PL222314B1 - Bioczujnik elektrochemiczny oraz zastosowanie bioczujnika - Google Patents
Bioczujnik elektrochemiczny oraz zastosowanie bioczujnikaInfo
- Publication number
- PL222314B1 PL222314B1 PL400337A PL40033712A PL222314B1 PL 222314 B1 PL222314 B1 PL 222314B1 PL 400337 A PL400337 A PL 400337A PL 40033712 A PL40033712 A PL 40033712A PL 222314 B1 PL222314 B1 PL 222314B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- dna
- complementary
- electrode
- electrochemical
- biosensor
- Prior art date
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 5
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 3
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 3
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 3
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 2
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 2
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 2
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 2
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 2
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WKGZJBVXZWCZQC-UHFFFAOYSA-N 1-(1-benzyltriazol-4-yl)-n,n-bis[(1-benzyltriazol-4-yl)methyl]methanamine Chemical compound C=1N(CC=2C=CC=CC=2)N=NC=1CN(CC=1N=NN(CC=2C=CC=CC=2)C=1)CC(N=N1)=CN1CC1=CC=CC=C1 WKGZJBVXZWCZQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 3-mercaptopropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCS DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBKVUFQGVWHZIR-UHFFFAOYSA-N 8-oxoguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=NC(=O)N=C21 UBKVUFQGVWHZIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000005052 Osteryoung square wave voltammetry Methods 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000043 antiallergic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- MPMSMUBQXQALQI-UHFFFAOYSA-N cobalt phthalocyanine Chemical compound [Co+2].C12=CC=CC=C2C(N=C2[N-]C(C3=CC=CC=C32)=N2)=NC1=NC([C]1C=CC=CC1=1)=NC=1N=C1[C]3C=CC=CC3=C2[N-]1 MPMSMUBQXQALQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 1
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest bioczujnik elektrochemiczny zawierający przetwornik w postaci złotej elektrody oraz immobilizowaną na powierzchni elektrody sondę DNA. Sonda jednoniciowego DNA zawiera od 15 do 40 nukleotydów o dowolnej sekwencji i zmodyfikowana jest metalokarboboranem: kompleksem karboboran - Fe (III) (3,3'-Fe-1,2-C2B10H11 -1',2'-C2B10H11). Kolejnym przedmiotem rozwiązania jest zastosowanie bioczujnika do oznaczania komplementarnych sekwencji DNA w roztworze oraz rozróżniania położenia komplementarnych sekwencji oligonukleotydów w produktach PCR.
Description
(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 222314 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 400337 (51) Int Cl
G01N 27/327 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 10.08.2012 (54)
Bioczujnik elektrochemiczny oraz zastosowanie bioczujnika
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.02.2014 BUP 04/14 | (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT ROZRODU ZWIERZĄT I BADAŃ ŻYWNOŚCI POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Olsztyn, PL INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Warszawa, PL INSTYTUT BIOLOGII MEDYCZNEJ POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Łódź, PL |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.07.2016 WUP 07/16 | (72) Twórca(y) wynalazku: JERZY RADECKI, Olsztyn, PL HANNA RADECKA, Olsztyn, PL IWONA GRABOWSKA, Olsztyn, PL AGNIESZKA SIRKO, Warszawa, PL ANNA GÓRA-SOCHACKA, Warszawa, PL ZBIGNIEW LEŚNIKOWSKI, Łódź, PL AGNIESZKA OLEJNICZAK, Łódź, PL |
| (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zbigniew Kamiński |
PL 222 314 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest bioczujnik elektrochemiczny oraz zastosowanie bioczujnika do oznaczania komplementarnych sekwencji DNA w roztworze.
W ostatnich latach obserwuje się wzrastające zainteresowanie czujnikami elektrochemicznymi przeznaczonymi do wykrywania DNA (bioczujniki/genoczujniki). Bioczujniki charakteryzują się takimi pożądanymi cechami jak: krótki czas wykonania analizy, miniaturyzacja, prostota i stosunkowo niski koszt wytwarzania [1,2].
W większości opisanych, opracowanych do tej pory bioczujników detekcja opiera się na: (i) p omiarze zmian elektroaktywności niemodyfikowanych zasad nukleinowych takich jak guanina, adenina i cytozyna wywołanych reakcją hybrydyzacji [3], lub (ii) pomiarze zmian elektrochemicznych parametrów granicy faz elektroda/roztwór wywołanych reakcją hybrydyzacji (czujniki typu jono-kanałowego) [4].
W przypadku bioczujników, których podstawą działania jest elektroaktywność niemodyfikowanych zasad nukleinowych (głównie adeniny i guaniny) na powierzchni elektrod węglowych, najpoważniejszym problemem jest uzyskanie odpowiednio silnego sygnału analitycznego. Unieruchamianie ssDNA bezpośrednio na powierzchni elektrod węglowych jest niewystarczające. W celu zwiększenia efektywności procesu utlenienia guaniny, adeniny czy też cytozyny stosuje się modyfikacje powierzchni elektrod węglowych np. nanorurkami węglowymi [5], czy też nanorurkami węglowymi zmodyfikowanymi kompleksem ftalocyjaniny z kobaltem [6, 7].
