PL220977B1 - Startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, sekwencja DNA wraz z miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych NdeI i XhoI, wektor ekspresyjny i sposób jego otrzymywania, rekombinantowy szczep Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS i jego sposób otrzymywania oraz sposób wytwarzania białka rekombinantowego z metką oligohistydynową syntazy trehalozy (ST) Deinococcus geothermalis DSMZ 1130 - Google Patents
Startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, sekwencja DNA wraz z miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych NdeI i XhoI, wektor ekspresyjny i sposób jego otrzymywania, rekombinantowy szczep Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS i jego sposób otrzymywania oraz sposób wytwarzania białka rekombinantowego z metką oligohistydynową syntazy trehalozy (ST) Deinococcus geothermalis DSMZ 1130Info
- Publication number
- PL220977B1 PL220977B1 PL393026A PL39302610A PL220977B1 PL 220977 B1 PL220977 B1 PL 220977B1 PL 393026 A PL393026 A PL 393026A PL 39302610 A PL39302610 A PL 39302610A PL 220977 B1 PL220977 B1 PL 220977B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- formula
- dsmz
- dna
- escherichia coli
- pet30ek
- Prior art date
Links
- 108010045348 trehalose synthase Proteins 0.000 title claims description 36
- 241000959949 Deinococcus geothermalis Species 0.000 title claims description 32
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title claims description 15
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 title claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 12
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 5
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 2
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 claims description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims 1
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000192093 Deinococcus Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- FMKJUUQOYOHLTF-OWOJBTEDSA-N (e)-4-azaniumylbut-2-enoate Chemical compound NC\C=C\C(O)=O FMKJUUQOYOHLTF-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000192091 Deinococcus radiodurans Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, a także zamplifikowana sekwencja DNA genu syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 wraz z miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych Ndel i Xhol, wektor ekspresyjny i sposób jego otrzymywania, rekombinantowy szczep E. coli BL21 (DE3) pLysS i jego sposób otrzymywania oraz sposób wytwarzania białka syntazy trehalozy (ST) Deinococcus geothermalis DSMZ 11300.
Trehaloza (a-D-glukopiranozylo-1,1a-D-glukopiranozyd) jest cukrem nieredukującym, zbudowanym z dwóch cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem a-1,1-glikozydowym. Trehaloza łatwo ulega hydrolizie do glukozy i może pełnić w komórce rezerwę tego cukru. Występowanie trehalozy stwierdzono w komórkach grzybów i drożdży, bakterii, nicieni, owadów, jaj, poczwarek oraz niektórych roślin. Właściwości trehalozy czynią z niej potencjalne źródło wielu zastosowań w medycynie, weterynarii, przemyśle farmaceutycznym i spożywczym.
Biosynteza trehalozy w żywych komórkach prowadzona jest różnymi znanymi szlakami metabolicznymi, między innymi z wykorzystaniem syntazy trehalozy.
Bakterie z rodzaju Deinococcus należą do mikroorganizmów wytwarzających syntazę trehalozy.
Geny kodujące białka syntazy trehalozy mikroorganizmów rodzaju Deinococcus klonowano w komórkach E. coli. Prowadzono również biosyntezę termostabilnych enzymów w komórkach mezofilnego gospodarza w układzie Tabora-Studiera. Niestety zastosowane układy ekspresyjne E. coli nie należą do optymalnych i najbardziej wydajnych. Ponadto otrzymywane białka nie posiadały, ułatwiającej w znaczący sposób proces otrzymywania, metki oligohistydynowej, a w trakcie samej procedury oczyszczania nie stosowano etapu wstępnej denaturacji termicznej białek gospodarza.
W trakcie prowadzonych prac wykonano izolację i klonowanie genu kodującego syntazę trehalozy pochodzącej z D. radiodurans do wektorów ekspresyjnych w układzie Tabora-Studiera oraz arabinozowym oraz jego ekspresja w różnych gospodarzach. Ustalono także optymalny sposób oczyszczania i określono właściwości białek rekombinantowych w układzie arabinozowym oraz Tabora-Studiera z domeną oligohistydynową DgeoSTHis.
Oczyszczanie białka polega na nowatorskim zastosowaniu wstępnej denaturacji białek gospodarza oraz chromatografii metalopowinowactwa.
Dla białka DgeoSTHis uzyskano preparat o wysokiej czystości. Ustalono optymalne warunki działania dla białka DgeoSTHis. Za optymalne warunki działania enzymu wyznaczono zakres temperatur od 25 do 55°C oraz pH 6,28 do 8,72. Czas konwersji powyżej 180 minut można uznać za bezcelowy ze względu na dalsze podwyższanie wydajności, a ilość użytego su bstratu nie większą niż 10% maltozy.
Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe o wzorze 2 i o symbolach DgeoSTNdeF i DgeoSTXhoR do reakcji amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 o wzorze 1.
Przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o wzorze 2, zawierająca fragment DNA kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny Ndel, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny Xhol, o wzorze 3.
Przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny zawierający wklonowane DNA z fragmentem kodującym białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, z fragmentami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne Ndel i Xhol, z miejscem wiązania rybosomów rbs, z genem oporności na kanamycynę, z origin plazmidu pBR322, z origin fl, regionem polihistydynowym, promotorem T7, sekwencją kodującą S-Tag, z miejscem terminacji transkrypcji T7, z miejscem operatorowym lacI o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoSTHis.
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli TOP10F' o symbolu Escherichia coli TOP10F'-pET30Ek/LICDgeoSTHis który charakteryzuje się tym, że uzyskuje się fragment DNA kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 o wzorze 3 poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 2 i o symbolach DgeoSTNdeF i DgeoSTXhoR. Uzyskany fragment DNA klonuje się do wektora plazmidowego pET30Ek/LIC firmy Merck, w wyniku czego uzyskuje się wektor plazmidowy o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoSTHis, którym następnie transformuje się komórki Escherichia coli TOP10F'.
