PL219444B1 - Sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego do badań i symulacji zjawisk transportu: przepływu krwi oraz transportu substancji, w szczególności leków, zachodzących w sieci mikronaczyń krwionośnych, w szczególności naczyniach włosowatych, arteriolach i drobnych żyłkach, w tym w naczyniach patologicznie zdegenerowanych w guzach nowotworowych.

Sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego znajduje zastosowane przy wytwarzaniu mikroukładów wykorzystywanych przy prowadzeniu badań podstawowych in vitro in silico z zakresu biologii i biochemii w medycynie, farmakologii i biotechnologii, umożliwiając obserwację reakcji fizjologicznych organów, tkanek i pojedynczych komórek na czynniki biofizyczne i biochemiczne. Umożliwia wytwarzanie mikrourządzeń pozwalających na badania i optymalizację transportu leków, w tym leków w postaci mikrokapsułek oraz mikro- i nanocząstek, jak również liposomów, w strukturach tkankowych i sieci naczyń krwionośnych, w szczególności mikronaczyń, zwłaszcza zwyrodniałych na skutek przebiegających zmian chorobowych w chorobach nowotworowych, arteriosklerozie, cukrzycy, nadciśnieniu czy po radioterapii. Mikrosystemy umożliwiają precyzyjną kontrolę warunków prowadzenia badań in vitro hodowli tkankowych komórek śródbłonka znane są z publikacji Wang L , Zhang Z-L., Wdzieczak-Bakala J., Pang D-W., Liu J., Chen Y. Patterning cells and shear flow conditions: Convenient observation of endothelial cell remoulding, enhanced production of angiogenesis factors and drug response. Lab Chip, 2011, 11, 4235-4240. Z kolei w publikacji Ishikawa T., Fujiwara H., Matsuki N., Yoshimoto T., Imai Y., Ueno H., Yamaguchi T Asymmetry of blood flow and cancer cell adhesion in a microchannel with symmetric bifurcation and confluence. Biomed Microdevices; 2011, 13, 159-167 opisano mikroukład z systemem kanałów w kształcie rombu wykonany metodą litografii miękkiej w polimerze PDMS do badania przepływu krwi w rozwidleniach i łącznikach kanałów typu Y. Układ ten nie odzwierciedlał jednak struktury naczyniowej tkanek. Natomiast z publikacji Tatsuya Tanaka, Takuji Ishikawa, Keiko Numayama-Tsuruta, Yohsuke Imai, Hironori Ueno, Takefumi Yoshimoto, Noriaki Matsuki, Takami Yamaguchi, Inertial migration of cancer cells in blood flaw in microchannels, Biomed Microdevices (2012) 14:25-33 znany jest mikroukład z prostym kanałem do badań migracji komórek nowotworowych Żaden z obecnie znanych układów nie umożliwiał pełnego odwzorowania rzeczywistej struktury naczyń włosowatych i arteriol tkanek, a co za tym idzie prowadzenia badań i symulacji zjawisk transportu zachodzących w guzach nowotworowych.

W amerykańskim opisie patentowym nr US7517453 autorzy opisują mikrourządzenie będące modelem sieci naczyń krwionośnych w postaci prostoliniowych, prostokątnych kanałów o różnych szerokościach. Do wykonania kanałów w podłożu z elestomeru silikonowego wykorzystano klasyczną, wieloetapową metodę fotolitografii i miękkiej litografii. Na podstawie graficznego odwzorowania sieci kanałów wykonano maskę przez którą naświetlano pokryty substancją fotoaktywną wafel krzemowy. Następnie strukturę kanałów wytrawiano otrzymując matrycę odwrotną. Matrycę taką pokrywano warstwą elastomeru silikonowego, który po utwardzeniu zdejmowano z matrycy otrzymując warstwę polimerową z siecią kanałów. Przedstawiona metoda jest wieloetapowa i czasochłonna, nie umożliwia uzyskania kanałów o krawędziach nieregularnych, pofałdowanych o płynnie zmiennej głębokości, stykających się i przecinających pod różnymi kątami, cechującej się gwałtownymi przewężeniami i pęcherzykowatymi wybrzuszeniami.

