PL221404B1 - Peptyd o aktywności enzymatycznej białka typu Dicer i jego zastosowanie do produkcji krótkich cząsteczek RNA - Google Patents
Peptyd o aktywności enzymatycznej białka typu Dicer i jego zastosowanie do produkcji krótkich cząsteczek RNAInfo
- Publication number
- PL221404B1 PL221404B1 PL395495A PL39549511A PL221404B1 PL 221404 B1 PL221404 B1 PL 221404B1 PL 395495 A PL395495 A PL 395495A PL 39549511 A PL39549511 A PL 39549511A PL 221404 B1 PL221404 B1 PL 221404B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- peptide
- protein
- sequence
- mtdcl1pepa
- dicer
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 title description 6
- 101000720976 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ATP-dependent helicase dcr1 Proteins 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 7
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 claims 2
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 abstract description 29
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 abstract description 28
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 34
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 32
- 241000219828 Medicago truncatula Species 0.000 description 22
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 102100025238 CD302 antigen Human genes 0.000 description 21
- 101100273718 Homo sapiens CD302 gene Proteins 0.000 description 21
- 101100496109 Mus musculus Clec2i gene Proteins 0.000 description 21
- 101150012655 dcl1 gene Proteins 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 241000224467 Giardia intestinalis Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 8
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 102100028285 DNA repair protein REV1 Human genes 0.000 description 5
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 5
- 101100411643 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RAD5 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100317179 Dictyostelium discoideum vps26 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100407639 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) prtB gene Proteins 0.000 description 4
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 108700011066 PreScission Protease Proteins 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 101150093025 pepA gene Proteins 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 101150059979 DCL2 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 3
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 101100169883 Arabidopsis thaliana DCL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100062776 Arabidopsis thaliana DCL3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100366043 Caenorhabditis elegans sms-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150065381 DCL4 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 101150083707 dicer1 gene Proteins 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000040623 Dicer family Human genes 0.000 description 1
- 108091070648 Dicer family Proteins 0.000 description 1
- 101100408379 Drosophila melanogaster piwi gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000002494 Endoribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000016187 PAZ domains Human genes 0.000 description 1
- 108050004670 PAZ domains Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000051308 human DICER1 Human genes 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest peptyd o aktywności enzymatycznej białka typu Dicer i jego zastosowanie do produkcji krótkich regulatorowych cząsteczek RNA.
Organizmy eukariotyczne (rośliny i zwierzęta, włącznie z człowiekiem) mają zdolność generowania krótkich cząsteczek RNA, o długości około 20-25 nukleotydów, uczestniczących w regulacji ekspresji genów. Regulacja ekspresji genów przez krótkie cząsteczki RNA występuje w wielu ważnych procesach fizjologicznych (proliferacja i różnicowanie komórek, programowana śmierć komórki), jak i w procesach patologicznych (kancerogeneza, infekcje wirusowe, procesy neurodegeneracyjne).
Do powstawania krótkich cząsteczek RNA niezbędny jest specyficzny enzym - białko wykazujące podobieństwo do RNazy typu III. Białko takie, w zależności od pochodzenia, może nosić różne nazwy, w przypadku człowieka zwane jest Dicer, a w przypadku roślin - białkiem typu Dicer (DCL, ang. Dicerlike protein).
Większość białek typu Dicer (Dicer oraz DCL) występujących u kręgowców, owadów i roślin ma w swej strukturze 6 typów domen: kasety DEAD, helikazy C, DUF283 (ang. domain of unknown function),
PAZ (Piwi/Argonaute/Zwill), RNazy III oraz RBD (ang. dsRNA binding domain) [Margis et al.].
U niższych organizmów eukariotycznych białka z rodziny Dicer pozbawione są jednej lub kilku z wymienionych domen. Przykładowo białko Dicer z pierwotniaka Giardia intestinalis zawiera jedynie domeny PAZ oraz RNazy III [Macrae et al.]. Wskazuje to na kluczową rolę tych dwóch domen dla katalitycznej aktywności białek typu Dicer.
Działanie białka typu Dicer polega na wycięciu krótkiego, około 20-25 nukleotydowego, dupleksu RNA z większej cząsteczki prekursorowej. Aby białko typu Dicer właściwie spełniało swą rolę musi być zdolne do rozpoznania dwuniciowego regionu, z którego ma zostać wycięty krótki dsRNA oraz do bardzo precyzyjnego cięcia, tak by otrzymana cząsteczka spełniała ściśle określone parametry. Istotna jest nie tylko długość dupleksu RNA, ale i jego struktura. Musi on mieć dwa niesparowane, wolne nukleotydy na końcu 3'. Należy podkreślić, że cząsteczki dsRNA nie spełniające tych kryteriów nie będą skutecznie włączane do kompleksu efektorowego (RISC; ang. RNA-induced silencing complex), który uczestniczy w regulacji ekspresji genów. Po włączeniu krótkiego dupleksu do RISC jedna z nici RNA jest usuwana i degradowana, podczas, gdy druga służy jako specyficzna sonda umożliwiająca rozpoznanie komplementarnego RNA lub DNA (genu).
W ostatnich latach krótkie cząsteczki RNA znajdują coraz szersze zastosowanie zarówno w biotechnologii jak i w medycynie. Techniki wykorzystujące krótkie cząsteczki RNA do regulacji ekspresji genów są stosowane w celach poznawczych (np. do badania funkcji genów) oraz praktycznych (do uzyskania korzystnych pod względem użytkowym cech u organizmów roślinnych i zwierzęcych). Dodatkowo opracowywane są nowe metody terapeutyczne bazujące na preparatach zawierających krótkie cząsteczki RNA. Większość z tych technik wymaga zastosowania białka Dicer lub DCL do otrzymania krótkich dsRNA. Obecnie w skład komercyjnych zestawów stosowanych w badaniach aktywności biologicznej krótkich regulatorowych RNA wchodzi, między innymi, ekstrakt białkowy wzbogacony w Dicer ludzki lub z Giardia intestinalis.
Odnośnie już istniejących patentów dotyczących zjawisk związanych z RNAi większość z nich dotyczy ludzkiego białka DICER - znacznie różniącego się od niniejszego wynalazku na poziomie sekwencji aminokwasowej, a także zastosowania sztucznych transgenów - zawierających krótkie sekwencje, kodujące cząsteczki konkretnych RNAi, skierowane do ściśle określonych genów - w celu transformacji roślin i modulacji ich fenotypu,
W zgłoszeniu patentowym WO2009117513 (opublikowanym 2009 09 24) opisano zmodyfikowany polipeptyd Dicer, który wykazuje wzmocnioną aktywność katalityczną. Rozwiązanie dostarcza także sposób otrzymywania krótkich regulatorowych RNA z dsRNA, obejmujący kontakt dsRNA z przedmiotowym modyfikowanym Dicer.
