PL220139B1 - Oligonukleotydy do wykrywania i różnicowania opornych i wrażliwych na Oseltamivir szczepów wirusa grypy - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa primerów oraz sond służących do powielenia fragmentów genu białka NA o długości około 172 nukleotydów zawierającego miejsce mutacji odpowiedzialnej za nabycie oporności na oseltamivir (Fig.1). Wynalazek obejmuje rownież zastosowanie sekwencji nukleotydowej primerów oraz sond do powielenia fragmentu genu białka NA o długości około 172 nukleotydów zawierającego miejsce mutacji odpowiedzialnej za nabycie oporności na lek przeciwwirusowy.

Description

Przedmiotem wynalazku jest jakościowa metoda diagnostyczna oparta o technikę real-time PCR, służąca do detekcji wirusa grypy (Influenza Virus, IV) i określania jego oporności lub podatności na popularny lek przeciwwirusowy - oseltamivir, a także nukleotydy nadające się do analizy wirusa. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie nukleotydów (primerów i sondy) do wykrywania mutacji odpowiedzialnej za wrażliwość na oseltamivir.

Wirus grypy typu A (Influenza A virus, lAV) należy do rodziny Orthomyxoviridae i jest jednym z najczęściej występujących patogenów infekujących każdego roku miliony ludzi oraz zwierząt (zwłaszcza ptaków). Wiriony przyjmują kształt sferyczny lub filamentarny, a materiał genetycznym wirusa stanowi jednoniciowe segmentowane RNA o ujemnej polarności. Ta cecha sprzyja dużej zmienności genetycznej wirusa, która następuje na drodze mutacji punktowych (dryftu antygenowego) oraz reasortacji (skoku antygenowego).

Ze względu na dużą zmienność wirusa posiada on duży potencjał wywoływania lokalnych epidemii oraz pandemii na skalę światową. W XX wieku miały miejsce trzy takie wydarzenia, które pochłonęły dziesiątki milionów ofiar.

Wirusy grypy A są szeroko rozpowszechnione wśród różnych populacji ptaków na całym świecie - zarówno dzikich jak i domowych czy nawet ozdobnych [Esterday et al., 1998]. Jednak wirus patogenny dla jednego gatunku może powodować bezobjawowe przejście choroby w innych organizmach [Webster, 1997].

Najważniejszym rezerwuarem wszystkich szczepów wirusa jest ptactwo dzikie, wodne, wędrowne, u których infekcje wirusowe przechodzą bezobjawowo. Stanowią one główne źródło zakażenia ptactwa domowego jak i innych zwierząt [Webster, 2002; Esterday et al., 1998]. Podejrzewa się, że wszystkie szczepy infekujące ssaki, w tym ludzi, pochodzą od szczepów wirusów ptasich i w drodze adaptacji i mutacji uzyskały zdolność infekowania innych organizmów [Webster, 2002]. Zakażenia ptaków dzikich następują najczęściej bezobjawowo na drodze kontaktu bezpośredniego z innym chorym zwierzęciem lub poprzez kontakt z materiałem zawierającym wirusa np. odchodami [Webster, 2002].

Wirus ptasiej grypy bytuje w środowisku, a jego przetrwanie przedłużają otaczające go cząstki organiczne np. kał. Infekcyjność wirusa zawartego w kale w temperaturze 4°C wynosi około 30-35 dni, w temperaturze 20°C nawet 7 dni. Jeden gram odchodów zawierający ponad miliard kopii wirusowego RNA jest w stanie zakazić około 1 miliona ptaków. Jednak stosowane środki dezynfekcyjne niszczą wirusa ze 100% skutecznością [ECHCPD, 2003]. Zakażenia wśród ludzi następują na ogół drogą kropelkową [WHO, 2008a].

Różnorodność serotypów wirusa wiąże się z różną wirulencją poszczególnych szczepów. Możliwy jest jednak podział na wirusy o wysokiej zjadliwości (HPAl - Highly Pathogenic Avian Influenza) oraz wirusy o niskiej zjadliwości (LPAI - Low Pathogenic Avian Influenza). Do pierwszej grupy zaliczacza się wirusy o sereotypie H5 i H7, których pojawienie się w stadzie prowadzi najczęściej do 100% śmiertelności. Do LPAI zalicza się wszystkie pozostałe podtypy wirusa. Obecność wirusa tego typu w organizmie nie objawia się lub objawia w niewielkim stopniu.

To czy dany szczep jest silnie zjadliwy czy nie jest uzależnione od łatwości cięcia proteolitycznego hemaglutyniny podczas infekcji na etapie endosomalnym. Wirusy stają się zjadliwe w wyniku mutacji. Tak stało się np. z wirusem H7N1, który ze słabo zjadliwego zmutował w wysoko złośliwy. Pierwszy raz zidentyfikowano ten wirus jako wysoce patogenny na fermach włoskich w latach 1999-2000 [ECHCPD, 2003].