W związku z trudnościami związanymi z wykorzystaniem pomiaru zmian elektroaktywności zasad nukleinowych wynikających z wysokiego poziomu tła, zdecydowana większość genoczujników należy do grupy czujników jono-kanałowych. W wyniku procesu hybrydyzacji, zmienia się nie tylko stopień uporządkowania powierzchni elektrody, ale także zwiększa się jej ładunek ujemny. Zatem, następuje zwiększone elektrostatyczne odpychanie ujemnie naładowanego markera redoks obecnego w roztworze badanym, lub zwiększone elektrostatyczne przyciąganie w przypadku zastosowania markera redoks naładowanego dodatnio. Te zjawiska stanowią podstawę generowania sygnałów analitycznych czujników typu jono-kanałowego [8, 9]. Niekorzystną cechą tego typu czujników jest konieczność dodawania znaczników aktywnych elektrochemicznie do roztworów badanych.
Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jest umiejscowienie znaczników aktywnych elektrochemicznie na powierzchni elektrod. W dotychczasowych doniesieniach opisano elektrochemiczne bioczujniki, w których zastosowano sondy oligonukleotydowe posiadające znacznik redoks-aktywny na jednym z końców sondy DNA, natomiast grupę - SH na końcu przeciwnym [10-14]. W ten sposób sonda zostaje unieruchomiona na powierzchni elektrody złotej poprzez tworzenie wiązania kowalencyjnego Au-S, co powoduje, że znacznik redoks-aktywny znajduje się w określonej odległości od elektrody, zależnej od długości łańcucha oligonukleotydowego sondy. W wyniku reakcji hybrydyzacji (spontanicznego łączenia się komplementarnych nici DNA, zgodnie z regułą parowania zasad nukleinowych Watsona-Cricka) powstaje podwójna helisa, która charakteryzuje się ściśle określoną strukturą, bardziej sztywną niż jednoniciowa sonda DNA umocowana do elektrody na jej powierzchni. Ta zmiana powoduje wzrost odległości znacznika redoks-aktywnego, kowalencyjnie umocowanego do sondy DNA od powierzchni elektrody. W konsekwencji, obserwuje się utrudnienie przebiegu reakcji utlenienia i redukcji znacznika redoks [10-14].
Do związków często stosowanych do modyfikacji sond DNA należą ferrocen [15-17] i błękit metylenowy [18-20]. Powyższe związki są często wykorzystywane do tego celu, ponieważ charakteryzują się wysoką odwracalnością procesów utleniania i redukcji oraz wielkościami potencjałów utleniania i redukcji odpowiednimi do przeprowadzania pomiarów z zastosowaniem elektrod złotych. Poza tym są one komercyjnie dostępne w formie umożliwiającej łatwe przyłączenie do chemicznie zsyntetyzowanych oligonukleotydów. Jednakże, jak pokazują badania, zastosowanie sond DNA modyfikowanych ferrocenem w złożonych mieszaninach, takich jak np. osocze krwi, skutkuje częściową utratą elektroaktywności centrów redoks-aktywnych [19, 21].
Przyczyną tego zjawiska, jest niespecyficzna adsorpcja białek obecnych w osoczu na powierzchni elektrody. Sprzyja temu zjawisku charakterystyczny dla ferrocenu dodatni potencjał. Sondy DNA zmodyfikowane błękitem metylenowym są mniej wrażliwe na obecność składników złożonych matryc [19, 21]. Jakkolwiek znaczniki w postaci grupy ferrocenylowej pozwalają na uzyskanie diagnostycznego sygnału, to jednak element detekcyjny bioczujnika oparty na tak znakowanej sondzie nie jest trwały. W trakcie przechowywania sondy w buforze następuje degradacja ferrocenu. Dodatkowo sondy te charakteryzują się spadkiem czułości w kolejnych powtórzeniach pomiarów elektrochemiczPL 222 314 B1 nych a także spadkiem wartości szczytowej prądu, w miarę upływu czasu (o 91% spada wartość prądu po 180 h przechowywania sondy w buforze) [19]. Genoczujniki elektrochemiczne były wielokrotnie przedmiotem zgłoszeń patentowych oraz patentów. W dokumencie patentowym US20100059391A1 ujawniono sposób modyfikacji elektrody poprzez zakotwiczenie sondy specyficznej dla biocząsteczki. Elektroda ta jest następnie poddawana działaniu biocząsteczki, która jest wychwytywana przez sondę tworząc kompleks. Następnie związana przez sondę biocząsteczka reaguje z elektroaktywnym znac znikiem posiadającym względem niej zdolność do wiązania. Biocząsteczka tworząc kompleks ze znacznikiem elektroaktywnym na powierzchni elektrody zmodyfikowanej, tworzy elektrodę roboczą. Elektroda robocza jest umieszczana w elektrolicie. Pomiar elektrochemiczny prowadzi się między elektrodą roboczą a elektrodą odniesienia. Zarejestrowany sygnał elektrochemiczny pochodzi od zakotwiczonego na powierzchni elektrody roboczej znacznika redoks-aktywnego i jest on wprost proporcjonalny do stężenia biocząsteczki.
Z kolei w zgłoszeniu patentowym US20040171043A1 przedstawiono nośnik do efektywnego umocowania sondy DNA, sposób oceny nośnika oraz sposób oznaczania kwasów nukleinowych.
