PL220839B1 - Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb - Google Patents

Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb

Info

Publication number
PL220839B1
PL220839B1 PL404376A PL40437613A PL220839B1 PL 220839 B1 PL220839 B1 PL 220839B1 PL 404376 A PL404376 A PL 404376A PL 40437613 A PL40437613 A PL 40437613A PL 220839 B1 PL220839 B1 PL 220839B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
arsenic
shewanella
plasmid
strain
psheb
Prior art date
Application number
PL404376A
Other languages
English (en)
Other versions
PL404376A1 (pl
Inventor
Łukasz Drewniak
Aleksandra Skłodowska
Monika Radlińska
Robert Stasiuk
Original Assignee
Univ Warszawski
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Warszawski filed Critical Univ Warszawski
Priority to PL404376A priority Critical patent/PL220839B1/pl
Priority to HUE13817732A priority patent/HUE028023T2/en
Priority to EP13817732.4A priority patent/EP2882851B1/en
Priority to PCT/IB2013/059773 priority patent/WO2014203046A1/en
Publication of PL404376A1 publication Critical patent/PL404376A1/pl
Priority to US14/678,143 priority patent/US9328397B2/en
Publication of PL220839B1 publication Critical patent/PL220839B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C22—METALLURGY; FERROUS OR NON-FERROUS ALLOYS; TREATMENT OF ALLOYS OR NON-FERROUS METALS
    • C22B—PRODUCTION AND REFINING OF METALS; PRETREATMENT OF RAW MATERIALS
    • C22B3/00—Extraction of metal compounds from ores or concentrates by wet processes
    • C22B3/18—Extraction of metal compounds from ores or concentrates by wet processes with the aid of microorganisms or enzymes, e.g. bacteria or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C02F3/342—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used characterised by the enzymes used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y120/00—Oxidoreductases acting on phosphorus or arsenic in donors (1.20)
    • C12Y120/99—Oxidoreductases acting on phosphorus or arsenic in donors (1.20) with other acceptors (1.20.99)
    • C12Y120/99001—Arsenate reductase (donor) (1.20.99.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/03—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; catalysing transmembrane movement of substances (3.6.3)
    • C12Y306/03016—Arsenite-transporting ATPase (3.6.3.16)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C22—METALLURGY; FERROUS OR NON-FERROUS ALLOYS; TREATMENT OF ALLOYS OR NON-FERROUS METALS
    • C22B—PRODUCTION AND REFINING OF METALS; PRETREATMENT OF RAW MATERIALS
    • C22B1/00—Preliminary treatment of ores or scrap
    • C22B1/11—Removing sulfur, phosphorus or arsenic other than by roasting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2101/00—Nature of the contaminant
    • C02F2101/10—Inorganic compounds
    • C02F2101/103—Arsenic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/28—Anaerobic digestion processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y120/00—Oxidoreductases acting on phosphorus or arsenic in donors (1.20)
    • C12Y120/04—Oxidoreductases acting on phosphorus or arsenic in donors (1.20) acting on phosphorus or arsenic in donors, with disulfide as acceptor (1.20.4)
    • C12Y120/04001—Arsenate reductase (1.20.4.1), i.e. glutaredoxin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Metallurgy (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Geochemistry & Mineralogy (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Geology (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Processing Of Solid Wastes (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest plazmid pSheB, szczególnie plazmid zawierający fragment pSheB obejmujący moduł arr, oraz szczepy zawierające taki plazmid, szczególnie szczep Shewanella sp. O23S, które są zdolne do usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego oraz gleb, w szczególności pokopalnianych w warunkach beztlenowych poprzez rozpuszczanie minerałów i redukcję arsenianów do arseninów. Przedmiotem wynalazku jest również sposób i zastosowanie takich szczepów bakteryjnych lub kompozycji je zawierającej do selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub z gleby.
Arsen jest pierwiastkiem, który bardzo często współwystępuje w minerałach miedziowych i stanowi ich swoiste zanieczyszczenie. Podczas procesów pirometalurgicznego prażenia i wytapiania koncentratów miedziowych do atmosfery uwalniane są lotne związki arsenu, co ze względu na toksyczność tych związków, stanowi istotne zagrożenie środowiskowe. Podczas procesu wytapiania większość arsenu jest usuwana w postaci lotnego związku As4O6 w stężeniach do 0,5 mg/l, natomiast w stałej, stabilnej postaci wraz z żużlami usuwane jest tylko 0,04%-0,06% [Piret, 1999]. Poza lotnymi związkami arsenu, wysokie stężenia arsenu znajdowane są także w pyłach. Z tego powodu niezwykle istotnym, zarówno z ekonomicznego jak i środowiskowego punktu widzenia, jest opracowanie skutecznej metody kontrolowanego usuwania arsenu ze złóż miedzi i produktów ich przeróbki.
Aby usuwanie arsenu z minerałów miedziowych przyniosło oczekiwane ekonomiczne i środowiskowe korzyści, proces ten musi być przeprowadzany na pierwszych etapach obróbki złóż miedzi, takich jak flotacja. Tradycyjne układy do flotacji miedzi są niewystarczające i nieodpowiednie do separacji i rozdziału minerałów siarczkowych zawierających arsen (np. enargit Cu3AsS4 czy tennantyt (Cu,Fe)12As4S13) od siarczków miedzi niezawierających arsenu występujących w rudach. Wspomaganiem konwencjonalnych sposobów flotacji są metody zaproponowane w ostatnich latach. Jedna z metod dotyczy selektywnego utleniania siarczków opartego na właściwościach elektrochemicznych rozdzielanych związków [Fornasiero et al., 2001]. Inna metoda selektywnej flotacji wykorzystuje różnice w potencjałach pulpy flotacyjnej [Guo and Yen, 2005]. Stosując rozdział oparty o różnicę potencjałów pulpy można oddzielić minerały zawierające arsen, np. enargit (Cu3AsS4) od siarczków miedzi nie zawierających arsenu. W wyniku takich procesów powstają dwie frakcje koncentratów: (i) z niską zawartością arsenu oraz (ii) z wysoką zawartością arsenu. Te pierwsze mogą być wykorzystywane w procesach pirometalurgicznych, natomiast druga frakcja koncentratów zawierająca minerały miedziowe zanieczyszczone arsenem nadal wymaga odpowiedniego traktowania [Senior et al., 2006].
Jednym ze sposobów, które mogą pomóc rozwiązać problem usuwania arsenu z minerałów miedziowych jest zastosowanie metod biohydometalurgicznych, wykorzystujących mikroorganizmy do odzyskiwania metali z minerałów i złóż. Zastosowanie mikroorganizmów do ekstrakcji miedzi czy złota z ich rud oraz koncentratów jest procesem dobrze poznanym i często opisywanym w literaturze [Xia L. et al. 2010; Xia L. et al. 2009; Oison et al. 2003; Rawlings and Johnson, 2007]. Większość procesów biohydrometalurgicznych opiera się na procesach utleniania minerałów i prowadzi do (i) zwiększenia dostępności dla chemicznych rozpuszczalników (bioutlenianie) lub (ii) ich bezpośredniego rozpuszczania (bioługowanie) [Rawlings and Johnson, 2007]. Niestety metody te są niespecyficzne, ponieważ opierają się na utlenianiu siarki i/lub żelaza z minerałów i wiążą się z uwalnianiem wszystkich metali związanych z tego typu minerałami. Kolejnym ograniczeniem tradycyjnych metod biohydrometalurgicznych jest stosowanie bakterii kwasolubnych do ługowania ze złóż neutralnych i lekko zasadowych, co jest często mało wydajne, a czasami nawet niemożliwe, ze względu na potrzebę zastosowania znacznych ilości kwasu siarkowego do zakwaszenia złóż. W literaturze są opisane mikroorganizmy, głównie chemolitoautotroficzne bakterie utleniające siarkę, należące do rodzaju: Thiobacillus, Halothiobacillus, Thiomonas, oraz bakterie utleniające żelazo, takie jak: Galionella feruginea czy Leptothrix ochracea, Thiothrix i Beggiatoa, które mogą być wykorzystane do procesów bioługowania w neutralnych pH, ale są bardzo trudne do hodowania i nadal są słabo poznane. Ponadto, bioługowanie z wykorzystaniem tych mikroorganizmów jest czasochłonne i procesy te prowadzi się nawet przez kilka miesięcy [Skłodowska i Matlakowska, 2007]. Potwierdzeniem braku odpowiednich mikroorganizmów zdolnych do odzyskiwania metali w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych jest obecna sytuacja na rynku górniczym. Obecnie nie są znane i komercyjnie dostępne biotechnologiczne sposoby usuwania
PL 220 839 B1 metali szlachetnych występujących w postaci siarczków w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych złóż.
Alternatywą dla procesów utleniania są selektywne procesy bioredukcji, w których uwalniane są wybrane pierwiastki związane z aktywnością metaboliczną mikroorganizmów. Pomimo, kilku przykładów zastosowania procesów bioredukcji, nie są znane sposoby usuwania arsenu z minerałów miedziowych za pomocą mikrobiologicznej redukcji. Zidentyfikowanych zostało wiele szczepów bakterii dysymilacyjnie redukujących arseniany, ale zastosowanie większości z nich ogranicza się do transformacji rozpuszczalnych związków arsenu [Newman i wsp., 1998] lub wtórnych minerałów arsenowych powstałych ze związków żelaza [Zobrist et al. 2000]. Opisane zostały także szczepy zdolne do usuwania arsenu z koncentratów miedziowych i odpadów flotacyjnych [Mantur i wsp. 2011], ale prowadzony przez wspomniane szczepy proces dysymilacyjnej redukcji arsenianów nie jest w pełni zbilansowany i część arsenu może być usuwana poza komórki w formie lotnych, toksycznych związków arsenu (dane niepublikowane). Poza tym szczepy opisane przez Mantur i wsp., 2011, jednocześnie uwalniają miedź i arsen z minerałów, przez co obniżają wartość otrzymanego koncentratu miedzi.
W świetle opisanego stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest przezwyciężenie wskazanych niedogodności i dostarczenie plazmidu zawierającego informację genetyczną zapewniającą zdolność do dysymilacyjnej redukcji arsenianów i selektywnego usuwania arsenu, szczególnie ze złóż miedziowych. Celem wynalazku jest dostarczenie nowych szczepów bakteryjnych zawierających taki plazmid, kompozycji je obejmujących i ich zastosowań oraz sposobów selektywnego usuwania arsenu wykorzystującego takie szczepy. Ponadto pożądane jest aby takie mikroorganizmy posiadające zdolność do redukcji arsenianów nie produkowały lotnych, a zarazem toksycznych związków arsenu. Takie właściwości posiada szczep Shewanella sp. O23S, który został wyizolowany z mat mikrobiologicznych z kopalni złota w Złotym Stoku [Drewniak, 2009]. Szczep Shewanella sp. O23S został zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych IBPRS w Warszawie pod nr depozytu KKP 2045p. Szczep ten jest zdolny do beztlenowego wzrostu z wykorzystaniem arsenianów jako ostatecznego akceptora elektronów oraz może mobilizować arsen ze skał z kopalni złota w Złotym Stoku [Drewniak i wsp. 2010]. Nieoczekiwanie okazało się, że właściwości te zapewnia wyizolowany z Shewanella sp. O23S plazmid pSheB którego sekwencja została przedstawiona na SEKW. ID. NR 1, szczególnie jego region obejmujący fragment od 63978 do 72599, który koduje m.in. dysmilacyjną reduktazę arsenianową warunkującą te właściwości.
Szczepy bakteryjne zawierające plazmid obejmujący fragment od 63978 do 72599z SEKW. ID. NR 1, pSheB lub ich funkcjonalne pochodne, szczególnie szczep Shewanella sp. O23S (KKP 2045p) są zdolne do dysymilacyjnej redukcji arsenianów i do selektywnego usuwania arsenu, szczególnie z surowców mineralnych i odpadów przemysłu surowcowego oraz z gleby, szczególnie korzystne jest to, że są zdolne do dysymilacyjnej redukcji arsenianów i do selektywnego usuwania arsenu ze złóż miedziowych, korzystnie w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych. Szczepy bakteryjne zawierające plazmid obejmujący fragment od 63978 do 72599z SEKW. ID. NR 1, pSheB lub ich funkcjonalne pochodne, szczególnie szczep Shewanella sp. O23S (zdeponowany jako KKP 2045p) nie produkują toksycznych, lotnych związków arsenu i stabilnie utrzymują się w środowisku.
Wynalazek dotyczy więc wyizolowanego plazmidu obejmującego fragment sekwencji nukleotydowej od 63978 do 72599 z plazmidu pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1.
Wynalazek dotyczy również plazmidu pSheB przedstawionego na SEKW. ID. NR 1.
Termin „funkcjonalna pochodna plazmidu” lub „funkcjonalna pochodna sekwencji” obejmuje plazmidy/sekwencje o sekwencji nukleotydowej kodującej otwarte ramki odczytu, które kodują produkty zawierające identyczną lub wysoce homologiczną sekwencję aminokwasową lub nukleotydową do sekwencji kodowanych przez wskazane sekwencje, których sekwencje kodujące lub inne sekwencje plazmidu/sekwencji zostały zmienione np. przez podstawienie, zastąpienie, delecję czy insercję tak, że nie zmienia to zasadniczo aktywności produktów tych otwartych ramek odczytu i umożliwia zachowanie funkcjonalnych właściwości niesionych przez taki plazmid/sekwencję. Wskazaną sekwencją będzie więc region obejmujący fragment od 63978 do 72599 SEKW. ID. NR 1, równie korzystnie będzie nią sekwencja plazmidu pSheB przedstawiona na SEKW. ID. NR 1. Sekwencja wysoce homologiczna oznacza, że sekwencja jest homologiczna, korzystniej identyczna, w co najmniej 70%, korzystniej 80%, bardziej korzystnie 90%, najkorzyst4
PL 220 839 B1 niej, w co najmniej 95%. Termin „funkcjonalna pochodna plazmidu” oznacza więc plazmidy o sekwencji nukleotydowej kodującej otwarte ramki odczytu, które kodują produkty zawierające identyczną lub wysoce homologiczną sekwencję aminokwasową lub nukleotydową do sekwencji kodowanych przez fragment od 63978 do 72599 SEKW. ID. NR 1 i/lub sekwencję plazmidu pSheB przedstawioną na SEKW. ID. NR 1, których sekwencje kodujące lub inne sekwencje plazmidu zostały zmienione np. przez podstawienie, zastąpienie, delecję czy insercję tak, że nie zmienia to zasadniczo aktywności produktów tych otwartych ramek odczytu i umożliwia zachowanie funkcjonalnych właściwości niesionych przez taki plazmid.
Istota niniejszego wynalazku opiera się, więc na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że możliwe jest wykorzystanie szczepu zawierającego plazmid obejmujący fragment nukleotydowy od 63978 do 72599 SEKW. ID. NR 1, pSheB przedstawiony na SEKW. ID. NR 1, szczególnie szczepu Shewanella sp. O23S zdeponowanego jako KKP 2045p, do selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego oraz gleb, korzystnie w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych. Nieoczekiwanie stwierdzono, że szczep zawierający plazmid pSheB przedstawiony na SEKW. ID. NR 1, szczególnie szczep Shewanella sp. O23S jest zdolny do: (i) wzrostu na podłożach mineralnych zawierających łupki bitumiczne, odpady flotacyjne oraz gleby pokopalniane zawierające arsen, (ii) selektywnego uwalniania arsenu z minerałów miedziowych zawierających arsen, (iii) tolerowania toksycznego działania metali ciężkich uwalnianych w wyniku rozpuszczania minerałów, (iv) braku zdolności do produkcji lotnych związków arsenu, (v) braku zdolności do mobilizacji miedzi z surowców mineralnych. Niniejszy wynalazek dotyczy więc również szczepu Shewanella sp. O23S obejmującego plazmid pSheB zdeponowanego pod nr KKP2045p w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno Spożywczego w Warszawie .
Wynalazek dotyczy również kompozycji obejmującej wyizolowany plazmid według wynalazku i/lub szczep bakteryjny według wynalazku lub ich kombinację.
Wynalazek dotyczy również zastosowania szczepu bakteryjnego według wynalazku, kompozycji według wynalazku do selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub z gleby.
Szczególnie korzystne jest zastosowanie szczepu bakteryjnego Shewanella sp. O23S zawierającego naturalny plazmid pSheB, który niesie: (i) wszystkie geny niezbędne do dysymilacyjnej redukcji arsenianów, (ii) geny oporności na arseniny i arseniany oraz (iii) geny kodujące system replikacyjnostabilizujący do selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego oraz gleb pokopalnianych. Pełna sekwencja plazmidu pSheB z Shewanella sp. O23S została przedstawiona na SEKW. ID. NR 1.
Przedstawione rozwiązania według wynalazku umożliwiają usuwanie arsenu z surowców mineralnych, odpadów surowcowych oraz z gleb pokopalnianych, korzystnie w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych, korzystnie o pH w zakresie około 6 do około 8 z wykorzystaniem szczepu zawierającego plazmid pSheB lub jego pochodną, korzystniej Shewanella sp. O23S, bez konieczności zakwaszania „środowiska” oraz bez ryzyka uwalniania toksycznych lotnych związków arsenu. Dzięki wynalazkowi możliwe jest selektywne usuwanie arsenu bez niepożądanego efektu uwalniania metali docelowych np. miedzi czy złota.
Wynalazek dotyczy więc sposobu selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub gleby, w którym etap dysymilacyjnej redukcji arsenianów jest prowadzony z wykorzystaniem szczepu bakteryjnego według wynalazku i/lub kompozycji według wynalazku. Korzystnie etap dysymilacyjnej redukcji arsenianów jest prowadzony w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych. Korzystnie surowcami mineralnymi są złoża miedzionośne.
Wynalazek dotyczy korzystnie sposobu selektywnego usuwania arsenu z różnorodnych surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub gleb, w którym usuwanie arsenu prowadzone jest przez dysymilacyjną redukcję arsenianów z wykorzystaniem szczepu bakteryjnego według wynalazku, korzystnie zawierającego plazmid pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1, korzystniej szczepu Shewanella sp. O23S zdeponowanego jako KKP2045p, który to sposób obejmuje następujące etapy
a) przygotowania surowców mineralnych, odpadów lub gleb i zmieszania z odpowiednią pożywką hodowlaną umożliwiającą hodowlę szczepu,
b) dodanie innokulum szczepu i prowadzenia hodowli w warunkach umożliwiających jego wzrost i prowadzenie dysymilacyjnej redukcji arsenianów.
PL 220 839 B1
Korzystne jest jeśli po etapie b) następuje etap c) selektywnego usuwania uwolnionego arsenu z roztworów uzyskanych w etapie b). Takie usuwanie arsenu z roztworów (płynów hodowlanych) korzystnie będzie prowadzone z wykorzystaniem już opracowanych metod np. przez flotację, korzystnie przez selektywne wytrącanie arseninów siarczkami, w konsekwencji czego powstaje stabilny, nie rozpuszczalny w wodzie związek siarczek arsenu As2S3 [Robins 1985].
W korzystnym sposobie etap a) przeprowadza się przez: (i) rozdrabnianie i frakcjonowanie surowców mineralnych, odpadów lub gleb, korzystnie do frakcji 125-250 μm (o średniej wielkości cząstek) ze względu na uzyskiwaną najwyższą wydajność w tym przedziale wielkości cząstek. Równie korzystne jest (ii) przygotowanie jako odpowiedniej pożywki hodowlanej pożywki R1-R2 z dodatkami odpowiednich substratów wśród których są mleczan sodu jako źródło węgla i energii, ekstrakt drożdżowy jako dodatkowe źródło węgla i witamin, sole Tuoviniena jako źródło mikroelementów. Ponadto
3- 3+ w korzystnym sposobie pożywka nie zawiera NO - i Fe .
Równie korzystne jest jeśli w etapie b) hodowla prowadzona jest w warunkach odpowiedniej beztlenowej atmosfery, co uzyskuje się przez prowadzenie hodowli z przepłukiwaniem pożywki mieszaniną gazów N2:CO2, korzystnie w stosunku 4:1. Przepłukiwanie pożywki mieszaniną gazów N2:CO2, korzystnie w stosunku 4:1 może być równie korzystne już na etapie a) sposobu dysymilacyjnej redukcji arsenianów. W korzystnym sposobie w celu uzyskania największej wydajności dla szczepu Shewanella sp. O23S etap b) prowadzi się w temperaturze w zakresie 15°C do 30°C, korzystnie około 22°C z wytrząsaniem 160 rpm, przez co najmniej 21 dni. Korzystne jest jeśli gęstość hodowli na początku procesu wynosi co najmniej około 106 komórek/ml. W korzystnym sposobie innokulum szczepu Shewanella sp. O23S kilkukrotnie przepłukuje się roztworem soli fizjologicznej lub kilkukrotnie pasażuje na podłożu R1-R2 wzbogaconym arsenianem sodu.
Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są w całości niniejszym włączone jako referencje. Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:
Fig. 1. Przedstawia organizację genetyczną plazmidu pSheB. Na schemacie opisano poszczególne moduły budowy plazmidu i regiony fenotypowe: REP/STA- moduł replikacyjno-stabilizujący, TA - moduł toksyna/antytoksyna, TRA - moduł koniugacyjny, SIDERO - moduł produkcji sideroforów, STA - dodatkowy moduł stabilizujący, ARS - moduł metabolizmu arsenu, oraz SOS - moduł systemu naprawczego SOS.
Fig. 2. Przedstawia porównanie zdolności do dysymilacyjnej redukcji arsenianów przez dziki szczep (wt) Shewanella sp. O23S zdeponowany jako KKP2045p (niosący plazmid pSheB) oraz jego pochodną pozbawioną plazmidu pSheB. W celu porównania zdolności badanych szczepów do redukcji arsenianów do arseninów prowadzono beztlenowe hodowle na podłożu minimalnym R1-R2 zawierającym 2,5 mM (187,5 ppm) arsenianu sodu. Na wykresie przedstawiona jest zawartość As(V) i As(III) w płynach hodowlanych pobieranych z hodowli co 24 godziny, • zaznaczono stężenie As(V), - zaznaczono stężenie As(III), linią ciągłą zaznaczono kinetykę redukcji As(V) prowadzoną przez szczep dziki, natomiast linią przerywaną przez pochodną pozbawioną plazmidu pSheB.
Fig. 3. Przedstawia wykres obrazujący wydajność procesu usuwania arsenu z surowców mineralnych przez szczep Shewanella sp. O23S, dla A) odpadów flotacyjnych, B) łupków bitumicznych. Jako próby kontrolne zastosowano sterylne podłoże R1-R2 wzbogacone odpowiednimi surowcami mineralnymi: (A) odpadami flotacyjnymi („middlings”) i (B) łupkami bitumicznymi („łupkami”).
Fig. 4. Przedstawia wykres obrazujący wydajność procesu usuwania miedzi z surowców mineralnych przez szczep Shewanella sp. O23S dla odpadów flotacyjnych („middlings”) oraz łupków bitumicznych („łupków”). Jako próby kontrolne zastosowano sterylne podłoże R1-R2 wzbogacone odpowiednimi surowcami mineralnymi: odpadami flotacyjnymi („middlings”) i łupkami bitumicznymi („łupkami”).
Fig. 5. Przedstawia wykres obrazujący wydajność procesu usuwania arsenu z gleby skażonej arsenem przez szczep Shewanella sp. O23S. W celu sprawdzenia zdolności badanego szczepu do usuwania arsenu z gleby wykorzystano próbkę gleby pochodzącą z okolic Złotego Potoku i przeprowadzono beztlenową hodowlę na podłożu minimalnym R1-R2. Na wykresie przedstawiona jest zawartość arsenu w płynach hodowlanych pobieranych z hodowli co 24 godziny. Jako kontrole zastosowano sterylne podłoże R1-R2 z dodatkiem gleby.
Fig. 6. Przedstawia wykres obrazujący wydajność usuwania arsenu przez szczep Shewanella sp. O23S w podłożu zawierającym 2,5mM (187,5 ppm) arsenian sodu oraz 5 mM tiosiarczan sodu. Jako kontrole zastosowano sterylne podłoże R1-R2 z arsenianem sodu i tiosiarczanem sodu.
PL 220 839 B1
Fig. 7. Przedstawia porównanie zdolności do dysmilacyjnej redukcji arsenianów przez szczep Shewanella sp. O23S w podłożu minimalnym R1-R2 o pH 8 (A) i pH4 (B). W celu porównania zdolności badanego szczepu do dysmilacyjnej redukcji arsenianów w różnych warunkach pH prowadzono beztlenowe hodowle na podłożu minimalnym R1-R2 zawierającym 2,5mM (187,5 ppm) arsenian sodu oraz 5 mM mleczan sodu.
Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.
W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i metody opisane w Sambrook J. i D.W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Charakterystyka plazmidu pSheB i określenie jego pełnej sekwencji
Plazmid pSheB o wielkości 81 kpz został wyizolowany ze szczepu Shewanella sp. O23S. W celu zsekwencjonowania plazmidu wyizolowano plazmid pSheB z 200 ml nocnej hodowli Shewanella sp. O23S metodą lizy alkalicznej. Plazmid pSheB zsekwencjonowano metodą pirosekwencjonowania stosując strategię typu „shotgun” na sekwenatorze GS FLX Titanium (454) (w centrum Oligo Pl.). Do konstrukcji biblioteki DNA wykorzystano ok. 5 μg DNA pSheB i zastosowano dostarczone przez producenta zestawy odczynników (GS FLX Titanium Library Preparation Kit, Roche). Skonstruowana biblioteka została zsekwencjonowana i poskładana z wykorzystaniem programów z pakietu Newbler de novo assembler (Roche). Uzyskane sekwencje zostały następnie złożone w kontigii z wykorzystaniem programów Seqman z pakietu Lasergene package (DNAStar). Adnotację plazmidu (wyróżnienie otwartych ramek odczytu i określenie ich potencjalnych funkcji) wykonano z wykorzystaniem programu Artemis oraz programów BLAST (z bazy NCBI). Pełna sekwencja plazmidu została przedstawiona na SEKW. ID. NR 1. Sekwencjonowanie plazmidu pSheB wykazało, że jest to cząstka DNA o wielkości 81 591 pz i zawartości par GC 44,04%. W jej skład wchodzą 87 otwarte ramki odczytu (ORF), co stanowi 89,6% sekwencji plazmidu. Poniżej w Tabeli 1 przedstawiono szczegółowy opis wyróżnionych ORF w obrębie SEKW. ID. NR 1.
