PL222090B1 - Sposób wytwarzania podłoża z powłoką termoczułą, podłoże z powłoką termoczułą oraz jego zastosowanie - Google Patents
Sposób wytwarzania podłoża z powłoką termoczułą, podłoże z powłoką termoczułą oraz jego zastosowanieInfo
- Publication number
- PL222090B1 PL222090B1 PL396476A PL39647611A PL222090B1 PL 222090 B1 PL222090 B1 PL 222090B1 PL 396476 A PL396476 A PL 396476A PL 39647611 A PL39647611 A PL 39647611A PL 222090 B1 PL222090 B1 PL 222090B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- substrate
- polymer
- group
- substituted
- coating
- Prior art date
Links
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 109
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 title claims description 37
- 238000000576 coating method Methods 0.000 title claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- -1 2-substituted-2-oxazolines Chemical class 0.000 claims description 38
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 29
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 27
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 21
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 13
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000010538 cationic polymerization reaction Methods 0.000 claims description 8
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 claims description 8
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 8
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 claims description 5
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 5
- AOGYCOYQMAVAFD-UHFFFAOYSA-N chlorocarbonic acid Chemical class OC(Cl)=O AOGYCOYQMAVAFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 5
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 claims description 5
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 claims description 4
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003505 polymerization initiator Substances 0.000 claims description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 claims description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 3
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052787 antimony Inorganic materials 0.000 claims description 2
- WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N antimony atom Chemical compound [Sb] WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N boron trifluoride Chemical class FB(F)F WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000005489 p-toluenesulfonic acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000001301 oxygen Chemical group 0.000 claims 1
- 229910052717 sulfur Chemical group 0.000 claims 1
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 17
- 239000002585 base Substances 0.000 description 15
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 11
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 11
- NYEZZYQZRQDLEH-UHFFFAOYSA-N 2-ethyl-4,5-dihydro-1,3-oxazole Chemical compound CCC1=NCCO1 NYEZZYQZRQDLEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FVEZUCIZWRDMSJ-UHFFFAOYSA-N 2-propan-2-yl-4,5-dihydro-1,3-oxazole Chemical compound CC(C)C1=NCCO1 FVEZUCIZWRDMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 9
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 9
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 9
- OQWAVMKUNIQCFD-UHFFFAOYSA-N 2-nonyl-4,5-dihydro-1,3-oxazole Chemical group CCCCCCCCCC1=NCCO1 OQWAVMKUNIQCFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 6
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 4
- 229920003213 poly(N-isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 description 4
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 4
- WJKHJLXJJJATHN-UHFFFAOYSA-N triflic anhydride Chemical compound FC(F)(F)S(=O)(=O)OS(=O)(=O)C(F)(F)F WJKHJLXJJJATHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 3
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000252506 Characiformes Species 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000011557 critical solution Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 229920005553 polystyrene-acrylate Polymers 0.000 description 2
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- IMSODMZESSGVBE-UHFFFAOYSA-N 2-Oxazoline Chemical compound C1CN=CO1 IMSODMZESSGVBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYAYDWLKTPIEDC-UHFFFAOYSA-N 2-[2-hydroxyethyl(3-triethoxysilylpropyl)amino]ethanol Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN(CCO)CCO IYAYDWLKTPIEDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHWIEAWILPSRMU-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-3-pyrimidin-4-ylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)CC1=CC=NC=N1 JHWIEAWILPSRMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 6-(4-aminophenyl)sulfonylpyridin-3-amine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=N1 XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001082241 Lythrum hyssopifolia Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002808 Si–O–Si Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- XOCUXOWLYLLJLV-UHFFFAOYSA-N [O].[S] Chemical compound [O].[S] XOCUXOWLYLLJLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004703 alkoxides Chemical group 0.000 description 1
- 125000005370 alkoxysilyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005103 alkyl silyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000181 anti-adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- RMNJNEUWTBBZPT-UHFFFAOYSA-N methyl 4-nitrobenzenesulfonate Chemical compound COS(=O)(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 RMNJNEUWTBBZPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001977 poly(N,N-diethylacrylamides) Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920005597 polymer membrane Polymers 0.000 description 1
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000007944 thiolates Chemical class 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 1
- 244000000023 zoonotic pathogen Species 0.000 description 1
Landscapes
- Paints Or Removers (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania podłoża z powłoką termoczułą, podłoże z powłoką termoczułą oraz jego zastosowanie.
Rozwiązanie przeznaczone jest do stosowania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, biologii, biotechnologii, oraz w innych pokrewnych dziedzinach.
W medycynie w przypadkach leczenia chorych ciężko poparzonych, aby zapobiec powstaniu zakażenia rany, stosuje się wiele rozwiązań mających na celu zamianę rany oparzonej na chirurgiczną. Najlepszym rozwiązaniem jest wykonanie autoprzeszczepu skóry. Jednak nie zawsze ta metoda jest skuteczna, ze względu na niedostateczną ilość miejsc dawczych. Alternatywne stosowanie opatrunków biologicznych tj. alloprzeszczepów lub ksenoprzeszczepów skóry stanowi tymczasowe rozwiązanie gdyż po pewnym czasie są odrzucane one przez organizm pacjenta, ponadto istnieje dodatkowo możliwość przeniesienia patogenów zoonotycznych [Fishman J.A., Patience C. American Journal of Transplantation 2004, 4, 1383-1390; Onons D., Cooper D.K.C., Alexander T.J.L Xenotransplantation 2000, 7, 143-155; Klama-Baryła A., Kraut M., Łabuś W., Maj M., Kawecki M., Nowak M., Glik J., Cichowski A., Szydło A., Lesiak M., Anioł J., Sieroń A.L The Journal of Orthopaedics Trauma Surgery and Related Research 2011, 2(22), 77-86]. Możliwe jest również wykorzystanie substytutów skóry otrzymanych na drodze inżynierii tkankowej. Jako komponent skóry wykorzystywany jest kolagen, glikozoaminoglikan, kwas poliglikolowy czy hialuronowy lub biodegradowalne matryce [Han C., Zhang L., Sun J., Shi H., Zhou J., Gao C. Journal of Zhejiang University 2010, 11, 524-530; Klama-Baryła A., Glik J., Kawecki M., Nowak M., Sieroń A.L. The Journal of Orthopaedics Trauma Surgery and Related Research 2009, 1, 90-99]. Komponent taki tworzy matrycę, którą można pokryć fibroblastami lub keratynocytami uzyskanymi w hodowlach in vitro. Jednak stosowanie takich komponentów skóry jest dość drogie i mogą występować problemy procesu terapeutycznego. Ponadto otrzymanie odpowiedniej ilości hodowlanych keratynocytów jest czasochłonne i bardzo często powoduje ich obumieranie zmniejszając wydajność hodowli. Alternatywą powyżej opisanych metod jest hodowla własnych komórek skóry pacjenta, jakimi są keratynocyty i umieszczenie ich samodzielnie na przygotowanej ranie. Jednakże, ten sposób postępowania ma zasadnicze mankamenty [Klama-Baryła A., Kraut M., Łabuś W., Maj M., Kawecki M., Nowak M., Glik J., Cichowski A., Szydło A., Lesiak M., Anioł J., Sieroń A.L. The Journal of Orthopaedics Trauma Surgery and Related Research 2011,2(22), 77-86; Klama-Baryła A., Glik J., Kawecki M., Nowak M., Sieroń A.L. The Journal of Orthopaedics Trauma Surgery and Related Research 2009, 1, 90-99]. Pierwszy, jak opisano wcześniej dotyczy wolnej hodowli keratynocytów. Ponadto po namnożeniu komórek aby je oddzielić od podłoża stosuje się głównie metody enzymatyczne. Enzymy niszczą jednak wytworzoną przez komórki zewnątrzkomórkową macierz i ważne proteiny. Dezintegracji ulega także arkusz komórek (po oddzieleniu komórki nie są ze sobą połączone), a znaczna część komórek obumiera. Keratynocyty są wówczas nanoszone na ranę w postaci zawiesiny tworząc ogniska komórek. Precyzyjna kontrola rozmieszczenia komórek na ranie w celu jej całkowitego pokrycia nie jest więc możliwa.