Objawy kliniczne u ptaków są różne w zależności od typu wirusa oraz gatunku zwierzęcia. Infekcje wirusem o wysokiej zjadliwości HPAI charakteryzuje się ostrym i ciężkim przebiegiem, objawami ze strony układu oddechowego, pokarmowego oraz nerwowego. Śmiertelność jest bardzo wysoka i często osiąga 100% [Subbarao et al., 1998].

Wirusy o niskiej zjadliwości (LPAI) powodują łagodne objawy ze strony układu oddechowego, czasami wpływają na obniżenie nieśności jaj, a wielokrotnie ptactwo nie wykazuje żadnych symptomów chorobowych [Alexander, 1993].

U ludzi objawy kliniczne grypy to wysoka gorączka oraz objawy ze strony dróg oddechowych. Infekcje wirusowe często połączone są z zapaleniami tchawicy i oskrzeli. Pierwsze symptomy widoczne są już po 1-4 dniach od wniknięcia wirusa [WHO, 2008a].

PL 220 139 B1

Każdego roku grypa dotyka około 5-15% populacji ludzkiej i powoduje od 250 do 500 tysięcy zgonów w wyniku powikłań zwłaszcza u dzieci i osób starszych. Dwa najważniejsze szczepy krążące w populacji ludzkiej to H3N2 i H1N1 [WHO, 2008a]. W Polsce w 2005 roku na grypę zachorowało ponad 730 tys. osób [GUS, 2007].

Wirus grypy infekuje rocznie od 300 do 900 milionów ludzi na świecie. Większość przypadków nie wymaga specjalistycznego leczenia, gdyż choroba zostaje zwalczona przez układ odpornościowy gospodarza. Jednak, co roku zdarzają się powikłania związane z wirusem grypy i liczne zgony. Na największe zagrożenie narażone są osoby w wieku starszym i dzieci, a także osoby z osłabionym układem odpornościowym [WHO, 2008a].

Jak do tej pory nie stworzono w pełni skutecznego leku przeciw wirusowi grypy. Opracowane zostały dwa typy leków hamujących rozwój wirusa w organizmie. Pierwsza grupa stanowi inhibitory kanału jonowego M2. Są to przede wszystkim amantadyna, metylowa pochodna rimantydyny oraz rzadziej stosowana rybawiryna. Leki te stosowane są nie tylko w celach leczniczych, ale także w profilaktyce. Niestety wirus bardzo szybko mutuje i staje się niewrażliwy na leki tej generacji. Szacuje się, że 80% izolowanych wirusów jest już kompletnie nie podatna na działanie tego leku [Beigel, 2008].

Do drugiej grupy zalicza się leki będące kompetycyjnymi inhibitorami neuramimdazy. Przykładem są zanamivir (Relenaza®) oraz oseltamivir (Tamiflu®) [McKimm-Breschkin et al., 2001]. Są to leki nowej generacji rekomendowane przez Komitet Doradztwa ds. Szczepień (ACIP). Leki te są skuteczne zarówno w walce z wirusem grypy typu A jak i typu B, jednak podane muszą zostać do 48 godzin po stwierdzeniu infekcji tym patogenem [de Clercq, 2006]. Skuteczność tych leków została wielokrotnie potwierdzona m.in poprzez stosowanie ich, w walce z wirusem H7N7 w Chinach i Belgii oraz w walce z mutantem wirusa H5N1 zakażającym ludzi w Chinach w marcu 2003 roku [Brydak, 2004]. Jednak coraz więcej szczepów charakteryzuje się opornością na oseltamivir i przez to znacznie utrudnione jest leczenie pacjentów zainfekowanych takim szczepem. Jak wykazano oporność na lek wirus uzyskuje w wyniku pojedynczej mutacji w genie kodującym białko neuraminidazę skutkującą mutacją w pozycji 275 - zamianą Histydyny w tyrozynę (H275Y).

Najskuteczniejszym sposobem walki z wirusem i powikłaniami wywoływanymi przez niego są szczepienia ochronne. Niestety ze względu na dużą zmienność wirusa konieczne jest coroczne szczepienie się preparatem przeciw wirusowi aktywnemu w danym sezonie. Wiąże się to z koniecznością produkcji nowej szczepionki każdego roku. Czas potrzebny na wyprodukowanie działającego preparatu to około 6 miesięcy, a zdolności produkcyjne szacowane są na około 250 milionów dawek rocznie, przy zapotrzebowaniu około 2-3-krotnie większym. Obecnie stosuje się dwa rodzaje szczepionek; inaktywowane oraz atenuowane. Wyzwaniem jest stworzenie aktywnej szczepionki rekombinowanej, której produkcja będzie znacznie szybsza i mniej pracochłonna [Kamble, et al. 2003].

