PL219326B1 - Zastosowanie fluoresceino-karbaminian eserolino-5'-N-kadaweryny i jej pochodnych oraz barwnik fluorescencyjny do wybarwiania kolagenów - Google Patents
Zastosowanie fluoresceino-karbaminian eserolino-5'-N-kadaweryny i jej pochodnych oraz barwnik fluorescencyjny do wybarwiania kolagenówInfo
- Publication number
- PL219326B1 PL219326B1 PL384305A PL38430508A PL219326B1 PL 219326 B1 PL219326 B1 PL 219326B1 PL 384305 A PL384305 A PL 384305A PL 38430508 A PL38430508 A PL 38430508A PL 219326 B1 PL219326 B1 PL 219326B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- collagen
- staining
- fluorescent
- fluorescent marker
- fluorescence
- Prior art date
Links
- 239000003550 marker Substances 0.000 title description 25
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 62
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 60
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 60
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 29
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 42
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 11
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 4
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 4
- 229960001697 physostigmine Drugs 0.000 description 4
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 3
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 3
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N Physostigmine Natural products C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)C2C1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 3
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 3
- PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N physostigmine Chemical group C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)[C@@H]2[C@@]1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- NBAOBNBFGNQAEJ-UHFFFAOYSA-M tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.CCOC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C21 NBAOBNBFGNQAEJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- -1 (5-aminopentyl) thiourea Chemical compound 0.000 description 2
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- HKGWQUVGHPDEBZ-OLZOCXBDSA-N eseroline Chemical compound C1=C(O)C=C2[C@]3(C)CCN(C)[C@@H]3N(C)C2=C1 HKGWQUVGHPDEBZ-OLZOCXBDSA-N 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024985 Alport syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 108010053652 Butyrylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Chemical group 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100032404 Cholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 102000004405 Collectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000909 Collectins Proteins 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002197 Ehlers-Danlos syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- NKWPZUCBCARRDP-UHFFFAOYSA-L calcium bicarbonate Chemical compound [Ca+2].OC([O-])=O.OC([O-])=O NKWPZUCBCARRDP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000020 calcium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- VFRSADQPWYCXDG-LEUCUCNGSA-N ethyl (2s,5s)-5-methylpyrrolidine-2-carboxylate;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.CCOC(=O)[C@@H]1CC[C@H](C)N1 VFRSADQPWYCXDG-LEUCUCNGSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000003215 hereditary nephritis Diseases 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Chemical group 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCPYLLCMEDAXFR-UHFFFAOYSA-N triphosgene Chemical compound ClC(Cl)(Cl)OC(=O)OC(Cl)(Cl)Cl UCPYLLCMEDAXFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy znacznik fluorescencyjny do barwienia kolagenów nadający się do stosowania w badaniach naukowych i diagnostyce medycznej.
Kolageny są składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej [Aumailley and Gayraud, J. Mol. Med. 76 (3-4): 253-65, 1998] oraz rekonstytuowanych substytutów tkankowych. Kolageny wpływają na zachowanie komórek w tkankach - adhezję, migrację, proliferację i metabolizm oraz pełnią rolę w utrzymaniu mechanicznej odporności tkanek [Friedl et al. Microsc. Res. Tech. 43 (5): 369-78, 1998; Friedl et al., Int. J. Dev. Biol. 48 (5-6): 441-9, 2004].
Mutacje w genach kodujących kolageny różnych typów prowadzą do zaburzeń w syntezie, potranslacyjnych modyfikacjach, polimeryzacji i składaniu fibryli we włókna, oraz konstrukcji sieci włókien. Skutkiem tych zaburzeń są schorzenia dziedziczne jak pęcherzyca noworodków, Epidermolysis bullosa, zespół Alporta, syndrom Ehlers-Danlos i inne [Baxter Cardiovasc. Pathol., 14 (4): 185-8, 2005]. Podczas starzenia organizmów zachodzi denaturacja kolagenu, która prowadzi do utraty własności mechanicznych tkanek.