Z amerykańskiego opisu patentowego nr US7725267 opisano mikrourządzenie będące modelem sieci mikronaczyń krwionośnych oraz model matematyczny służący do symulacji przepływu płynu i adhezji komórek do ścian mikronaczyń. Przedstawiona metoda fabrykacji struktury jest wieloetapowa i bazuje na czasochłonnej metodzie wytwarzania układów MEMS - fotolitografii z powtórnym nakładaniem fotorezystu oraz miękkiej litografii w elastomerze silikonowym. Metoda wymaga wytworzenia fotomasek na podstawie zdigitalizowanych obrazów naczyń krwionośnych, następnie wykonania matrycy, naświetlania fotorezystu, ponownego nakładania fotorezystu w miejscach naświetlonych w celu utworzenia wypukłości. Na tak utworzoną matrycę nakładany i utwardzany jest elastomer, który następnie jest zdejmowany z matrycy. W ten sposób otrzymywane są półokrągłe kanały o stałej średnicy (wysokości). Z nałożenia dwóch struktur o półkolistych kanałach powstaje właściwa struktura o przekroju kołowym. Zaproponowana metoda jest wieloetapowa, żmudna i pracochłonna. Część etapów musi być wykonywana ręcznie, przez co nie jest ona przystosowana do wielkoskalowej produkcji seryjnej. Przygotowanie struktury wymaga od kilkunastu do kilkudziesięciu godzin. Otrzymane struktury cechuje stała wysokość (głębokość kanału) zależna od wielkości siły napięcia powierzchniowego fotorezystu oraz kąta zwilżania powierzchni fotomaski, co uniemożliwia wytwarzanie kanałów o dowolnej

PL 219 444 B1 głębokości i stosunku średnicy do wysokości, jak również odwzorowanie uwypukleń, pęcherzy i przewężeń występujących w guzach nowotworowych.

Z polskiego zgłoszenia patentowego nr PL391030 znany jest mikrosystem przepływowy do oznaczania bioanalitów metodą optyczną w próbkach wieloskładnikowych, w szczególności płynów fizjologicznych. Mikrosystem składa się z elementu polimerowego - poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) oraz elementu ceramicznego, przy czym w elemencie polimerowym znajduje się meandryczny mikrokanał o długości odpowiednio dostosowanej do prowadzonej reakcji analitycznej z rozgałęzieniem w kształcie litery „Y”. Na końcach mikrokanału znajdują się otwory wlotowe i otwór wylotowy, natomiast element polimerowy połączony jest z elementem ceramicznym poprzez warstwę szkliwa. Przed otworem wylotowym znajduje się celka światłowodowa wraz ze światłowodami, przy czym na spodniej stronie elementu ceramicznego umieszczona jest grzałka.

Dotychczas znane metody wytwarzania sieci mikrokanałów nie pozwalają na oddanie rzeczywistej zdegenerowanej struktury sieci naczyń krwionośnych guzów nowotworowych Wyidealizowane kanały mikroukładów o przekroju prostokątnym lub kołowym nie są w stanie oddać zniekształceń (zwyrodnień) naczyń krwionośnych jakie występują w guzach nowotworowych, arteriosklerozie, cukrzycy, nadciśnieniu czy po radioterapii.

Sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego, według wynalazku, polega na tym, że w pierwszym etapie na podstawie zaprojektowanej mapy układu naczyń krwionośnych, w szczególności mikronaczyń, przygotowanej na podstawie zdjęcia fizycznej struktury, modelu matematycznego lub zgodnie z założeniami projektowymi, wytwarza się warstwy funkcjonalne oraz elementy i struktury pomocnicze, w tym celu podłoże w postaci warstwy elastomeru przygotowuje się poprzez powlekanie obrotowe nośnika w postaci folii poliestrowej oraz graweruje się struktury kanałów, po uprzednim osłonięciu powierzchni arkuszem ściśle przylegającego papieru osłonowego, poprzez naświetlanie skupioną wiązką lasera CO₂ o długości fali 10,6 μm, w drugim etapie łączy się warstwy funkcjonalne urządzenia wzajemnie lub z dnem oraz wiekiem urządzenia: warstwę funkcjonalną na nośniku z folii poliestrowej przemywa się w rozworze KOH w etanolu, naświetla się w komorze UV promieniowaniem o długości fali 185 nm i 253,7 nm, po czym łączy się z uprzednio wyprażonym w temperaturze nie niższej niż 200°C arkuszem szkła stanowiącym dno i złączoną strukturę umieszcza się na okres od 5 do 15 min na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze od 90 do 150°C, lub łączy się z uprzednio naświetloną w komorze UV powierzchnią z tworzywa sztucznego PMMA lub PC stanowiącą wieko urządzenia, po czym złączoną strukturę umieszcza się w prasie hydraulicznej pod naciskiem nie niższym niż 1 bar, a następnie w obecności izopropanolu usuwa się podłoże i ponownie łączy elementy uprzednio naświetlone w komorze UV w jedną całość, a następnie w trzecim etapie modyfikuje się wewnętrzne powierzchnie mikrokanałów, za pomocą elastomeru, powłoki krzemianowej i/lub roztworów i zawiesin protein, glikoprotein, proteoglikanów lub kultur komórkowych.

Korzystnie jako elastomer stosuje się polidimetylosiloksan (PDMS).

Korzystnie w pierwszym etapie wytwarza się elementy pomocnicze, w szczególności elektrody, ścieżki sygnałowe i przewodzące ładunki elektryczne, w warstwach funkcjonalnych, dnie i wieku urządzenia, w taki sposób, że w wygrawerowane laserowo puste przestrzenie i kanały wprowadza się mechanicznie substancję przewodzącą prąd, w szczególności mieszaninę PDMS i węgla, nanorurek węglowych lub proszku metalicznego w postaci pasty.

