulowany YB-1. Zastosowanie adenowirusów grupy I i/lub adenowirusów grupy II w odniesieniu do tej grupy pacjentów jest oparte na odkryciu, że indukcja replikacji wirusa jest oparta na jądrowej lokalizacji YB-1, z następującym potem wiązaniem YB-1 z późnym promotorem E2. Ze względu na ujawnione tutaj odkrycie, adenowirusy takie jak np. AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB106 i/lub adenowirusy opisane w europejskim opisie patentowym EP0931830 mogą replikować się w takich komórkach, które zawierają YB-1-dodatnie jądra, i/lub w komórkach, w których YB-1 jest obecny w rozregulowany sposób w znaczeniu według wynalazku. W ten sposób te adenowirusy według wynalazku można stosować w leczeniu chorób oraz grup pacjentów, którzy zawierają komórki o tych cechach, w szczególności jeżeli komórki te są związane z wytworzeniem odpowiedniej leczonej choroby. Jest to podstawą skuteczności AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB106, adenowirusów opisanych w europejskim opisie patentowym EP0931830 oraz adenowirusów grupy I i/lub adenowirusów grupy II w leczeniu według wynalazku nowotworów takich, które zawierają YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego lub które zawierają rozregulowany YB-1 w znaczeniu według ujawnienia. Dalszą grupą pacjentów, którzy mogą być leczeni według wynalazku przy zastosowaniu opisanych tutaj wirusów, stosowanych zgodnie z wynalazkiem lub przy zastosowaniu wirusów opisanych tutaj po raz pierwszy, w szczególności odpowiednio adenowirusów, czyli adenowirusów grupy I i/lub grupy II, stanowią ci pacjenci, którzy zawierają komórki z YB-1-dodatnimi jądrami i/lub z YB-1-dodatnimi jądrami w wyniku jakiegokolwiek dalej opisanego leczenia, i/lub ci pacjenci, u których stosuje się jeden z poniższych czynników, korzystnie w znaczeniu leczenia, przed podaniem adenowirusów, równocześnie z podaniem odpowiednich wirusów lub po podaniu adenowirusów. Wynalazkiem objęci są także pacjenci z komórkami z YB-1-dodatnimi jądrami, którzy w szczególności mają YB-1 w jądrach kilku komórek tworzących nowotwór niezależnie od fazy cyklu komórkowego i/lub zawierają rozregulowany YB-1 w takich komórkach. Jednym z takich czynników jest zastosowanie cytostatyków, jak tutaj opisano w całości lub stosowane w terapii nowotworowej. Dalej, naświetlanie należy do grupy tych czynników, w szczególności takie naświetlanie jak stosowane w terapii nowotworowej. Naświetlanie w szczególności oznacza naświetlanie promieniowaniem o wysokiej energii, korzystnie naświetlanie środkami radioaktywnymi, korzystnie takie jak stosowane w terapii nowotworów. Dalszym czynnikiem jest odpowiednio hipertermia oraz zastosowanie hipertermii, korzystnie takiej hipertermii jaką stosuje się w terapii nowotworowej. W szczególnie korzystnej postaci hipertermię stosuje się miejscowo. Ostatecznie, dalszym czynnikiem jest leczenie hormonami, w takie szczególności leczenie hormonami jakie stosuje się w terapii nowotworów. W przebiegu takiej terapii hormonami stosuje się antyestrogeny i/lub antyandrogeny. W związku z tym, antyestrogeny, takie jak tamoksyfen, są w szczególności stosowane w leczeniu raka sutka, a antyandrogeny, takie jak np. flutamid lub octan cyproteronu, są w szczególności stosowane w leczeniu raka prostaty.

Ujawnione tutaj adenowirusy można także stosować do Ieczenia nowotworów, przy czym nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej nowotwory pierwotne, nowotwory wtórne, nowotwory trzeciorzędowe, oraz nowotwory przerzutujące. Korzystne jest przy tym aby nowotwory wykazywały co najmniej jedną z poniższych cech, a dokładnie aby ich komórki zawierały YB-1 w jądrze niezależnie

PL 219 321 B1 od fazy cyklu komórkowego, niezależnie od tego jaka jest tego przyczyna i/lub zawierały rozregulowany YB-1.

Wynalazkiem objęty jest fakt, że komórki, w których adenowirusy według wynalazku replikują się lub mogą się replikować, lub nowotwory, obejmujące takie komórki, wykazują jedną lub klika cech tutaj opisanych, w szczególności taką cechę, że zawierają YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego, niezależnie od tego jaka jest tego przyczyna, i/lub taką cechę, że zawierają rozregulowany YB-1 oraz że te komórki lub nowotwory można traktować adenowirusami grupy I i/lub adenowirusami grupy II według wynalazku lub że te adenowirusy można stosować do wytwarzania leku do ich leczenia, przy czym adenowirusy eksprymują kwas nukleinowy kodujący YB-1. Zatem, istnieją korzystnie trzy kategorie komórek, a zatem nowotworów, w których adenowirusy grupy I i adenowirusy grupy II według wynalazku mogą się replikować oraz które można traktować, a korzystnie poddać lizie, przy pomocy tych adenowirusów, odpowiednio:

Grupa A: Komórki zawierające YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego;

Grupa B: Komórki nie zawierające YB-1 w jądrze, w szczególności nie niezależnie od fazy cyklu komórkowego, ale zawierające rozregulowany YB-1; oraz

Grupa C: Komórki nie zawierające YB-1 w jądrze, w szczególności nie niezależnie od fazy cyklu komórkowego, oraz nie zawierające rozregulowanego YB-1.

W przypadku komórek grupy A, adenowirusy według wynalazku, w szczególności adenowirusy grupy I, które nie eksprymują dodatkowego YB-1, można stosować do replikacji lub lizy. Jednakże, możliwe jest także, że takie adenowirusy według wynalazku, w szczególności adenowirusy grupy I, które eksprymują dodatkowe YB-1, stosuje się do replikacji i lizy. Stosuje się to także do grupy B. Nie mając na celu ograniczania się przez poniższe stwierdzenie, przyczyną tego wydaje się to, że ze względu na wpływ białka E1B, w szczególności białka E1B55K i/lub białka E4, w szczególności białka E4orf6, wydajna replikacja jest zapewniona przez odpowiednio lokalizację YB-1 w jądrze lub jego przeniesienie do jądra. YB-1 dodatkowo eksprymowane przez adenowirusy wspiera ten proces.

W przypadku grupy C, do replikacji lub lizy korzystnie będą stosowane te adenowirusy według wynalazku, w szczególności adenowirusy grupy I, które dodatkowo eksprymują YB-1. Nie mając na celu ograniczania się przez poniższe stwierdzenie, przyczyną tego wydaje się to, że powyższy proces replikacji wirusa nie jest aktywny, w szczególności w tle komórkowym, tak żeby mogła wystąpić wydajna replikacja. Tylko przez odpowiednio dostarczenie kodowanego YB-1 lub eksprymowanie YB-1, może zajść wydajna replikacja, przy czym mechanizmem leżącym u podstawy tego zjawiska wydaje się być to, że nadekspresja YB-1 powoduje jądrową lokalizację YB-1, co także opisano w Bargou [Bargout R.C. i in., Nature Medicine 1997, 3, 447-450) i Jϋrchott [Jiirchott Κ. i in., JBC 2003, 278, 27988-27966].

Wynalazkiem objęty jest fakt, że niektóre z komórek tworzących nowotwór same z siebie zawierają YB-1 w jądrze lub YB-1 pojawił się w ich jądrze po indukcji lub czynnym wprowadzeniu lub zawierają rozregulowany YB-1 w znaczeniu według wynalazku. Korzystnie około 5% lub jakakolwiek wyższa liczba, tj. 6%, 7%, 8% itd., komórek tworzących nowotwór jest komórkami z YB-1-dodatnim jądrem lub komórkami, w których obecny jest rozregulowany YB-1. W przypadku szeregu nowotworów, takich jak rak sutka, kostniakomięsak, rak jajnika, rak maziówki lub rak płuca udział komórek nowotworowych zawierających rozregulowany YB-1 lub wykazujących jądrową lokalizację YB-1 niezależnie od fazy cyklu komórkowego, może wynosić 30-50% [Kohno K. i in., BioEssays 2003, 25, 691-698]. Takie nowotwory można korzystnie leczyć przy zastosowaniu adenowirusów według wynalazku. Jądrową lokalizację YB-1 można wywołać przez zewnętrzny stres lub miejscowo stosowany stres. Takie wywołanie może zajść np. przez naświetlenie, w szczególności promieniami UV, zastosowanie cytostatyków takich jak, między innymi, te które tutaj także ujawniono, oraz hipertermię. W odniesieniu do hipertermii istotne jest aby przeprowadzić ją w bardzo specyficzny sposób, w szczególności miejscowy sposób, oraz tak że może być wywołany specyficzny transport jądrowy YB-1 do jądra oraz, ze względu na to, zachodzą warunki wstępne do wystąpienia replikacji adenowirusa, a tym samym Iizy komórki i nowotworu, które korzystnie są ograniczone miejscowo (Stein U, Jϋrchott K, Walther W, Bergmann, S, Schlag PM, Royer HO. J Biol Chem. 2001, 276(30):28562-9; Hu Z, Jin S, Scotto KW. J Biol Chem. 28 stycznia 2000 r.; 275(4):2979-85; Ohga T, Uchiumi T, Makino Y, Koike K, Wada M, Kuwano M, Konno K. J Biol Chem. 1998, 273(11):5997-6000).

Zatem taki lek według wynalazku będzie podawany pacjentom oraz grupom pacjentów lub będzie dla nich zaprojektowany, gdzie przez odpowiednie wstępne lub późniejsze lub równoległe lecze24

PL 219 321 B1 nie odpowiednio wywołany jest transport YB-1, w szczególności w odpowiednich komórkach nowotworowych, lub rozregulowany YB-1 jest wytwarzany w komórce.

W oparciu o zamieszczone tutaj wskazówki techniczne specjalista będzie w stanie odpowiednio zmodyfikować, w szczególności E1A, co może, np. obejmować wytworzenie delecji lub mutacji punktowych wprowadzanych w celu wytworzenia różnych postaci adenowirusów, które można stosować zgodnie z wynalazkiem.

Jak już wspomniano, adenowirusy grupy I i/lub grupy II są zdolne do replikowania się w takich komórkach lub układach komórkowych, które zawierają YB-1 w jądrze. Pod względem tego, czy te adenowirusy, stosowane według wynalazku, są w stanie replikować się, a zatem są zdolne do Iizy nowotworu, nie jest istotny stan tych komórek w odniesieniu do obecności lub braku Rb, tj. produktu genu supresora nowotworu retinoblastoma. Dalej, do zastosowania wspomnianych adenowirusów według wynalazku, nie jest konieczne uwzględnianie stanu p53 zakażonych komórek, komórek, które mają być zakażone, lub komórek, które mają być leczone, ponieważ przy stosowaniu ujawnionych tutaj układów adenowirusowych w połączeniu z komórkami z YB-1-dodatnim jądrem, tj. komórkami zawierającymi YB-1 w jądrze niezależnie od stanu komórki, stan p53, a także stan Rb nie ma wpływu na replikację adenowirusa do wprowadzania w życie ujawnionej tutaj techniki.

Transaktywujący onkogen lub białko onkogenu, w szczególności E1A, korzystnie adenowirusów grupy II, może być pod kontrolą własnych naturalnych promotorów adenowirusowych i/lub może być kontrolowany przez promotor nowotworowo-specyficzny lub tkankowo-specyficzny. Odpowiednie nieadenowirusowe promotory można wybrać z grupy obejmującej promotor wirusa cytomegalii, promotor RSV (wirusa mięsaka Rousa), oparty na adenowirusie promotor Va I oraz nie wirusowy promotor YB-1 (Makino Υ. i in., Nucleic Acids Res. 1996, 15, 1873-1878). Dalszymi promotorami, które mogą być stosowane łącznie z którymkolwiek ujawnionym tutaj aspektem wynalazku, są promotor telomerazy, promotor α-fetoproteiny (AFP), promotor antygenu rakowo-płodowego (CEA) (Cao, G., Kuriyama, S., Gac, J., Mitoro, A., Cui, L., Nakatani, T., Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X., Fukui, H., Qi, Z. Int.

J. Cancer. 78, 242-247, 1998), promotor L-plastyny (Chung, L, Schwartz, PE., Crystal, RC., Pizzorno, G, Leavitt, J., Deisseroth, AB. Cancer Gene Therapy, 6, 99-106, 1999), promotor argininowej wazopresyny (Coulson, JM, Staley, J., Woli, PJ. British J. Cancer, 80, 1935-1944, 1999), promotor E2f (Tsukada i in., Cancer Res., 62, 3428-3477, 2002), promotor uroplakiny II (Zhang i in., Cancer Res., 62, 3743-3750, 2002) oraz promotor PSA (Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C, Golightly, D., Stewart,

D., Lin, J., Phipps, S., Chiang, YL. Human Gene Therapy, 10, 1721-1733, 1999), promotor tyrozynazy (Nettelbeck, DM. Anti-Cancer Drugs, 14, 577-584, 2003), promotor cyklooksygenazy 2 (Nettelbeck, DM., Rivera, AA, Davydova, J., Dieckmann, D., Yamamoto, M., Curiel, DT. Melanoma Res., 13, 287-292, 2003) oraz układy indukujące, takie jak np. tetracyklinowy (Xu, XL., Mizuguchi, H., Mayumi, T., Hayakawa, T. Gene, 309, 145-151, 2003). Dalej, zależny od YB-1 późny promotor E2 adenowirusów, jak opisano w niemieckim zgłoszeniu patentowym DE10150984.7 jest promotorem, który może być stosowany w połączeniu z wynalazkiem.

Odnośnie promotora telomerazy wiadomo, że odgrywa on zasadniczą rolę w komórkach ludzkich. Zgodnie z tym, aktywność telomerazy jest regulowana przez transkrypcyjną kontrolę genu telomerazy odwrotnej transkryptazy (hTERT), która jest podjednostką katalityczną enzymu. Ekspresja telomerazy jest aktywna w 85% ludzkich komórek nowotworowych. W odróżnieniu od tego jest ona nieaktywna w większości normalnych komórek. Wyjątkiem od tej reguły są komórki rozrodcze i tkanka embrionalna (Braunstein, I. i in., Cancer Research, 61, 5529-5536, 2001; Majumdar, A. S. i in., Gene Therapy 8, 568-578, 2001). Szczegółowe badanie promotora hTERT wykazało, że fragmenty promotora oddzielone od kodonu startu replikacji o 283 pz lub 82 pz wystarczają do specyficznej ekspresji w komórkach nowotworowych (Braunstein I. i in.; Majumdar AS i in., jak wyżej). Zatem odpowiednio ten promotor lub jego specyficzne fragmenty są odpowiednie do specyficznego eksprymowania w komórkach nowotworowych genu, a w szczególności transgenu, korzystnie jednego z ujawnionych tutaj transgenów. Promotor ten umożliwia ekspresję zmodyfikowanego onkogenu, korzystnie białka onkogenu E1A, tylko w komórkach nowotworowych. Zatem, w jednej postaci, rozważa się ekspresję transgenu w wektorze adenowirusowym pod kontrolą tych promotorów, korzystnie transgenu wybranego z grupy obejmującej E4orf6, E1B55kD, ADP i YB-1. Wynalazek obejmuje także to, że ramka odczytu transaktywującego białka onkogenu, w szczególności białka E1A znajduje się w ramce odczytu z jednym lub kilkoma produktami genów układu adenowirusowego. Jednakże ramka odczytu transaktywującego białka E1A może być od nich niezależna.