Barwienie fluorescencyjne kolagenów ma na celu uzyskanie wybiórczej i specyficznej (tzn. pochodzącej wyłącznie lub prawie wyłącznie od kolagenu lub kolagenów) fluorescencji struktur zawierających kolagen lub kolageny, o żądanych własnościach spektralnych i biofizycznych, w tym o żądanej barwie i intensywności oraz stabilności w czasie pomiarów (tzn. małej utraty intensywności luminescencji w czasie naświetlania i obserwacji), zarówno w tkankach żywych, jak i utrwalonych, w celu stworzenia trójwymiarowych obrazów struktur zawierających kolagen, z wysoką rozdzielczością przestrzenną (ułamki mikrometra) i jej zmian lub w celu dokonania pomiarów, w żywych lub utrwalonych tkankach oraz w celu badania metodami mikroskopowymi i cytometrycznymi, jak mikroskopia fluorescencyjna, konfokalna (CLSM), wielofotonowa (MP), odzyskiwanie fluorescencji po fotoblaknięciu (FRAP), utrata fluorescencji przy fotoblaknięciu (FLIP), rezonansowy transfer energii fluorescencji (FRET), fluorescencyjna spektroskopia korelacyjna (FCS), mikroskopia wykorzystująca modulowane oświetlenie, laserowa cytometria skaningowa (LSC), cytometria przepływowa i podobne.
Mikroskopowa identyfikacja włókien kolagenowych znajduje zastosowanie w badaniach macierzy zewnątrzkomórkowej i rekonstytuowanych substytutów tkankowych.
Znane są metody obserwacji kolagenu w żelach [Brightman et al., Biopolymers. 54 (3): 222- 34, 2000; Wu et al. Microsc. Microanal. 9 (6): 574-80, 2003; Wu et al., J. Microsc. 210 (Pt 2): 158-65, 2003], barwienia histochemicznego i immunofluorescencyjnego w utrwalonych tkankach i kontrastowania kolagenu w preparatach do mikroskopii elektronowej, brak jednak specyficznej metody wizualizacji i badania trójwymiarowej struktury sieci włókien kolagenowych w żywych tkankach.
Znane metody badania kolagenów in situ przedstawiono w poniższej tabeli.
| Metoda | Tkanki utrwalo- ne | Tkanki żywe | Zalety | Ograniczenia | Potrzebna aparatura |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Barwienie Picrosyrius Red i barwienie metodą srebrową („silver sta- ining”) | Tak | Nie | Względnie specyficzna | Utrwalanie tkanki zmienia strukturę sieci włókien kolagenowych, otrzymuje się tylko obrazy dwuwymiarowe z wybranego skrawka tkanki, nie nadaje się do równoczesnego badania innych struktur i funkcji, nie nadaje się do badania zależności czasowych, pracochłonna procedura | Pracownia histochemiczna. Mikroskop optyczny |
| Kontrastowanie do mikroskopii elektronowej („freeze substitution”) | Tak | Nie | Względnie specyficzna | Utrwalanie tkanki zmienia strukturę sieci włókien kolagenowych, otrzymuje się tylko obrazy dwuwymiarowe z wybranego skrawka tkanki, nie nadaje się do równoczesnego badania innych struktur i funkcji, nie nadaje się do badania zależności czasowych, pracochłonna procedura | Mikrotom. mikroskop elektronowy |
PL 219 326 B1 cd tabeli
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Światło odbite lub rozproszone | Nie | Tylko układy modelo- we | Brak specyficzności | Brak specyficzności, przydatna tylko do badania żeli kolagenowych in vitro; ograniczona przydatność w badaniach żywych komórek i tkanek; w mikroskopii konfokalnej światła odbitego silne efekty interferencyjne i 'hot spot', które muszą być usuwane metodami analizy Fouriera | Mikroskop optyczny z przystawką do ciemnego pola; mikroskop konfokainy z układem do detekcji światła odbitego + specjalne procedury usuwania szumów i pasków interferencyjnych w domenie częstotliwości, w przestrzeni 4D |
| Autofluoresce ncja | Tak | Tak | Brak specyficzności | Brak specyficzności (podobną autofluorescencję wykazują inne składniki komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej) | Mikroskop fluorescencyjny lub konfokalny |
| SHG (Second Harmonie Generation) | Nie | Tak | Pozwala w ograniczonym zakresie) rekonstru- ować strukturę trójwymiarową sieci włókien kolagenowych, badać inne struktury i funkcje komórek, badać zależności czasowe | Mało specyficzna; inne struktury również dają sygnał drugiej harmonicznej; fotouszkodzenia komórek, grzanie tkanki w czasie obserwacji; wymaga kosztownej aparatury (mikroskop wielofotonowy) i specjalnego detektora | Mikroskop wielofotonowy, wyposażony w specjalny detektor |
Celem wynalazku jest stworzenie możliwości obserwacji kolagenów in vivo w nienaruszonych tkankach.
Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie barwnika fluorescencyjnego nadającego się wybarwiania kolagenów.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze:
tj. fluoresceino-karbaminianu eserolino-5'-N-kadaweryny lub jego pochodnych, do wytwarzania barwnika fluorescencyjnego do wybarwiania kolagenów.
Przez pochodne, związki pokrewne lub podobne użytego znacznika fluorescencyjnego rozumie się związki chemiczne, które mają pokrewną strukturę chemiczną, to znaczy składają się z fluoroforu (zawierają ugrupowanie chemiczne zdolne od razu lub po zmodyfikowaniu do emisji luminescencji) oraz przyłączonej doń struktury molekularnej, która razem tworzy cząsteczkę o masie nie przekraczającej 3000Da, wykazującą powinowactwo do kolagenu naturalnego jednego lub wielu typów, lub do sztucznych kolagenów, znajdujących się w formie monomerycznej lub spolimeryzowanej, w próbce biologicznej, materiałowej lub innej.
PL 219 326 B1
Korzystnymi pochodnymi fluoresceinokarbaminianu eserolino-5'-N-kadaweryny, które mogą być stosowane zgodnie z wynalazkiem są związki o wzorze I:
gdzie R może oznaczać: H, -OH, -CH3.
Równie korzystnie pochodną stosowaną według wynalazku może być związek wybrany z grupy zawierającej:
Fluoresceino-karbaminian eserolino-5'-N-metylo-kadaweryny:
Metylofluoresceinokarbaminian eserolino-5'-N-kadaweryny oraz
Fluoresceino-karbaminian eserolino-5'-N-metanolo-kadaweryny.
PL 219 326 B1
Pochodne te mogą być otrzymane znanymi metodami.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest barwnik fluorescencyjny do wybarwiania kolagenów zawierający znacznik fluorescencyjny rozpuszczony w odpowiednim roztworze, znamienny tym, że jako znacznik fluorescencyjny zawiera fluoresceinokarbaminian eserolino-5'-N-kadaweryny lub jego pochodną, jak zdefiniowano powyżej.
Dla celów niniejszego opisu jako „znacznik fluorescencyjny” należy rozumieć związek chemiczny posiadający powinowactwo do określonej substancji, w tym przypadku kolagenów oraz właściwości fluorescencyjne.
Zastosowany znacznik fluorescencyjny jest związkiem chemicznym zbudowanym ze znanych wcześniej elementów (fizostygmina, fluoresceina, łańcuch węglowodorowy). Cząsteczki te, nie połączone w szczególny sposób w jedną molekułę, nie mają jednak powinowactwa do kolagenów i nie nadają się do barwienia monomerów, fibryli lub włókien kolagenowych. Wymienione cząsteczki, połączone w jeden zespół, wykazują silne powinowactwo do kolagenu. Reakcja (powstanie wiązań chemicznych między cząsteczką fluoresceino-x-fizostygminy a cząsteczkami kolagenu) zachodzi w czasie kilku sekund. Zgromadzone na powierzchni włókien kolagenowych cząsteczki znacznika, po oświetleniu promieniowaniem z zakresu 300-500 nm, np. światłem niebieskim, emitują zieloną fluorescencję, co umożliwia łatwą detekcję położenia w przestrzeni włókien kolagenowych w tkance lub innej próbce zawierającej kolagen.