Znane są również z literatury naukowej [Yamato M., Akiyama Y., Kobayashi J., Yang J., Kikuchi A., Okano T. Prag. Polym. Sci. 2007, 32, 1123; Yamato M., Utsami M., Kushida A., Konno Ch., Kikuchi A., Okano T. Tissue Eng. 2001, 7, 473; Kumar P.R.A., Sreenivasan K., Kumary T.V., J. Appl. Polym. Sci. 2007, 105, 2245; Nagase K., Kobayashi J., Okano T. J. R. Soc. Interface 2009, 6, 293] oraz literatury patentowej sposoby hodowli komórek na podłożach stałych do powierzchni których kowalencyjnie jest przyczepiony polimer o termoprzełączalnych właściwościach. Wykorzystywane w takich podłożach polimery i kopolimery wykazują w sposób odwracalny zmiany swoich właściwości na skutek zmian temperatury otoczenia, tzn. są rozpuszczalne tylko poniżej pewnej temperatury, a po jej przekroczeniu (tzw. punktu zmętnienia - TCP) przestają się rozpuszczać i wytrącają z roztworu. Hodowlę komórek na podłożu z powłoką z termoczułego polimeru lub kopolimeru, o zmiennym powinowactwie do wody (LCST) w zakresie 0-80°C, prowadzi się w temperaturze powyżej dolnej krytycznej temperatury rozpuszczania polimeru (LCST), w której powierzchnia jest hydrofobowa.
Po namnożeniu komórek temperaturę hodowli obniża się poniżej dolnej krytycznej temperatury rozpuszczania (LCST), aż powierzchnia podłoża stanie się hydrofitowa, a komórki oddzielają się od podłoża i mogą zostać usunięte w całości w postaci arkusza. Nie jest wymagane stosowanie metod enzymatycznych czy mechanicznych.
Etap hodowli komórek poprzedza przygotowanie powierzchni związanej z modyfikacją podłoża bazowego a następnie przyczepienie właściwej powłoki z termoczułego polimeru.
PL 222 090 B1
Powierzchnie materiałów stosowanych jako podłoża bazowe można modyfikować metodami chemicznymi i fizykochemicznymi mającymi na celu zmiany strukturalne powierzchni lub zmiany ich zwilżalności. Materiały takie służą następnie jako baza do związania z termoczułym polimerem. W tym celu wykorzystuje się głównie szczepienie radiacyjne czy fotoszczepienie prowadzące do powstania wiązań chemicznych pomiędzy podłożem bazowym a polimerem. Znane jest stosowanie silanowych związków sprzęgających do modyfikacji powierzchni szklanej w celu nadania jej odpowiednich cech użytkowych. Powłokę tworzy się za pomocą reakcji w roztworze grup hydroksylowych podłoża szklanego ze związkiem sililowym zawierającym obok grup alkiloksysililowej (Si-O-Alkil) także reaktywne grupy funkcyjne. Reakcję prowadzi się zwykle dwuetapowo, gdzie pierwszy etap polega na reakcji przyłączenia związku sililowego do powierzchni a w drugim, poprzez wygrzewanie w podwyższonej temperaturze utrwala się warstwę sililową z grupą funkcyjną przez zwiększenie ilości wiązań Si-O-Si między związkiem sililowym a powierzchnią szkła wykorzystując nieprzereagowane w pierwszym etapie grupy alkilosililowe. Tak przygotowane zmodyfikowane powierzchnie są szeroko wykorzystywane do przyczepienia do powierzchni szklanych lub krzemowych licznych związków z grupami zdolnymi do wytworzenia wiązań kowalencyjnych z reaktywnymi grupami funkcyjnymi wprowadzonymi wraz ze związkiem sililowym.
W odniesieniu do podstawowych podłoży bazowych stosowanych do hodowli komórkowych dokumenty patentowe np. JP 6104061 lub JP5192130 oraz inne, wskazują podłoża, które można wytwarzać z dowolnego rodzaju polimerów np. polietylenu, polipropylenu, poli(tereftalanu etylenu), poli(tetrafluoro etylenu), polistyrenu i polimetakrylanu metylu) lub ceramiki, metali obojętnych czy szkła. Kształt i rodzaj podłoża nie jest ograniczony ale zazwyczaj stosuje się płytki lub pojemniki do hodowli komórkowych.
W literaturze naukowej i patentowej opisano, że głównie jako podłoże bazowe stosuje się modyfikowany polistyren (TCPS - tissue culture polystyren). Zastosowania podłoży do hodowli komórek innych niż z polistyrenu, zostały dokonane tylko na zmodyfikowanej z użyciem środka sprzęgającego powierzchni szklanej lub powierzchni porowatej politereftalanu etylenu (PET), co opisano, m. innymi w publikacji patentowej JP 2006008975 (A), a szczepienie na podłożu polimerów zawierających np. poli(N-izopropyloakryloamid) prowadzono z udziałem inicjatora rodnikowego.
Podłoże do hodowli komórek, którego powierzchnia, pokryta polimerem lub kopolimerem termoczułym, odwracalnie zmienia właściwości od hydrofilowych do hydrofobowych wskutek zmiany temperatury, stanowi przedmiot opatentowanego wynalazku EP0382214(B1). W przykładach realizacji wynalazku otrzymano powłokę poli(N-izopropyloakryloamidu) lub poli(N,N-dietyloakrylamidu) na płytce Petriego z polistyrenu w wyniku szczepienia przez napromieniowanie wiązką elektronów. Na podłożu prowadzono hodowlę komórek śródbłonka w pożywce, w temperaturze 37°C i z 5% udziałem CO2, a po namnożeniu temperaturę hodowli obniżano w zakresie od 37°C do 4°C, i pozostawiano do oddzielenia komórek.
Sposób hodowli komórek skóry i przygotowania podłoża jest również przedmiotem japońskiego zgłoszenia patentowego JP5192138(A), gdzie na płytce Petriego szczepiono N-izopropyloakryloamid rozpuszczony w alkoholu izopropylowym przez napromieniowanie wiązką elektronów. Na płytce, poddanej sterylizacji tlenkiem etylenu, prowadzono hodowlę keratynocytów w sposób i w warunkach opisanych wyżej.