Korzystnie w drugim etapie połączone elementy umieszcza się w izopropanolu w celu ułatwienia zdjęcia folii poliestrowej, po czym usuwa się nośnik poliestrowy z powierzchni elastomeru.

Korzystnie w trzecim etapie modyfikuje się średnicę kanałów za pomocą elastomeru: przetłacza się mieszaninę prepolimeru i aktywatora polimeryzacji oraz, korzystnie, rozpuszczalnika obniżającego lepkość mieszaniny, usuwa się nadmiar elastomeru, a następnie przetłacza się powietrze, po czym urządzenie umieszcza się na termostatowanej płycie grzejnej, a przez kanały przetłacza się w sposób ciągły powietrze przez okres dwóch godzin w temperaturze 60°C,

Korzystnie w trzecim etapie zmniejsza się średnicę kanałów poprzez podanie do ich wnętrza prekursorów krzemionki, oraz etanolu i wody o kwaśnym odczynie i ogrzewa się do temperatury 100°C przez okres od 5 do 60 sekund, po czym nadmiar mieszaniny usuwa się z wnętrza kanałów poprzez przetłoczenie powietrza, a następnie urządzenie umieszcza się na termostatowanej płycie grzejnej w temp. 200°C w celu utwardzenia warstwy krzemionki opłaszczającej wewnętrzną powierzchnię mikrokanałów.

Korzystnie w trzecim etapie zatłacza się do kanałów roztwory i zawiesiny protein, glikoprotein, proteoglikanów lub kultur komórkowych, a następnie usuwa się ich nadmiar poprzez przetłoczenie

PL 219 444 B1 powietrza i suszy przez okres od 1 do 15 minut, w wyniku czego na ich powierzchni tworzy się biokompatybilny film proteinowo białkowy.

Przez warstwę funkcjonalną mikrourządzenia rozumie się jedną lub kilka warstw wykonanych z elastomeru, w szczególności PDMS, które są położone pomiędzy dnem i wiekiem mikrourządzenia. W warstwie funkcjonalnej grawerowana jest struktura kanałów i komór przepływnych dla płynu i/lub nanoszona struktura przewodząca ładunki elektryczne.

Wielokrotne naświetlanie powierzchni skupioną wiązką lasera w różnych punktach podłoża prowadzi do powstania sieci kanałów o zmiennej geometrii, o prostych lub pofałdowanych ścianach, o zmiennej głębokości i szerokości, stykających się i krzyżujących pod dowolnym kątem, gwałtownie zwężających i rozszerzających, tworzących pęcherze i szyjki. W sposób bezpośredni możliwe jest uzyskanie kanałów o średnicy od 30 do 300 mikrometrów.

Sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego, według wynalazku jest wydajny, prosty i bezpośredni - kanały są bezpośrednio grawerowane w strukturze PDMS, a nie jest tworzona matryca, która dopiero służy do wytworzenia właściwych kanałów tak jak ma to miejsce w litografii miękkiej Sposób według wynalazku umożliwia wytworzenie mikrourządzenia w zautomatyzowany sposób dzięki prostej sekwencji powtarzalnych czynności, przez co znajduje zastosowanie do szybkiego wytwarzania urządzeń prototypowych jak i wielkoskalowej produkcji seryjnej. Nie wymaga stosowania pomieszczeń czystych (ang. clean room) oraz drogich urządzeń i odczynników chemicznych stosowanych w metodach wytwarzania układów MEMS, w szczególności nie wymaga przygotowania fotomasek oraz matryc replikacji. Umożliwia przygotowanie funkcjonalnego urządzenia mikronaczyniowego składającego się z: pojedynczej lub wielokrotnej cienkiej warstwy elastomeru, w szczególności PDMS z wygrawerowaną strukturą odwzorowującą w sposób dokładny fizyczną sieć naczyń krwionośnych, w szczególności zdegenerowaną na skutek zmian chorobowych, w postaci łączących i rozchodzących się oraz przecinających pod dowolnym kątem naczyń krwionośnych w szczególności mikronaczyń (arteriol, żyłek, naczyń włosowatych oraz ich kombinacji) o dowolnie zmiennym kształcie, średnicy i wysokości oraz komór i kanałów pomocniczych magazynujących, doprowadzających i odprowadzających płyny z sieci naczyń oraz elementów pomocniczych, w szczególności dna i wieka, zaopatrzonych w jeden lub więcej otworów i/lub portów przyłączeniowych dla kapilar doprowadzających i odprowadzających płyny z układu, jak również elementów przewodzących ładunki elektryczne, w szczególności elektrod, ścieżek przewodzących i sygnałowych oraz przyłączy dla układów pomiarowych.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania

P r z y k ł a d 1

Sposób wytworzenia urządzenia mikronaczyniowego do symulacji przepływu krwi w mikronaczyniach krwionośnych modelowego guza nowotworowego.

a) Projektowanie urządzenia

Na podstawie obrazu rastrowego struktury modelowej guza nowotworowego opracowanej na podstawie wyników symulacji komputerowych unaczynienia tkanek nowotworowych, przygotowywana została mapa układu naczyń krwionośnych, w szczególności mikronaczyń. W tym celu obraz w postaci pliku rastrowego wczytywany został do oprogramowania typu CAD w skali 1:1 na jedną z warstw rysunkowych. Następnie na wczytaną strukturę na kolejnej warstwie rysunkowej naniesione zostały linie i polilinie oraz wypełnione pola w kształcie prostokątów i trójkątów oraz okręgów o początkach i końcach umieszczonych w początkach i końcach naczyń krwionośnych uwidocznionych na obrazie rastrowym i oddające w sposób dokładny kształt naczyń. Naczynia krwionośne o różnej średnicy i głębokości odwzorowane zostały na różnych warstwach i przypisywane zostały im inne kolory z palety barw. W ten sposób uzyskano wektorową mapę mikrokanałów odpowiadającą w sposób dokładnych geometrii naczyń krwionośnych zobrazowanych na obrazie rastrowym, kodującą za pomocą kolorów średnicę i wysokość kanału. Do mapy mikrokanałów dorysowano na oddzielnej warstwie rysunkowej i w innym kolorze strukturę kanałów pomocniczych doprowadzających i odprowadzających płyny z sieci mikrokanałów oraz komory.

Na oddzielnej warstwie rysunkowej narysowano w skali 1:1 prostokątny kształt dna i wieka oraz otwory do których przyłączane będą kapilary doprowadzające i odprowadzające płyny z mikrourządzenia. Elementy dna i wieka przestrzennie pokrywały się z odpowiedniki zakończeniami kanałów na bezpośrednio przylegającej do nich warstwie funkcjonalnej.

Rysunek zaprojektowanego mikrourządzenia został bezpośrednio wyeksportowany ze środowiska graficznego CAD do środowiska pracy stacji grawerującej w sposób sekwencyjny kolejno dla każPL 219 444 B1 dej z warstw funkcjonalnych oraz dna i wieka mikrourządzenia, w ten sposób, że warstwy rysunkowe składające się na projekt jednej warstwy funkcjonalnej lub dna lub wieka mikrourządzenia zostały wyeksportowane jednocześnie, podczas gdy pozostałe warstwy rysunkowe były wyłączone.

b) Fabrykacja elementów mikrourządzenia

Warstwę funkcjonalną o grubości 100 mikrometrów wytworzono metodą powlekania obrotowego w powlekaczu obrotowym (ang. spin coater) w ten sposób, że mieszanina prepolimeru PDMS (polidimetylosiloksanu) i aktywatora polimeryzacji w stosunku wagowym 10:1 została odpowietrzona pod ₃ próżną, a następnie zadana w ilości 5 cm³ na wirujący z prędkością 700 obrotów na minutę w komorze roboczej powlekacza dysk o średnicy 100 mm wykonany z folii poliestrowej (folia do wydruków kserograficznych). Materiał był następnie wirowany przez 3 minuty, po czym zmniejszano stopniowo prędkość obrotową dysku przez 1 minutę do zera. W trakcie prowadzenia procesu powlekania w komorze powlekacza wytwarzane było nadciśnienie za pomocą doprowadzonego sprężonego, pozbawionego pyłów suchego powietrza. Następnie folia poliestrowa wraz z naniesioną warstwą elastomeru umieszczona została w szklanej szalce Petriego w suszarce szafkowej, w której zachodził proces polimeryzacji w temperaturze 60°C na okres trzech godzin. Następnie na powierzchnię polimeru naniesiono arkusz przylegającego papieru osłonowego (papier wagowy) w celu ochrony przed zabrudzeniem pyłami podczas grawerowania. Gotowe podłoże przechowywano w eksykatorze nad sitami molekularnymi 4A w atmosferze suchego powietrza o wilgotności względnej 1%.