T a b e l a 1 Wyznaczenie potencjalnych sekwencji kodujących plazmidu pSheB w odniesieniu do SEKW. ID. NR 1. *Numery podane w sekwencji kodującej odpowiadają nr nukleotydów z SEKW. ID. NR 1
Nr ORF Sekwencja kodująca (start-stop kodon) Wielkość białka (aa) Przewidywana funkcja białka Największe podobieństwo (porgram BLASTP)
IdenL (%) Organizm Numer w GenBank
l 1-813 270 Deoxyrybonuelease I (EndA) 97 (233/240) Shewanella batlica OS 195 (pS19501) YP 0015569 93
2 826-1061 77 1 lypolhelical protein 100 (77/77) Shewanella bal/ica BAI75 (pSBAL!7501) YP 0060186 02
3 1454-3328 624 ParB like nuclease 99(618/624) Shewanella ballica BAI 75 (pSBAL17501) AEG 13 584
4 3453-3908 151 Hypolhetical protein 99(149/151) Shewanella ballica OS 195 (pS 19501) YP 0015569 96
5 4113^4397 94 Hypolhetical protein 97(91/94) Shewanella ballica BAI75 (pSB ALI 7501) YP 0060185 98
6 4428-4649 73 Hypothelical protein 97(71/73) Shewanella ballica OS 185 (pS18501) YP 0013554 38
7 5014-5358 114 Hypothetical protein 100 (114/114) Shewanella ballica OS 195 (pS 19502) YP 0015570 25
8 5321-5944 207 Hypolhetical protein 99 (204/207) Shewanella ballica BA 175 YP 0060185
PL 220 839 B1 (pS BALI 7501) 95
9 5946 6347 133 Hypothetieal protein 99 (132/133) Shewanella baltica OSI85 (pS18501) YP 0013554 40
10 6545-6790 81 Toxin protein (HicA) 100 (81/81) Shewanella ballica OS 195 (pS 19501) YP 0015570 01
11 6790-7125 111 Antitoxin protein (HicB) 100(111/111) Shewanella ballica OS 195 (pS 19501) YP 0015570 02
12 7423-7767 114 Hypothetieal protein 98(112/114) Shewanella ballica OS 195 (pS19502) YP 0015570 25
13 7730-9058 442 Hypothelieal protein 98 (4432/442) Shewanella ballica OS625 EHC04198
14 9656-9967 103 Hypothelieal protein 99 (102/103) Shewanella ballica OS625 EHC04199
15 10260-10445c 61 Hypothelieal protein 34(13/38) Scheffersomyces siipitis CBS 6054 XP 0013840 86
16 10524-10883 119 Hypothelieal protein 100(119/119) Shewanella ballica OSI 85 (pS18501) YP 0013554 46
17 I0904-I6857C 1979 Conjugative transfer relaxa.se (Trał) 99(1945/1969) Shewanella ballica OS 195 (pS19502) YP 0015570 30
18 17109-1923 5c 708 Type IV conjugative transfer system coupling (TraD) 98 (694/708) Shewanella ballica OS223 (pS22302) YP 0023603 31
19 19908 2272Ic 937 Sex pilus assembly and mating pair (TraG) 95 (892/937) Shewanella ballica OS223 (pS22302) YP 0023642 50
20 22724-241I2c 462 Type IV conjugalive transfer system protein (TraH) 99(460/462) Shewanella ballica OS625 EHC04207
21 24296-24736c 146 Type-F conjugativc transfer system pilin assembly thioldisulfidc isomerase (TrbB) 97(141/146) Shewanella baltica OS 195 (pS19501) YP 0015569 45
223 24750-25622C 290 Type-F conjugattve transfer system pilin assembly protein (TraF) 99 (287/289) Shewanella ballica OSI 85 (pS18501) YP 0013554 54
23 25622-27433c 603 Conjugal transfer mating pair stabilization protein (TraN) 87 (530/607) Shewanella ballica OS223 (pS22302) YP 0023642 56
24 27430-28170c 246 Typc-F eonjugativc transfer system pilin assembly protein (TrbC) ' 100 (246/246) Shewanella baltica OS 195 (pS19501) YP 0015569 48
25 28193-29200c 335 Sex pilus assembly and synthesis protein (TraU) 99 (332/335) Shewanella ballica BAI75 (pSBAL1750I) YP 0060185 ” 70
26 29187-2989 Ic 234 Type-F conjugative transfer system protein (TraW) 99 (232/234) Shewanella ballica OS625 EHC04215
27 29R88-30259c 123 Conjugal transfer protein (Trbl) 98(120/123) Shewanella ballica OS223 (pS22302) YP 0023603 19
28 30261-32849C 862 Typc-!V secretion system protein (TraC) 99 (856/862) Shewanella baltica BA17S (pSSAL17502) YP 0060228 65
29 32853-33296c 147 Type IV conjugative transfer system protein (TraV) 100(147/147) Shewanella ballica OS 195 (pS19501) YP 0015569 53
30 33329-34855c 508 Sex pilus assembly and synthesis protein (TraB) 98 (500/508) Shewanella ballica OS67E YP 0052804 01
31 34852-35667c 271 Type-F conjugative transfer system secretin (TraK) 95 (258/271) Shewanella ballica OS223 (PS22302) YP 0023642 64
32 35807-36232c 141 Type IV canjugative transfer system protein (TraE) 97(118/122) Shewanella ballica OS223 (pS22302) YP 0023642 65
33 36273-36575C 100 Type IV conjugative transfer system protein (TraL) 94(94/100) Shewanella ballica OS 195 (PS195O1) YP 0015569 57
34 36579-36953c 124 Type IV conjugativc transfer system pilin (TraA) 87(111128) Shewanella ballica BAI75 (pSBAL17502) YP 0060228 71
35 37O17-372O5c 62 Hypothelieal protein 100 (62/62) Shewanella ballica OS223 (pS22301) YP 0023602 54
36 37307-37564c 85 Hypothelieal protein witli helix-tum-helix domain 100 (85/85) Shewanella ballica OS 195 (pS19501) YP 0015569 ” 59
37 37684-37866 60 Hypothetieal protein 100 (60/60) Shewanella ballica OS 195 (pS19501) YP 0015569 60
38 38139-38321 60 Hypothelieal protein 32(18/56) Siapliylococcns aureus subsp. awetts USA300_FPR3757 YP 494132
39 38308-39240 310 Hypothetieal protein 97(301/310) Shewanella ballica OS 195 (pS19503) YP 0015571 03
40 39774-40076c 100 Pyridoxamine kinase Tamily protein 27(28/104) Megasphaera micronuci/armis F0359 ZP 0775718 7
41 40161-40442c 93 Hypothelieal protein 86 (75/87) Shewanella oneidensis MR-1 (megaplasmid) NP 720395
42 40448-40975 175 N-Acyltransferase superfamily protein 91 (160/175) Shewanella oneidensis MR-1 NP 720396
(megaplasmid)
PL 220 839 B1
43 41417-41647c 76 Hypothetical protein 100 (74/74) Shewanella baliica OS223 (pS22301) YP 0023602 50
44 41822-43012 396 Plasmid partition protein (ParA) 99 (392/396) Shewanella baliica BA 175 (pSBAL1750l) AEG13539
45 46 43012-44169 44256-44402 385 48 Plasmid panilion protein (ParB) Hypothetical protein 97(347/356) Shewanella baliica BA 175 (pSBAL1750l) YP 0060185 54
47 44438-48298 1268 NTPase with transtnembranc hellces 25 (321/1284) Bacillus subtilis subsp, subtilis str. 168 NP 389778
48 48454-49113 219 Hypothetical protein 60 (131/218) Methylophaga tliioaxydans DMS010 7.P 0510295 2
49 49234-49623 129 Hypothetical protein 39(49/125) Methylororus glucoselrophus SIP3-4 YP 0030501 41
50 49640-50545 301 Hypothetical protein 34(102/300) delta pmteobacterium MLMS-I ZP 0129054 4
51 50655-51623 322 Hypothetical protein 66(212/322) Pseudoaheromonas arclica A 37-1-2 ZP 1027990 6
52 51781-52386 201 Hypothetical protein 25 (44/176) Entembacter ctoacae SCF1 YP 0039413 96
53 52593-53222c 209 Resolvase domain-containing protein (TnpR) 98 (204/209) Shewanella baliica OS 185 (pS 18501) YP 0013554 08
54 53345-53827 159 Transposase(TnpA) 72 (32/46) Vibrio fumissii CIP 102972 ΕΕΧ38686
55 53836-54123 95 Hypothetical protein 83 (79/95) Martnomortas sp. MWYL1 ABR70068
56 54532-54840 102 ArsR family transcriptional regulator 94(96/102) Shewanella sp. ANA-3 YP_869986
57 54901-55143 80 Thioredoxin - redox-active disal fide protein 2 93 (74/80) Shewanella sp. ANA-3 YP_869985
58 55162-55695 177 Hypothetical protein 95(169/177) Shewanella sp. ANA-3 YP 869984
59 55706-56386 226 Cytochrome c biogenesis protein 99(225/226) Shewanella sp. ANA-3 YP_869983
60 56554-57555 333 RND family eftlux transporter MFP subunit 93(311/333) Shewanella sp. ANA-3 YP 869982
61 57552-60625 1023 Acriflavin resistance protein (AcrB) 98(1002/1023) Shewanella sp. ANA-3 YP 869981
62 60743-61177c 144 Arsenate reductase (ArsC) 94(131/140) Shewanella sp. ANA-3 YP 869980
63 61265-62512c 415 Arscnical pump membrano protein (ArsB) 98 (407/414) Shewanella sp. W3-18-1 YP 964320
64 62613-64385c 590 Arsenite-activatcd ATPase (ArsA) 92(543/590) Shewanella sp. W3-18-1 YP 964319
65 64420-64782C 120 Arsenical resistance operon trans-acting repressor (ArsD) 85(102/120) Shewanella sp. W3-18-1 YP_964318
66 65155-67719 854 Respiratory arsenate reductase, Mo binding subunit (ArrA) 96(818/854) Shewanella sp. ANA-3 YP869976
67 67731-68435 234 Respiratory arsenate reductase, FeS subunit (ArrB) 97 (228/234) Shewanella sp. ANA-3 YP_869975
68 68506-69936e 476 Glutathirme synthase 86 (409/476) Shewanella pulrefaciens CN-32 YP 0011827 43
69 70092-71144c 350 Peimease 76(271/358) Shewanella pulrefaciens CN-32 YP 0011853 28
70 71369-71656 95 ArsR family transcriptional regulator 92 (87/95) Shewanella sp. ANA-3 YP.869972
71 71755-72171 138 Transcriptional regulator tyrosine phosphatase (ArsR) 93(127/138) Shewanella sp. ANA-3 YP_869971
72 72164-72511 115 ArsR family transcriptional regulator 97(112/15) Shewanella sp. ANA-3 YP 869970
73 72590-73102 170 Protein tyrosine phosphatase (ArsC2) 84(141/167) Shewanella sp. ANA-3 YP 869969
74 73195-74192 332 Permease 96 (318/332) Shewanella sp. ANA-3 YP 869968
74204-74440 78 Redox-activedisulfide protein 2 97 (76/78) Shewanella putrefaciens CN-32 YP 0011853 22
75 74448-74939 163 Dual specifici ty protein phosphatase 86(140/163) Shewanella putrefaciens CN-32 YP 0011853 21
76 74996-76006 336 Glyccraldchydc-3-phosphate dehydrogenase 99(332/336) Shewanetla sp. W3-18-1 YP 964294
77 76012-77250 412 Major facilitator superfamily prutein 99(409/412) Shewanella pulrefaciens 200 YP 0060091 70
78 77357-77656 99 Hypothetical protein 92 (91/99) Shewanella pulrefaciens CN-32 YP 0011853 18
79 77964-78146 60 Hypothetical protein 32(13/41) Slreplocoacus pneumoniae CAI34I25
80 78249-78683 144 Peptidase S24/S26A/S26B 97(139/144) Shewanella baliica BA175 (pSBALI7501) YP 0060186 10
81 78671-79924 417 UMUC domain-contaming protein DNA-repair protein 93(389/417) Shewanella baliica BA175 (pS BALI 7501) YP 0060186 09
PL 220 839 B1
82 79975-80238 87 Vitamin B12 dependent incthionine synthasc 30(24/81) Coprococcus cotnes ATCC 27758 ZP 0379871 0
83 80344-80994 216 Hypothctical protein 68(150/219) Aciomonas hydrophila YP 0029955 63 YP 0060352 06
84 81035-81253 72 Hypothetical protein 93 (67/72) Shewanella ballica OS 117 (pSBAL11701)
85 81273-81591 106 Hypothetical protein 96(102/106) Shewanella ballica BA 175 (PSBAL17501) YP 0060186 03
P r z y k ł a d 2. Konstrukcja szczepu bezplazmidowego oraz analiza funkcjonalna plazmidu pSheB
Aby wykazać, że plazmid pSheB oraz zlokalizowany w jego obrębie moduł genowy kodujący potencjalne białka są zaangażowane w oporność na arsen oraz dysymilacyjną redukcję arseninów, skonstruowano bezplazmidową pochodną szczepu Shewanella sp. O23S i przeprowadzono jego analizę funkcjonalną. Jako czynnik stresowy stymulujący mechanizmy usuwania plazmidów z komórek gospodarza wykorzystano roztwór Bromku Etydyny (EtBr) o końcowym stężeniu 5 μΜ.
Nocną hodowlę dzikiego szczepu Shewanella sp. O23 prowadzoną na podłożu LB z dodatkiem 5 mM arsenianu sodu przepasażowano na podłoże LB z 5 μΜ EtBr. Gęstość optyczna hodowli na starcie eksperymentu wynosiła OD=0,1, a hodowlę prowadzono 24 godziny, w 22°C z wytrząsaniem 160 rpm. Po 24 godzinach inkubacji przygotowano rozcieńczenia hodowli 10-4,-6,-8,-10, odpowiednio i wysiano po 100 μΐ każdego z nich na podłoże LB zestalone agarem. Następnie, losowo wybrano 96 kolonii i przepasażowano metodą replik na:
i. stałe podłoże LB, ii. stałe podłoże LB z dodatkiem arsenianu sodu (50 mM), oraz iii. płynne podłoże minimalne R1-R2 (sól R1: NaCl-1,17g/l; KCl-0,3g/l; NH4Cl-0,15g/l; MgCl2 x 6H2O-0,41g/l; CaCl2 x 2H2O-0,05g/l oraz sól R2 (KH2PO4-0,17g/l; NaHCO3-2, g/l; Na2SO4 x 10 H2O-0,07g/l zmieszane w stosunku 1:1), wzbogacone mleczanem sodu o końcowym stężeniu 5 mM, solami wg Touvinena* (2 ml/l) (pH 6,0; o składzie: Na2EDTA 50 g/l; ZnSO4-7H2O 11 g/l; MnCl2-7H2O 5,5 g/l; FeSO4-7H2O 2,5 g/l; (NH4)6Mo7O24-4H2O 5 g/l; CuSO4-5H2O 2 g/l; CoCl2-6H2O 0,5 g/l; NaOH 11 g/l) (Touvinien et al., 1973), ekstraktem drożdżowym o końcowym stężeniu 0,004% oraz 2,5 mM arsenianem sodu.
Hodowle na podłożach stałych inkubowano 72 godziny, natomiast hodowle na podłożu płynnym prowadzono w 200 μl w 96 dołkowych płytkach titracyjnych w pojemnikach typu Anaerocult® (Merck) zapewniających warunki beztlenowe przez 168 godzin.
Hodowle prowadzone na podłożu płynnym miały na celu określenie zdolności wybranych szczepów do dysymilacyjnej redukcji arsenianów. Po 5 dniach inkubacji w warunkach beztlenowych, do hodowli dodawano 100 μl 0,1 M roztworu azotanu srebrowego. Wynikiem reakcji pomiędzy AgNO3 a As (III) lub As (V) jest wytworzenie kolorowego osadu. Brązowy osad świadczy o obecności Ag3AsO4 (ortoarsenian srebrowy), podczas gdy żółty osad świadczy o obecności Ag3AsO3 (arsenin srebrowy). W przypadku testu na zdolność do redukcji arseninów obecność żółtego osadu świadczy, więc o redukcji As(V) do As(III).
Hodowle prowadzone na podłożu stałym LB wzbogaconym arsenianem sodu miały na celu sprawdzenie oporności na As(V). Z kolei, hodowle prowadzone na podłożu stałym LB (niewzbogacanym dodatkowymi substancjami) miały na celu zabezpieczenie (kontrolę pozytywną) potencjalnych mutantów. Wszystkie szczepy, które wyrosły na podłożu LB, a nie były zdolne do wzrostu na podłożu LB wzbogaconym As(V) oraz na podłożu minimalnych R1-R2 zawierającym arsenian (ostateczny akceptor elektronów) i mleczan (donor elektronów), zostały wytypowane jako potencjalne mutanty pozbawione plazmidu pSheB.
W celu weryfikacji wyselekcjonowanych konsorcjów sprawdzono profil plazmidowy dzikiego szczepu (Shewanella sp. O23) oraz potencjalnych bezplazmidowych mutantów. Za pomocą metody mini-lizy alkalicznej wyizolowano plazmidowe DNA i przeprowadzono analizę elektroforetyczną (0,8% żel agarozowy). Porównanie wzorów plazmidowych wybranych szczepów pozwoliło na identyfikację, bezplazmidowych mutantów. Dodatkowym potwierdzeniem braku obecności plazmidu pSheB w komórkach skonstruowanych mutantów była analiza PCR. W genomach potencjalnych mutantów przeprowadzono reakcję PCR z zastosowaniem starterów:
endA-L GCTGTTGCTTCCAATACGAC (SEKW. ID. NR 2) oraz endA-R GGCGCTGCGACTTACTCATC (SEKW. ID. NR 3)
PL 220 839 B1
Starter endA-L odpowiada odpowiednio pozycji nukleotydu 127, a endA-R pozycji 679 plazmidu pSheB w odniesieniu do SEKW. ID. NR 1. Do dalszej analizy zostały wybrane szczepy (potencjalne mutanty), które w reakcji PCR dały negatywny wynik z zastosowaniem opisanych powyżej starterów.
Następnym etapem weryfikacji szczepów nieposiadających plazmidu pSheB była ich analiza funkcjonalna. Ponownie sprawdzano czy wybrane szczepy są zdolne do dysymilacyjnej redukcji arsenianów. W tym celu przeprowadzono testy na podłożu minimalnym R1-R2 wzbogaconym arsenianem sodu i mleczanem sodu oraz z wykorzystaniem testu z 0,1M roztworem azotanu srebra. Szczepy, które nie były zdolne do redukcji, były wrażliwe na As(V) i As(III) oraz nie posiadały plazmidu pSheB okazały się dowodem, że plazmid pSheB warunkuje zdolność do oddychania arsenianowego oraz oporność na arsen. Fig. 2. przedstawia wykres obrazujący kinetykę redukcji arsenianów szczepu dzikiego i mutanta pozbawionego plazmidu pSheB. Szczep pozbawiony plazmidu nie był zdolny do wzrostu na podłożu minimalnym z dodatkiem 2,5 mM arsenianu sodu, w związku z czym nie był w stanie redukować As (V) do As (III). W ten sposób wykazano, że informacja genetyczna zawarta na plazmidzie pSheB (SEKW. ID. NR 1) warunkuje nabycie zdolności do wzrostu w warunkach beztlenowych z wykorzystaniem arseninów jako ostatecznego akceptora elektronów, a więc zdolności do dysymilacyjnej redukcji arsenianów.
P r z y k ł a d 3. Konstrukcja wektora niosącego moduł genowy kodujący białka zaangażowane w dysymilacyjną redukcję arseninów
Aby wykazać, które geny zlokalizowane na plazmidzie pSheB kodują białka odpowiedzialne za dysymilacyjną redukcję arsenianów, sklonowano moduł arr, obejmujący m.in. geny dysymilacyjnej reduktazy arsenianowej arrAB, w wektorze pBBR1-MCS2 (Kmr) w szczepie Escherichia coli TOP10 i sprawdzono jego funkcjonalność.
W celu sklonowania modułu arr przeprowadzono reakcję amplifikacji fragmentu DNA o wielkości 8634 pz (obejmującego region od pozycji 63978 do 72599 w genomie pSheB) na matrycy DNA plazmidu pSheB wyizolowanego za pomocą metody mini-lizy alkalicznej. Jako startery w reakcji PCR wykorzystano następujące oligonukleotydy:
She_Mph1103F: GAAATCTTGCAGTAGCGATGCATC (SEKW. ID. NR 4) [pozycja w genomie plazmidu pSheB: 63978-64001; podkreślona sekwencja to miejsce restrykcyjne rozpoznawane przez enzym Mph103I (Nsil)] oraz
She_XmaJR: GTTGTTCCTAGG CTGGTGCCATATCAACCTCTAG (SEKW. ID. NR 5) (pozycja w genomie plazmidu pSheB: 72578-72599; sekwencja zapisana italikiem to sekwencja dodana; podkreślone miejsce jest rozpoznawane przez enzym restrykcyjny XmaJI). Do amplifikacji wykorzystano Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific).
Uzyskany produkt PCR (8634pz) wklonowano w wektor plazmidowy: pBBR1MCS-2 (Kmr) [Kovach et al., 1995] strawiony (uliniowiony) Smal. Mieszaninę ligacyjną produktu PCR oraz wektora pBBR1MCS2 strawionego enzymem Smal wprowadzono za pomocą transformacji chemicznej, metodą rubidowo wapniową wg Kushnera (1978), do komórek szczepu Escherichia coli Top 10 [merA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) <p80/acZAM15 AlacX74 recA1 araD139 &(ara-leu)7697 galU galK rpsL end A1 nupG]. Jako podłoże selekcyjne zastosowano podłoże pełne LB z kanamycyną (30 μg/ml), IPTG (0,5 μg), oraz X-gal (40 μg/ml).
Z puli uzyskanych transformantów (białych kolonii opornych na kanamycynę), wybrano szczepy, które niosły plazmid o odpowiedniej wielkości: 13778 pz (pBBR1MCS2 - 5144pz + moduł arr 8634pz). Obecność skonstruowanego plazmidu potwierdzano poprzez analizę restrykcyjną (trawienie enzymami XmaJI oraz Mph1103I), analizę elektroforetyczną i sekwencjonowanie. Do dalszej analizy wybrano szczep Escherichia coli MR1 (pochodna szczepu E. coli TOP10) niosący plazmid pARRIA (pochodna pBBR1MCS2 z wklonowanym modułem arr).
W celu sprawdzenia funkcjonalności skonstruowanego plazmidu pARR1A przeprowadzono analizę fenotypową szczepu E. coli MR1 na podłożu minimalnym R1-R2 wzbogaconym 2mM arsenianem sodu i 5 mM mleczanem sodu oraz z dodatkiem 0,004% ekstraktu drożdżowego. Hodowlę prowadzono przez 120 h w warunkach beztlenowych (w atmosferze CO2:N2) w temperaturze 37°C. Po pięciu dniach hodowli przeprowadzono test z 0,1M roztworem azotanu srebra, który wykazał, że badany szczep zredukował arseniany do arseninów. Potwierdzeniem redukcji arsenianów do arseninów przez szczep E. coli MR1 (pARRIA) była analiza jakościowa HPLC na specjację arsenu. Przeprowadzona analiza wykazała, że po 120 h inkubacji szczepu E. coli MR1 w podłożu zidentyfikowano arseniny. W reakcji kontrolnej ze szczepem E. coli TOP10 (bez plazmidu) nie zaobserwowano redukcji As(V) do As(III).
PL 220 839 B1
Uzyskane wyniki wykazały, że wprowadzenie genów modułu arr, pochodzące z genomu plazmidu pSheB, na wektorze pBBRIMCS do szczepu E. coli TOP10 prowadzi do nabycia zdolności do dysymilacyjnej redukcji arsenianów. Wprowadzony do E. coli TOP10 moduł odpowiadał fragmentowi sekwencji nukleotydowej od 63978 do 72599 z plazmidu pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1. W ten sposób wykazano, że jest to fragment plazmidu odpowiedzialny za jego zdolność do dysymilacyjnej redukcji arsenianów. Wykazano również, że inna bakteria niż ta od której pochodzi plazmid pSheB, czyli inny gatunek bakterii lub szczep bakteryjny, do którego wprowadzono fragment sekwencji obejmujący fragment sekwencji nukleotydowej od 63978 do 72599 z plazmidu pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1 nabywa zdolność do dysymilacyjnej redukcji arsenianów.
P r z y k ł a d 4. Usuwanie arsenu z minerałów miedziowych z wykorzystaniem szczepu
Shewanella sp. O23S
Aby wykazać, że szczep zawierający plazmid pSheB (SEKW. ID. NR 1), przykładowo szczep Shewanella sp. 023S niosący plazmid pSheB może być wykorzystany w biometalurgii, w procesach selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych przeprowadzono eksperyment z wykorzystaniem dwóch typów minerałów: miedzionośnego łupka bitumicznego typu „Kupferschiefer” oraz odpadów flotacyjnych pierwszego ciągu uzyskanych z Zakładu Górniczego Lubin (KGHM, Polska). Średnia zawartość arsenu w miedzionośnym łupku bitumicznym oznaczonym jako „Łupki” wyniosła 1000-3000 mg/kg łupka, natomiast zawartość arsenu w odpadach flotacyjnych oznaczonych jako Middlings wynosiła 250-350 mg/kg odpadów. Poza arsenem, oba typy minerałów zawierają Cu w zakresie 35000-110000 mg/kg suchej masy oraz inne cenne metale np. Co - 500-2500 mg/kg, Zn 15-2800mg/kg, Ni - 250-500 mg/kg.
Eksperyment usuwania arsenu z opisanych powyżej surowców mineralnych prowadzono w podłożu R1-R2 wzbogaconym 5 mM mleczanem sodu jako źródło węgla i energii, solami Touvinena* (2 ml/l) oraz ekstraktem drożdżowym o końcowym stężeniu 0,004%. Substrat mineralny (łupki lub odpady flotacyjne) o wielkości frakcji 125-250 mm był dodawany do końcowego stężenia 10%. Hodowle były prowadzone w 100-ml butelkach w warunkach beztlenowych w atmosferze mieszaniny gazów N2:CO2 (4:1), przez 21 dni w temperaturze 22°C z wytrząsaniem 160 rpm. W celu uzyskania inokulum szczepu Shewanella sp. O23S założono hodowle nocne na płynnym podłożu pełnym LB. Hodowlę nocną szczepu O23S kilkukrotnie wirowano i przepłukiwano roztworem soli fizjologicznej, a następnie pasażowano na odpowiednie podłoże do uzyskania gęstości około 106 komórek/ml. Jako kontrole zastosowano sterylne podłoże z dodatkiem odpowiedniego substratu, nie zaszczepione bakteriami.
Na początku eksperymentu oraz co 7 dni pobierano próbki do oznaczeń zawartości miedzi oraz arsenu, które to oznaczenia prowadzono przy pomocy atomowej spektroskopii absorbcyjnej - techniką płomieniową; (AA Solaar M6 Spectrometer, TJA Solutions, UK).
Przeprowadzone analizy wykazały, że najwyższe stężenie arsenu w płynach hodowlanych na podłożu wzbogaconym odpadami flotacyjnymi zanotowano po 14 dniach inkubacji (324,75 μg/l) (Fig. 3A). W kolejnym tygodniu inkubacji stężenie arsenu spadło (192,75 mg/l), co może być związane z wytrącaniem arsenu w postaci wtórnych minerałów.
W próbkach kontrolnych stężenie arsenu było na dużo niższym poziomie (nie przekroczyło 153,75 μg/l) i odzwierciedlało chemiczne procesy ługowania. Z kolei, w płynach hodowlanych na podłożu wzbogaconym łupkami bitumicznymi, najwyższe stężenie arsenu zanotowano po 21 dniach eksperymentu (678,25 μg/l). W tym samym czasie w próbie kontrolnej odnotowano ok. 14 krotnie niższe stężenie arsenu (47,25 μg/l). Wyniki te wskazują że szczep Shewanella sp. O23S z plazmidem pSheB (SEKW. ID. NR 1) jest zdolny do uwalniania arsenu z minerałów miedziowych. Niezwykle istotne było więc sprawdzenie jak uwalnianie arsenu wpłynie na mobilizację miedzi. W przypadku analizy zawartości miedzi nie zaobserwowano istotnych różnic pomiędzy zawartością Cu w płynach hodowlanych a próbą kontrolną. Na starcie eksperymentu zanotowano, że część miedzi została wypłukana z minerałów w wyniku chemicznego (stymulowanego przez składniki podłoża) rozpuszczania minerałów miedziowych (Fig. 4). Uwalnianie miedzi zachodziło z niezwykle niską wydajnością, a stężenia Cu w płynach hodowlanych i w próbach kontrolnych nie przekraczały 3,5 ppm. Ponadto wraz z upływem czasu stężenie miedzi spadało (po 21 dniach hodowli stężenie Cu było poniżej 0,5 ppm (Fig 4.), co było zapewne związane z chemicznym wytrącaniem miedzi.
PL 220 839 B1
Przeprowadzony eksperyment pozwolił wykazać, że szczep zawierający plazmid pSheB (SEKW. ID. NR 1), tj. szczep Shewanella sp. O23S zdeponowany jako KKP2045p usuwa arsen z miedzionośnych łupków bitumicznych jak i odpadów flotacyjnych w sposób selektywny przy jednoczesnym braku mobilizacji miedzi ze złóż miedzionośnych.
P r z y k ł a d 5. Mobilizacja arsenu z gleb zanieczyszczonych arsenem z wykorzystaniem szczepu Shewanella sp. O23S
Aby wykazać, że szczep niosący plazmid pSheB o SEKW. ID. NR 1 lub jego funkcjonalną pochodną, taki jak Shewanella sp. O23S niosący plazmid pSheB może być wykorzystany w bioremediacji, w procesach selektywnego usuwania arsenu z gleb skażonych arsenem przeprowadzono eksperyment z wykorzystaniem gleby pochodzącej z okolic kopalni złota w Złotym Stoku. Średnia zawartość arsenu w glebie wyniosła 17955,7 mg/kg gleby.
Eksperyment usuwania arsenu z gleby prowadzono w podłożu R1-R2 wzbogaconym 5 mM mleczanem sodu (źródło węgla i energii), solami Touvinena* (2 ml/l) oraz ekstraktem drożdżowym o końcowym stężeniu 0,004%. Rozdrobniona próbka (o wielkości frakcji < 3 mm) była dodawana do podłoża do końcowego stężenia 10%. Hodowle były prowadzone w 100-ml butelkach w warunkach beztlenowych w atmosferze mieszaniny gazów N2:CO2 (4:1), przez 21 dni w temperaturze 22°C z wytrząsaniem 160 rpm. W celu uzyskania inokulum szczepu Shewanella sp. O23S założono hodowle nocne na płynnym podłożu pełnym LB. Hodowlę nocną szczepu 023S kilkukrotnie wirowano i przepłukiwano roztworem soli fizjologicznej, a następnie pasażowano na odpowiednie podłoże do uzyskania gęstości około 106 komórek/ml. Jako kontrole zastosowano sterylne podłoże z dodatkiem gleby, nie zaszczepione bakteriami.
Na początku eksperymentu oraz co 7 dni pobierano próbki do: (i) oznaczeń zawartości arsenu (oznaczenia za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej - techniką płomieniową) w płynach hodowlanych (ii) monitorowania wzrostu bakterii, poprzez analizę liczby jednostek tworzących kolonię (jtk (ang. cfu)) (wysiewy na podłoże stałe LB wzbogacone 5 mM arsenianem sodu). Przeprowadzone analizy wykazały, że najwyższe stężenie arsenu w płynach hodowlanych zanotowano po 14 dniach inkubacji (166,53 mg/l), natomiast po kolejnych 7 dniach inkubacji stężenie arsenu nieznacznie spadło (123,03 mg/l), co może być związane z wytrącaniem arsenu w postaci wtórnych minerałów. W próbkach kontrolnych stężenie arsenu było na dużo niższym poziomie (nie przekroczyło 25 mg/l) i odzwierciedlało chemiczne procesy ługowania. Wykazano, że szczep zawierający plazmid pSheB o SEKW. ID. NR 1 tj. szczep Shewanella sp. O23S usuwa arsen z gleb nim zanieczyszczonych i może być wykorzystanych w bioremediacji np. przy rekultywacji gleb skażonych arsenem czy usuwania arsenu z innych zanieczyszczonych środowisk.