W zgłoszeniu patentowym US20100058490 (opublikowanym 2010 03 04) opisano sposoby wyciszania genów. W rozwiązaniu przedstawiono sposoby i środki do modulowania wyciszenia genu u eukariota poprzez zmianę poziomu funkcjonalnego białka DICER i białek typu DICER. W rozwiązaniu przedstawiono także sposoby i środki do modulowania potranskrypcyjnego wyciszania genu u eukariota poprzez zmianę poziomu funkcjonalnego białek zaangażowanych w wyciszanie transkrypcyjne genu kodującego wyciszany RNA.
Pomimo istniejących do tej pory rozwiązań wykorzystujących krótkie cząsteczki RNA do regulacji ekspresji genów stosowanych zarówno do badania funkcji genów, jak i do uzyskania między innymi
PL 221 404 B1 korzystnych pod względem użytkowym cech u organizmów roślinnych i zwierzęcych istnieje ciągła potrzeba wytwarzania krótkich cząsteczek RNA, z wykorzystaniem białek o aktywności Dicer.
Celem przedmiotowego rozwiązania jest opracowanie zaprojektowanego przez twórców nowego peptydu MtDCL1pepA o aktywności enzymatycznej białka typu Dicer pochodzenia roślinnego oraz jego zastosowanie do generowania 15-30 nukleotydowych cząsteczek RNA.
Realizację tak określonego celu i rozwiązanie problemów opisanych w stanie techniki związanych z opracowaniem i dostarczeniem peptydu o aktywności białka typu Dicer, odróżniającego go od występujących w dostępnych preparatach pod względem pochodzenia oraz zoptymalizowanych parametrów fizykochemicznych i biochemicznych, rozpuszczalnego w roztworach wodnych, osiągnięto według wynalazku.
Wskazane powyżej cechy peptydu MtDCL1pepA przekładają się na możliwość jego zastosowania do generowania krótkich cząsteczek RNA, o długości 15-30 nukleotydów. Proponowane zastosowanie peptydu MtDCL1pepA umożliwia produkcję krótkich cząsteczek RNA o właściwości krótkich regulatorowych RNA zdecydowanie taniej od innych obecnie stosowanych, gdyż białko MtDCL1pepA można produkować zarówno w systemie eukariotycznym, jak i, co jest unikatową właściwością peptydu MtDCL1pepA, w tanim i niezwykle wydajnym systemie prokariotycznym. System ten pozwala także uzyskiwać preparat o niezwykle wysokiej czystości, zdecydowanie przewyższającej pozostałe opisane dotąd preparaty. Proponowane zastosowanie, z racji wykorzystania enzymu roślinnego, umożliwia szczegółowe badania zjawiska interferencji RNA u roślin - jak dotąd nie istnieje możliwość produkcji krótkich regulatorowych RNA przy użyciu komercyjnego enzymu pochodzenia roślinnego.
Przedmiotem wynalazku jest peptyd, charakteryzujący się tym, że obejmuje peptyd MtDCL1pepA określony sekwencją SEQ ID NO: 1 o aktywności enzymatycznej białka typu Dicer.
Korzystnie peptyd MtDCL1pepA zawiera sekwencję wykazującą co najmniej 80% podobieństwa do SEQ ID NO: 1.
Korzystnie peptyd MtDCL1pepA zaopatrzony jest w znaczniki.
Korzystnie, gdy znaczniki obejmują peptyd S-transferazy glutationowej (GST) na N-końcu MtDCL1pepA oraz jeden znacznik FLAG i jeden znacznik heksahistydynowy (His) na C-końcu.
Korzystnie peptyd MtDCL1 pepA jest wytwarzany w systemie eukariotycznym lub prokariotycznym.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie peptydu określonego powyżej do generowania 15-30 nukleotydowych cząsteczek RNA.
Rozwiązanie przedstawiono na rysunku, gdzie:
Figura 1 przedstawia amplifikację cDNA kodującego peptyd MtDCL1. Linie 1, 2, 3 - produkt PCR otrzymany w efekcie amplifikacji cDNA z młodych liści i szczytowej części pędu nadziemnego M. truncatula z zastosowaniem oligomerów DNA: J08-10 oraz J08-13. Wielkość produktu zgadza się z oczekiwaną dla cDNA DCL1 z M. truncatula - 5784 par zasad, oszacowaną na podstawie analiz bioinformatycznych cDNA dla DCL1 z innych organizmów oraz sekwencji klonu genomowego z M. truncatula - mth2-71o19, nr dostępu AC150443.
Figura 2 przedstawia strukturę klonu 44-57 kodującego peptyd DCL1 z M truncatula. Porównanie sekwencji cDNA - klonu 44-57 z sekwencją klonu genomowego mth2-71o19 (nr dostępu AC150443) uwidacznia granice pomiędzy egzonami zaznaczone, jako pionowe czarne linie; egzon 1, 14 i 17 zostały podpisane, a egzony 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 i 20 zaznaczono jako prostokąty; granice pomiędzy egzonami oznaczono według koordynat odnoszących się do sekwencji klonu 44-57. Część kodująca klonu 44-57, oznaczona jako CDS (coding sequence) i zaznaczona na zielono, leży pomiędzy pozycją 79 a 5742 klonu 44-57. Pokazano też położenie regionów kodujących poszczególne domeny białkowe w peptydzie MtDCL1 44-57 kodowanym przez klon 44-57 i ich lokalizację w stosunku do granic pomiędzy egzonami.
Struktura sekwencji klonu 44-57 uwidacznia, że klon ten zawiera kompletną sekwencję kodującą peptyd DCL1 - powyżej startu translacji, w pozycji 79, znajduje się 78 nukleotydów a poniżej kodonu stop, w pozycji 5742, jest 42 nukleotydowy odcinek nie kodujący. Region kodujący (CDS) klonu 44-57 - leżący pomiędzy pozycjami 79 a 5742 - zawiera wszystkie domeny charakterystyczne dla peptydów DCL. W obrębie egzonu 13 i 15 widoczne jest niższe podobieństwo pomiędzy cDNA - sekwencją klonu 44-57 a sekwencją genomową pochodzącą z klonu mth2-71o19 (nr dostępu AC150443). Analizy dokonano przy pomocy programu Blastn.