W Polsce szczepienia przeciw grypie figurują w kalendarzu szczepień od 1994 roku, ale jako zalecane, a nie obowiązkowe [Gerdil, 2003].

Metody diagnostyczne określające wrażliwość wirusa grypy na oseltamivir zostały opisane w wielu publikacjach.

Chutinimitkul et al. (Chutinimitkul, S., K. Suwannakarn, T. Chieochansin, Q. Mai le, S. Damrongwatanapokin, A. Chaisingh, A. Amonsin, O. Landt, T. Songserm, A. Theamboonlers, and Y. Povorawan. 2007. H5N1 oseltamivir-resistance detection by real-time PCR using two high sensitivity labeled

TaqMan probes. J. Virol. Methods 139: 44-49.), Hindiyeh et al. (Hindiyeh M, Ram D, Mandelboim M, Meningher T, Hirsh S, Robinov], Levy V, Orzitzer S, Azar R, Grossman Z, Mendelson E. 2010. Rapid detection of influenza A pandemic (H1N1) 2009 virus neuraminidase resistance mutation H275Y by real-time reverse transcriptase PCR J Clin Microbiol. 48(5):1884-7.) czy Payungporn et al. (Payungporn, S., Poomipak, W., Makkoch, J., Rianthavorn, P., Theamboonlers, A., Poovorawan, Y. 2011. Detection of oseltamivir sensitive/resistant strains of pandemic influenza A virus (H1N1) from patients admitted to hospitals in Thailand. J Virol Methods. 177(2): 133-139.) opisali metodę real-time RT-PCR z wvkorzystaniem dwóch sond typu TaqMan. Sondy zostały zaprojektowane zarówno do wariantu dzikiego (opornych na Oseltamiwir) jak i wariantu opornego. Jednak konieczność wykorzystania dwóch sond powoduje zwiększenie kosztów analizy.

Tong et al. (Tong, S.Y.C., Dakh, F., Hurt, A.C., Deng, Y-M., Freeman, K., Fagan, P.K., Barr,

I.G., Giffard, F.M. 2011. Rapid Detection of the H275Y Oseltamivir Resistance Mutation in Influenza A/H1N1 2009 by Single Base Pair RT-PCR and High-Resolution Melting. PLoS One. 6(6): e21446.) zaprezentowali metodę opartą o technikę HRM, jednak jak podają sami autorzy metoda ta narażona jest na wyniki fałszywe i trudno jest rozróżnić szczepy wrażliwe od opornych w przypadku niskiego

PL 220 139 B1 miana wirusa (przy Ct>30). Podobnie Lee et al. Lee, H.K., Lee, C.K., Loh, T.P., Tang, J.W-T, Tambyah, P.A., Siew-Chuan Koay, E. 2011. High-Resolution Melting Approach to Efficient Identification and Quantification of H275Y Mutant Influenza H1N1 2009 Virus in Mxed-Virus-Population Samples. J Clin Microbiol 2011 October; 49(10): 3555-3559.) zaprezentowali metodę opartą o HRM. Jednak wady tej metody pozostały.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie narzędzi, które mogłyby zostać wykorzystane do szybkiego analizowania wrażliwości wirusa i podatności na leczenie lekiem przeciwwirusowym, korzystnie oseltamivirem.

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa primerów (starterów) oraz sondy służących do powielania oraz wykrywania fragmentów genu białka NA o długości około 172 nukleotydów zawierającego miejsce mutacji (823 nukleotyd odpowiedzialnej za nabycie oporności na oseltamivir mutacja H275Y (numeracja N1) - (Fig. 1).