P r z y k ł a d 6. Analiza akumulacji arsenu przez szczep Shewanella sp. O23S
Eksperyment wzrostowy oraz analiza wydajności dysymilacyjnej redukcji arsenianów prowadzona w podłożu R1-R2 (Fig. 2) wykazała, że szczep niosący plazmid pSheB o SEKW. ID. NR 1. lub jego funkcjonalną pochodną taki jak Shewanella sp. O23S całkowicie redukuje arseniany do arseninów, które są całkowicie usuwane poza komórkę. Aby potwierdzić, że szczep Shewanella sp. O23S nie jest zdolny do akumulacji arsenu w komórkach, przeprowadzono dodatkowy 24 godzinny eksperyment wzrostowy na podłożu płynnym LB. Podłoże LB zostało wzbogacone roztworem arseninów sodu (NaAsO2) bądź arsenianów sodu (Na2HAsO4) o stężeniu końcowym 2 mM. Hodowle były prowadzone w objętości 50 ml w warunkach tlenowych w temperaturze 22°C z wytrząsaniem 160 rpm. Jako kontrolę zastosowano sterylne podłoże LB z roztworami badanych soli. Po 24 godzinach inkubacji hodowle zwirowano i oznaczono zawartość arsenu w płynach hodowlanych oraz biomasie (osadzie bakteryjnym) za pomocą absorpcyjnej spektroskopii atomowej (AA Solaar M6 Spectrometer, TJA Solutions, UK).
Przeprowadzone analizy nie potwierdziły eksperymentów wzrostowych na podłożu R1-R2 i wykazały, że związki arsenu mogą być częściowo akumulowane w komórkach szczepu Shewanella sp. O23S. Efektywność tego procesu jest jednak na bardzo niskim poziomie, poniżej 3% dla związków As(III), natomiast poniżej 8% dla związków As(V).
PL 220 839 B1
T a b e l a 2. Porównanie zdolności do akumulacji arsenu przez szczep Shewanella sp. 023S hodowany na podłożu minimalnym (R1-R2) oraz pełnym (LB).
Podłoże LB Podłoże R1-R2
Aslll AsV Aslll AsV
Zawartość arsenu w płynach hodowlanych [ppm] 144,8119 163,8377 204,8073 N/O
Zawartość arsenu w biomasie [ppm] 5,809583 13,97905 4,1078 N/O
Wydajność akumulacji [%] 7,861492 1,9636 N/O
N/O - nie oznaczano
P r z y k ł a d 7. Analiza produkcji lotnych związków arsenu przez szczep Shewanella sp. O23S
Aby sprawdzić czy szczep Shewanella sp. O23S zawierający plazmid pSheB jest zdolny do produkcji lotnych związków arsenu przeprowadzono beztlenową (w atmosferze N2:CO2; 4:1) hodowlę na podłożu minimalnym R1-R2 wzbogaconym 5 mM mleczanem sodu oraz 2,5 mM arsenianem sodu. Po 5 dniach inkubacji w temperaturze 22°C pobrano próbki gazów do analizy składu chemicznego w chromatografie gazowym GC-MS i GC-AED. Przeprowadzone analizy wykazały, że jedynym lotnym związkiem produkowanym przez szczep Shewanella sp. O23S z plazmidem pSheB jest dimetylomonosiarczek (DMS). Nie zaobserwowano produkcji lotnych związków arsenu.
P r z y k ł a d 8. Strącanie AS2S3 (siarczku arsenu(III)) przez szczep Shewanella sp. 023S w podłożu zawierającym As(V) i tiosiarczan
Aby wykazać, że szczep niosący plazmid pSheB o SEKW. ID. NR 1 lub jego funkcjonalną pochodną, taki jak Shewanella sp. O23S niosący plazmid pSheB może być wykorzystany w bioremediacji, w procesach selektywnego usuwania arsenu z gleb skażonych arsenem przeprowadzono eksperyment, w którym arsen był wytrącany z podłoża w postaci siarczku arsenu (III) (As2S3). W tym celu przeprowadzono eksperyment usuwania arsenu z podłoża R1-R2 wzbogaconego 5 mM mleczanem sodu (jako źródło węgla i energii) i solami Touvinena* (2 ml/l) oraz 2,5 mM arsenianem sodu oraz 5 mM tiosiarczanem sodu jako ostateczne akceptory elektronów. Podłoże zaszczepiano uzyskując wyjściową gęstość hodowli 106 komórek/ml. Hodowle prowadzono w warunkach beztlenowych, w temperaturze pokojowej. Zwartość arsenu w roztworze mierzono w czasie T0 oraz w 1, 2, 3, 4 oraz 7, 14 i 21 dniu hodowli. Obserwowano również pojawianie się żółtopomarańczowego osadu siarczku arsenu III (As2S3). Po 7 dniach zanotowano ubytek 47,8% arsenu w roztworze i pojawianie się charakterystycznego osadu nierozpuszczalnego w wodzie. Po 21 dniach hodowli ubytek arsenu sięgał 82,3% (Fig. 6). W kontrolach zawierających sterylne podłoże tiosiarczan lub siarczek sodu lub siarczany (IV) lub siarczany (VI) oraz arseniany (III) lub arseniany (V) nie obserwowano ubytku arsenu w roztworze, ani pojawiania się osadów siarczków arsenu. Niniejszym wykazano, że szczep zawierający plazmid pSheB (SEKW. ID. NR 1), tj. szczep Shewanella sp. O23S zdeponowany jako KKP2045p jest zdolny w obecności mineralnych związków siarki do usuwania arsenu z roztworów (np. glebowych) w postaci siarczku arsenu III a tym samym jego immobilizacji.
P r z y k ł a d 9. Zdolność do dysymilacyjnej redukcji arsenianów przez szczep Shewanella sp. O23S w warunkach lekko kwaśnych
Aby sprawdzić czy szczep Shewanella sp. O23S jest zdolny do dysymilacyjnej redukcji arsenianów w warunkach lekko zasadowych przeprowadzono hodowlę na podłożu minimalnym R1+R2 o pH 4, wzbogaconym 2,5 mM arsenianem sodu, 5 mM mleczanem sodu oraz 0,004% ekstraktem drożdżowym. Hodowlę prowadzono przez 168 h w temperaturze pokojowej. Jako kontrolę przeprowadzono analogiczny eksperyment w podłożu o pH 8. Przeprowadzone badania wykazały, że najbardziej optymalnych warunkach w podłożu o pH 8, Shewanella sp. O23S całkowicie zredukowała obecny w podłożu As(V) w ciągu 4h (Fig. 7A). Natomiast w podłożu o pH 4 metabolizm Shewanella sp. O23S oraz kinetyka procesu redukcji arsenianów do arseninów zostały spowolnione i całkowita redukcja As(V) nastąpiła po 48h (Fig. 7B). Niemniej jednak, uzyskane wyniki wykazały, że szczep Shewanella sp. O23S jest zdolny do dysymilacyjnej redukcji arsenianów w warunkach lekko kwaśnych.
PL 220 839 B1
P r z y k ł a d 10. Oporność na metale ciężkie szczepu Shewanella sp. O23S
Aby zastosować szczep w mobilizacji arsenu ze złóż polimetalicznych, koncentratów miedziowych czy odpadów flotacyjnych wykorzystywany szczep musi charakteryzować wysoką opornością na metale ciężkie. W związku z powyższym sprawdzono zdolność Shewanella sp. O23S do tolerowania obecności metali ciężkich oraz zdolność do redukcji As(V) do As(III) w obecności metali ciężkich.
W celu sprawdzenia zakresu tolerancji na obecność metali ciężkich szczep Shewanella sp. O23S hodowano na podłożu pełnym LB z dodatkiem odpowiednich roztworów metali ciężkich:
T a b e l a 3. Metale i ich związki wykorzystane do oznaczeń minimalnego stężenia hamującego (MIC).
Analizowany metal Związek chemiczny Stężenie [mM] Stężenie [mg/l]
As (III) NaAsO2 0,5-5 37,5-375
As (V) Na2HAsO4 1-600 75-45 000
Cr (III) Cr2(SO4)3-18H2O 2-12 104-624
Zn (II) ZnSO4-7H2O 1-6 65,5-393
Se (VI) Na2SeO4-10H2O 1-20 79-1580
Cu (II) CuSO4-5H2O 1-6 63,5-380
Co (II) CoSO4-7H2O 1-6 59-354
Mn (II) MnSO4-H2O 1-20 55-330
V (V) NaVO3 1-20 51-1020
Cd (II) CdSO4-8H2O 1-6 112-672
Nocną hodowlę Shewanella sp. O23S pasażowano na podłoże LB wzbogacone odpowiednim związkiem metalu lub metaloidu (do uzyskania gęstości około 106 cfu/ml) i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 22°C. Następnie przeprowadzono pomiary OD600 i wyznaczono wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC, ang. minimal inhibitory concentration), które jest definiowane jako najniższe stężenie Men+, które całkowicie hamuje wzrost bakterii. W celu sprawdzenia czy obecność metali ciężkich hamuje zdolność do redukcji arsenianów do arseninów przeprowadzono test na podłożu minimalnym R1-R2 wzbogaconym 2,5 mM arsenianem sodu, 5 mM mleczanem sodu, 0,004% ekstraktem drożdżowym oraz dodatkiem odpowiednich roztworów metali ciężkich.
Przeprowadzone eksperymenty wykazały, że szczep Shewanella sp. 023S oprócz oporności na As(III) i As(V) jest także oporny na Cu, Cd, Cr, Co, Mii, Zn, Se, V (Tabela 4). Ponadto, jest także zdolny do dysymilacyjnej redukcji arsenianów w obecności metali ciężkich. Tylko w obecności żelaza (III) nie wykazano zdolności do dysymilacyjnej redukcji, 5 ponieważ szczep ten jest zdolny do redukcji Fe(III) i wykorzystywania go jako ostateczny akceptor elektronów (Tabela 4).
T a b e l a 4. Wartość minimalnego stężenia metali ciężkich hamującego (MIC) wzrost bakterii oraz wartość maksymalnego stężenia metali pozwalającego na dysymilacyjną redukcję 2,5 mM arsenianu sodu przez szczep Shewanella sp. O23S.
Pierwiastek Wartość MIC [Mm] Redukcja arsenu w obecności metalu [Mm]
Cd(II) 1 1
Co(II) 2 2
Cr(III) 5 3
Cu(II) 3 2
Fe(III) 5 -
Mn(II) > 20 > 5
Se(VI) > 20 5
Zn(II) 3 2
V(V) > 20 > 5
PL 220 839 B1
Literatura powoływana w opisie, włączona jest niniejszym w całości jako referencie:
Bultreys A. i I. Gheysen. 2000. Production and comparison of peptide siderophores from strains of distantly related pathovars of Pseudomonas syringae and Pseudomonas viridiflava LMG 2352. Appl. Environ. Microbiol. 66:325-31.
Drewniak L. 2009. Charakterystyka bakterii arsenowych wyizolowanych z kopalni złota w Złotym Stoku. Praca doktorska. Wydział Biologii. Uniwersytet Warszawski.
Drewniak L., Matlakowska R., Rewerski B. i Skłodowska A. 2010. Arsenic release from gold mine rocks mediated by the activity of indigenous bacteria. Hydrometallurgy 104 (3-4): 437-442
Fornasiero D., Fullston C.L. i Ralston J. 2001. Separation of enargite and tennantite from nonarsenic copper sulfide minerals by selective oxidation or dissolution. International Journal of Mineral Processing, 61 (2): 109-119
Guo H. i Yen W.T. 2005. Selective flotation of enargite from chalcopyrite by electrochemical control, Miner Eng. 18 (6):605-612.
Kovach M.E., Elzer P.H., Hill D.S., Robertson G.T., Farris M.A., Roop R.M., Peterson K.M. 1995. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175-6.
Kushner S.R. 1978. An improved method for transformation of E. coli with ColE1 derived plasmids, str. 17-23. Boyer H.B. i S. Nicosia (ed.). Genetic engineering. Elsevier/North-Holland, Amsterdam
Mantur A., Rajpert L., Rewerski B., Ruszkowski D., Skłodowska A. i Drewniak L. 2011. New dissimilatory arsenate reducers - isolation, characteristic and potential application in biometallurgy. Prezentacja na konferencji BioMicroWorld 2011, Malaga, Hiszpania
Newman D.K., Ahmann D. i Morel F.M. 1998. A brief review of microbial arsenate respiration. Geomicorbiol. J. 15:255-268
Olson G.J., Brierley J.A. i Brierley C.L. 2003. Bioleaching review part B: progress in bioleaching: applications of microbial processes by the minerals industries. Appl Microbiol Biotechnol. 63(3):249-257
Piret N.L. 1999. The removal and safe disposal of arsenic in copper processing. JOM, 51(9) 16-17
Rawlings D.E. i Johnson D.B. 2007. A Rewiew: The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiol. 153:315-324
Robins R.G. 1985. The aqueous chemistry of arsenic in relation to hydrometallurgical processes. Proceedings of the 15th Annual CIM Hydrometallurgical Meeting, Vancouver, Canada, pp. I1-126.
Sambrook J. i Russell D.W. 2001 Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Schwyn B. i J.B. Neilands. 1987. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Anal. Biochem. 160:47-56.
Senior G.D. Guy P.J. i Bruckard W.J. 2006. The Selective Flotation of Enargite from Other Copper Minerals - A Single Mineral Study in Relation to Beneficiation of the Tampakan Desposit in the Philippines. Internation Journal of Mineral Processing, 81:15-26
Skłodowska A. i Matlakowska R. 2007. Bioleaching of metals in neutral and slightly alkaline environment In Microbial Processing of Metal Sulfides Edts.: Edgardo R. Donati Wolfgang Sand Published by Springer, Dordrecht, The Netherlands. ISBN-10 1-4020-5588-9 (HB); ISBN-13 978-1-4020-5588-1 (HB)pp. 121-130
Tuovinen O.H. i D.P. Kelly. 1973. Studies on the growth of Thiobacillus ferrooxidans, I. Use of membrane filters and ferrous iron agar to determine viable numbers, and comparison with 14 CO2fixation and iron oxidation as measures of growth. Arch. Mikrobiol. 88:285-98.
Xia L., Yin C., Dai S., Qiu G., Chen X. i Liu J. 2010. Bioleaching of chalcopyrite concentrate using Leptospirillum ferriphilum, Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans in a continuous bubble column reactor. J Ind Microbiol Biotechnol. 37(3): 289-295.
Xia L., Dai S., Yin C., Hu Y., Liu J., i Qiu G. 2009. Comparison of bioleaching behaviors of different compositional sphalerite using Leptospirillum ferriphilum, Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus caldus. J Ind Microbiol Biotechnol. 36(6):845-85.
Zobrist J., Dowdle P.R., Davis J.A. i Oremland R.S. 2000. Mobilization of Arsenite by Dissimilatory Reduction of Adsorbed Arsenate. Environ. Sci. Technol. 34:4747-4753.
PL 220 839 B1
Na poniższym wykazie sekwencji:
-SEKW. ID. NR. 1 odpowiada pełnej sekwencji nukleotydowej plazmidu pSheB z Shewanella sp. O23S
Wykaz sekwencji <110> Uniwersytet Warszawski <120> Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb <130> PK/2014/AGR <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <21θ> 1 <211> 81591 <212> DNA <213> Shewanella sp.
<400> 1
atgcaatttg gccaaatcgc attattaaaa tcgatttgcg agctagcgaa tattgtgatt 60
tgcttgaaaa aaggaaagat atttgaatcg ttttttattt caatcattgc ggtaattccc 120
ctttttgctg ttgcttccaa tacgaccaat cagtcgttta atcaggctaa aaaacagctg 180
ttatcggtct atcaagatca gcgggaaacc ctctattgcg gtgctgcatt tgacgcaaaa 240
gggcaggtaa tctctccgcc aggatttact actaaaacac atttagcgcg cgctaaaaaa 300
atagaatggg aacacgttgt acccgccgaa aattttggca aagcatttat tgagtggcgt 360
gatggccatg ggcaatgtgt cgatagcaaa ggtaagtcgt tcaagggccg caagtgtgcc 420
gagaagatga atgttgagta tcgatacatg caagcggata tgcacaatct atttccggcc 480
attggcgctg tgaatgcgct gcgcagtaat tacaattttg ccttgttacc gtcggctaaa 540
tctgattttg gtgcctgtga tatgcgcatt gatggtagca aagctcaacc tcccgaagac 600
gctagagggc gcattgctcg gtcctatctg tatatggacc aaagttatcc taaatattcg 660
atgagtaagt cgcagcgcca gcttatgagt gcgtgggata agcaatatcc ggtgaatatc 720
caagagtgcc agcgggctaa aaaaattgcc gccattcagc tcaatgataa tgagatcgtc 780
aaaagtcgtt gtcagcaagc caatatttgg taaacatacg agaagctatg aattatattg 840
ataataacac cttgtcagag ttggatttgg tttggttgcg taagtttaaa gccagtaaga 900
atctcgatac gctattaatc caagtgaccg gcgctgagcg taaaatagat caagatcctg 960
cgctcactca acgtgagaag tttgataatc taacgtcgat taatacggcg ttttgtcttc 1020
PL 220 839 B1 p2014-sekwencje_ST25.txt
gtgaaacgga agtaaaacag ctcaccggag attggtctta aactgggcgt tcccttcggt 1080
cgggcttttc gcttcgctcc ccgcgataac gtgatccact gatggcaagc aagcttgccg 1140
tggctctacg ttcctgcttg ccaatcccta acgcaatcac caagccccaa acaaaagcaa 1200
acatcaactt cctaaagcac tgtccggttc attgccggct aaagtgtgag taagcgtgcg 1260
cttctctatc gcttgtcatc gtttccctgc caataccgtt cacgtctgcg ctgtcacttc 1320
ttatctgtct catttcacaa cctgcccgcc aagggaggct tcgccgctgc gcgcccttgt 1380
ctgtcagaac gtgaaatgag tcaggaagtt aggcgaagac gagaacgata tttaaacgac 1440
aggaaaacaa gcaatgacaa actcaattca agcgcaagca actcacacta aagccaccac 1500
tttacctgcc agcccaaaga ctcaagcagg ctctcacaag cccgatattg ctcaaaaatc 1560
agcaactgcg gctaacgctg tggtggcatt ggcttcaaca gcaaagccag tgttactgca 1620
attgcagatt aaccagttgg tgttgtctga gaagaacgcg cgtaaagaaa atgcgtctaa 1680
ggctgacgat gaacagttgt atgcctccat tttggcgcat ggcattttac aaaatctgat 1740
tgtcgagccc atgaacgcgc aaggcttata cccagttttg ggcggtggtc gtagactgag 1800
acagctcatt aaagcggtca aaaataataa gctgaaaccg aaaacgcttg tgcctgttaa 1860
gttgctgaca gccgaagaag tggccaacta tgccaccgag ctatcaatga ctgaaaattt 1920
cacacgtgca aagatgcacc cagtcgatga atttcacgct tttgctgaca tggtgaataa 1980
gggcgctagc attgctgatg ttgcgacgcg gtttggcgta acagcgaaat tcgtgcagca 2040
gcgcatgaag ttaagcatgg tcgcccctgt tgtgctcgat gcgtacaaag cggggaacgt 21Θ0
gtcgcttgat gttgtgatga tattcacgat tgccagtgte gaaaaacaag tcgaagtgtg 2160
ggagctggca ggcgatagac gttacaacga aaaccagttc cgcaatatgc ttaaagacgc 2220
cgctgtgaat gctgatcact atttggctca gtttgttggc caagaagaat acgaaaaagc 2280
gggcggggtt gtgacctcag acttgttcag tgacgaagtc tatcttgatg ataaagcgtt 2340
gctcgaatca ttagcgaccg caaaattgga aatcgaagca gcaaagttaa tcgcgcgtgg 2400
ctggaagtgg acacagataa agttagtttc tgaatacgat gaacttgcag ggtttgggct 2460
tctagactca aaagagggtg agtatgatcc cgctgaaatg gcgctagcgg ggtgtatgct 2520
cgtgttaaaa agttatggtg agcctgtcag tatctatatt gggttagtgc ataaggacga 2580
taaaaaggcg ctggcacaat taaaagccag tgtgcaatca gacccactca acgtgggtga 2640
PL 220 839 B1
cgtgaaaaaa attgaagaaa aggatactag cggttattcc gctgcgctta atgacgactt 2700
acgggcgcag cgtttgatta tcacgaaaca tgcgttaatg agtgcgccaa gcgttgcgct 2760
tgatacgttg catttttctg tctgtgtaag cgcgttcact gattcacatt atggcagtcg 2820
tccactgcat atcagcgtta acgacaccac ttgccatcct aaaacgggat cgctcacgga 2880
taacaaagcg gtgcagttaa tcgagggtgt aaaagccagc ctaaatttag cgtgggttgg 2940
tctgcccacg gtcgctgaac gctttaacgc tttttgcgcc ctcgatgtaa aagagaaaga 3000
aaagcaggtg gcttacgcca cggcttccat gttcgaggcg tcaattgata atagtcataa 3060
agctgttgag gccgtgatat ccacgctcga tgtgaaatgg tctaactact ggcgacctac 3120
tgcggaaacc ttctttaagc gCgt gclgttt gtcttgttta attgatatgg ctcagcctgt 3180
catgggtgag cagtgggcat tacaagccgc tgcacteaag aaaaaggatt tagcaaatca 3240
ggttgatagc ttagtgaacg gtgagcgaaa agggctagat gatgcacaaa aagcctactt 3300
tgatgcgttg atgccagctg gattttaagc cgcatactga tgcagattta ccctgttaat 3360
tcagggtaaa tctgagcaag aattaactaa ataaattgag ttgtgtgtat gcgtgtgtat 3420
aatggttcaa cggttaacgc agaggtttta caatgctatt tatggtcggg atcgaaagcc 3480
ctgctgatga aacgcaggcg tttggtatcg ttatccccgt gtttgaaaaa ttaggctatg 3540
gctgtttttc ggcggcggat tgccaagaag aaatcttgtt taaggctaaa gaagccattt 3600
tattaatggc tgaggaagtg atcaacgatg gtcatttagt cgatagtttg aatgaaggat 3660
atcgcgacta tcaggcattg catcccaagt tcgaccaatg gctggcctta gaggtgccac 3720
tagaggcgct taaagccaaa caaaaacgcc tcaatatcac attgtcagaa tcgcagattg 3780
tacgtatcga tagctttgtg gcgtttcatc gcgagttcaa agaccgttcg gacttcttgg 3840
ccaaggcggc cgataagtta atgaacagcg cagactcagt aagatcgtgt tcaaaagtgg 3900
gagattgata tgggcaaagt aaccggtatt ccattttcag aggtgaaagc gcagcttatg 3960
gataatcccg aggttgtcgc agcctatgag caagcagtac aagccgatga accgatccac 4020
attattccag tgcaacacag tgagggcgtt atcatgccaa tcaacaatat cgtgagttgt 4080
actcgtgaag gtcatcatgt ttattttcct ttgtgaatct gtttggtggc catcactatc 4140
cagtgacgat gatttttatg ccctctggcg cggtgaatgt cgttgtcggt ggggcgcggt 4200
atcgatgcca agccaatcaa gtgcagcgcg tgattgatga gtctgggctt gagcatgagg 4260
PL 220 839 B1
gcttagcgtg tttgaagtat ttgattgaag cgggggagtt gaattttcat attcccgctg 4320
atgttcacga gcagcttaaa gtgcatccag agtttcaaaa ataccgcctc atcgagtggg 4380
aagatgaaga catgtgagtg ttgcgataac gacaaggaga attaggcatg tctcaacgtg 4440
cgatagagat tgtaaagata agtgatctca agtccgtcaa acagggtgaa gtgtttgagt 4500
ggtgtattga ttatgaagaa tttcaatggc gcaagggaga tgactttcta aggagtcgaa 4560
caggcgtcga ttctccttgg gaaatttggc cgttgactga taacaccaaa accgctgcta 4620
atcgcaaagt ctttaagctg ataaaatgaa aggacaaaat gatgatggcg ttcttggata 4680
atgtactatt ggtgatttgt tggctgttca ttgccatttc tgctatttat ttcgtcgcag 4740
ccgcattcag gctcgttttt attggccgcc gatagtcgct attccctgtt agttccccgc 4800
aaaacgcgaa acaagcggcg gctgcgccgc ccttttccgt ttatctgaca ataccccttg 4860
gtgtgctttg aaacgtgcct cggcggttaa tctatttact ctgagtgtct attggctgct 4920
gtcgcgctat gtcatctaaa gacaactgat gaacttgggc gttcccttcg gtcgggcttt 4980
tcgcttcgct ccccgcgata acgtgatcca ctgatggcaa gcaagcttgc cgtggctcta 5040
cgttcctgct tgccaatccc taacgcaacc accaaaccgc caagcacagt cctactcact 5100
gcgcggcaag tgtggctaag ctggtcgttt cattcggcat catggccgct cctggtgcta 5160
tccctttcgt ttacgcttcc gtcttatctg tcgctcacca caacccgctt gccaagggtt 5220
cgcttcgccg ctgcgcgccc ttgtcaatca gaacgatggc gagcgagcag gacgtcaggc 5280
gaaaacgaag atgatagacc ccaaacggag caagcagccc atgacacact caatcactac 5340
cccagcaagc cacactaagc ctttcagcga gcaagccagc ttacaagcga caagcaggct 5400
ctccaaagac gatattcaac agcaaaaaag gggcgagttg acgatcattg ttttaactga 5460
aatgaatttc tttcacttct gcggcctcgg acttgagggc gtggctaatg aggcatggta 5520
tccctattca caagggttat tgtttgaagc ggtcgagcgg tacttagtcg cggcaaaagt 5580
ggctcaaaat gtcgtatcaa tcgatcaacc tcgacgcaat ggcgcaagta ttgattatcg 5640
cgtgcgtttt aatgtgttta gcactgacaa aaaacgggtt tcggttcgtt ttcctgtcgt 5700
gattaagaat tttggcaacg atacgcaatg cctctcagtc gatgaactaa cgagggcgtt 5760
aagtctgaac tatcgaaata agcacgtttc aatcatgtgg tctttaccct cggggatcac 5820
atcaacggtt tatgtgtcgg tggcggctga cggggggata agcgattgct atacacatca 5880
PL 220 839 B1
tgccctttgg tttgtgatgg aagggggttg cattgagttg gccactaaca cgggggcgat 5940
atgatatgtg caaaccctca gtgacgtttg aagaaatgaa cacctattta caagggcaat 6000
ataaacatga acgtttatat ggtcgcaccc ctgcaacggg ttggcctgcg gactatgcaa 6060