Figura 3 przedstawia drzewo filogenetyczne peptydów DCL z M. truncatula i A. thaliana. Drzewo otrzymano metodą N-J (Neighbourhood-Joining) na podstawie sekwencji uporządkowanych
PL 221 404 B1 programem ClustalW. W roślinie modelowej A. thaliana obecne są geny dla czterech typów białek DCL, nazywane: DCL1, DCL2, DCL3 i DCL4. Niektóre z tych białek występują w kilku formach splicingowych - oznaczonych na rysunku jako „-sf”. Cztery typy białek DCL obecne u A. thaliana mają podobny molekularny mechanizm działania, ale różnią się funkcją. Przypuszcza się, że u innych roślin również występują geny dla wszystkich czterech typów białek DCL, tak jak u A. thaliana, przy czym niekiedy mogło dojść do duplikacji niektórych genów tworzących wówczas małe, blisko spokrewnione grupy nazywane rodzinami genowymi. Analiza filogenetyczna peptydu badanego pochodzącego z M. truncatula - peptydu kodowanego przez klon 44-57 - wobec wszystkich peptydów DCL z A. thaliana przyporządkowuje peptyd badany do peptydu ortologicznego. Przedstawione drzewo filogenetyczne pokazuje, że pokrewieństwo pomiędzy peptydem MtDCL1 kodowanym przez klon 44-57 a peptydem DCL1 z A. thaliana jest większe niż pomiędzy peptydem DCL1 z A. thaliana a dowolnym innym peptydem DCL z A. thaliana. Stąd wnosi się, że peptydy MtDCL1 z M. truncatula i DCL1 z A. thaliana są to peptydy ortologiczne. W analizie uwzględniono też peptyd otrzymany w efekcie bioinformatycznej analizy sekwencji klonu genomowego z M. truncatula mt2-71o19 (nr dostępu AC150443). Analizę filogenetyczną dokonano zestawem programów dostępnych na stronie internetowej http://align.genome.jp. W przypadku peptydów z A. thaliana podane są nazwy jak DCL1, DCL2 oraz numery dostępu peptydów, dla peptydu pochodzącego z klonu genomowego mt2-71o19 (wyróżnionego przez jednokrotne podkreślenie) podano nr dostępu sekwencji nukleotydowej, peptyd kodowany przez sekwencje cDNA klonu 44-57 otrzymany przez twórców oznaczono MtDCL1 peptyd (wyróżniony przez dwukrotne podkreślenie).
Figura 4 przedstawia budowę domenową białek typu Dicer z Medicago truncatula i Arabidopsis thaliana, człowieka i pierwotniaka Giardia intestinalis. Zaznaczono także aktywny fragment białka DCL1 z M. truncatula - MtDCL1pepA. Identyfikacji domen dokonano przy pomocy narzędzia EMBL-EBI InterProScan.
Figura 5 przedstawia: (A) schemat budowy wektora ekspresyjnego pGEX-6P-3 (GE Healthcare); (B) schemat wektora ekspresyjnego pGEX-MtDCL1pepA, otrzymanego z wektora pGEX-6P-3 i sekwencji kodującej MtDCL1pepA, wykorzystanego do produkcji peptydu MtDCL1pepA w komórkach bakteryjnych. Na schematach wskazano m.in. lokalizację sekwencji kodujących białko MtDCL1pepA, znaczniki GST, FLAG i His, lokalizację promotora tac (Ptac), genu selekcyjnego i miejsc restrykcyjnych wykorzystywanych w procedurze wklonowania sekwencji MtDCL1pepA; (C) schemat reakcji PCR wykorzystanej do amplifikacji DNA kodującego białko MtDCL1pepA. Wskazana została budowa starterów.
Figura 6 przedstawia: (A) wynik produkcji białka MtDCL1pepA zaopatrzonego w znaczniki GST na końcu N oraz FLAG i His na końcu C (masa całego białka fuzyjnego wynosiła 112 kDa). Na żelu 10% PAA z SDS dokonano rozdziału frakcji białek izolowanych z próbek hodowli bakteryjnej szczepu transformowanego wektorem ekspresyjnym. Próbki pobrano tuż przed indukcją ekspresji (czas 0h) oraz 4 godziny po dodaniu induktora - IPTG. Równocześnie prowadzono kontrolną hodowlę bez dodatku induktora ekspresji. Żel wybarwiono barwnikiem Comassine Blue; (B) otrzymany preparat białkowy wzbogacony w białko DCL1pepA pozbawione znacznika GST na N końcu (masa białka: 86 kDa). Preparat był rozdzielony na żelu 10% PAA z SDS. Czystość preparatu ilustruje żel wybarwiony Comassine Blue, białko zidentyfikowano przy pomocy techniki Western Blot; (C) porównanie aktywności białka DCL1pepA oraz komercyjnie dostępnego białka Dicer z Giardia intestinalis. W reakcji z prekursorem ludzkiego miRNA 33a (66nt) w obecności dwóch różnych roztworów buforujących (B1, B2) białko DCL1pepA generuje produkty o długości ok. 20-25nt Porównywane rekombinowane białko Dicer z Giardia intestinalis w obecności identycznego substratu, generuje produkty o większym zakresie długości, z przewagą fragmentów 36-37 nukleotydowych. Reakcje były prowadzone w zoptymalizowanym roztworze buforującym dołączonym do białka Dicer z Giardia intestinalis (oznaczenie B1) lub buforze 20 mM Tris-HCl pH 7,5 z 250 mM NaCl i 2,5 mM MgCl2 (oznaczenie B2). M - marker mas cząsteczkowych, K - kontrola (mieszanina reakcyjna bez dodatku enzymu, HA - substrat miRNA 33a poddany hydrolizie alkalicznej, h - czas prowadzenia reakcji w godzinach.
Dla lepszego zrozumienia wynalazku poniżej przedstawiono przykłady rozwiązania.
Przykład
W bazach sekwencji (GenBank) nie ma zdeponowanej sekwencji cDNA dla białka DCL1 z M. truncatula (MtDCL1). Dostępna jest jedynie sekwencja genu (złożona z intronów i egzonów) oraz sztuczna sekwencja cDNA otrzymana w wyniku bioinformatycznej obróbki sekwencji genowej. Poznana
PL 221 404 B1 sekwencja cDNA MtDCL1 różni się nieznacznie od sztucznej sekwencji cDNA MtDCL1 otrzymanej w wyniku obróbki bioinformatycznej sekwencji genomowej.
cDNA kodujące peptyd DCL1 z rośliny Medicago truncatula (dalej nazywany jako MtDCL1) otrzymano przy pomocy techniki RT PGR i klonowania wykorzystującego homologię. W pierwszym etapie przeszukano bazę nr sekwencji Medicago truncatula w GenBank, przy pomocy aminokwasowej sekwencji białka DCL1 z Arabidopsis thalian, nr dostępu NP_171612.1 i programu tblastn. Do dalszej pracy wybrano region [119169-109079] sekwencji klonu mt2-71o19 z Medicago truncatula o numerze dostępu AC150443, dla którego podobieństwo z sekwencją białka DCL1 z Arabidopsis thalian (nr dostępu NP._171612.1) cechuje się najniższą oczekiwaną wartością.