Zagadnienia dotyczące hodowli komórek, w tym wielu typów komórek w jednej warstwie oraz podłoży z co najmniej jednym termoczułym polimerem są przedmiotem zgłoszonych wynalazków np. WO2010010837(A1), gdzie dla hodowli komórkowej na podłożu wykorzystuje się dwa lub więcej polimery, zaszczepione na podłożu bazowym w różnych obszarach. Według EP1264877A1 hodowlę komórek prowadzi się na podłożu pokrytym powłoką z kombinacji polimerów o różnym powinowactwie do wody, a jako materiał podłoża można stosować nie tylko polistyren i polimetakrylanu metylu), ale także inne materiały, w tym na przykład ceramiczne oraz metale. Pokrewne zagadnienia są przedmiotem zgłoszeń wynalazków według WO2010044417(A1) (EP2348099(A1)).
Opis zgłoszeniowy EP0470681 (A1) przedstawia zagadnienie hodowli wielu gatunków komórek w klastrach o kontrolowanej wielkości, a zgłoszony wynalazek US20080009063A1 dotyczy wymiennego podłoża hodowli komórkowej, którego powierzchnia ukształtowana jest z licznych wgłębień tworzących różne wzory, pokrytych co najmniej jednym termoczułym polimerem. Komórki naskórka, według zgłoszonego wynalazku WO0210349(A1), mogą być również hodowane na powierzchni podłoża pokrytego termoczułym polimerem, w jednej lub wielu warstwach, odczepianie z takiego podłoża z zastosowaniem membrany polimerowej.
PL 222 090 B1
Warstwowa budowa podłoża do hodowli komórek, sposób jej przygotowania oraz hodowla komórek stanowi przedmiot zgłoszonego wynalazku WO2010047171 (A1). Na warstwy podłoża składa się warstwa materiału bazowego z polistyrenu, pokryta polimerem termoczułym (poli(N-izopropyloakryloamidem) szczepionym radiacyjnie). Tak utworzoną powierzchnię poddano sililowaniu pokrywając następnie na całej powierzchni lub na wydzielonych obszarach warstwą poli(glikolu etylenowego) o właściwościach antyadhezyjnych.
W przykładach opisanych w literaturze naukowej i patentowej oraz w przedstawionych powyżej przykładowych rozwiązaniach, powierzchnia polimerowa podłoży do hodowli komórek została wykonana z polimeru o termoczułych właściwościach - poli(N-izopropyloakryloamidu) PNIPAM [Yamato M., Utsami M., Kushida A., Konno Ch., Kikuchi A., Okano T. Tissue Eng. 2001, 7, 473; Kumar P.R.A., Sreenivasan K., Kumary T.V., J. Appl. Polym. Sci. 2007,105, 2245; Kikuchi A., Okano T. J. Control. Release 2005, 101, 69; Okano T., Yamada N., Okuhara M., Sakai H., Sakurai Y. Biomaterials 1995, 16, 297; Akiyama Y., Kikuchi A., Yamato M., Okano T. Langmuir 2004, 20, 5506], oraz jego pochodnych tj. kopolimerów: NIPAMu i n-butylometakrylanu [Tsuda Y., Kikuchi A., Yamato M., Nakao A., Sakurai Y., Umezu M., Okano T. Biomaterials, 2005, 26, 1885; Tsuda Y., Kikuchi A., Yamato M., Sakurai Y., Umezu M., Okano T. J. Biomed. Mater. Res. 2004, 69A, 70], NIPAMu i glikolu etylenowego [16-18], NIPAMu i 2-karboksyiso-propyloakrylamidu (CIPAM) [Schmaljohann D. e-Polymers 2005, 021, 1; Hatakeyama H., Kikuchi A., Yamato M., Okano T. Biomaterials 2005, 26, 5167; Hatakeyama H., Kikuchi A., Yamato M., Okano T, Biomaterials 2006, 27, 5069],
Polimery te szczepiono przede wszystkim na podłożach wykonanych z modyfikowanego polistyrenu (TCPS - tissue culture polystyren), w specjalistycznej aparaturze, wykorzystując technikę szczepienia radiacyjnego. W procesie tym kowalencyjne wiązanie polimeru (PNIPAM) z podłożem, następuje z jego jednoczesnym sieciowaniem tworząc na powierzchni warstwę hydrożelu, w której łańcuchy są połączone ze sobą węzłami sieci.
2
Gęstość polimerowej powłoki na powierzchni podłoża bazowego, wynosi od 5 do 80 gg/cm , przy czym gdy powłoka jest mniejsza niż 5 gg/cm2 komórki są hodowane w warunkach pojedynczej warstwy, co może powodować trudności z oderwaniem hodowanego arkusza komórek od podłoża, 2 natomiast powłoka powyżej 80 gg/cm2 jest niestabilna i może utrudniać adhezję komórek.
Stosowany w opisie termin oznacza:
- LCST - (lower critical solution temperature), najniższą krytyczną temperaturę rozpuszczania
- grupa terminująca - grupę funkcyjną, nukleofilową, zdolną do reakcji z kationowym centrum wzrostu w procesie polimeryzacji kationowej
- wiązanie kowalencyjne - wiązanie chemiczne pomiędzy atomami o różnicy elektroujemności nie większej niż 1,7 w skali Paulinga, np. wiązanie C-C, C-O, C-N, itp.
- szczotka polimerowa - powierzchnię zaszczepioną łańcuchami polimerowymi przyczepionymi do powierzchni jednym końcem
- TCPS - (tissue culture polystyrene) - polistyren modyfikowany do hodowli komórek lub tkanek
- „szczepienie od” - rodzaj immobilizacji polimeru polegający na inicjowaniu polimeryzacji inicjatorem zaczepionym na powierzchni w rezultacie czego kolejne cząsteczki monomeru są przyłączane do przyczepionego do powierzchni rosnącego łańcucha polimerowego
- „szczepienie do” - rodzaj immobilizacji polimeru polegający na przyczepieniu końca łańcucha już wcześniej uformowanego na etapie polimeryzacji inicjowanej przez inicjator w roztworze
- konfluencja - miarę ilości komórek na powierzchni, określającą procent powierzchni zajętej przez rosnące komórki
- mieszanina chromowa - roztwór dwuchromianu sodu w stężonym kwasie siarkowym używany do mycia i odtłuszczania szkła
- roztwór pirahna - roztwór stężonego kwasu siarkowego z 30% nadtlenkiem wodoru używany do usuwania zanieczyszczeń powierzchni
- immobilizacja polimeru - przyczepienie łańcuchów polimeru do powierzchni bez utraty mobilności łańcucha
- kationowa grupa inicjująca - grupa o ładunku dodatnim będąca częścią inicjatora, inicjująca wzrost łańcucha polimerowego
- łącznik sililowy - połączenie pomiędzy polimerem a podłożem powstałe w wyniku reakcji końca łańcucha polimerowego a wcześniej przyczepionym do podłoża związkiem z atomem krzemu i grupą funkcyjną
PL 222 090 B1
- kationowe centrum wzrostu - końcowa reaktywna grupa o ładunku dodatnim zdolna do przyłączenia cząsteczki monomeru i odtworzenia takiego samego centrum, a tym samym wzrostu długości łańcucha w reakcji polimeryzacji kationowej
W sposobie wytwarzania podłoża z powłoką z termoczułego polimeru o zmiennym powinowactwie do wody (LCST) w zakresie 0-80°C, według wynalazku, w którym warstwę bazową nieorganiczną, korzystnie szklaną lub krzemową, oczyszcza się i modyfikuje przez wprowadzenie łącznika sililowego z reaktywnymi grupami funkcyjnymi a następnie, w atmosferze ochronnej argonu, w roztworze prowadzi immobilizację polimeru termoczułego przez szczepienie łańcuchów z wytworzeniem wiązań kowalencyjnych, istotą jest to, że prowadzi się immobilizację polimeru termoczułego z roztworu żyjącego homo i (ko)polimerów 2-podstawionych-2-oksazolin, o podstawniku alifatycznym C2-C9, korzystnie w acetonitrylu, w której wiązania kowalencyjne tworzy się przez, stanowiące wynik reakcji modyfikacji podłoża, grupy terminujące nukleofilowe w reakcji z kationowym centrum wzrostu na końcu łańcuchów polimeru z grupy 2-podstawionych-2-oksazolin.