catcggttgt cagtagccac atggatgatt tgaatgctaa cgggatcggg tacattggcc 6120
atcacgaatc cgcgacaggt caggcgatcc gttataccgt ggacgaggtt aaatattccc 6180
cccgcttttt tattgttggc tatgactccg aaaacgatat tgcccaaaaa caatgctatt 6240
ttattgattc agcgatcaat atcgaaaggg ctcgcgctaa atgcttagag agtgctaatc 6300
gctatccgat agtgagaatt aaggatctac aagggcagtt tgtgtaaaca gcctgaacgt 6360
cttacagggg aacatgcgtt cccctttctc gttaattcac atcatgaccc acttcgtttt 6420
tttcgtctta agttcaaacc gttcgatagg ttaagtctcg aaaatatcct tttttgcaac 6480
tatatatagt tgcacttttt gcggttgatt tggtataatg atcccctata tagcaggggg 6540
cattatgacg aaaacggata aattattagc aaagctcaaa tcgtccaaaa cactgacttg 6600
gaatgaatta gcgggggcgt taaaagtgct cggctatcaa caagtcgagg gtgatggttc 6660
gagggttaag tttgataatg gcattccgaa ggagttaatc aacctgcata aaccgcatcc 6720
taaaaatgaa ttaaaggctt acgcattgcg ccaagtgaga gacaaattaa ccgaatgggg 6780
gaaactatga tgcaaaatac aatgacatat aagggttatc acggctctgt agaaatcagc 6840
ccagaggata atattctgtt tgggcaggtg ctattcattt caccgttgat caactatgag 6900
gccgaaacag ccaaagggtt agagcaagcc tttcaagagg cgattaacgc ttatcttgct 6960
gactgtgctc aacaggacat tcaaccagag aagccttgta agggatcgct taatgtcaga 7020
ttaggccatg acttgcattt ggctgcgtct atcgcggcat ttcaggcatc gactagcacg 7080
aatgagttta tcaaaagggc agttcaaaaa agcgtgggtt tgtaggctgc aaatcgttgt 7140
cgagcaatga tatcagcctg agccatgtga tctacttaaa ctgaacatta ccccctgtta 7200
gctccccgca aaacgcgaaa caagcggcgg ctgcgccgcc cttttccgtt tatctgacaa 7260
taccccttgg tgtgctttga aacgtgcctc ggcggttaat ctatttactc tgagtgtcta 7320
ttggctgctg tcgcgctatg tcatctaaag acaactgatg aacttgggcg ttcccttcgg 7380
tcgggctttt cgcttcgctc cccgcgataa cgtgatccac tgatggcaag caagcttgcc 7440
gtggctctac gttcctgctt gccaatccct aacgcaacca ccaaaccgcc aagcacagtc 7500
PL 220 839 B1
ctactcactg cgcggcaagt gtggctaagc tggtcgttca tttcggcatc atggccgctc 7560
ctggtgctat ccctttcgtt tacgcttccg tcttatctgt cgctcaccac aacccgcttg 7620
ccaagggttc gcttcgccgc tgcgcgccct tgtcaatcag aacgatggca agcgagcagg 7680
acgtcaggcg aaaacgaaga tgatagaccc caaacggagc aagcagccca tgacacactc 7740
aatcactacc ccagcaagcc acactaagcc tttcagcgag caagccagct tacaagcgac 7800
aagcaggctc tccaaagacg ataaattgaa aggctttaaa gatgggaaac tacgtaaaaa 7860
cgcaaaaagt aaaattgcag tgttgttgtc aatggcgaca aagatcgtac tcagaaccca 7920
aacaatgggg atggatgatt gttttaatga taatgccccg cagatcgttg atataaattt 7980
cttttggagc tggtacgaga aggaatactc agagctagaa atttatgtaa ccgtgattga 8040
tggtgtatta actaaagtgc gtttttctga ttgtccctat catttttctg acgatatcgt 8100
tttgaccttt gaagaagtca aagcgaaaaa gccgcatttt acctatgcac aagttaaaca 8160
ggcattgtta gacggctatt tatgcccgtt gtcgaacgat tccaaagccc ctgagccaac 8220
accgccaaac gatgacaaca ctcgcaaagt ggttagtttt ggcgattatc aagatcgcct 8280
cgaaagcaag cgtgaccgct tagagagcgc cgcaggtaaa gcggcggcag actcaaacaa 8340
attttatgag tcgtctagaa gccttgcttc ttgtattccg ttcggccagc caattttggt 8400
tggacaccat agcgagaaac gcgcgagacg ccacgcagac aagattttta atgatatggg 8460
taaatctgtt gcggcaagca aaaaagcggg ttattacgct gacagagcgg ccagcgttgg 8520
cactaatggc attgcatcgg atgatcccga agctatcgcc aaactaaaag aaaaactcgc 8580
aggcttggag cgttcacaag aaacgatgaa agcgatcaat aaagttatcc gctctaagca 8640
tatgacggac gccgacaaaa tcgagtacat gacgcaaacg cataagctaa ccgaaaaaga 8700
agcggaagaa ttactaaagg gggatttttg cggtcgggta gggtttgcta gttactcaat 8760
cgcaaataac agcgcgacta ttcgcaccgt aagggatcga attgaagatt tggaaaagtt 8820
acataatcaa gttgcattga gtgcaagcgg tgaaattgag gggatttctt gggcgttata 8880
tgaggaagat ggacgtatta aaataacttt tgatgatata ccaagcgagg cgctacggtt 8940
aacaataaaa aaacatgctt ttaaatggtc gcgatattct aaagcttggg ttcgtaaaat 9000
aacacctaat gccatttata gcgcaaaaca attgataggc aagttggcag aaaagtagca 9060
gctgtcaaaa tgtgaaatcc ttgctaatta ttaatggtta aagtggcggc tctgccgtca 9120
PL 220 839 B1
tctaatttac aactggtttt aaatggagga ggttgaggcg ttaaaaattt cagaggtcgg 9180
cgcgattgaa tgaaataaga ttaatttcac cttgctatgt gtagattttt tataataaat 9240
tttggtgagt aaataaacgg agaagtacgg cggggattgt gttgccatca atcaatgtaa 9300
aatgccattt tttagttgtt taaagttttg cgatttttac gaggcagcat tgcacgattt 9360
aactcaccta gcaggatatt aagatcgttt tgatagaaat aaaggattta actttcgctc 9420
atgtaattgc caattttaaa agccattcgc cgaattagga gcaagttctt ttaatggttt 9480
agttaagtgt taacggtaac gttcaacatg attcctatat agcaagttgg ctagaaatgt 9540
tgaaagggat aatcgcagca tctaaggcac atcattattt aatcgaatta acgttataaa 9600
taaaaagcca tctagtttaa tgagttcagt ttaaataaat agtaatggga tttttatgtt 9660
agaaacaata gaagaaaaag ccgcaagaga aaagagggtg ttagcgtggc ttggggctgg 9720
gtatgtctcg caaggcgtac ttgcgctaat cgaaaattca agcaatgaag aactggcagt 9780
attattttac cgtcacgcgt tgggagattg ggggctcgtt cctgatgagg ataggcaatc 9840
taatgatcac gcacttcgaa ataatgaacg ggtaatatca tcctatttat tcgcagggat 9900
taagattttg atcatcactg aggcagacag agcacgaacc accgcattat tgccaagcga 9960
atattaagcc gccacgcttg cagaaaacgc actcattgag tgcgtttttt tggcttgaaa 10020
atcccccgat acctttgccg cttcatacgg cagcagccta gcaaaaatcg aaaattccca 10080
aaaaatcccc aaaaaatgaa aagtgcaaaa ccctggcgaa atagtgaagt tggaaccttg 10140
agaataagac cacaccccac gcaagaattg ataaatcaat tcttatggtt gtttgtggtg 1Θ200
taaattattg aaattaaatg tttaaatatc aaaatagttt aaatattttt tttgaaaatt 10260
catttcgttt ttacactaaa tcgtattaaa ggtgtattaa taaaataata caatcgtatt 1Θ32Θ
aaaagccctt gtaccaatgg tttcaggcgg attaatacag tattaatacc gtgtgtatta 10380
tttagtatta aagtgatgtt tataaaagaa ttacttatta actcattttg tgagtgtatt 10440
aaactttaat acactggtta atacagttat aatgcaaacc gatacgttgt taatacactt 10500
ttaatacatt ggataatgtc actatggcca gaagtaaagt tgtgcaagtc ccctgcgatg 10560
cagatctcta tgccaagatt gttgcttatc gagaagagaa ggggttagaa aaagatgctg 10620
ctgccgcgcg agatttgatc ttgtttgctc tgcgtattct tgagcataaa gatgatgccg 10680
aggggttatc tactcgcgaa ctgttagagg tgattttgac ctatacagtt aaggcacaac 10740
PL 220 839 B1
acactagcag tttggtctat taccagacat acaatgcggc tcctgtagat atacagaatg 108Θ0
caggtattaa gcataaggac actatgagaa aggcagagga aaaagttgag cagattttag 10860
cgggcgaaaa taaagaggac taagtgtcct ctttatatat tcattacatg gtcttttccc 10920
caatatccaa tttaggattg tcgatgttgg gggagtattc tttcgtcgtt gaacggtggc 10980
tatccattgc taaatgttga tagtgttcat cgtgctttat tttattcgtc gttacgttag 11040
tgctgtcatc tttcatcgtg atattttttg tgcctgcaat atcatgactc aatgattgaa 11100
tggctttaga tagggtatta tcttttgtcg tgatgctata gatcgcttcg ttgactaatt 11160
gctttgtcgt ttcgactttg tttaagccgt caggtatcag gctgggttca ataataaccg 11220
catgtatatt ttCCttgCtg aatttttcgg taaggtcatt agccagtttt gcagtgtctt 11280
gtgaattatc aagtaccact atcacgtttt cgcgcaattc atttgtattg aatgttttgg 1134Θ
tgtcattatt attgttaagc gcaataacgt cagccccgtt tttattatca gcatttatct 11400
taagcgcgtt ctctacaccg acagcgacaa tgctatagtc taaattattg cctttgttga 11460
tcgtcgtgct gttccccgat ttggagccga gtatgcgctt atttatttta agcgctgcaa 11520
tgtcaccgct ggatttatca aggtaagcaa tttctactgc cttggtctca tctttatcat 11580
tggtgatgtt cgcaattaat gcggggaagg ttccacgttt ttctgacgaa taaacggcat 11640
cgtgaaaacg taagttttca tgctgcttaa cgtcgatgcc ttgcttgttt aaatacgtct 11700
gtgcgagcga gttttctata ggttttgctt cgttaaagta ttgcttcgcg cgcgcttcta 11760
attggctttg cttaaccgga atggcatgtg ttaattcatc atgctgtggg ttttttacca 11820
gattatattt atcgggttcg ttcatcattt tatcggcttt ataaagtgca tccttataac 1188Θ
tgcatttttc agcgaccata atcaggttaa ttagggtgcc tttatcgccg gttttccagt 11940
ctttaaaata gccacgatat tggcccgttg tggtcaatgt taggctcccc tctttgccaa 12000
atgtcaggtt atctttgtct gatttatcgc ggttcggctc acctaaaagc tgcgttgcca 12060
gcgattcact gtaggccgga agcttggcat ttagctcagt ggccatccgt tttagatcca 12120
catatccatt cacatcgagg tactttgggt tttcctgcgg caagggtttg tcattaaata 12180
gcggggtatg ttcagggtaa tacttatctc ttgtctcaag tgcagagact ttattgggat 12240
cgttattgac ccatgagagc atcatttttt gcgggttatc ggtgatgatt tttacgtgct 1230Θ
tactggcacg ggtgatatcg atatacgcgc gccttacgtt agttaatgca ccttggccct 12360
PL 220 839 B1
taatcgcagt aatgacattC tcataggttg ccccttgcgc catatcggcg gtgcgggtgt 12420
atgcataatc ccaatgagca tctttcaact ctttggttga gagcgttaat gtgtggttat 1248Θ
ccgtggattt gagctgcatt tgtttatcgt caatgcggct aacggtatag gttttgttgc 12540
cctgcatttc acggtcaata tcgcttttgc ggagcatgat actgtcgcct tctgcgagag 126ΘΘ
gttgctcact cttagcccaa aggttcgtga atttgtggcc atgatttttg gggaagaaat 12660
gcttttcctc gccggttttc atatccgcga gggtgagcat gttattgagc ttatcgacct 12720
tcataatttc aaaataactg tctttactgg tcgttaggat taacccctgc tgatagggca 12780
acatggtcgc caattccgcc ttactggcat gaacaccgcg taatctcggt acggtgaatt 12840
gttcggtact gaggcttttt tgttgctgta acccttggcg gatttcgtgg gtaatgtcgt 12900
cgcgttcctt gttggtgtac gcaatgataa gggtattttc acgcgcttta ggtgttctgg 12960
ccaagtattc cagtgccacc gtggcgggca gggcttcggt cgccagttgc tggtttttct 13020
tcgggttatc ggttatcgac tgcaaagtcg aaatgatatt caaactttga ttgatgttag 13080
cggtagcctg cttttcgggc gttaccgcgt cgttcgcggt gggcgcgatg tattggtcaa 13140
agggtaattg ttgctgaatt ttatcaatag cgctttcgcc ttggcgatcg acaatattgt 13200
gtactgcact cagtagcgtg ctgttctgtt ggcgcacaat gtctttcatg gtgacgctat 13260
tgattgcgcc tttgtttaac gcgagttcaa aaggtttacc cgcttcttgg gacgttaact 13320
gtttagtgtc acccaagaac acggcgcgcg cgcctgttgt ctcaatcaaa tgggtaaatt 13380
tatccatttg ggcgttactg gtcatcgagg attcatcgag caagaacacg gtgttagcgt 13440
attggtctgg tttcgcatct tggcttaaaa agttgcttag gagtgattgc acagtttggc 13500
tttcgacgtt cttgtctttg agttcgttaa cggcggcgtg tgtcggcgct agacctatga 13560
attgtgtcgg tgtcttattg ggttgtgagt tgagaatgga ttcgctttgt ttaacaagat 13620
cgatacccgt ttcaagcatg gtcgatttac ccgtacccgc taacccttga acacctacaa 13680
atcggtcttt ggtggtggtg ataagcaagg tcgcgtcttt ttggccatcg gtcaggtttt 13740
gattttgact gagtacctgc gcggcgtgtt caacgctggt aaggggcgca agttgatctt 13800
tgcccgcttg tagtctgtct aaaatacgca cttcggtatc gatggcggct tgggtggtcc 13860
agcgggtgcc gtcgtggtat tcggcgctca ggagtgaggg cgcgccttta tccgtgctgt 13920
tcgtggccat gtgttgcagg gtgttgatga tttcatgttg ggtaatgctg gtgccttttt 13980
PL 220 839 B1
cctcaaaggc gtacttgatc gcattaacaa tcagttcttt ttgtgagtaa ccggcttctt 14040
tctcgctaat gtgctggatg gcaaaatcca cggcattgtg aataagccct ttgtcttgat 14100
gctgggcacc aatggcattc agtgctgcgg tcacatcttg ggtgagcagg gccgtagttt 14160
ggctattcac gaacttttct ggcatatcag cggcttgcat gatgcgcgaa atactggatg 14220
gtttcacttc acttttttct aatcggtcat caaattgtgt gccttgtcgg tgaatatatc 14280
aatgtgtttg atgccttgtg tcagcgtgtc atgtaaccac tcttttgagg cgctataggc 14340
tttaatattg acgatgtggt gacttgcatt agggctggca ttgcttggcg tggtggcgta 1440Θ
accatgattg agcggcgcat ggtgcaatgc actggcttta acgctgtgtt gtttgccgct 14460
ttcgtctttg agcgtgaccc attctttgga cagggcgttg atcgtataaa tttgtttgct 14520
caaaccactg tcttgatggt ttgtggccat gatgagtttg tcgccgttgg cgatatgtaa 14580
attgtccggt ttagcgatcg cgtactctgc ggctttaaag gctttgctgc tggggttaat 14640
ctcggacgct ttaccgtttt tgtctatcag cgtgagggtg ttgttatcgc ggtttacact 14700
gtccaccgtc aattgctgct gttgattgcg gccaccgact ttttgccatt gggtgagtac 14760
catgcccttg gtgtactggc cgacgacttc ccgttgctgc gcggataaga acacgggatt 14820
aagggtaggg atgttgagcc caaggcgcga tacgtcacct tgattttgca gttctgcgcg 14880
gatcgcgctg ttaagctgct tcacgtcttt atgggtgccc gcaatgactt gggtgtgttg 14940
cttctcgggc agttgcgcgt aagtttttgc aatcaggtta accctgtcac tgtctttgct 15000
ttcatgcagt cgcatggctg tgttgctttg tttggtggcg acccagttgc tttcgtttac 15060
gttgcctttt ttaagtacct cgatagcgtt accggctttc atgccttgct tggcattggc 15120
gtgattgagc aaaatcactt tactgttacc cgctttggct tgcgcgagca gggcattaaa 15180
gtcgttaagg ccgagtttat tggcgttctc aaccactaaa atatcgcggt tagtgttgtt 15240
ggccgtttta gtaaagctgc tgagtgtatg ggtgtggtca ggtttgaagt ggttcattat 15300
ccacttgcca atagtcgatg aatcccgttg tacccgttca ctggtgtgca gtttgctttt 15360
catgtcaggg gtaatgatgt gaatacgttt accgttggct tcaccgacat tgagcagggc 15420
tgtggcgagt tgttcgctac tgccaaagac gttcactagg ttaacttgtt ttgtgctggc 15480
gaacagttca gagactttct tttggttgtc cgcatttaag cctttgcctt gaagcgtgtt 15540
ggtatcgacc acttggcgca tgttggccgt tttgggcttg atgctctcta gcaggttggt 15600
PL 220 839 B1
ttctgctttg atgtgggcgg cgctggtaaa ggttgcagac tctttatcaa gtggaatgag 15660
tgcgccatct tcaatgtgct tatcgagtgc caatttaata tcgagcgcat cgagcttctg 1572Θ
gccttgcgta aattcaagcg tggctgattc cactaatttc gcgtaattaa aacggttttg 15780
ggtgttactg gcgtgctcaa tcgcgcgact caccgcatcg atagcggcgg gtttgagcgc 15840
taacgcattg agtgatgttt ctcgtgacat gctgtttgtt acaaagcctg tcaggttaaa 15900
gccgctgtta ttggctttgt ttttccattg ctcaaacaag gtggcttcgc tggtataggc 15960
tttgctcttg cgggtatcct ttgcggccac gtcccgcgcg gcttgtgagt ctaaacctaa 16020
gctttgggtt tgttcgttga tttgctggct acgggttgaa aatgtatcga gtaaggactg 16080
cgggacacct tccacttcaa acaaattatt acccagtgaa cgagtttgat aacccgcttg 16140
ttcaacactg cgggctaagg cgctttgata gagcgaggta tagtattttt gatggttata 16200
aacccgctca cctgtgccat tgatgatgcc gcctttttgt ttaaagctac ttgccagagc 16260
gcgcaatgtg ccctcgctgt ccttggtcat gttggcggtg agtgagtggg tgtgcagctg 16320
cggatcttct tcacggctgg ttttgtggcg caccatcgca aacagcaaat ttcccgtgtt 16380
ttcaaaagag gtcgctttgg tatcagggtt ggtttgtctg gcctgcgccg catctttctc 16440
gatatgcgat aacgcgaatt ttaccgcgtc atcgtgcgct gtcattaagc gtttatcgcc 16500
gcccacgagt gcaagtaaac tgaccgattt aggcgccgaa aaggtaaagt caaaaccgtt 16560
gcgggcgttg ctgttttggg ttttaagcgt ttggtcgttc aggctaccgg ctaacacctc 16620
tttgagttga tgttcttcaa cgggcttacc tagcattccc tcttgctctg ccagtttgcc 16680
aaaccattgg gtattgggct cggcgctctg ctctttcaag taatagttgg tttccccttc 16740
tttggcgtcc gctgcttttt ctaacgacac gtcaggcaaa ttgaggttct tttcttcact 16800
gaggtagtag ctggccgcgc cgccagcgct cgacgcaatg ggactgatgg aaagcataat 16860
gatattcctt tsgdgggacc “t cgcgcgggg cacgaggtga actaatccgg taggtttatt 16920
ctgagtcgag ttgggctttg atttcgtcag acgtgaagcc cagcgctttg agttccttga 16980
tggcttcaat tcgacgcatg acgttcatcc gttcattgtc atttttagag gctttacgtg 17040
agggcttttt cgccgacaat tcgggcactc gtactgtggt gttgaatgag gtcatcgttt 17100
tagctccttt agtcgagcga tatttcttca tgtactgagg ctatttgttg ctcttcaagt 17160
cgctgtgcat cctcaatgtg ctggtcattg gccttttgtt tttcagcggc ttttttcttc 17220
PL 220 839 B1
tctgcatctt tgagcgctaa ctctgtcggt ttggcctttt tcgcatcgat gaggctttgg 17280
gcgaccgcat cggttttttc agcaagtttg gtcatgcgct gcgcttccgc gctgcgttca 17340
tcattgtttt catccccttc atacatggtg tcatgaatgc tttggagctt ggttttatcg 17400
gccttatcga gatgttgtgc cgcgctgaat tggtgatagt taaggcttat ctctaatttc 17460
ttcactttct cagatggtgt gtaatcccgc ttaataaacg gggcgcacag tgagcgcatt 17520
tggttaaaga ctaaatccac tcttaccacg ggataattgc caggcgtgcg cagccaaaat 17580
tgtaaatctt caagctgcat gatttcagag ggcgtgacca cagggcgggt aattgtttga 17640
tggcccagtg atacgccatc cctgatttca ttagcgccgt agctgtattg ctctttagag 17700
acatcgactt cttgctcacc taaatcgtga gacgagattt tggccatttc gttagagggt 17760
gagcggaaaa atagccgagt gttgagcaag tcgaacattt caagcgccgc attttcgcca 17820
tagacttttt taagctgcgc aaaagactga atacctatga cataacagcc gccgaacttg 17880
cgcacttctg cgattgtttc ggcaagttca ggtaacttgt gcaagcttgg tgcttcatcc 17940
atcaacaccc aaattctgcg gtccggatct tcgtcttgtt ctaaaatggc ggtcgaggca 18Θ00
atggatagcc acattgagat cagtggccgc aatgaagcat gttgctgtgc gttactggac 18060
agaaatagaa agcctctttc ggcatcgttt ttcacccact cacgaataga aaatttgcgg 18120
cgaagaagtt ttccctgttc gtccttttca tccagtccgg caaggaatcg taatgatttg 18180
atgtaggccg cgaggaccga tttaatcgat atcgccgttt tttggatttt atctgatacc 18240
agtgaggccg attcggtccc ttttaagtat tcacttaagg actcaagttc gctggtcagc 18300
atgagttcaa gcagtcgttc agtggtttgg ttctttttag gttcatcttg catcttaaat 18360
gcagtagatg aaaaaatggt acgtgctgat tgcacccaaa atggatcgcc ctcgccgtgt 18420
tggggaatga gcgcgctcgc catgttctca aaatctgagg gttcatgtgc atcacaccac 18480
acatcccaat aggcacagcg ttcatcaaac gggtttagta gtacgtccgt tgccggatta 18540
taaaatttac tgacaaaggt acagcctttg tcatagataa tggctttgtc gccccgttca 18600
cgtatccacg t t a a a a a c tt acgcagcgcc acggactttc ctgcgcccgt ggtgccatca 18660
agtaacaagt gttgtacttc aaagcgttct ttgaaaatac cgataccatc gagcttgaaa 18720
tcggactggc gcttgtcctt tttaagctgt tttgctaatt ccttcggcgt ggctttttgc 18780
atcccccgaa taaagtgttc ctcggtttgc tcatcgcctt ttttcttgaa ataccacatg 18840
PL 220 839 B1
gccactgaca ggaaaacgat gccaatcaca cagctaataa ggaggtaaat ttgtgtccat 18900
aaccaaaagc ggctgttggc cgcaatcagt atcgggtttt ctaattgaga ccctaacgta 18960
ctggtataga cagtgccttg ccattcagtc tgcataacat gactttctgg tctaaacacg 19020
ctaaccgttt ggtttatcca ataataataa gcgcccgtta aggtgtcttt atcaaggaag 19080
agatagcata gcagcgctgt taagatgagc acgccaaaac acgtccagcg gacaagcacg 19140
gcgttaatct gcagaaacat ccgcaaattg tgaaataaaa tctggccacc acgggtgtag 19200
ttactgcctt tagtacgttt ggggtttaag gtcattagtg aggctcctta tctaagagat 19260
tttcaataaa ggagttaagt tcttcatcat ggcggatgta gtcatttagc gctttgttgt 19320
tagtatcttg taagttttgt ttacttatgc tttgaacttt agctataaat ggcttaatag 19380
taatatcctg aatttgtaat ttcccagagt tgatgttgtt aattagcttg tcacaagcaa 19440
taattttttt atcttgcaat tcaaatttat tttttaaata cggtggcata atttgctgcg 19500
caaaattttc agattttgat ttaaccaaat cactttcgta aaagtttttt agtaaatcat 19560
ttcgtaaatt taaattttcg atagtttctc cagcaaaaat cttgctgcaa ttatctggat 19620
acagtttaca aatgaaatct ataaaatctt gagtgaagtc atagttgtag tttatttggc 19680
cgcttttgag catacttgcg atgctagtat agtaatctgc taagtcttct tgcttttgtt 19740
gacctgtttt gtacttgtag gtgttaataa tacctacaag aaaatctttt tcttgtagcg 19800
atagcggtgc tgcttgagat actgaactta ataagcaaat taataatagg catgttttta 19860
tgatattcat taggttatct ctttttgatt gaaggtcatg gctattatca catttttggt 19920
cctgtattaa agggacttga ttgacgcact gtttctgcca ttttttcatc gtcacttcga 19980
ttgtctggct gtattagggt gtgcgccgct tttgcgtctg cacgggcctg ttccatatca 20040
atgctcggga cgctagacgc gttatgagtc tgttcttcgt gtaacacatc ttgtctaatt 20100
tccgcgttgc cttgcgctgc atggccttgg atgcgctcaa attcgcccgt ttggtagagg 20160
ctgtcattga acggcgcagg ggcatactgt ggtgattgct gtttattgaa atcaatatcg 20220
gcggcatagc gctcctgagc ttgcacaatg tcatcgcggt tttgcggtaa cgctgcgttt 20280
ttgtattgct cagcaatggc tttcacttca gggctgttcg taaattcagc cgcaagtttg 20340
gttcgctctt gctgcatttc tggcgtttgc cccctgatca ccgccatgaa atcaccttgc 20400
tcatctcttg atcttccaac gaattccaca aagtcttgat ttaaatcgtg actaatactg 20460
PL 220 839 B1
atagatccac ttttcacgcg attagccgca tcggtgtagc tttgggcttc agtgagctgg 20520
gattgggagt ttttggcgtg ggtagtcgct tcgttaagtc cttgtaggaa ggtttgtgtt 20580
tcaccttcgt ttttactgtt ggttgtactg gcttgttcgc cgctgttata ggatttgacg 20640
gtgttaacgt tagcgctgaa ctggtcaagg tagctttgct gtagactgtc acgttcgctt 20700
tcactggtac gggctgtgct gacatcatcg gttgagcctt tagtgccagt attggcggat 20760
acgtgcgcac tagaaccaag aaatccactc ccaggtgtgc cgagtttcac ccctgcttct 20820
gctccgacat acattgataa taaggtactt gtggcttggt cttctgtcag gttgaagtcc 20880
ttagcaaaag acttaaccgt actacgcata tctgcgaagc ctttgttatg ggtgccgcta 20940
tcgctggtgg cgctattgct gccataactg ttcgaggtat tgaccccgct catttgactt 21000
agtgcggcat tcttgacggt ggcgaggctt tcgcttgcta gctcactctc aattttgctc 21060
gcactgatcg cgtttgatcc agattgcgat aaggagtttg agaccacatc gttactgctg 21120
atattcactg gcaagctacg gcttaaagca ttttggccat taatgacttg tctgccatca 21180
tcaaaggtgg tggtttcata gccagttgca tcttgcttgg tgttgccatg aatacgttca 21240
acgccagtgg tgtcgatttt attgccgttg gtgttgttgt agctgtagtt atccacctga 21300
gcgttaccca aattgatatc accacttgcc gcactcgcag aggtgcgcgc gttaacgctg 21360
ctcatcatgc ccgcgaactg atgcgacata ctgctcatta ccgacgcgcc gcctttcata 21420
atgagcggga caattaatgt cggtacgctc atcattaaaa agccggtcat ggccgcatag 21480
cgggagtgca tttcttgtaa gggatcaacg ttgcttaacg tgataccgcc gtaaatgtta 21540
gtgatttcgg tggcgttaag ggataagcgc gtggtcatga tgaagttaat gagggcaaac 21600
atcaccggcc atgtgccaag gtagataaag cctttgaaat agttgccgag cacttgaaac 21660
gtgagtgagg ggatcatggc aatcgccacc actaaaaagg cgacagagct aaacagcaaa 21720
aacaaaatcg attgcagcat gggcaaaaat tcccgcgcct gcagggccat tcccgcccac 21780
atcgatgtgg tttgcatttt gttttgcgta taggcgtagt tgaatgcggc ggcggtgttg 21840
ttgctcaccg ctgcatcatc tgcaaggcca tttcgcaggg cgttaatcgt catgttttgc 21900
agcgtgattt gcgacgcgct ttgactgata ttggcgtatt tttgataacc actgctgatg 21960
ctggtattca aaaagctttg ttggcttgtg gccttttcac cataaatcca actgcccagt 22020
aacttgatgc tttttgcgct gtctgcttgg aatagctgct tgaggcgcgg aagggcttct 22080
PL 220 839 B1
ttgcaggtag gatagtcatt aggacccatt tgaatcgccc gtagtggcga agggttgtga 22140
gtcgctagaa agtcccaaat atccggcgca ctggctaaat ctcgccatgt gtatttatta 22200
ttgagtagca tatctccgcg aatacaactg ctgatgtagt gctgccaata gcctttaagt 22260
tgggtgtttt ctatctcgct ttgtctggat aacttgtaca gctcagagcc aaacatcatg 22320
cccgttttac tgtattgttg atcatccggt acgtgaaaaa tatcttccac cgtttgggtg 22380
gtggcataca tataatgcga tgcccatgag gccggaaatg ccactatcgc gggcacattg 22440
tccacgcgat agttacccgt cggattggtt aaatcggtaa tttgcactgt ggcggtggtg 22500
ttcatggcaa gcaatggcac ggcaaagtaa accgcgcacc atttcataat cgcgttatgg 22560