Region [119169-109079] sekwencji klonu mt2-71o19 z Medicago truncatula o numerze dostępu AC150443 posłużył do rekonstrukcji przypuszczalnej sekwencji cDNA zawierającej kompletną sekwencję kodującą białko MtDCL1. Rekonstrukcja przypuszczalnej sekwencji cDNA (egzonów) genu kodującego MtDCL1 została przeprowadzona na drodze porównania regionu [119169-109079] sekwencji klonu mt2-71o19 (nr dostępu AC150443) z sekwencją kodującą DCL1 z Arabidopsis thaliana o numerze dostępu NM_099986 przy pomocy programu Spidey (www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey), oraz poprzez porównanie sekwencji aminokwasowej otrzymanej w wyniku translacji sekwencji klonu mt2-71o19 (nr dostępu AC150443) z sekwencją białka DCL1 z Arabidopsis thaliana. Bioinformatycznej translacji sekwencji klonu mt2-71o19 (nr dostępu AC150443) dokonano przy pomocy programów z zestawu Sequence Manipulation Suite (http://www.bioinformatics.org/sms2). Przyjęto, że region [119169-109079] sekwencji klonu mt2-71o19, nr dostępu AC150443 zawiera kompletną sekwencję kodującą białko DCL1 z M. truncatula oraz część lub całość regionów cDNA nieulegających translacji (UTR). Następnie zaprojektowano dwa oligomery DNA - J08-10 i JU8-13, oskrzydlające sekwencję kodującą białko MtDCL1, których sekwencja była w 100% identyczna z wybranymi odcinkami regionu [119169-109079] sekwencji klonu mth2-71o19 (nr dostępu AC150443). Oligomer DNA o nazwie J08-10 składał się z 29 nukleotydów i był określony sekwencją SEQ ID NO: 2, podczas gdy oligomer J08-13 o składał się z 25 nukleotydów i był określony sekwencją SEQ ID NO: 3 (sekwencje podane zgodnie z konwencją od końca 5' do końca 3').
W kolejnym etapie prac przeprowadzono reakcję syntezy pierwszej nici cDNA stosując 2 mikrogramy RNA pochodzącego z młodych liści i młodych, szczytowych części nadziemnych pędów Medicago truncatula R108 na 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej oraz oligomer DNA (dT)18 o stężeniu końcowym 2,5 mikromoli/L, DTT o stężeniu końcowym 10 milimoli/L, dATP o stężeniu końcowym 0,5 milimoli/L, dCTP o stężeniu końcowym 0,5 milimoli/L, dGTP o stężeniu końcowym 0,5 milimoli/L, dTTP o stężeniu końcowym 0,5 milimoli/L, inhibitor RNAzy - RNaseOUT (Invitrogen) o stężeniu końcowym 2 jednostki/mikrolitr, oraz bufor do odwrotnej transkrypcji z zestawu Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) i enzym - Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) o stężeniu 10 jednostek/mikrolitr. Reakcję syntezy pierwszej nici cDNA prowadzono zgodnie z zaleceniami dostawcy zestawu Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) z tym, że inkubację w 42°C prowadzono przez 55 minut. Otrzymany w wyniku tej reakcji jednoniciowy cDNA użyto następnie, bez oczyszczania go z pozostałych składników reakcji odwrotnej transkrypcji, do syntezy drugiej nici cDNA i amplifikacji cDNA w reakcji PCR z zastosowaniem zestawu FastStart High Fidelity PCR System firmy
Roche. Reakcję PCR prowadzono w buforze 2 (zawierającym chlorek magnezu o stężeniu końcowym w mieszaninie reakcyjnej 1,8 milimola/L) z zestawu FastStart High Fidelity PCR System (Roche), stosując 1 mikrolitr reakcji odwrotnej transkrypcji (opisanej wyżej) przy objętości końcowej mieszaniny reakcyjnej 50 mikrolitrów. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziło: DMSO o stężeniu końcowym 2%, dATP o stężeniu 0,2 milimola/L, dCTP o stężeniu 0,2 milimola/L, dGTP o stężeniu 0,2 milimola/L, dTTP o stężeniu 0,2 milimola/, oligomer DNA J08-10 (sekwencja patrz wyżej) o stężeniu 0,3 mikromola/L, oligomer DNA J08-13 (sekwencja patrz wyżej) o stężeniu 0,3 mikromola/L, oraz mieszanina enzymów z zestawu FastSart High Fidelity PCR System (Roche) o stężeniu końcowym 0,05 jednostki/mikrolitr. Reakcję PCR prowadzono stosując następujący program: etap pierwszy - inkubacja w 94°C przez 2 minuty, etap drugi: dziesięć razy sekwencja inkubacji: inkubacja w 94°C przez 30 sekund, inkubacja w 53°C przez 30 sekund, inkubacja w 68°C przez 6 minut, etap trzeci: dwadzieścia pięć razy sekwencja inkubacji: inkubacja w 94°C przez 30 sekund, inkubacja w 55°C przez 30 sekund, inkubacja w 68°C przez 6 minut z wydłużeniem czasu inkubacji o 10 sekund przy każdym kolejnym cyklu, etap czwarty: jeden raz inkubacja w 68°C przez 7 minut zakończona schłodzeniem reakcji do 4°C. Otrzymano w efekcie produkt o długości około 5784 pz (par zasad), Fig. 1. Produkt reakcji PCR oczyszczono na 0,7% żelu agarozowym, z którego wydęto DNA o długości fragmentów około
PL 221 404 B1
5.784 pz i zestawem. QIAquick Gel Extraction Kit firmy Qiagen dokonano ekstrakcji DNA z żelu agarozowego postępując zgodnie z instrukcją producenta zestawu. Otrzymano preparat DNA o długości cząsteczek około 5.784 pz i stężeniu około 15 ng/mikrolitr, który użyto do kolejnego etapu - klonowania cDNA kodującego MtDCL1. Najpierw dokonano wprowadzenia badanego DNA do wektora plazmidowego pCR-XL-TOPO firmy (Invitrogen). Reakcję prowadzono zgodnie z instrukcją dostarczaną przez producenta zestawu TOPO XL PCR Cloning Kit - firmę Invitrogen, stosując 0,5 mikrolitra wyżej opisanego preparatu zawierającego klonowany cDNA kodujący MtDCL 1 i 2,5 mikrolitra mieszaniny zawierającej aktywowany plazmid i enzym z zestawu TOPO XL PCR Cloning Kit (Invitrogen). Po zakończeniu reakcji, w której cDNA jest włączany do wektora plazmidowego dając zrekombinowane plazmidy, przeprowadzono transformację bakterii One Shot TOP10 Electrocomp E. coli (Invitrogen) zgodnie z instrukcją producenta. Do transformacji użyto 40 mikrolitrów bakterii, 1 mikrolitr zrekombinowanego plazmidu, kuwety do elektroporacji o odległości elektrod -1 mm oraz elektroporator Gen-Pulser firmy BioLabs. W celu podania impulsu elektrycznego zastosowano 1250 V, 25 mikroFaradów i 200 Ohmów. Po inkubacji mieszaniny transformacyjnej z 250 mikrolitrami pożywki SOC w 37°C przez 75 minut, wysiano po 20 mikrolitrów i 200 mikrolitrów bakterii na szalki zawierające pożywkę stałą LB z kanamycyną o stężeniu 50 mikrogramów/ml, jako czynnikiem selekcyjnym i inkubowano je w 37°C przez 20 godzin. Otrzymano i przebadano 19 kolonii, z których trzy miały insert o spodziewanej długości - około 5.784 pz. Przeprowadzono hodowlę tych klonów w 20 ml pożywki płynnej i wyizolowano - metodą lizy alkalicznej [Sambrook et al.] - DNA plazmidowy, który użyto do sekwencjonowania. Analiza sekwencji wykazała, że tylko jeden klon nazwany 41-57 zawiera kompletną sekwencję kodującą peptyd DCL1 pochodzący z Medicago truncatula (MtDCL1), Fig. 2. Potwierdzenie, że peptyd kodowany przez klon 44-57 jest odpowiednikiem M. truncatula peptydu DCL1 z A. thaliana uzyskano w efekcie analizy filogenetycznej - Fig. 3 oraz tabela 1.