PL 220 977 B1
Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS o symbolu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoSTHis który charakteryzuje się tym, że uzyskuje się fragment DNA kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 o wzorze 3 poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 2 i o symbolach DgeoSTNdeF i DgeoSTXhoR. Uzyskany fragment DNA klonuje się do wektora plazmidowego pET30Ek/LIC firmy Merck, w wyniku czego uzyskuje się wektor plazmidowy o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoSTHis, którym następnie transformuje się komórki Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania białka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 polegający na produkcji białka przez komórki rekombinantowego szczepu bakterii w pożywkach płynnych który charakteryzuje się tym, że prowadzi się hodowlę komórek szczepu bakterii o symbolu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoSTHis w temperaturze początkowej od 35°C do 38°C i po indukcji w temperaturze pokojowej, a następnie po uzyskaniu gęstości zawiesiny komórkowej od 0,3 do 0,9, prowadzi się nadekspresję genu kodującego białko przez czas z zakresu 2-24 h, poprzez dodanie do pożywki induktora jakim jest IPTG o stężeniu od 0,05 mM do 10 mM. Po oddzieleniu zawiesiny komórkowej od płynu pohodowlanego, dezintegracji komórek i wstępnej termicznej denaturacji, na drodze wirowania izoluje się białka rozpuszczalne, po czym oczyszcza się je stosując jeden etap oczyszczania na złożach IDA-Co, wiążących koordynacyjnie, odwracalnie jony metali, po czym zagęszcza i zawiesza w buforze do przechowywania korzystnie o składzie: 0,85% NaCl, 20% glicerol (v/v), 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 0,05% IGEPAL.
Uzyskane według wynalazku, rekombinantowe białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 cechuje się dużą aktywnością w temperaturach niewiele powyżej pokojowych co umożliwia zastosowanie go w ciągłej konwersji maltozy do trehalozy bez konieczności ponoszenia wysokich nakładów na ogrzewanie bioreaktora kolumnowego.
Dodatkowo korzystną cechą rekombinantowego białka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 uzyskiwanego według wynalazku metodą jest krótki czas i mała ilość etapów potrzebnych do uzyskania preparatu białkowego.
Wynalazek objaśniony jest bliżej w przykładach wykonania i na rysunku, na k tórym fig. 1 przedstawia fragment DNA o wzorze 3 z zaznaczeniem sekwencji genu syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 i fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne Ndel i Xhol;
fig. 2 przedstawia sekwencję nukleotydową wektora plazmidowego pET30Ek/LICDgeoSTHis w rejonie klonowania fragmentu DNA o wzorze 3 oraz sekwencję aminokwasową białka powstającego w komórkach Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS transformowanych DNA wektora ekspresyjnego pET30Ek/LICDgeoSTHis;
fig. 3 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego w 12% żelu poliakrylamidowym z 6% warstwą zagęszczającą frakcji pochodzących z kolejnych etapów izolacji i oczyszczania białka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 produkowanego przez rekombinantowy szczep Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoSTHis;
fig. 4 przedstawia schemat uzyskania fragmentu DNA o wzorze 3 z zaznaczeniem sekwencji genu syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 i fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne Ndel i Xhol oraz wektora ekspresyjnego o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoSTHis.
P r z y k ł a d 1 - Otrzymywanie sekwencji DNA kodującej białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300
W celu amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 syntetyzuje się w znany sposób startery oligonukleotydowe o wzorze 2 i o symbolach DgeoSTNdeF i DgeoSTXhoR. Reakcję amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 wykonuje się z użyciem starterów DgeoSTNdeF (0,2 pM) i DgeoSTXhoR (0,2 μΜ) na matrycy wyizolowanego DNA genomowego w buforze zawierającym: 50 mM Tris-HCl pH 9,0, 2,5 mM MgCl2, 20 mM (NH4)2SO4, 5% DMSO, 200 pM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 0,5 U polimerazy DNA Marathon produkowanej przez A&A Biotechnology szopo Gdynia, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: wstępna denaturacja 94°C-1 minuta, 5 cykli: 94°C-1 minuta 59°C1 minuta, 72°C-2 minuty; 25 cykli: 94°C-1 minuta 64-68°C-1 minuta, 72°C-1,5 minuty; wydłużanie końcowe 72°C-5 minut. W wyniku reakcji amplifikacji uzyskuje się fragment DNA o wzorze 3. Frag4
PL 220 977 B1 ment DNA o wzorze 3 z dokładnym zaznaczeniem sekwencji genu kodującego białko syntazy treahlozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 i fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne Ndel i XhoI ilustruje fig. 1.
Przykład 2 - Otrzymywanie wektora ekspresyjnego o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoSTHis oraz rekombinantowego szczepu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoSTHis
Schemat uzyskania wektora ekspresyjnego o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoSTHis ilustruje fig. 4. W celu uzyskania wektora plazmidowego pET30Ek/LICDgeoSTHis przeprowadza się klonowanie fragmentu DNA o wzorze 3 otrzymanego według przykładu 1 do wektora ekspresyjnego pET30Ek/LIC firmy Merck. W tym celu przeprowadza się reakcję ligacji fragmentu DNA o wielkości 5234 par zasad powstałego w wyniku trawienia plazmidu pET30Ek/LIC firmy Merck enzymami restrykcyjnymi Ndel i Xhol (wektora) z fragmentem DNA o wielkości 1658 par zasad powstałym po trawieniu produktu PCR o wzorze 3 enzymami restrykcyjnymi Ndel i XhoI (insertu), w temperaturze 17°C przez 3 godziny z użyciem 2U DNA ligazy faga T4, stosując bufor reakcyjny: 33 mM Tris-CH3COOH pH=7,8; 10 mM (CH3COO)2Mg; 66 mM CH3COOK; 0,5 mM DTT; 1 mM ATP.
Następnie mieszaniną reakcyjną transformuje się komórki kompetentne Escherichia coli TOP10F' i po wytrząsaniu przez okres 1 h, w temperaturze 37°C, przy około 230 rpm, w 250 μl pożywki LB wysiewa na pożywkę LA (pożywka LB z dodatkiem 1,5% agaru wg Sambrook i in., 1989), zawierającą tetracyklinę i kanamycynę.
Uzyskane kolonie bakteryjne Escherichia coli TOP10F'-pET30Ek/LICDgeoSTHis zawierające ekspresyjne wektory plazmidowe przesiewa się na pożywkę LB z dodatkiem tetracykliny i kanamycyny i hoduje się w celu izolacji DNA plazmidowego.