tcacgcttga tgaaaaagtg cagcgcggtg gccaccacgg c a a a c a 1— c acagatgctt 22620
atcatgctgg caaatgaatc ggacttgaac agcacggcaa tggcattcat cacttgcttg 22680
gctacgtcac cgttgctgta cgtgaaaatc tcaaccgcca tggttatcgc tccccaaaat 22740
tcaagttggc cttagcttta gcgctcatgg cgcccgttat ttgctgtttg atttgctggt 22800
tttgcataat gagctggtgc tgtgatatcg cctcattttg agctttagcg gtgagtcctt 22860
ctaaaaagcg gttagcgttg ataatgtctt tctcgatgcg gtcaatgtct ttgggatcat 22920
tgttcgtggc cgtgattgaa gatttcacaa tcgacagcat gttttgcaga tagagggtaa 22980
taaactgcac gctgatgatt ttggcgtaag tattggtttg gggcgtgagt cctgcctcca 23040
attcggtacg taaaaaggtc atgatgggca gtgtggtgta ttcgagcagc gacttgtcgt 23100
tatctgttag tggctggtcg ttttgcatct tgctggcgat acctctgagt aaggtttcta 23160
cgcggtattg caggccgtga ttactttgga tggtgatcgt ttgttgtgtc ggtgctaagc 23220
attggtcaat ggcttgattg gtgcattgat agctttcagc tttgccgccc tctaacagac 23280
tattaatcag gttattgttg tcggtcagca gtgagccata accgcgcgca ttgccggtcg 23340
cgtcatagat atacgtgccc gaaatcgaca tgagaaattc tgccaaggtg ggatcgctgg 23400
caaggaaggt gttttttaaa atggcggccc acacaatatt ggtgtttttg cgcaccatgt 23460
cttttagtgc gggatctttc tttgcgttat cgagctgatt gttagcttga ccgcccgcgc 23520
cgcattcttg ctggccagat acccaatccg caaacgcgtt attttgtgtg cccatagtgg 23580
cacaaatgta tttttgactg ccaacacctg caaaccccgc cagtgcagat acgcccgctt 23640
gggcactctc gcaagaattg atcgactgat tgagatactt atcagcaatg gccgttagcg 23700
PL 220 839 B1
tgtccttaat ctgtttgatt tgcggtgccc acgtctgcag ggctaaatcg actgcgaacg 23760
gtgcagcgtt ggcgataata gccttgcctt gttgcacaag ggcgtcagag ttaatgtggc 23820
tgaatccccc cataaacata tcaataccgc cacagcctgc ggcaatgctg ggcatttgca 23880
cactcacgag ctgcgcgtcg cgaatggggc tacgcacaaa gagattgccg ccgctgtagt 23940
agttggcgct ttggcctttg aatgagcccg gattggtcac gttagtgcca tagcctaggc 240ΘΘ
cattgaaaaa atcgtttagt gaacctgaaa cccccgcgct ataggcgtgt gttgtcagca 24060
aacatgaaat agtgacgccc agtagtgtgc gcgtcagtgc taagcgtttc atgatttacc 24120
tccggtattg ccgtttatgc tgccgcttat gttgccgtta tgacgcgggt ttagtgtgcg 24180
tagcgcacgc aagcaaacgg cacttaacaa tgcatgcact gggacgagta cgaatttata 24240
aatggctaag gccagtaaaa tattgatgat taacatcgtg tccatgagat tgctcctaac 243ΘΘ
gcatgcttgc aatgacttgt gggtcattga gggattgaag gtaactttgt tgaagctgcg 24360
agggcgtcac atcaccgacg gttaaacgga caaacttacg ggtattgacg ttgattaaaa 24420
atgtggcagg cactgtcacg ctgcgcggat tctcaaagaa ggtggcggca atgtctggcg 24480
tggaaggtat cggtacttca aagcctgcta tgccttggtt gtcgagcgaa aaggcatagg 24540
tataggtgcc agtttgcgcc gcaagctgtt tcagtttcgg ggcgaactgg tggcagtaag 24600
ggcaatcaga gcgaaagaaa aacactaacg cgtaatcatt cggattggcc gcaactgccg 24660
ccccccccat aggcgtcgcc ttagcgctta aagagaatag aagagtcatt aacattactg 24720
tgatgatgcg tttcatgggt attttccgtt taaaagtcag gggcgaaatc ggtggccacg 2478Θ
ttcaggaagc ggccaagtaa atcgtcttga gagataaagc catacgcgag cggtttcatt 24840
tcccccgtgc caggattaac taacacgagt gcgggactaa acgggacgtt tatgtgctgg 24900
tcgttttggc ggttctgcac gatggctggc agtgctacac catcgagcgt gacgccaagt 24960
agctcaatgc catgctcagt agcgaactgc tgcacactgg gcgctagcgc aatatcaatt 25020
tcttcttggc ctttgtagac aaagaacagc ccccatcccg catcggcaag gctgcgtact 25080
gcgcgcatct tcttgttgcg ctctaatgat aaataggtgc ttcttgccgc ttgttccgtc 25140
ggtctatctt tggtgtaaga cagctcaggg ttatctagca ggaccttttt aaaggtcatg 25200
ccgaactctg acgatttatt gctgacgtac tgattaagca gcatggccct ttccactttc 25260
ttgctgtctt ggctgtttat cgccgcgtca ttgagcgtgt cttggtagta gctgtgaaac 25320
PL 220 839 B1
caatccatct gctctgtggg cgtcagtgtt tgggtgcgcg tgagtgtgac gcttggcgtt 25380
tcggcctttt taggtgcttg cttcttgggg gcggtcggtt cgttatacca gcgccagcct 25440
tgtgcatccg tggcgttcgc gccgaggcaa aacgttgtca gcataaggat cactaacgcg 25500
ctgcgcttgt tgaccaccgc atcccctttt tttgtggaca accacgccaa cggcgcgtgg 25560
cttgaccacc gaaaaaaagg agatactgcg gcatgttgta agcggtcatt taacaacgtc 25620
atcatggttt ggttcctcca accgactgtt gtaagcgttt ttgaatttca tctgtgttgg 25680
gcagttcgat ggcgtcgtac atgtcttcat aaaaatcaga aaagtccatt gaagacatat 25740
caatgcgttg cagttcgtta ggtgaaaagg cgctgcaatc aggttgttta gcgctgccga 25800
agtttttgcc caattgcgcg cggccctcaa cctgcacaat gcgcgcgagc ttgctatcaa 25860
acgcgcaata ggcttttttc ttgcggatac acacgccaag cactttctca gcgcaatatt 25920
ggccaagtga tacggtgagc ttgtcttctt tggcggtacc cagcgctttt tcttcttcac 25980
tgcaggacgt taagccgatg ccgttacccc aaccgctgtc ctgacaacaa ttgctgatcc 2604Θ
ccagcgcttt atcgctgcac tccatgatgt tgcctttgaa aatgatggcg ctgttttcgt 26100
tgatgttggc tttgtctttc acatcaccgg ctgcgtcact gacggcggcc agtcctgccg 26160
cagcatggtt aaagtcagtg ctgcgagtgg cagcaggatc gtaatagtca ccactgagcg 26220
caaagctgtc agcaccgcag ataaggcccg tatcgcggca ttgctgttta tcacataggc 26280
gttgttgttt atctttaatg caaacgccgc caagttgggt gtcacaactg gtcgattgaa 26340
tgctgcaatc tgcgatggcg tcgcaggtat tgggaaaggc acattgatag gtggtttgtt 26400
ctttccagca atccaatgtc acggctatcc cattaatcat gcgcgtttct ttaccttcta 26460
cgcattgaga ttggacttgt tggcactcag gaagaacagc accacagctg ttgttgtaac 26520
cgacttcaac atgcgtttca gtggtgatga tagtgatggg taaattctgt aactcaattt 26580
taaagtaaaa atcccaattt gcacttatat gaaccgctaa tggggatgct ttaatatcat 26640
aattttctgt ggttaatgaa ctgtttacac tcattgcgca aggttgatta gcaacacatg 26700
taccaggggc tctctctgtt agaacatgtc ctataaacgt accatttaat gcaattgata 26760
attcggcatc aatggctata gaacgatact cacctttaaa ttgaacacgg acgatcttaa 26820
cattagggtt tggtaattta atgtcaatag taaacggtgg tgtgccagtt aagctgtatg 26880
aatgcgccac ttccttaacc gatgtgcttt tgacaaaggg tgttaggtag cattgcaccg 26940
PL 220 839 B1
gattattggt gggcaacgtg caagaacgtg gcagagaatc gacttcacaa acgagccctt 27000
tttcacagtc atgatattta gatgaaatgc cgtggctgat attgtaagca tcattttgat 27060
agccaacggc ggtatggtat gccggatcgt tttcatcaat cgtcgggcgg ccattattaa 27120
agccactcgt cacggcttgg gcttggccat ccgtgctcat gccttgcatt ttggcactgt 27180
ccatggcgct cgggttgttg tagtaacggc tttcgcttgg gttagcgact tcttgctgac 27240
atgtcgcatc tttgcatagg ctgttaacgt caaagccggt gtaacccgct ttgttctgat 27300
tctgcttgat actgtctttg gcccactgca cattatcgcg gtaatccttt tcgctgttgg 27360
ccgccataac aggcaaggcg gcgctcaatg tgaggatggc actgaggatt aaggcattat 27420
tcaactgagt catttcgccc cctttgctaa tgtcttagct gccacatcgg gaatgctgcc 27480
gtgttgtgca agtaagttca gcgcgtcata caacgaaacg ttgccgtaaa tcacgtcaaa 27540
gtcatcggta ctgcagggct gttttgcctg acatttgttg ggtcttacag caacaaaggc 27600
gggtacttgg gtaatgccga attgcgtaaa ccactgggga ttaatcgcaa aaccgctctg 27660
tatggtttta cccttgttat cgataaggtg attcatctgt ttaacggtgg ctgtaaagcc 27720
ttgaggcagt acaccgcgca caatgagtgg cacctgtaag tctgcgcttt gcatgagtaa 27780
ctgctgcaaa ctggtcgcag gcatacccaa cgacacaaat accatcacac cattagcatc 27840
ggcgctgggg ttgggctttg catcgagcaa tggtgatagt gcgttgtcta attggccttt 27900
gctttgcgct tcgaactgac ggg 't θ t C aaatagtgcg g c t t g g c t a cgttcaatgg 27960
gggtaatgtg tgacgttctc gcatcgacag cgcttttaat tcgtcaatac tgtaatccgt 28020
ttgggcgaac acctgtgaaa ttgatccaag gcaccataag ctcacgagca gggctaagcc 28080
tttaaatgaa tgtgaaaata ggctgttatc cacaattttt gtgcataaag cggtatatgt 28140
tgttggtaat ttggtctcaa actttttcat cgaaaatccc tctccttatt ggtcacaaaa 28200
acacgcaatt gcgttttttg aagttgataa aaccaaagtt gtcacccgac acagggttgt 28260
cgtggccact ttcccagatc accgttgtcg tggtgtaagg gtgcgcccat agcgcatcgg 28320
gtatggtgtt ggtcatttga tagcgatagc gggatttagg catgaggggc atcggcgttt 28380
gatagcaaat cgcgccatct tcaccgtggg attcccatac gatgccttgg cgatgcaatt 28440
tgtagttcag gcgctctaaa atcaacgtac ccgcctgaat tggcgtgtcg cggtaattgg 28500
tggtgccagt cagggggtaa gcactgcctt gtgagcccat acaccaaaac agaaaatcaa 28560
PL 220 839 B1
aaggcaatat gctgttagtt gaggtggcca cggcttcggt tgcacaggcg agttgtgaca 28620
cgatattgcc aaataaaatg gcttcgggat tgaggataaa tgacaactcg tcatcatccc 28680
acagtgggtc aatctctgtt aaataggcaa tgtcgaaatt gtccgtggcc atacaagctg 28740
cgctttgcat aatttgcagc caatagatca cagggtattt gtaccagtgc ccatgataaa 2880Θ
acgcgccatc actggcatcg ttatcgcggt tagtgacgcg gccgccgatt tggggggaat 28860
tactcatgtc gagcttcatg cccatgttga ccatgcagta agggacgcgc gtcacgtcca 28920
ctaaggtatc aggctcccaa tagccaatat tgaggccaat ttgcataaaa attggtggcg 28980
gtttgggaca aaatgaaatg ggtgatacgg ggttgcgcgt atcgggtagg ctcccaggaa 29040
taataggcac actgccaatg gtcatcggga agatacacga ccaacaaatg tcggtcatcg 29100
ggttaacgaa cgtgcccgta caggccgctt gcgcgttgac ttgtgcggga atgactccca 29160
ttaagaatgc taagagcagc gcaggtttaa tgtgtcgcat ggtttgtttc ctccatgaat 29220
acggggaaat ttgacacatc tatttcgcgc acttgccaca tcacccccgc ttgcttaatg 29280
acactcggca cgcgcttaag tgttaatgcg cggctgaggt ttccttgctg gtcaaagtaa 29340
acgcgcgcat ctaattggcc atgcagtgtt tcgggttcgc cgcccgttaa aatccatttg 29400
atggtgtgtg gcttgtcatg ggttgttgca aactctttgg cccataacac ttgctgcaca 29460
tcatccccat caaaaaacac cagcgtttta ctgaactcaa acttgccgac gttggccttt 29520
tgcaatgctg gccatgtctt ggtgtcaaat gggtttacgc gcgtcccttt gggataaatc 29580
aggttgccat tagcatcatt gatatctttg gccagcgtta aagtgggatc gactaaaaac 29640
acttctggtg ttttagttgt gataagtccc actggacgag ggcgcttaac accggctttg 29700
acattctctt ggaattgctc gcgcatactg tctagctcac ccgttttttc taaggtttgc 29760
agacggtttt caatccactg cagcatgtca atttcagcta tggggaacac ttggcccacg 29820
gtgccgatgg acgcagcctt gagtggtaag agtgggcata gcgctagcat cagaagcgcg 29880
aatttattca tttagccgtg acctcgttcg cttgggcgcg gttcgccttg ttttgcgctt 29940
gaagggtttg cagtagtgac tgctgaattt cttgggtgac attcacggcg ccactgacga 30000
cggcggggct gactaacacc acgacatggt tatcaatggc gtattgctgc accacatcat 3ΘΘ6Θ
cgagtgtttg ggtaaatcga gtgatttctt tttcgcgttg ttcgtcggat agctcgcttt 30120
gaccgataga ttggtgaaag ctcgccacgg tttcgttaat gtcatactcg acaacactgg 3Θ180
PL 220 839 B1
gttcgcgcgt cacccagagg gttatcatga cgcccagcgt caccagccat aaaattgatt 30240
gtatgatggt tttttccatt ttatgcggcc tctttgtggg ttgctgcggc ggacaaaatg 30300
gcatcaaagc gggccatatc atcgggatag aaatgttggg ctgtcagttc aatggcatcg 30360
agtaacggca tgccgccttt aatcaagttt tcgcaatatt caaactcttt gggttcagtt 30420
gagagcatgg cgcgcgacca tggatcggca aaaatccggt gaaaggacac tagcccgccc 30480
gctttgagca tgacgcagga atgacccgca tcattggcgc gggggaatga cttgatcatg 30540
tgttgctcga agggcgagaa gtggtcagga tgcttgttca agaaatcccc aaagccatca 3Θ6ΘΘ
ccttggcgca atgtgatatg aatatctgaa ctgttcagtg ccgcttcggc ctcggcgttg 30660
gcaaagaagt cgttcatgcc ttgcgttact gtggcaaagc tgccgccgaa cttacgcact 30720
gtgcgataac cttcgttgat gaaatcctta ctttgcgcat tcgcgccgct catgagtgac 30780
catgcttctt caatcacaca gattttcgga atagaacgtt ggcccgataa gtacatttgt 30840
tggctgatcg tcaccatcaa cgcgaaaatc accggacgtt gtagctcgcc tttaaatcca 30900
tcaagttcca gcgtggtgat atcgatattg ggatcgagca tcgagggctt attgaaaatt 30960
gcgccatgaa tgccctgtga gcagaacttg tttaattgcg cggcaatatc actgatacgg 31020
gtatcgtcat ttttttgtgc ggcaatgtca tagagtgccg tttgcacatc gtcaatcagc 31080
gtgtcgttac cgcatttttg ccatgccagc aaaatagcat cgccgagtaa tgccgtctga 31140
aatccggtga gcttttcatc aggtgatgcc atggtggcga taagcgcggt gatgtttccc 312ΘΘ
aacacttcgg tgatgggatc aatggcttga ccttcatcat cgaggattgg gccaaaagta 31260
cccgcatccc gcacgcttaa tactttgcct aagtgggtaa acgggtttag gaaaatctgc 31320
gaactgtcga gatagacgcc gcctaatgtt tgagtgagtt ttttataact ctgacccttg 31380
tctaaaatcc atgccttgcc ccctttggca aaaatcgatt ttactaaggc ttgcatgaag 31440
aatgacttcc ctgcccctga gccgcccgta atcgccatgt tgtagttatc actgccgcag 31500
ttaaacggat cgaaatagct aatttgatgg cgcattgttg gcaagagtag ccctgctgat 31560
aagcgtttgt agtctgcaac aatcggtaag aaattcacca agtttgaggt tttcatcatg 31620
aaacacaggc ccgctttttg gctgtctttc ataaagcctt cgctcattga gaacgggagt 31680
gtggacaggg tgcacatgcc ttgcagttta ttgtttcgga ttaaatcaat gcctgccgtg 31740
cggaaggtcg caatcgcttt tgaggtgtca tggcgttgtt tctcttctgt cgtatacagg 31800
PL 220 839 B1
gtgacattca atgtcatggt ggtgatttta aaggcgtgtg agctgagtcc tttttgtatc 3186Θ
tccttgcgtt cagccagttc atccgcggcg ctggggatta acaaccgcat aggggagttg 3192Θ
accgttttcg ttagtgagcc aattttgctg tcgttacggg tggtttgctc gccggtttta 31980
ttaatataaa aagacacgct gacacgataa ggacattgaa cactgttcat ggtgtaactg 32040
agtgatgcaa tacagttggg aaacgcatat agcctaaagt cgttcggcag cccctttagc 32100
ccaagattga ttaaggtggt atcgacactg ttgtcggatt gcatcggcgt gtgacggata 32160
ttgaccgaat cacgattaat gatgaactca ctgtcagggc tgagaatttg ggtgttgaga 32220
ggttgatact cgttatattt agcgggcgaa acgcgatctt gttgatgcga aaaatttaaa 32280
tgctcgcggc aatgctcaat caaatcgtca gcgcctaagc ggcgaatgtg catgcctgtt 32340
tgcgccagtt ctgactcaac gccaagacgc atatccagca gtgcaggcat gtcctctgtg 32400
gttgaaacaa agaaaaaccc tttggtgttc tttaaatcgt agtggtatgc gctgctgagc 32460
ttggtgccaa agcctttggt cgaactgtgt ttggcataga tagcttcatt attagcaaat 32520
ttatcgcaaa tggcattgcg accactgagc agcgcttgat tttgctcgat gagttcaccg 32580
acttggttgt tacccaccat gacgaattga tagtgccatt tgtcgccctc tggcagtgtg 32640
cacaccaagg cgttcatggt tttgatcaag tcgtcattag ccccgccaaa cagcgaaatg 32700
gcaaagccaa aaccaagcgt attggcattt tcaaatactt gttcggcatc atcataaatg 32760
cgatagggca attcatgatg cagatggttg tgctgctgtt tgctgctggc atagagtgcg 32820
ccgagatcgt ctttaatacg ttgtttcatg gcttaatcct gcttgatgta tttggcaggt 32880
ctacccgtcc aacggctctt atcgaccacg atgtagacat cgctggtatc aacgtaatca 32940
ccttgctcat tgagatacgg gaagattgtt actttttgga ctgactcaga ggtgcgcagc 33000
ggtacaccgt ggrzggtcgcg gcgtggcaat gggataaagt cttgttgttg gctcgcgagc 33060
ttgggaagtg cagttgtgct ttggccgctt aaggccgtca ccgcagggct ttgtgcttgt 3312Θ
ggctgattga acacaccact gtcggtaagt tgcctcactt ccatcatatt ggtacagcca 33180
ttgatgccgc ccaccttatc gcaggaatag tcaccatcca gccctgctgc acagccactt 3324Θ
aatagccatg aagccagtgc gataataccg gtgttacgta atgcattttt gctcatgatt 33300
gggttcaaaa tgtcactcct taaatgaatt aattcgcacg gccaaaggct gagttaacag 33360
gggggcgttg accttgttgg ttatattgct gctgtggtgt aggcgtgttt gcgccttggg 33420
PL 220 839 B1
cctgcggctt aatattccct ggcatctgtt ctaacagtgg gttgctgata gtgttgagga 33480
tttgcgctgt ggcactgaca ggattttggg cttgttgcgc tagcgcttct tcatattctt 33540
gaatgccaac cggatcgagt gggaagcctt tcaaaaacac gatgttgacg gtattgcccg 33600
gattgagctc aataatcggg tggtattgct cagctaattt gatgtagtaa tcagcaagct 33660
tgctacccac gcttgaactg gcactgccgg ctaagttgag cagtgcatcg gccccattca 33720
cgcttgaagt tgatccaagt gctgagttag atgtggtttg gctcagtgct ttacctgtct 33780
caccaatgcc cgtcaaaatg ccgctaatgc ccgccatttg aacgattttg ccgttcttca 33840
taatggcagt accgcgaatg ccattgcggc catagttaaa tacggtcgcc tcgacgggaa 33900
tgtcgatgat ttcatcttca aaaatacagc tgaggcgagt ggtgcgcaca atgccgcgac 33960
tcgatgagat ttcgccgtaa gccgcgccta aaactgtaca gttgtttagt tttgagggct 34020
tgccgttagg cagtacacct tggttaatgg tttggaatac cattggtacg gtatcgcctt 34080
ggccattcac acccgcattg gcatctgcgc cgccagtaac gacagctgtc acaaatgaac 34140
ctgcaggaac gtagttctca ggggtgcgtt tttttggcag gttttggtct ggcgtttccc 34200
aatttagtgc aaaggaatcg atgccatttt gggttgcagg tggcgggata gcaccgcctt 34260
gatagggggc agcataccca ctttgtccgt cacccacgct cgggcgtggt ggtagcgttt 34320
gttcacctaa gtagcgtgtg ctttgcctaa cgggataggc tgatgcatca atgccctctg 34380
tcgaaaattc atcggtgaca ttgctatgct gcattgcatt tgcggtagcg gcattaatct 34440
tatcatcaat tctttcagtg atggtcagtt ggaacgtctc taaattacgt tttaaatcaa 34500
ggcggttagc ttcattgctg cgctcaatgg cttgcatgct gctcagcatt ttatcaatcg 34560
ttttttgttg cttatctaag gcaatttgtt gtgcggtgag cgcagactga ttgtctttct 34620
ctgtgaaatc tttatcaatc acggcaccaa aatcgattgg attgcccgct gcggtttcag 34680
gagcacgttt aggggcagac atataggcgt cgcccgctaa atagagggca ccgagtaccg 34740
tggcccccac ccctgcaatc acccaattgc gttttttatt ggcttcattt aacgcactgc 34800
cttgctcaaa gtcggcttcg gggtcttttt tgaagtagtc taggagttgc ttcattgcat 34860
gctctccccg cctgagacaa caaagaggtg gcctgtttgc tgtggtgcca attcataggt 34920
tgataaggct gcggctcgcg tcgttgggga gtagaactgc gccgttgtga gggtgactgg 34980
gagtgttgcg tgattggtta cgcgataaat gatgccgttg aaatgcttac cagtgaacac 35040
PL 220 839 B1
gaaagcaggt tctgttgtca gtcctgctgg tttgggcatt tgctcattta agcgagtaaa 35100
cataaggtca tctattgatg tttctgtgcc tcttggctcg ttatttgttg gttctcgttc 3516Θ
agcaggggca ctaactatat gcacacgata accgtcaatc ggtttgcctg tgttcaggta 35220
acggatcatt tgcgcggtaa actccgtcat catggtgggg taaggggttt tcttatcgaa 35280
aacggagggt tgttcttctc gataatgttc tgctgtgaag atagaggtca cggcaggaat 3534Θ
ggctttaggg ctgatgaata agccgaaatg tctgcccttt tctgttgata cataggctgt 35400
gaatggcatg gccagattga ggttaacgcg cgctgcgccg gatttatccg atttagtgcc 35460
agtgacaacg caaaatcctt cagggcaatc aatcgaggtg attttgtcac cttcaacgac 35520
taagcggttg atatcgacac tcgacagctc aataggaacc gtttcactgt cattgaatcc 35580
gtagtgtttt gggggcgtat ttgctgctaa cacgctcata ggaaaaagcg cgcaggctgc 35640
gaaaacaagt gggttagcaa tcttcattat ttaacgtcct tttgcacttt cttaatggct 35700
ttgagcgaca gttggccatg gtcataattc atggcaatga tgtagctgat gttttcgggt 35760
tctagcgcgc gtttgcccac atatttgttt aacgtgcccg ttatttttac gagacgatca 35820
tcaagggcaa tttgagtttc attgatggtg aagtgactgc tgatgttttg tttttaatca 35880
ttgctgcatc ttcaaccagt aaaggttgca tctgatgcca atcagcttca tcgatatagt 35940
ttgcgagctg tttgtactga tggtctaccg aagcgggcgt gacattgagc tttagaaagg 36000
caaagtattc cgacatctgc tgtaaatacg gttcgtctat agacgtgtct gatacggtaa 36060
aggctgcgct gatggtcggt ggcacaacgg tgcggctttt attgaagtag gccttccata 36120
caatacttgc taggaccgtg ttactgatca tggctacggt aaagccgatt aacagaagtg 36180
tgttgaggga ttttgcaatg cggataaagt cgatcttgtt cttttgtaac atggggcatc 36240
cttaggggga ttggccccct aattcacatc atttaacgta accagtagcg gcgacatgcc 36300
gcaggcgttc gttttaaaaa tgaagcgcta aattctgctg gggcgtacca ataagcggtg 36360
aggcgtaata cgctcatgcc gtattgcgat ttcattctgc gcatccctaa aaaccatgaa 36420
gaggcaagcg caatgccaat gagcgcttga ttcatcatga ataacacgac aaaaaacact 36480
aaggcaggag caagttcatc catcgcgaac cctaatagcg taggggtgtt attaaggtgt 3654Θ
ttagggatgc taaaaaactg agtgggatta tccacggcct atagacctac aaccttcatt 36600
ccaacgttga cgaaaatgac gccaacgata aagccgccga tagccccgcc ccagtttttg 36660
PL 220 839 B1
gtcagaaagc ccccgaccgc ggcggcacat aaacctacgg cgagaatggc gaactgtgca 36720
gttgagccgg tgccaacggt atcaacaatt tcagatttag ccggtgcaaa aggatcagca 36780
gcatgtacat cccaagacaa cagcaaagta gcgacgacac aaatgatgaa taggaaagtg 36840
cagcgcatta tgaatatggt gctatcactg ggtatatgtt ttgcgagtct taggatctct 36900
gcgtttactt cagtttgttg tgcgctaggt tgtttttgag tcagagttgt catataacac 36960
ttcctttgta tatatttagg tgagacttat gtaattaatt gtaattactc gtttaatcat 37020
tgttgcttaa ttggtttggg cggagcatca acaaaactta ataaactatg ttcaattcga 37080
agctgtattt cggctcgttt gctacgtgct gaacgttcac atgaattaac taatttattg 37140
tgatattcac ctgttagaat aattgttatt cttgagtggt ttttgttaat ttttccatcg 372Θ0
gacatgtaat cctcatttat atctggttgt gcgactatcg cggcgaagat aataagtgaa 37260
aacagatacc gttattagtt aggaaattcc taacttgaaa tgaaacttaa attgagttac 3732Θ
gtaatacttg tattaatagt ttatttaaaa agatagttct aatttcatta gatgacgtgc 37380
atccaaattc tgctctgaga tcggcaaggt gcctttcaat tgccgtgcgt gagcagtctg 37440
ctttggcttg taattgagat ggtgtcattc ctagtgaaaa atccttcatt acttctagct 37500
gccgttgcgt aagagttggg aacaactcac ggaaaatagt gatctcgctt ttatttagag 37560
gcatattttt ttacttcttt attgaaaaat cgatatgttc tatcatgaat aaaattacaa 37620
gattactgta ttacagtaaa cttactgtat tacagtaggg tggtcaatac aaaatgaatt 37680
attatgaaaa aaaattataa ccctcctact tcgtctaaaa ctgagcttgt gacgtttagg 37740
tgcccaaaga agcttaagga attgatggac caagctgtaa aagatggtaa atatcaaaca 37800
attacagctt taactgttga ggctgttaag gataaattgc aattcgaccc cgattcagat 37860
gcatagttga tctgttttgc attggccttg caattttttt gatgagctat taaaatacga 37920
agtagatttt gaagcaaaag tgcattacat agcacgctac tacatagttt tctatgtagt 37980
gtatttttca aaattagagt gtgttggggg tggttccctg acgtgaagca ttcgacaaca 38040
aagccgactt accgaatggg tcggcttttt tgtgcctaaa attcaagaca ttgaaagatc 38100
attgatcttt gcgatcgatc atattatagt gtttggcaat gtttgaacta accattcaaa 38160
cagccctaaa acattcggaa tcaacaataa tgcctaattt cttaaatggc tgctatttgc 38220
agcacaagat ccatatcctc agatacatat accctctatg ccgccagatc tcgcgatcta 38280
PL 220 839 B1
tgctgagcta cagtgggata gtgtctgatg caaaactcta gtcaatcaga tcttctctat 38340
tcatcattca gcagtgatga ttatcaagaa catcctcctt tatctagtta tgctgatata 384Θ0
cctcatgttc atatggcaga actgccagat ggcaatgctt actctgtcga tgaagaagcg 38460
attaggttaa aagttgctag aaaagctgag cgtgacaaga tcaatgccga aattaagagc 38520
cttgctaaca tcgtcaagaa aaaaggtgta gctgttggct ttaaagcaaa agtagcatct 38580
tatgctggat ttaaagctaa gcgactacct gattttgtgc aaacgttatt aacccaatct 38640
aaactattgc ctcaccgcga cgatttttta gatcgtggtg atggattgtg tagaggaaaa 387Θ0
actcaggcac gttctaaagt gattttaggc tatatgctct ctgcatttgt tgttaactgt 38760
aatgtcaaca acggtcatat tgtcgttgct actagacatg gcggcaagaa cgttactcat 38820
gatgaactac gtaaagaagt ggccatgcgt cacggtgtct acataccaga atcaacatgg 38880
tacttttacg ttaatcgatt agttcaatgc ggccacattg aaagccatac tgtgagcatt 38940