Następnie podłoże grawerowano skupioną wiązką lasera CO₂ o długości fali 10.6 μm o mocy 30 wat w miejscach, w których zgodnie z projektem warstwa elastomeru miała zostać płytko grawerowana lub przecięta do powierzchni nośnika. W tym celu dla każdej linii o określonym kolorze przyporządkowano wektorowy tryb pracy stacji grawerującej oraz ustalono moc wiązki laserowej w zakresie 0,1-100% mocy znamionowej, częstotliwość impulsu w zakresie 100-1000 DPI, prędkość przesuwu głowicy laserowej w zakresie 0,00025 m/s - 0,25 m/s, jak również odległość płaszczyzny roboczej od punktu ogniskowania wiązki laserowej w zakresie 0,1-10 mm. W zależności od kombinacji parametrów uzyskano kanały o średnicach od 30 do 300 mikronów o głębokościach od 30 do 100 mikronów w wierzchniej warstwie PDMS, jak również możliwe było całkowite przecięcie podłoża dzięki czemu wycięto arkusz warstwy funkcjonalnej dopasowany do dna i wieka mikrourządzenia. Dla uzyskania komór o średnicy 5 mm zastosowano tryb rastrowy usuwając zbędny PDMS z wnętrza komory wiązką lasera. Dla uzyskania kanałów o średnicy powyżej 0,3 mm zastosowano tryb wektorowy. W tym trybie przecięto na obrzeżach kanału warstwę elastomeru do powierzchni nośnika, a następnie usunięto mechanicznie PDMS z wnętrza kanału za pomocą ostrego szpikulca pod mikroskopem stereoskopowym.

Dno mikrourządzenia wykonano ze szkła, a wieko z PMMA (polimetakrylanu metylu) w ten sposób, że arkusz materiału przecięto z wykorzystaniem skupionej wiązki lasera CO2 o mocy 30 wat otrzymując prostokątne arkusze o wymiarach 76x26 mm. W wieku wykonano otwory służące do przyłączenia kapilar doprowadzających i odprowadzających płyny.

c) Łączenie elementów mikrourządzenia

W celu przeniesienia warstwy elastomeru z nośnika oraz trwałego i szczelnego hydraulicznie połączenia z dnem mikrourządzenia usunięto z powierzchni elastomeru ochronny arkusz papieru osłonowego. Następnie warstwę funkcjonalną na nośniku z folii poliestrowej przemyto roztworem KOH ₃ w etanolu o stężeniu 40 g/dm³, po czym trzykrotnie przemyto wodą dejonizowanej i wysuszono w strumieniu czystego sprężonego powietrza . Następnie arkusz szkła (szkiełko mikroskopowe podstawowe) wyprażono w temperaturze 200°C w piecu, w atmosferze powierza w czasie 30 minut. Następnie warstwę funkcjonalną naświetlono w komorze UV promieniowaniem o długości fali 185 nm i 253,7 nm przez 1 minutę. Następnie oba elementy umieszczono i połączono w dopasowanym szablonie, przy czym temperatura szkła wynosiła 150°C. Po dociśnięciu elementów za pomocą wałka gumowego i usunięciu pęcherzy powietrza pomiędzy warstwami, zespół umieszczono na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze 120°C na okres 10 min, po czym elementy umieszczono w prasie hydraulicznej pod naciskiem 1 bara na okres 20 min. Następnie połączone elementy zanurzono na okres 5 sekund w izopropanolu, po czym usunięto nośnik poliestrowy z powierzchni elastomeru.

W celu trwałego i szczelnego wzajemnego połączenia warstwy funkcjonalnej z wiekiem mikrourządzenia wykonanym z PMMA oba elementy - zespół dna i warstwy funkcjonalnej oraz wieko naświetlono w komorze UV promieniowaniem o długości fali 185 nm i 253,7 nn i w atmosferze powietrza, przy czym powierzchnie podlegające łączeniu były skierowane bezpośrednio w kierunku źródła promieniowania UV. Następnie oba elementy pozycjonowano wzajemnie i połączono, po czym dociśnięto za pomocą wałka gumowego i umieszczono w prasie hydraulicznej pod naciskiem 1 bar na okres 10 minut.

PL 219 444 B1

d) Modyfikacja światła oraz wewnętrznej powierzchni mikrokanałów

W celu zmniejszenia pola powierzchni przekroju mikrokanałów przez ich wnętrze przetłoczono mieszaninę prepolimeru PDMS oraz aktywatora polimeryzacji w stosunku wagowym 10:1 z dodatkiem rozpuszczalnika - alkoholu amylowego w proporcjach wagowych 1:1, za pomocą pompy strzykawkowej. Mieszaninę przed podaniem do wnętrza kanałów odpowietrzono pod próżnią. Nadmiar mieszaniny z wnętrza kanałów usunięto poprzez odessanie nadmiaru za pomocą strzykawki, a następnie przetłaczano powietrze z natężeniem przepływu 1 ml/min. Następnie mikrourządzenie umieszczono na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze 75°C, a przez kanały przetłaczano w sposób ciągły powietrze z natężeniem 0,5 ml/min o temperaturze 75°C przez okres 2 godzin. W ten sposób otrzymano kanały o średnicy 15 mikrometrów.

Następnie wewnętrzną powierzchnię kanałów opłaszczono za pomocą wodnego roztworu kolagenu o stężeniu 7 mg/ml, w ten sposób że mieszaninę podano do wnętrza mikrokanałów, po czym niezwłocznie nadmiar mieszaniny z wnętrza kanałów usunięto poprzez odessanie za pomocą strzykawki, a następnie przetłoczono powietrze z natężeniem 3 ml/min przez okres 10 min w celu wysuszenia powierzchni mikrokanałów. W efekcie w kanałach utworzył się biokompatybilny film kolagenowy opłaszczający ich wewnętrzną powierzchnię.