PL 219 321 B1

Wynalazek obejmuje także to, że różne opisane powyżej promotory są stosowane w połączeniu z różnymi postaciami adenowirusów według wynalazku, korzystnie adenowirusów grupy I, w szczególności w przypadku promotora, stosuje się taki promotor, który jest różny od tego, który kontroluje ekspresję odpowiedniego białka lub produktu ekspresji w adenowirusach typu dzikiego. Wspomniane powyżej promotory są zatem odpowiednimi promotorami heterologicznymi w rozumieniu według wynalazku. W korzystnych postaciach adenowirusów według wynalazku, w szczególności adenowirusów grupy I, rozważa się, że gdy stosuje się adenowirusy dla komórek grupy A i B, jak zdefiniowano powyżej, przeprowadza się to tak, że ekspresja białka E1B i/lub białka E4 zaczyna się z takich heterologicznych promotorów, przy czym korzystnie, ale nie wyłącznie, ekspresja białka E1A jest kontrolowana przez YB-1. Ekspresja białka E1A jest w tej i innych postaciach pod kontrolą promotora kontrolowanego YB-1, takiego jak np. adenowirusowy późny promotor E2. Jest to także prawda w przypadku gdy białko E1B i/lub białko E4 jest/są eksprymowane w kasecie ekspresyjnej.

W korzystnych postaciach adenowirusów według wynalazku, w szczególności adenowirusów grupy I, rozważa się, że gdy stosuje się adenowirusy w odniesieniu do komórek z grupy C, promotor jest każdym z poniższych promotorów oraz niezależnie promotorem nowotworowo-specyficznym, narządowo-specyficznym lub tkankowo-specyficznym. W połączeniu z tym wystarczające jest gdy co najmniej jeden z promotorów, które kontrolują ekspresję białka E1B, białka E4 i/lub białka E1A, jest takim specyficzny promotorem. Przez tą specyficzność względem nowotworu, narządu lub tkanki, powoduje się, że replikacja adenowirusów według wynalazku zachodzi tylko w komórkach odpowiedniego nowotworu, narządu lub tkanki oraz, oprócz tego, żadna inna tkanka nie jest uszkadzana przez replikację adenowirusów jako takich, np. nie jest lizowana. Korzystnie dwa, a korzystniej wszystkie trzy białka są kontrolowane przez takie promotory nowotworowo-specyficzne, narządowo-specyficzne lub tkankowo-specyficzne. Przy zastosowaniu takich adenowirusów możliwe jest zlizowanie także tych komórek, które nie tworzą nowotworu lub które nie mogą rozwinąć się w taki nowotwór, ale które z innych powodów, takich jak powody medyczne powinny być zniszczone lub usunięte z organizmu, korzystnie ssaka, a korzystniej organizmu człowieka, np. ze względu na to, że wytwarzają niepożądany czynnik lub wytwarzają taki czynnik na zbyt wysokim poziomie.

Rozważa się, że w jednej postaci komórki, do których Iizy stosuje się opisane adenowirusy według wynalazku, wykazują oporność, korzystnie wykazują oporność wielokrotną lub wielolekową.

Oporności we wspomnianym tutaj znaczeniu oraz te które są cechami charakterystycznymi leczonych nowotworów lub pacjentów, są to oporności, w których uczestniczą poniższe geny, ale nie tylko: MDR, MRP, topoizomeraza, BCL2, S-transferaza glutationowa (GST), kinaza białkowa C (PKC). Ponieważ działanie cytostatyków jest oparte, między innymi na wywoływaniu apoptozy, ekspresja genów związanych z apoptozą odgrywa kluczową rolę w wytwarzaniu jakiejkolwiek oporności, zatem zastosowanie w odniesieniu do tego mają także poniższe czynniki, a dokładnie Fas, rodzina BCL2, HSP 70 i EGFR [Kim i in., Cancer Chemther. Pharmacol. 2002, 50, 343-352].

Levenson i in. [Levenson, V.V. i in., Cancer Res., 2000, 60, 5027-5030] opisali, że ekspresja YB-1 jest silnie podwyższona w opornych komórkach nowotworowych w porównaniu z komórkami nie opornymi.

Oporność w stosowanym tutaj znaczeniu korzystnie odnosi się do oporności przeciw opisanym tutaj cytostatykom. Ta wielokrotna oporność korzystnie występuje razem z ekspresją, korzystnie nadekspresją, związanego z błoną białka transporterowego, glikoproteiny P, która może być stosowana jako marker do określania odpowiednich komórek, a zatem także nowotworów wykazujących taki marker lub odpowiednich grup pacjentów. Termin oporność w stosowanym tutaj znaczeniu obejmuje zarówno oporność nazywaną klasyczną opornością, w której uczestniczy glikoproteina P, a także oporność nazywaną nietypową opornością, w której uczestniczy MRP lub inną oporność nie kierowaną glikoproteiną P. Dalszym markerem, który koreluje z ekspresją YB-1 jest topoizomeraza II a. Jak dotychczas topoizomeraza II a może być stosowana jako metoda przeszukiwania zamiast, lub dodatkowo, do oznaczania YB-1 w jądrze w celu stwierdzenia, czy pacjent może być leczony zgodnie z wynalazkiem przy zastosowaniu adenowirusów przy oczekiwaniu udanej terapii. Markerem, który ogólnie może być stosowany podobnie jak glikoproteina P, jest MRP. Dalszym markerem, co najmniej w przypadku komórek raka jelita grubego lub pacjentów z rakiem jelita grubego, jest PCNA (ang. „proliferating cell nuclear antigen”, jądrowy antygen komórek proliferujących) (Hasan S. i in., Nature, 15, 387-391, 2001), jak np. opisano w Shibao K. i in. (Shibao K i in., Int. Cancer, 83, 732-737, 1999). Ostatecznie, co najmniej w odniesieniu do komórek raka sutka i komórek kostniakomięsaka, ekspresja MDR (ang. „multi drug resistance”, oporność wielolekowa) jest markerem w opisanym powyżej zna26

PL 219 321 B1 czeniu (Oda Y i in., Clin. Cancer Res., 4, 2273-2277, 1998). Dalszym potencjalnym markerem, który może być stosowany zgodnie z wynalazkiem jest p73 (Kamiya, M., Nakazatp, Y., J Neurooncology 59,

143-149 (2002); Stiewe i in., J. Biol. Chem., 278, 14230-14236, 2003).

Ostatecznie, należy także odnieść się do YB-1 jako markera prognostycznego w raku sutka, co można zastosować w wynalazku. Tylko u pacjentów z podwyższoną ekspresją YB-1 w pierwotnym nowotworze, nawrót choroby pojawia się po operacji chirurgicznej i chemioterapii [Janz M. i in., Int. J. Cancer 2002, 97, 278-282].

Szczególną zaletą wynalazku jest fakt, że przy zastosowaniu, zgodnie z wynalazkiem, opisanych adenowirusów, mogą być leczeni także ci pacjenci, którzy inaczej nie mogą być leczeni w znaczeniu medyczno-klinicznym, a zatem gdy dalsze leczenie chorób nowotworowych, przy zastosowaniu sposobów ze stanu techniki, nie jest już możliwe przy oczekiwaniu powodzenia terapii, w szczególności gdy zastosowanie cytostatyków i naświetlania nie jest dłużej rozsądnie możliwe lub nie może być dłużej skutecznie przeprowadzane w znaczeniu wpływu na nowotwór lub jego zmniejszenia. Tutaj, termin nowotwór dotyczy ogólnie także jakiejkolwiek choroby nowotworowej lub rakowej, w której komórki zawierają YB-1 w jądrze same z siebie, lub pod wpływem zastosowania egzogennych czynników, jak tutaj ujawniono, korzystnie niezależnie od fazy cyklu komórkowego, i/lub których komórki zawierają rozregulowany YB-1.

Dalej, wirusy tutaj opisane można stosować, ogólnie, do leczenia nowotworów. Korzystnie nowotwory te są wybrane z grupy obejmującej rak sutka, rak jajnika, rak prostaty, kostniakomięsak, glejak, czerniak, drobnokmórkowy rak płuca oraz rak jelita grubego. Dalszymi nowotworami są te, które wykazują oporność, jak tutaj opisano, korzystnie wykazują oporność wielolekową, w szczególności także nowotwory z opisanej powyżej grupy. Szczególnie korzystne nowotwory są wybrane z grupy obejmującej nowotwory sutka, nowotwory kości, nowotwory żołądka, nowotwory jelita, nowotwory pęcherzyka żółciowego, nowotwory trzustki, nowotwory wątroby, nowotwory nerek, nowotwory mózgu, nowotwory jajników, nowotwory skóry i przydatków skórnych, nowotwory głowy/szyi, nowotwory macicy, nowotwory maziówkowe, nowotwory krtani, nowotwory przełyku, nowotwory języka i nowotwory prostaty. W związku z tym korzystne jest aby nowotwory te manifestowały się tak jak tutaj ogólnie opisano.

Adenowirusy według wynalazku, korzystnie adenowirusy grupy I oraz adenowirusy stosowane według wynalazku, korzystnie adenowirusy grupy II.

Zastosowanie ujawnionych tutaj adenowirusów, w szczególności adenowirusów grupy I i/lub adenowirusów grupy II, jako leków, a w szczególności w związku z ogólnoustrojowym podawaniem, można ulepszyć przez odpowiednie skierowanie adenowirusów. Zakażenie komórek nowotworowych adenowirusami zależy, między innymi, w pewnym stopniu od obecności rece pto ra wirusa Coxackie-adenowirusowego CAR oraz różnych integryn. Tak długo jak są one silnie eksprymowane w komórkach nowotworowych możliwe jest zakażenie przy bardzo niskich mianach (pfu/komórkę). Dotychczas wypróbowano różne strategie mające na celu, tak zwane, ponowne skierowanie rekombinowanych adenowirusów, np. przez odpowiednio wprowadzenie heterologicznych sekwencji w regionie główki włókna, zastosowanie bispecyficznych przeciwciał, powlekanie adenowirusów ligandami, wprowadzenie Iigandów do włókna Ad, podstawienie główki serotypu 5 lub trzonu i główki włókna serotypu 5 główką serotypu 3 lub trzonem i główką włókna Ad 35, oraz modyfikację podstawy pentonu (Nicklin S. A. i in., Molecular Therapy 2001, 4, 534-542; Magnusson, Μ. Κ. i in., J. of Virology 2001, 75, 7280-7289; Barnett B. G. i in., Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1575, 1-14). Realizacja odpowiednio takich dalszych postaci lub cech, w związku z różnymi aspektami wynalazku, w adenowirusach według wynalazku i adenowirusach stosowanych według wynalazku, w szczególności adenowirusach grupy I i adenowirusach grupy II, jest objęta wynalazkiem.

Wynalazek w dalszym aspekcie umożliwia realizację sposobu badania przesiewowego pacjentów, którzy mogą być leczeni przy pomocy zmodyfikowanego adenowirusa, tj. adenowirusa stosowanego zgodnie z wynalazkiem, takiego jak np. AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB016 lub wirusy opisane w europejskim opisie patentowym EP0931830, i/lub adenowirus grupy I i/lub adenowirus grupy II, przy czym sposób ten obejmuje następujące etapy:

- Analizę próbki tkanki nowotworu oraz

- Określenie czy YB-1 jest umiejscowiony w jądrze komórkowym niezależnie od fazy cyklu komórkowego, lub czy komórki zawierają rozregulowany YB-1.

Zamiast lub łącznie z YB-1 można badać obecność opisanych powyżej markerów.

PL 219 321 B1

W przypadku gdy tkanka nowotworowa lub jej część zawiera YB-1 w jądrze komórkowym, korzystnie niezależnie od fazy cyklu komórkowego, lub jej komórki zawierają rozregulowany YB-1, ujawnione tutaj adenowirusy, w szczególności adenowirusy grupy I i/lub adenowirusy grupy II można stosować zgodnie z wynalazkiem.

W jednej postaci sposobu rozważa się, że analizę tkanki nowotworowej przeprowadza się przy pomocy czynnika, który jest wybrany z grupy obejmującej przeciwciała przeciw YB-1, aptamery przeciw YB-1, Spiegelmery przeciw YB-1 a także antykaliny przeciw YB-1. Ogólnie, można także odpowiednio wytwarzać lub stosować ten sam typ środków dla odpowiednich markerów. Wytwarzanie przeciwciał, w szczególności przeciwciał monoklonalnych, jest znane specjalistom. Dalszym środkiem do specyficznego wykrycia YB-1 lub markerów są peptydy, które wiążą się z dużym powinowactwem ze swoimi strukturami docelowymi, w obecnym przypadku z YB-1 lub wspomnianymi markerami. W stanie techniki znane są sposoby wytwarzania takich peptydów, takie jak, np. prezentacja fagowa. Do takich celów wychodzi się od biblioteki peptydowej, w której poszczególne peptydy mają długość około 8 do 20 aminokwasów a wielkość biblioteki wynosi około 10² do 10¹⁸, korzystnie 10⁸ do 10¹⁵ różnych peptydów. Szczególną postacią cząsteczek docelowych wiążących polipeptydy są, tak zwane antykaliny, które opisano w, np. niemieckim zgłoszeniu patentowym DE19742706.

Dalszymi czynnikami do specyficznego wiązania YB-1 lub odpowiednich, ujawnionych tutaj, markerów, a zatem do wykrycia niezależnej od fazy cyklu komórkowego lokalizacji YB-1 w jądrze komórkowym, są tak zwane aptamery, tj. D-kwasy nukleinowe, które są obecne w postaci pojedynczej lub podwójnej nici w oparciu o RNA lub DNA i specyficznie wiążą cząsteczkę docelową. Wytwarzanie aptamerów opisano, np. w europejskim opisie patentowym EP0533838. Specjalną postacią aptamerów są tak zwane aptazymy, które np. opisano w Piganeau, N. i in. (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, nr 29, str. 4369-4373. Są one szczególną postacią aptamerów pod tym względem, że zawierają, oprócz ugrupowania aptamerowego, ugrupowanie rybozymowe oraz, po związaniu lub uwolnieniu związanej z ugrupowaniem aptamerowym cząsteczki docelowej, ugrupowanie rybozymowe staje się aktywne katalitycznie i rozszczepia substratowy kwas nukleinowy, co powoduje wytworzenie sygnału.

Dalszą postacią aptamerów są tak zwane Spiegelmery, tj. cząsteczki docelowe wiążące kwasy nukleinowe zawierające L-kwasy nukleinowe. Sposób opisania takich Spiegelmerów opisano, np. w WO 98/08856.