W dokumencie patentowym US6391624B1 ujawniono ulepszoną sondę biologiczną o wysokiej czułości, która wykorzystuje modyfikowaną sondę ssDNA przyłączoną do elektrody zawierającą wiele (więcej niż jeden) znaczników redoks-aktywnych. Wykorzystanie większej liczby znaczników redoks-aktywnych zwiększa czułość sondy. Modyfikacja oligonukleotydów polega na przyłączeniu cząsteczki donora oraz akceptora elektronu, których obecność zmienia właściwości elektrochemiczne powstających hybryd. Wybrane grupy zmodyfikowanych oligonukleotydów są komplementarne do unikalnych charakterystycznych sekwencji analizowanych DNA lub RNA. Próbka zawierająca anality np.: diagnostyczny DNA czy produkt PCR (amplikon) poddawana jest działaniu sondy. Ich komplementarne fragmenty ulegają hybrydyzacji z sondą oligonukleotydową. W momencie przyłożenia napięcia, nastąpi przepływ prądu z niewielkim oporem przez wytworzone hybrydy. Pomiar natężenia prądu lub zmian natężenia prądu wskazuje na obecność lub brak poszukiwanego, diagnostycznego DNA lub RNA w analizowanym materiale.
W zgłoszeniu patentowym GB2280754A przedstawiono sposób oraz układ pomiarowy do wykrywania hybrydyzacji DNA, który może być również przydatny do wykrywania mutacji genetycznych. Wynalazek ten dostarcza informacji o sposobie wykrywania hybrydyzacji DNA bez zastosowania radioaktywnych izotopów i obejmuje następujące etapy: denaturację wzorca DNA, kontaktowanie wzorca z elektrodą do pomiaru elektrochemicznego, pomiar polarograficznego sygnału odniesienia ssDNA, kontaktowanie próbki analizowanej z sondą oligonukleotydową w warunkach zapewniających możliwość zajścia hybrydyzacji, usunięcie nadmiaru reagentów oraz odczytanie sygnału polarograficznego z elektrody i porównanie go z sygnałem odniesienia.
Wysokoczuła elektrochemiczna metoda detekcji DNA została również opisana w zgłoszeniu patentowym WO02063041A1. W metodzie tej wykorzystano mieszane interkalatory oraz zestaw odczynników do praktycznego oznaczania ssDNA z wykorzystaniem zjawiska hybrydyzacji.
W zgłoszeniu patentowym US2002010668A1 ujawniono sposób wykrywania kwasów nukleinowych (RNA, DNA) posiadających przynajmniej jedną wstępnie wybraną zasadę (adeninę, guaninę, 6-merkaptoguaninę, 8-okso-guaninę czy 8-osko-adeninę) obejmujący (a) reakcję kwasu nukleinowego z kompleksem metalu przejściowego zdolnego do utlenienia wstępnie wybranej zasady w reakcji typu redoks; (b) wykrywanie reakcji redoks; (c) określenie obecności lub braku obecności kwasu nukleinowego na podstawie wykrywanej reakcji redoks wybranej zasady. Sposób ten może być wykorzystany w wielu zastosowaniach, włączając sekwencjonowanie DNA, pomiary diagnostyczne, czy analizy.
Biorąc pod uwagę powyższe wady i zalety stosowanych do tej pory znaczników redoks, w przedmiotowym rozwiązaniu zastosowano sondę DNA zawierającą alternatywny typ znacznika redoks-aktywnego: metalokarboboran - kompleks karboboranu z Fe(III) [22-25]. Właściwości elektrochemiczne szeregu metalokarboboranów są znane już od wielu lat [26].
W odróżnieniu od wymienionych powyżej znaczników redoks-aktywnych, typu ferrocen czy błękit metylenowy przyłączonych na końcach oligonukleotydowych sond, kompleks karboboranu z Fe(III) został kowalencyjnie przyłączony do sondy jednoniciowego DNA zawierającej od 15 do 40 nukleotydów o dowolnej sekwencji w sposób zapewniający jego położenie blisko powierzchni elektrody złotej (w odległości równej 10-40 wiązań kowalencyjnych). Utworzenie na powierzchni elektrody podwójnej helisy w wyniku hybrydyzacji komplementarnych oligonukleotydów zmienia grubość podwójnej warstwy na granicy faz powierzchnia elektrody/roztwór analizowany, a także zmienia się dostępność anionów obecnych w roztworze badanym do kompleksu karboboran-Fe(III). Zmiana tych parametrów
PL 222 314 B1 ma wpływ na reakcję utlenienia i redukcji centrum Fe(III). To stanowi podstawę generowania sygnału analitycznego [27-29].
W badaniach, do monitorowania reakcji hybrydyzacji przy pomocy opracowanego bioczujnika zastosowano metodę woltamperometrii fali prostokątnej Osteryounga. Przebadano czułość bioczujnika w stosunku do oligonukleotydów w pełni komplementarnych i w pełni niekomplementarnych do modyfikowanej sondy o długości 20 nukleotydów, czyli takiej samej jak długość sondy, oraz produktów reakcji PCR, o długości 180 par zasad, które zawierały sekwencje w pełni komplementarne do sondy na końcu 3', 5', w środku, oraz nie zawierające sekwencji komplementarnej do sondy. Otrzymane wyniki świadczą o wysokiej selektywności bioczujnika, oraz wysokiej czułości - rzędu fmoli. Opracowany bioczujnik nie wymaga znakowania analizowanych sekwencji ssDNA. Wymaga jedynie znakowania sondy DNA.