P r z y k ł a d 2

Sposób wytworzenia trójwymiarowego (wielowarstwowego) urządzenia mikronaczyniowego do separacji składników krwi.

a) Projektowanie mikrourządzenia

W oprogramowaniu typu CAD w skali 1:1 na jednej z warstw rysunkowych naniesione zostały zgodnie z założeniami projektowymi linie i polilinie oraz wypełnione pola w kształcie prostokątów i trójkątów oraz okręgów. Mikrokanały o różnej średnicy i głębokości odwzorowywane zostały na różnych warstwach i przypisywane zostały im inne kolory z palety barw. W ten sposób uzyskano wektorową mapę mikrokanałów kodującą za pomocą kolorów średnicę i wysokość kanału. Do mapy mikrokanałów dorysowano na oddzielnej warstwie rysunkowej i w innym kolorze strukturę kanałów pomocniczych doprowadzających i odprowadzających płyny z sieci mikrokanałów oraz komory. Na oddzielnej warstwie rysunkowej narysowano w skali 1:1 narysowano układ elementów przewodzących prąd: elektrody oraz ścieżki przewodzące i przyłącza elektryczne za pomocą linii i polilini oraz wypełnionych pól w kształcie prostokątów, trójkątów oraz okręgów w różnym kolorze, tak aby ich położenie względem sieci mikrokanałów i kształt odpowiadały projektowanej strukturze.

Na oddzielnej warstwie rysunkowej narysowano w skali 1:1 prostokątny kształt dna i wieka oraz otwory do których przyłączane będą kapilary doprowadzające i odprowadzające płyny z mikrourządzenia oraz otwory do przyłączy elektrycznych. Elementy dna i wieka przestrzennie pokrywały się z odpowiednimi zakończeniami kanałów na bezpośrednio przylegającej do nich warstwie funkcjonalnej.

Rysunek zaprojektowanego mikrourządzenia został bezpośrednio wyeksportowany ze środowiska graficznego CAD do środowiska pracy stacji grawerującej w sposób sekwencyjny kolejno dla każdej z warstw funkcjonalnych oraz dna i wieka mikrourządzenia, w ten sposób, że warstwy rysunkowe składające się na projekt jednej warstwy funkcjonalnej lub dna lub wieka mikrourządzenia zostały wyeksportowane jednocześnie, podczas gdy pozostałe warstwy rysunkowe były wyłączone.

b) Fabrykacja elementów mikrourządzenia

Dwie warstwy funkcjonalne (jedna zawierająca mikrokanały i jedna zawierająca elektrody oraz ścieżki przewodzące) o grubości 50 mikrometrów każda, wytworzono metodą powlekania obrotowego w powlekaczu obrotowym (ang spin coater) w ten sposób, że mieszanina prepolimeru PDMS (polidimetylosiloksanu) i aktywatora polimeryzacji w stosunku wagowym 10 I została odpowietrzona pod ₃ próżną, a następnie zadana w ilości 5 cm³ na wirujący z prędkością 1200 obrotów na minutę w komorze roboczej powlekacza dysk o średnicy 100 mm wykonany z folii poliestrowej (folia do wydruków kserograficznych). Materiał był następnie wirowany przez 1 minutę, po czym zmniejszano stopniowo prędkość obrotową dysku przez 1 minutę do zera. W trakcie prowadzenia procesu powlekania w komorze powlekacza wytwarzane było nadciśnienie za pomocą doprowadzonego sprężonego pozbawionego pyłów suchego powietrza. Następnie folia poliestrowa wraz z naniesioną warstwą elastomeru umieszczona została w szklanej szalce Petriego w suszarce szafkowej, w której zachodził proces polimeryzacji w temperaturze 60°C na okres trzech godzin. Następnie na powierzchnię polimeru naniesiono arkusz przylegającego papieru osłonowego (papier wagowy) w celu ochrony przed zabrudzeniem podczas grawerowania laserowego. Gotowe podłoże przechowywano w eksykatorze nad sitami molekularnymi 4A w atmosferze suchego powietrza o wilgotności względnej 1%.

