PL219970B1 - Sposób izolacji laktonów z hodowli mikroorganizmów - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji laktonów z hodowli mikroorganizmów, zwłaszcza grzybów strzępkowych z rodzaju Trichoderma i Aspergillus oraz drożdży z rodzaju Rhodotorula.

Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym do otrzymywania komponentów zapachowych oraz w przemyśle spożywczym do otrzymywania aromatów i wzmacniaczy smaku m.in. w napojach, jogurtach, serach, wyrobach cukierniczych. Wynalazek także może znaleźć zastosowanie w przemyśle chemicznym do otrzymywania wzorca analitycznego, np. do oznaczeń chromatograficznych.

W ostatnim czasie, w związku ze zwiększonym zapotrzebowania na produkty naturalne, wzrasta zainteresowanie pozyskiwaniem związków aromatycznych. Tradycyjnie, takie związki pozyskiwanie są z roślin, ale występują one w niskich stężeniach, poza tym ich produkcja ma charakter sezonowy i zależna jest od czynników środowiskowych (warunki klimatyczne, geograficzne, choroby roślin). Z kolei związki aromatyczne, otrzymane w wyniku syntezy chemicznej, określane są jako sztuczne i przez to nie są doceniane przez konsumentów.

Ciekawą alternatywną wydaje się być produkcja metabolitów lotnych przez mikroorganizmy. Pozyskane w ten sposób związki uznawane są za substancje naturalne (Dastager S.G., 2009. Aroma Compounds. Singh nee' Nigam P., Pandey A. (eds.), w Biotechnology for Agro-Industrial Residues Utilisation, rozdz. 6, str. 105-238, DOI 10.1007/978-1-40209942-7 6, S pringer Science Business Media B.V.). Do naturalnych związków aromatycznych, o trwałej strukturze należą γ- i δ-laktony, syn. 4- i 5-alkanolidy (penta-, heksa-, hepta-, okta-, nona-, deka-, undeka-, dodeka- nasycone i nienasycone). Wśród mikroorganizmów zdolnych do produkcji naturalnych związków aromatycznych, o trwałej strukturze, najczęściej wymienia się grzyby strzępkowe m.in. z rodzaju Trichoderma, Aspergillus, Monilia i Fusarium oraz drożdże m.in. z rodzaju Candidia, Saccharomyces, Rhodotorula, Yarrowia, Kloeckera, Sporidiobulus, Pichia. Laktony są przedmiotem opracowań wielu syntez chemicznych i sposobów izolowania ze źródeł naturalnych, głównie, ze względu na interesujące właściwości sensoryczne oraz zapachowe. Do laktonów o znaczeniu przemysłowym można zaliczyć, między innymi te o zapachu brzoskwiniowym, kremowym, kokosowym, czy orzechowym. Ich ważną, pozytywną cechą jest niski próg wyczuwalności (rzędu dziesiątych części ppm) (Janssens L. i wsp., 1992. Production of flavors by microorganisms. Process Biochem., 27: 195-215, Endrizzi A., Pagot Y., 1996. Production of lactones and peroxisomal beta-oxidation in yeasts. Critical Rev. Biotech., 16(4):301-329; Haarmann

I. L.G., 1997. Biotechnological production of flavour-active lactones. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnol., 55: 221-238, T. Scheper (eds.), Springer-Verlag Belin Heidelberg 1997).

Do laktonów lotnych z parą wodną, należą między innymi, nienasycone δ-laktony (5-alkanolidy), wśród których największe zainteresowanie wzbudza biosynteza 6-pentylu-a-pironu (syn. 6PAP, 6PP, 6-n-pentylo-2H-piran-2-on, 6-amylo-a-piron). Ze względu na intensywnie kokosowy zapach ma on znaczenie jako ważny składnik zapachowy w produkcji żywności (Parker S.R. i wsp., 1999. Spectrum of activity of antifungal natural products and their analogs. W “Biologically active natural products: agrochemicals”, Edrs Cutler H.G., Cutler S.J., Wyd. CRC Press LLC, Boca, Raton, London, New York, Washington, D.C.; Spencer, M.D. i wsp., 1978, Occurrence of 6-pentyl-a-pyrone in peach essence.