W wyniku izolacji uzyskuje się DNA wektora plazmidowego o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoSTHis, który zawiera wklonowany gen kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 pod kontrolą silnego promotora faga T7 (rys. 2), co potwierdza się poprzez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie DNA, np. metodą Sangera.
Dokładną sekwencję nukleotydową wektora plazmidowego o wzorze 4 i symbolu pET30Ek/LICDgeoSTHis w rejonie klonowania fragmentu DNA o wzorze 3 ilustruje fig. 2.
P r z y k ł a d 3 - Otrzymywanie białka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ
11300
Uzyskuje się sekwencję DNA kodującą białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 wraz z miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych Ndel i XhoI o wzorze 3 według przykładu 1.
Następnie otrzymuje się ekspresyjny wektor plazmidowy o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LlCDgeoSTHis zgodnie z przykładem 2.
W kolejnym etapie poprzez transformację komórek kompetentnych Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS i presję selekcyjną na podłożu z chloramfenikolem i kanamycyną otrzymuje się rekombinantowy szczep Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoSTHis.
Szczep hoduje się w pożywce LB z dodatkiem ampicyliny przez 18 godzin w temperaturze 37°C. Hodowlą nocną rekombinantowego szczepu E. coli szczepi się 500 mL pożywki LB z a ntybiotykiem i po uzyskaniu w hodowli gęstości zawiesiny komórkowej na poziomie OD600nm>0,5 indukuje się ekspresję białka syntazy trehalozy IPTG. Hodowlę po 4 h od indukcji przeprowadzoną w temperaturze pokojowej (objętość pożywki 500 mL) wiruje się przez 10 minut przy 5000 rpm. Osad bakteryjny zawiesza się w 30 mL buforu lizującego, homogenizuje i poddaje działaniu ultradźwięków przez 10 s przy amplitudzie A=30%, powtarzając procedurę trzykrotnie w krótkich odstępach czasowych. Otrzymany totalny lizat wiruje się przez 40 minut przy 9000 rpm. Białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 oczyszcza się na drodze strącania termicznego innych obecnych w preparacie białek (białka mezofilnej bakterii E. coli) w temperaturze 65°C, przez 10 minut. Lizat wiruje się przez 30 minut przy 12000 rpm. Supernatant zawierający niezdenaturowane białka rozpuszczalne poddaje się dalszemu oczyszczaniu stosując chromatografię metalopowinowactwa. W innym wariancie oczyszczania można poddawać otrzymane białka strącaniu siarczanem amonu lub wytrącaniu etanolem, acetonem, izopropanolem lub innym alkoholem niskorzędowym.
Kolumnę ze złożem IDA-Co kalibruje się 5 objętościami złoża buforu A: 5 mM imidazolu, 50 mM bufor fosforanowy, 50 mM NaCl o pH=7,6. Następnie na złoże nanosi się ilość całkowitego ekstraktu bezkomórkowego równą objętościowo objętości złoża. Kolumnę płucze się buforem niskosolnym A: 5 mM, 50 mM bufor fosforanowy, 50 mM NaCl i A' o stężeniu 25 mM imidazolu, 50 mM bufor fosforaPL 220 977 B1 nowy, 50 mM NaCl o pH=7,6 oraz buforami o analogicznym składzie poza wyjątkiem rosnącego stężenia imidazolu (B=50 mM, C=80 mN, D=100 mM) celem usunięcia niezwiązanych ze złożem białek. Elucję DgeoST prowadzi się dwoma porcjami po 10 ml wysokosolnego buforu fosforanowego o pH=7,6 i stężeniu imidazolu 500 mM, 50 mM bufor fosforanowy, 50 mM NaCl.
Preparat po oczyszczaniu na kolumnie IDA-Co należy trzykrotnie zwirować na filtrach wirówkowych o wielkości odcięcia równej 30 kDa (Amicon, Millipore), przy 5000 rpm, przez 30 minut, dodając kolejno uzyskane powyżej frakcje elucyjne celem zagęszczenia białka. W trakcie zagęszczania należy wymienić bufor wysokosolny na bufor do przechowywania preparatu białkowego (np. zawierającego inhibitory proteaz lub glicerol, i/lub sól fizjologiczną. Korzystnie o składzie: 0,85% NaCl, 20% glicerol (v/v), 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 0,05% IGEPAL. W innym wariancie uzyskany preparat białkowy można dializować do żądanego buforu. Możliwe jest także zastosowanie do konwersji maltozy do trehalozy całkowitego ekstraktu bezkomórkowego już po etapie lizy lub tylko po wstępnej termicznej denaturacji białek gospodarza.
Wyniki biosyntezy i oczyszczania białka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 analizuje się metodą elektroforezy w 12% żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących w obecności odpowiedniego białkowego markera wielkości (fig. 3).