tatgaagatg gccacgtagc ctcttttcat gctgaagcga gccataagta tttatcaaca 39000
aagcttatgt caatgttggg tgctgaccga ttatctgtaa gaacagcagc tgcgaagcat 39060
aacgttgatc tgaaactggc aggaaaatca tttaagcaaa aaccccgcta cgcgagttcg 39120
cgctatcgtc gcgatggttc tcttcgtcaa aatatgccaa tcataaaacc gtctcaagaa 39180
ttgttggcac ttattcgctc tcactatgaa cgcgaagctt actacgtacc tcccaattga 39240
cattctaagc ctttttaatt cttcgactat caatcagtac attactgatg cttctcatgt 39300
cccaatgtcc aataagcccc tcatacccct aatttattag gagtatctcc atcaattctt 39360
aatattactt agccaaattg gattggattg atcttatttt atgtatagcc atactttctt 39420
tttaataaac ttaaagtaca aaaaaaactg caaagttagt tgtgatcttt agtctcacct 39480
cttttgattt tttcttttga tttttagctt tagaaaatga aagataaaaa gatctatagc 39540
aaaagatata aaaatgatga ctgataaatc agtcgcttct acaagagatt aagagaagcg 39600
ctgcaagtta attttgtctt cgaccgttaa actacaaacg tgctgtaact cagttgctaa 39660
agaaaaaagc gtctagcagg actagtttgc aagctcaatg ccaaggtaca taaatagaat 39720
ggttaaacca ttctattgag aaagtcattt gttaaagtaa tcccctcaga tattcaacga 39780
tccactttat agttaacgct tagagaaaga tcaaaaacac cgctaacacc tccttttgtc 39840
atccgaccgt ttaacaacaa acgcgctggc caatcgttaa aaaccaaaaa acggtcttgc 39900
PL 220 839 B1
agggaaagaa atttcaaaca ctgtgccatt aacaatcgta cggttttagt acggctaaat 39960
ttgactaaaa tatcatttag acgtactatg tacggagttt tacataaaga taaaacacaa 40Θ20
cagagtttgc tcgcagcaag taatgaggta ctaaaaaatg gaaattttga ataattttaa 40080
tgaattagac aaatttattg tcttagattg ttattaagga ggttacaact taaaaaattt 40140
gatccaatga ggaattcgat atgagtattc aaaatacggc aaatgctgga gccgtttcaa 4020Θ
aaccagcgcg gatagaactt aaaacctcgc tagaggtaaa ggaactgctt gaacgagcgg 40260
cagctatcaa tggcatcaat cttacggcat ttatcattaa tcaagcccga gagagagccc 40320
atgcaattat tgaatcagaa actacactac atctgaacca acatgcttgg actcaatttg 40380
aaaccatttt agataatcct cgtaaagcta ctccggcact aaaggcacta ttttcggagt 40440
aaaataaatg agcacaagcg atgttgatta tcagctgcta aacaagatgg aacgacaacc 40500
aagtttttca aattttgatt gtggtgatct gtttcttgat agttttgcgc ctaagaaatt 40560
ggcgaaagct gatgctaata atgattctcg ggtctatgtt gctgtagaca gagatatagg 40620
tgttggattt gcaacgatga aagtttttat gctcagtaat gacgagcatt caattttatc 40680
tgggaaatat ccacgccagg ttcctgtggt aatgttagat caaattgcag ttgataaagc 40740
ttaccaaggc aaaggaattg gtaaacgcct gatgcggaaa gtgatggaag ctacggtgtt 4080Θ
agttaatgag cttgctgccg cgaagggttt agcgttatgg gctcacccta gagctaaaga 4086Θ
tttttatata tcgttagggt ttgatgccat tcctgatgca accaaacaag tgcaagacgt 40920
tgaattagct ttaatgttta ttcatgttga aaccattttg gatgcattga agtaactaag 40980
agttatcaag aaacggatta ccaccactaa accccgcttg cggggttttt atttggggtt 41040
Ctgtgccgga accgccgaac gccaaaactt atgcctcacg gaaatttcgg cggttccgac 41100
gtacaccccc taaaagcagt gctgtaagtt aattttgtct acgaccgtta aaattcaaac 41160
gcgctgtata gtcagtcgct aaagaaaaag cgtctagcag aagggatttg taagctaagt 41220
gccaaagtgg cgaagaaacg gagtaaaact gagattttca aaagcaaaag agttgatcta 41280
tataaaatgg ttgaaccatt ttattgtaag ttcacttgag tatgagccaa gtaagtaaga 41340
aagaaaggtt aaaaattgag aaaggtattt agacctggca ttaaagagca ggaacttaat 41400
ccctgctctc tatggtttat tgttgaagtg ttagttgttt aaatactcgc tgttgtaacc 41460
aatcaggttt cgttactaac cattgaatca acaatcccga tgggatcatt ggtaagtcaa 41520
PL 220 839 B1
ttagacgcgc tttttcaatt tggttatact gaaattgtga cataagttta gttaccttta 41580
ΐ C C t cl g t g tggcacaggc cagtgatgat cttgaccatc atcattggcc gtatttttat 41640
ccgtcatttc tcatttcaat accctcaact tccgtatttc gttgtttggc cacattaaca 41700
gtctgaccaa attcgggttc ttttaccttt aaaatagcaa ttccattgaa tataagtata 41760
caccttaaat attaaggtat acacttaaat ttaattattt aaggaggatt tcatggatag 41820
catgcagact acagagactt ttcaagagct taaaatgggg gctgatgcct atattaagcg 41880
acgtaaccaa cggttattgt ctaatcaccg gaaagagttg cgaaaattta cgcgtgcgga 41940
agcctttacc tatttggaca ttgacgcaaa aacacttgat aaatatgtat ctacagcaga 42000
ttttgatcca aggcggcatg aagattctca atggctaatc aacatagaag aaatgtataa 4206Θ
attacgagat ttgctaccag ataatttgcg caaagcatct aaatttaagc gcagtgataa 42120
ccagaaaatg caggttattg ttatacaaaa tcaaaaaggt ggtgttggta aaaccgtttc 42180
tgctgcaaca attgcttcag gcttggctac agagtttcat caagagtatc gggtaggcct 42240
tatcgatatg gatggtcaag ctactttgtc catgtattac gcaccagaag cggatctaga 42300
aggttgttta tctgttggcg atctcatgat gaataatttt gatctagatg aaggtgagac 42360
tcttgaacaa gtcgtttcaa acgcattctt acctacaact atacctaatc tccgtatttt 42420
gccggcatca caaagtgata gagctattga aggttggttt catgaacaag tatttggtca 42480
aaagttaaag tctccttact ctcttttgaa cacgatcatc aatgctgttc aagatgaatt 4254Θ
tgatatcatc attatcgata cccctccctc attagggtat gcaacttata atgcatattt 42600
tgccgctacc agtgtagttt tcccgttgtc catcacagaa aacgacattg atgctacttg 42660
ttcctatttt agttatatcc ctcaagtgtg ggctttattg gcgaatgcta atcatcgtgg 42720
ttatgatttt atgaagattt taattacaaa tcatcgcgat agcgctacaa caaccgatct 42780
aatgaatagt ttatacgatc attttgcgcc ttatatgtac tcaaatgaat ttaaacatag 42840
tgaagctatt cgtcagtcat cttcgttgct ttctaccgtg tttgatatgt ctaagagtga 429ΘΘ
ataccctaag agtaaagcga cgttccaaag tgcacagcaa aattgttatg aagtaaccag 42960
ccaagtccta agagatattg tgaacgtctg gcgtgaacag gagcaagcat aatggctaaa 43020
aaacgtgggg taatgagccc tctaggtaat gctgttggtg ccgaagaagc acaaataaat 43080
gcagccaaag ctaatattga gtctttaaaa cgccaaatta caactgaaat tgaaaaagta 43140
PL 220 839 B1
agtgaagacg taacgttatc tcttcaaaat ttatttggtt ttgaatctgt aggtaaaagc 43200
ttcttatggc aattagcttc tggtgctacc gctacattta ccgaagcaac attatcatat 43260
gaacaagttc gcgatagtac ctatgtgact ttcgatgtta acgggcgtga ccaggcatta 43320
ttaaatgcag attctctaca agatctcgat tcattagctt tccagcaatt ttacccagca 43380
gtcgctagag aagtgaatgg taaactcgat gtgctagatg gttctcgacg cagagcttgg 43440
tttttactgc aaaatggtga agttgatata tttcgcatac tggtaactaa agatgatatt 43500
tcactttcag atgctaaagc tctagctaaa cagctccaaa ctgcaaaaga acataaccta 43560
cgtgaaattg gccaacaatg tttatctttg gaaaaagcga atcctaagat tacacaggct 43620
gaagtagctg ctcaacttgg aatgagtcag gctggtgtga gtaaagcttt aaaagccgct 43680
aaggtcgatg aacgtttggt gaagcttttt cctgtggcta atgacttgtc acacactgac 43740
tatgctttgc tgagtaaagt tatggaagtc tatgaatttg aagatgaatt actatcattc 43800
atcaatggtt tgactaaaca agttgtcatt attcaggctg aatattcaag ggaagaacgt 43860
aaatcagcta tcaccaaagc gataaaagca gaacttcaga tcgctaagga tatgaaaagt 43920
aaagcacagg ttagtgttac taatcttgcg acatttgata gctcaggcat ttacgcaaga 43980
aagcgtatta aaggacgcaa cttcgcttat gaatttggtc gactgtcttt agatattcaa 44040
ctgcagttag atgttgctat tgcagatgtt ttgaaaaaaa taaatttaac acaaaatcag 44100
atttttaaaa aatttagttt tatgtcactg caattaaatt atttctccga ttgtggtact 44160
acatactaaa acgccttagt tacaccttaa atattgccta tttataacag tagataactc 44220
aggactatct actgttatct atctatttgc tgtatatgac ttcggttcga ggtgtacata 44280
tgagctataa acaatcgaaa tttttcagtg gtggatattt ccaaaatccc agcgacccct 44340
caaacccaca taaatacctt aacttgttta ataaatccac ttatgacaat atatctatct 44400
gatatttata tattttacta agggtccttg gtgttttatg aaagaagttt ttaatgctat 44460
tcgagacctg ttagttgttt ttttgcggta tgccttaaga tgcgtgctct ttaaacgaga 44520
ttttgctgac cataatgcag tacctgattt agccccggtt atttgtgaga agggtcatga 44580
acattacgcg caacagttgg aagtatatct gagccgagcg gaacgggtaa aagggattgc 44640
tgtaaccggt ccttacgcta gtggcaagag tacgtttctc aatacatatc aggttcacca 44700
ccctgaactc aagtacatta atatctcttt agctaatttc tatgatgagg atattaaaac 44760
PL 220 839 B1
agttggtgaa aacacattat tagatgctca acaacggccg acagttgaac gcattgaacg 44820
tgcagtatta aagcagttat tatatagaga aagtgacata gagagccgag gctctcgctt 44880
tgtccgtgca cctttaacta acccatctag accattcgca atcgctgtca cgtttactat 44940
aacgatattt gggattgcat tgttgtttgc gaacctttat ggcacaaaaa agatattaga 45000
ttgggctcaa ataaactcaa ccaattttac tgattcaacc caccctttat attggtttgc 45060
agctttcatg gtcgcagtgc caactttatt acttgctgat ttggttcgtt atgttagaca 45120
gatacgaata agtaagataa atcctgttag tggtgatata gaggtacagg gtaaaagtca 45180
tgactctgtg ttcaatctat accttgaaga tattttggct tacttcggcc atgctaaaat 45240
tgatgtggtt atatttgaag atttagatcg ctttgagtgc catagaattt ttgaacggct 45300
tagagaatta aataaagtac tcaacgatag taatgttgtc agtcggcccg tccgttttat 45360
ctatgctctt tctgatgatg tatttgaggg tcctgatcgg actaagtttt ttgatgcgat 45420
tgttccaatc cttcctgtgg ttgcgggggc taatgcctac ccacaattca aacaattact 45480
ggccaaagct agtatcacta tcgcagacaa tacaagtcat tgggatgatc tgtgccgaac 45540
tatcacgcta tatattcagg agatgaggct tcttaaaagc attgtggcgg agtttttatt 45500
gtacagaaaa gtgcttgaac tcaataacac ccaaggcagc gaaacaaaat tattggcgtt 45660
tatcgcgtat aagaatttgt atagtgatga ttttgcttta tgccaagaag gtaaaggctc 45720
gcttgttgaa caaatacaac aaaagaaaaa ttttataact ctagagcacc aaatgcttga 45780
aaagcaaata ttagagcttc gtcaagaaga gaaagaggcc gaggcagatc atttggctga 45840
tcaaggtgaa ttggctgagt tgatgttata tagagtgaat tcatctaaag tcactggagc 45900
tgattcttct tatcatccgc ttctctctat tgatagtatt cccctatatg gtgttgaaaa 45960
tcctgtggag gtggttgaaa gaatgtttaa cgcgacctgc agcgagtcat cgtacggaag 46020
cgttaatgga ataacaagga atggggggtc tcatggtagc ctcagaaaat ggtcagctat 46080
gcttgagtcg gcaatgcctg attatcaaac acgtctagcg cggttgaaaa atcgcaatat 46140
agaagctcgt caagcgcggc agaaaaaaat aaaacaacta caacaggaac aacaggcttt 46200
gagtttgcta agcctagcac aatgcctaaa gcggcctctc aaccaggcga cacctacgcc 46260
atcgaatgac aagccaatgc ttcacgcatt tctcatagca ggatttatcg atgaggatta 46320
cggcttctac ttgagtgccc atgttgaagg gcatcttact aaacaagata tggaattatt 46380
PL 220 839 B1
aagagcattg aaggggctga cagtattcga ccaaaattat gaatctggca actataaaga 46440
gctggtagca tttatcaatg gggaagcatg tgcttctcct gcggcatata acatcggact 465ΘΘ
gatagagtat ctgtcagact cgcaaaattc tgatgctatg ccttttttca ttgagatttt 46560
gaaaaatcaa tttaaagacc actcacaggg gcttgagcga ttagctcaac ctatctggag 46620
taaagtatgc tttaaatctc ttattaagca ttggcctgaa gtgttatcaa cattgcaaaa 46680
taatcaagtg ttaacaacaa gcgagactgc agtattactc gttagaatac tacttactat 46740
tgaggaagta agagaagatg agtcattttt cattcagtca ataattgatg cctgtgctga 46800
tatgcttgaa atagtcgcag atagtggcaa tgtatctaag gctctaaagt taatagcaga 46860
agccgatatt aaaatcgaaa ctgtgaatat tttacctaac ttatatgtgg tcattcgaga 46920
ggcactgaac tatcaagtgc taaagctgaa ctcagtaacg tttatcgcca caatatcagc 46980
aataagagat aaagacatca tcacttttcc tgttgcatat actaaattac caattaccaa 47040
caaagccttt aaatcatttc tatattcaga tattcatgag tatgcaagat taatctattg 47100
tggtgaaatt tccgaagtgc cagcaacagt tatagcttcg ctattgaacg atgagtttaa 47160
atctattttg actgagaaag agaagctttc tctgattgag gggctagact ttctgattga 47220
ggatctcaat attatggacc ttggtaattg caagttgata gccttagccg aagagtttcg 47280
aattgcgcct acttggtcta acgtagctgt gttaataaat ttctataaca acgttctaaa 47340
tgataaaaaa atagataaaa agcataacga aagcactgat gagttaaaag tcatggtgct 47400
gaatttttta caagcacaga gtacaaaaga tgcattatgc tacaaaggtg agaagttaga 47460
acttgaatcg gtacgcgatg agtttatttc atttatcgaa tctagtgaga taaacgcgga 47520
tagttttgct gaatatatag ctgcggtaga gtatcaatat ggtcctgata atatttatgg 47580
tttgcgtgag gatcaatcct ccatattgtt aaagagagga ttacttttac catcatttga 47640
gctttatcag gcgctaagag ctgaccagca aaataatact gctttagctt tgatacagat 47700
gaacgaatca atattcttta aacttaatat tatggaagtg gatggttctt ggttaccaga 47760
gttggagttt tcgtctgagg atttgttgaa attgatcgtc agtgattctc tttcggtaat 47820
agcaaaacaa gcgttattaa aaactcatca agtaaatatt tataaagata ttgccccgaa 47880
agaatggtta cacttggttt tacctattca aaagcaagaa aaaatatacg gactgactct 47940
gataaaaaat tcagttctga ctgagcaaat tgctattgat ttaggcttga ttcctgagca 48000
PL 220 839 B1
gttactattg gaagacgatg ttataaaagc attgcttgca atgaagtcaa tttcttcgga 48060
tgacaaagta cgtttattga tagggcaaat ggctcatcag aaagcgaaaa tcttgccaat 48120
gatcaattcg tgggactcga agccagatag tttctatacc actagtgatg gaatattgaa 48180
tggattgcta gataataata ccaattacgc tttcagttgt tctttggttt accatgaagt 48240
cgtatcttct tgctctgtca ggcgtggacg actacatatc aattacttta agggttagtt 48300
ttatttttca gccactcttc aacgatgact aggttattaa aaccgttcac tcgtaatagt 48360
attgttagtt taaagtagga aaatatcgtg gttatacaag aacaagcatt gagtaaatta 48420
gcgaatgcca tgaggatata tggcgaagct catatgaatt ttaatcgttt gaagttagtt 48480
gatgccgaag aggctattga taacttagat cgagctatgg aagccaagct tgaagctttc 4854Θ
catagtctat atgatgtaac aaagggcctc tttgattact ttgaccatgc ggatacagca 486ΘΘ
attctcattt tactgagaaa tgcagttcac caccgtaacc atctgttgtt taaaacttgg 48660
aatcaagaga tgggtttaaa tgaagggcac aaaaaatacc ttggtggtga gtttttgctt 48720
gcaagtcacg acattttgac taatggtcat gaaatgaagc atttgtacaa gcttgaagat 48780
ttctatctgc gaatagaccc atcactaggg tcaccttatg tcgaggatag aattagtgac 48840
aaaagtcgag aaaaattgtt aaatcagctc gaaaatgatc ttagttttgg tgcgcttaaa 48900
aaatactcaa acagtgaaag atacccgcta aaacatgtgt atataaatat aattcctatt 48960
tatatttcag ctactgttaa ggttttcaaa gcacttaacg aaaagggtgt aaagtttgtt 49020
ggttttgacg caaatgcata caaagaagct tttacaaatg aactagctgt agatttgggc 49080
tcgtttaatt attcgacaat acggatattg taattaaagt aacaactgtt taagagtgat 49140
tatcaatgca aagcattttc actattctat ctatggtatt cgggtggatt gcgttgctca 49200
cgtcttaaca ggcagttagc tttcttatat taaatggtgc tatttatgaa attttttgaa 49260
gcaggagttc aatataaaga tcttgatggt tctgtccatg cagaccgaga tgataatcag 49320
gatgcaactt attatctaag aaaacaccac agcattcctg ataatagctt cgtgcttggt 49380
attcaagttt attcgtctgt acataatgtt agatataata cccttacagt taggtttttt 49440
cattcaaatg ttggtagtta tgacaatatc caagaaaaga taaaaactga aggcgatgct 49500
ttggttctaa acgaagttga aattgaaatg ccttacaatg atttttttag tctgtttaag 49560
cgctttagtt taactttatc atctaatggt ttactcgaag gcaagtcata taccacaata 49620
PL 220 839 B1
taaaagctaa caaggcgtta tgcctatctt ggagactatc gtgaataatg agcaacgtct 49680
aagaattggg tactaccgtt cctctgattt aaacgatggg aaaatagatt ttggtatctt 49740
aaatgcagat ttttctttag attcctatag agagctttat cgcaactcga aggtgattct 49800
tgatttacag ccaatagcaa ttttgttcga agctgttcaa attaatttca acgaattaaa 4986Θ
ttctagtttt aatattggga ttaactttac gaagaatatg aaacctggta aaggggttgt 49920
ttttcaatat ctttcattga tgagtgattt gtctgtaaaa attacaaatt ttataacctc 49980
agcgaataca tttcttgtca actcggaatg caatcttaaa aagacatctg agcattttga 50040
atggaatgaa tatcgaaata aactacataa atcctcattt tcttacagat tcacttatga 50100
gttaagaaac tattcgcaac atcatagttt gccaatatca tcgctaaatg tgaaccaaga 50160
taagacgaaa gataaaataa ccttgcttgt aaacatgaaa agagatgagt tacttagttg 50220
tggttataaa tggggtaaaa ttaaaaatga catccaaagt tgtgacgagg tcttcgatct 50280
ttatcctcat ttaaataaat atatgaaaat tatagaggag ttattctcta agtatataga 50340
cgttaagagt gctaaactgc aagaaacaat catctatttt gcaaaactaa atagcacttt 50400
taagttccct gaaaaaagtg ttcctgtagt ttttgttggt gaagccgaaa atgacaaacc 50460
tgtacctaaa catcatgaaa tgataccatt tgaaaattta gattggttat taagtatttg 50520
taataaggta ggttcattat cctgatgaac agttctaaag ggaaaattta ccgtttgcca 50580
ttttcactta gttaaatgtt atcgctaacg ttaaatttat cattaactgg ttcgttaggt 5064Θ
ttctaggaag tattatgtat ctattagaca gatcaaagtt gaagctcgga gacatcattc 50700
tcactcgctc gaatgaaaag aacagctcat taatttgtaa gattactaat tcaaatttct 50760
cacatgctat tttgtatgtt ggtgaatcga gctatattca ttctgatctc tatggggtgc 50820
attctagtaa tactcagcga ttactaatag atgagcttca atatgtaaaa gttatgcgag 50880
tggacgatcc cgttgtagca gaaaaagcca taatttatgc gcggctacaa gttggaactt 50940
cctattcaaa ggttagtgct gctaatgcgt tcgttaaagt ttttacaaaa ctagattcga 51000
aaaggcagtt ttgttctagt ttggtcgcaa aagcttttga gtcggcaggt gtcaaacttg 51060
ttgcaaacag tgatgcgtgt ttaccgcaag aaatcgctga ttctatgttt gtaaaagaag 5112Θ
ttaaaggttg tgtgtatcaa gctgaaccga atgaaattga ctttgctaat agctatgatc 51180
ctatcaagaa tcaagctgaa attacaaaca acatactcaa atctgctaga aaaatgttag 51240
PL 220 839 B1
gtaacaaaat ccaatcactt tcagatatta ctaaagctct tatagcggac cctaaatacg 51300
atagcgaaat cactgatatt tatgagtcct ctggatactt aaccatgtgg gaatacgagc 51360
taaaagcaaa cccatggcga tataacattg acttatttga ggctttacca ttgtcaaaaa 51420
gtgaacaata tgtactagct acacaagagt tgaaaaatgc tgatgggcta cttgagttgt 51480
acaagattaa ctttgaacaa tacttttata tcaaagagtt acaccgtttg aaatatgcca 51540
accaacaata tatcttatac aaaaaattag ttgaaaatgc tcttgaccat aagtttacag 51600
ccgaagcaat tctcgggaaa tagaccatac aaagtgttcc aacaccgttc cggcgcttcg 51660
cgcctccact cgacagtttg taagtagcgc atttagcgaa ttgctgccca aggtttatcg 51720
caatgtgcta cttacaaact gcggttgaac acaacgttat acatcacatg gagtcaactt 51780
atgtcctatg aatgggtaaa ggatttaatg ccactggctg gtgttggttt aggtgtctat 51840
ctagttcctt atatcgaaag tagaaagtca aagtcagagt caaaaagagc tattgattgt 51900
ttttatgctg agttggctga ttatgaaaag gcagcatcct catacgtaaa aaattattat 51960
gaatcatact ggatactttg gaaggctgat aaaggtcaaa agtttaatga tcgtttttat 52020
gagcttaccc tagctcctcg tctagaattc ttatctttgg aaaccttgct tagcaagtct 52080
ttgctagagc tgtctagcga tcaaagaatg gctgttaaag cactaaagtc tcttgcagat 52140
aaaattaata aaaattcaga cctgattggg caagcgaaga gtgcggaaga ttttgtgctc 52200
ctaattggaa aatttagagc aaatacagaa atgttagctt cattttacta tttggttagt 52260
cgtatgcatc atgaagctga tcggtttgct tatctagatc taacaaatag tgaggtagtg 52320
aaaaaggtca atggagttct tggcatttcg ttcgaatggg aggatctagc gaaagccaat 52380
gtataacaaa ttgctgcacg ctgacacata ctgctacgct aatttttgtg ttttcgctgc 52440
gctccatttt atacaaaagc actctccgca gcatgtgcag gtgagaaaga cgttgtcaaa 52500
aatgaaccag tgaatcactc tacaccagac tgattttcac cccgtatctt ccttccaacg 52560
gggctttttt tgccttagaa tgaatcaaat ctttagagaa ttgattcatc ggtttttagc 52620
tcattcaact tagcagcctt ggcaatggta gaacgactgc atttaagcag actctgcact 52680
tgtgaccagc ttttcccttc atcgagtagt aaccgaatat tgtgcctcaa tccatggtta 52740
ggctgacgcc caaggtattt acctaaggtt ttggcctttt cgatgccttg tgcttgtcgc 52800
tttcttcttg tctcgtaatc atctctggcc atggccgcgg ctaaatcaat catgaactca 52860
PL 220 839 B1
gtcagtacct ttgcgatcat ggtatgttct tcagtgttat ttaagatccc atgtgtcatt 52920
ggctggtcaa caacaacaat atgaatatag gcttttacca atttactttt taggaccttc 52980
cattgctcaa aggggaggcg agacaatcta tcgacttttt ctatgagtaa aacatcacca 53040
gggtgagagt ccatgattaa gcgcccaagt tcaggccgtt caattttcgc ccctgattgc 53100
gtctcagtat aaaaactggc tatgcgaaca tttttacttt ctgaaaactg aaccaactca 53160
tttctggctc gattggcatc ttgttcatct gttgatgcgc gtaggtaggc ccgaataaac 53220
attttgcctc atttggtgtt tttaggatgt ggtttacgat gctagtgcga gtagggtttt 53280
aaatcaatat atagcgaacc aattggcaat gtgatgtggt tagtttgctt ggggtatacc 53340
ctaaatggtg gttcgtctag tggtatcctt gtgtatagat atactaatag cgacctactt 53400
cggatatgag caacgtgaca ctactcaagt tgtcgatacc tgcatactct tgagctcttt 53460
cttgtggaaa ccttacgatc atacttgccg caatgagaga gtaaataact ctttcaggag 53520
tatagaagct gtacttagat tatccccgat cagcgataaa cacgtgaaca tgctggggca 53580
ttattcgttt acccttattg aacaagtact aagtgggcaa ctcaggccgc agaagcaacc 53640
atcagagcag aacgaattga cttagcgtac gttttgttcc gttggacttc acactcctga 53700
agcaaggctt aaccagtata aatatgctac gctacgccaa aaagtggcgc acttacttaa 53760
ggtgttatgt gcaatcaatc agaggtatcg tattttgact gaaatgaaaa ccttagttct 53820
tttttaatta ctgctttggc agagattgtt ggttgttatt taccatacct ttggttgcgt 53880
gagggaaaat cgatttggtt gctgattccg gccgccatta gtcttgctgt gtttgcttgg 53940
ttgttatcct tacatccaac agcagcaggc agagtttatg ccgcttatgg tggtgtttat 54000
atttttatgg ctattttgtg gctgtgggta gtagatggaa tcaaaccaac aacctgggat 54060
tttgttggct caggcgtggc aattttgggt atggtaatta tcatttttgc accacgcacg 54120
tagtacataa taagttgttt aattttgttc cgcccacaaa aatcgtagcc agaactggac 54180
tggctacgct gcgccagcca attagcaaag cgttacctat agatattttt cgccactaga 54240
tctgaacatc taacaatttg tattccagag taatttagcg ttgttcagtt tcgattgtaa 54300
tcagtaccaa ttaagcatta gttttcatag ttagaaagca aacttagaaa tattttcaaa 54360
gagttcattg tttatcaaca acagagaatt gacattcaat acttgaattt agaatcttgt 54420
gttcagtcaa taaaatagat gtcactttgc gttattcacc aacgtttttt tagctcgatt 54480
PL 220 839 B1
attttatact tatcactgat ttagccactg tagagttaag ggatgtcagt aatgaaacaa 54540
cgcatcatat taaaagctaa tattttcaaa gctctggggc atccaacgcg attatggatg 546ΘΘ
gtagagcaac taacaaaggg tgaaaaatgt gtatgtgaat ttgttgaggg cgttgatgtt 54660
gatttttcca caatttctaa gcacttatcc gttttgcgcc atgctggaat tgtggatatg 54720
gaaaaacgag gtaagcagat tttttatcgt ctcaccatgc catgcttact gacatcgtta 54780
cattgcattg atggtttatt agatcaacaa attcagaagc agatcgcatt aatggagtag 54840
tttcagactt atcatttggt taaatggcaa aataacgaag taaccaagtg aggctaaatt 54900
atggatatta aaattctcgg tacgggttgt acaaagtgtc aaaaattggc agaggctact 54960
aatgccgcgg cgcaagcact taatcttgat taccagctaa ctaaagtgac tgatattgag 55020
aaaattatgg cctacaacgt aatgtcgaca ccggcgttgg tggtcgacga gcaaataaag 55Θ8Θ
ctgatgggac gacttgccag tgttgatgaa ctcatgacct tgcttcaagc ccatacagct 55140
tagtggcata aaggagtcgg catgaacgtt aaaaaaattg tccgctacct gctgctcact 55200
gtggtttgtg taggcttagg gttggttggg tatcagcaat ttggcacgat aaccgctgct 55260
aaaactaaca atgcggatat cgctgccagc gtgtcacctc aattaaaaga tgggctgaat 55320
gtttattatt ttcatggaaa tcagcgctgt acaacgtgtg tccgcatgga aaaattcaca 55380