Próbkę tkanki nowotworowej można uzyskać w wyniku punkcji lub operacji chirurgicznej. Ocenę czy YB-1 jest umiejscowiony w jądrze komórkowym, niezależnie od fazy cyklu komórkowego, często przeprowadza się przy zastosowaniu technik mikroskopowych i/lub analizy immunohistologicznej, zazwyczaj przy zastosowaniu przeciwciała lub któregokolwiek z dalszych opisanych powyżej środków. Dalsze sposoby wykrywania YB-1 w jądrze komórkowym oraz jego lokalizacji niezależnie od fazy cyklu komórkowego są znane specjalistom. Przykładowo, lokalizację YB-1 można łatwo wykryć przez przeszukanie przekrojów tkanki wybarwionych przeciw YB-1. Częstość występowania YB-1 w jądrze komórkowym jest wskazaniem tego, czy jądrowa lokalizacja jest niezależna od fazy cyklu komórkowego. Dalszą możliwością wykrycia niezależnej od fazy cyklu komórkowego obecności YB-1 w jądrze komórkowym jest wybarwienie próbki przeciw YB-1 i ocena czy YB-1 jest umiejscowione w jądrze wraz z wyznaczeniem fazy cyklu komórkowego komórek. Jednakże analizę tę lub wykrycie YB-1 można przeprowadzić przy zastosowaniu wymienionych powyżej środków skierowanych przeciw YB-1. Wykrywanie przy pomocy tych środków przeprowadza się zgodnie z procedurami znanymi specjaliście w dziedzinie. Ponieważ wspomniane środki są specyficznie skierowane przeciw YB-1, a zatem nie wiążą innych struktur w analizowanej próbce, w szczególności innych struktur komórkowych, zatem zarówno ze względu na lokalizację wspomnianych środków przy pomocy odpowiedniego wyznakowania tych środków oraz ich specyficzne wiązanie z YB-1, można wykryć i ocenić lokalizację YB-1. Sposoby znakowania tych czynników są znane specjalistom. Niektóre techniki można także stosować w celu wyznaczenia czy oraz jeżeli tak to jak wiele komórek w próbce zawiera rozregulowany YB-1. Ponieważ rozregulowany YB-1 wykazuje także nadekspresję w porównaniu z nierozregulowanym YB-1, względną ekspresję YB-1, w porównaniu z próbką odniesienia, można zastosować do wyznaczenia czy YB-1 jest rozregulowany w analizowanej komórce.

Wynalazek zostanie teraz zilustrowany przy pomocy figur i przykładów, z których można wyprowadzić nowe cechy, postacie oraz zalety wynalazku. W związku z tym

Fig. 1 przedstawia model strukturalny wektorów adenowirusowych nazwanych tutaj wektorami adenowirusowymi AdE1/E3-minus, które są adenowirusami z delecją E1/E3, adenowirusa typu dzikiego i adenowirusa dl520;

PL 219 321 B1

Fig. 2 przedstawia domeny wiążące białka E1A w odniesieniu do wiązania p300, p107 i p105;

Fig. 3 przedstawia komórki U2OS, które nie zawierają YB-1 w jądrze, po zakażeniu adenowirusem Ad5 z delecją E1/E3, nazywanym tutaj E1/E3-minus Ad5 oraz dl520;

Fig. 4 przedstawia komórki 257RDB, które zawierają YB-1 w jądrze, po zakażeniu adenowirusem Ad5 z delecją E1/E3, nazywanym tutaj E1/E3-minus Ad5 oraz dl520;

Fig. 5 przedstawia komórki 257RDB i U2OS po zakażeniu adenowirusem dl1119/1131;

Fig. 6 przedstawia wynik analizy EMSA, która potwierdza, że YB-1 jest obecny w jądrze komórkowym wieloopornych komórek oraz w liniach komórkowych 257RDB, 181 RDB, MCF-7Ad, przy czym YB-1 nie jest obecny w jądrze komórkowym komórek US2OS i HeLa;

Fig. 7 przedstawia model strukturalny białka E1A adenowirusa typu dzikiego, adenowirusa dl520 oraz adenowirusa dl1119/1131;

Fig. 8 przedstawia wykres słupkowy pokazujący wydajność replikacyjną adenowirusa w obecności dodatkowo eksprymowanego białka wirusowego w wartościach bezwzględnych;

Fig. 9 przedstawia wykres słupkowy pokazujący wzrost wydajności replikacji adenowirusów w obecności dodatkowo eksprymowanego białka wirusowego;

Fig. 10 przedstawia studzienki z hodowanymi tam komórkami U2OS po wybarwieniu fioletem krystalicznym i zakażeniu dl520 przy 10 lub 30 pfu/komórkę lub kontrolne (K), bez podania daunorubicyny lub po podaniu 40 ng daunorubicyny na ml;

Fig. 11 przedstawia studzienki z hodowanymi tam komórkami HeLa po wybarwieniu fioletem krystalicznym i zakażeniu dl520 przy 10 lub 30 pfu/komórkę lub kontrolne (K), bez podania daunorubicyny lub po podaniu 40 ng daunorubicyny na ml;

Fig. 12 przedstawia diagram objętości nowotworu w funkcji czasu dla nowotworów różnego pochodzenia (RDB257 i HeLa) po leczeniu PBS lub dl520;

Fig. 13 przedstawia obraz uśmierconych myszy, u których rozwinął się nowotwór oparty na komórkach RDB257, po leczeniu PBS lub 5x10 pfu dl520;

Fig. 14 przedstawia wynik analizy Southern blot na ekstrakcie komórkowym (podskórnie hodowanych nowotworów) komórek RDB257 i komórek HeLa po zakażeniu dl520;

Fig. 15 przedstawia wykres słupkowy wskazujący wydajność replikacji lub tworzenia cząstek dl520 oraz adenowirusa typu dzikiego w komórkach nowotworowych z YB-1 -dodatnim jądrem (257RDB i 181RDB) oraz komórkach nowotworowych z YB-1-ujemnym jądrem (HeLa, U2OS);

Fig. 16 przedstawia model strukturalny adenowirusa typu dzikiego oraz adenowirusowego wektora AdXVir03;

Fig. 17 przedstawia model strukturalny adenowirusa typu dzikiego oraz adenowirusowego wektora AdXVir03/01; oraz

Fig. 18A/B przedstawia studzienki z hodowlami komórek 18RDB (fig. 18A) i komórek 272RDB (fig. 18B) po wybarwieniu fioletem krystalicznym i zakażeniu Ad312 (20 pfu/komórkę), Xvir03 (5 pfu/komórkę) oraz komórek kontrolnych (nie zakażonych), w których wybarwienie fioletem krystalicznym przeprowadzono pięć dni po zakażeniu;

Fig. 19 przedstawia wynik analizy Northern blot ekspresji genu E2 w komórkach A549 i U2OS po zakażeniu adenowirusem Ad5 typu dzikiego i adenowirusem Ad312;

Fig. 20 przedstawia wynik analizy Northern blot ekspresji genu E2 w komórkach U2OS po zakażeniu adenowirusem typu dzikiego i adenowirusem delta24 po 12 i 24 godzinach;

Fig. 21 przedstawia model strukturalny adenowirusowego wektora XvirPSJL1;

Fig. 22 przedstawia model strukturalny adenowirusowego wektora XvirPSJL2;

Fig. 23 przedstawia studzienki z hodowanymi komórkami HeLa po wybarwieniu fioletem krystalicznym i zakażeniu dl520 przy różnych pfu/komórkę;

Fig. 24 przedstawia wykres słupkowy wskazujący aktywność Iucyferazy w komórkach U2OS, komórkach HeLa i komórkach 257RDB po zastosowaniu różnych fragmentów promotora adenowirusowego późnego promotora E2; oraz

Fig. 25 przedstawia wykres słupkowy wskazujący liczbę cząstek wirusa po zakażeniu komórek U2OS adenowirusem eksprymującym YB-1 oraz wirusem Ad312 po dwóch i pięciu dniach, przy czym rozróżnienie przeprowadza się pomiędzy cząstkami wirusa pozostałymi wewnątrz komórki (przedstawionymi na czarno) a cząstkami wirusa uwolnionymi na zewnątrz komórki (poziome paski).

PL 219 321 B1

P r z y k ł a d 1: Typy modyfikacji E1A, które mogą być zawarte w adenowirusach, które są stosowane zgodnie z wynalazkiem

Fig. 1 przedstawia model strukturalny adenowirusowych wektorów AdE1/E3-minus, tj. adenowirusów z delecją E1/E3, adenowirusa typu dzikiego i adenowirusa dl520.

Adenowirus AdE1/E3-minus nie zawiera regionu kodującego funkcjonalne E1A lub funkcjonalne E1B lub E3 i jest stosowany w doświadczeniach jako kontrola toksyczności.

Gen E1A typu dzikiego koduje łącznie 5 białek, które są wytwarzane przez alternatywne składanie RNA E1A. Między innymi wytwarzane są dwa różne białka, dokładnie 289-aminokwasowe białko i 243-aminokwasowe białko. dl520 nie koduje 289-aminokwasowego białka, gdyż zawiera delecję we fragmencie CR3 genu E1A, która powoduje brak produktu genu 13S. Adenowirus dl520, który może być stosowany według wynalazku, jest nazywany przez specjalistów wirusem 12S-E1A. Adenowirus dl347 (Wong i Ziff, J. Virol., 68, 4910-4920, 1994) znany w dziedzinie wynalazku jest także wirusem 12S-E1A, który może być stosowany zgodnie z wynalazkiem.

W 289-aminokwasowym białku, które jest kodowane przez 13S-E1A mRNA, występują 3 regiony, które są konserwatywne wśród różnych podtypów adenowirusów. Są one nazywane CR1, CR2 i CR3. Podczas gdy CR1 i CR2 są obecne w obydwu białkach E1A (E1A 12S i E1A 13S), tj. zarówno w 289-aminokwasowym i 243-aminokwasowym białku, region CR3 jest obecny tylko w dłuższym z tych dwóch wspomnianych powyżej białek.

Region CR3 jest wymagany do aktywacji genów wirusowych, w szczególności E1B, E2, E3 i E4. Wirusy, które zawierają tylko krótsze, 243-aminokwasowe białko, bardzo słabo transaktywują geny wirusowe oraz nie prowadzą replikacji adenowirusa w tych komórkach, które nie zawierają YB-1 w jądrze. Ponieważ YB-1 jest obecny w jądrze tylko w komórkach nowotworowych lub może być wykryte tylko tam, wektor ten jest odpowiedni do wywołania nowotworowo-specyficznej replikacji.

Ze względu na delecję CR3 w dl520 adenowirus ten nie może przenosić komórkowego YB-1 do jądra komórkowego, co jest tutaj także nazywane translokacją, a zatem nie występuje ono w miejscu replikacji w komórkach, które mają YB-1-ujemne jądra, a zatem jest on wirusem, który może być stosowany zgodnie z wynalazkiem, przy czym wirus ten wykazuje transaktywację wymaganą zgodnie z wynalazkiem.

P r z y k ł a d 2: Sposób działania adenowirusów w zależności od stanu Rb komórek

Fig. 2 przedstawia domeny wiążące białka E1A w odniesieniu do wiązania p300, p107 i p105. P300, a także p107, jest komórkowym białkiem wiążącym. Wiązanie białka retinoblastoma (pRb), białka supresora nowotworów, zachodzi przez CR1 i CR2. Badania wykazały, że pRb i p107/p300 w połączeniu z komórkowym czynnikiem transkrypcyjnym E2F skutecznie regulują transkrypcję. Białko E1A typu dzikiego oddziałuje z wiązaniem E2F z Rb. Tak uwolnione E2F wiąże się z wczesnym promotorem E2 i w ten sposób indukuje replikację adenowirusa.

Ze stanu techniki wiadomo, że przez pewne delecje w onkoproteinie E1A można wytworzyć rekombinowane wektory adenowirusowe, takie jak te wspomniane powyżej, które są zdolne do replikowania się głównie w komórkach Rb-ujemnych i mogą być stosowane zgodnie z wynalazkiem. Przykładowo, adenowirusowy wektor dl922-947 zawiera delecję w regionie CR2 (pozycje aminokwasowe 122-129), a wektor CB016 zawiera delecje w regionie CR1 (pozycje aminokwasowe 27-80) oraz regionie CR2 (pozycje aminokwasowe 122-129). Wektor E1AdI01/07 zawiera delecję w regionie CR2 (pozycje aminokwasowe 111-123). Ponadto, ze względu na dodatkową delecję na N-końcu (pozycje aminokwasowe 4-25), brak także wiązania z białkiem p300. Adenowirusowy wektor AdΔ24 zawiera delecję w regionie CR2 (pozycje aminokwasowe 120-127). Adenowirusowy wektor opisany w opisie patentowym EP0931830 zawiera delecje w regionie CR1 i regionie CR2.

Mechanizm wiązania E2F/RB i uwalniania E2F kierowany E1A różni się fundamentalnie od mechanizmu leżącego u podstaw wynalazku. Inaczej niż twierdzono w stanie techniki, uwalnianie E2F z białka Rb nie jest istotne, ani też nie odgrywa zasadniczej roli do replikacji wirusa, ale najważniejsza jest jądrowa lokalizacja ludzkiego czynnika transkrypcyjnego YB-1. Ten czynnik transkrypcyjny jest, w normalnych komórkach, obecny tylko w cytoplazmie przez większość cyklu komórkowego. Po zakażeniu adenowirusem wprowadzany jest on do jądra w pewnych warunkach lub też już jest obecny w jądrze w określonych układach komórkowych, takich jak pewne choroby nowotworowe obejmujące, lecz nie wyłącznie, np. raka sutka, raka jajnika, raka prostaty, kostniakomięsaka, glejaka, czerniaka, drobnokomórkowego raka płuca oraz raka jelita grubego.

PL 219 321 B1

P r z y k ł a d 3: Zakażenie komórek U2OS

Wysiano po 100000 komórek U2OS na szalkę. Następnego dnia komórki zakażono różnymi adenowirusami, jak wskazano na fig. 3. Zakażenie przeprowadzono w 500 μl wolnego od surowicy podłoża DMEM w 37°C przez 1 godzinę. Następnie podłoże zakażające usunięto i zastąpiono je 2 ml podłoża pełnego (10% FCS/DMEM). Analizę przeprowadzono po 3 dniach przy zastosowaniu barwienia fioletem krystalicznym.

Jak można wywnioskować z fig. 3, komórki U2OS, które nie zawierają YB-1 w jądrze, nie wykazują lizy, co wykazano przez barwienie fioletem krystalicznym, po zakażeniu dwoma różnymi adenowirusami, a dokładnie adenowirusem z delecją E1/E3, nazywanym E1/E3-minus oraz adenowirusem dl520, który może być stosowany zgodnie z wynalazkiem. W tym celu najpierw usunięto podłoże. Następnie, na komórki naniesiono fiolet krystaliczny (50% ETOH, 3% formaldehyd, 5% kwas octowy, 1% fiolet krystaliczny) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut. Następnie 6-studzienkowe płytki dokładnie przemyto wodą i wysuszono w temperaturze pokojowej.

Potwierdziło to odkrycie leżące u podstaw wynalazku, że obecność YB-1 jest wymagana do zaindukowania wirusów, stosowanych zgodnie z wynalazkiem, do zlizowania zakażonych komórek.

P r z y k ł a d 4: Zakażenie komórek 257RDB

Wysiano po 100000 komórek 257RDB na szalkę. Następnego dnia komórki zakażono różnymi adenowirusami, jak wskazano na fig. 4. Zakażenie przeprowadzono w 500 μl wolnego od surowicy podłoża DMEM W 37°C przez 1 godzinę. Następnie podłoże zakażające usunięto i zastąpiono je 2 ml podłoża pełnego (10% FCS/DMEM). Analizę przeprowadzono po trzech dniach przy zastosowaniu barwienia fioletem krystalicznym.