Korzystnie immobilizację prowadzi się do wytworzenia na podłożu bazowym powłoki o konfor2 macji szczotki polimerowej i gęstości łańcuchów 0,1-1,8 łańcucha/nm .
Korzystnie grupę terminującą nukleofilową, wybiera się z grupy obejmującej grupy aminowe, hydroksylowe i tiolowe.
Korzystnie również grupę inicjującą kationową wybiera się z grupy obejmującej kwas p-toluenosulfonowy i jego estry, kwas trifluorometanosulfonowy i jego estry, halogenki alkilowe, halogenki benzylowe, fluorki antymonu i boru, kwas siarkowy i jego estry, kwas solny, kwas nadjodowy i nadchlorowy i ich sole, chloromrówczany, kwas trójchlorooctowy.
W sposobie wytwarzania podłoża z powłoką z termoczułego polimeru o zmiennym powinowactwie do wody (LCST) w zakresie 0-80°C, według innej odmiany wynalazku, w której warstwę bazową nieorganiczną, korzystnie szklaną lub krzemową, oczyszcza się i modyfikuje przez wprowadzenie łącznika sililowego z reaktywnymi grupami funkcyjnymi a następnie, w atmosferze ochronnej argonu, w roztworze prowadzi immobilizację polimeru termoczułego przez szczepienie łańcuchów z wytworzeniem wiązań kowalencyjnych, istotą jest to, że prowadzi się immobilizację polimeru termoczułego z grupy homo i (ko)polimerów 2-podstawionych-2-oksazolin o podstawniku alifatycznym C2-C9 z roztworu, korzystnie acetonitrylu, w której wiązania kowalencyjne tworzy się przez inicjowanie polimeryzacji monomeru z grupy 2-podstawionych-2-oksazolin o wzorze (1) inicjatorem polimeryzacji kationowej, stanowiącym wynik reakcji modyfikacji podłoża.
Korzystnie immobilizację prowadzi się do wytworzenia na podłożu bazowym powłoki o konfor2 macji szczotki polimerowej i gęstości łańcuchów 0,1-1,8 łańcucha/nm2.
Korzystnie inicjator polimeryzacji kationowej wybiera się z grupy obejmującej kwas p-toluenosulfonowy i jego estry, kwas trifluoro-metanosulfonowy i jego estry, halogenki alkilowe, halogenki benzylowe, chloromrówczany i kwas trójchlorooctowy.
Korzystnie również zawartość grup inicjujących w stosunku do co najmniej jednego monomeru z grupy 2-podstawionych-2-oksazolin, wynosi od 10,0% molowych do 0,08% molowych.
Podłoże z powłoką z termoczułego polimeru o zmiennym powinowactwie do wody z zakresie 0-80°C, którego podłoże bazowe nieorganiczne, szklane lub krzemowe, zawiera po modyfikacji łącznik sililowy kowalencyjnie związany funkcyjną grupą ze środkiem powłokowym, immobilizowanym na podłożu przez szczepienie łańcuchów termoczułego polimeru lub kopolimeru, charakteryzuje się tym, że środek powłokowy stanowi polimer lub kopolimer z grupy 2-podstawionych-2-oksazolin o podstawniku alifatycznym C2-C9, a gęstość łańcuchów związanych z funkcyjną grupą łącznika sililowego wy2 nosi 0,1-1,8 łańcucha/nm i ma konformację szczotki polimerowej.
Korzystnie środek powłokowy jest związany kowalencyjnie z funkcyjną grupą sililową łącznika elementem o wzorze (2).
Korzystnie również środek powłokowy jest związany kowalencyjne z funkcyjną grupą sililową łącznika elementem o wzorze (3).
Zastosowanie podłoża z powłoką termoczułą, utworzoną z polimerów z grupy homo i (ko)polimerów 2-podstawionych-2-oksazolin o podstawniku alifatycznym C2-C9, do hodowli komórkowych, zwłaszcza komórek skóry.
W badaniach dotyczących zagadnień związanych z termoczułymi podłożami, zarówno w zakresie stosowanych materiałów, które nie zostały w pełni rozpoznane, jak i samych procesów, konieczność stosowania wysoce specjalistycznej i kosztownej aparatury jest niejednokrotnie poważnym ograniczeniem możliwości osiągania pozytywnych wyników.
PL 222 090 B1
Rozwiązanie według wynalazku, zarówno w zakresie sposobu wytwarzania termoczułego podłoża, jak i zastosowanych nowych materiałów polimerowych z grupy homo i (ko)polimerów 2-podstawionych-2-oksazolin o podstawniku alifatycznym C2-C9, umożliwia uzyskanie podłoża, bez konieczności stosowania wysoce specjalistycznej aparatury na poszczególnych etapach procesu, o parametrach pozwalających na hodowlę komórek, zwłaszcza skóry, z możliwością oddzielenia arkusza tych komórek tylko po obniżeniu temperatury poniżej LCST. Wytworzona powierzchnia i jej struktura, posiadająca strukturę szczotki polimerowej, różni się od opisanej w literaturze naukowej i patentowej struktury termoczułych powierzchni opartych na PNIPAMie, gdzie łańcuchy nie są izolowane lecz połączone ze sobą węzłami sieci a na powierzchni tworzy się warstwa hydrożelu. Uzyskana metodą według wynalazku struktura charakteryzuje się szybką i mocną odpowiedzią na bodziec temperaturowy.
Na rysunku wzór 1 przedstawia wzór strukturalny monomeru z grupy 2-podstawionych-2-oksazolin, wzory 2 i 3 przedstawiają wzór strukturalny wiązania środka powłokowego z funkcyjną grupą sililową łącznika, natomiast na zdjęciach nr 1 do 12 przedstawiono wynik hodowli komórek na podłożach uzyskanych sposobem według wynalazku oraz na podłożach kontrolnych.
Wynalazek dotyczy podłoża z powłoką termoczułego polimeru o zmiennym powinowactwie do wody (LCST) w zakresie 0-80°C oraz sposobu jego wytwarzania. Wytwarzanie podłoża jest prowadzone wieloetapowo, zarówno na etapie przygotowania podłoża bazowego, jak i dalszych etapów procesu, w którym prowadzi się wariantową immobilizację polimeru termoczułego na powierzchni podłoża metodą szczepienia od i do podłoża w celu wytworzenia środka powłokowego.
Podłoże wytwarza się na podłożu bazowym nieorganicznym, szklanym, krzemowym, metalowym np, z tytanu, zawierającym funkcyjne grupy hydroksylowe, które można poddać dalszej modyfikacji dla umożliwienia trwałego, kowalencyjnego związania podłoża z termoczułym polimerem. Na potrzeby immobilizacji polimeru metodą szczepienia do podłoża, funkcjonalizację przeprowadza się wprowadzając na podłoże bazowe grupy terminujące nukleofilowe, obejmujące grupy aminowe i ich sole jako pochodne, hydroksylowe i alkoholanowe jako ich pochodne, tiolowe i tiolanowe jako jej pochodne, a w przykładowym wykonaniu zastosowano 3-aminopropylotrietoksy-silan (APTES) do wprowadzenia na jego powierzchnię grupy aminowej.