Natomiast jako „barwnik fluorescencyjny” należy rozumieć odczynnik nadający się do bezpośredniego wybarwiania badanego preparatu, mający zazwyczaj postać buforowanego roztworu wodnego, zawierający znacznik fluorescencyjny oraz odpowiednie substancje dodatkowe, przykładowo wodne roztwory buforowe jak bufor fosforanowy, węglanowy lub cytrynianowy, nadające się do stosowania wobec wybarwianych preparatów oraz zapewniającą odpowiednią trwałość odczynnika.
Znacznik według wynalazku może być stosowany w sposobie barwienia kolagenów do obserwacji metodami optycznymi z zastosowaniem fluoroforu, w którym podaje się barwnik zwierzęciu laboratoryjnemu, lub pobiera się próbki żywej tkanki lub próbkę biomateriału, badaną próbkę zawierającą kolageny kontaktuje się ze znacznikiem fluorescencyjnym według wynalazku, tak przygotowaną próbkę pozostawia się na okres od kilku sekund do kilkudziesięciu minut w celu wytworzenia, przez połączenia nie kowalencyjne, kompleksu chemicznego znacznik fluorescencyjny-kolageny, następnie badaną próbkę oświetla się światłem o długości fali od 300 nm do 500 nm i obserwuje się lub bada znanymi metodami optycznymi, mikroskopowymi lub innymi wykorzystującymi fluorescencję, przy czym w razie potrzeby badaną próbkę można utrwalić za pomocą formaldehydu lub innych czynników utrwalających przed rozpoczęciem obserwacji.
Spolimeryzowany kolagen tworzy w tkankach zwierzęcych włókna, które są odpowiedzialne za mechaniczną integralność tkanek oraz pełnią role w rozwoju zarodkowym, gojeniu ran, starzeniu i innych ważnych procesach biologicznych. Znanych jest szereg nabytych lub genetycznych chorób, których przyczyny lub skutki wiążą się z kolagenami. Możliwość detekcji i obserwacji włókien kolagenowych metodami fluorescencyjnymi, m. in. metodą mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej, może mieć zastosowania w badaniach naukowych i diagnostyce medycznej. Wynalazek pozwala na obserwację kolagenów in vivo w nienaruszonych lub utrwalonych tkankach, lub materiałach zawierających kolagen. Wiązania niekowalencyjne kompleksu chemicznego fluoresceina-x-fizostygmina-kolagen pozwalają zapobiec utracie fluorescencji wybarwionego kolagenu.
Załączone figury pozwalają na wyjaśnienie istoty wynalazku.
Figura 1 przedstawia powinowactwo znacznika fluorescencyjnego do włókien kolagenowych. Pojedyncza fibryla kolagenu spolimeryzowanego in vitro - obraz w świetle odbitym (A) oraz obraz fluorescencyjny, po wybarwieniu z użyciem znacznika fluorescencyjnego (B). Grubość warstwy konfokalnej w obserwacji metodą światła odbitego jest mniejsza niż w obrazie fluorescencyjnym, stąd obraz A pokazuje krótszy fragment lekko wygiętego włókna, niż obraz B.
Figura 2 przedstawia specyficzne wiązanie znacznika fluorescencyjnego do włókien kolagenowych w żywych tkankach. Włókna kolagenowe na powierzchni mięśnia szkieletowego myszy (po lewej) i w naczyniach krwionośnych (po prawej). Pole widzenia 160 x 160 μm.
Figura 3. przedstawia strukturę biomateriału zawierającego kolagen, używanego w leczeniu ran oparzeniowych.
Figura 4 prezentuje schemat syntezy znacznika fluorescencyjnego, który składa się fluoresceiny sprzężnej z fizostygminą.
Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.
PL 219 326 B1
P r z y k ł a d 1
Otrzymywanie znaczników fluorescencyjnych.