Wynik doświadczenia przedstawiono na fig. 4. Adenowirus nazwany E1/E3-minus Ad5, który zawiera delecję E1/E3, nie wykazuje żadnej Iizy przy niskiej MOI (pfu/komórkę) przy zakażeniu komórek 257RDB, które zawierają YB-1 w jądrze. W odróżnieniu od tego, dl520, jak pokazano w przykładzie 3, nie replikuje się w komórkach z YB-1-ujemnym jądrem i równocześnie koduje onkogenne białko transaktywowane przez E1A w znaczeniu według wynalazku, co powoduje praktycznie całkowitą lizę przy MOI (ang. „multiplicity of infection”, krotności zakażenia) wynoszącej 40 pfu na komórkę i nadal dominującą lizę przy MOI wynoszącej 10 pfu na komórkę. Można z tego wywnioskować, że dl520 i podobne wirusy, takie jak tutaj opisane dl1119/1131 lub AdXvir 03, wymagają MOI, która jest obniżona o co najmniej jeden rząd wielkości (około dziesięciokrotnie) w porównaniu z adenowirusem z delecją E1 lub delecją E1/E3, co uzasadnia ich kliniczne stosowanie.

Jak przedstawiono na fig. 7, białko E1A dl520 charakteryzuje się tym, że jego region CR3 jest wydeletowany, co wywołuje transaktywację wymaganą do stosowania zgodnie z wynalazkiem oraz replikację w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem.

P r z y k ł a d 5: Zakażenie komórek 257RDB i U2OS dl1119/1131

Jak przedstawiono na fig. 5, nie występuje Iiza przy MOI wynoszącej 20 pfu na komórkę przy zakażeniu komórek U2OS z YB-1-ujemnym jądrem adenowirusem dl1119/1131, który zawiera delecję aminokwasów 4-138 białka E1A lub kodującego je kwasu nukleinowego, oraz dalej zawiera kodon stop po aminokwasie 218, przy czym eksprymowane skrócone białko E1A zawiera region CR3 pełnego białka E1A. Jako kontrolę negatywną zastosowano warstwę komórek nie zakażonych.

W odróżnieniu od tego, występowała praktycznie całkowita Iiza warstwy komórek przy MOI wynoszącej 20 pfu na komórkę pod wpływem adenowirusa dl1119/1131 w układzie komórkowym, takim jak komórki 257RDB, które zawierają YB-1 w jądrze, tj. mają YB-1-dodatnie jądro. Jak dotychczas przykład ten jest kolejnym dowodem, że zmodyfikowane białko onkogenu E1A, które, jak przedstawiono na fig. 7, zawiera, np. tylko region CR3 i brak w nim regionu CR1 oraz regionu CR2, zapewnia wymaganą do stosowania adenowirusów zgodnie z wynalazkiem transaktywację w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem, co wywołuje replikację wirusa. Adenowirus dl1119/1131 jest zatem dalszym adenowirusem, który może być stosowany zgodnie z wynalazkiem. Wynalazek obejmuje także stosowanie wirusów, które są zaprojektowane podobnie do dl1119/1131 w odniesieniu do regionu CR3, ale w odróżnieniu od niego zawierają region CR1 i/lub region CR2.

P r z y k ł a d 6: Wykrycie jądrowego YB-1 w komórkach opornych wielolekowo

Przykład ten jest oparty na okoliczności, że jądrowe YB-1 powinno wiązać jako czynnik transkrypcyjny kasetę Y (sekwencja CAAT) w promotorze mdr1 (ang. „multiple drug resistance”, promotor oporności wielolekowej). W celu wykrycia tego przeprowadzono tak zwaną analizę EMSA (ang. „electrophoretie mobility shift assay”, test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej). W związku z tym wyizolowano jądrowe białko, a następnie 1-10 μg białka inkubowano z krótkim fragmentem DNA

PL 219 321 B1 (oligo) w 37°C. W celu związania YB-1 zastosowano następujący oligonukleotyd: promotor mdr1 w odróżnieniu od U2OS (pozycje -86 do -67): TGAGGCTGATTGGCTGGGCA (kasetę Y podkreślono).

Przed reakcją ten fragment DNA wyznakowano radiokatywnie ³²P na 5'-końcu. Następnie rozdział prowadzono w natywnym żelu poliakryloamidowym. W przypadku białka YB-1, jego wiązanie do sekwencji w oligonukleotydzie, można było wykryć przez to, że niezwiązany oligonukleotyd migrował w żelu szybciej niż związany oligonukleotyd (Holm, P. S. i in., JBC 277, 10427-10434, 2002; Bargou, R. C. i in., Nature Medicine 3, 447-450, 1997).

Jak przedstawiono na fig. 6, przy pomocy analizy EMSA można wykazać, że YB-1 jest obecny w jądrze wielolekowo opornych komórek 257RDB, 181RDB i MCF-7Ad, w odróżnieniu od linii komórkowych U2OS i HeLa.

Wyniki przedstawione w przykładach 4 i 5 potwierdzają, że adenowirusy dl520 i dl1119/1131 replikują się w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem, takich jak np. 257RDB w odróżnieniu od komórek U2OS, oraz wywołują ich lizę. Potwierdza to odkrycie dotyczące zastosowania adenowirusów według wynalazku. Ponadto, wyniki potwierdzają, że słaba, w porównaniu z adenowirusem typu dzikiego, transaktywacja genów wirusowych w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem, przez tak zmodyfikowane lub wydeletowane produkty genu E1A wywołuje skuteczną replikację i lizę takich komórek w obecności YB-1 w jądrze, obejmujących np. komórki oporne wielolekowo oraz że adenowirusy tutaj opisane, mogą być zatem stosowane do Iizy takich nowotworów.

P r z y k ł a d 7: Wzrost wydajności replikacji w adenowirusach E1-minus

Przykład ten pokazuje, że wczesne geny wirusowe E1B-55K i E4orf6 mogą zostać podstawione przez transfekcję plazmidem pE4orf6 i zakażenie adenowirusem Ad-55K z delecją E1/E3. Ad-55K jest wirusem z delecją E1/E3, w którym E1B-55K jest wklonowane w E1 i jest pod kontrolą CMV. Podstawienie to jest wymagane ze względu na fakt, że AdYB-1, tj. adenowirus eksprymujący YB-1, nie eksprymuje tych wczesnych genów, a wynalazca stwierdził, że podstawienie tych wczesnych genów w układzie replikacyjnym, który zawiera YB-1 w jądrze, jest w stanie podwyższyć odpowiednio wydajność replikacji i wydajność tworzenia cząstek, do poziomu porównywalnego z adenowirusami typu Ad5 typu dzikiego.

Przeprowadzono następujące operacje:

₅

Transfekowano każde 10⁵ komórek U2OS plazmidem pE4orf6 przy zastosowaniu Iipofektaminy. Plazmid pE4orf6 niesie sekwencję DNA kodującą wczesny gen wirusowy E4orf6 pod kontrolą CMY.

godziny po transfekcji plazmidem pE4orf6 komórki zakażono eksprymującym YB-1 adenowirusem AdYB-1 z delecją E1/E3 (50 pfu/komórkę) oraz adenowirusem Ad-55K E1B-55K z delecją E1/E3 (50 pfu/komórkę). Ad-55K jest wirusem z delecją E1/E3 niosącym jako transgen wirusowy gen E1B-55K pod kontrolą CMV.

Następnie, komórki usunięto z podłoża (2 ml) 5 dni po zakażeniu (= po zakażeniu). Cząstki wirusa uwolniono z izolowanych komórek przez trzykrotne naprzemienne zamrażanie i rozmrażanie (zamrażanie/rozmrażanie). Następnie test łysinkowy przeprowadzono na komórkach 293 w celu wyznaczenia wytworzonych zakażonych cząstek (cząstki tworzące łysinki na ml (pfu/ml)). Wyniki przedstawiono na fig. 8 i 9. Fig. 8 przedstawia wynik testu łysinkowego w liczbach bezwzględnych. Najistotniejszą różnicę, w porównaniu z zakażeniem samym AdYB-1, zaobserwowano przy zakażeniu plazmidem pE4orf6 i kozakażeniu dwoma wirusami AdYB-1 i Ad-55K. Fig. 9 pokazuje wynik z fig. 8, gdzie wzrost wydajności replikacji przedstawiono jako krotność replikacji wyznaczonej dla AdYB-1. Komórki zakażone plazmidem pE4orf6, a następnie AdYB-1 i E1B-55K (Ad-55K) wytworzyły do 25-krotnie wyższą liczbę pfu/ml.

W oparciu o te wyniki można wywnioskować, że podstawienie E1B-55K i E4orf6 25-krotnie zwiększa liczbę tworzonych wirusów (pfu/ml), po zakażeniu adenowirusem AdYB-1 z delecją E1/E3. Addytywny wpływ E1B-55K i E4orf6 na wytwarzanie jednostek tworzących łysinki (pfu) jest znacznie wyższy w porównaniu z wpływem tych dwóch produktów genu.

Doświadczenia kontrolne z plazmidem eksprymującym EGFP, wyraźnie pokazały, że w wybranym podejściu doświadczalnym tylko 10% komórek zostało skutecznie transfekowane plazmidem pE4orf6. Liczba cząstek wytworzonych w komórkach, które eksprymu ją zarówno E1B-55K, jak i E4orf6 jest porównywalna z ludzkich adenowirusów typu 5 (typ dziki). Potwierdza to, że odkrycie leżące u podstaw wynalazku, że ekspresja E4orf6 i E1B-55K jest w stanie, w połączeniu z jądrową lokalizacją YB-1, dostarczyć replikację adenowirusa i tworzenie cząstek, w szczególności adenowirusów z delecją E1A, porównywalne z Ad5 typu dzikiego.

PL 219 321 B1

P r z y k ł a d 8: Podwyższona replikacja adenowirusów, które nie replikują się w komórkach z YB-1-ujemnym jądrem, w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem po podaniu cytostatyków

W stanie techniki ogólnie wiadomo, że różne cytostatyki wywołują jądrową lokalizację ludzkiego czynnika transkrypcyjnego YB-1. Jak stwierdził wynalazca, YB-1 umiejscowiony w jądrze kontroluje replikację adenowirusa przy pomocy aktywacji adenowirusowego późnego promotora E2. Połączenie obydwu efektów można stosować w celu zapewnienia specyficznej Iizy nowotworu.

W przeprowadzaniu testów onkolitycznych zastosowano następującą procedurę: 200000 komórek (HeLa lub U2OS) wysiano do każdej studzienku 6-studzienkowej płytki. Następnego dnia dodano 40 ng/ml (stężenie końcowe) daunorubicyny. Po trzech godzinach inkubacji komórki zakażono 10 lub 30 pfu dl520/komórkę. Następnie komórki inkubowano w podłożu wolnym od cytostatyku. Po 3 - 5 dniach komórki wybarwiono przy pomocy fioletu krystalicznego.

Jak można wywnioskować z fig. 10 i 11, dodanie daunorubicyny indukuje replikację dl520 przez jądrową lokalizację YB-1. Zatem, dl520 powoduje większe działanie wywołujące lizę nowotworu w połączeniu z cytostatykiem daunorubicyną w porównaniu z zastosowaniem samej daunorubicyny.

P r z y k ł a d 9: Liza nowotworu in vivo przez dl520

Komórki HeLa (jądro YB-1-ujemne) i 257RDB (jądro YB-1-dodatnie) zastosowane w doświadczeniu in vivo namnożono w warunkach jałowej hodowli komórkowej. Przed wstrzyknięciem komórek myszom (szczep CD1NuNu) w celu wytworzenia podskórnego nowotworu, komórki zebrano przez trypsynizację, przeniesiono do podłoża DMEM (10% FCS), policzono i przemyto jednokrotnie PBS. Następnie komórki odwirowano, PBS odessano i komórki rozporcjowano w świeżym PBS do odpowiedniej liczby komórek. Liczba komórek, które wstrzyknięto podskórnie w tym doświadczeniu, wynosiła 5x10⁶ dla obydwu linii komórkowych. Wstrzyknięcie przeprowadzono podskórnie do jednego boku zwierząt, przy czym komórki HeLa wstrzyknięto w prawy bok, a komórki 257RDB wstrzyknięto w lewy bok w celu lepszego ich rozróżnienia. Wzrost nowotworów kontrolowano dwa razy na tydzień, kiedy to mierzono długość i szerokość nowotworu przy pomocy suwmiarki z noniuszem. W oparciu o te pomiary obliczono objętość nowotworu na podstawie poniższego wzoru matematycznego:

₂

3/4Π • a/2 • (b/2)² a = długość, b = szerokość ₃

Gdy nowotwór osiągnął objętość 200 do 520 mm³ do nowotworu podano wirus lub PBS, jako kontrolę negatywną. Wstrzykiwane objętości były identyczne i wynosiły za każdym razem 50 pl. Zastrzyki powtarzano przez trzy kolejne dni. Ogólna dawka zastosowanych wirusów wynosiła 5 x 10⁸ pfu. Następnie badanie wzrostu nowotworu kontynuowano i dwa razy na tydzień obliczano jego objętość. Pod koniec doświadczenia myszy uśmiercono i nowotwory usunięto do dalszej analizy.

Wyniki przedstawiono na fig. 12 i 13.

Fig. 12 przedstawia diagram objętości nowotworu w funkcji czasu oraz przy różnych schematach leczenia. W przypadku gdy nowotwór był tworzony przez komórki RDB257, zaobserwowano istotny wzrost nowotworu do około 438 mm³ do 1466 mm³ po wstrzyknięciu PBS. Pod wpływem wektora dl520, który zastosowano zgodnie z wynalazkiem, wzrost nowotworu mógł być znacznie obniżo₃ ny. Wychodząc od średniej wielkości nowotworu 344 mm³, wielkość nowotworu wzrosła tylko o 21% ₃ całkowicie do 543 mm³.

W przykładzie tym nowotwór zawierający komórki HeLa zastosowano jako kontrolę i po podaniu PBS zachowywał się on podobnie jak nowotwór oparty na RDB257 po podaniu PBS. Jednakże nowotwory oparte na komórkach HeLa i leczone dl520, wykazywały znaczący wzrost wielkości nowotworu, wychodząc od 311 mm³ i wzrastały do 1954 mm³.

Fig. 13 przedstawia obraz uśmierconych myszy naiwnych, które miały nowotwory oparte na RDB257. Można wyraźnie zaobserwować, że po podaniu adenowirusa dl520 według wynalazku wystąpiło znaczne zmniejszenie nowotworu. W tym przypadku zaobserwowano nawet zmniejszenie obję₃ tości nowotworu (dzień po pierwszym podaniu wirusa dl520: 515 mm³; 30 dni po podaniu wirusa dl520: 350 mm³).

P r z y k ł a d 10: Analiza Southern Blot nowotworowego DNA

DNA wyekstrahowano z próbki nowotworu, którą pobrano ze środka nowotworu wyhodowanego w przykładzie 9. Do izolacji zastosowano zestaw Dneasy Tissue Kit firmy Qiagen. Izolację DNA przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Zgodnie z tym DNA uwolniono z komórek przez lizę alkaliczną. Następnie wyizolowany DNA oczyszczono na kolumnie. Następnie, stężenie wyizolowanego DNA wyznaczono spektrofotometrycznie przy 260 nm. analizę przeprowadzono stosując 2 μg próbek DNA, które strawiono 10 jednostkami enzymu restrykcyjnego KpnI. Następnie, rozdział elektroforetyczny próbek przeprowadzono w 0,8% żelu agarozowym. Następnie, DNA przeniesiono na błonę

PL 219 321 B1 nylonową (co wykonano zgodnie z systemem Schleicher & Schuell). DNA przeniesione na błonę hybrydyzowano ze specyficzną sondą DNA wielkości 1501 pz. Sonda DNA wielkości 1501 pz specyficznie wiąże fragment Kpn I o wielkości 3369 pz w sekwencji Ad5 kodującej E2A. Sondę przygotowano wcześniej przy pomocy PCR (starter: 5'- GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT (SEQ. ID. NO. 2),

5'- GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT (SEQ. ID. NO.3)) i wyznakowano radioaktywnie przy pomocy ³²P. Następnie błonę przemyto i naświetlono nią błonę rentgenowską.