Wykaz sekwencji
Wzór 1. Sekwencje genu kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ
11300
ATGACGCAAACCTCCACCTCCGAGTGGTACAAGAGTGCTGTTTTCTATGAGCTGAGTG
TCCGCACCTATGCCGACGGCAATGGCGATGGCAAGGGGGATTTTCCTGGCCTGACCG
GCAAGCTCGACTACCTGAAGAACCTGGGCGTGGATTGCCTGTGGCTGCTGCCCTTTTA
CCCCAGCCCGCTGAGGGATGACGGGTATGACGTGGCCGACTACACGGACATTCACCC
CGATCTGGGCACGCTGGACGACTTCAAGGTCTTTTTGCGCGAAGCGCATGTGCGCGGC
CTGCGGGTGATTGGTGACCTGGTGACCAACCACACCTCTTCAGACCATCCCTGGTTTC
AGGCGGCGCGGCGCGGCCCCACCCTGCCTGACGGCAGCCCCAACGAATACTTCGACT
ACTACGTCTGGAGCGACACCGGCACCGAATACGCGGACGCGCGCATCATCTTTACCG
ACACCGAGACGAGCAACTGGACCTTTGACGAGATGGCCGGGAAATACTACTGGCACC
GCTTCTTCTCGTCGCAGCCTGACCTCAACTACGACAACCCCCGGGTGCAGGAGGAGCT
GCTGAACGTGCTGCGCTTCTGGCTGGACCTGGGGCTGGATGGCTTCCGAGTGGACGCG
GTGCCCTACCTGATCGAGCGCGAGGGCACCAACTGCGAGAACCTGCCCGAGACGCAC
GCCATCTTGCAGAAGCTGCGCCGCGTGGTGGATGAGGAGTACCCAGGGCGCCTGCTG
CTGGCCGAGGCCAACCAGTGGCCGGAGGAAGTCGTCGAATACTTCGGTACGGAGACA
CACCCCGAGTTCCACATGTGCTTCAACTTTCCGGTGATGCCAAGGCTATTTATGAGCC
TGAAGCGCGAGGACACCACTTCCATTCGCGAGATCATGGCGCGCCTGCCCAAGTTGCC
CAGTTTTGGGCAGTGGGCAACGTTTTTGCGCAACCACGACGAACTCACGCTGGAGATG
GTCACCGAGGACGAGCGCGCCTTTATGTACGCCGCCTACGCGCCCGACGCACGCATG
AAGATCAATGTGGGGATTCGCCGCCGGCTCGCGCCGCTGCTGGACAATGACCGCCGC
CGGATCGAGCTGCTGACCACCGTGCTGTTGGCCCTCCCCGGCAGTCCCATCCTGTACT
ACGGCGACGAGATCGGCATGGGCGACAACCTCTCGCTGGCTGACCGCAACGGCGTCC
GCACCCCGATGCAGTGGAATGCCGGAATCAGCGGCGGCTTCTCGACGGCCCTACCCG
AGCAGTGTTTTTATCCACCCATCAGCGACCCGGTGTACGGGTATCAGCGAGTGAACGT
GAACTCGCAGGAGCAGGACCCCAGCAGCCTGCTGAAATGGGTGTCCCGCCAGCTTGA
GGTGCGCCGTGCCCATCCCGCCTTCGCCCACGGGGACCTCACCTTTATCGAGACGAAC
AACCCCGCGGTGCTTGCCTTTACCCGCCGCTACGACAATGAAGTTCTGCTCATCGTGA
GCAATTTCGCTGGCAATGCGCAGGCGGTCGAGCTTGACCTCTTTGCGTATCGGGGCTG
CGTGCCCGTCACGCTTGCCGGTGGCAGCCACTTCCCGCCGGTGGGTGACCGTGGCCTC
TACCCCCTGACACTGGGCAAGTACGACTACTACTGGTTGAAGCTGTCGGGGGTGCGGT
AA
Informacja o sekwencji:
DŁUGOŚĆ: 1671 nukleotydy
TYP: kwas nukleinowy
TOPOLOGIA: liniowa
ILOŚĆ NICI: jedna
RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA
PL 220 977 B1
Wzór 2. Sekwencja starterów
DgeoSTNdeF
5' aaa cat ATG ACGCAAACCTCCACCTCCGAGT 3' Informacja o sekwencji:
DŁUGOŚĆ: 32 nukleotydy
TYP: kwas nukleinowy
TOPOLOGIA: liniowa
RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA
DgeoSTXhoR
5' aaa ctc GAG CCGCACCCCCGACAGCTTC 3' Informacja o sekwencji:
DŁUGOŚĆ: 28 nukleotydy
TYP: kwas nukleinowy
TOPOLOGIA: liniowa
RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA
PL 220 977 B1
Wzór 3. Sekwencja zamplifikowanego genu kodującego białko Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 wraz z dodatkowymi miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych Ndei i Xhol
AAAACATATGACGCAAACCTCCACCTCCGAGTGGTACAAGAGTGCTGTTTTCTATGAG
CTGAGTGTCCGCACCTATGCCGACGGCAATGGCGATGGCAAGGGGGATTTTCCTGGCC
TGACCGGCAAGCTCGACTACCTGAAGAACCTGGGCGTGGATTGCCTGTGGCTGCTGCC
CTTTTACCCCAGCCCGCTGAGGGATGACGGGTATGACGTGGCCGACTACACGGACATT
CACCCCGATCTGGGCACGCTGGACGACTTCAAGGTCTTTTTGCGCGAAGCGCATGTGC
GCGGCCTGCGGGTGATTGGTGACCTGGTGACCAACCACACCTCTTCAGACCATCCCTG
GTTTCAGGCGGCGCGGCGCGGCCCCACCCTGCCTGACGGCAGCCCCAACGAATACTTC
GACTACTACGTCTGGAGCGACACCGGCACCGAATACGCGGACGCGCGCATCATCTTT
ACCGACACCGAGACGAGCAACTGGACCTTTGACGAGATGGCCGGGAAATACTACTGG
CACCGCTTCTTCTCGTCGCAGCCTGACCTCAACTACGACAACCCCCGGGTGCAGGAGG
AGCTGCTGAACGTGCTGCGCTTCTGGCTGGACCTGGGGCTGGATGGCTTCCGAGTGGA
CGCGGTGCCCTACCTGATCGAGCGCGAGGGCACCAACTGCGAGAACCTGCCCGAGAC
GCACGCCATCTTGCAGAAGCTGCGCCGCGTGGTGGATGAGGAGTACCCAGGGCGCCT
GCTGCTGGCCGAGGCCAACCAGTGGCCGGAGGAAGTCGTCGAATACTTCGGTACGGA
GACACACCCCGAGTTCCACATGTGCTTCAACTTTCCGGTGATGCCAAGGCTATTTATG