cagtctactg tgatgaatca gtttttcaag caagtgcgcg atggtgaaat gcagttaaat 55440
ttggtgaatg tcgatttgcc tgaaaaccag cattacatcg atgattatca gttggtattt 55500
cgtaccgtgg tgattgctaa tacccataat ggcgtggata cagattggcg acggttagac 55560
cgtgtgtggg agttggccaa caacgagctg gcattcagcc aatatttgac tgaagagatt 5562Θ
aacgcaatgg ttaatcaaat tcaggcaaat caaaccctcg cggcgccatc tcccaaggag 55680
ctcccccatg gatgagtggg cagtcatgct gttatcggcc ttttggtttg gcattttaac 55740
ctctataagt ccctgtcctt tggccaccaa tgtggcggcc atttcctata tcagtaaagg 55800
aatacaatcg ccttatcggg tagtgggtac tgggcttgcc tacacgatag ggcgcatgct 55860
gagttatttg gtgattggtg tgatattggt tggcagtttg ctctcgacaa tgacattatc 55920
cgtcgcgctt cagaaatata tgaacctact attaggtccg attttgatat tggtagggat 55980
gtttttgctg gagttattga cgttgcgtct accgggtgat ggtgccttaa tcgaaaaatt 56040
aaagtctaaa atcaaccctc agggatatgt aggagcttta ctgctaggcg tgttatttgc 56100
PL 220 839 B1
gctgtcattt tgtccgactt ccgccgcgct cttctttggt tcgctgctgc cgcttgcact 56160
agagtcacaa tcgagtattg cactgccagc gatttatggt tttgcgactg ggctgccggt 56220
tttagttttc gctattttgc ttggcgttag cgcccatcgt gttgctaaag cctacaacca 56280
tattttgacg tttgagcatt gggccagaaa aatcactggc gtggtgttta tcatcattgg 56340
tgcctattac gcttgggtga atattttcgt tccatctttg ttttagcata attttattcc 56400
taacaatgct tatcttgtga ggtccttcct gtgaaaaaaa cgttggtgtt aatagttgga 56460
agtaccttta ttctattaat tgggatagta gtttggggtc ttaatttttc ctcaaaaaca 56520
caatatgctg aaagtaaatt aacggcagag atgatggcta agtcaacgtc taaaaagtcg 56580
caactacctc ctgcagttag cctttttaaa gtcacaaatc aaacgtttag ccagtatatt 56640
gtattgactg gaacaattga gccaacaaaa atggcgagtt tggcctctcc ggcagaaggt 56700
ccgattctta atcttgtggt gcgcgagggg gacactgtta atttaggaca agagatttta 56760
cgcattggac gaactcatgc ggctaattct tttcaaacat ctgccgctga agaagtacgt 56820
aaacaagtat taaatttaaa gcgtattgaa actttagtta agcagcatac tttacctgag 56880
gagcagttag acgaagcact agcatcatta gaaaaagcga aggcggcatt gagccaagca 56940
aaacaagctc ttaatgatta catcgtgacc tcgccttggt cagggattat atctaaagtc 57000
ttggtttcag atggtcattt cgttataccc cgtagtccct tggttgaaat gtatgatcca 57060
gatagtttgg tattacgatt tagcgtcgca gaagcccaag ctttagcgct taagaagggg 57120
cataaaatta aagcgacttt tgatgggctt gctgggaagg aatttgaatt agagattatt 57180
cgagcttatc ccgatttaga tagaaagtta cgtacgcgtc tttttgaggc ggcgctgcct 57240
gtaaatgagt ttattccagg tatgtttgcg cggatcagtg caatacaaca aaaacacgaa 57300
aatacccttg tcataccgat tgatgcgctt caagtgcaag gaaatgacaa aagtgtgttt 57360
gtggtgactg ataatatagc cactcgacga ttagtcgaaa ctggtctaga gcaggatgat 57420
caaattgaag tgttatcggg actgaaagcg ggcgagaaga tcgttctaac tggcattgaa 57480
cgggtgaaaa atggctctgc agtaagagta ttggagcaac ccgctaaaaa caatagcgcg 57540
ggtgttgtga aatgatcatt aaagccgcta tttctcgtcg aatttcaacg gctgtattgg 576Θ0
ctttcggttt agctattttt ggggcgctaa atctgaatat gctacctgtc gatttcttac 57660
cttcggttaa ataccctctc atcaagttat cgatagtttg gcagggtgca acacctgagg 57720
PL 220 839 B1
atatagacca aaacttagcc gatcctattg agcgtgaact cgcctcagta gatggtctag 57780
attatctttc atctagcgcg atagagggcc tatatcaatt ggatgtcaat taccgttacg 57840
gtgttgatgt tgatgttgca tatcaagata cgttagcggc gtttaatcgc tccaccaagg 57900
agctgcctgt tgatattgag gctgccgtca tcatcaaagc cgatccgtca caattaccga 57960
tagtacaagc tgtgtttgag tcggaacata tggatttgac tcagctgcgt acttgggttg 58020
attcatggtt aactcagcga ctgttatctg ccggtggcgt agccgctatt gatgttgccg 58080
gcggtcttga gcgtgaaatt cgtatttttg tggatgatga aaaactagaa gcccacggat 58140
tagatctcac cacgttagaa cgggtcctcg ctgctgagaa tttacaacgg gttggcggaa 58200
gggtgactgg ccaataccgt gagaatatag tgagggtgat gggggagttt aggcagttag 58260
ctgttattca agatctcgta ttaagccgcg ataataatgg caacattgtt cgtgtcaggg 58320
atgtggccga ggttaaagat agccatgaag acattcgtat gctgacccgc ttaaatggtc 58380
atccggcggt taaagttaac gtgattaaac aagccgacgc taatactgtc acaacggtag 58440
ataatgttga ggaccgttta gcggagttag cgccatcttt tcctaaggat atcaaattca 58500
ctttagttga aaaccaagcc gactatatca atgattctat ccgtggtgta cgtaacactg 58560
ccttagaggc tatggcgctg gttgtgctgg tattattcgt atttttaggt aactcaaggc 58620
aagtgttaat tattgcgata gccttgccat ttgcattatt ggtgaatttc tttttaatgc 58680
acctcgcagg cttttcactc aatatttttt cccttggtgg tcttgtcgtt gcgattgggg 58740
tgttacccga cacatcaatt atagtggttg aaaatatttc ccggctgcgt agtttacatg 58800
ataaggctaa cccacaatcc atctccgagg aggctacact ggaagtgggt ggggcgatta 58860
tggcagcgac agtgaccttt atagcgctgt ttgttccgtt tttactcgtg cctgggctaa 58920
tcaccttact atttaaagag ttagtcctag ttatccttgg tttgatgatc attgcaggtc 58980
ttgccgctat cacactgact cccatgctag gtggcgtgtt attaaaagcc aatcaacgcg 59040
aatttgcctt cagtgagaag attaaccatg gcttacgctg ggcttatggc gtcttgttgc 59100
atagcgcatt gcagtttagg ttaaccacta tatttatatt tattggtgtt gcaatcggtg 59160
gtgtgctgct gtttaagtcc gcagggtctg aatttttccc cgctgttgat gatggccgta 59220
tagtcgttaa aattcgaatg cctgcggggg cgaatttagc tcgcatggat gccatagcac 59280
agcaagttga agcattagtg ataggcgatc agcgagttcg tagtgttttt gcgctttcag 59340
PL 220 839 B1
gtggtgcggt caggggactg tataccaata aaattggtaa tgaaggtgaa gtcgatattg 59400
aacttgtccc ctccagtgag cgtaaaatta ctactacgga atacattaaa gaattgcggc 5946Θ
ctaaggtggc taagttgcta gccccggggg cgatattagc ggtcaatcag gcaaagatgc 59520
ggggtattcg ctctgtggga caggccgaaa ttgaagttga aattaatggc tcagaagttg 59580
atacactttt tgatgtggcg aataaattgg cggcaaaatt agccgaaagg cccgaattaa 59540
ccaatgtcta tgtctcgctt gattcttcga agcctgaatg gcaagttgat attgacagga 59700
ctctggccgc cgaacatggc ttatctacta aggaaattgc ccacgttctt aacggctaca 59760
ttaatggaag tgtggcgaca cgttatcgag aggcgagtga gttgtatgat atccgaatca 59820
ttatgcctga gtcacagtta cggtcgcgct ctgatgttga aaatatctct atagccacgc 59880
cttctggtca ttatgtgcgc cttaaagacg tagctaaagt gaccgcagca acaggtcctg 59940
ttgaaataat tagaaaaaat cagataaaac aagtaattgt acgttgtgat ccgtcagcaa 60000
ctgatcttaa ctcagcaaaa gaattggtca ctaatattct tacagagaca acttggccta 60060
cgggatacac ttattcgata ggcggtaagg cattgcaaat gacgcaaatg caaacgacag 60120
tgcaaagtat tctgggctat gcagtatttt ttcctttatt gtcttagcgg tacaatttaa 60180
tagtattcgc cttcctttgg tgatcttatt tgccgcacct ttttgcctta caggtattgg 60240
atatgggctc ttcttagcag gtcaaccgtt tggagctacc gtgatcattg cggctatgat 60300
agtgctagcg gccaatgtta ttgatggtgt gttactgatc caaaccgctg agcgtcaaaa 60360
acaacagggt atgaccttgt tgaaagcgac atttgatgca ggtttgagtc gacttcgtcc 60420
tcgactgatg acggtattac ccgccgtatt aggctttaca ccgttagcat ttgcatttga 60480
ggaaggaggg gagttattgc gtcctatggc cgctgcagcg ataggtggtt tgctattaaa 60540
tgtctttgtt gcgctatttc tggttcctgt tctgtatact tttatggcat ctacaccaga 60600
accagcatca gctgatataa cttaagcggt agggtaataa acgcggttat caaggttaaa 60660
aaacgcctgc gaagtcatta gcttcgcagg cgtttatttt gagattaagc agcgtttagg 60720
gagtaatcta taaacgaaaa tgttattgag ccactctttg cccattggca tcaataacca 60780
cttcaccgtc ttctttagta aaagcaccca gttggggttt gggtataata tccaatacct 6Θ84Θ
gttccgaggg gcggcagagg cgagtgccta atggagtaac gacgataggg cgattaatta 60900
ggatcgggtg ctcaagcata aaatcgatta attcactgtc gctaaactta tcttcactta 60960
PL 220 839 B1
agcctaatac ggtaaagggc tcaacatttt gccgcagtaa actgcgtacc gaaataccca 61020
tctccgcaat cagttgctgc agagtttgtc ggctcggtgg cgtctcaagg tagaggatta 61080
tggtcggttc aacccctgaa ttgcggataa ggcctaaagt gttgcgcgat gtgccacagg 61140
etggattgtg gtaaatctta atgctgtcat caatcatatt agtcataaca tgtctctgat 61200
aaataatcgc ttataaattt atccataggc actaaataga tgctctagtg cccatggaag 61260
aagattagaa ggagaggcgc agcgccagtg ccgctagggt gacaaatagc actggtactg 61320
tcatcacaat gccgacgcgg aaataataac cccaggtaat attgatattt ttctgcgcca 61380
gtacatgcag ccataacaag gttgctaaac tgccgatggg ggtgattttg ggacctaaat 61440
cgctaccaat tacgttcgcg taaatcatgg cctctttaat cacgccagtt gcattgctac 61500
cgtctatcga cagggcgcca attaacactg tgggcatgtt gttcatgatg gacgataaaa 61560
aggcgaccaa gaagcctgtg cccatagtgg cagcccaaag cccttgttct gccaagctat 61620
ttaatacgct tgataggtaa tcggttaagc ctgcgttgcg aagaccataa acaaccaaat 61680
acatgcctaa tgaaaagact acgatttgcc atggcgcgcc gcgaagtact ttagtggtat 61740
ctatggcatg gccttttttc gcgacaacaa acaggatcag ggcacccacg gcagccacta 61800
aactcacggg cacaccgagt ggttctaagc caaaaaagcc caccaagagc aagactaata 61860
caccccaacc ggttttaaag gtgttgaggt cgcgaatggc ggccttaggc tcgcgtagtt 61920
tttgcaagtc gtaggtcgcg ggaatatctt tgcggaaaaa cagatgcagc atgactaagg 61980
tggcgctaat agcggcaata tcgacgggca ccatcactgc agcatattcg ttaaagccta 62040
tgttgaagaa gtcagccgaa acgatattca ctaagttaga gacgattaac ggcaaactcg 62100
cggtatcggc aataaaaccc gccgccatta caaaggctaa ggtcgctccg gcgctaaagc 62160
ccagagccag taacatcgca attactatgg gggtgaggat cagcgccgcg ccatcattgg 62220
cgaacaatgc ggcaacagta gcgccgagta acactatgta agtaaagagt aaacggccac 62280
gacctttgcc ccaacgggcc acatgcagcg cggcccattc gaaaaatccc gactcatcta 6234Θ
ataataaact gatgatgatc acggcaataa aggtggcggt cgcattccag acaatattcc 62400
ataccacagg aatatcccct aagtgcacca cacccagtag tagagccaat acggcgccca 62460
aggtggcact ccaacctatg cctaatccct taggctgcca aattactaac actatggtga 62520
gtacaaaaat tgccccagct aaccacatac aagctcctaa aagggcagat accgtctacc 62580
PL 220 839 B1
cgtaacccta aaataatgcc cataaggata cattaatgtt gttttgccag taggcttaat 62640
cgcgtaatac caatgggttc aatgggatta atgccaaccg agaggctaag 627ΘΘ
ccctgttgca ctttctctat ttgcaccagt tcatggcgag cgcgtacttt taataatggc 62760
gaggtcgttc tggcaacggc gaggctatta ttgataagcc atgcccaagg ttcaatccct 62820
gcgcggcgca aatcttcctg caaattcgcg gcttcgagca caggggtagt ttcgggcaaa 62880
gtgaccaata ataccttagt gcgctctttg tcttgcaact gcatcattgg cgttgaatag 62940
tgagttgttt ctcccatacg tttagctact tcacggtggt aggcgccggt agcgtcaagc 63000
agcaataagg tatgccccgt tggcgcggta tccattacca caaagcgttt ccccgcctcg 63060
cggataatgc gcgaaaaggc ttggaatacg gcaatttctt cggtgcatgg cgaacgtaaa 63120
tcttcttcta acaaggcttt accttggaca tctaacgctt tgcccttcgt tgctaacacc 63180
tgttcgcggt agcgagtggt gacttcgacg ggatcgattc tgctgacttg caaattcgcc 63240
aattgaccat gcagcgtttg ttctagatgc gcggcaggat ctgatgtggt caaatgcaca 63300
tctaagccca gctctgccaa tctgaccgca atggcggcgg ccagcgtagt tttcccgaca 63360
ccacctttgc ccatgagcat gataaggcca tggtcctgct gcgcgatttc actgattaaa 63420
ctatccagtg ttggcacttg gggctgactg tcttgcttac attggtcttg ctcatccatt 63480
gcgggtaaat ctatgtcttc tgcaggcata aagagttgge gtaatggcgc aacgcctacc 63540
aggttcatcg attgaagtat cagcgtttcg tgaggtaatg ccgtgagaat gggggataaa 63600
ttggtgagca ccgcttgttc acgttggtag agtgctgagg caaggggatc attgagtgct 63660
gcgcctttgg gcaatacgcc gttaatcacc agatattgat tcttaaggcc cacttggcgc 63720
aattcttggt gagtgcgctc cacttctatc agggtggatt gctgtggacg cgcaactaag 63780
atcaagcgtg ttttgtcggg attggccagt gcagctaatg cttgcgagta gcgttccgcc 63840
tgtttttcga ggcccgctaa tgggccaaga caggaagcgc cctcggggtt agtctcgata 63900
aagctgctcc aagccccagg gagttgtaac agcctaatcg tatgccccgt tggtgcggta 63960
tcaaaaataa tatgatcgaa atcttgcagt agcgatgcat cggttaataa accggtgaat 64020
tcatcgaagg cggcaatttc agtggtacag gcaccagaga gttgttcttc aatactgcga 64080
actacatctg gcggtaatag gcctttgacg ggatccacaa tacgagcgcg gtattgctct 64140
gcagctgctt gaggatcaat ttccagtgcc gttagtcccg caacgctgtc tattggcgtg 64200
PL 220 839 B1
agtttattac ctatggtttg tccgaaaact tgacctacat tggatgcggg atcggtactg 64260
accaacaaca cccgcttacc actgtcagct aaggtaattg ctgtcgcgca ggatagcgat 64320
gttttaccaa caccgccttt accggtaaag aagaggaatg cgggcggatt ctgaataaat 64380
ttcattagat tatccttggt gtttccaaac gtgagttgac taacagcaag aggttttgcc 64440
actgcaacaa ggagcgatat ttttcgcagg ttctgcgata tcgatcttcg cccaacgggc 64500
tagttcctgc cgacttggat aacggcccgc taatatcatc tcaccattta ggagaataag 64560
cggtagggat tctgtaccag atgtttctaa aaagcgtctg acaagggcat tttctgcaaa 64620
ggccatgggc tgttgggata aattaaagcg atctactgta atgtettgtt gttttagcca 64680
ttggcaatcg gcggcaaagg tgacgagtgc ttggtcaact tcagtgccac acacgccaga 64740
gctgcaacat aaagcgggat cgaatattga aaattgagtc ataacttttc cccataaaat 64800
tgattttggt ttgaaagtgg aggcgataaa aggtggtaac aggcgcctta aaaatcactt 64860
catataaaca tatgaatttt catatatact atacgcttca aaaaagggga gtcaaacata 64920
ctgaggatat tcgtcattaa aatctaaaaa atctgaaata gatcatcttt atacgtgtaa 64980
atttttttac taaacttcag gatattgttc ttgatcacat tttttatatt tttcaactta 65040
gtttcacaat tgtaaatttc agtaaaggat acttgtgtat taattgatct aaatcgcagt 65100
tacataccct aaaagatata tattaaattc cataccctta tcaggagtgt ggaaatgaaa 65160
aaagaaattc aagtcaactt ggggcggcgc cagctactca agtcaactgc ggcgggcacg 65220
gtattaacag gtattggtgg gaccttatcc tttaccccta tcgttgatag tattgctgca 65280
gaattacctg cgcctttgcg tagaaccggc actggagagt ggttagcgac gacctgccaa 65340
g~t 3 C Ct catggtgcgc taagcagatt tatgtgatgg atggccgagc attaaaagtg 65400
aggggtaatc caaactccgg cgtacacggt atgtccagtt gccctcgcca gcacttaagc 65460
ttacagcagg tttacgatcc cgatagattg cgtacaccaa tgatgcgaac taatcctaaa 65520
aaaggccgcg atcaagatcc taaatttgtc cctattactt gggataaagc gctggatatg 65580
ttagcggata aaatcattgc tttacgcgaa gctaatgagc cccataaata tgcgctcctt 65640
cgcggtagat attcgcatat cactgattta ctctataaaa agatgaccaa tctgattggt 65700
tctcccaata atatttccca tagttcagtg tgtgctgaag cccataaaat gggaccgtat 65760
tatctagatg gtaactgggg atataaccag tacgatatca aaaatgctaa atttattttg 65820
PL 220 839 B1
tcatttggcg ccgatcccat tgcgagtaac cgtcaagtct cgttttattc gcagacatgg 65880
ggtgattccc tcgatcaggc tacagtcgtc gtagtcgacc caaggctttc tgcttcggcg 65940
gccaaagccc ataaatggat cccgattgaa cctggtcaag acagtgtgct ggccctagcc 66000
attgcccatg tcgccttggt tgaaggtgta tggcataagc cttttgttgg tgattttatt 6606Θ
gagggtaaaa acctgtttaa agcgggtaaa accgtcagta tcgagagctt taaagaaacc 66120
catacctacg gtttagtgga gtggtggaac caagctctta aagactatac gccagaatgg 66180
gcgagcaaaa ttactggtat agaccctaaa accattattg ccattgctaa agatatgggg 66240
gcggcggcac ctgcggtgca agtatggact tcccgtggcg cagtgatgca agcccgcgga 66300
acatatactt cgatttcttg ccatgcttta aatggcttat ttggtggtat cgatagtaaa 66360
gggggtttat tcccaggtaa caaaacgcct ctcctgaaag aatatccaga ggcaaaagcc 66420
tatatggatg agattgctgc taaaggtgtc aaaaaagaaa aaattgacca acgtggtcgt 66480
ttagcattcc ctgccattgc taaaggtaag cctggaggtg gggtgatcac gggtaacgtc 66540
cctaatggca tgctcgctgc tgatccttat gaaataaaag tgattttagc ttattttaat 66600
aacttcaact tttccaatcc tgaagggaaa cgttgggatg aagccttaag caaagtcgat 66660
ttcatggccc atgtgaccac caacgtgtcc gaattcagtt ggtttgctga tgtgttatta 66720
ccttctagcc accatatgtt tgaaaaatgg ggtgtgttgg attctatcgg taatggtgtt 66780
gcacaggttt caattcaaca accctcgatt aaacgtctat gggatacccg tatcgatgaa 66840
tctgaaatcc cttacatgtt agctaaaaag ctggcagata aaggatttga tgcaccatgg 66900
cgttatatca atgaacaaat tgtcgatcct gaaacaggta aacctgctgc ggatgaagct 66960
gagtttgcga agttgatggt cagattcttg actgcgccgc tgtggaaaga agatgcgtct 67020
aaatacggtg ataagctcaa ttcatgggat gagttcgtgc aaaaaggggt gtggaatagc 67080
tctccttata agcttgagtc tcgctggggt aagttcaaaa cagaaacctc taagtttgag 67140
ttttacagta agaccttgga aaaagcgttg caagaacatg ctgataaaca caaagtcagc 67200
atagatgagg taatgaaagc ttgtgactac caagctcgtg gtcaattggt atttatccct 67260
cattatgaag aaccctatcg atttggtgac gaagccgagt tcccgctgtt actcgtggat 67320
caaaagtcac gtctaaacaa agaaggtcga actgcaaata gtccttggta ctacgagttt 67380
aaagatgtcg atcctggtga tgtggcgaat gaagatgtgg ctaaattcaa cccgatagac 67440
PL 220 839 B1
ggcaagaaat ttggcctcaa agacggtgat gaaatccgca ttacaagccc tgtgggtacg 67500
ctgacctgta aggcgaagct atgggaaggt gtccgtcctg gcactgtggc taagtgtttt 6756Θ
ggccaagggc attgggccta tggacgttac gccagtacca aatttggcat aaccccaaga 67620
ggtggctcaa ataatgaett gattgcagae aggtacgatc gcttaagtgg cgcgtcggca 67680
ttctatggtc atatccgtgt tcgtgttgag aaagtgtgag gtaacccact atgagattag 67740
gaatggtgat tgacctacaa aaatgtgtag ggtgtggtgg ctgtagctta gcctgtaaaa 67800
cagagaacaa cacgaacgac ggtattcatt ggtcgcatca tattgccacc actgagggga 67860
tttttcctga tgtaaaatac acttatatac cgaccttatg taatcattgt gatgatgcac 67920
cttgtgtaaa agtctgcccg acaggggcta tgcacaaaga taagcgcggc ttaacgctgc 67980
aaaacaatga tgaatgtatt ggttgcaaga agtgtatgaa tgcttgccca tacggcgtga 6804Θ
ttagttttaa tgcggcaaca ccacatcgtc gttggcagga tgactcagag gtggtcgcga 68100
acggaactgt atctccactg atgctgctca aacgcacggg ggctgctgca tcacccaatg 6816Θ
aaaacccaga gcggggtgat acttaccctg ttacacgacc aagacgcact acagagaaat 68220
gtactttctg tgatcatagg cttgataagg ggttgaatcc tgcctgtgtt gacgcttgtc 68280
catctgaagc gcgggtgatt ggtgatttag atgatccgca gagcaaggta tcccagttga 6834Θ
ttaaattgca taaaccgatg cagttgaaac ctgaagcggg aacgggacca agggtatttt 68400
atattcgcag ttttggtgtt aaaaccgctt attaatcata taggttaatt tgttagttaa 6846Θ
agccacagat gagattctgt ggctttttac tttatacgcg ccctgttaat cgctaaacat 68520
cagcgaatct aatacccctt ggccgctgtg aactccaccc tcagtcacca tggccgattt 68580
gctgcgaact aaatatcccg cataaccggg gttgtcgcta ttagagctat cctccatcac 68640
aggctcgcca tcaatgtgga tggtgaacat gcctatttca gggatcatgt catttatggt 68700
ttctatcttg ccgttacgca ccactaaggc tggtgttgct ctcggtctag ggtgtaagcg 6876Θ
gcgcatcagt gaccatgctt ggtattgcgc gggttctagc tcggctaatt catgtgaaat 68820
atcggtacca aacaggcaat tgccaccgcc ttcaccttga ttttttagca cccaagtgtc 68880
tattggggat gcttcgacta atttgatact ctctggggta acggggcgca tctcgccgag 6894Θ
gagggatttg accattttgg cttgttgcag cgttaaacca aactgagtca aggacatttc 69000
atccatagac gagagcagca tctgcatccg cttactggtt gccagttgtt gccctacggt 69060
PL 220 839 B1
ggcattgacg gcaacgcgat gtttttcaat caatacacgg atcgccatca gggcttggca 69120
gtttttgtta ccattgatgt caacggattc ataatctgta tattgataac ccgctcgcag 69180
ataaacggta tcaatagtgc ctatgccttc gagtatcagt ctatgttttt cgcctgtggt 69240
aacttgttct tgtagttcac taaaggttct gcgaattgtt tgtatctttt gttgttgtaa 69300
cgcgagttcg agtaaatgtt ggtcaaacac attgtcttca ttttcttgca ctatcatcaa 69360
aaatcttgct ggccccgcat cttcaaattc ctgttttatc ttaaaggttg ctttagctat 69420
gcctgcggat aattgttcaa tggcatgatt atcaacaagt tcacctatag gcagttgatg 69480
ccattgctgc aaataatggt ggaattgatg cactctctga ccaaagggcc ccataccagc 69540
cgcaatgcca ttaaactcca ctagttttgg ccctaagtcc ttatcgtcca tgaagtcact 69600
acgcataatg agcaatggca ttctctgcgc tggagtctgc gagcaatgta cttgctggtg 69660
tataccaagc aaggcggcaa aaaagggatc gctagccgta ataggttgaa tcgcatcgta 69720
taagaaggca tgttcttctg atatagaatg aataagttta ccgagtaaat gcacagaatc 69780
ttttaagtat tgatagtgac ctcgactgat taaactcggc gttaaggtaa atggcgcgtg 69840
gcgggcagaa tattgggttt ctttaaacgc catgccatgg gttagcgccc attctattgc 69900
atcatctttg gcttttagac taataggtga attcattatg cttctcttaa gcgaggcgaa 69960
tttattcgca ataccagtat gttataggtt tacgttttag atgatttaat cttggggcgt 7Θ020
aaaggcccta tggcactcac tttaggagca tgcggtgagt gccatatcga gttagaacat 70080
tattttttgt gttaactaaa tacatagcta taaagaaatc cggcagtcat tgccatactt 70140
aaaattaccg ctaaaaatgc aataatcatc tgatttttaa agagggattt tagtaaaatg 70200
acttctgtta aactcgctcc tgcactgccg ataattaagg ccattacaga acccatcgcc 70260
atcccttttt gcactaatgc ggcgctgaga gggattactg cttcggcgcg aatataaagt 70320
ggaataccaa ttaaagccgc cacaggaata gcgtaccatt ttgcttcacc ggcatattta 70380
acgattaaat ctgtaggaat aaaaccgtag atcattgacc ccaacagaat gcccacaaat 70440
agataaggta gtacttgttt gaagtccttc caagtagagt gccaaactct tatccagcgg 70500
ctctgaggct tacttttggg tgctatatca gtagtcgtta ctggtttagt atcgcaacat 70560
gagttcgcaa cagctgtggg tttagtatcg caacatgagt tcgcaactgc tgtcgattta 70620
gtttcgcaac aggtactgga aaaggaggaa ggtttagtgt cacaacatga agtgacagtg 70680
PL 220 839 B1
tcttccagag tataagcttc tttacggaca tacctttcaa accccagctt ttcaagcata 70740
tagcctgcaa tgacagagac tcccattgct actacaaaat aaaaaagtgc tacttttaag 7Θ80Θ
ccaaaggtga caacaaatag tccgataata atcggattca gtaatggact ggcaaacagg 70860
aataccatca tagggccaaa accggcacga gccctgagta agcctttcaa aaatggaatg 7Θ920
gtagaacaag agcaaaacgg ggtaattgac ccaagtagtg cagcaatgac ataacctctg 70980
ccgttgcgtg agcttagcat cgcttgtatt ttttgagggg tgataaattc ttgtaaaata 71040
cctactaggt agcttatgac aagaaatagt agggtaagct caacggcaag gaaagcgaac 71100
atgcttgccg tttctttcat cataagaatc atttcaggac tcattttttt acctcttcaa 71160
cttaaagttt cgaatattct agaataatag tgtttgggcg aagtgttttc aatatattat 71220
ttctagaata atggaaatat ttggtatacc tattgatgct taaacacatg acaccctgct 71280
tttgattgtt tatgagtggt cgattttgag gtcgctaggg taaggatatt tctggtatta 71340
tcgaattact taacgaaatg aggccgatat gaatatagag aatgctgcta aagtattaaa 71400
agaactgggc catccaacgc gtctcgccct atttcgatta ctggtcaagg gcggatatgc 71460
tggcgttgcg gtgggtcagt tacaagacga gttgcagatc cctggttcaa ctctctcaca 71520
ccatattagt gcccttgtgt cagcgggagt gatttcccaa cggcgcgagg gaagggtgct 71580
gtactgcgta cctgactatg aattattaca aggattagtg cattttttac aagatcaatg 71640
ttgtagtgct cagtgaacaa ttttgttaaa tgaacagtaa attattacat gtggatattt 71700
acatatatga taaatcgtat atagtgacat tctctttcat caggactcat tcccatgaaa 71760
aaacgtgtac tttttctctg tgttggtaat tctgcgcgtt cacaactcgc tgaggcctta 71820