W literaturze patentowej brak jest doniesień odnośnie zastosowania elektrod modyfikowanych kompleksem karboboran-Fe(III). Niemniej, istnieją doniesienia patentowe traktujące o modyfikacjach sond karboboranami. I tak przykładowo, w zgłoszeniu japońskim JP2005274525A ujawniono bioczip utworzony na bazie samoorganizującej się warstwy utworzonej z pochodnej karboboranów. Przy czym łańcuch DNA został przyłączony do samoorganizującej się warstwy poprzez sprzęganie amidowe.
Z kolei w zgłoszeniu patentowym WO2004096824A2 ujawniono nową klasę detalowanych nukleozydów oraz koniugatów nukleotydów zawierających metalokarboboran, jak również oligonukleotydów modyfikowanych metalokarboboranem. Tak modyfikowane nukleozydy, nukleotydy oraz oligonukleotydy mogą służyć między innymi jako startery w amplifikacji RNA i DNA, leki antyuczuleniowe, nośniki boru w BNCT, radiofarmaceutyki posiadające szeroki zakres izotopów użytecznych w różnych typach radioterapii, molekularne sondy, elementy bioczujników czy materiały dla nanotechnologii.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowej sondy DNA, która dzięki nowemu typowi mocowania do elektrody zapewni obecność centrum redoks-aktywnego Fe(III) blisko jej powierzchni (odległość 10-40 wiązań kowalencyjnych) oraz zastosowanie opracowanego bioczujnika do oznaczania komplementarnych sekwencji DNA, w szczególności komplementarnych sekwencji ssDNA składających się z 20 oligonukleotydów oraz produktów PCR posiadających komplementarne sekwencje w różnych położeniach w stosunku do końca 5'.
Nieoczekiwanie okazało się, że cel ten można osiągnąć poprzez modyfikację sondy DNA kompleksem karboboran-Fe(III).
Przedmiotem rozwiązania jest bioczujnik elektrochemiczny zawierający przetwornik w postaci złotej elektrody oraz immobilizowaną na powierzchni elektrody sondę DNA, charakteryzujący się tym, że sonda jednoniciowego DNA zawierająca od 20 do 40 nukleotydów o dowolnej sekwencji zmodyfikowana jest metalokarboboranem: kompleksem karboboran-Fe(III) (3,3‘-Fe-1,2-C2B10H11-1‘,2‘-C2B10H11), przy czym centrum redoks-aktywne (metalokarboboran) znajduje się w stosunku do powierzchni elektrody w odległości równej od 10 do 40 wiązań kowalencyjnych.
Korzystnie zmodyfikowana sonda DNA umieszczona/przytwierdzona jest na powierzchni złotej elektrody poprzez wytworzenie wiązania amidowego.
Kolejnym przedmiotem rozwiązania jest zastosowanie bioczujnika opisanego jak wyżej do oznaczania komplementarnych sekwencji DNA w roztworze.
Korzystnie zastosowanie bioczujnika do oznaczania komplementarnych sekwencji ssDNA składających się z 20 oligonukleotydów.
Równie korzystnie zastosowanie bioczujnika do oznaczania produktów PCR posiadających komplementarne sekwencje w różnych położeniach w stosunku do końca 5'.
Korzystnie zastosowanie bioczujnika do rozróżniania położenia komplementarnych sekwencji oligonukleotydów w produktach PCR.
Przedmiot rozwiązania został przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia (A) Struktury chemiczne sondy NH2--OLIGO-Fe-CB (B) poszczególne etapy modyfikacji elektrod złotych przy pomocy sondy NH2--OLIGO-Fe-CB poprzez wytworzenie wiązań peptydowych z grupami karboksylowymi w obecności EDC/NHS, fig. 2 przedstawia przykładowe krzywe woltamperometryczne fali pr ostokątnej Osteryoung (OSWV) zarejestrowane dla elektrody roboczej zmodyfikowanej sondą OLIGO-Fe-CB (A) po procesie hybrydyzacji z 20-merowym w pełni komplementarnym ssDNA w zakresie stężeń: 0.00 fM (a), 0.01 fM (b), 0.05 fM (c), 0.1 fM (d), 0.5 fM (e) (B) po procesie hybrydyzacji z 20-merowym w pełni niekomplementarnym ssDNA; zakres stężeń: 0.00 fM (a), 0.01 fM (b), 0.05 fM (c), 0.1 fM (d), 0.5 fM (e). Skład buforu: 1 M NaCl, 0.1 M NaCO 0.01 M KH2PO4, pH 7.0. Parametry
PL 222 314 B1 pomiarowe OSWV: impuls potencjału: 5 mV, częstotliwość fali prostokątnej: 20 Hz, amplituda potencjału: 50 mV.
W celu lepszego zrozumienia wynalazku poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania.