T a b e l a 1
Porównanie peptydów DCL1 z Medicago truncatula - tj. peptydu MtDCL1 kodowanego przez klon 44-57 oraz peptydu otrzymanego z bioinformatycznej analizy klonu genomowego mth2-71o19, nr dostępu AC150443 z peptydami DCL1, DCL2, DCL3 i DCL4 z Arabidopsis thaliana.
Podobieństwo pomiędzy peptydami DCL z M. truncatula i A. thaliana wyrażono w procentach
| MtDCLI klon 44-57 | mth2-71o19 AC150443 | AthDCL1 NP171612.1 | AthDCL2 NP001078101 | AthDCL3 ABF19799.1 | AthDCL4 AAZ80387.1 | |
| MtDCLI Klon 44-57 | 100% | 99.57% | 86.54% | 45.73% | 43.13% | 41.39% |
| mth2-71o19 AC150443 | 99.57% | 100% | 86.98% | 45.88% | 43.27% | 41.53% |
| AthDCLI NP171612.1 | 86.54% | 86.98% | 100% | 45.88% | 43.70% | 40.96% |
| AthDCL2 NP001078101 | 45.73% | 45.88% | 45.88% | 100% | 40.81% | 40.81% |
| AthDCL3 ABF19799.1 | 43.13% | 43.27% | 43.70% | 40.81% | 100% | 38.49% |
| AthDCL4 AAZ80387.1 | 41.39% | 41.53% | 40.96% | 40.81% | 38.49% | 100% |
Stopień podobieństwa między parą peptydów wyrażono jako procent identycznych aminokwasów na odpowiadających sobie pozycjach porównywanych peptydów. Korelację peptydów przyporządkowującą odpowiadające sobie pozycje w poszczególnych pe ptydach przeprowadzono programem ClustalW. Peptydy uporządkowane przez program ClustalW, przed analizą stopnia podobieństwa, zostały poddane oczyszczaniu z pozycji o niskiej wiarygodności korelacji oraz z regionów nie mających odpowiedników we wszystkich porównywanych sekwencjach przy pomocy programu Gblocks.
Analizę prowadzono przy pomocy pakietu programów dostępnych na stronach internetowych http://www.phylogeny.fr oraz http://www.bioinformatics.org/sms2/.
Peptydy pochodzące z M. truncatula - peptyd MtDCL1 kodowany przez klon 44-57 oraz peptyd otrzymany w efekcie bioinformatycznej analizy sekwencji klonu genomowego mth2-71o19 (nr dostępu
PL 221 404 B1
AC150443) są prawie dwa razy bardziej podobne do peptydu DCL1 z A. thaliana niż do pozostałych peptydów DCL z A. thaliana.
Podobieństwo pomiędzy peptydami pochodzącymi z M. truncatula - peptydem MtDCLI kodowanym przez klon 44-57 oraz peptydem otrzymanym w efekcie bioinformatycznej analizy sekwencji klonu genomowego mth2-71o19 (nr dostępu AC150443) jest prawie dwukrotnie wyższe (1.89-2.10) od podobieństwa z pozostałymi peptydami DCL. Świadczy to - podobnie jak wynik analiz filogenetycznych, że peptyd DCL1 z A. thaliana jest bliżej spokrewniony z peptydami. MtDCL1 i z peptydem otrzymanym w efekcie bioinformatycznej analizy sekwencji klonu genomowego mth2-71o19, niż z pozostałymi peptydami DCL z A. thaliana.
Uzyskaną sekwencję białka MtDCL1 (wynik translacji sekwencji DNA genu obecnego w klonie 41-57) poddano analizie bioinformatycznej pod kątem zawartości znanych domen funkcjonalnych, wykorzystując narzędzie EMBL-EBI InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan). W zadanej sekwencji zidentyfikowanych zostało 6 typów domen charakterystycznych dla większości białek typu Dicer: kaseta DEAD, helikaza C, DUF283, PAZ, RNaza III oraz RBD. Ich szczegółowe rozmieszczenie w białku MtDCL1 przedstawia Fig. 4. Na podstawie wspomnianej analizy zaprojektowano białko skrócone, tzn. zawierające jedynie wybrane domeny, niezbędne do zachowania właściwej aktywności katalitycznej. Skrócenie białka było zabiegiem niezbędnym, by móc produkować białko w tanim i wydajnym bakteryjnym systemie ekspresyjnym. Za wzorzec przy wyborze domen posłużyło białko Dicer z pierwotniaka Giardia intestinalis, które mając jedynie 2 typy domen: PAZ i RNazy III, jest aktywne katalitycznie. Zaprojektowane skrócone białko, zwane dalej MtDCL1 pepA, nie ma 1154 aminokwasów z N końca białka MtDCL1. Usunięty fragment obejmuje kasetę DEAD, domenę helikazy C oraz DUF283. Peptyd MtDCL1pepA zawiera domenę PAZ, dwie domeny RNazy III oraz dwie domeny RBD, co obrazuje Fig. 4.
Dla podniesienia wydajności ekspresji oraz zapewnienia możliwości zastosowania łatwych i efektywnych metod identyfikacji oraz oczyszczania białka zadecydowano o zaopatrzeniu MtDCL1pepA w kilka znaczników. I tak na N końcu MtDCL1pepA dołączono duży peptyd S-transferazy glutationowej (GST, ang. glutathione S-transferase), natomiast na C końcu dwa krótkie znaczniki: FLAG oraz heksahistydynowy (His), By otrzymać tak zaprojektowane białko przygotowano wektor ekspresyjny pGEX-MtDCLpepA, pochodną komercyjnie dostępnego plazmidu pGEX-6P-3 (GE Healthcare) zawierającego sekwencję znacznika GST (por. Fig. 5). Do plazmidu pGEX-6P-3 wklonowano fragment genu MtDCL1, kodujący wybrany fragment białka (aminokwasy 1155-1887) wraz ze znacznikami FLAG i His.