ttaagacacc aagcccaaga gcagtttgat gtgtttagtg cgggtacgca gcctgagccc 71880
atcgatgagc gaactcttgc gcttttgcag aaaaataatt tgggtacgag tgagttacgt 71940
tcgaagtctg tcagtgagtt tagtgggcaa tcctttgact ttgtgatcag tctctgtgaa 72Θ0Θ
aaatcaacgc aagagtgtca gagtttcccc ttggcagata agattattgc ttgggattat 72060
cccgatccca aaatcgaatc gggcactcgt gggtttgaac aaacttttag agaactcaac 72120
gaaagaataa aaatgtttgt actcgttcag tctaaggatc ttaatgatta atcctacgca 72180
attttttaaa tgtttagccg atgaaactcg cttgcgctgt ttgatgttga ttcagcacga 72240
gggtgagctt tgcgtctgtg aattgaccga agccttgcag gaaattcagc ccaagatctc 72300
PL 220 839 B1
gcggcattta gcccaattac gtaagtgcgg attattagtc gatcgccggc aggggcaatg 72360
gattttctat agtatcagta atgatttacc cgaatgggga aagtcagtgt tgagtgaggt 72420
taccagccaa aatccggtat tccttgaaga aaacatgcgt aatctgtgca agatgggtgg 72480
ccgccccgag cgcgctagag cctgttgcta aagattgttt gtaacaaata aataaaaaat 72540
ttaatctaaa atatatgaaa attcatatat taaatcgcta gaggttgata tggcaccagc 72600
tataaaagtg ctctttctat gtacccataa tgcctgtcgc agcatcctag ctgaagctat 72660
aggtcgagat ctcgtcggta agcaagcttt gactactatt gctcaatggc aatttgcgag 72720
tgccggtagt gaacctgccg gggtcgttca tcctcaaact ctattgcaac tagcacacag 72780
aggctatgtt accgaagggc tctgcagcaa aagctgggat atgatggcgg atttcactcc 72840
tgacttagtg atcactgttt gtgataatgc tgcgggagaa acctgtcctt tgtggttagg 72900
tcaaacactt aaattacatt ggggtttacc cgacccaaca tcaatcgacg cccccgatat 72960
agatgagcaa tttagctatg ttatagaaac acttgaaaat cgtataaagg cattaatctc 73Θ20
gttgccgctt tcggcaggta tagaagctca aaaagcatca ttacaatcaa ttgcgagtca 73080
atttccactt attcaaagat aaatggtttg tatttaattg gtgtttattc aactaattaa 73140
aatagcaata tccttttgct tcatcgcttt catgtatacc aaggaagttt gattatgctg 732ΘΘ
caactatttt ccgatttagc gagctggcta acctttggag taatgggttt agatcccaat 73260
actaagctcg ccgacgccat ccattttttt attgaagata ccactaagat ttttgcgctc 73320
ctgttgctga tgatttatgg catcgctttg gtgcgggcct cgctcaatgt cgagcgcgtt 73380
cgggattact tggcgggtaa aaatcgtttt gtcggttact ttatgggatc gggttttggc 73440
gcggttactc cattctgctc atgttcgagc attccggttt tttaggtttc acctctgctg 735ΘΘ
ggatccccgt tgggatcact atggcgtttc tgattacttc gccgttaatt aatgaagtcg 73560
ccgttctgtt gcttgtgagt ctgttgggct ggaagtttac tgtgatatac gtgctggtcg 73620
gcatgtcagt gggtatgttg gcgggggcat ttttggacac gatccgcgct gagcgttggc 73680
tgcagtcctt tgccgccaaa gcactcgagc aaggaaaggc acaagcaagt cacgataata 73740
gcgagggtat gacatcaaca tccatgacgt taacggaacg gcatgaattt gcgaaaggcg 73800
agaccctaga gatttttggc cgagtgtgga aatgggtcat tattggggtt gggcttggcg 73860
ccgcactcca tggatttgta cctgacggtt ggatcgaagc ccacttaggc gatggtcaat 73920
PL 220 839 B1
ggtggtctgt tcctgcggcg gtattgattg gtattcctct gtattccaat gccacagggg 73980
ttatccctat catggagagc cttatcacta atggcttgcc cgtagggaca acattggcat 74Θ4Θ
tttgtatggc aacggttgcc gccagttttc ctgagttcat tttgctcaag caggtgatgc 741Θ0
aatggcgttt actggccatc gtttttgcca ttttattgat ttcattcacc ttaataggtt 74160
ggatctttaa cgctataggt cccgttctgt gagaattata aaaatgctaa acatcaaagt 74220
attaggcagt ggatgtgcca aatgcacaaa aaccgctgag attattaccg ccatcgccaa 74280
cgaaaagggc atcagtattg cgctggtaaa ggaaaccaat ccagaagtca tcatgggcta 74340
taaggtgatg agtacacccg ctgtggtgat tgatgagaag ctagtgcatt ggggctccat 74400
tccccataga gccatgattg aatcttggtt agtggggtaa cacttaaatg tcacatccat 74460
ttgatatttt gccgctagag agtggtgcta ggttgatttt taccccttgc ccagggacta 74520
aatctgtccc tgtgacagag gcggtggcaa ttcttaaagc ggcgggaact gaggtcatca 74580
taaccttaat gccacttgcc gaattgcaaa catttggtgc tgcattattg cccgatattt 74640
gccatgaagc ggggatccgt tggttgcatt tacctataga agatgatgcg gcacccgcag 74700
aggtattcga gctcgcgttt gcacgacaca aagcagaact gctggcattg atgcaaactc 74760
aatccacaat tgccattcat tgtcgcggtg gttccggtcg cacaggatta atggcggcaa 74820
tcttgctgtt actggcggga ggcaccttgg cagaagtgat tacccaagtg caatccattc 74880
gccctaatgc cttaaccaat gtgcatcaac gtggctatat cgaacagata acgctttaat 74940
cttaaacaaa taatataaaa cacctaatat aaaactgagt gtgaaggatg caggtatgac 75000
aatcaaaatc gggataaatg gctttggccg tatgggacgt ttagcactgc gcgctgcttg 75060
gggctgggaa gaggttgagt ttgtgcagat taatgatccc gccggagatg cggcgacctt 75120
agcccatttg ctgacattcg attctgtgca tggccgctgg caacatgagg cgagcagcga 75180
tggcgatgac atcattatcg atggcaagcg tattcgctgt actcgcaata aaaccatcgg 75240
ggaaaccgat tggtccggtt gtgatgtggt gattgaagct tcgggtaaaa tgaaaaccaa 75300
agcagtgctg caagcttatt tagatcaagg cgttaaacgc gtggt c a cagcgccagt 75360
taaagaagag ggcgtgttaa acgttgtcat gggagtgaat catcaactct atgacaaagc 75420
tattcatccg attgtgactg cggcctcctg tactactaac tgtttggcgc cgatcgtcaa 75480
agtgatccac gaaaacctcg gcatagtgca tggttccatg acgactattc acgatattac 75540
PL 220 839 B1
caacactcaa actattttag atgcaccgca taaagatctt cgccgtgcgc gggcctgtgg 75600
tttaagcctt atccctacga caacaggctc agcgacggcc attacccata ttttccctga 75660
actcaaaggt aagcttaacg gccatgcggt gcgggtgcca ttagcgaacg cttcattaac 75720
cgattgcgtg ttcgaggtga gtcgcaaaac gaccgaagct gaagtcaatc gcctgttaaa 7578Θ
agaagcggca gacggaccgc taaaaggcat tttaggttat gaggaacgcc cattagtctc 75840
ggtcgattat aaaaccgatc cgcgttcgag cattatcgat gcgctatcga ccatgattat 75900
caatggcact caggtcaaac tctacgcttg gtatgacaac gagtggggtt atgccaatcg 75960
caccgtcgaa ctggcccgca tggtcggtct gatggataag gcataagctt tatgggtaag 76020
ctgacagggt tcttgtctaa catatcaccc gagatccgcc agtatttggt ggtcacaggc 76080
aactattggg cattcacgct caccgatggc gcattacgta tgttagtggt gctccatttt 76140
catggcttag gttatagccc gctgcaaatt gccatgctat tcctcttcta tgaaatcttt 76200
ggggtggtaa cgaacttagt cggcggctgg ctcggggcgc gtttaggctt aaataagacc 76260
atgaatgtag gcctatttat gcagattgtc gcccttagca tgctgcttgt gcctagcggt 76320
atgctcacgg ttgcttgggt gatggcggcg caggccttgt cgggtatcgc taaagatctc 76380
aataagatga gcgctaaaag cagtatcaag ttgttggtgc ccaatgatgc tcagggtgag 76440
ctgtataagt gggttgccat gctcactggc tccaaaaatg cgctaaaggg cgcggggttc 76560
ttcttgggcg gcgccttact gaccctgttt ggattccagc tggccgtgtt aggtatggcg 76560
attggcctat tactggtgtg gatttttagt ctgttaagtt tgcaacgcga tttaggtaaa 76520
gccaaaaaca aacctaagtt cacggaaatt ttctctaaga gtccggcggt aaatacgctt 76680
tctgccgcac gcatgttttt gtttggtgcg cgggatgtgt ggtttgtggt ggctttaccc 76740
gtttatttgg cctcagcctt tggttgggat cattggtatg tcggcggttt tctcgcactc 76800
tgggtaatag gttatggcat agtgcaaggc tttgcacctc gcttgacggg gacaaagtcg 76860
gcgagccaaa acaaggttcc cgatggacgt agcgccttag gttgggcggc gatattgagc 76920
atagtgccgg caggcattgc gctggcgata agttatgact tccatgccgc gaatatactg 76980
atttggggat tgatgctgtt tggcgcctta ttcgcgatca actcttcatt acacagctat 77040
cttatcgtca gttatgcgga tgaagatggc gtatcgttag atgtgggttt ttactacatg 77100
gctaatgcta tgggacgctt gatcgggact gtgttgtctg gctgggtgta tcaagtgtat 77160
PL 220 839 B1
ggcatggcgg cttgtctgtg gatatcggcg gcatttattg cgctcgcagc gcttatctca 77220
attaagcttc caagacatag agcgatataa agacattaaa cgcgaaaaaa tgtcacaaac 77280
aatatgcgaa ttaacatata tgtcatattt catatgtatt ctagcggtgt tacataaaga 77340
cagttaaatg acacctatgt ctccaaatga ggatatcaat atgaaaaaaa cagcgttaat 77400
gtcactgctt ggtttaggat tatttgcttg tgttgctcac gctagcgagt tcgatttacc 77460
gggttttgtc actgaagtag aagatggtcg tctatgggtg tttaaagaga attcggctga 77520
gttaactgag tttaaacagc atggtgagcc agcaaagcaa tttactgtca ttggtgttgg 77580
tcctaagggg atgacggtta aagcggccga tcaaataacc ttagatgaat atttagctaa 77640
ggtaaaagcg aactaatgta cttagtgaag cgttactcga atttctaaat cccattttct 77700
gatgttttac gagttggaac tttggttcta actcgtaata tctaaaaatt aggtgaatta 77760
ctctagccca gattgactga gtcagactta cctattcggg ttcacgtgcc aaacccctgc 77820
tattttgtgc agccttctta ctaaccaatt tttgccccat tgtgagctat gaccgattaa 77880
tcactcagtg cacagaggat aattgactta catttagtca ttccaaaaat atggaagtaa 77940
agtcaaatta cgcctctatc taagtgacca aatttagcgt accagtacaa gtcaataatc 78000
tgtgggtatt gaccagattt atgcaactaa agtggatttg tctgcaatta tttaccgttt 78060
tccatcattc attgccattt caagcgaaat atcactcgcc accgaaccct gattttttgt 78120
ggataacacc ccaaagagcg cggtgattat ccaccgaaaa aatcacgaac cggcagcagg 78180
accgaaattt tagaattttt taaatttcct gctattatta ctgattattt atacagtagt 78240
ttggtgctat gaaactcata acatgccatg cgagtgcagg aatttcgggt tttccaagtc 78300
ctgcagcgga ttacgttgaa ttacccctta gtcttgatca actgcttgtt gagcatccta 78360
gctcgacctg gtttggtcgt gctgcgggtt gctcaatgga aggggttggg atctatgatg 78420
gcgatatact ggtgattgac cgtgccgcta agcgccgtaa tctctctatt gttgttgcca 78480
gctataacgg agaatttacc gtaaagctcc tcgatgaaaa gcgccggtta ctggtttcta 78540
tcgatcaaca gcaaaacatg acgtccgttg caatcgatga tgcagatacc ttctcggttg 78600
aaggggtgat catcaagtca atccgacttc acgagcattc aagcttactt gaacaatatc 78660
tgagtcaatc atgtacggac tgattgatgc taattcattt tatgtgtcat gcgaattggt 78720
gtttagaccc gacttgcgcg aacttcccgc gattgtactc agcaacaacg acggttgttg 78780
PL 220 839 B1
tgtggcagtc aatcgagcgg ccaagtccgt tggcgtgaaa aaatttgtcc cttactttga 78840
gctgcaacat ttgtgcagac aacataatgt gcaggtgttt tcatctaatt atgaattgta 78900
cgcagatctg tctgcaaaaa tgatgcaagt gatcgggcgt ttcgcacccg agcaatacgt 78960
gtactccatc gatgagtctt ttgtgtcgtt taaaggctgt gctgcaattg cagacttaac 79020
ggcacattgt gctcagctgc gccgaacagt ttggcgtgaa tgccgtttgc cggtgtgtgt 79080
gggggttggt gagacattaa ccttggcgaa gttggctaat catgccgcga aacaattggc 79140
tcaatataaa ggtgtttgcg ttattgataa tgatgcgcag cgtattgaga ttttaaaatc 79200
gatgccagtt gatgaagttt gggggattgg ccgcaaacta acggtcaaac tgggattact 79260
gggtgtgcat actgcctatg atttggcaca actggcgccg aaagtggcgc gacaacattt 79320
ttccatcgat gtagagcgaa ctgtgcgaga actcaatggg cagatctgta aaacgtggga 79380
tgtcaccaaa gcagataagc agcaaatatt ttccacccgc agcctaggcg aacgaatatg 79440
tacccgggaa catttacacc aagcgttagc aaagcatgcc gcaattgccg gtgcgaaggt 79500
tcgagaacaa ggctcattgt gtaaagcaat ggtcgtgttt gccgccaact cgccacatga 79560
tccacagcct gtgtatttta aaaggcttgt tcagtttact tgtgccactg atgacagtcg 79620
tgaactgtgc gccgcggtta gcagcgagct atcaaacctt tatcgcccag gtgtgcgcta 79680
ttaccgaatt ggtgtaggcc tgattgatct ttgccctaaa acgtcagtgc aatatgactt 79740
atttaatgcg ccaaagagcg atcctaactt aatgaaaatc tttgatagtc tgaataatcg 79800
ctatggccgt gatgtgttgt atattgctgc acaggggagt gatcagcatt ggactatgcg 79860
ccgtcagttt ttatcgccgc agtacaccac ccgttggtcc gatattccga tgattaaagc 79920
gtaataggat tttatggtgc tttatccagg ccttactcca cgtatacaac ctaaaacgtc 79980
tgtcataggt tacaattttt tgagaataag aggaaaaatc aaatgtctag gaacttagaa 80040
gttaaaaagc aacaagcgct aatggttaaa gagcaagttg acattatttt aaagcgttat 80100
gaactgagtg atgctgacaa ggacaaaata gcaaaggacg ttgctgatgt tatcttgact 80160
gcttgggatc tacaactcag tgatttgagc tttggtaata cttggtgtaa acctgagatt 80220
aacactaaac agtgttaaat atttctctag gtcggcgttg cgtccatcgt tctaatatca 80280
cggaaatgat ggacacagaa cgtcgatcta catctagagc tacatctata taaggtataa 80340
acaatgagaa caaaagaaga ttttttcttt ggtaagacgc atcaaggaag caaaggtata 80400
PL 220 839 B1
acactccaat tgagcgatat cgagtctctt gcggaaaaag tgtcagataa tttttttact 80460
gcacaactga atagaatgct gcaggagcat gggggaaggc tgactatatc agatgaaacc 8Θ520
tcgcttccca atttctggag cctcatcgat aaaattgcca ttgagcaagt agggttcgtg 80580
gaaatttatg ctcgctatga cgtcaatgat agtgttaacg cgacgctggc ctgtgacatt 80640
gtgctgttaa atggtgtgct ctcgattaag tcgcattggt gcgcgtataa agaaattaga 80700
gcgggtgaga ttgtttcttc gttattggtg cccttgcacc tgaaagctct tcagaacaaa 80760
acctatattc gctgggatga tggcacaaca gagtcactgt tggagatgct tgattaccag 8Θ820
acagagctag aaaaggtgtt tctgcttgct aaatatccct ctgctattaa tcgtggtgtt 80880
tcatacatca ttgatttgga gtgtgcgaca gataccggtc ggcgtggtat ttcgtcagaa 80940
ctggtatggg atgtatatca agagcttcga acagaacgat gtgtcggaaa gtagcacatt 81Θ0Θ
ggatactaaa gactgcaaaa aactaacgga tctaatgcgc tctggccgta aatttggggc 81060
gacaacttat actgttaaag ttatgagtat tggggctgtt gatgctgtga gcgatagtga 81120
aaaagtagtc gttatagctc gtaacgataa gactggaatg cttgttatga acgaacaggt 81180
tgatgccaaa aatgttagag acaatggtat tcctttgccg agtattcatg acataaattc 81240
agagtttgag taattagtgc ggaaaatcac gaatgttcaa tttcttaaga agaaaaccga 81300
agatatcaat tcccactata gatagggttt cagaagagat tcaaggttat cttcctgact 81360
accaaggccc gactataaat tatcgttttt tctccaattc aaaatatatc ggttcagtga 8142Θ
aaactgagtt gtggaaagag gataatctct tattggttca tgatattagg gcttccacta 81480
caggggtaaa aaatggcact gctatggtca gttggttggt ggctaactct tctgaaatga 81540
tacaacccgt tcatgttatc tgtggtgggt tgggtttctg gtataaattg a 81591
Zastrzeżenia patentowe

Claims (16)

1. Wyizolowany plazmid obejmujący fragment sekwencji nukleotydowej od 63978 do 72599 z plazmidu pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1.
2. Wyizolowany plazmid pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1.
3. Szczep bakteryjny Shewanella sp. zawierający plazmid określony w zastrz. 1 albo 2 albo zawierający sekwenecję nukleotydową obejmującą nukleotydy od 63978 do 72599 z SEKW. ID. NR 1.
4. Szczep bakteryjny według zastrz. 3, znamienny tym, że jest szczepem Shewanella sp. O23S zdeponowanym w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych IBPRS w Warszawie pod nr depozytu KKP 2045p.
5. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje wyizolowany plazmid określony w zastrz. 1-2 albo szczep bakteryjny określony w zastrz. 3-4 lub ich kombinację.
PL 220 839 B1
6. Zastosowanie szczepu bakteryjnego określonego w zastrz. 3-4 i/lub kompozycji określonej w zastrz. 5 do selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub z gleby.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że surowcami mineralnymi są polimetaliczne złoża miedzionośne.
8. Sposób selektywnego usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub gleby, znamienny tym, że etap dysymilacyjnej redukcji arsenianów jest prowadzony z wykorzystaniem szczepu bakteryjnego jak określonego w zastrz. 3-4 i/lub kompozycji określonej w zastrz. 5.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że etap dysymilacyjnej redukcji arsenianów jest prowadzony w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych.
10. Sposób według zastrz. 8-9, znamienny tym, że surowcami mineralnymi są złoża miedzionośne.
11. Sposób selektywnego usuwania arsenu z różnorodnych surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego lub gleb według zastrz. 8, znamienny tym, że usuwanie arsenu prowadzone jest przez dysymilacyjną redukcję arsenianów z wykorzystaniem szczepu bakteryjnego zawierającego plazmid pSheB o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1 korzystnie szczepu Shewanella sp. O23S zdeponowanego jako KKP2045p, który to sposób obejmuje następujące etapy:
a) przygotowania surowców mineralnych, odpadów lub gleb i zmieszania z odpowiednią pożywką hodowlaną umożliwiającą hodowlę tego szczepu,
b) dodania innokulum tego szczepu i prowadzenia hodowli w warunkach umożliwiających jego wzrost i prowadzenie dysymilacyjnej redukcji arsenianów.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że po etapie b) prowadzi się etap
c) selektywnego usuwania uwolnionego arsenu z roztworów uzyskanych w etapie b).
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że usuwanie uwolnionego arsenu prowadzi się przez flotację, korzystnie przez selektywne wytrącanie arseninów siarczkami.
14. Sposób według zastrz. 11-13, znamienny tym, że etap a) przeprowadza się przez: (i) rozdrabnianie i frakcjonowanie surowców mineralnych, odpadów lub gleb, korzystnie do frakcji 125-250 pm.
15. Sposób według zastrz. 11-14, znamienny tym, że pożywką hodowlaną jest pożywka R1-R2 uzupełniona mleczanem sodu, ekstraktem drożdżowym oraz solami Tuoviniena.
316. Sposób według zastrz. 11-15, znamienny tym, że pożywka hodowlana nie zawiera NO3- i Fe3+.
17. Sposób według zastrz. 11-16, znamienny tym, że w etapie b) hodowla prowadzona jest w warunkach atmosfery beztlenowej i prowadzona jest z przepłukiwaniem pożywki mieszaniną gazów N2:CO2, korzystnie w stosunku 4:1.
PL404376A 2013-06-19 2013-06-19 Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb PL220839B1 (pl)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL404376A PL220839B1 (pl) 2013-06-19 2013-06-19 Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb
HUE13817732A HUE028023T2 (en) 2013-06-19 2013-10-30 Removal of arsenic by the use of dissimilation arsenic reductase
EP13817732.4A EP2882851B1 (en) 2013-06-19 2013-10-30 The removal of arsenic using a dissimilatory arsenic reductase
PCT/IB2013/059773 WO2014203046A1 (en) 2013-06-19 2013-10-30 The removal of arsenic using a dissimilatory arsenic reductase
US14/678,143 US9328397B2 (en) 2013-06-19 2015-04-03 Removal of arsenic using a dissimilatory arsenic reductase

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL404376A PL220839B1 (pl) 2013-06-19 2013-06-19 Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL404376A1 PL404376A1 (pl) 2014-12-22
PL220839B1 true PL220839B1 (pl) 2016-01-29

Family

ID=49917678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL404376A PL220839B1 (pl) 2013-06-19 2013-06-19 Plazmidy, szczepy je obejmujące, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób usuwania arsenu z surowców mineralnych, odpadów przemysłu surowcowego i skażonych gleb

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9328397B2 (pl)
EP (1) EP2882851B1 (pl)
HU (1) HUE028023T2 (pl)
PL (1) PL220839B1 (pl)
WO (1) WO2014203046A1 (pl)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114703104B (zh) * 2022-04-29 2023-07-18 暨南大学 一株具有铁还原能力和电化学活性的菌株及其应用
CN114686404B (zh) * 2022-04-29 2023-07-18 暨南大学 一株具有铁还原能力和产电能力的菌株及其应用
CN115125166B (zh) * 2022-06-08 2023-06-20 北京林业大学 一种利用导电载体形成希瓦氏菌电活性生物膜强化厨余垃圾厌氧处理的方法
CN117070424B (zh) * 2023-10-10 2023-12-22 华南理工大学 一株化能自养型盐硫杆菌菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
HUE028023T2 (en) 2016-11-28
WO2014203046A4 (en) 2015-02-19
EP2882851A1 (en) 2015-06-17
US9328397B2 (en) 2016-05-03
WO2014203046A1 (en) 2014-12-24
US20150267276A1 (en) 2015-09-24
EP2882851B1 (en) 2016-04-06
PL404376A1 (pl) 2014-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bartsevich et al. Molecular identification of an ABC transporter complex for manganese: analysis of a cyanobacterial mutant strain impaired in the photosynthetic oxygen evolution process.
Young et al. A bifunctional urease enhances survival of pathogenic Yersinia enterocolitica and Morganella morganii at low pH
Corstjens et al. Identification and molecular analysis of the Leptothrix discophora SS‐1 mofA gene, a gene putatively encoding a manganese‐oxidizing protein with copper domains
Myers et al. A sulphite respiration system in the chemoheterotrophic human pathogen Campylobacter jejuni
US11279916B2 (en) Enzyme and application thereof
JPH03501086A (ja) パラチオンヒドロラーゼ類縁体並びにその製造方法及び精製方法
Binh et al. Establishment of a new and efficient Agrobacterium-mediated transformation system in the nematicidal fungus Purpureocillium lilacinum
WO2014203046A1 (en) The removal of arsenic using a dissimilatory arsenic reductase
CN101935621A (zh) 一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌及其应用
EP2800808B1 (en) New bacterial strains, plasmids, method of producing bacterial strains capable of chemolithotrophic arsenites oxidation and uses thereof
WO2025232521A1 (zh) 拟孢囊菌来源的胆固醇氧化酶、其突变体、其表达方法及在杀虫中的应用
Calugay et al. Siderophore production of a periplasmic transport binding protein kinase gene defective mutant of Magnetospirillum magneticum AMB-1
Zhao et al. Expression, purification and characterization of pectate lyase A from Aspergillus nidulans in Escherichia coli
Santhanam et al. A reassessment of flocculosin-mediated biocontrol activity of Pseudozyma flocculosa through CRISPR/Cas9 gene editing
Suzuki et al. Cytoplasmic ATPase involved in ferrous ion uptake from magnetotactic bacterium Magnetospirillum magneticum AMB‐1
Durbin et al. The role of intercellular fluid and bacterial isolate on the in vivo production of tabtoxin and tabtoxinine-β-lactarn
WO2024024427A1 (ja) シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置、及び、プログラム
JPH062061B2 (ja) Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法
CN114605510A (zh) 具有亚砷酸盐和甲基亚砷酸盐结合能力的蛋白a10、含所述蛋白基因的工程菌株及应用
CN108018305B (zh) 一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法
Tsaplina et al. Phenotypic properties of Sulfobacillus thermotolerans: Comparative aspects
CN119592488B (zh) 一种降解除草剂2,4-d的工程菌及其构建方法和应用
Sugio et al. Existence of a tungsten-binding protein in Acidithiobacillus ferrooxidans AP19-3
JP5145506B2 (ja) バシラス属細菌、及びその用途
Lankhorst et al. Identification and characterization of a bacteroid-specific dehydrogenase complex in Rhizobium leguminosarum PRE