Oligonukleotyd modyfikowany jednostką metalokarboranylową zawierającą jon Fe(III) (3,3'-Fe-1,2-C2Bi0H11-1’,2’-C2Bi0H11), gdzie modyfikacja przyłączona jest do zasady nukleinowej-adeniny. Oligonukleotyd otrzymano metodą amidofosforynową. Ostatni monomer: 2'-deoksyadenozynę zmodyfikowaną metalokarboranem zawierającym jon Fe(III) przyłączono do końca 5'-oligomeru metodą H-fosfoniową. Otrzymany, modyfikowany oligonukleotyd składający się z dziewiętnastu reszt nukleotydowych, odcięto od złoża za pomocą wodnego roztworu amoniaku. Docelowy oligonukleotyd oczyszczono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) a jego struktura i jednorodność została potwierdzona analizą MALDI i PAGE [25].
1. Synteza sondy modyfikowanej karboboranem-Fe(III) (skrót: OLIGO-Fe-CB)
Oligonukleotyd zawierający wiązanie potrójne (5'-NH2-C6-alkin-CCT-CAA-GGA-GAG-AGA-AGA-AG-3') (MW. 6631,50) rozpuszczono w wodzie dejonizowanej (0,6 ml). Z roztworu pobrano 6 pl, uzupełniono wodą do 1000 pl i wykonano widmo UV względem wody przy długości fali 260 nm. Z roztworu pobrano 1 jednostkę optyczną (ODU) (0,03 pg, 4,63 nmola). Do roztworu zawierającego i ODU (w tym przypadku 17,14 pl) dodano tris[(1-benzyl-1H-2,3-triazol-4-yl)metylo]aminę (42,99 pg, 81,03 nmola, 18,06 pl roztworu powstałego przez rozpuszczenie 1 mg tego związku w 0,42 ml wody dejonizowanej). Następnie dodano askorbinian sodu (22,93 pg, 115,75 nmola, 4,70 pl roztworu powstałego przez rozpuszczenie 1 mg tego związku w 0,205 ml wody dejonizowanej), siarczan miedzi (2,89 pg, 11,56 mmola, 4,70 pl roztworu powstałego przez rozpuszczenie 1 mg tego związku w 1,63 ml wody dejonizowanej) oraz metalokarboran zawierający grupę azydową ([8-N3-(CH2CH2O)2-1,2-C2B9H10)(1’,2’-C2B9H11-3,3’Fe], 41,95 pg, 92,60 mmola, 21 pl roztworu powstałego przez rozpuszczenie 1 mg tego związku w 0,50 ml wody dejonizowanej). Wszystkie składniki dobrze ze sobą zmieszano. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej, z załączonym mieszadłem magnetycznym. Po dwóch godzinach reakcji dodano ponownie: tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metylo]aminę (42,99 pg, 81,03 nmola, 18,06 pl), askorbinian sodu (22,93 pg, 115,75 nmola, 4,70 pl), siarczan miedzi (2,89 pg, 56 mmola, 4,70 pl) oraz metalokarboran zawierający grupę azydową ([8-N3-(CH2CH2O)2-1,2-C2B9Hio)(1’,2’-C2B9Hii-3,3’Fe], 41,95 pg, 92,60 mmola, 21 pl). Reakcję zakończono po 2 godzinach od dodania dodatkowej porcji substratów.
Po tym czasie mieszaninę reakcyjną zamrożono w temperaturze -70°C do czasu oczyszczania za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Warunki analizy HPLC: kolumna HPLC - Alltech Econosil RP-C18, 5 pm, 4.6 x 250 mm, detekcja UV przy długości fali λ = 268 nm, przepływ 1 ml/min, analizę przeprowadzono w temperaturze pokojowej, gradient analizy: 20 min od 0% D do 100% D, 5 min 100% D, 5 min od 100% D do 0% D (bufor A: mieszanina acetonitryl:woda (2:98, v/v) w 0,1 M wodorowęglanie trietyloamoniowym; bufor D: mieszanina acetonitryl:woda (40:60, v/v) w 0,1 M wodorowęglanie trietyloamoniowym). Zbierano frakcje modyfikowanego oligonukleotydu i zatężano na wirówce próżniowej. Pozostałość odparowano kilkakrotnie z 95% etanolem usuwając wodorowęglan trietyloamoniowy. Pozostałość rozpuszczono w wodzie (0,2 ml) i liofilizowano. RP-HPLC Rf = 15.88 min; MALDI-TOF MS: m/z (%) = 7082,16 [M+1] (100%).
2. Przyłączanie sond oligonukleotydowych z karboboranem-Fe(III) (skrót: OLIGO-Fe-CB) do powierzchni elektrod złotych
Etapy otrzymywania genoczujnika zostały przedstawione na Fig. 1. Elektrody złote, po uprzednim wstępnym mechanicznym oczyszczeniu przy użyciu aluminy, czyszczone były elektr ochemicznie w 0.5 M KOH w zakresie potencjału -0.4 V + +1.2 V. Tak przygotowane elektrody, umieszczane były w pierwszym etapie w 1 mM etanolowym roztworze kwasu 3-merkaptopropionowego z dodatkiem 2% v/v kwasu trifluorooctowego na 3 godziny. Następnie elektrody, po opłuk aniu 10% roztworem amoniaku w etanolu, zanurzano do roztworu zawierającego 100 mM 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropyl)karbodiimidu (ang. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) (EDC) oraz 50 mM N-Hydroksy-sukcynoimidu (ang. N-hydroxysuccinimide) (NHS) w 0.05 M buforze MES, pH 5.5 na 1 godzinę. Celem tego etapu było wytworzenie wiązań peptydowych pomiędzy grupami karboksylowymi znajdującymi się na powierzchni elektrody oraz grupami aminowymi sondy DNA.