J. Food Sei. 36, 536), kosmetyków (Horvat R.J. i wsp., 1990. Comparison of the volatile compounds from several commercial peach cultivars. J. Agricul. Food Chem., 38(1): 234-237; Hui Y.H. i Clark S., 2007. Handbook of Food Products Manufacturing: Principles, bakery, beverages, str. 187, Wiley Interscience), czy też produktów farmaceutycznych (Janssens L. i wsp., 1992. Production of flavors by microorganisms. Process Biochem., 27: 195-215; Rocha-Valadez J.A. i wsp., 2006. Fromshake flasks to stirred fermentors: Scale-up of an extractive fermentation process or 6-pentyl-a-pyrone production by Trichoderma harzianum using volumetric power input. Process Biochem., 41: 1347-1352).

Znane są również laktony o właściwościach grzybobójczych. Wśród nich można wymienić δ- i γ-dekalaktony aktywne w stosunku do dermatofitów takich jak Trichophyton rubrum i Candida albicans (Kalinowska K i wsp., 2010, Aktywność przeciwgrzybicza in vitro laktonów, ketonów oraz dioli. Mikol. Lek., 17 (4); 217-220), czy też δ-lakton 6PAP aktywny wobec szeregu fitopatogenów, takich jak Botrytis cinerea (Pezet R. i wsp., 1999. Simple analysis of 6-pentyl-a-pyrone, a major antifungal metabolite of Trichoderma spp., useful for testing the antagonistic activity of these fungi. Phytochem. Anal., 10: 285-288), Chaetomium spp., Curvularia lunata, Aspergillus flavus, Escherichia coli (Cutler H.G. i wsp., 1986. 6-pentyl-a-pyrone from Trichoderma harzianum inhibitory and antimicrobial properties. Agric. Biol., Chem., 50: 2943-2945), Rhizoctonia solani, Fusarium oxy-sporum (Scarselletti R.

PL 219 970 B1 i Fauli J.L., 1994. In vitro activity of 6-pentyl-a-pyrone, a metabolite of Trichoderma harzianum in the inhibition of Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Mycol. Res., 98: 1207-1209).

Znaną metodą izolacji laktonów z kultur mikroorganizmów, na skalę laboratoryjną, jest ekstrakcja przy zastosowaniu rozpuszczalników organicznych. Jest to metoda czaso- i pracochłonna, a do tego bardzo kosztowna.

Jedną z najczęściej wykorzystywanych technik jest ekstrakcja periodyczna. W pierwszym etapie następuje oddzielenie komórek od płynu pohodowlanego (do tego etapu wymagane są m.in. lejki, sączki jakościowe, kolbki Erlenmayera). Otrzymany płyn pohodowlany poddaje się min. 3-krotnej ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym (do tego etapu wymagany jest rozpuszczalnik, np. octan etylu, eter dietylowy, aceton oraz rozdzielacz). W kolejnym etapie następuje osuszenie rozpuszczalnika (np. nadbezwodnym siarczanem sodu), odsączenie (sączki Whatmana, lejki) i jego odparowanie (do tego etapu wymagana jest m.in. wyparka próżniowa). Otrzymany surowy ekstrakt oczyszcza się przy zastosowaniu preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej PTLC (do tego etapu wymagane są m.in. płytki chromatograficzne, komora chromatograficzna, rozpuszczalniki np. dichlorometan, metanol, lampa UV do wizualizacji chromatogramu) lub chromatografii kolumnowej (kolumna, złoża chromatograficzne, np. krzemowe, rozpuszczalniki organiczne np. eter dietylowy, heksan, aceton, chlorek metylenu) i poddaje analizie jakościowej i ilościowej. Ilościowe i jakościowe oznaczenie lotnych metabolitów grzybowych zazwyczaj wykonywane jest przy pomocy chromatografii gazowej (GC) lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Stosując w/w technikę ekstrakcji z płynnej hodowli, na przykład grzybów Trichoderma spp., można uzyskać 100 pg laktonu 6PAP / ml. (Pezet i wsp., 1999, Simple analysis of 6-pentyl-a-pyrone, a major antifungal metabolite of Trichoderma spp., useful for testing the antagonistic activity of these fungi. Phytochem. Anal., 10; 285-288; Vinale F. i wsp., 2008. A novel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants. Physiological and Molecular Plant Pathology 72: 80-86, Alchihab M. i wsp., 2009, Production of γ-Decalactone by a Psychrophilic and a Mesophilic Strain of the Yeast Rhodotorula aurantiaca. AppI Biochem Biotechnol., 158:41-50).