DNA do wklonowania uzyskano w dwóch reakcjach PCR, z wykorzystaniem trzech odmiennych starterów: starter FWD zawierał miejsce cięcia enzymu EcoRI oraz fragment sekwencji komplementarnej do sekwencji kodującej N koniec zaprojektowanego białka MtDCL1pepA, starter REV1 zawierał fragment sekwencji komplementarnej do sekwencji kodującej C koniec MtDCL1pepA oraz część sekwencji kodującej znaczniki FLAG i His, natomiast starter REV2 zawierał część sekwencji kodującej znaczniki FLAG i His oraz miejsce cięcia enzymu SalI. Sekwencje starterów REV1 i REV2 częściowo się pokrywały, by umożliwić przeprowadzenie reakcji PCR z wykorzystaniem REV2 na matrycy produktu reakcji PCR ze starterem REV1 (Fig. 5). W pierwszej reakcji PCR użyto DNA klonu 41-57 oraz startery FWD i REV1, natomiast w drugiej - startery FWD i REV2 oraz oczyszczony przy użyciu zestawu QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) produkt poprzedniej reakcji PCR. Skład każdej reakcji PCR (podano stężenia końcowe, objętość reakcji: 50 pl): DNA klonu 41-57 (100 ng/50 pl), primer FWD (1 pM), primer REV1 lub REV2 (1 pM), mix dNTP (200 pM), bufor reakcyjny z zestawu Promega Pfu DNA Polymerase (1x), enzym z zestawu Promega Pfu DNA Polymerase (1,25 U/50 pl), woda wolna od nukleaz. Program reakcji: etap 1 (temp. 95°C - 2 min,), etap II (sekwencja: temp. 95°C - 1 min, 60°C - 30 sek., 72°C - 4 min) powtórzony 30 razy, etap III (temp. 72°C - 5 min). Produkt reakcji oczyszczono przy użyciu zestawu QIAquick PCR Purification Kit (QIAG E N) zgodnie z opisem producenta. Tak przygotowane DNA insertu oraz DNA wektora pGEX-6P-3 poddano reakcjom trawienia enzymami restrykcyjnymi EcoRI (Fermentas) i SalI (Fermentas). Skład reakcji trawienia (podano stężenia końcowe, objętość reakcji: 40 pl): DNA insertu lub wektora (1 pg/40 pl), Fermentas Bufor O (1x), enzym Fermentas EcoRI (5 U/40 pl), enzym Fermentas SalI (5 U/40 pl), woda wolna od nukleaz. Reakcję prowadzono 4 godziny w temp. 37°C. Produkt każdej reakcji oczyszczono przy użyciu zestawu QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) zgodnie z opisem producenta. Oczyszczone produkty trawień poddano reakcji ligacji z użyciem enzymu T4 DNA Ligase (Promega). Skład reakcji ligacji (podano stężenia końcowe, objętość reakcji: 20 pl): DNA wektora (100 ng/20 pl), DNA insertu (200 ng/20 pl), bufor
PL 221 404 B1 z zestawu Promega T4 DNA Ligase (1x), enzym z zestawu Promega T4 DNA Ligase (2 U/20 μΐ), woda wolna od n uk leaz. Reakcję prowadzono 16 godz. w temp. 4°C. Produktem reakcji transformowano komórki kompetentne E. Coli DH5a, w celu selekcji i namnożenia poprawnie skonstruowanych plazmidów pGEX-MtDCL1pepA. Do 50μl zawiesiny komórek kompetentnych dodano 5 μl produktu ligacji, bakterie delikatnie mieszano, inkubowano w temp. 4°C przez 45 min. Następnie poddano szokowi termicznemu przez inkubację zawiesiny w temp. 42°C przez 45 sek. i szybkie schłodzenie w 4°C. Do zawiesiny dodano 1 ml płynnej pożywki LB i wytrząsano przez godzinę w 37°C z prędkością 225 rpm. Zawiesinę rozprowadzono na dwóch szalkach ze stałą pożywką LB z ampicyliną. Szalki inkubowano przez 16 godz. w temp. 37°C. Wybrano 24 pojedyncze kolonie bakterii wyhodowane na stałej pożywce LB z ampicyliną, przeniesiono do 2 ml płynnej pożywki LB zawierającej ampicylinę i wytrząsano przez 16 godz. w 37°C z prędkością 300 rpm. Każdą hodowlę wirowano z prędkością 14000 rpm przez 1 min, roztwór dekantowano, a z osadu zawierającego bakterie izolowano plazmidy metodą lizy alkalicznej. Każdy plazmid oczyszczono przy użyciu zestawu QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) zgodnie z opisem producenta i sekwencjonowano. Tak wyselekcjonowano preparat zawierający poprawnie skonstruowany, oczyszczony plazmid pGEX-MtDCL1 pepA.
W celu przeprowadzenia procedury ekspresji białka gotowy plazmid wykorzystano do transformacji komórek kompetentnych szczepu E. coli BL21 (szczep ekspresyjny). Do 50 μl preparatu komórek kompetentnych dodano 5 μl oczyszczonego plazmidu pGEX-MtDCL1pepA (2 ng/μθ, delikatnie mieszano i inkubowano w temp. 4°C przez 30 min. Następnie bakterie poddano szokowi termicznemu przez inkubację zawiesiny w 42°C przez 30 sek. i szybkie schłodzenie w 4°C. Do zawiesiny dodano 250 μl pożywki SOC i wytrząsano przez godzinę w temp. 37°C z prędkością 225 rpm, po czym zawiesinę rozprowadzono na dwóch szalkach ze stałą pożywką LB zawierającą ampicylinę. Szalki inkubowano przez 16 godz. w temp 37°C. Spośród otrzymanych na szalkach kolonii wybrano jedną, która posłużyła do inicjacji kultury ekspresyjnej. Kolonię przeniesiono do 10 ml płynnej pożywki LB zawierającej ampicylinę, hodowlę wytrząsano przez 16 godz. w temp. 37°C z prędkością 300 rpm i wykorzystano do zaszczepienia 1000 ml świeżej pożywki LB z ampicyliną. Prowadzono dalszą inkubację hodowli w identycznych warunkach. W momencie osiągnięcia przez zawiesinę bakterii gęstości optycznej OD600~0,7 temperaturę hodowli obniżono do 18°C i indukowano ekspresję przez dodanie roztworu izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do stężenia końcowego 0,05 mM. Ekspresję prowadzono przez kolejne 16 godzin. Zawiesinę bakterii wirowano następnie z prędkością 5000 rpm w 4°C przez 15 min, roztwór dekantowano, a osad bakteryjny wykorzystano do izolacji białka.