Z kolei przy metodzie szczepienia od podłoża, na podłoże bazowe wprowadza się grupy obejmujące kwas p-toluenosulfonowy i halogenki kwasowe oraz estry jako jego pochodne, kwas trifluofometanosulfonowy i halogenki kwasowe oraz estry jako jego pochodne, halogenki alkilowe, halogenki benzylowe, chloromrówczany, kwas trójchlorooctowy i halogenki kwasowe oraz estry jako jego pochodne, które w procesie immobilizacji są inicjatorem polimeryzacji kationowej.
W przykładowym wykonaniu wynalazku do wprowadzenia na powierzchnię grupy trifluorometanosulfonowej stosowano 3-[bis(2-hydroksyetyloamino)]propylotrietoksysilan estryfikowany bezwodnikiem trifluorometanosulfonowym, przy czym istotnym jest, aby zawartość grup inicjujących w stosunku do co najmniej jednego monomeru z grupy 2-podstawionych-2-oksazolin, wynosiła od 10,0% molowych do 0,08% molowych.
Wszystkie czynności związane z przygotowaniem podłoży, w celu zminimalizowania możliwości wprowadzenia zanieczyszczeń, zostały wykonane w komorze laminarnej z zastosowaniem filtrowanych rozpuszczalników i roztworów.
Podłoża bazowe ze zmodyfikowaną powierzchnią, zawierające łącznik sililowy z wyżej wymienionymi grupami funkcyjnymi, wykorzystano do trwałego, kowalencyjnego związania z polimerem lub kopolimerem z grupy homo i (ko)polimerów 2-podstawionych-2-oksazolin o podstawniku alifatycznym C2-C9, prowadząc kontrolowaną immobilizację polimeru na powierzchni.
W rozwiązaniu według jednego wariantu wynalazku kowalencyjne wiązania z podłożem powstają w wyniku inicjowania kationowej polimeryzacji monomerów przez inicjator znajdujący się na powierzchni substratu, a w wyniku reakcji powstaje wiązanie między atomem azotu monomeru 2-podstawionej-2-oksazoliny i grupą alkilową łącznika sililowego. W innym wariancie wynalazku wiązanie tworzy się przez terminację rosnących łańcuchów polimerowych w reakcji z grupami funkcyjnymi łącznika sililowego podłoża, gdzie mogą powstać wiązania między atomem azotu z grupy aminowej lub atomem tlenu z grupy hydroksylowej lub siarki z grupy tiolowej z atomem węgla końcowego monomeru poli(2-podstawionej-2-oksazoliny).
W przykładowych rozwiązaniach zastosowano poli(2-izopropylo-2-oksazolinę) i kopolimer 2-etylo-2-oksazoliny i 2-nonyIo-2-oksazoliny dla ilustracji metody szczepienie do podłoża, co przedstawia Schemat 1 oraz poli(2-izopropylo-2-oksazolinę) dla ilustracji metody szczepienie od podłoża, co przedstawia Schemat 2.
PL 222 090 B1
Powyżej wymienione polimery i kopolimery są polimerami biozgodnymi względem komórek skóry, i nie wykazują wobec nich działania toksycznego, nawet w wysokich stężeniach w medium hodowlanym. Polimery te zawierają w łańcuchu ugrupowanie amidowe, przypominają więc swoją strukturą peptydy, co może mieć wpływ na ich oddziaływanie z komórkami skóry. Ponadto na podstawie przeprowadzonych badań ustalono, że przez zmianę składu kopolimeru, tj. udziału merów 2-etylo-2-oksazoliny i 2-nonylo-2-oksazoliny, można swobodnie sterować temperaturą przejścia fazowego (LCST) od 10°C do 80°C, przy czym ze względu na uwarunkowania wynikające z temperatury właściwej
PL 222 090 B1 dla hodowli komórek, zakres ten może wynosić od 20°C do 37°C. Dotychczas najczęściej stosowanym polimerem termoczułym na podłożu do hodowli komórek jest PNIPAM a jego szczepienie na podłożu prowadzi do warstwy wykazującej zmiany właściwości (LCST) w jednej, określonej temperaturze. Także stosowane dotychczas kopolimery NIPAMu na powierzchni nie pozwalają na zmianę temperatury przejścia fazowego (LCST) w interesującym dla hodowli komórek zakresie.
Na podstawie analiz przeprowadzonych prób, w wyniku zastosowanych metod immobilizacji polimerów i kopolimerów 2-podstawionych-2-oksazolin otrzymano termoczułe powierzchnie o dużej gę2 stości łańcuchów, wynoszącej 0,1-1,8 łańcucha/nm , przy czym polimer związany jest kowalencyjnie z podłożem jednym końcem łańcucha tworząc na powierzchni tzw. szczotkę polimerową.
Wytworzony, w przykładach wykonania, metodami „szczepienia do podłoża i od” podłoża środek powłokowy, stanowi warstwa poli(2-izopropylo-2-oksazoliny) lub kopolimeru 2-etylo-2-oksazoliny i 2-nonylo-2-oksazoliny na podłożu szklanym, wykazująca zmiany właściwości z hydrofilowych na hydrofobowe i odwrotnie w zależności od zmian temperatury otoczenia w zakresie temperatur od 20°C do 37°C.
Podłoża z termoczułą powłoką wykorzystano do oceny zdolności komórek skóry (fibroblastów) do jego porastania oraz tworzenia jednolitej warstwy komórek a następnie oddzielenia od niego komórek w postaci arkusza bez stosowania enzymatycznych lub mechanicznych metod oddzielenia. Czas odklejania arkusza komórek w zależności od polimeru oraz warunków odklejania wynosił od kilku minut do kilku godzin, co opisano w przykładach.
P r z y k ł a d 1
1.1. Modyfikacja podłoża szklanego
Podłoże szklane, gdzie stosowano płytki ze szkła boro-krzemianowego o różnej powierzchni (φ = 13 mm oraz 24x40 mm), odtłuszczono i płukano trzykrotnie w wodzie, po czym pozostawiono na 1 godzinę w mieszaninie chromowej (5 g dwuchromianu sodu, 5 ml wody i 90 ml stężonego kwasu siarkowego) po czym płukano 5 razy wodą. Następnie płytki pozostawiono w 1 M roztworze NaOH przez 1 h i płukano 5 razy w wodzie. Mokre płytki umieszczono w kąpieli 0,1M HCI na 1 godzinę a następnie przemywano wodą i moczono w kąpieli 1% kwasu octowego przez 1 h. Po 5 krotnym przemyciu wodą płytki umieszczono w 1% roztworze 3-aminopropylotrietoksysilanu w 3 mM roztworze kwasu octowego w wodzie. Po 24 h płytki przemywano mieszaniną woda/acetonitryl 1:1 (v:v) i umieszczono w kąpieli wodnej w łaźni ultradźwiękowej na 20 sekund po czym przemywano pięciokrotnie wodą i suszono pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej. Tak otrzymane podłoża szklane w następnym etapie poddawano szczepieniu w roztworze poli(2-izopropylo-2-oksazoliny).