W kolejnym kroku, na powierzchnię elektrod nakraplano 10 pl roztworu OLIGO-Fe-CB o stężeniu 0.01 mM w 0.05 M buforze MES, pH 7.0 na 48 godzin i pozostawiano elektrody w lodówce, zabezpieczone przed odparowywaniem roztworu. Po zadanym czasie, spłukiwano elektrody buforem 0.05 M MES o pH 7.0 i umieszczano je na 0.5 minuty w roztworze 0.1 M etanoloaminy w buforze MES
PL 222 314 B1 pH 7.0. Po ostatnim etapie modyfikacji, spłukiwano elektrody buforem o pH 7.0 i umieszczano w roztworze kondycjonującym: 1 M NaCl, 0.1 M NaClO4, 0.01 M KH2PO4, pH 7.2 na ok. 18 godzin w lodówce.
3. Badanie procesu hybrydyzacji pomiędzy sondą oligonukleotydową zawierającą karboboran-Fe(III) (OLIGO-Fe-CB) unieruchomioną na powierzchni elektrody złotej, a ssDNA komplementarnym znajdującym się w roztworze badanym
Elektrody złote zmodyfikowane wg. procedury opisanej w punkcie 2, umies zczano w celce pomiarowej, w roztworze 1 M NaCl, 0.1 M NaCIO4, 0.01 M KH2PO4, pH 7.2 i rejestrowano woltamperogramy, aż do momentu uzyskania niezmiennego w czasie sygnału. W kolejnym kroku, na p owierzchnię elektrody nakraplano 10 ul roztworu ssDNA o danym stężeniu w zakresie od 0.01 do 0.05 fmola, w buforze 1 M NaCl, 0.1 M NaCIO4, 0.01 M KH2PO4, pH 7.2, i pozostawiano elektrody na 1 godzinę, pod przykryciem uniemożliwiającym odparowanie roztworu, w temperaturze pokoj owej. Po 1 h elektrody spłukiwano powyższym buforem i umieszczano w celce elektrochemicznej. Rejestrowano woltamperogramy do momentu uzyskania stabilnego powtarzalnego pomiaru. W wyniku reakcji hybrydyzacji obserwowano obniżanie piku prądu redukcji/utlenienia Fe(III) w kompleksie z karboboranem. Zmiany te były proporcjonalne do stężenia ssDNA komplementarnego obecnego w roztworze badanym.
Sygnał (obniżenie natężenia prądu reakcji utleniania i redukcji Fe(III)) generowany w obecności w pełni komplementarnych 20-merowych sekwencji DNA był proporcjonalny do jego stężenia w zakresie od 0.01 fM do 0.05 fM.
W obecności 20-merowych sekwencji DNA w pełni niekomplementarnych do sondy nie obserwowano znaczących zmian natężenia prądu reakcji utleniania i redukcji Fe(III).
Bioczujnik wykorzystano również do wykrywania komplementarnych do sondy sekwencji oligonukleotydów znajdujących się w różnych położeniach w produktach PCR.
Najsilniejszy sygnał obserwowano w przypadku produktu PCR posiadającego komplementarne sekwencje oligonukleotydów na końcu 3', najsłabszy sygnał obserwowano dla produktu PCR z komplementarną sekwencją na końcu 5'. Produkt PCR posiadający komplementarne sekwencje pośrodku, generował sygnał pośredni.
Powyższe różnice są prawdopodobnie spowodowane różnym stopniem dostępności komplementarnych sekwencji oligonukleotydów znajdujących się w produktach PCR do sondy DNA przym ocowanej przy pomocy wiązania peptydowego do powierzchni elektrody.
Literatura:
[1] Chang, Haixin; Wang, Ying; Li, Jinghong, Electrochemical DNA Sensors: From Nanoconstruction to Biosensing, Current Organic Chemistry, Volume 15, Number 4, February 2011, 506-517.
[2] F. Lucarelli, Tombelli S., Minunni M., Marrazza G., Mascini M., Electrochemical and piezoelectric DNA biosensors for hybridization detection. Anal. Chim. Acta. 609, 2008, 139-159.
[3] E. Palecek, Fifty Years of Nucleic Acid Electrochemistry, Electroanal., 2009, 21 (3-5), 239-251.
[4] J. Wang, Electrochemical nucleic acid biosensors, Anal. Chim. Acta, 469, 2002, 63-69.
[5] J. Wang, A. N. Kawde, M. Musameh, Carbon - nanotube - modified glassy carbon electrodes for amplified label - free electrochemical detection of DNA hybridization, Analyst, 128, 2003, 912-916.
[6] A. Abbaspour, M. A. Mehrgardi, R. Kia, Electrocatalytic oxidation of guanine and ss-DNA at a cobalt (11) phthalocyanine modified carbon paste electrode, J. Electroanal. Chem., 568, 2004, 261-266.