AGCCTGAAGCGCGAGGACACCACTTCCATTCGCGAGATCATGGCGCGCCTGCCCAAG
TTGCCCAGTTTTGGGCAGTGGGCAACGTTTTTGCGCAACCACGACGAACTCACGCTGG
AGATGGTCACCGAGGACGAGCGCGCCTTTATGTACGCCGCCTACGCGCCCGACGCAC
GCATGAAGATCAATGTGGGGATTCGCCGCCGGCTCGCGCCGCTGCTGGACAATGACC
GCCGCCGGATCGAGCTGCTGACCACCGTGCTGTTGGCCCTCCCCGGCAGTCCCATCCT
GTACTACGGCGACGAGATCGGCATGGGCGACAACCTCTCGCTGGCTGACCGCAACGG
CGTCCGCACCCCGATGCAGTGGAATGCCGGAATCAGCGGCGGCTTCTCGACGGCCCT
ACCCGAGCAGTGTTTTTATCCACCCATCAGCGACCCGGTGTACGGGTATCAGCGAGTG
AACGTGAACTCGCAGGAGCAGGACCCCAGCAGCCTGCTGAAATGGGTGTCCCGCCAG
CTTGAGGTGCGCCGTGCCCATCCCGCCTTCGCCCACGGGGACCTCACCTTTATCGAGA
CGAACAACCCCGCGGTGCTTGCCTTTACCCGCCGCTACGACAATGAAGTTCTGCTCAT
CGTGAGCAATTTCGCTGGCAATGCGCAGGCGGTCGAGCTTGACCTCTTTGCGTATCGG
GGCTGCGTGCCCGTCACGCTTGCCGGTGGCAGCCACTTCCCGCCGGTGGGTGACCGTG
GCCTCTACCCCCTGACACTGGGCAAGTACGACTAC
TACTGGTTGAAGCTGTCGGGGGTGCGGCTCGAGTTT
Informacja o sekwencji: DŁUGOŚĆ: 1684 nukleotydy TYP: kwas nukleinowy TOPOLOGIA: liniowa
ILOŚĆ NICI: jedna RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA
PL 220 977 B1
Wzór 4. Sekwencja plazmidu rekombinantowego pET30Ek/LICDraSTH
I TATGACCCAG GCACACCCGG AGTGGTACAA GAGCGCTGTC TTCTACGAAC TGTCCGTGCG 61 GACCTTTCAG GACGGCAACG GCGACGGCAA GGGCGATTTT CCCGGCCTGA CCTCGCGGCT 121 GGACTACCTG AAAAACCTCG GCGTGGACTG CCTGTGGTTG CTGCCCTGGT TTCCCAGCCC 181 ACTGCGCGAC GACGGGTACG ACGTGGCCGA CTACCGGGGG ATTCACCCTG ACCTCGGCAC 241 GCTCGACGAC TTCAAGGTCT TTCTGCGCGA AGCCCACGCC CGGGGCCTGC GGGTCATCGG 301 CGACCTGGTG ACCAACCACA CGTCCAGCGA CCACCCCTGG TTTCAGGCGG CGCGGCGCGG 361 CCCGACCCTG CCCGACGGCT CGCCCAACGA GTACCACGAC TACTACGTCT GGAGCGACGA 421 GGGCAAGGAA TACGCCGACA CCCGCATCAT CTTCACCGAC ACCGAGGTCA GCAACTGGAC 481 GCTCGACGAG CAGGCAGGCA AGTATTACTG GCACCGCITr TTCGCCAGCC AGCCGGACCT 541 GAACTACGAC AACCCGAAAG TGGTGGAAGA ACTTCACGGC GCCGCCCGCT TCTGGCTCGA 601 CCTCGGCCTC GACGGGTTCC GGGTGGACGC CGTGCCCTAC CTCATCGAGC GCGAGGGCAC 661 GAGCTGCGAG AATCTGCCCG AAACACACGA GATTCTCAAG GGCTTCCGGG CGATGGTGGA 721 CCGCGAGTAT CCGGGGCGGC TGCTGCTTGC CGAGGCGAAC CAGTGGCCCG AGGAAGTCGT 781 CGAGTACTTC GGCACCGAAGCCGAGCCCGA GTTCCACATG TGCTTCAACT TCCCGGTGAT 841 GCCCCGGCTG TACATGAGCC TGAAAAGGGA GGACACCTCC AGCATCCGCG AGATCATGGG 901 CCGCCTGCCG AAAATCCCGA GTTTCGGCCA GTGGTGCACC TTCCTGCGCA ACCACGACGA 961 ACTGACGCTG GAAATGGTCA CCGACGACGA GCGCGCCTTC ATGTATGCCG CCTACGCGCC 1021 CGACGCCCGC ATGAAAATCA ACGTGGGCAT CCGCCGTCGC CTCGCGCCGC TGCTCGACAA 1081 CGACCGGCGC CGCATCGAGC TGCTGAACAC TGTGCTCCTC GCCCTGCCCG GCAGCCCCAT 1141 CCTGTACTAC GGCGACGAAA TCGGCATGGG CGACGACCTC GGCCTGCCCG ACCGCAACGG 1201 CGTGCGCACC CCGATGCAGT GGAACGCGGG CACCAGCGGC GGTTTTTCCA CTGCGCAGCC 1261 CTCCGACTGC TTTTTCCCGC CGATTCAGGA CCCGGTGTAC GGCTTCGGGC GCGTCAACGT 1321 GCAGAGCCAG CTCCAAGACC CCAGCAGCCT GCTGAAGTGG ACCGCCCGGC AACTCGAACT 1381 GCGCCGCGCC CACCCCGCCT TTGCGCACGG CGACCTCACC TTCATCGAAA CCGGCAACCC 1441 CGCCATCCTC GCCTTTACCC GCCAGTACGA CGGCGAAACG CTGCTCATCG TCAGCAACTT 1501 CGCGGGCAAC GCCCAGGCCG GGCTGCTCGA TCTCGCGCCC TTCGTGGGCC GCGCCCCGGT 1561 CACACTTTCC GGGGCCAGCC CGCTGCCGGT GGTCACTGGA AACGGCCAGT ACCCGGTGGT 1621 GATGGGCAAG TACGACTATT ACTGGCTGCG GTTGAATCTC GAGCACCACC ACCACCACCA 1681 CTGAGATCCG GCTGCTAACA AAGCCCGAAA GGAAGCTGAG TTGGCTGCTG CCACCGCTGA 1741 GCAATAACTA GCATAACCCC TTGGGGCCTC TAAACGGGTC TTGAGGGGTT TTTTGCTGAA 1801 AGGAGGAACT ATATCCGGAT TGGCGAATGG GACGCGCCCT GTAGCGGCGC ATTAAGCGCG 1861 GCGGGTGTGG TGGTTACGCG CAGCGTGACC GCTACACTTG CCAGCGCCCT AGCGCCCGCT 1921 CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG TCAAGCTCTA 1981 AATCGGGGGC TCCCTTTAGG GTTCCGATTT AGTGCTTTAC GGCACCTCGA CCCCAAAAAA 2041 CTTGATTAGG GTGATGGTTC ACGTAGTGGG CCATCGCCCT GATAGACGGT