Wynik analizy Southern Blot nowotworowego DNA przedstawiono na fig. 14. Analiza ta potwierdziła, że tylko dl520 replikuje się in vitro w opornych komórkach RDB257, co widać w ścieżkach 3, 4 i 5. Ścieżka 1 przedstawia kontrolę pozytywną Ad-5d, ścieżki 6, 7 i 8 przedstawiają DNA z komórek HeLa, które zakażono dl520. Ponieważ komórki HeLa nie mają YB-1-dodatniego jądra, wirus dl520 nie replikuje się w nich, a zatem, zgodnie z tym, sekwencja E2A nie może być wykryta.

Dalszy wynik z dl520 przedstawiono na fig. 15. W oparciu o test łysinkowy zbadano tworzenie cząstek (pfu/ml) po zakażeniu dl520 i adenowirusem typu dzikiego. Różne komórki nowotworowe z YB-1-dodatnim jądrem (257RDB i 181RDB) i komórki z YB-1-ujemnym jądrem zakażono dl520 i adenowirusem typu dzikiego.

Przeprowadzono następującą procedurę:

100000-200000 każdych komórek wysiano do tak zwanych płytek 6-studzienkowych w podłożu L 15 (komórki oporne) i DMEM (komórki nieoporne) z 10% FCS. Po 24 godzinach przeprowadzono zakażenia dl520 i adenowirusami typu dzikiego (10 pfu/komórkę). Trzy dni po zakażeniu (po zakażeniu) cząstki wirusa były uwalniane z zawiesiny komórek (3 ml) przez trzykrotne naprzemienne zamrażanie i rozmrażanie. Następnie przeprowadzono test łysinkowy na komórkach 293 w celu oznaczenia zakaźnych cząstek (jednostki tworzące łysinki na ml (pfu/ml)). Wynik przedstawiono na fig. 15. Wynik testu łysinkowego pokazuje, że dl520 replikuje się w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem (257RDB i 181RDB) podobnie jak adenowirus typu dzikiego. Ponadto, można zaobserwować wydajność replikacji porównywalną z wydajnością dla adenowirusów typu dzikiego przy stosowaniu, zgodnie z wynalazkiem, opisanych tutaj adenowirusów.

P r z y k ł a d 11: Model strukturalny adenowirusowego wektora Xvir03

Fig. 16 przedstawia model strukturalny adenowirusowego wektora Xvir03. Adenowirus Xvir03 jest tak zwanym adenowirusem z delecją E1/E3. Oznacza to, że nie są wytwarzane białka E1A, E1B i E3, które byłyby funkcjonalne w replikacji adenowirusa. Delecja regionu E1 obejmuje fragment 3423528; deIecja regionu E3 obejmuje pozycje aminokwasowe 27865 - 30995. W zastosowanym tutaj znaczeniu, termin „wirus z delecją E1” oznacza wirus, w którym E1 nie jest dłużej aktywne funkcjonalnie. Można to osiągnąć przez inaktywację w innym przypadku w większości nienaruszonej sekwencji kwasu nukleinowego lub aminokwasowej, jednakże może to także oznaczać delecję regionu E1 kodującego białka o różnych wielkościach. Ze względu na brak E1A i białka E1B lub kodującego je kwasu nukleinowego, region E4, np. E4orf6, jest tylko słabo eksprymowany (około 1-5% w porównaniu z adenowirusami typu dzikiego) lub wcale nie eksprymowany. Wirusowe geny E1B55k i E4orf6 są eksprymowane w regionie E1 przez zastosowanie heterologicznego promotora CMV (Clontech: plazmid pShuttle) wprowadzonego do Xvir03. Zamiast promotora CMV, w połączeniu z ekspresją E1A można zastosować każdy z oraz którykolwiek z promotorów tutaj ujawnionych. Otwarte ramki odczytu obydwu genów są połączone ze sobą przy pomocy tak zwanej sekwencji IRES (ang. „internal ribosomal entry site”, wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu) (Pelletier, J. and Sonenberg, N. Nature, 1988, 334, 320-325). Element ten (Novagen; pCITE) zapewnia ekspresję dwóch białek z jednego mRNA.

Wektor wytworzono w następujący sposób:

Plazmid E1B55k-pShuttle wytworzono przez sklonowanie otwartej ramki odczytu E1B55k z pCGNE1B uzyskanego od M. Dobelstein (University of Marburg) przez strawienie Xbal i BfrI i wprowadzenie do wektora pShuttle firmy Clontech. Następnie, E1B55k w wektorze pShuttle zlinearyzowano przy pomocy ApaI, wytworzono w nim tępe końce i strawiono NheI.

Następnie w drugi wektor pcDNA3.1(+) (Invitrogen), kolejno wklonowano element IRES, jako produkt PCR z zastosowaniem pCITE-4a(+) firmy Novagen jako matrycy przy pomocy klonowania TA w miejsce trawienia EcoRV, oraz E4orf6 z plazmidu pCMV-E4orf6 (Μ. Dobelstein, University of Marburg) wklonowano przy pomocy BamHI = IRES-E4orf6-pcDNA3.1(+). IRES-E4orf6 w pcDNA3.1(+) zlinearyzowano NotI, wytworzono w nim tępe końce, a następnie fragment IRES-E4orf6 wycięto NheI. Fragment IRES-E4orf6 połączono z otwartym wektorem E1B55k-pShuttle (tępe końce, Nhel]. Następnie kasetę sklonowane z E1B55k-IRES-E4orf6-pShuttle razem z promotorem CMV i PolyA bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) w AE1, AE3 Adeno-X-Plazmid (Clontech) przy pomocy I-Ceu I i Pl-Scel,

PL 219 321 B1 i nazwano go AdcmvE1B/IRES/E4orf6. Następnie, adenowirus wytworzono zgodnie z instrukcjami producenta (Clontech). Adenoplazmidem, który zlinearyzowano Pacl, zawierającym element ekspresyjny CMV-E1B55k-IRES-E4orf6-BGH polyA, transfekowano komórki HEK293 i 11 dni po transfekcji odwarstwione komórki usunięto razem z podłożem w celu uwolnienia adenowirusów przez powtarzanie cykli zamrażania-rozmrażania.

Opisany powyżej wektor jest ogólnie odpowiedni, tak jak inne opisane tutaj wirusy, do stosowania zgodnie z wynalazkiem. W szczególności, wspomniany powyżej wektor jest w stanie się replikować i wywołać lizę, w komórkach z YB-1-dodatnimi jądrami, a także w komórkach, w których YB-1 jest rozregulowany, tj. jest nadeksprymowany w porównaniu z normalnymi komórkami lub komórkami nienowotworowymi. Wektor ten ma zastosowanie w chorobach oraz u grup pacjentów lub zbiorów pacjentów, które ujawniono tutaj w związku z innymi adenowirusami, które opisano tutaj do stosowania zgodnie z wynalazkiem oraz innymi ujawnionymi tutaj adenowirusami według wynalazku.

P r z y k ł a d 12: Model strukturalny adenowirusowego wektora Xvir03/01

Jak można wywnioskować z fig. 17, Xvir03/01 jest dalszą pochodną Xvir03. Terapeutyczne geny, takie jak np. opisane tutaj geny i transgeny można wklonować w region E3. Ponadto, delecję wprowadzono w region E4, tak aby zapobiec homologicznej rekombinacji E4orf6 z kasety ekspresyjnej Xvir03. Umożliwia to wklonowanie większych transgenów do tego konstruktu. Wydeletowany region E3 zawiera miejsca restrykcyjne SacI, NdeI i Nhel do wprowadzenia kasety, do której można wklonować, np. terapeutyczne transgeny.

Przygotowanie plazmidu do wklonowania terapeutycznych genów w region E3, a także wprowadzania delecji w regionie E4:

pAdenoX-Plazmid z Clontech zawiera miejsce restrykcyjne SfuI przez 3' regionem ITR, którego brak w adenowirusie typu dzikiego. Region E3-E4 wycięto z pAdenoX (Clontech) przy pomocy Spel (pozycja 23644) i S/I i transfekowano nim pcDNA3.1(+) (Invitrogen) = pcDNA3.1-Ε3Δ27865-30995-Ε4. Większość E4ORF6, a dokładnie pozycje 33241-33875 usunięto przy pomocy PstI = pcDNA3.1-Ε3Δ27865-30995, Ε4Δ33241-33875. Do dalszego modyfikowania Xvir03 wydeletowany region E3/E4 z pcD-NA3.1-Ε3Δ27865-30995,Ε4Δ33241-33875 wklonowano przy pomocy S/I i SpeI do plazmidu pAdenoX = pAdenoXE3Δ27865- 30995,Ε4Δ33241-33875.

Następnie kasetę ekspresyjną, jak opisano dla Xvir03, sklonowano przy pomocy I-Ceu I i PISceI z E1B55k-IRES-E4orf6-pShuttle razem z promotorem CMV i PolyA bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) - do pAdenoX Ε3Δ27865-30995,Ε4Δ33241-33875 i plazmid ten nazwano AdemvE1B//IRES/E4orf6^E4. Następnie, adenowirus wytworzono zgodnie z instrukcjami producenta (Clontech).

Opisany powyżej wektor ma ogólne zastosowanie, tak jak inne opisane tutaj wirusy, do stosowania zgodnie z wynalazkiem. W szczególności, opisany powyżej wektor może się replikować w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem, a także w komórkach z rozregulowanym YB-1, tj. nadeksprymowanym w porównaniu z komórkami normalnymi lub nienowotworowymi, a zatem może wywołać lizę tych komórek. Wektor ten można także stosować w chorobach oraz u grup pacjentów lub zbiorów pacjentów, które ujawniono tutaj w związku z innymi adenowirusami, które opisano tutaj do stosowania zgodnie z wynalazkiem oraz innymi ujawnionymi tutaj adenowirusami według wynalazku.

P r z y k ł a d 13: Onkolityczne działanie Xvir 03 w komórkach 257 RDB i 181 RDB

Wysiano po 100000 komórek (257RDB i 181RDB) na studzienkę 6-studzienkowej płytki. Następnego dnia komórki, jak przedstawiono na fig. 18, zakażono Ad312 (20 pfu/komórkę) i Xvir03 (5 pfu/komórkę). Zakażenie przeprowadzono w 500 μl wolnego od surowicy podłoża DMEM w 37°C przez 1 godzinę. Następnie, podłoże zakażające usunięto i zastąpiono je 2 ml pełnego podłoża (10% FCS/DMEM). Analizę przeprowadzono przy pomocy barwienia fioletem krystalicznym po 5 dniach. Wynik przedstawiono na fig. 18A i 18B.

Jak można wywnioskować z fig. 18A i 18B, komórki oporne wielolekowo, które zawierają YB-1 w jądrze komórkowym, wykazują lizę po zakażeniu Ad312 i Xvir03 tylko w przypadku Xvir03, co wykazano przez wybarwienie komórek fioletem krystalicznym. W połączeniu z tym najpierw usunięto podłoże. Następnie, na komórki naniesiono fiolet krystaliczny (50% ETOH, 3% formaldehyd, 5% kwas octowy, 1% fiolet krystaliczny) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut. Następnie 6-studzienkowe płytki dokładnie przemyto wodą i wysuszono w temperaturze pokojowej.

Wynalazca zdaje sobie sprawę, że wirusy z delecją E1A (np. Ad312) które, jakkolwiek nie są transaktywującymi adenowirusami w znaczeniu według wynalazku, mogą się replikować bardzo wydajnie przy wyższych MOI (Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981), co jednakże, nie może być zrealizowane w zastosowaniach klinicznych. Zjawisko to nazwano w literaturze „aktywnością typu E1A”.

PL 219 321 B1

Zastosowany tutaj adenowirus Ad312, jest wirusem z delecją E1A. Przy zastosowanej ilości (20 pfu/komórkę), która nadal jest wyższe niż klinicznie pożądane miano, wczesne geny adenowirusowe, takie jak E1B55k i E4orf6 nie są eksprymowane lub są eksprymowane w bardzo niewielkim stopniu (Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981). Jak już tutaj opisano, te geny i białka odgrywają istotną rolę w replikacji wirusa. W odróżnieniu od tego te odpowiednio geny i białka, są eksprymowane przez adenowirusa Xvir03 (fig. 16). Jak można wywnioskować z fig. 18A i 18B, ekspresja genów E1B55k i E4orf6 wywołuje wydajną replikację wirusa i lizę komórek równocześnie przy wymaganym niższym mianie zakażenia (wyrażonym w pfu/komórkę). Potwierdza to odkrycie leżące u podstaw wynalazku, a dokładnie to, że ekspresja E4orf6 i E1B-55K (oraz brak E1A), w połączeniu z jądrową lokalizacją YB-1, jest w stanie zaindukować bardzo wydajną replikację adenowirusa. Miano wymagane do tej replikacji wynoszące zaledwie 1 do 5 pfu/komórkę pozwala teraz na stosowanie kliniczne.

Potwierdza to także odkrycie leżące u podstaw wynalazku, a dokładnie to, że obecność YB-1 w jądrze, w szczególności niezależnie od fazy cyklu komórkowego, jest wymagana do wytworzenia wirusów, które można stosować zgodnie z wynalazkiem, do lizowania zakażonych komórek.

P r z y k ł a d 14: Analiza Northern blot ekspresji genu E2 adenowirusa Ad312

W każdym przypadku 1 milion komórek A549 i U2OS wysiano do 10 cm szalek Petriego. Następnego dnia komórki zakażono Ad312 (50 pfu/komórkę) i Adwt (co służyło jako kontrola, 5 pfu/komórkę). Zastosowane wysokie miano wirusa Ad312 spowodowało E1-niezależną replikację w komórkach nowotworowych. Zakażenie przeprowadzono w 1-2 ml wolnego od surowicy podłoża DMEM przez 1 godzinę w 37°C. Następnie, podłoże zakażające usunięto i zstąpiono 10 ml podłoża pełnego (10% FCS/DMEM). Po 3 dniach wyizolowano RNA. Następnie, spektrofotometrycznie zmierzono stężenie wyizolowanego RNA przy 260 nm. Następnie próbki RNA rozdzielono elektroforetycznie w 0,8% żelu agarozowym z formaldehydem. Następnie, RNA przeniesiono na błonę nylonową (co przeprowadzono zgodnie z systemem Schleicher & Schuell). RNA przeniesiony na błonę hybrydyzowano z „wczesną sondą” E2 i „późną sondą” E2. „Późna sonda” o wielkości 1501 pz specyficznie wiązała się za późnym promotorem E2. Sondę przygotowano wcześniej przy pomocy PCR (starter: 5'- GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT (SEQ. ID. NO. 4), 5'-GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT (SEQ.

ID. NO. 5)) i wyznakowano radioaktywnie przy pomocy ³²P. W odróżnieniu od tego „wczesna sonda” wiązała się pomiędzy wczesnym promotorem E2 a późnym promotorem E2 (pozycja: 226791-227002) i wytworzono ją także przy pomocy PCR (starter: 5'-AGCTGATCTTCGCTTTTG (SEQ. ID. NO. 6), 5'-GGATAGCAAGACTCTGAC AAAG (SEQ. ID. NO. 7)). Następnie, błonę przemyto i naświetlono nią kliszę rentgenowską.