Celem wynalazku było opracowanie metody izolacji laktonów z hodowli mikroorganizmów, która byłaby prosta, a zarazem ekonomiczna i ekologiczna - przyjazna dla środowiska i dla bezpieczeństwa pracy oraz zdrowia ludzkiego.

Istotą wynalazku jest, że otrzymaną, według znanej metody, hodowlę poddaje się bezpośrednio destylacji z parą wodną, na aparacie Derynga, przez okres co najmniej 45 minut. Następnie zbiera się wydestylowany produkt i poddaje analizie GC-MS. W celu odzyskania minimalnych ilości produktu, jako fazę organiczną, do aparatu Derynga wprowadza się, co najmniej 0,5 ml dowolnego rozpuszczalnika organicznego, o gęstości mniejszej niż 1 g/ml, lotnego i nierozpuszczalnego w wodzie.

Korzystnie jest, gdy laktonami są δ-laktony, zwłaszcza 6-pentylo-a-piron.

Korzystnie także jest, gdy rozpuszczalnikiem organicznym jest cykloheksan i/lub n-alkany od C-5 do C-7 i/lub eter dietylowy i/lub eter diizopropylowy.

Korzystnie także jest, gdy mikroorganizmami są grzyby strzępkowe, zwłaszcza z rodzaju Trichoderma albo Aspergillus lub drożdże, zwłaszcza z rodzaju Rhodotorula.

Czystość produktu wg GC > 98%, natomiast wydajność odzysku wynosi > 98%.

Zaletą sposobu izolacji laktonów jest to, że pozwala on na pominięcie, między innymi, wielokrotnej ekstrakcji oraz oczyszczania surowego ekstraktu przy użyciu preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej (płytki PTLC) czy kolumnowej.

Tym samym eliminuje konieczność użycia rozpuszczalników organicznych, środka suszącego, specjalistycznego sprzętu i materiałów, takich jak rozdzielacz, bioreaktor, wyparka próżniowa, kolumny i złoża chromatograficzne, lejki, sączki filtracyjne. Jest to sposób prosty, a zarazem ekonomiczny i ekologiczny - przyjazny dla środowiska i dla bezpieczeństwa pracy oraz zdrowia. Nadaje się do zastosowania bez rozbudowanego zaplecza chemicznego czy biochemicznego, np. w mikrobiologii czy fitopatologii.

Bardziej uniwersalnym zastosowaniem metody może być wykorzystanie jej jako szybkiej i prostej oceny przydatności szeregu szczepów do produkcji związków lotnych z parą wodną, zwłaszcza z hodowli mikroorganizmów zawierających wieloskładnikowe mieszaniny metabolitów. Ze względu na oczyszczenie surowego ekstraktu z nielotnych metabolitów ułatwiona jest bardzo identyfikacja związku (możliwość przeprowadzenia bezpośredniej analizy GC/MS, bez obawy uszkodzenie nielotnymi

PL 219 970 B1 metabolitami kolumny GC/MS) czy potwierdzenie struktury metodą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

P r z y k ł a d 1: 100 ml sterylnej pożywki Czapka inokuluje się zawiesiną zarodników konidialnych Trichoderma viride nr 1. Kolbki inkubuje się w temp. 27°C w warunkach intensywnego napowietrzania (150 rpm, amplituda 5) przez 14 dni. Uzyskaną hodowlę przenosi się do kolby okrągłodennej o objętości 500 ml i ogrzewając w koszu grzejnym, destyluje się z parą wodną na aparacie Derynga. Jako fazę organiczną dodaje się 1 ml cykloheksanu. Destylację prowadzi się przez 1 godzinę. Po jej zakończeniu zbiera się fazę organiczną, w której znajduje się końcowy produkt - 6PAP. Otrzymaną próbkę poddaje się analizie metodą chromatografii gazowej zestawionej z detektorem mas (GC-MS, Saturn 2000 Varian Chrompack), używając kolumny TRACE TR-5 (5% fenylometylopolisiloksanu) o wymiarach 30 m x 0,53 mm x 0,25 pm. Jony cząsteczkowe i fragmentacyjne otrzymuje się metodą jonizacji elektronami (El, 70 eV). Użytym gazem nośnym był hel; przepływ 1 ml/min, stosunek strumienia dzielonego 1:20. Program gradientu był następujący: 80°C przez 0 min, narost 5°C/min 80-200°C, narost 25°C/min 200-280°C i 5 min w temp. 280°C. Objętość nastrzykiwanej próbki wynosiła 1 pl. Stosując powyższą procedurę otrzymuje się 110 pg 6PAP na 1 ml hodowli. Czystość produktu wg GC> 98%.