Oryginalna metoda syntezy znacznika fluorescencyjnego, fluoresceiny sprzężonej z fizostygminą, składa się z pięciu reakcji, przedstawionych na figurze 4. Do skonstruowania sekwencji reakcji prowadzących do syntezy znacznika wykorzystano modyfikacje metod opisanych przez Yu et al. (Yu et al., Heterocycles 1987, 26 (5): 1271-1275) oraz Atack et al (Atack et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1989, 249 (1): 194-202). Synteza karbaminianu przez bezpośrednie przyłączenie 5-((5-aminopentyl)tiomoczniko)fluoresceiny do eseroliny, z zastosowaniem kilku metod tworzenia karbaminianu, nie prowadzi do otrzymania żądanej struktury.
Izocyjanian (2) jest otrzymywany zgodnie ze zmodyfikowaną procedurą opisaną przez Nowick i wsp. (Nowick et al., J. Org. Chem. 1992, 57: 7364-7366; Nowick et al., J. Org. Chem. 1996, 61: 3929-3934; Nowick et al., J. Org Chem. 1998, 63: 9144). Roztwór mono-N-t-BOC-kadaweryny (1) w dichlorometanie jest chłodzony do 0°C i wysycany dwuwęglanem wapnia. Dodawany jest trifosgen i dwufazowy układ jest mieszany. Powstaje 5-N-(t-Butyloksykarbonyl)-1-N'-izocyjanatopentan (2).
Reakcja izocyjanianu (2) z eseroliną (3) jest wykonywana zgodnie z metodą Yu i wsp. (Yu et al., J. Med. Chem. 1999, 42: 1855-1861) oraz Atack i wsp. (Atack et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1989, 249: 194-202). Fumaran eseroliny jest ekstrahowany do estru dietylowego i odparowywany. Izocyjanian N-t-BOC-kadaweryny (2) jest dodawany w formie emulsji w dietyleterze. Powstaje karbaminian 5'-N-t-BOC-kadawerynoeseroliny (4).
Do roztworu karbaminianu N-t-BOC-kadawerynoeseroliny (4) o temperaturze 0°C dodawany jest kwas trifluorooctowy (TFA) w celu usunięcia grupy ochraniającej (t-BOC). Powstaje sól trifluorooctowa karbaminianu eserolino-5'-N-kadaweryny (5).
Związek (5) jest rozpuszczany w diizopropyletylaminie (DEA), a następnie do roztwou dodawany jest 5-izotiocyjanian fluoresceiny (FITC). Powstaje żądany produkt reakcji - tiomocznikowy addukt fluoresceiny do karbaminianu eserolino-5'-N-kadaweryny (6).
P r z y k ł a d 2
Wybarwianie włókien kolagenowych
Przechowywanie barwnika
Znacznik fluorescencyjny według wynalazku, w postaci proszku, rozpuścić w DMSO do stężenia mM i podzielić na naważki o objętości 5 μ|. Roztwór znacznika fluorescencyjnego przechowywać w temperaturze -18°C. Chronić przed światłem.
Przygotowanie roztworu do barwienia
Rozmrozić porcję roztworu znacznika fluorescencyjnego bezpośrednio przed barwieniem. Wymieszać używając wytrząsarki (Vortex). Chronić roztwór przed światłem.
Przygotowanie tkanek do barwienia
Wyizolowany fragment tkanki pozostawić w temperaturze pokojowej, nie chłodzić. Położyć fragment tkanki na sza|ce Petriego z szklanym dnem o grubości 0,17 mm (np. sza|ki produkcji firmy Mattek lub podobnej). Zalać tkankę odpowiednią ilością pożywki hodowlanej o temperaturze 37°C zbuforowanej do kontaktu z powietrzem (tzn. pożywki zachowującej kwasowość pH 7,2-7,4 w równowadze z powietrzem), bez dodatku czerwieni fenolowej. Pożywka powinna zawierać 1% surowicy.
Barwienie
Dodać do pożywki taką objętość wyjściowego roztworu znacznika fluorescencyjnego według wynalazku, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μΜ. Usunąć z szalki Petriego zawierającej tkankę zwykłą pożywkę i zastąpić ją pożywką zawierającą znacznik fluorescencyjny. Inkubować 5 do 60 minut, w zależności od typu i grubości tkanki.