TTTTCGCCCT 2101 TTGACGTTGG AGTCCACGTT CTTTAATAGT GGACTCTTGT TCCAAACTGG AACAACACTC 2161 AACCCTATCT CGGTCTATTC TTTTGATTTA TAAGGGATTT TGCCGATTTC GGCCTATTGG 2221 TTAAAAAATG AGCTGATTTA ACAAAAATTT AACGCGAATT TTAACAAAAT ATTAACGTTT 228! ACAATTTCAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC 2341 TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG AATTAATTCT TAGAAAAACT CATCGAGCAT 2401 CAAATGAAAC TGCAATTTAT TCATATCAGG ATTATCAATA CCATATTTTT GAAAAAGCCG 2461 TTTCTGTAAT GAAGGAGAAA ACTCACCGAG GCAGTTCCAT AGGATGGCAA GATCCTGGTA 2521 TCGGTCTGCG ATTCCGACTC GTCCAACATC AATACAACCT ATTAATTTCC CCTCGTCAAA 2581 AATAAGGTTA TCAAGTGAGA AATCACCATG AGTGACGACT GAATCCGGTG AGAATGGCAA 2641 AAGTTTATGC ATTTCTTTCC AGACTTGTTC AACAGGCCAG CCATTACGCT CGTCATCAAA 2701 ATCACTCGCA TCAACCAAAC CGTTATTCAT TCGTGATTGC GCCTGAGCGA GACGAAATAC 2761 GCGATCGCTG TTAAAAGGAC AATTACAAAC AGGAATCGAA TGCAACCGGC GCAGGAACAC 2821 TGCCAGCGCA TCAACAATAT TTTCACCTGA ATCAGGATAT TCTTCTAATA CCTGGAATGC 2881 TGTTTTCCCG GGGATCGCAG TGGTGAGTAA CCATGCATCA TCAGGAGTAC GGATAAAATG 2941 CTTGATGGTC GGAAGAGGCA TAAATTCCGT CAGCCAGTTT AGTCTGACCA TCTCATCTGT 3001 AACATCATTG GCAACGCTAC CTTTGCCATG TTTCAGAAAC AACTCTGGCG CATCGGGCTT 3061 CCCATACAAT CGATAGATTG TCGCACCTGA TTGCCCGACA TTATCGCGAG CCCATTTATA 3121 CCCATATAAA TCAGCATCCA TGTTGGAATT TAATCGCGGC CTAGAGCAAG ACGTTTCCCG 3181 TTGAATATGG CTCATAACAC CCCTTGTATT ACTGTTTATG TAAGCAGACA GTTTTATTGT 3241 TCATGACCAA AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG AGCGTCAGAC CCCGTAGAAA 3301 AGATCAAAGG ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT AATCTGCTGC TTGCAAACAA 3361 AAAAACCACC GCTACCAGCG GTGGTTTGTT TGCCGGATCA AGAGCTACCA ACTCTTTTTC
PL 220 977 B1
3421 CGAAGGTAAC TGGCTTCAGC AGAGCGCAGA TACCAAATAC TGTCCTTCTA GTGTAGCCGT 3481 AGTTAGGCCA CCACTTCAAG AACTCTGTAG CACCGCCTAC ATACCTCGCT CTGCTAATCC 3S41 TGTTACCAGT GGCTGCTGCC AGTGGCGATA AGTCGTGTCT TACCGGGTTG GACTCAAGAC 3601 GATAGTTACC GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG GGGTTCGTGC ACACAGCCCA 3661 GCTTGGAGCG AACGACCTAC ACCGAACTGA GATACCTACA GCGTGAGCTA TGAGAAAGCG 3721 CCACGCTTCC CGAAGGGAGA AAGOCGGACA GGTATCCGGT AAGCGGCAGG GTCGGAACAG 3781 GAGAGCGCAC GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA TCTTTATAGT CCTGTCGGGT 3841 TTCGCCACCT CTGACTTGAG CGTCGATTTT TGTGATGCTC GTCAGGGGGG CGGAGCCTAT 3901 GGAAAAACGC CAGCAACGCG GCCTTTTTAC GGTTCCTGGC CTTTTGCTGG CCTTTTGCTC 3961 ACATGTTCTT TCCTGCGTTA TCCCCTGATT CTGTGGATAA CCGTATTACC GCCTTTGAGT 4021 GAGCTGATAC CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGAGCGCAG CGAGTCAGTG AGCGAGGAAG 4081 CGGAAGAGCG CCTGATGCGG TATTTTCTCC TTACGCATCT GTGCGGTATT TCACACCGCA 4141 TATATGGTGC ACTCTCAGTA CAATCTGCTC TGATGCCGCA TAGTTAAGCC AGTATACACT 4201 CCGCTATCGC TACGTGACTG GGTCATGGCT GCGCCCCGAC ACCCGCCAAC ACCCGCTGAC 4261 GCGCCCTGAC GGGCTTGTCT GCTCCCGGCA TCCGCTTACA GACAAGCTGT GACCGTCTCC 4321 GGGAGCTGCA TGTGTCAGAG GTTTTCACCG TCATCACCGA AACGCGCGAG GCAGCTGCGG 4381 TAAAGCTCAT CAGCGTGGTC GTGAAGCGAT TCACAGATGT CTGCCTGTTC ATCCGCGTCC 4441 AGCTCGTTGA GTTTCTCCAG AAGCGTTAAT GTCTGGCTTC TGATAAAGCG GGCCATGTTA 4501 AGGGCGGTTT TTTCCTGTTT GGTCACTGATGCCTCCGTGT AAGGGGGATT TCTGTTCATG 4561 GGGGTAATGA TACCGATGAA ACGAGAGAOG ATGCTCACGA TACGGGTTAC TGATGATGAA 4621 CATGCCCGGT TACTGGAACG TTGTGAGGGT AAACAACTGG CGGTATGGAT GCGGCGGGAC 4681 CAGAGAAAAA TCACTCAGGG TCAATGCCAG CGCTTCGTTA ATACAGATGT AGGTGTTCCA 4741 CAGGGTAGCC AGCAGCATCC TGCGATGCAG ATCCGGAACA TAATGGTGCA GGGCGCTGAC 4801 TTCCGCGTTT CCAGACTTTA CGAAACACGG AAACCGAAGA CCATTCATGT TGTTGCTCAG 4861 GTCGCAGACG TTTTGCAGCA GCAGTCGCTT CACGTTCGCT CGCGTATCGG TGATTCATTC 4921 