[7] X. Zhu, S. Ai, Q. Chen, H. Yin, J. Xu, Label-free electrochemical detection of Avian Influenza Virus genotype utilizing multi-walled carbon nanotubes-cobalt phthalocyanine-PAMAM nanocomposite modified glassy carbon electrode, Electrochem. Comm. 11, 2009, 1543-1546.
[8] H. Aoki, p. Buhlmann, Y. Umezawa, Electrochemical detection of one-base mismatch in an oligonucleotide using ion-channel sensor with self-assembled PNA monolayers, Electroanal. 12, 2000, 1272-1276.
[9] Y. Umezawa, H. Aoki, Ion Channel Sensor Based on Artificial Receptors, 2004, 76, 320
A-326a.
[10] E. Farjami, L. Clima, K. Gothelf, E. E. Ferapontova, Off-On electrochemical hairpin-DNA-based genosensors for cancer diagnostics, Anal. Chem., 83, 2011, 1594-1602.
[11] K. Yang, Ch. Zhang, Improved sensitivity for the electrochemical biosensors with an adjunct probe, Anal. Chem. 82, 2010, 9500-9505.
PL 222 314 B1
[12] A. Patterson, F. Caprio, A. Valle - Belisle, D. Mascone, K. W. Plaxco, G. Palleschi, F. Ricci, Using triplex - forming nucleotide probes for reagentless, electrochemical detection of double stranded DNA, Anal. Chem. 82, 2010, 9109-9115.
[13] Y. Liu, N. Tuleouva, E. Ramanculov, A. Revzin, Aptamer - based electrochemical biosensors for interferon gamma detection, Anal. Chem., 82, 2010, 8131-8136.
[14] B. Yin, D. Wu, B. Ye, Sensitive DNA - based electrochemical strategy for trace bleomycin detection, Anal. Chem., 82, 2010, 8272-8277.
[15] A. Anne, Ch. Demaille, Dynamics of Electron Transport by Elastic Bending of Short DNA Duplexes. Experimental Study and Quantitative Modeling of the Cyclic Voltametric Behaviour of 3'-ferrocenyl DNA End-Grafted on Gold, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 542-3.
[16] H. Aoki, H. Tao, Label-and marker-free gene detection based on hybridization-induced conformational flexibility changes in ferrocene - PNA conjugate probe, Analyst, 2007, 132, 784-791. 557.
[17] Ch. Fan, K. W. Plaxco, A. J. Heeger, Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-specific detection of DNA, PNAS, 2003, 100 (16), 9134-9137.
[18] F. Ricci, R. Y. Lai, K. W. Plaxco, Linear, redox modified DNA probes as electrochemical DNA sensors, Chem. Comm. 2007, 36, 3768-3770.
[19] D. Kang, X. Zuo, R. Yang, F. Xia, K. W. Plaxco, R. J. White, Comparing the Properties of Electrochemical-Based DNA Sensors Employing Different Tags, Anal. Chem., 2009, 81 (21), 9109-9113.
[20] F. Ricci, K. W. Plaxco, E-DNA sensors for convinient, label - free electrochemical detection of hybridization, Microchim. Acta, 2008, 163, 149-155.
[21] E. E. Ferapontova, K. V. Gothelf, Effect of serum on an RNA - aptamer - based electrochemical sensor for theophylline, Langmuir, 2009, 25, 4279-4283.
[22] A. B. Olejniczak, M. Corsini, S. Fedi, P. Zanello, Z. L. Leśnikowski, Nucleoside-metallacaborane conjugates for multipotential electrochemical coding of DNA, El. Comm., 2007, 9, 1007-1011.
[23] A. B. Olejniczak, B. Gruner, V. Sicha, S. Broniarek, Z. J. Leśnikowski, Metallacarboranes as labels for multipotential electrochemical coding of DNA. [3-Chromium bis(dicarbollide)](-1)ate and Its Nucleoside Conjugates], Electroanal., 21,2009, 501-506.
[24] A. B. Olejniczak, J. Piesek, Z. J. Leśnikowski, Nucleoside-metallacarborane conjugates for base-specific metal labeling of DNA, Chem. Eur. J., 13, 2007, 311-318.
[25] A. B. Olejniczak, Metallacarboranes for the labeling of DNA, Can. J. of Chem., 89, 2011, 465-470.
[26] M. Corsini, F. Fabrizi de Biani, P. Zanello, Mononuclear metallacarboranes of group 6-10 metals: analouges of metallocenes: electrochemical and X-ray structural aspects, Coord. Chem. Rev., 250, 2006, 1351 -1372.
[27] Creager S. E.; Rowe G. K. J. of Electroanal. Chem. 1997, 420, 291-299.
[28] Smith Ch. P.; White H. S. Anal. Chem. 1992, 64, 2398-2405.
[29] Khor S. M.; Liu G.; Fairman C.; Iyengar S.; Gooding J. J. Biosens, and Bioelectr. 2011,26, 2038-2044.
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Bioczujnik elektrochemiczny zawierający przetwornik w postaci złotej elektrody oraz immobilizowaną na powierzchni elektrody sondę DNA, znamienny tym, że sonda jednoniciowego DNA zawierająca od 20 do 40 nukleotydów o dowolnej sekwencji zmodyfikowana jest metalokarboboranem: kompleksem karboboran-Fe (III) (3,3’-Fe-1,2-C2B1oH11-1’,2’-C2B1oH11), przy czym centrum redoks-aktywne (metalokarboboran) znajduje się w stosunku do powierzchni elektrody w odległości równej od 10 do 40 wiązań kowalencyjnych.