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie sekwencji nukleotydowej primerów oraz sond (Fig. 1A) do powielania fragmentu genu białka NA o długości około 172 nukleotydów i wykrywania mutacji odpowiedzialnej za nabycie oporności na lek przeciwwirusowy korzystnie oseltamivir. Wykrywanie mutacji prowadzi się metodą opartą o technikę real-time PCR z zastosowaniem sondy hydrolizującej (typu TaqMan, Fig. 1B), charakteryzującą się tym, że przeprowadza się reakcję real-time PCR w warunkach: denaturacja wstępna 1 x: 94°C 10 min.; 45 cykli: denaturacja 94°C 10 sek., hybrydyzacja, elongacja 72°C i analizuje się produkty reakcji poprzez analizowanie wykresu w czasie rzeczywistym i po zakończeniu reakcji, korzystając z oprogramowania dołączonego do aparatur. Korzystnie gdy DNA matrycowym jest cDNA wirusa grypy uzyskane w wyniku izolacji wirusowego RNA z materiału środowiskowego (np. wymazu z gardła), a następnie poddane reakcji odwrotnej transkrypcji z wykorzystaniem metody RT-PCR, korzystnie gdy temperatura hybrydyzacji wynosi od 50 do 60°C a czas od 10 do 20 sek., korzystnie gdy elongacja trwa od 1 do 10 sekund.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie sekwencji nukleotydowej primerów (Fig. 1A) do powielania odcinka genu o długości około 172 par zasad i wykrywania mutacji odpowiedzialnej za nabycie oporności na lek przeciwwirusowy, korzystnie oseltamivir. Wykrywanie mutacji prowadzi się metodą opartą o technikę real-time PCR z wykorzystaniem sondy hydrolizującej (typu TaqMan, Fig. 1B), charakteryzującą się tym, że przeprowadza się reakcję reverse transcriptase Realtime PCR (RRT-PCR) w warunkach: odwrotna transkrypcja 1 x: 61°C 20 min.; denaturacja wstępna 1 x: 94°C 30 sek.; 45 cykli: denaturacja 94°C 10 sek., hybrydyzacja, elongacja 72°C i analizuje się produkty reakcji poprzez analizowanie wykresu w czasie rzeczywistym i po zakończeniu reakcji, korzystając z oprogramowania dołączonego do aparatury. Korzystnie gdy RNA matrycowym jest RNA wirusa grypy uzyskane w wyniku izolacji z materiału środowiskowego (np. wymazu z gardła), korzystnie gdy czas dentauracji wstępnej wynosi od 2 do 10 sek., korzystnie gdy temperatura hybrydyzacji wynosi od 50 do 60°C a czas od 10 do 20 sek., korzystnie gdy elongacja trwa od 5 do 20 sekund.

Załączone figury - pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku:

Fig. 1 (a i b) - przedstawia Sekwencje primerów oraz sondy używanych do powielenia fragmentu genu NA o długości około 172 nukleotydów zawierającego miejsce mutacji odpowiedzialnej za nabycie oporności na oseltamivir

Fig 2 przedstawia wykres wyniku reakcji real-time PCR z wykorzystaniem primerów i sondy (Fig. 1).

Wynalazek przedstawia poniższy przykład wykonania, nie stanowiący jego ograniczenia:

P r z y k ł a d

Badanie wrażliwości wirusa grypy na oseltamivir z wymazu gardła pacjenta

Po pobraniu wymazu z gardła wacik zanurzono w buforze PBS z antybiotykami, a następnie izolowano materiał genetyczny wirusa - RNA wirusowe, przy wykorzystaniu zestawu do izolacji RNA (np. A&A BIOTECHNOLOGY Total RNA). Następnie przeprowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji, tj. przepisania materiału RNA na cDNA, które posłużyło jako matryca do reakcji real-time PCR. Do powielenia określonego fragmentu genu NA wirusa grypy zastosowano primery przedstawione na Figurze 1A. Do detekcji szczepu wrażliwego na oseltamivir wykorzystano sondę przedstawioną na Figurze 1B.

Reakcja PCR przeprowadzona została w następujących warunkach:

1x: 94°C 10 min.

45x: 94°C 10 sek.

56°C 15 sek.

72°C 7 sek.

PL 220 139 B1

Rezultat obserwowano na monitorze komputera w czasie rzeczywistym. Pozytywny wynik obecności wirusa grypy wrażliwego na oseltamivir obrazowany był wzrostem krzywej fluorescencji. Brak przyrostu fluorescencji oznaczał szczep oporny. Wynik przedstawiono na Fig. 2.

Claims (5)

1. Sekwencja nukleotydowa primerów oraz sond służących do powielenia fragmentów genu białka NA o długości około 172 nukleotydów zawierającego miejsce mutacji odpowiedzialnej za nabycie oporności na oseltamivir (Fig. 1).

2. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej primerów oraz sond do powielenia fragmentu genu białka NA o długości około 172 nukleotydów zawierającego miejsce mutacji odpowiedzialnej za nabycie oporności na lek przeciwwirusowy.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że lekiem przeciwwirusowym jest oseltamivir.

4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że przeprowadza się reakcję real-time PCR z zastosowaniem sond typu TaqMan i analizuje się produkty reakcji w czasie rzeczywistym i po zakończeniu reakcji, korzystając z oprogramowania dołączonego do aparatury.

5. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że przeprowadza się reakcję reverse transcriptase Real-time PCR (RRT-PCR) z zastosowaniem sond typu TaqMan i analizuje się produkty reakcji w czasie rzeczywistym i po zakończeniu reakcji, korzystając z oprogramowania dołączonego do aparatury.