PL 219 444 B1

Następnie podłoże grawerowano skupioną wiązką lasera CO₂ o długości fali 10,6 μm o mocy 30 wat w miejscach, w których zgodnie z projektem warstwa elastomeru miała zostać powierzchniowo grawerowana lub przecięta do powierzchni nośnika. W tym celu dla każdej linii o określonym kolorze przyporządkowano wektorowy tryb pracy stacji grawerującej oraz ustalono moc wiązki laserowej w zakresie 0,1-100% mocy znamionowej, częstotliwość impulsu w zakresie 100-1000 DPI, prędkość przesuwu głowicy laserowej w zakresie 0,00025 m/s-0,25 m/s, jak również odległość płaszczyzny roboczej od punktu ogniskowania wiązki laserowej w zakresie 0,1-10 mm. W zależności od kombinacji parametrów uzyskano kanały o średnicach od 30 do 300 mikronów o głębokościach od 30 do 50 mikronów w wierzchniej warstwie PDMS, jak również możliwe było całkowite przecięcie podłoża dzięki czemu wycięto arkusz warstwy funkcjonalnej dopasowany do dna i wieka mikrourządzenia. Dla uzyskania kanałów o średnicy powyżej 0,3 mm oraz komór o średnicy 2 i 4 mm zastosowano tryb wektorowy. W tym trybie przecięto na obrzeżach kanału i komory warstwę PDMS do powierzchni nośnika, a następnie usunięto mechanicznie PDMS z wnętrza kanału oraz komór za pomocą ostrego szpikulca pod mikroskopem stereoskopowym.

Warstwę funkcjonalną na której rozmieszczone zostały ścieżki przewodzące oraz elektrody wykonano w ten sposób, że ich strukturę wg projektu wygrawerowano w podłożu w sposób opisany powyżej. Z obszarów z których została usunięta warstwa elastomeru wprowadzono mechanicznie za pomocą ostrza skalpela pastę przewodzącą prąd będącą mieszaniną prepolimeru PDMS oraz aktywatora polimeryzacji w stosunku wagowym 10:1 oraz węgla pierwiastkowego (carbon black) w stosunku wagowym 2:10 do PDMS. Następnie element umieszczono w suszarce szafkowej w temperaturze 60°C na okres 3 godzin.

Dno mikrourządzenia wykonano ze szkła, a wieko z PMMA (polimetaktylanu metylu) w ten sposób, że arkusz materiału przecięto z wykorzystaniem skupionej wiązki lasera CO2 o mocy 30 wat otrzymując prostokątne arkusze o wymiarach 76x26 mm. W wieku wykonano otwory służące do przyłączenia kapilar doprowadzających i odprowadzających płyny.

c) Łączenie elementów mikrourządzenia

W celu przeniesienia warstwy PDMS z nośnika oraz trwałego i szczelnego hydraulicznie połączenia warstwy funkcjonalnej zawierającej mikrokanały z dnem mikrourządzenia usunięto z powierzchni elastomeru ochronny arkusz papieru osłonowego. Następnie warstwę funkcjonalną na no₃ śniku z folii poliestrowej przemyto roztworem KOH w etanolu o stężeniu 40 g/dm³, po czym trzykrotnie przemyto wodą dejonizowanej i wysuszono w strumieniu czystego sprężonego powietrza. Następnie arkusz szkła (szkiełko mikroskopowe podstawowe) wyprażono w temperaturze 250°C w piecu, w atmosferze powierza w czasie 45 minut. Następnie warstwę funkcjonalną naświetlono w komorze UV promieniowaniem o długości fali 185 nm i 253,7 nm przez 1,5 minuty. Następnie oba elementy umieszczono i połączono w dopasowanym szablonie, przy czym temperatura szkła wynosiła 150°C. Po dociśnięciu elementów za pomocą wałka gumowego i usunięciu pęcherzy powietrza pomiędzy warstwami, zespół umieszczono na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze 150°C na okres 5 min, po czym elementy umieszczono w prasie hydraulicznej pod naciskiem 2 bar na okres 10 min. Następnie połączone elementy zanurzono na okres 5 sekund w izopropanolu, po czym usunięto nośnik poliestrowy z powierzchni elastomeru. W celu trwałego i szczelnego wzajemnego połączenia warstwy funkcjonalnej zawierającej mikrokanały oraz warstwy zawierającej ścieżki przewodzące i elektrody oraz warstwy funkcjonalnej zawierającej elektrody i ścieżki przewodzące z wiekiem wykonanym z PMMA przeprowadzono procedurę opisaną powyżej z tą różnicą, że łączonego arkusza tworzywa sztucznego lub warstwy funkcjonalnej nie wygrzewano w piecu, ale naświetlano obydwa elementy w komorze UV, po czym złączono obydwa elementy, dociśnięto za pomocą wałka gumowego i umie-szczono w prasie hydraulicznej pod naciskiem 1 bar na okres 30 minut.

d) Modyfikacja światła oraz wewnętrznej powierzchni mikrokanałów

W celu zmniejszenia pola powierzchni przekroju mikrokanałów do ich wnętrza podano mieszaninę prekursorów krzemionki, którą przygotowano w ten sposób, że równomolową mieszaninę tetraetyloortokrzemianu, tetrametyloortokrzemianu oraz etanolu i wody o pH 4,5 ogrzewano w temperaturze 200°C przez okres 10 min do czasu zaniku zmętnienia. Następnie umieszczono ją w komorze suszarki szafkowej w temp. 65°C na okres 12 godzin. Następnie mieszaninę zatłoczono do kanałów mikrourządzenia i ogrzewano do temperatury 100°C przez 10 sekund, po czym nadmiar mieszaniny usunięto z wnętrza kanałów poprzez przetłoczenie powietrza z natężeniem 0,5 ml/min przez okres 1 minuty. Następnie mikrourządzenie umieszczono na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze 200°C na okres 10 min. W ten sposób zredukowano średnicę kanałów do 20 mikrometrów.