Jeżeli konieczne jest jednoczesne barwienie innych struktur w badanej tkance, potrzebne barwniki można dodać do pożywki zawierającej znacznik fluorescencyjny lub bezpośrednio do tkanki wybarwionej za pomocą znacznika fluorescencyjnego.
Niespecyficzne barwienie
Barwienie z użyciem znacznika fluorescencyjnego może prowadzić do pojawienia się niespecyficznego sygnału fluorescencji. Powody i sposób minimalizacji tego problemu podano poniżej:
a. niespecyficzne barwienie uszkodzonych komórek występuje w przypadku, gdy znacznik fluorescencyjny uzyskuje dostęp do wnętrza komórek, które mają uszkodzoną błonę plazmatyczną. Zjawisko to występuje w przypadku barwienia tkanki uszkodzonej lub tkanki, która została wyizolowana na wiele godzin przed barwieniem. W tych okolicznościach, z upływem czasu błona zewnętrzna traci
PL 219 326 B1 zdolność rozdzielania środowiska zewnętrznego i wewnętrznego komórki. Wnikanie barwnika znacznika fluorescencyjnego pozwala na wytwarzanie słabych wiązań ze składnikami komórki i słabego barwienia struktur wewnętrznych. Całe wnętrze komórki przybiera wtedy słabą barwę zieloną. Charakter tego wzoru barwienia jest stosunkowo łatwy do rozpoznania i odróżnienia od wybarwionych włókien kolagenowych. Problemu można uniknąć barwiąc nieuszkodzone tkanki zaraz po izolacji.
b. niespecyficzne barwienie jąder niektórych typów komórek może następować w wyniku penetracji wolnej fluoresceiny przez funkcjonalną błonę komórkową. Wolna fluoresceina może występować w roztworze znacznika fluorescencyjnego - jest to zanieczyszczenie pozostające po syntezie barwnika. Stężenie wolnej fluoresceiny zależy od wydajności procesu oczyszczania zsyntetyzowanego związku.
c. barwienie struktur zawierających cząsteczki podobne do kolagenu. W niektórych typach komórek i tkanek mogą występować cząsteczki zawierające podjednostkę o budowie bardzo zbliżonej do kolagenu. Do cząsteczek tej grupy należy forma acetylcholinesterazy zakotwiczona w błonach komórkowych. Posiada ona w swej strukturze łańcuchy kolagenowe, tzw. kolagen Q. Innym przedstawicielem są lektyny, które zawierają cząsteczki kolagenu (kolektyny). Stężenie tych związków w tkankach jest zazwyczaj wielokrotnie niższe niż stężenie kolagenu, zatem sygnał fluorescencyjny pochodzący od cząsteczek zawierających łańcuchy polipeptydowe podobne do kolagenu jest poniżej poziomu detekcji.
d. barwienie acetylcholinesterazy, poprzez wiązanie znacznika fluorescencyjnego z centrum aktywnym enzymu. Składnikiem cząsteczki znacznika fluorescencyjnego jest fizostygmina - cząsteczka wykazująca powinowactwo do centrum aktywnego cholinesteraz (acetylo- i butyrylocholinesterazy). Ustalono, że wiązanie między znacznikiem fluorescencyjnym a wyizolowanymi cholinesterazami zachodzi, jednak jest słabe i nietrwałe. Powinowactwo znacznika fluorescencyjnego do cholinesteraz nie prowadzi do wyraźnego wybarwienia nerwów cholinergicznych.
Blaknięcie i wymiana dynamiczna barwnika (izolowane włókna, nienaruszona tkanka)
Światło wzbudzające fluorescencję znacznik fluorescencyjny prowadzi do uszkodzenia fluoroforu i utraty zdolności do emitowania fluorescencji. Skutkiem blaknięcia jest zmniejszanie intensywności fluorescencji znacznika fluorescencyjnego w badanych obszarze próbki. Spadek intensywności fluorescencji jest jednak znacznie wolniejszy, niż wynikałoby to z tempa blaknięcia fluoroforu użytego znacznika fluorescencyjnego. Przyczyną niespodziewanej stabilności sygnału jest wymiana dynamiczna między pulą znacznika fluorescencyjnego związanego z włóknami kolagenu a pulą obecną w roztworze. Prowadzi to do stałego odtwarzania populacji niewyblakniętych cząsteczek znacznika fluorescencyjnego związanych z włóknami kolagenu. Wykazano to metodą FRAP.