TGCTAACCAG TAAGGCAACC CCGCCAGCCT AGCCGGGTCC TCAACGACAG GAGCACGATC 4981 ATGCGCACCC GTGGGGCCGC CATGCCGGCG ATAATGGCCT GCTTCTCGCC GAAACGTTTG 5041 GTGGCGGGAC CAGTGACGAA GGCTTGAGCG AGGGCGTGCA AGATTCCGAA TACCGCAAGC 5101 GACAGGCCGA TCATCGTCGC GCTCCAGCGA AAGCGGTCCT CGCCGAAAAT GACCCAGAGC 5161 GCTGCCGGCA CCTGTCCTAC GAGTTGCATG ATAAAGAAGA CAGTCATAAG TGCGGCGACG 5221 ATAGTCATGC CCCGCGCCCA CCGGAAGGAG CTGACTGGGT TGAAGGCTCT CAAGGGCATC 5281 GGTCGAOATC CCGGTGCCTA ATGAGTGAGC TAACTTACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG 5341 CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC CAGCTGCATT AATGAATCGG CCAACGCGCG 5401 GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCCAG GGTGGTTTTT CTTTTCACCA GTGAGACGGG 5461 CAACAGCTGA TTGCCCTTCA CCGCCTGGCC CTGAGAGAGT TGCAGCAAGC GGTCCACGCT 5521 GGTTTGCCCC AGCAGGCGAA AATCCTGTTT GATGGTGGTT AACGGCGGGA TATAACATGA 5581 GCTGTCTTCG GTATCGTCGT ATCCCACTAC CGAGATGTCC GCACCAACGC GCAGCCCGGA 5641 CTCGGTAATG GCGCGCATTG CGCCCAGCGC CATCTGATCG TTGGCAACCA GCATCGCAGT 5701 GGGAACGATG CCCTCATTCA GCATTTGCAT GGTTTGTTGA AAACCGGACA TGGCACTCCA 5761 GTCGCCTTCC CGTTCCGCTA TCGGCTGAAT TTGATTGCGA GTGAGATATT TATGCCAGCC 5821 AGCCAGACGC AGACGCGCCG AGACAGAACT TAATGGGCCC GCTAACAGCG CGATTTGCTG 5881 GTGACCCAAT GCGACCAGAT GCTCCACGCC CAGTCGCGTA CCGTCTTCAT GGGAGAAAAT 5941 AATACTOTTG ATGGGTGTCT GGTCAGAGAC ATCAAGAAAT AACGCCGGAA CATTAGTGCA 6001 GGCAGCTTCC ACAGCAATGG CATCCTGGTC ATCCAGCGGA TAGTTAATGA TCAGCCCACT 6061 GACGCGTTGC GCGAGAAGAT TGTGCACCGC CGCTTTACAG GCTTCGACGC CGCTTCGTTC 6121 TACCATCGAC ACCACCACGC TGGCACCCAG TTGATCGGCG CGAGATTTAA TCGCCGCGAC 6181 AATTTGCGAC GGCGCGTGCA GGGCCAGACT GGAGGTGGCA ACGCCAATCA GCAACGACTG 6241 TTTGCCCGCC AGTTGTTGTG CCACGCGGTT GGGAATGTAA TTCAGCTCCG CCATCGCCGC 6301 TTCCACTTTT TCCCGCGTTT TCGCAGAAAC GTGGCTGGCC TGGTTCACCA CGCGGGAAAC 6361 GGTCTGATAA GAGACACCGG CATACTCTGC GACATCGTAT AACGTTACTG GTTTCACATT 6421 CACCACCCTG AATTGACTCT CTTCCGGGCG CTATCATGCC ATACCGCGAA AGGTTTTGCG 6481 CCATTCGATG GTGTCCGGGA TCTCGACGCT CTCCCTTATG CGACTCCTGC ATTAGGAAGC 6541 AGCCCAGTAG TAGGTTGAGG CCGTTGAGCA CCGCCGCCGC AAGGAATGGT GCATGCAAGG 6601 AGATGGCGCC CAACAGTCCC CCGGCCACGG GGCCTGCCAC CATACCCACG CCGAAACAAG 6661 CGCTCATGAG CCCGAAGTGG CGAGCCCGAT CTTCCCCATC GGTGATGTCG GCGATATAGG 6721 CGCCAGCAAC CGCACCTGTG GCGCCGGTGA TGCCGGCCAC CATGCGTCCG GCGTAGAGGA 6781 TCGAGATCGA TCTCGATCCC GCGAAATTAA TACGACTCAC TATAGGGGAA TTGTGAGCGG 6841 ATAACAATTC CCCTCTAGAA ATAATTTTGT TTAACTTTAA GAAGGAGATA TACA
PL 220 977 B1
Wzór 4 - Informacja o sekwencji: DŁUGOŚĆ: 6894 nukleotydów TYP: kwas nukleinowy TOPOLOGIA: plazmid ILOŚĆ NICI: jedna RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA
Claims (6)
1. Startery oligonukleotydowe o wzorze 2 i o symbolach DgeoSTNdeF i DgeoSTXhoR do reakcji amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 o wzorze 1.
2. Sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o wzorze 2, zawierająca fragment DNA kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny NdeI, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny XhoI, o wzorze 3.
3. Wektor ekspresyjny zawierający wklonowane DNA z fragmentem kodującym białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, z fragmentami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne NdeI i XhoI, z miejscem wiązania rybosomów rbs, z genem oporności na kanamycynę, a origin plazmidu pBR322, z origin fI, regionem polihistydynowym, promotorem T7, sekwencją kodującą S-Tag, z miejscem germinacji transkrypcji T7, z miejscem operatorowym lacI o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoSTHis.