W celu izolacji rekombinowanego białka MtDCL1 pepA przeprowadzono ekstrakcję totalnej frakcji białek rozpuszczalnych z bakterii. Osad bakteryjny zawieszono w buforze do ekstrakcji (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 5 m M DTT, 1x CelLytic, 0,1 mg/ml lizozym, 25 U/ml benzonaza, pH 7,3) stosując proporcję 5 ml buforu na każdy 1 g osadu, wytrząsano w temp. 23°C przez 15 minut i wirowano z prędkością 15000 rpm. Otrzymany supernatant zawierający frakcję rozpuszczalnych białek bakteryjnych analizowano na 10% denaturującym żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE). Wynik analizy przedstawia Fig. 6. Z supernatantu izolowano MtDCL1pepA metodą chromatografii powinowactwa do glutationu. Supernatant nałożono na kolumnę zawierającą 1 ml upakowanego złoża Glutathione Sepharose 4 Fast Flow przygotowanego zgodnie z opisem producenta. Złoże przemyto kolejno 10 ml buforu do wiązania (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3) i 10 ml buforu do cięcia proteazą PreScission (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7,5), a następnie zmieszano z 1 ml bufora do cięcia proteazą PreScission z dodatkiem proteazy PreScission (40 U/ml) i inkubowano w temp. 4°C przez 16 godzin. Białko eluowano z kolumny 1 ml bufora do cięcia proteazą PreScission, a następnie dokonano wymiany buforu na 50 mM Tris-HCl pH 7,5 przy użyciu filtra Millipore Amicon Ultra-0.5 10K, zgodnie z opisem, producenta. Otrzymany preparat (1 ml) analizowano na żelu (SDS-PAGE) oraz techniką Westem-Blot (Fig. 6).
Aby określić aktywność otrzymanego peptydu przeprowadzono standardową reakcję trawienia prekursora miRNA (hsa-miR 33a) znakowanego radioaktywnie na końcu 5'. Dla porównania wykonano analogiczną serię reakcji trawienia, w których zamiast preparatu MtDCL1pepA użyto komercyjnie dostępne białko Dicer z G. intestinalis. Reakcje prowadzono w zoptymalizowanym komercyjnym buforze dołączonym do białka Dicer z G. intestinalis, a w przypadku peptydu MtDCL1pepA dodatkowo w buforze 20 mM Tris-HCl pH 7,5 z 250 mM NaCl i 2,5 mM MgCl2. We wszystkich przypadkach substrat reakcji (10 pikomoli) poddawano najpierw przez 3 minuty ogrzaniu w temp. 85°C, a następnie
PL 221 404 B1 powolnemu schładzaniu (1°C/min.) do temperatury 23°C, w celu uzyskania możliwie najbardziej homogennej struktury produktu.
Po schłodzeniu do roztworu substratu dodawano właściwy bufor oraz enzym (preparat
MtDCL1pepA - 7 μ!, Dicer - zgodnie z opisem producenta). Reakcję prowadzono przez 16 godzin w temperaturze 37°C. Analizę produktów reakcji prowadzono metodą elektroforezy w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym (Fig. 6). W reakcji z peptydem MtDCL1pepA powstawał szereg produktów, z których większość mieści się w zakresie długości 20-25 nukleotydów, co odpowiada długości krótkich regulatorowych RNA. Reakcja z białkiem Dicer z G. intestinalis daje zdecydowanie inny zestaw produktów, z których dwa główne (36 oraz 37 nukleotydowe) są zdecydowanie dłuższe od typowych regulatorowych RNA (por. Fig. 6).
Opisane powyżej wstępne testy aktywności dowiodły, że otrzymany peptyd MtDCL1pepA wykazuje oczekiwaną aktywność endorybonukleazy, katalizując reakcję wycięcia krótkich dupleksów RNA z dwuniciowego prekursora miRNA.
Produkty te mają, zgodnie z oczekiwaniami, długości w zakresie 15-30 nukleotydów.
Dowodzi to, że MtDCL1pepA ma aktywność katalityczną charakterystyczną dla białek typu Dicer i może być z powodzeniem zastosowany do produkcji krótkich regulatorowych RNA.
PL 221 404 B1
Literatura
1. Margis R, Fusaro AF, Smith NA, Curtin SJ, Watson JM, Finnegan EJ, Waterhouse PM 2006 The evolution and diversification of Dicers in plants, FEBS Lett 580:2442-2450. Macrae IJ, Zhou K, Li F, Repie A, Brooks AN, Cande WZ, Adams PD, Doudna JA.
2. Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer, Science. 2006 Jan 13;311(5758):195-8.
3. R. D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J. E, Pollington, O. L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E. L. Sonnhammer, S. R. Eddy, A. Bateman; The Pfam protein families database; Nucleic Acids Research 2010 Database Issue 38:D211-22.
4. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T., Molecular Cloning A Laboratory manual, 1989, Second Edit., Cold Spring Harbor Lab. Press, pp. 1.26-1.28.
Lista sekwencji
SEQ ID NO: 1
Sekwencja peptydu MtDCLlpepA >MtDCLlpepA
DWKASGLVPNRDSMETQNHINMTTKGKLMMADTCTSPDDLVGRIVTAAHSGKRFYVDS IRYEMTAENSFPRKEGYLGPLEYSSYADYYKQKYGVDLAYKQQPLIRGRGVPYCKNLLS PRFEHSEGHEDETEETHDKTYYVFLPPELCLVPPLPGSLVRGAQRLPSIMRRVESMLLA VQLKNMINYPVGASKILEALTAASCQETFCYERAELLGDAYLKWVVSRFLFLKRPQKHE GQLTRMRQQMVSNMVLYR¥AŁSKGLQSYILADRFAPSRWAAPGVLPVFDEDTKDEESSL FDQERSIFKAERMDNTDEFEDEMEDGELESDSSSYRVLSSKTLADWEALIGVYYVEGG KNAANHLMKWIGIHIEIDPDEMECITRPSNVPDSILRSVDFDALEGALNIKFKDKGLLI ESITHASRPSSGVSCYGRLEFVGDAVLDHLITRHLFFSYTDLPPGRLTDLRAAAVNNEN FARVTVKHNLHLHLRHGSSALEKQIKDFVREVQDELSKPGFKSFGLGDCKAPKVLGDIL ESIAGAIFLDSGRNTAWWKVFQPLLHPMVTPETLPMHPVRELQERCQQQAEGLEYRAS RAGNLATVEVFIDGVQVGAAQNPQKKMAQKLAARNALAALKEKEESKIQEKNDEKETKS GNQTFTRQTLHDICLRRNWPMPFYRCVSEGGPAHAKKFTFAVRVNTTDKGWTDECVGEP MP ΞVKKAKDSAAVLLLELINKLYSS
SEQIDNO:2 Oligomer J08-10 >J08-10
TAGAATAGGCGTTGATACACAGCAATAGG
SEQIDNO:3 Oligomer J08-13 >J08-13
ACAACCACTGCTTGCTTCTGATTGG
PL 221 404 B1
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Peptyd, znamienny tym, że obejmuje peptyd MtDCL1pepA określony sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 1 o aktywności enzymatycznej białka typu Dicer.