1.2. Przygotowanie roztworu żyjącego polimeru 2-izopropylo-2-oksazoliny
Do szczelnego reaktora szklanego wyposażonego w mieszadło magnetyczne wprowadzono 45 mL suchego acetonitrylu, 7,6 g 2-izopropylo-2-oksazoliny oraz 0,12 g inicjatora w postaci estru metylowego kwasu paranitrobenzenosulfonowego. Po wymieszaniu reagentów roztwór ogrzewano do temperatury 80°C przez 120 h. Po ochłodzeniu roztwór przeniesiono w atmosferze argonu do reaktora.
1.3. Immobilizacja
W reaktorze podłoża szklane, po reakcji z 3-aminopropylotrietoksysilanem, pozostawiono w kontakcie z roztworem żyjącego polimeru 2-izopropylo-2-oksazoliny, mieszając zawartość przez 48 h, po czym płytki wyjęto i płukano 3 razy w mieszaninie woda/acetonitryl 1:1 a następnie 3 razy w wodzie i umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na około 20 sekund. Po dodatkowym płukaniu wodą płytki suszono pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej.
1.4. Hodowla komórek
Komórki skóry - fibroblasty otrzymano w wyniku izolacji z fragmentu skóry pobranej od pacjenta Centrum Leczenie Oparzeń i hodowli pierwotnej a następnie zabankowano.
1.4.1. Przygotowanie podłoża do wysiewu komórek
Podłoża szklane o różnej powierzchni płytek (φ = 13 mm oraz 24x40 mm), pokryte warstwą poli(2-izopropylo-2-oksazoliny) zostały poddane sterylizacji tlenkiem etylenu. Następnie podłoża umieszczono na płytkach Petriego i poddano inkubacji w pożywce hodowlanej DMEM-ATMP w temperaturze około 20°C przez 2 h, a następnie w inkubatorze w temperaturze 37°C, o 95% wilgotności i z dostępem 5% CO2 przez kolejne 3 h.
Podłoża kontrolne z TCPS zostały w ten sam sposób przygotowane do wysiewu komórek fibroblastów.
PL 222 090 B1
1.4.2. Hodowla i odczepianie komórek
Na tak przygotowane podłoża wysiano komórki skóry pobrane z banku tkanek po 100 tysięcy komórek na podłoża o średnicy 13 mm oraz dołek kontrolny z TOPS oraz po 250 tysięcy komórek na podłoże o rozmiarach 24x40 mm oraz płytkę kontrolną z TCPS. Następnie co 48 h od rozpoczęcia hodowli zmieniano pożywkę na świeżą.
Hodowlę prowadzono do uzyskania konfluencji około 60-70% po czym przeprowadzono procedurę odklejenia komórek w postaci arkusza.
W celu oddzielenia komórek, podłoże z komórkami umieszczono w inkubatorze w środowisku zapewniającym temperaturę 20°C. Aby przyspieszyć proces odklejania się komórek, medium hodowlane wymieniono na pożywkę o temperaturze 20-25°C.
Wnioski
Podłoża szklane zawierające kowalencyjnie związaną metodą „szczepienia do” podłoża warstwę termowrażliwego polimeru - poli(2-izopropylo-2-oksazolinę) zapewniają skuteczne podłoże do hodowli komórek skóry (zdjęcie 1 i 2).
Komórki skóry ulegają oddzieleniu od tego podłoża w postaci arkusza jedynie pod wpływem obniżenia temperatury. Nie jest wymagane stosowanie enzymatycznych metod oddzielenia komórek od podłoża. Fibroblasty samoistnie oddzielają się od powierzchni polimerowej o średnicy 13 mm po 2 min inkubacji w obniżonej temperaturze, a po 15 min do kilku godzin otrzymano oddzielony od podłoża, jednolity arkusz komórek (zdjęcie 3). Na podłożu kontrolnym - TCPS nie zaobserwowano oddzielenia komórek po obniżeniu temperatury (zdjęcie 4). Fibroblasty wyhodowane na powierzchni polimerowej o rozmiarach 24x40 mm oddzielają się od tego podłoża po kilku godzinach inkubacji w obniżonej temperaturze. Na podłożu kontrolnym - TCPS nie zaobserwowano oddzielenia komórek po obniżeniu temperatury.
P r z y k ł a d 2
2.1. Modyfikacja podłoża szklanego
Podłoża o różnej powierzchni płytek (φ = 13 mm oraz 24x40 mm), ze szkła boro-krzemianowego odtłuszczono i płukano w wodzie. Płytki pozostawiono na 1 h w mieszaninie chromowej po czym płukano wodą. Następnie płytki pozostawiono w 1 M roztworze NaOH przez 1 h i ponownie płukano. Mokre płytki umieszczono w kąpieli 0,1 M HCI przez 1 godzinę a następnie przemywano wodą i moczono w kąpieli 1% kwasu octowego przez 1 godzinę. Po przemyciu wodą płytki umieszczono w 1% roztworze 3-[bis(2-hydroksyetylo)amino]propylotrietoksysilanu w 3 mM roztworze kwasu octowego w wodzie. Po 24 godzinach płytki przemywano mieszaniną wody i acetonitrylu a następnie umieszczono w kąpieli wodnej w łaźni ultradźwiękowej na 20 sekund, po czym przemywano wodą i suszono. Następnie płytki umieszczono w szczelnym reaktorze przepłukanym argonem z roztworem 0,5 g bezwodnika trifluorometanosulfonowego z dodatkiem 0,4 g pirydyny w chlorku metylenu w temperaturze około 0°C. Reakcję prowadzono w tej temperaturze przez 6 h a następnie temperaturę podwyższono do 10°C i mieszano jeszcze przez 12 h. Po usunięciu roztworu płytki w atmosferze suchego argonu płukano trzykrotnie suchym chlorkiem metylenu, a następnie dwukrotnie suchym acetonitrylem i suszono w temperaturze pokojowej pod obniżonym ciśnieniem.
2.2. Immobilizacja polimeru
Suche płytki umieszczono w atmosferze argonu w reaktorze, do którego wprowadzono roztwór 2-izopropylo-2-oksazoliny (8,9 g) w suchym acetonitrylu (450 ml). Polimeryzację prowadzono przez 220 godzin w temperaturze 75°C. Po zakończeniu polimeryzacji płytki umieszczono w roztworze 2,7 g KOH w 450 mL metanolu w temperaturze pokojowej na 24 h. Następnie płytki płukano wodą i suszono pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej.
2.3. Hodowla komórek
Komórki skóry - fibroblasty otrzymano w wyniku izolacji z fragmentu skóry pobranej od pacjenta Centrum Leczenie Oparzeń i hodowli pierwotnej a następnie zabankowano.
2.3.1. Przygotowanie podłoża do wysiewu komórek
Przygotowania podłoży prowadzono jak w przykładzie 1.
2.3.2. Wysiew komórek na podłoża
Wysiew komórek oraz ich hodowlę prowadzono jak w przykładzie 1
Wnioski
Podłoża szklane zawierające kowalencyjnie związaną metodą „szczepienia od” podłoża warstwę termowrażliwego polimeru - poli(2-izopropylo-2-oksazolinę) zapewniają skuteczne podłoże do hodowli komórek skóry (zdjęcie 5 i 6).