P r z y k ł a d 2: 100 ml stałego podłoża PDA rozlewa się na 5 płytek Petriego. Zestalone podłoże inokuluje się szczepem Trichoderma harzianum nr 1 i inkubuje się w temp. 27°C w warunkach stacjonarnych przez 7 dni. Wszystkie płytki z hodowlą badanego szczepu wprowadza się następnie do kolby okrągłodennej o objętości 500 ml, dodaje 20 ml wody destylowanej i dalej postępuje się jak w przykładzie 1. Stosując powyższą procedurę otrzymuje się 115 pg 6PAP/1 ml. Czystość produktu wg GC> 98%.

P r z y k ł a d 3: 100 g sterylnych wysłodków buraczanych inokuluje się zawiesiną zarodników konidialnych, po czym dokładnie miesza. Hodowlę inkubuje się w temp. 27°C w warunkach stacjonarnych przez 14 dni. Po tym czasie całość hodowli wprowadza się do kolby okrągłodennej o objętości 500 ml, dodaje 100 ml wody destylowanej i dalej postępuje się jak w przykładzie 1. Stosując powyższą procedurę otrzymuje się 46 pg 6PAP/1 g hodowli. Czystość produktu GC> 88%.

P r z y k ł a d 4: 100 ml sterylnej pożywki Czapka inokuluje się zawiesiną zarodników konidialnych Aspergillus niger nr 1 i dalej postępuje się jak w przykładzie 1. Hodowlę prowadzono przez 10 dni. Stosując powyższą procedurę otrzymuje się 53 pg 6PAP/1 ml hodowli. Czystość produktu GC> 98%.

P r z y k ł a d 5: 100 ml sterylnego ekstraktu drożdżowego inokuluje się zawiesiną drożdży Rhodotorula glutinis. Hodowlę prowadzi się w temp. 27°C w warunkach intensywnego napowietrzania (150 rpm, amplituda 5) przez 7 dni. Uzyskaną hodowlę przenosi się do kolby okrągłodennej o objętości 500 ml i dalej postępuje się jak w przykładzie 1. Stosując powyższą procedurę otrzymuje się 90 pg 6PAP /1 ml hodowli. Czystość produktu GC> 98%.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób izolacji laktonów z hodowli mikroorganizmów, znamienny tym, że otrzymaną, według znanej metody, hodowlę poddaje się bezpośrednio destylacji z parą wodną, na aparacie Derynga, przez okres co najmniej 45 minut, następnie zbiera się wydestylowany produkt i poddaje analizie GC-MS, przy czym, w celu odzyskania minimalnych ilości produktu jako fazę organiczną, do aparatu Derynga, wprowadza się co najmniej 0,5 ml dowolnego rozpuszczalnika organicznego, o gęstości mniejszej niż 1 g/ml, lotnego i nierozpuszczalnego w wodzie.
2. 2. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że laktonami są δ-laktony.
3. 3. Sposób, według zastrz. 2, znamienny tym, że δ-laktonem jest 6-pentylo-a-piron.
4. 4. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalnikiem organicznym jest cykloheksan i/lub n-alkany od C-5 do C-7 i/lub eter dietylowy i/lub eter diizopropylowy.
5. 5. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmami są grzyby strzępkowe, zwłaszcza z rodzaju Trichoderma albo Aspergillus.
6. 6. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmami są drożdże, zwłaszcza z rodzaju Rhodotorula.