Wynik przedstawiono na fig. 19. Zarówno wczesna, jak i późna sonda dostarczyły specyficzne sygnały w kontrolnym zakażeniu adenowirusem typu dzikiego, podczas gdy tylko komórki nowotworowe zakażone Ad312 wytworzyły specyficzny sygnał gdy zastosowano sondę późną. Potwierdza to odkrycie leżące u podstaw wynalazku, że ekspresja E4orf6 i E1B55K oraz brak E1A powoduje transport nadeksprymowanego lub rozregulowanego YB-1 do jądra, a zatem wywołuje ekspresję genu E2 jako warunku wstępnego do wystąpienia wydajnej replikacji adenowirusa.

P r z y k ł a d 15: Analiza Northern blot ekspresji genu E2 adenowirusa Addelta 24

W każdym przypadku wysiano 1 milion komórek U2OS na 10 cm szalki Petriego. Następnego dnia komórki zakażono adenowirusem delta 24 (Addelta24) (10 pfu/komórkę) i adenowirusem typu dzikiego (Adwt) (co służyło jako kontrola, 10 pfu/komórkę). Zastosowany rekombinowany adenowirus Addelta24 (Fueyo, J. i in., Oncogene 19, 2-12, 2000) posiada specyficzną delecję w regionie CR2 białka E1A, a zatem jest w stanie replikować się tylko w nowotworach Rb-ujemnych. Ponadto, wirus ten eksprymuje geny E1B55k i E4orf6 porównywalnie z adenowirusem typu dzikiego. Zakażenie przeprowadzono w 1-2 ml wolnego od surowicy podłoża DMEM przez 1 godzinę w 37°C. Następnie, podłoże zakażające usunięto i zstąpiono 10 ml podłoża pełnego (10% FCS/DMEM). RNA wyizolowano po 12 i 24 godzinach. Następnie, fotometrycznie zmierzono stężenie wyizolowanego RNA przy 260 nm. Następnie próbki RNA rozdzielono elektroforetycznie w 0,8% żelu agarozowym z formaldehydem. Następnie, RNA przeniesiono na błonę nylonową (co przeprowadzono zgodnie z systemem Schleicher & Schuell). RNA przeniesiony na błonę hybrydyzowano z „wczesną sondą” i „późną sondą”. „Późna sonda” o wielkości 1501 pz specyficznie wiązała się za późnym promotorem E2. Sondę przygotowano wcześniej przy pomocy PCR (starter: 5'- GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT (SEQ. ID. NO. 4), 5'-GATCCTCGTCGTCTTCGCTT (SEQ. ID. NO. 5)) i wyznakowano radioaktywnie przy pomocy ³²P. Jednakże „wczesna sonda” wiązała się pomiędzy wczesnym promotorem E2 a późnym promotorem E2 i wytworzono ją także przy pomocy PCR (starter: 5'-AGCTGATCTTCGCTTTTG (SEQ. ID. NO. 6),

PL 219 321 B1

5'-GGATAGCAAGACTCTGACAAAG (SEQ. ID. NO. 7)). Następnie, błonę przemyto i naświetlono nią kliszę rentgenowską.

Wynik przedstawiono na fig. 20.

Po 12 godzinach tylko późna sonda dostarczyła specyficzny sygnał. Dopiero po 24 godzinach także wczesna sonda dostarczyła sygnał w komórkach zakażonych Addelta24. Jednakże, w porównaniu z adenowirusami typu dzikiego sygnał był znacznie słabszy. Także ten wynik potwierdza odkrycie leżące u podstaw wynalazku, że ekspresja E4orf6 i E1B55K transportuje nadeksprymowany lub rozregulowany YB-1 do jądra, które następnie wiąże późny promotor E2 i indukuje ekspresję genu E2.

P r z y k ł a d 16: Model strukturalny adenowirusowych wektorów XvirPSJL1 i XvirPSJL2

Opis wektorów: wektory grupy XvirPSJL, które są postaciami wirusów nazwanych tutaj adenowirusami grupy I oraz, których przykładami są wektory lub adenowirusy, XvirPSJL1 i XvirPSJL2, są nie tylko, tak jak adenowirus dl520, zdolne do replikacji w komórkach z YB-1-dodatnim jądrem, w szczególności w komórkach nowotworowych, ale także w komórkach nowotworowych, których YB-1 jest nadeksprymowany lub rozregulowany. Podczas gdy geny wirusowe E1B55k i E4orf6 są eksprymowane tylko przy zakażeniu dl520 komórek z YB-1-dodatnim jądrem pod wpływem promotora E1B lub promotora E4, ekspresja E1B55k i E4orf6 w XvirPSJL zachodzi przez promotor wirusa cytomegalii (cmw). Jednakże zamiast promotora cmw można zastosować także inne promotory, w szczególności nowotworowo-specyficzne, tkankowo-specyficzne i narządowo-specyficzne. Ze względu na ekspresję E1B55k i E4orf6, nadeksprymowany YB-1 lub rozregulowany YB-1 jest transportowany do jądra i rozpoczynana jest replikacja adenowirusa. Zatem, wektory adenowirusowe z grupy XvirPSJL, jak tutaj ujawniono, łączą różne elementy, a tym samym funkcje adenowirusowych wektorów dl520, Xvir03 i AdYB-1. Podobnie jak wektor dl520, wirusy XvirPSJL zawierają gen E1A12S. Odpowiednio ten gen i odpowiadający mu produkt jest odpowiedzialny za indukcję fazy S zakażonej komórki oraz ułatwia replikację wirusa oraz wpływ chemioterapeutyków i naświetlania. Podobnie jak Xvir03, wirusy XvirPSJL zawierają kasetę ekspresyjną CMV-E1B55k/IRES/E4orf6, która jest wymagana do wydajnej replikacji oraz pośredniego lub bezpośredniego transportu do jądra rozregulowanego YB-1, który korzystnie znajduje się w komórkach nowotworowych. Zatem replikacja jest możliwa tylko w komórkach, w szczególności komórkach nowotworowych, w których YB-1 jest nadeksprymowany lub rozregulowany. Ponadto P53 podlega rozkładowi przez kompleks E1B55k/E4orf6. Sekwencję kodującą ludzki czynnik transkrypcyjny YB-1 pobrano z wirusa AdYB-1. Endogenny YB-1, tj. już obecny w komórce, wzmaga replikację wirusa. Ekspresja zarówno E1A12S, jak i YB-1 jest kontrolowana przez zależny od YB-1 adenowirusowy późny promotor E2. Także w połączeniu z tym można stosować specyficzne promotory, w szczególności promotory nowotworowo-specyficzne, tkankowo-specyficzne lub narządowo-specyficzne. Dalszą cechą tych wirusów jest to, że wydeIetowany jest region E4. Wektor zawiera miejsca restrykcyjne, przez które, w przypadku adenowirusowych wektorów XvirPSJL1 i XvirPSJL2, można eksprymować różne transgeny, jak ujawniono w opisie, takie jak rybozymy, cząsteczki antysensowne, siRNA, geny wywołujące apoptozę, cytokiny i geny proleków. Ich ekspresję można także kontrolować przez promotory nowotworowo-specyficzne, tkankowo-specyficzne lub narządowo-specyficzne, jak ujawniono w specyfikacji. Lokalizacja kaset ekspresyjnych nie jest ustalona, w szczególności nie w odniesieniu do lub w regionie E1, E3 i E4, ale może być zaaranżowana w jakikolwiek sposób. Wektory replikują się niezależnie od stanu p53 lub Rb komórek nowotworowych.

Modele strukturalne rekombinowanych adenowirusów XvirPSJL1 i XvirPSJL2 przedstawiono na fig. 21 i 22:

Wytworzenie kasety E2-late-YB1IRES/12S:

Plazmid pAdenoX firmy Clontech/BD Biosciences, który zastosowano tutaj jako materiał wyjściowy, zawiera genomowy kwas nukleinowy adenowirusa Ad5 oraz miejsce restrykcyjne Sful za regionem 3' ITR, którego brak jest w adenowirusie typu dzikiego. Region E3-E4 przeniesiono przez SpeI (pozycja 23644) i SfuI z pAdenoX (Clontech) do pcDNA3.1(+) (Invitrogen) i powstały plazmid nazwano pcDNA3.1-Ε3Δ27865-30995-E4. Większość E4ORF6, a dokładnie zasady 33241-33875 usunięto przy pomocy PstI. Tak uzyskany fragment nazwano pcDNA3.1-Ε3Δ27865-30995,Ε4Δ33241-33875.

Późny promotor E2 wycięto z pGL3-EGFP (Holm i in., JBC 2002, 277, 10427-10434) przy pomocy SacI i NheI i wklonowano do pcDNA3.1-Ε3Δ27865-30995,Ε4Δ33241-33875. Przez tą operację region E3 dalej wydeletowano w regionie zasad A27593-31509. Tak uzyskany fragment nazwano E2-late-pcDNA3.1-Ε3Δ27593-31509,Ε4Δ33241-33875.

cDNA dla produktu E1A-243AA wytworzono przy pomocy RT-PCR, wyizolowano, sprawdzono sekwencję i wklonowano do wektora pcDNA3.1(+) (Invitrogen) przy zastosowaniu BamHI i EcoRl.

PL 219 321 B1

E1A-12S-pcDNA3.1(+) zlinearyzowano Nhel i BamHl, i wytworzono w nim tępe końce przy pomocy polimerazy T4 oraz wytworzono lepkie końce T przy pomocy polimerazy Taq i dTTP. Element IRES sklonowane jako produkt PCR (matryca = pCITE, Novagen) do wektora E1A-12S-pcDNA 3.1(+) (strategia klonowania TA).

Fragment YB-1 EcoRl wyizolowano z wektora pHVad2c (Holm i in., JBC 2002, 277, 10427-10434) i wytworzono w nim tępe końce. Wektor pShuttle (dostępny w handlu z BD Biosciences) zlinearyzowano XbaI, wytworzono w nim tępe końce, defosforyIowano i zligowano z wcześniej wytworzonym kwasem nukleinowym kodującym YB-1. Tak uzyskany wektor nazwano YB-1-pShuttle. W wyniku wklonowania do wektora pShuttle uzyskano kwas nukleinowy kodujący fragment YB-1 z kodonem STOP w ramce odczytu. Kwas nukleinowy kodujący YB-1 sklonowane z YB-1-pShuttle przy pomocy NheI i BfrI do wektora IRES-E1A-12S w pcDNA3.1(+). Tak uzyskany fragment nazwano YB-1 (EcoRI-EcoRI z kodonem STOP)-IRES-E1A-12S-pcDNA3.1(+).

Następnie, kasetę ekspresyjną YB-1-IRES-E1A12S wycięto przy pomocy PmeI i wklonowano do zlinearyzowanego przy pomocy NheI, z wytworzonymi tępymi końcami i defosforylowanego wektora E2-late-pcDNA3.1-E3Δ27593-31509,E4Δ33241-33875. Tak też druga kaseta znajdowała się w wydeletowanym regionie regionu E3.

Kasetę transgenu zawierającą konstrukt kwasu nukleinowego E2-Iate-YB-1-IRES-E1A12S wklonowano z pozostałymi sekwencjami adenowirusowymi Ε3Δ27593-31509,Ε4Δ33241-33875 przy pomocy SfuI i SpeI do wektora pAdenoX firmy Clontech (= AdenoX/E2-late-YB-1-IRES-E1A12S/E3Δ27593-31509,Ε4Δ33241-33875).

Kasetę CMV-E1B55k/IRES/E4orf6 wycięto przy pomocy I-CeuI i PI-Scel z opisanego powyżej, w związku z Xvir03, wektora pShuttle i wstawiono do wektora AdenoX/E2-Iate-YB-1-IRESE1A12S/E3Δ27593-31509,Ε4Δ33241-33875.

Następnie, wektor zlinearyzowano PacI, transfekowano nim komórki 293 i rekombinowane adenowirusy XvirPSJL1 lub XvirPSJL2, wyizolowano bez transgenów wskazanych na rysunku, zgodnie z instrukcjami producenta.

P r z y k ł a d 17: Zakażenie komórek HeLa adenowirusem dl520

Wysiano po 100000 komórek HeLa na szalkę. Następnego dnia komórki zakażono różnymi mianami (pfu/ml) adenowirusa dl520. Zakażenie przeprowadzono w 500 μl wolnego od surowicy podłoża DMEM przez 1 godzinę w 37°C. Następnie podłoże zakażające usunięto i zastąpiono 2 ml podłoża pełnego (10% FCS/DMEM). Po 3-5 dniach przeprowadzono analizę z zastosowaniem barwienia fioletem krystalicznym.

Wynik tego doświadczenia przedstawiono na fig. 23. Adenowirus dl520 nie wywoływał żadnej Iizy przy niskich MOI (5-10 pfu/komórkę) przy zakażeniu komórek HeLa, które nie zawierają YB-1 w jądrze. W odróżnieniu od tego, dl520 wywoływał praktycznie całkowitą lizę przy MOI (krotności zakażenia) wynoszącej 100-200 pfu na komórkę, a także dominującą lizę przy MOI 50 pfu na komórkę. Można z tego wywnioskować, że dl520 i podobne wirusy, które są w stanie włączyć adenowirusowe geny E1B55k i E4orf6 przy wyższych MOI, są odpowiednie do transportowania, bezpośrednio lub pośrednio, nadeksprymowanego lub rozregulowanego YB-1 do jądra, a zatem wywołania Iizy komórek.

P r z y k ł a d 18: Test Iucyferazowy wyznaczający aktywność późnego promotora E2

Wiadomo, że YB-1 wiąże adenowirusowy późny promotor E2 w jądrze (Holm i in., JBC 2002, 277, 10427-20434) oraz, że ten promotor jest także dobrze dostosowany do ekspresji kwasów nukleinowych. Zastosowanie adenowirusowego późnego promotora E2 jest w rzeczywistości podyktowane faktem, że może być on regulowany YB-1, przy czym YB-1 działa jako efektor dodatni, tj. promotor jest aktywny tylko w obecności YB-1 w jądrze. Wspomniany adenowirusowy późny promotor E2 może być regulowany w wysoce wybiórczy sposób, a zatem może być stosowany w układach, w których YB-1 jest obecny w jądrze i w rzeczywistości pozwala uniknąć jakiejkolwiek ekspresji kwasu nukleinowego, który znajduje się pod kontrolą adenowirusowego późnego promotora E2 w przypadku, gdy YB-1 nie jest obecny w jądrze jako efektor lub regulator. Późny promotor E2 zawiera trzy kasety Y (CCAAT), które są odpowiednie do aktywacji genu E2. Przygotowano i przebadano różne konstrukty późnego promotora E2 pod względem ich specyficzności i aktywności. Analizę przeprowadzono w następujący sposób.

Linie komórkowe EPG-257 RDB (rak nabłonka żołądka), która zawiera YB-1 w jądrze, HeLa (rak nabłonka szyjki macicy) i U2OS (kostniakomięsak) wysiano w trzech różnych stężeniach komórek do 6-studzienkowych płytek. Studzienki, w których komórki osiągnęły 70% stan konfluencji następnego dnia zastosowano do transfekcji. Na każdą studzienkę, 500 ng plazmidowego DNA różnych kon38

PL 219 321 B1 struktów późnego promotora E2 w wektorach Iucyferazowych (dostępne w handlu z Promega, plazmid wyjściowy: pGL3-enhancer), oczyszczonego przy pomocy SpinMiniprep (Qiagen), dodano do 500 μl OptiMEM w 1,5 ml zamykanych naczynkach reakcyjnych i 5 μl DOTAP do 500 μl w innych zamykanych naczynkach reakcyjnych. Obydwa roztwory połączono i zmieszano. Mieszaninę inkubowano do wytworzenia kompleksu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki przemyto trzykrotnie PBS i nawarstwiono na nie mieszaninę transfekcyjną. Płytki inkubowano w 37°C przez 5 godzin, następnie ponownie trzykrotnie przemyto PBS i dodano do nich pełne podłoże.