Claims (8)

1. Sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego, znamienny tym, że w pierwszym etapie na podstawie zaprojektowanej mapy układu naczyń krwionośnych, w szczególności mikronaczyń, przygotowanej na podstawie zdjęcia fizycznej struktury, modelu matematycznego lub zgodnie z założeniami projektowymi, wytwarza się warstwy funkcjonalne oraz elementy i struktury pomocnicze, w tym celu podłoże w postaci warstwy elastomeru, przygotowuje się poprzez powlekanie obrotowe nośnika, w postaci folii poliestrowej oraz graweruje się struktury kanałów, po uprzednim osłonięciu powierzchni arkuszem ściśle przylegającego papieru osłonowego, poprzez naświetlanie skupioną wiązką lasera CO₃ o długości fali 10,6 μm, w drugim etapie łączy się warstwy funkcjonalne urządzenia wzajemnie lub z dnem oraz wiekiem urządzenia: warstwę funkcjonalną na nośniku z folii poliestrowej przemywa się w rozworze KOH w etanolu, naświetla się w komorze UV promieniowaniem o długości fali 185 nm i 253,7 nm, po czym łączy się z uprzednio wyprażonym w temperaturze nie niższej niż 200°C arkuszem szkła stanowiącym dno i złączoną strukturę umieszcza się na okres od 5 do 15 min na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze od 90 do 150°C, lub łączy się z uprzednio naświetloną w komorze UV powierzchnią z tworzywa sztucznego PMMA lub PC stanowiącą wieko urządzenia, po czym złączoną strukturę umieszcza się w prasie hydraulicznej pod naciskiem nie niższym niż 1 bar, po czym w obecności izopropanolu usuwa się podłoże i ponownie łączy elementy uprzednio naświetlone w komorze UV w jedną całość, a następnie w trzecim etapie modyfikuje się wewnętrzne powierzchnie mikrokanałów, za pomocą elastomeru, powłoki krzemianowej i/lub roztworów i zawiesin protein, glikoprotein, proteoglikanów lub kultur komórkowych.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako elastomer stosuje się polidimetyIosiloksan (PDMS).

3 Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w pierwszym etapie wytwarza się elementy pomocnicze, w szczególności elektrody, ścieżki sygnałowe i przewodzące ładunki elektryczne, w warstwach funkcjonalnych, dnie i wielu mikrourządzenia, w taki sposób, że w wygrawerowane laserowo puste przestrzenie i kanały wprowadza się mechanicznie substancję przewodzącą prąd, w szczególności mieszaninę PDMS i węgla, nanorurek węglowych lub proszku metalicznego w postaci pasty.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w drugim etapie połączone elementy umieszcza się w izopropanolu w celu ułatwienia zdjęcia folii poliestrowej, po czym usuwa się nośnik poliestrowy z powierzchni elastomeru.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trzecim etapie modyfikuje się średnicę kanałów za pomocą elastomeru: w wygrawerowane laserowo puste przestrzenie i kanały wprowadza się mieszaninę prepolimeru i aktywatora polimeryzacji, usuwa się nadmiar elastomeru a następnie przetłacza się powietrze, po czym urządzenie umieszcza się na termostatowanej płycie grzejnej, a przez kanały przetłacza się w sposób ciągły powietrze przez okres dwóch godzin w temperaturze 60°C.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że do mieszaniny prepolimeru i aktywatora polimeryzacji dodaje się rozpuszczalnik obniżający lepkość mieszaniny.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trzecim etapie zmniejsza się średnicę kanałów poprzez podanie do ich wnętrza prekursorów krzemionki, oraz etanolu i wody o kwaśnym odczynie i ogrzewa się do temperatury 100°C przez okres od 5 do 60 sekund, po czym nadmiar mieszaniny usuwa się z wnętrza kanałów poprzez przetłoczenie powietrza pod niewielkim ciśnieniem, a następnie urządzenie umieszcza się na termostatowanej płycie grzejnej w temp 200°C w celu utwardzenia warstwy krzemionki opłaszczającej wewnętrzną powierzchnię mikrokanałów.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trzecim etapie zatłacza się do kanałów roztwory i zawiesiny protein, glikoprotein, proteoglikanów lub kultur komórkowych, a następnie usuwa się ich nadmiar poprzez przetłoczenie powietrza i suszy przez okres od 1 do 15 minut, w wyniku czego na ich powierzchni tworzy się biokompatybilny film proteinowo białkowy.