- 2. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję wykazującą co najmniej 80% podobieństwa do SEQ ID NO: 1.
- 3. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że peptyd MtDCL1pepA zaopatrzony jest w znaczniki.
- 4. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że znaczniki obejmują peptyd S-transferazy glutationowej (GST) na N-końcu MtDCL1pepA oraz jeden znacznik FLAG i jeden znacznik heksahistydynowy (His) na C-końcu.
- 5. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że peptyd MtDCL1pepA jest wytwarzany w systemie eukariotycznym lub prokariotycznym,
- 6. Zastosowanie peptydu określonego zastrzeżeniami od 1 do 5 do generowania 15-30 nukleotydowych cząsteczek RNA.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395495A PL221404B1 (pl) | 2011-07-01 | 2011-07-01 | Peptyd o aktywności enzymatycznej białka typu Dicer i jego zastosowanie do produkcji krótkich cząsteczek RNA |
| EP12738654.8A EP2726619B1 (en) | 2011-07-01 | 2012-06-25 | Peptide with the enzymatic activity of a dicer-like protein, a method for preparing short rna molecules, and use thereof |
| PCT/PL2012/000049 WO2013006069A1 (en) | 2011-07-01 | 2012-06-25 | Peptide with the enzymatic activity of a dicer-like protein, a method for preparing short rna molecules, and use thereof |
| US14/127,582 US9051559B2 (en) | 2011-07-01 | 2012-06-25 | Peptide with the enzymatic activity of a Dicer-like protein, a method for preparing short RNA molecules, and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395495A PL221404B1 (pl) | 2011-07-01 | 2011-07-01 | Peptyd o aktywności enzymatycznej białka typu Dicer i jego zastosowanie do produkcji krótkich cząsteczek RNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL395495A1 PL395495A1 (pl) | 2013-01-07 |
| PL221404B1 true PL221404B1 (pl) | 2016-04-29 |
Family
ID=46579304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL395495A PL221404B1 (pl) | 2011-07-01 | 2011-07-01 | Peptyd o aktywności enzymatycznej białka typu Dicer i jego zastosowanie do produkcji krótkich cząsteczek RNA |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9051559B2 (pl) |
| EP (1) | EP2726619B1 (pl) |
| PL (1) | PL221404B1 (pl) |
| WO (1) | WO2013006069A1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113373129B (zh) * | 2021-05-25 | 2022-07-26 | 湖北大学 | 一种原核生物来源的Mbp_Argonaute蛋白及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2650861A1 (en) * | 2006-05-03 | 2007-11-15 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Improved gene silencing methods |
| US9029636B2 (en) * | 2008-02-05 | 2015-05-12 | Monsanto Technology Llc | Isolated novel nucleic acid and protein molecules from soy and methods of using those molecules to generate transgenic plants with enhanced agronomic traits |
| US8440430B2 (en) | 2008-03-21 | 2013-05-14 | The Regents Of The University Of California | Modified dicer polypeptide and methods of use thereof |
-
2011
- 2011-07-01 PL PL395495A patent/PL221404B1/pl unknown
-
2012
- 2012-06-25 EP EP12738654.8A patent/EP2726619B1/en not_active Not-in-force
- 2012-06-25 US US14/127,582 patent/US9051559B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-06-25 WO PCT/PL2012/000049 patent/WO2013006069A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2013006069A1 (en) | 2013-01-10 |
| US9051559B2 (en) | 2015-06-09 |
| WO2013006069A9 (en) | 2017-07-06 |
| US20140186895A1 (en) | 2014-07-03 |
| EP2726619A1 (en) | 2014-05-07 |
| PL395495A1 (pl) | 2013-01-07 |
| EP2726619B1 (en) | 2017-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7379572B2 (ja) | 短縮ガイドＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）を用いたＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性の増大 | |
| Weckwerth et al. | Zm CPK 1, a calcium‐independent kinase member of the Z ea mays CDPK gene family, functions as a negative regulator in cold stress signalling | |
| JP2020103295A (ja) | Ｃａｓ９ターゲッティングをガイドする配列に関する方法および組成物 | |
| Díaz‐Santos et al. | Efficiency of different heterologous promoters in the unicellular microalga Chlamydomonas reinhardtii | |
| JP2011224002A5 (pl) | ||
| CN107278231A (zh) | 真菌基因组修饰系统及使用方法 | |
| KR101952470B1 (ko) | 변경된 점성 표현형을 갖는 사상균 | |
| García‐Ortiz et al. | Arabidopsis thaliana AtPOLK encodes a DinB‐like DNA polymerase that extends mispaired primer termini and is highly expressed in a variety of tissues | |
| CN105463015A (zh) | 毛竹转录因子nac基因cds序列的应用 | |
| WO2016197561A1 (zh) | 甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和生物合成方法 | |
| CN114958791B (zh) | 亚精胺衍生物糖基转移酶LbUGT62及其编码基因和应用 | |
| PL221404B1 (pl) | Peptyd o aktywności enzymatycznej białka typu Dicer i jego zastosowanie do produkcji krótkich cząsteczek RNA | |
| JP6741061B2 (ja) | 核酸増幅法 | |
| JP2018536400A (ja) | ドリメノールシンターゼｉｉｉ | |
| CN109735516A (zh) | 受核苷酸片段引导具有特异核酸内切酶活性的piwi蛋白 | |
| CN102604906A (zh) | 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4及其基因 | |
| KR20230041978A (ko) | 포도에서 분리된 신규 u6 프로모터 및 이의 용도 | |
| JP6044030B2 (ja) | チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有するタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド | |
| Cao et al. | Cloning, characterization and expression analysis of HSP70 gene from sweet potato | |
| EP3405571A1 (en) | Mini-ill rnases, methods for changing specificity of rna sequence cleavage by mini-ill rnases, and uses thereof | |
| CN106995809A (zh) | 一种低温木聚糖酶Xyn27及其基因和应用 | |
| JP5935382B2 (ja) | ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼおよびその遺伝子 | |
| CN101921804A (zh) | 大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30 K的RNAi植物表达载体 | |
| KR102054390B1 (ko) | 북극 미세조류 유래 신규 얼음결정 생성억제 단백질 및 그 용도 | |
| CN101245345A (zh) | 山羊S6K1基因cDNA编码区核苷酸序列 |