Wygaszanie kolizyjne
W przypadku użycia stężeń znacznika fluorescencyjnego przewyższających 10 μΜ, może dochodzić do zgromadzenia takiej liczby cząsteczek barwnika na powierzchni włókien kolagenowych, iż zachodzi zjawisko wygaszania kolizyjnego. Prowadzi to do zmniejszenia intensywności sygnału fluorescencji, mimo wzrostu stężenia barwnika w próbce. Uzyskanie optymalnych warunków barwienia wymaga miareczkowania. W większości przypadków optymalne stężenie znacznika fluorescencyjnego w roztworze wynosi ok. 10 μΜ.
P r z y k ł a d 3
Jednoczesne wybarwianie włókien kolagenowych, jąder komórkowych oraz aktywnych mitochondriów
Dodać barwnik TMRE do pożywki zawierającej znacznik fluorescencyjny. Końcowe stężenie TMRE powinno wynosić 1 μΜ. Tak przygotowanym roztworem zalać fragment tkanki. Następnie, dodać barwnik Draq5 pobrany bezpośrednio z roztworu dostarczonego przez producenta (Biostatus, UK). Końcowe stężenie Draq5 powinno wynosić 1 μΜ. Inkubować tkankę z roztworem trzech barwników 5-60 minut.
Rejestrowanie obrazów mikroskopowych
Obrazy fluorescencji włókien kolagenowych wybarwionych znacznikiem fluorescencyjnym można oglądać, rejestrować i badać używając standardowego mikroskopu fluorescencyjnego (tzw. szerokiego pola) lub mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w źródło światła niebieskiego i typowe filtry optyczne służące do detekcji fluoresceiny lub innego urządzenia badawczego posługującego się fluorescencją i jedną lub kilkoma metodami, jak MP, FRAP, FLIP, FRET, FCS, 4Pi, STED, mikroskopia wykorzystująca modulowane oświetlenie.
PL 219 326 B1
Warunki pomiaru w przypadku próbki wybarwionej znacznikiem fluorescencyjnym, Draq5 i TMRE, mikroskop Bio-Rad MRC1024. Długości fali światła wzbudzającego fluorescencję - 488 nm,
568 nm, laser KrAr, pierwsze lustro dichroiczne T1, drugie lustro dichroiczne T2A, filtry emisyjne
540/30, 580LP, 630LP.
Utrwalanie wybarwionych preparatów
Preparaty wybarwione znacznikiem fluorescencyjnym mogą być utrwalane formaldehydem i pozostają trwałe przez co najmniej kilka dni, jednak jakość uzyskanych obrazów jest gorsza niż w przypadku preparatów zawierających żywe tkanki.
W przypadku barwienia opisanego w przykładzie powyżej barwienie znacznikiem fluorescencyjnym i Draq5 pozostaje widoczne po utrwaleniu tkanki formaldehydem, natomiast barwienie mitochondriów znika z chwilą utraty potencjału mitochondrialnego.
Claims (2)
1. Zastosowanie związku o wzorze:
gdzie R oznacza: H, -OH lub -CH3, do wytwarzania barwnika fluorescencyjnego do wybarwiania kolagenów, przy czym stosowany związek wybiera się zwłaszcza z grupy zawierającej: fluoresceinokarbaminian eserolino-5'-N-kadaweryny, fluoresceinokarbaminian eserolino-5'-N-metylokadaweryny, metylofluoresceinokarbaminian eserolino-5'-N-kadaweryny oraz fluoresceinokarbaminian eserolino-5'-N-metanolokadaweryny.