Komórki badano przy pomocy zestawu do testu Iucyferazowego Luciferase Assay System Kit firmy Promega (nr katalogowy E1500) po 48 godzinach od zakażenia. Do każdej studzienki dodano warstwę 500 μl buforu lizującego, po 10 minutach w temperaturze pokojowej komórki wymyto z płytki przy pomocy pipety na 1 ml i przeniesiono do 1,5 ml zamykanych naczynek reakcyjnych. Następnie lizaty komórkowe odwirowano przy 4°C przez 15 minut przy 14 000 obrotów/minutę. Do każdych 50 μl supernatantu dodano 100 μl substratu Iucyferazy i dokonano pomiaru próbek przy pomocy licznika TopCount (Canberra-Packard GmbH, 63303 Dreieich) Microplate Scintillation & Luminescence w czarnych, 96-Studzienkowych płytkach przy długości fali 945 nm.

Białko zmierzono przy pomocy zestawu BCA Protein Assay Reagent Kit, nr katalogowy 23227 (PIERCE, Rockford, Illinois, USA) przy 570 nm w bioluminometerycznym (Biolumin™ 960) kinetycznym czytniku fIuorescencji/absorbancji do płytek firmy Molecular Dynamics. Względne sygnały świetlne próbek przełożono na zawartość białka (RLU^g białka).

Zastosowano następujące plazmidy: pGL3-enhancer (Promega), z którego usunięto enhancer (wzmacniacz) przez trawienie BamHI (2250 pz) i BsaBI (2003 pz), służył jako ślepa próba. Różne konstrukty promotora E2 wklonowano w MCS wektora pGL3 nie zawierającego enhancera, przy pomocy miejsc restrykcyjnych Apal i SacI. Do pGL3-enhancer przy pomocy BglII i Hindlll wklonowano promotor hCMV i posłużył on jako kontrola pozytywna. Pozytywna kontrola pozwoliła oszacować wydajność transfekcji, a także służyła jako wartość odniesienia dla aktywności Iucyferazowej. Dla każdej linii komórkowej kontrolę CMV ustalono jako 100%, a aktywność enzymatyczną wytworzoną przez konstrukty promotora E2 wyznaczono w odniesieniu do tej wartości i przedstawiono na wykresie słupkowym fig. 24.

Różne konstrukty nazwano w następujący sposób;

1. zawierający kasetę Y I, II i III, co odpowiada zasadom 25932-26179 pz (w odniesieniu do sekwencji adenowirusa typu dzikiego, patrz także część następnie zamieszczonego adenowirusowego regionu E2)

2. zawierający kasetę Y II i III, co odpowiada zasadom 25932-26127 pz (w odniesieniu do sekwencji adenowirusa typu dzikiego, patrz także część następnie zamieszczonego adenowirusowego regionu E2)

3. zawierający kasetę Y III, co odpowiada zasadom 25932-26004 pz (w odniesieniu do sekwencji adenowirusa typu dzikiego, patrz także część następnie zamieszczonego adenowirusowego region E2)

4. nie zawierający kasety Y, jako ślepa próba

Część adenowirusowego region E2 (z Virology 1992, 186, 280-285) (Miejsca wiązania YB-1 wytłuszczono):

PL 219 321 B1

25561

25621

25681

25741

25801

25861

25921

25981

26041

26101

26161

26221

26281

26341

26401

26461

26521

26581

26641

26701

26761 aggaaotttatcctagagcgctcaggaatcttgcccgccacctgctgtgcacttcctagc gactttgtgcccattaagtaccgcgaalgccctccgcogcittggggccactgctacctt ctgcagctagccaactaccttgcctaccactoteacataategaagacgtBagcggtgac ggtctactggagtgtcactgtcgctgcaacctatgcaccccgcaccgctccctggtttgc aattcgcagctgcttaacgaaagtcaaattatcggtacctttgagctgcagggtccctcg cctgacgaaaagtccgcggctccggggttgaaactcactccggggctgtggacgtcggct caaf cccgcccgccaaatgcggagcttaccgcctgcgtcattacccagggccacattctt gtttacttggacccccagtccggcgaggagctcaac|ccaatjccccccgccgccgcagccc tataagcapcagccgcRggcccttgcttcccaggatggcacccaaaaagaagctgcagct gccgccgccacccacggacgaggaggaatactgggacagtcaggcagaggaggttttgga cgaggaggaggaggacatgatggaagactgggagagcctagacgaggaagcttccgaggt cgaagaggtgtcagacgaaacaccgteaccctcggtcgcattcccctcgccggcgcccca gaaatcggcaaccggttccagcatggctacaacctccgctcctcaggcgccgccggcact gcccgttogccgacccaaocgtagatgggacaccactggaaccagggccggtaagtccaa gcagccgccgccgttagcccaagagcaacaacagcgccaaggctaccgctcatggcgcgg gcacaagaacgccatagttgcttgcttgcaagactgtgggggcaacatctccttcgcccg ccgctttcttctctaccatcacggcgtggccttcccccgtaacatcctgcattactaccg tcatctctacagcccatactgcaccggcggcagcggcagcggcagcaacagcagcggcca cacagaagcaaaggcgaccggalagcaagactctgacaaagcccaagaaatccacagcgg (SEQ. ID. No. 8)

Wyniki przedstawione na fig. 24 potwierdzają w imponujący sposób, że poszczególne fragmenty promotora, które zawierają różne kasety Y/późny E2, są odpowiednie do ekspresji transgenów terapeutycznych w komórkach nowotworowych z YB-1-dodatnim jądrem, a zatem mogą być stosowane jako promontory w znaczeniu według wynalazku.

P r z y k ł a d 19: Wpływ YB-1 eksprymowanego przez adenowirus na uwalnianie cząstek

Ludzkie komórki kostniakomięsaka (U2OS) zakażono wektorem adenowirusowym z delecją E1/E3 AdYB-1 i Ad312 oraz tylko z delecją E1A, przy MOI 50 pfu/komórkę. AdYB-1 zawiera w genomie sekwencję kodującą komórkowy czynnik transkrypcyjny YB-1, a zatem eksprymuje wiążące kasetę Y białko 1 (YB-1). W celu oszacowania uwalniania cząstek wirusa w postaci „jednostek tworzących łysinki” (pfu) po zakażeniu, wyizolowano supernatant podłoża hodowlanego i pozostałą warstwę komórek po 2 lub 5 dniach od zakażenia. Wewnątrzkomórkowe cząstki uwolniono przez trzy cykle zamrażania/rozmrażania. Liczbę cząstek analizowano przy pomocy testu łysinkowego na komórkach 293.

Wynik przedstawiono na fig. 25, przy czym czarne słupki oznaczają cząsteczki wirusa pozostające w komórkach, a słupki w kratkę oznaczają uwolnione, zewnątrzkomórkowe cząstki wirusa.

Wynik przedstawiony na fig. 25 potwierdza, że AdYB-1, ogólnie, wytwarza więcej pfu niż Ad312 i uwalnia więcej cząstek. Po 5 dniach komórki zakażone AdYB-1 wyraźnie wykazywały efekt cytopatyczny (CPE) w odróżnieniu od komórek zakażonych Ad312.

Cechy wynalazku ujawnione w poprzedzającej specyfikacji, zastrzeżenia, a także rysunki mogą być samodzielnie, a także w połączeniu, istotne do realizacji wynalazku w jego różnych postaciach.

PL 219 321 B1

Wykaz sekwencji <110> Holm, Per Sonne <120> Nowe adenowirusy, kodujące je kwasy nukleinowe oraz ich zastosowanie <130> H 10013 PCT <140> PCT/EP 03/11427 <141> 2003-10-15 <160> 8 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna <220>

<221> różne cechy <223> Sonda do wiązania z YB-1 <400> 1 tgaggctgat tggctgggca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna <220>

<221> różne cechy <223> Sonda do wytwarzania sondy do wykrywania fragmentu KpnI w sekwencji Ad 5 kodującej E2A <400> 2 gtcggagatc agatccgcgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA

PL 219 321 B1 <213> Sztuczna <220>

<221> różne cechy <223> Sonda do wytwarzania sondy do wykrywania fragmentu KpnI w sekwencji Ad 5 kodującej E2A <400 3 gatcctcgtc gtcttcgctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna <220>

<221> różne cechy <223> Sonda do wytwarzania sondy do wykrywania fragmentu KpnI w sekwencji Ad 5 kodującej E2A <400> 4 gtcggagatc agatccgcgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna <220>

<221> różne cechy <223> Sonda do wytwarzania sondy do wykrywania fragmentu KpnI w sekwencji Ad 5 kodującej E2A <400> 5 gatcctcgtc gtcttcgctt 20 <210 6 <211> 18 <212> DNA

PL 219 321 B1 <213> Sztuczna <220>

<221> różne cechy <223> Sonda do wytwarzania sondy do wykrywania wiązania sondy pomiędzy wczesnym promotorem E2 i późnym promotorem E2 <400> 6 agctgatctt cgcttttg 18 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna <220>

<221> różne cechy <223> Sonda do wytwarzania sondy do wykrywania wiązania sondy pomiędzy wczesnym promotorem E2 i późnym promotorem E2 <400> 7 ggatagcaag actctgacaa ag 22 <210> 8 <211> 1260 <212> DNA <213> Adenowirus typu 37 <220>

<221> różne cechy <223> Część zdenowirusowego obszaru E2 z miejscami wiązania YB-1

400> 8

aggaacttta tcctagagcg ctcaggaatc ttgcccgcca	cctgctgtgc acttcctagc	60
gactttgtgc ccattaagta ccgcgaatgc cctccgccgc	tttggggcca ctgctacctt	120
ctgcagctag ccaactacct tgcctaccac tctgacataa	tggaagacgt gagcggtgac	180
ggtctactgg agtgtcactg tcgctgcaac ctatgcaccc	cgcaccgctc cctggtttgc	240
aattcgcagc tgcttaacga aagtcaaatt atcggtacct	ttgagctgca gggtccctcg	300

PL 219 321 B1

cctgacgaaa agtccgcggc tccggggttg aaactcactc cggggctgtg gacgtcggct	360
taccttcgca aatttgtacc tgaggactac cacgcccacg agattaggtt ctacgaagac	420
caatcccgcc cgccaaatgc ggagcttacc gcctgcgtca ttacccaggg ccacattctt	480
ggccaattgc aagccatcaa caaagcccgc caagagtttc tgctacgaaa gggacggggg	54 0
gtttacttgg acccccagtc cggcgaggag ctcaacccaa tccccccgcc gccgcagccc	600
tatcagcagc agccgcgggc ccttgcttcc caggatggca cccaaaaaga agctgcagct	660
gccgccgcca cccacggacg aggaggaata ctgggacagt caggcagagg aggttttgga	720
cgaggaggag gaggacatga tggaagactg ggagagccta gacgaggaag cttccgaggt	780
cgaagaggtg tcagacgaaa caccgtcacc ctcggtcgca ttcccctcgc cggcgcccca	840
gaaatcggca accggttcca gcatggctac aacctccgct cctcaggcgc cgccggcact	900
gcccgttcgc cgacccaacc gtagatggga caccactgga accagggccg gtaagtccaa	960
gcagccgccg ccgttagccc aagagcaaca acagcgccaa ggctaccgct catggcgcgg	1020
gcacaagaac gccatagttg cttgcttgca agactgtggg ggcaacatct ccttcgcccg	1080
ccgctttctt ctctaccatc acggcgtggc cttcccccgt aacatcctgc attactaccg	1140
tcatctctac agcccatact gcaccggcgg cagcggcagc ggcagcaaca gcagcggcca	1200
cacagaagca aaggcgaccg gatagcaaga ctctgacaaa gcccaagaaa tccacagcgg	1260

Zastrzeżenia patentowe

Claims (84)

1. Adenowirus eksprymujący pierwsze białko, wybrane z grupy obejmującej białko E1B i białko E4, przed drugim białkiem, które jest wybrane z grupy obejmującej białka E1A, przy czym ten adenowirus zawiera co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący białko E1A, przy czym ekspresja białka E1A jest pod kontrolą promotora, który jest inny niż promotor kontrolujący ekspresję tego białka w adenowirusie typu dzikiego, a ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotor adenowirusowy jest różny od promotora E1A.

2. Adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszym białkiem jest białko E1B, korzystnie białko E1B55kD.

3. Adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszym białkiem jest białko E4, korzystnie białko E4orf6.

4. Adenowirus według zastrz. 1-3, znamienny tym, że pierwsze białko stanowi połączenie białka E1B i białka E4, korzystnie połączenie białka E1B55kD i białka E4orf6.

5. Adenowirus według zastrz. 1-4, znamienny tym, że białkiem E1A jest białko E1A12S.

6. Adenowirus według zastrz. 1-5, znamienny tym, że co najmniej jedno białko jest białkiem E1A12S.

7. Adenowirus według zastrz. 1-6, znamienny tym, że co najmniej jedno białko stanowi połączenie białka E1B i białka E1A, korzystnie połączenie białka E1B55kD i białka E1A12S.

PL 219 321 B1

8. Adenowirus według zastrz. 1-6, znamienny tym, że co najmniej jedno białko stanowi połączenie białka E4 i białka E1A, korzystnie połączenie białka E4orf6 i białka E1A12S.

9. Adenowirus według zastrz. 1-6, znamienny tym, że co najmniej jedno białko stanowi połączenie białka E1B, białka E4 i białka E1A, korzystnie połączenie białka E1B55kD, białka E4orf6 i białka E1A12S.

10. Adenowirus według zastrz. 1-9, znamienny tym, że ekspresja białka E1B jest kontrolowana przez promotor, przy czym ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotor adenowirusowy jest różny od promotora E1B.

11. Adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresja białka E4 jest kontrolowana przez promotor, przy czym ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotor adenowirusowy jest różny od promotora E4.

12. Adenowirus według zastrz. 10 albo 11, w którym promotorem adenowirusowym jest promotor E1A.

13. Adenowirus według zastrz. 10-12, znamienny tym, że promotor kontrolujący ekspresję białka E1A jest kontrolowany przez YB-1 lub może być regulowany przez YB-1.

14. Adenowirus według zastrz. 10-13, znamienny tym, że promotor kontrolujący ekspresję białka E1A jest adenowirusowym późnym promotorem E2.

15. Adenowirus według zastrz. 1-14, znamienny tym, że białko E4, korzystnie białko E4orf6, oraz białko E1B, korzystnie białko E1B55kD, są pod kontrolą tego samego lub wspólnego promotora.

16. Adenowirus według zastrz. 1-15, znamienny tym, że adenowirus dostarcza YB-1 do jądra przez co najmniej jedno białko adenowirusowe lub dostarczanie YB-1 do jądra jest pośredniczone przez co najmniej jedno białko adenowirusowe, przy czym korzystnie to białko adenowirusowe jest różne od E1A.