4. Sposób otrzymywania rekombinowanego szczepu Escherichia coli TOP10F' o symbolu Escherichia coli TOP10F'-pET30Ek/LICDgeoSTHis, znamienny tym, że uzyskuje się fragment DNA kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 o wzorze 3 poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 2 i o symbolach DgeoSTNdeF i DgeoSTXhoR, a uzyskany fragment DNA klonuje się do wektora plazmidowego pET30Ek/LIC, w wyniku czego uzyskuje się wektor plazmidowy o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoSTHis, którym następnie transformuje się komórki Escherichia coli TOP10F'.
5. Sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS o symbolu Escherichia coli BL21 pLysS-pET30Ek/LICDgeoSTHis, znamienny tym, że uzyskuje się fragment DNA kodujący białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 o wzorze 3 poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 2 i o symbolach DgeoSTNdeF i DgeoSTXhoR, a uzyskany fragment DNA klonuje się do wektora plazmidowego pET30Ek/LIC, w wyniku czego uzyskuje się wektor plazmidowy o wzorze 4 i o symbolu pET30Ek/LICDgeoSTHis, którym następnie transformuje się komórki Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS.
6. Sposób wytwarzania białka syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300 polegający na produkcji białka przez komórki rekombinantowego szczepu bakterii w pożywkach płynnych, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek szczepu bakterii o symbolu Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-pET30Ek/LICDgeoSTHis w temperaturze początkowej od 35°C do 38°C i po indukcji w temperaturze pokojowej, a następnie po uzyskaniu gęstości zawiesiny komórkowej od 0,3 do 0,9, prowadzi się nadekspresję genu kodującego białko przez czas z zakresu 2-24 h, poprzez dodanie do pożywki induktora jakim jest IPTG o stężeniu od 0,05 mM do 10 mM, a po oddzieleniu zawiesiny komórkowej od płynu pohodowlanego, dezintegracji komórek i wstępnej termicznej denaturacji, na drodze wirowania izoluje się białka rozpuszczalne, po czym oczyszcza się je stosując jeden etap oczyszczania na złożach IDA-Co, po czym zagęszcza i zawiesza w buforze do przechowywania korzystnie o składzie: 0,85% NaCl, 20% glicerol (v/v), 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 0,05% IGEPAL.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL393026A PL220977B1 (pl) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | Startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, sekwencja DNA wraz z miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych NdeI i XhoI, wektor ekspresyjny i sposób jego otrzymywania, rekombinantowy szczep Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS i jego sposób otrzymywania oraz sposób wytwarzania białka rekombinantowego z metką oligohistydynową syntazy trehalozy (ST) Deinococcus geothermalis DSMZ 1130 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL393026A PL220977B1 (pl) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | Startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, sekwencja DNA wraz z miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych NdeI i XhoI, wektor ekspresyjny i sposób jego otrzymywania, rekombinantowy szczep Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS i jego sposób otrzymywania oraz sposób wytwarzania białka rekombinantowego z metką oligohistydynową syntazy trehalozy (ST) Deinococcus geothermalis DSMZ 1130 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL393026A1 PL393026A1 (pl) | 2012-06-04 |
| PL220977B1 true PL220977B1 (pl) | 2016-02-29 |
Family
ID=46210598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL393026A PL220977B1 (pl) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | Startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, sekwencja DNA wraz z miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych NdeI i XhoI, wektor ekspresyjny i sposób jego otrzymywania, rekombinantowy szczep Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS i jego sposób otrzymywania oraz sposób wytwarzania białka rekombinantowego z metką oligohistydynową syntazy trehalozy (ST) Deinococcus geothermalis DSMZ 1130 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL220977B1 (pl) |
-
2010
- 2010-11-23 PL PL393026A patent/PL220977B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL393026A1 (pl) | 2012-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111139194B (zh) | 重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用 | |
| CN111454978B (zh) | 用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌及构建方法和应用 | |
| CN106676051B (zh) | 一种制备高效合成泛酸基因工程菌的方法及其应用 | |
| CN111304232B (zh) | 基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法及其应用 | |
| CN104531727B (zh) | 桑树类黄酮3‑o‑糖基转移酶基因、蛋白及其制备方法 | |
| CN113383080B (zh) | 用于增加蛋白质分泌的细菌表达载体 | |
| CN110257356B (zh) | 一种可用于合成肌肽的酶及其编码基因 | |
| KR102700000B1 (ko) | 2'-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 생산 방법 | |
| CN111850007A (zh) | 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36864及应用 | |
| CN113322243B (zh) | 蛋白质ugt236及其编码基因与应用 | |
| CN107739404B (zh) | 一种保护性人朊蛋白g127i突变体及其构建方法 | |
| CN114875004B (zh) | 一种高立体选择性r转酮酶突变体及其编码基因和应用 | |
| KR101842130B1 (ko) | 돼지 설사병 백신용 섬모 및 독소를 대량 생산하는 형질전환 대장균 및 이에 의해 생산되는 섬모 및 독소를 항원으로 포함하는 돼지 설사병 예방용 백신 조성물 | |
| CN114591985B (zh) | 一种突变果胶裂解酶及应用 | |
| CN113151214B (zh) | 一种具有脂肪酶活性的蛋白PnlipA及其基因和应用 | |
| CN115074340B (zh) | 一种新内含肽及其在合成人源原弹性蛋白上的应用 | |
| CN113355304B (zh) | 一种具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白CpoC及其基因和应用 | |
| CN113337491B (zh) | 一种提高角蛋白酶耐高温稳定性的结构域及其应用 | |
| CN112410361B (zh) | 一种生产南极假丝酵母脂肪酶b的方法及其使用的特异dna分子 | |
| PL243940B1 (pl) | Polimeraza Taq-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy | |
| CN115216485A (zh) | 耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB及其应用 | |
| PL220977B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, sekwencja DNA wraz z miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych NdeI i XhoI, wektor ekspresyjny i sposób jego otrzymywania, rekombinantowy szczep Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS i jego sposób otrzymywania oraz sposób wytwarzania białka rekombinantowego z metką oligohistydynową syntazy trehalozy (ST) Deinococcus geothermalis DSMZ 1130 | |
| AU2021102681A4 (en) | A bacterial expression vector for enhanced protein secretion | |
| CN113122561B (zh) | 膜蛋白SohB的表达载体及其表达纯化方法 | |
| KR20060098528A (ko) | 대장균 발현 시스템을 이용한 인간 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 발현 및 정제방법 |