PL 222 090 B1
Komórki skóry ulegają oddzieleniu od tego podłoża w postaci arkusza jedynie pod wpływem obniżenia temperatury. Nie jest wymagane stosowanie enzymatycznych metod oddzielenia komórek od podłoża. Fibroblasty samoistnie oddzielają się od powierzchni polimerowej o średnicy 13 mm po 5 min inkubacji w obniżonej temperaturze, a do kilku godzin otrzymano oddzielony od podłoża, jednolity arkusz komórek (zdjęcie 7). Na podłożu kontrolnym - TCPS nie zaobserwowano oddzielenia komórek po obniżeniu temperatury (zdjęcie 8). Fibroblasty wyhodowane na powierzchni polimerowej o rozmiarach 24x40 mm oddzielają się od tego podłoża po kilku godzinach inkubacji w obniżonej temperaturze.
Na podłożu kontrolnym - TCPS nie zaobserwowano oddzielenia komórek po obniżeniu temperatury.
P r z y k ł a d 3
3.1. Modyfikacja podłoży szklanych
Podłoża szklane o różnej powierzchni płytek (φ = 13 mm oraz 24x40 mm) zanurzono w roztworze piranha na 2 h, po czym trzykrotnie przemywano w wodzie oraz suszono w temperaturze 120°C przez 24 h. Wstępnie oczyszczone podłoża poddano aminosililowaniu za pomocą 3-(aminopropylo)trietoksysilanu (APTES). Płytki zanurzono w 1% (v/v) roztworze APTES w etanolu. Reakcję prowadzono pod stałym przepływem argonu przez 2 godziny. Następnie podłoża trzykrotnie przemywano w etanolu oraz suszono w temperaturze 120°C przez 24 h. Tak otrzymane płytki umieszczono w reaktorze i w następnym etapie poddawano szczepieniu w roztworze żyjących łańcuchów kopolimeru 2-etylo-2-oksazoliny oraz 2-nonylo-2-oksazoliny.
3.2. Przygotowanie roztworu „żyjącego” kopolimeru 2-etylo-2-oksazoliny i 2-nonylo-2-oksazoliny
W osobnym reaktorze zaopatrzonym w kran szklano-teflonowy pod stałym przepływem argonu umieszczono 2-etylo-2-oksazolinę (14,7 g), 2-nonylo-2-oksazolinę (3,3 g), 4-nitrobenzenosulfonian metylu (0,36 g), acetonitryl (36 mL). Zawartość reaktora trzykrotnie zamrażano i odgazowano. Po rozmrożeniu reaktor umieszczono w łaźni olejowej i reakcję prowadzono w temperaturze 80°C mieszając przez 48 godzin. Po ochłodzeniu roztwór przeniesiono w atmosferze argonu do reaktora.
3.3. Immobilizacja polimeru
Do reaktora, gdzie znajdowały się podłoża szklane po reakcji z 3-aminopropylotrietoksysilanem, przeniesiono roztwór „żyjącego” kopolimeru 2-etylo-2-oksazoliny i 2-nonylo-2-oksazoliny i dodano około 300 mL suchego acetonitrylu. Płytki pozostawiono w kontakcie z roztworem mieszając zawartość reaktora przez 72 godziny. Po tym czasie płytki wyjęto z reaktora, trzykrotnie przemywano acetonitrylem oraz suszono w temperaturze 120°C.
3.4. Hodowla komórek
Komórki skóry - fibroblasty otrzymano w wyniku izolacji z fragmentu skóry pobranej od pacjenta Centrum Leczenie Oparzeń i hodowli pierwotnej a następnie zabankowano.
3.4.1. Przygotowanie podłoża do hodowli komórek
Podłoża szklane o różnej powierzchni (φ = 13 mm oraz 24x40 mm), pokryte warstwą kopolimeru 2-etylo-2-oksazoliny i 2-nonylo-2-oksazoliny otrzymane według metody „szczepienia do” podłoża zostały poddane sterylizacji tlenkiem etylenu. Następnie podłoża te zostały przeniesione na płytki Petriego.
Dalsze przygotowania podłoży prowadzono jak w przykładzie 1
3.4.2. Wysiew komórek na podłoża
Wysiew komórek oraz ich hodowlę prowadzono jak w przykładzie 1
Wnioski
Podłoża szklane zawierające kowalencyjnie związaną warstwę termowrażliwego polimeru - kopolimeru 2-etylo-2-oksazoliny i 2-nonylo-2-oksazoliny zapewniają skuteczne podłoże do hodowli komórek skóry (zdjęcie 9 i 10).
Komórki skóry ulegają oddzieleniu od tego podłoża w postaci arkusza jedynie pod wpływem obniżenia temperatury. Nie jest wymagane stosowanie enzymatycznych metod oddzielenia komórek od podłoża. Fibroblasty samoistnie oddzielają się od powierzchni polimerowej o średnicy 13 mm i od powierzchni polimerowej o rozmiarach 24x40 mm po kilku godzinach inkubacji w obniżonej temperaturze (zdjęcie 11). W wypadku podłoży o większych powierzchniach dodatkowe wytrząsanie płytki oraz ostrożne przepłukanie pożywką było konieczne w celu oddzielania arkusza komórek.
Na podłoża kontrolnym - TCPS nie zaobserwowano oddzielenia komórek po obniżeniu temperatury (zdjęcie 12).
Claims (12)
1. Sposób wytwarzania podłoża z powłoką z termoczułego polimeru o zmiennym powinowactwie do wody (LCST) w zakresie 0-80°C, w którym podłoże bazowe nieorganiczne, korzystnie szklane lub krzemowe, oczyszcza się i modyfikuje przez wprowadzenie łącznika sililowego z reaktywnymi grupami funkcyjnymi a następnie, w atmosferze ochronnej argonu, w roztworze prowadzi immobilizację na jego powierzchni polimeru termoczułego przez szczepienie łańcuchów z wytworzeniem wiązań kowalencyjnych, znamienny tym, że prowadzi się immobilizację polimeru termoczułego z roztworu żyjącego homo i (ko)polimerów 2-podstawionych-2-oksazolin o podstawniku alifatycznym C2-C9, korzystnie w acetonitrylu, w której wiązania kowalencyjne tworzy się przez, stanowiące wynik reakcji modyfikacji podłoża, grupy terminujące nukleofilowe w reakcji z kationowym centrum wzrostu na końcu łańcuchów polimeru z grupy 2-podstawionych-2-oksazolin.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że immobilizację prowadzi się do wytworzenia na podłożu bazowym powłoki o konformacji szczotki polimerowej i gęstości łańcuchów 0,1-1,8 łańcu2 cha/nm2.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że grupę terminującą nukleofilową, wybiera się z grupy obejmującej grupy aminowe, hydroksylowe i tiolowe,
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że grupę inicjującą kationową wybiera się z grupy obejmującej kwas p-toluenosulfonowy oraz jego estry, kwas trifluofometanosulfonowy oraz jego estry, halogenki alkilowe, halogenki benzylowe, fluorki antymonu i boru, kwas siarkowy i jego estry, kwas solny, kwas nadjodowy i nadchlorowy i ich sole, chloromrówczany, kwas trójchlorooctowy.