17. Adenowirus według zastrz. 1-16, znamienny tym, że dostarcza YB-1 do replikacji adenowirusa przez co najmniej jedno białko adenowirusowe lub pośredniczy w dostarczeniu YB-1 do replikacji adenowirusa przez co najmniej jedno białko adenowirusowe, przy czym korzystnie to białko adenowirusowe jest różne od E1A.

18. Adenowirus według zastrz. 16 albo 17, znamienny tym, że to białko adenowirusowe stanowi kompleks E4orf6 i E1B55kD.

19. Adenowirus według zastrz. 1-18, znamienny tym, że kwas nukleinowy adenowirusa zawiera co najmniej jeden funkcjonalnie nieaktywny region adenowirusowy, przy czym ten region jest wybrany z grupy obejmującej region E1, region E3, region E4 oraz ich połączenia.

20. Adenowirus według zastrz. 19, znamienny tym, że tym regionem jest region E1.

21. Adenowirus według zastrz. 19 albo 20, znamienny tym, że tym regionem jest region E3.

22. Adenowirus według zastrz. 19-21, znamienny tym, że tym regionem jest region E4.

23. Adenowirus według zastrz. 19-22, znamienny tym, że ten region zawiera region E1, region E3 i region E4.

24. Adenowirus według zastrz. 1-23, znamienny tym, że adenowirus zawiera co najmniej jedną kasetę ekspresyjną, przy czym ta kaseta ekspresyjna zawiera co najmniej jeden promotor i kwas nukleinowy kodujący białko adenowirusowe, przy czym białkiem adenowirusowym jest białko E1B, korzystnie białko E1B55kD.

25. Adenowirus według zastrz. 24, znamienny tym, że ten promotor jest inny niż promotor E1B.

26. Adenowirus według zastrz. 25, znamienny tym, że ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotor jest różny od promotora E1B.

27. Adenowirus według zastrz. 1-26, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedną kasetę ekspresyjną, przy czym ta kaseta ekspresyjna zawiera co najmniej jeden promotor i kwas nukleinowy kodujący białko adenowirusowe, przy czym białkiem adenowirusowym jest białko E4, korzystnie białko E4orf6.

28. Adenowirus według zastrz. 27, znamienny tym, że ten promotor jest różny od promotora E4.

29. Adenowirus według zastrz. 28, znamienny tym, że ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory

PL 219 321 B1 tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotory adenowirusowe są różne od promotora E4.

30. Adenowirus według zastrz. 24-29, znamienny tym, że tym promotorem jest promotor E1A.

31. Adenowirus według zastrz. 1-30, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedną kasetę ekspresyjną, przy czym ta kaseta ekspresyjna zawiera co najmniej jeden promotor i kwas nukleinowy kodujący białko adenowirusowe, przy czym białkiem adenowirusowym jest białko E1A, korzystnie białko E1A12S.

32. Adenowirus według zastrz. 31, znamienny tym, że ten promotor jest różny od promotora E1A.

33. Adenowirus według zastrz. 32, znamienny tym, że ten promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe.

34. Adenowirus według zastrz. 1-33, znamienny tym, że adenowirus zawiera kwas nukleinowy, który to kwas nukleinowy koduje YB-1.

35. Adenowirus według zastrz. 34, znamienny tym, że kwas nukleinowy kodujący YB-1 jest pod kontrolą promotora, przy czym promotorem korzystnie jest późny promotor E2.

36. Adenowirus według zastrz. 34 albo 35, znamienny tym, że kwas nukleinowy kodujący YB-1 jest pod kontrolą promotora, który to promotor jest zależny od YB-1 lub kontrolowany przez YB-1.

37. Adenowirus według zastrz. 30-36, znamienny tym, że kwas nukleinowy kodujący YB-1 stanowi część kasety ekspresyjnej zawierającej kwas nukleinowy kodujący białko E1A, korzystnie kwas nukleinowy kodujący białko E1A12S.

38. Adenowirus według zastrz. 37, znamienny tym, że kwas nukleinowy kodujący białko E1A jest oddzielony od kwasu nukleinowego kodującego YB-1 przez sekwencję IRES.

39. Adenowirus według zastrz. 24-38, znamienny tym, że kwas nukleinowy kodujący białko E4, korzystnie białko E4orf6, oraz kwas nukleinowy kodujący białko E1B, korzystnie białko E1B55kD, znajdują się w kasecie ekspresyjnej, przy czym korzystnie te dwie sekwencje kodujące są rozdzielone sekwencją IRES.

40. Adenowirus według zastrz. 39, znamienny tym, że promotor kasety ekspresyjnej jest wybrany z grupy obejmującej promotory nowotworowo-specyficzne, promotory narządowo-specyficzne, promotory tkankowo-specyficzne, promotory heterologiczne i promotory adenowirusowe, przy czym promotory adenowirusowe są różne od promotora E4 oraz różne od promotora E1B, korzystnie są różne od promotora E4 typu dzikiego oraz różne od promotora E1B typu dzikiego.

41. Adenowirus według zastrz. 1-40, znamienny tym, że ten adenowirus zawiera kasetę ekspresyjną zawierającą promotor oraz sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmującej aptamery, rybozymy, aptazymy, cząsteczki antysensowne i siRNA.

42. Adenowirus według zastrz. 1-40, znamienny tym, że ten adenowirus zawiera kasetę ekspresyjną zawierającą promotor oraz sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym tę sekwencję kwasu nukleinowego stanowi kodujący kwas nukleinowy, przy czym ten kwas nukleinowy koduje cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej peptydy, polipeptydy, białka, antykaliny, przeciwciała i fragmenty przeciwciał.

43. Adenowirus według zastrz. 1-40, znamienny tym, że zawiera kasetę ekspresyjną, przy czym ta kaseta ekspresyjna zawiera promotor i sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym ta sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmującej geny wywołujące apoptozę, geny proleków, inhibitory proteaz, geny supresory nowotworów, cytokiny oraz inhibitory angiogenezy.

44. Adenowirus według zastrz. 1-43, znamienny tym, że jest rekombinowanym adenowirusem.

45. Adenowirus według zastrz. 1-44, znamienny tym, że jest mutantem adenowirusa.

46. Adenowirus według zastrz. 1-45, znamienny tym, że jest defektywny replikacyjnie.

47. Adenowirus według zastrz. 46, znamienny tym, że jest zdolny do replikacji w komórkach zawierających rozregulowany YB-1 lub zawierających YB-1 w jądrze.

48. Adenowirus według zastrz. 47, znamienny tym, że te komórki zawierają YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego.

49. Kwas nukleinowy kodujący adenowirus zdefiniowany w zastrz. 1-48.

50. Układ replikacyjny zawierający kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz. 49 oraz kwas nukleinowy wirusa pomocniczego, przy czym kwas nukleinowy wirusa pomocniczego zawiera jedną lub większą liczbę kaset ekspresyjnych adenowirusa zdefiniowanego w zastrz. 1-48.

PL 219 321 B1

51. Układ replikacyjny według zastrz. 50, znamienny tym, że ten adenowirus lub kodujący go kwas nukleinowy nie zawiera kasety ekspresyjnej zawartej w wirusie pomocniczym.

52. Wektor zawierający kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz. 49 i/lub układ replikacyjny zdefiniowany w zastrz. 50-51.

53. Wektor według zastrz. 52, znamienny tym, że jest wektorem ekspresyjnym.

54. Komórka zawierająca adenowirus zdefiniowany w zastrz. 1-48 i/lub kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz. 49 i/lub układ replikacyjny zdefiniowany w zastrz. 50 albo 51 i/lub wektor zdefiniowany w zastrz. 52 albo 53.

55. Komórka według zastrz. 54, znamienna tym, że jest komórką eukariotyczną, korzystnie komórką zwierzęcą, najkorzystniej komórką ssaczą.

56. Komórka według zastrz. 55, znamienna tym, że komórka ssacza jest komórką wybraną z grupy obejmującej komórki mysie, szczurze, świnek morskich, świńskie, owcze, kozie, bydlęce, końskie, psie, kocie i ludzkie.

57. Organizm zawierający adenowirus zdefniowany w zastrz. 1-48, kwas nukleinowy zdefniowany w zastrz. 49, układ replikacyjny zdefniowany w zastrz. 50 albo 51, wektor zdefniowany w zastrz. 52-53 lub komórkę zdefniowaną w zastrz. 54-56, przy czym ten organizm jest wybrany z grupy obejmującej myszy, szczury, świnki morskie, świnie, owce, kozy, bydło, konie, psy i koty.

58. Zastosowanie adenowirusa zdefniowanego w zastrz. 1-48, kwasu nukleinowego zdefniowanego w zastrz. 49, układu replikacyjnego zdefniowanego w zastrz. 50 albo 51, wektora zdefniowanego w zastrz. 52-53, lub komórki zdefniowanej w zastrz. 54-56, do replikacji adenowirusa in vitro.

59. Zastosowanie adenowirusa zdefniowanego w zastrz. 1-48, kwasu nukleinowego zdefniowanego w zastrz. 49, układu replikacyjnego zdefniowanego w zastrz. 50 albo 51, wektora zdefniowanego w zastrz. 52-53 lub komórki zdefniowanej w zastrz. 54-56, do wytwarzania adenowirusa in vitro.

60. Zastosowanie in vitro adenowirusa zdefniowanego w zastrz. 1-48, kwasu nukleinowego zdefniowanego w zastrz. 49, układu replikacyjnego zdefniowanego w zastrz. 50 albo 51, wektora zdefniowanego w zastrz. 52-53 lub komórki zdefniowanej w zastrz. 54-56, do ekspresji genów, korzystnie genów, które wywołują lizę komórki, korzystnie lizę komórki podczas replikacji adenowirusa i/lub wywołują lizę komórki za pomocą adenowirusa.

61. Zastosowanie adenowirusa zdefniowanego w zastrz. 1-48, kwasu nukleinowego zdefniowanego w zastrz. 49, układu replikacyjnego zdefniowanego w zastrz. 50 albo 51, wektora zdefniowanego w zastrz. 52-53 lub komórki zdefniowanej w zastrz. 54-56, do wytwarzania leku.

62. Zastosowanie według zastrz. 58-61, znamienne tym, że komórka, w której replikuje się adenowirus, zawiera YB-1 w swoim jądrze, korzystnie zawiera YB-1 w swoim jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego.

63. Zastosowanie według zastrz. 58-61, znamienne tym, że komórka, w której replikuje się adenowirus, zawiera rozregulowany YB-1.

64. Zastosowanie według zastrz. 61, znamienne tym, że lek przeznaczony jest do leczenia chorób nowotworowych.

65. Zastosowanie według zastrz. 64, znamienne tym, że choroba nowotworowa jest wybrana z grupy obejmującej nowotwory złośliwe, raka, choroby rakowe oraz guzy.

66. Zastosowanie według zastrz. 65, znamienne tym, że nowotwory są wybrane z grupy obejmującej guzy lite, nielite, złośliwe i łagodne.

67. Zastosowanie według zastrz. 64-66, znamienne tym, że co najmniej część komórek tworzących nowotwór zawiera YB-1 w jądrze, korzystnie zawiera YB-1 w jądrze niezależnie od fazy cyklu komórkowego.

68. Zastosowanie według zastrz. 64-67, znamienne tym, że co najmniej część komórek tworzących nowotwór zawiera rozregulowany YB-1.

69. Zastosowanie według zastrz. 64-68, znamienne tym, że co najmniej część komórek tworzących nowotwór stanowią komórki Rb-dodatnie lub Rb-ujemne.

70. Zastosowanie według zastrz. 65-68, znamienne tym, że co najmniej część komórek tworzących nowotwór wykazuje oporność, korzystnie oporność wielokrotną w stosunku do środków farmaceutycznie czynnych.

71. Zastosowanie według zastrz. 70, znamienne tym, że ta oporność jest opornością wielokrotną.

PL 219 321 B1

72. Zastosowanie według zastrz. 70 albo 71, znamienne tym, że ta oporność jest opornością przeciw środkom przeciwnowotworowym, korzystnie cytostatykom i/lub że ta oporność jest wywołana przez naświetlanie.

73. Zastosowanie według zastrz. 64-72, znamienne tym, że pacjent, któremu podaje się lek, zawiera wiele komórek, przy czym komórki te są komórkami takimi jak opisane w zastrzeżeniach 67-71.

74. Zastosowanie według zastrz. 64-73, znamienne tym, że lek zawiera co najmniej jeden kolejny środek farmaceutycznie czynny.

75. Zastosowanie według zastrz. 63-73, znamienne tym, że lek podaje się razem ze środkiem farmaceutycznie czynnym lub jest do tego przeznaczony.

76. Zastosowanie według zastrz. 73 albo 74, znamienne tym, że kolejny środek farmaceutycznie czynny jest wybrany z grupy obejmującej cytokiny, inhibitory metaloproteinaz, inhibitory angiogenezy, cytostatyki, inhibitory kinazy tyrozynowej oraz inhibitory cyklu komórkowego.

77. Zastosowanie według zastrz. 64-73, znamienne tym, że lek podaje się przed, podczas lub po naświetleniu.

78. Zastosowanie według zastrz. 77, znamienne tym, że promieniowanie stosuje się w celu leczenia nowotworu.

79. Zastosowanie według zastrz. 64-78, znamienne tym, że leczoną komórkę lub organizm poddaje się działaniu środka, przy czym ten środek jest wybrany z grupy obejmującej naświetlanie, podanie cytostatyków oraz hipertermię.

80. Zastosowanie według zastrz. 64-79, znamienne tym, że ten środek stosuje się miejscowo lub ogólnoustrojowo.

81. Zastosowanie według zastrz. 1-80, znamienne tym, że przy naświetlaniu stosuje się promieniowanie o wysokiej energii, korzystnie jakiekolwiek naświetlanie stosowane w leczeniu chorób nowotworowych.

82. Zastosowanie adenowirusa zdefniowanego w zastrz. 1-48, kwasu nukleinowego zdefniowanego w zastrz. 49, układu replikacyjnego zdefniowanego w zastrz. 50 albo 51, wektora zdefniowanego w zastrz. 52-53 lub komórki zdefniowanej w zastrz. 54-56, do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych, znamienne tym, że choroba nowotworowa jest wybrana z grupy obejmującej nowotwory sutka, nowotwory kości, nowotwory żołądka, nowotwory jelita, nowotwory pęcherzyka żółciowego, nowotwory trzustki, nowotwory wątroby, nowotwory nerek, nowotwory mózgu, nowotwory jajników, nowotwory skóry, nowotwory przydatków skórnych, nowotwory głowy i szyi, nowotwory macicy, nowotwory maziówkowe, nowotwory krtani, nowotwory przełyku, nowotwory języka oraz nowotwory prostaty, przy czym korzystnie jedna z powyższych chorób nowotworowych wykazuje cechy opisane w powyższych zastrzeżeniach.

83. Zastosowanie adenowirusa zdefniowanego w zastrz. 1-48, kwasu nukleinowego zdefniowanego w zastrz. 49, układu replikacyjnego zdefniowanego w zastrz. 50 albo 51, wektora zdefniowanego w zastrz. 52-53 lub komórki zdefniowanej w zastrz. 54-56, do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych, przy czym promotor nowotworowo-specyficzny jest promotorem, który jest specyficzny względem nowotworu dla którego stosuje się ten lek.

84. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera adenowirus zdefniowany w zastrz. 1-48, kwas nukleinowy zdefniowany w zastrz. 49, układ replikacyjny zdefniowany w zastrz. 50 albo 51, wektor zdefniowany w zastrz. 52-53 lub komórkę zdefniowaną w zastrz. 54-56 oraz ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.