2. Barwnik fluorescencyjny do wybarwiania kolagenów zawierający znacznik fluorescencyjny rozpuszczony w odpowiednim roztworze, znamienny tym, że jako znacznik fluorescencyjny zawiera związek określony w zastrz. 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL384305A PL219326B1 (pl) | 2008-01-22 | 2008-01-22 | Zastosowanie fluoresceino-karbaminian eserolino-5'-N-kadaweryny i jej pochodnych oraz barwnik fluorescencyjny do wybarwiania kolagenów |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL384305A PL219326B1 (pl) | 2008-01-22 | 2008-01-22 | Zastosowanie fluoresceino-karbaminian eserolino-5'-N-kadaweryny i jej pochodnych oraz barwnik fluorescencyjny do wybarwiania kolagenów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL384305A1 PL384305A1 (pl) | 2009-08-03 |
| PL219326B1 true PL219326B1 (pl) | 2015-04-30 |
Family
ID=42986792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL384305A PL219326B1 (pl) | 2008-01-22 | 2008-01-22 | Zastosowanie fluoresceino-karbaminian eserolino-5'-N-kadaweryny i jej pochodnych oraz barwnik fluorescencyjny do wybarwiania kolagenów |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL219326B1 (pl) |
-
2008
- 2008-01-22 PL PL384305A patent/PL219326B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL384305A1 (pl) | 2009-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cooper et al. | Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP | |
| Matryba et al. | Advances in ex situ tissue optical clearing | |
| Dailey et al. | Confocal imaging of microglial cell dynamics in hippocampal slice cultures | |
| Boerboom et al. | High resolution imaging of collagen organisation and synthesis using a versatile collagen specific probe | |
| Cooper et al. | Confocal microscopic analysis of morphogenetic movements | |
| Ashcroft et al. | Age‐related changes in the temporal and spatial distributions of fibrillin and elastin mRNAs and proteins in acute cutaneous wounds of healthy humans | |
| WO2017027368A1 (en) | Protein retention expansion microscopy | |
| WO2021113505A1 (en) | Method for preparing a specimen for expansion microscopy | |
| Biela et al. | Col‐F, a fluorescent probe for ex vivo confocal imaging of collagen and elastin in animal tissues | |
| US8153103B2 (en) | Conjugates of photo-activatable dyes | |
| Shirakawa et al. | Spatiotemporal characterization of intracellular Ca2+ rise during the acrosome reaction of mammalian spermatozoa induced by zona pellucida | |
| Soeller et al. | Application of two-photon flash photolysis to reveal intercellular communication and intracellular Ca 2+ movements | |
| PL219326B1 (pl) | Zastosowanie fluoresceino-karbaminian eserolino-5'-N-kadaweryny i jej pochodnych oraz barwnik fluorescencyjny do wybarwiania kolagenów | |
| Dumas et al. | Membrane fluidity and oxygen diffusion in cholesterol‐enriched endothelial cells | |
| Molnár et al. | Tract-tracing in developing systems and in postmortem human material using carbocyanine dyes | |
| Al-Gubory | Fibered confocal fluorescence microscopy for imaging apoptotic DNA fragmentation at the single-cell level in vivo | |
| Stylianou et al. | Fluorescence Microscopy of the Cell and Cell Interactions to Study Dynamic Cellular Processes | |
| Osman et al. | Fluorescence approaches to image and quantify the demarcation membrane system in living megakaryocytes | |
| Kneen et al. | Imaging of renal medullary interstitial cells in situ by confocal fluorescence microscopy | |
| Micotto et al. | Fluorescent mimics of 5-hydroxytryptamine based on N-alkylated derivatives of 6-hydroxycarbostyril | |
| RU2620559C1 (ru) | Способ окрашивания препаратов цельных биологических тканей и органов методом клик-гистохимии (варианты) | |
| Dailey | Optical imaging of neural structure and physiology: Confocal fluorescence microscopy in live brain slices | |
| Kumar et al. | Visualization of 3D organoids through the latest advancements in microscopy | |
| Kaestner et al. | Non-linear and ultra high-speed imaging for explorations of the murine and human heart | |
| Saal et al. | Heat denaturation enables multicolor X10-STED microscopy at single-digit nanometer resolution |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20110122 |