5. Sposób wytwarzania podłoża z powłoką z termoczułego polimeru o zmiennym powinowactwie do wody (LCST) w zakresie 0-80°C, w którym warstwę bazową nieorganiczną, korzystnie szklaną lub krzemową, oczyszcza się i modyfikuje przez wprowadzenie łącznika sililowego z reaktywnymi grupami funkcyjnymi a następnie, w atmosferze ochronnej argonu, w roztworze prowadzi immobilizację polimeru termoczułego przez szczepienie łańcuchów z wytworzeniem wiązań kowalencyjnych, znamienny tym, że prowadzi się immobilizację polimeru termoczułego z grupy homo i (ko)polimerów 2-podstawionych-2-oksazolin o podstawniku alifatycznym C2-C9, z roztworu, korzystnie acetonitrylu, w której wiązania kowalencyjne tworzy się przez inicjowanie polimeryzacji monomeru z grupy 2-podstawionych-2-oksazolin o wzorze (1) inicjatorem polimeryzacji kationowej, stanowiącym wynik reakcji modyfikacji podłoża.
i
R gdzie R oznacza grupę alkilową C2-C9.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że immobilizację prowadzi się do wytworzenia na podłożu bazowym powłoki o konformacji szczotki polimerowej i gęstości łańcuchów 0,1-1,8 łańcu2 cha/nm2.
7. Sposób według zastrz. 5 albo 8, znamienny tym, że inicjator polimeryzacji kationowej wybiera się z grupy obejmującej kwas p-toluenosulfonowy oraz jego estry, kwas trifluorometanosulfonowy oraz jego estry, halogenki alkilowe, halogenki benzylowe, chloromrówczany i kwas trójchlorooctowy.
8. Sposób, według zastrz. 5 do 7, znamienny tym, że zawartość grup inicjujących w stosunku do co najmniej jednego monomeru z grupy 2-podstawionych-2-oksazolin, wynosi od 10,0% molowych do 0,08% molowych.
9. Podłoże z powłoką z termoczułego polimeru o zmiennym powinowactwie do wody w zakresie 0-80°C, którego podłoże bazowe nieorganiczne, szklane lub krzemowe, zawiera po modyfikacji łącznik sililowy kowalencyjnie związany funkcyjną grupą ze środkiem powłokowym, immobilizowanym na podłożu przez szczepienie łańcuchów termoczułego polimeru lub kopolimeru, znamienne tym, że środek powłokowy stanowi polimer lub kopolimer z grupy 2-podstawionych-2-oksazolin o podstawniku alifatycznym C2-C9, a gęstość łańcuchów związanych z funkcyjną grupą łącznika sililowego wynosi 2
0,1-1,8 łańcucha/nm i ma konformację szczotki polimerowej.
PL 222 090 B1
10. Podłoże według zastrz. 9, znamienne tym, że środek powłokowy jest związany kowalencyjnie z funkcyjną grupą sililową łącznika elementem o wzorze (2) —X-CH2CH2-H~ i <2) θο ' 'Έ gdzie X oznacza atom azotu, atom tlenu lub siarki łącznika sililowego, natomiast R oznacza grupę alkilową C2-C9 monomeru 2-podstawionej-2-oksazoliny.
11. Podłoże według zastrz. 9, znamienne tym, że środek powłokowy jest związany kowalencyjnie z funkcyjną grupą sililową łącznika elementem o wzorze (3) —CHj-CHjCx
R Ό gdzie Y oznacza grupę alkilową o łańcuchu liniowym lub rozgałęzionym łącznika sililowego, natomiast R oznacza grupę alkilową C2-C9 monomeru 2-podstawionej-2-oksazoliny.
12. Zastosowanie podłoża z powłoką termoczułą utworzoną z polimerów z grupy homo i (ko)polimerów 2-podstawionych-2-oksazolin o podstawniku alifatycznym C2-C9, jak określone w zastrz. 9-11, do hodowli komórkowych, zwłaszcza komórek skóry.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL396476A PL222090B1 (pl) | 2011-09-30 | 2011-09-30 | Sposób wytwarzania podłoża z powłoką termoczułą, podłoże z powłoką termoczułą oraz jego zastosowanie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL396476A PL222090B1 (pl) | 2011-09-30 | 2011-09-30 | Sposób wytwarzania podłoża z powłoką termoczułą, podłoże z powłoką termoczułą oraz jego zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL396476A1 PL396476A1 (pl) | 2013-04-02 |
| PL222090B1 true PL222090B1 (pl) | 2016-06-30 |
Family
ID=48040862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL396476A PL222090B1 (pl) | 2011-09-30 | 2011-09-30 | Sposób wytwarzania podłoża z powłoką termoczułą, podłoże z powłoką termoczułą oraz jego zastosowanie |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL222090B1 (pl) |
-
2011
- 2011-09-30 PL PL396476A patent/PL222090B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL396476A1 (pl) | 2013-04-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kikuchi et al. | Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs | |
| AU750236B2 (en) | Method for providing coated moulded polymeric articles | |
| Liu et al. | Poly (N-isopropylacrylamide)-based thermo-responsive surfaces with controllable cell adhesion | |
| JP6451023B2 (ja) | 細胞培養基材 | |
| US10131874B2 (en) | Cell culture support and associated method for cell growth and release | |
| EP2574664B1 (en) | Method for preparation a thermosensitive coating substrate, the substrate with a thermosensitive coating and its application | |
| Oleszko et al. | Controlling the crystallinity of thermoresponsive poly (2-oxazoline)-based nanolayers to cell adhesion and detachment | |
| da Silva et al. | Poly (N‐isopropylacrylamide) surface‐grafted chitosan membranes as a new substrate for cell sheet engineering and manipulation | |
| JP5162784B2 (ja) | 細胞培養基材及びその製造方法並びに細胞培養方法 | |
| US20110165671A1 (en) | Process for providing an assembly of cell microcarriers | |
| CA2434596C (en) | Substrates containing polyphosphazene as matrices for producing biological implant materials | |
| JP5907661B2 (ja) | 直鎖型温度応答性高分子が固定化された温度応答性細胞培養基材、及びその製造方法 | |
| WO2019035436A1 (ja) | 多能性幹細胞の培養基材及び多能性幹細胞の製造方法 | |
| Utrata-Wesołek et al. | Thermoresponsive polymer surfaces and their application in tissue engineering | |
| Khorasani et al. | BHK cells behaviour on laser treated polydimethylsiloxane surface | |
| Gutsche et al. | N‐acetylglucosamine and adenosine derivatized surfaces for cell culture: 3T3 fibroblast and chicken hepatocyte response | |
| CN115369065A (zh) | 一种基于水凝胶的三维细胞培养支架及其制备方法 | |
| KR101755041B1 (ko) | 패턴화된 세포 배양기판 및 이를 이용한 패턴을 갖는 세포시트 제조방법 | |
| Nie et al. | Temperature‐sensitive chitosan membranes as a substrate for cell adhesion and cell sheet detachment | |
| CN101701207A (zh) | 一种温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法与应用 | |
| PL222090B1 (pl) | Sposób wytwarzania podłoża z powłoką termoczułą, podłoże z powłoką termoczułą oraz jego zastosowanie | |
| Haraguchi et al. | Thermoresponsible cell adhesion/detachment on transparent nanocomposite films consisting of poly (2-methoxyethyl acrylate) and clay | |
| Yoshida et al. | Scaffold‐Mediated 2D Cellular Orientations for Construction of Three Dimensionally Engineered Tissues Composed of Oriented Cells and Extracellular Matrices | |
| JP2018201463A (ja) | 幹細胞を調製するための方法およびキット | |
| JP3311074B2 (ja) | 細胞培養基材 |