- 2. Bioczujnik według zastrz. 1, znamienny tym, że zmodyfikowana sonda DNA umieszczona/przytwierdzona jest na powierzchni złotej elektrody poprzez wytworzenie wiązania amidowego.
- 3. Zastosowanie bioczujnika opisanego według zastrz. 1 -2 do oznaczania komplementarnych sekwencji DNA w roztworze.
- 4. Zastosowanie bioczujnika według zastrz. 3 do oznaczania komplementarnych sekwencji ssDNA składających się z 20 oligonukleotydów.PL 222 314 B1
- 5. Zastosowanie bioczujnika według zastrz. 4 do oznaczania produktów PCR posiadających komplementarne sekwencje w różnych położeniach w stosunku do końca 5'.
- 6. Zastosowanie według zastrz. 4 do rozróżniania położenia komplementarnych sekwencji oligonukleotydów w produktach PCR.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL400337A PL222314B1 (pl) | 2012-08-10 | 2012-08-10 | Bioczujnik elektrochemiczny oraz zastosowanie bioczujnika |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL400337A PL222314B1 (pl) | 2012-08-10 | 2012-08-10 | Bioczujnik elektrochemiczny oraz zastosowanie bioczujnika |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL400337A1 PL400337A1 (pl) | 2014-02-17 |
| PL222314B1 true PL222314B1 (pl) | 2016-07-29 |
Family
ID=50097310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL400337A PL222314B1 (pl) | 2012-08-10 | 2012-08-10 | Bioczujnik elektrochemiczny oraz zastosowanie bioczujnika |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL222314B1 (pl) |
-
2012
- 2012-08-10 PL PL400337A patent/PL222314B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL400337A1 (pl) | 2014-02-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7029919B2 (en) | Electro-optical device and methods for hybridization and detection | |
| Dauphin-Ducharme et al. | High-precision electrochemical measurements of the guanine-, mismatch-, and length-dependence of electron transfer from electrode-bound DNA are consistent with a contact-mediated mechanism | |
| ES2385341T3 (es) | Detección de hibridación de ácidos nucleicos electrocatalítica | |
| Gorodetsky et al. | Electrochemistry using self-assembled DNA monolayers on highly oriented pyrolytic graphite | |
| Dong et al. | A novel aptasensor for lysozyme based on electrogenerated chemiluminescence resonance energy transfer between luminol and silicon quantum dots | |
| US20110210017A1 (en) | Fabrication of electrochemical biosensors via click chemistry | |
| Grabowska et al. | DNA probe modified with 3-iron bis (dicarbollide) for electrochemical determination of DNA sequence of Avian Influenza Virus H5N1 | |
| Raoof et al. | Preparation of an electrochemical PNA biosensor for detection of target DNA sequence and single nucleotide mutation on p53 tumor suppressor gene corresponding oligonucleotide | |
| JP2002510791A (ja) | インターカレート性のレドックス活性部分を使用する電気化学的センサ | |
| Lin et al. | Electrochemical biosensor based on nanogold-modified poly-eriochrome black T film for BCR/ABL fusion gene assay by using hairpin LNA probe | |
| US6635426B2 (en) | Mixed intercalator and electrochemical detection of DNA using same | |
| US20040086894A1 (en) | Electrochemical method to measure DNA attachment to an electrode surface in the presence of molecular oxygen | |
| US20100133118A1 (en) | Electrochemical methods of detecting nucleic acid hybridization | |
| Hu et al. | Conjugated self-doped polyaniline–DNA hybrid as trigger for highly sensitive reagentless and electrochemical self-signal amplifying DNA hybridization sensing | |
| Spehar-Deleze et al. | Electrochemiluminescent hybridization chip with electric field aided mismatch discrimination | |
| Tansil et al. | An ultrasensitive nucleic acid biosensor based on the catalytic oxidation of guanine by a novel redox threading intercalator | |
| Wang et al. | A Sandwich‐Type Electrochemical Biosensor for Detection of BCR/ABL Fusion Gene Using Locked Nucleic Acids on Gold Electrode | |
| Hu et al. | A signal-on electrochemical DNA biosensor based on potential-assisted Cu (I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition mediated labeling of hairpin-like oligonucleotide with electroactive probe | |
| JP2003083968A (ja) | Ｄｎａチップおよびアッセイ方法 | |
| WO2002073183A1 (fr) | Procede permettant la detection electrochimique de la complementarite de bases d'acides nucleiques | |
| Zhong et al. | Electrochemical biosensor for detection of BCR/ABL fusion gene based on isorhamnetin as hybridization indicator | |
| JP2002000299A (ja) | 複数の電位を用いる遺伝子の発現解析 | |
| JP4580996B2 (ja) | 標的核酸の検出方法および標的核酸検出用基体 | |
| PL222314B1 (pl) | Bioczujnik elektrochemiczny oraz zastosowanie bioczujnika | |
| AU2004236714B2 (en) | Electrochemical method to measure DNA attachment to an electrode surface in the presence of molecular oxygen |